CN110981861A - 一种氯氮平衍生物及其制备方法与氯氮平检测试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于人体生物样本中氯氮平含量检测的氯氮平衍生物及其制备方法。使用该氯氮平衍生物获得了3种高免疫原性的氯氮平免疫原与相应的3种抗氯氮平特异性抗体以及3种氯氮平酶标偶联物,并制备出了3种灵敏度高、特异性强、检测效果好的氯氮平免疫学检验试剂。本发明还提供了3种氯氮平免疫检验试剂的制备方法及相应的使用方法。本发明提供的3种氯氮平免疫检测方法操作方便、检测快速、结果准确、灵敏度高、特异性强,能够对人体血液样本中的氯氮平含量进行定量检测。克服了现有技术中氯氮平检测方法存在的操作复杂、自动化程度低等缺陷,能有效指导临床个体化合理用药。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种氯氮平衍生物及其制备方法与氯氮平检测试剂。
背景技术
氯氮平(Clozapine)是苯二氮卓类抗精神病药物,其化学结构式如式Ⅷ所示:
式Ⅷ。
氯氮平对脑内5-羟色胺(5-HT2A)受体和多巴胺(DA1)受体的阻滞作用较强,对多巴胺(DA4)受体的也有阻滞作用,对多巴胺(DA2)受体的阻滞作用较弱,此外还有抗胆碱(M1),抗组胺(H1)及抗a-肾上腺素受体作用,锥体外系反应及迟发性运动障碍较轻,一般不引起血中泌乳素增高。能直接抑制脑干网状结构上行激活系统,具有强大镇静催眠作用,用于治疗多种类型的神经分裂症。氯氮平抗精神病作用强大,但锥体外系反应较轻,这表明抗精神病作用和锥体外系反应是可以分开的。本品不仅对精神病阳性症状有效,对阴性症状也有一定效果。适用于急性与慢性精神分裂症的各个亚型,对幻觉妄想型、青春型效果好。也可以减轻与精神分裂症有关的情感症状(如:抑郁、负罪感、焦虑)。对一些用传统抗精神病药治疗无效或疗效不好的病人,改用本品可能有效。本品也用于治疗躁狂症或其他精神病性障碍的兴奋躁动和幻觉妄想。本品镇静作用强和抗胆碱能不良反应较多,常见不良反应有头晕、无力、嗜睡、多汗、流涎、恶心、呕吐、口干、便秘等,其它不良反应还包括体位性低血压,心动过速,食欲和体重增加,心电图异常,癫痫发作,也可引起血糖增高。严重不良反应为粒细胞缺乏症及继发性感染,也可引起尿失禁或中枢系统紊乱,临床上应该慎用。
传统的氯氮平检验方法主要有:高效液相色谱法(HPLC)与液相色谱/串联质谱联用法(LC/MS-MS)等,这些方法操作复杂、速度较慢、且成本较高。而利用新型氯氮平衍生物研制的抗氯氮平特异性系列抗体可以用于制备多种灵敏度高、特异性强、检测效果好的氯氮平免疫检验试剂,能有效弥补传统方法的缺点。本发明的3种氯氮平检测试剂,可以对氯氮平的含量进行定量检测,有效指导临床个体化合理用药。与HPLC、LC/MS-MS等传统方法相比,本发明提供的免疫检测方法具有操作简便、检测快速快、结果准确、费用低廉等优势,有利于将来临床大规模推广应用,特别是对于缺乏昂贵仪器的基层医院具有良好的应用前景。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明所采用的技术方案是:
一、提供一种氯氮平衍生物,该衍生物为新合成物质,自然界中不存在,其结构式如式Ⅰ所示:
式Ⅰ。
二、提供一种如上所述的氯氮平衍生物的合成方法,该合成方法有别于常规合成方法,并具有良好的合成效果,显著提高氯氮平衍生物的合成效率,具体合成路线如下所示:
三、提供一种氯氮平均相酶免疫检测试剂,该检测试剂由R1试剂与R2试剂组成,所述R1试剂包含抗氯氮平特异性抗体1与R1缓冲液,所述R2试剂包含氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物与R2缓冲液;所述抗氯氮平特异性抗体1为氯氮平人转铁蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体;所述的氯氮平人转铁蛋白免疫原,由上述的氯氮平衍生物与人转铁蛋白偶联而成,其结构式如式Ⅱ所示:
式Ⅱ;
所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种;
所述的R1缓冲液含有酶底物、辅酶、牛血清白蛋白及Tris缓冲液,所述的酶底物为葡萄糖-6-磷酸,所述的辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型;
所述的氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物由上述的氯氮平衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联而成;其结构式如式Ⅲ所示:
式Ⅲ;
所述的R2缓冲液为含有牛血清白蛋白的Tris缓冲液。
四、提供一种如上所述的氯氮平均相酶免疫检测试剂的制备方法,包含以下步骤:
(1)将0.25%牛血清白蛋白、50mmol/L葡萄糖-6-磷酸及50mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型依次加入50mmol/L Tris缓冲液中搅拌溶解制成R1缓冲液,再将抗氯氮平特异性抗体1以1∶500-1∶5000的体积比加入到上述R1缓冲液中混匀,再用6 mol/L的盐酸调节pH至8.0,制成R1试剂;
(2)将0.25%牛血清白蛋白加入100mmol/L Tris缓冲液中搅拌溶解制成R2缓冲液,再将氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物以1∶1000-1∶8000的体积比加入到上述R2缓冲液中混匀,再用6 mol/L的盐酸调节pH至7.6,制成R2试剂;
所述抗氯氮平特异性抗体1的制备方法,包含以下步骤:
a. 将氯氮平人转铁蛋白免疫原用PBS缓冲液稀释至2.0-5.0 mg/ml,得到抗原溶液,然后将2.0-5.0 ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;
b. 1-4周后,再用2.0-5.0 ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔1-4周注射一次,共计注射3-8次;
c.对免疫后的实验动物取血,分离纯化抗血清,得到抗氯氮平特异性抗体1。
所述的氯氮平人转铁蛋白免疫原的制备方法,包含以下步骤:
a.称取2.0-5.0 g磷酸二氢钾、3.0-6.0 g磷酸氢二钠、7.5-15.0 g氯化钠、1.0-2.5 g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5 L去离子水中,调节pH至7.8-8.3,制成缓冲溶液A;
b.称取3.0-6.0 mg人转铁蛋白,0-8℃下溶解于3.0-6.0 ml上述缓冲溶液A中,制成人转铁蛋白载体溶液;
c.称取3.0-8.0 mg上述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800 μl上述缓冲溶液A中,制成氯氮平衍生物溶液A;
d.当上述氯氮平衍生物溶液A刚变澄清时,将其逐滴加入上述人转铁蛋白载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液A进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平人转铁蛋白免疫原溶液,在氯氮平人转铁蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于-20℃下储存。
所述的氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物的制备方法,包含以下步骤:
a.称取1.0-3.0 g磷酸二氢钾、1.0-5.0 g磷酸氢二钠、7.5-15.0 g氯化钠、1.0-3.0 g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5 L去离子水中,调节pH至7.8-8.3,制成缓冲溶液B;
b.称取3.0-6.0 mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,0-8℃下溶解于3.0-6.0 mL上述缓冲溶液B中,制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液;
c.称取3.0-8.0 mg上述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800 μl上述缓冲溶液B中,制成氯氮平衍生物溶液B;
d.当上述氯氮平衍生物溶液B刚变澄清时,将其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液B进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物溶液,在氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物溶液中加入质量分数0.5-1.0%的BSA和质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于0~8℃下储存。
五、提供一种如上所述的氯氮平均相酶免疫检测试剂的使用方法,包括以下操作步骤:
(1)在全自动生化分析仪中加入校准品、R1试剂,混匀,37℃温育3-5分钟;加入R2试剂,混匀,37℃恒温5-10分钟后,340nm主波长/405nm次波长进行检测,连续监测3分钟内的吸光度变化率,由全自动生化分析仪制作校准曲线;
(2)在全自动生化分析仪中加入待测样本、R1试剂,混匀,37℃温育3-5分钟;加入R2试剂,混匀,37℃恒温5-10分钟后,340nm主波长/405nm次波长进行检测,连续监测3分钟内的吸光度变化率,由全自动生化分析仪根据步骤(1)中制作的校准曲线自动计算待测样本中氯氮平的含量;
所述试剂R1与试剂R2按1:1~4:1的体积比使用;所述的待测样本为血清、血浆、尿液、唾液、组织液或脑脊液中的任意一种。
六、提供一种氯氮平酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂,该检测试剂含有:抗氯氮平特异性抗体2、氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物及反应底物;
所述抗氯氮平特异性抗体2为氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体;所述的氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原,由上述的氯氮平衍生物与人甲状腺球蛋白偶联而成,其结构式如式Ⅳ所示:
式Ⅳ;
所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种;
所述的氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物由上述的氯氮平衍生物与辣根过氧化物酶偶联而成;其结构式如式Ⅴ所示:
式Ⅴ;
所述的反应底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺;
所述抗氯氮平特异性抗体2的制备方法,包含以下步骤:
a. 将氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原用PBS缓冲液稀释至2.0-5.0 mg/ml,得到抗原溶液,然后将2.0-5.0 ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;
b. 1-4周后,再用2.0-5.0 ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔1-4周注射一次,共计注射3-8次;
c.对免疫后的实验动物取血,分离纯化抗血清,得到抗氯氮平特异性抗体2。
所述的氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原的制备方法,包含以下步骤:
a.称取2.0-5.0 g磷酸二氢钾、3.0-6.0 g磷酸氢二钠、7.5-15.0 g氯化钠、1.0-2.5 g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5 L去离子水中,调节pH至7.8-8.3,制成缓冲溶液C;
b.称取3.0-6.0 mg人甲状腺球蛋白,0-8℃下溶解于3.0-6.0 ml上述缓冲溶液C中,制成人甲状腺球蛋白载体溶液;
c.称取3.0-8.0 mg上述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800 μl上述缓冲溶液C中,制成氯氮平衍生物溶液C;
d.当上述氯氮平衍生物溶液C刚变澄清时,将其逐滴加入上述人甲状腺球蛋白载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液C进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原溶液,在氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于-20℃下储存。
所述的氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物的制备方法,包含以下步骤:
a.称取1.0-3.0 g磷酸二氢钾、1.0-5.0 g磷酸氢二钠、7.5-15.0 g氯化钠、1.0-3.0 g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5 L去离子水中,调节pH至7.8-8.3,制成缓冲溶液D;
b.称取3.0-6.0 mg辣根过氧化物酶,0-8℃下溶解于3.0-6.0 mL上述缓冲溶液D中,制成辣根过氧化物酶溶液;
c.称取3.0-8.0 mg上述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800 μl上述缓冲溶液B中,制成氯氮平衍生物溶液D;
d.当上述氯氮平衍生物溶液D刚变澄清时,将其逐滴加入上述辣根过氧化物酶溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液D进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物溶液,在氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物溶液中加入质量分数0.5-1.0%的BSA和质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于0~8℃下储存。
七、提供一种如上所述的氯氮平ELISA检测试剂的使用方法,包括以下操作步骤:
(a)将抗氯氮平特异性抗体2用磷酸盐缓冲液按1∶1000-1∶20000的比例进行稀释,制成抗体溶液,将抗体溶液按 100μL/孔的用量包被在96孔酶联板上,4℃过夜;
(b)用磷酸盐缓冲液洗涤3次后,加入200μL/孔的0.5%的牛血清白蛋白溶液,4℃封闭过夜,磷酸盐缓冲液洗涤3次;
(c)加入20μL/孔的校准品及待测样本;
(d)加入100μL/孔工作浓度的氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物;
(e)室温下孵育30分钟,磷酸盐缓冲液洗板5次;
(f)每孔加入100μL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺,室温孵育30分钟;
(g)每孔加入100μL 的浓度为2mol/L的硫酸,终止反应;
(h)使用酶标仪测定450nm波长的吸光值;
(i)根据不同浓度校准品的吸光值制作校准曲线,并根据校准曲线与待测样本的吸光值计算待测样本中氯氮平的含量;
所述的待测样本为血清、血浆、尿液、唾液、组织液或脑脊液中的任意一种。
八、提供一种氯氮平胶乳增强免疫比浊检测试剂,该检测试剂包括:L1试剂与L2试剂;
所述L1试剂由氯氮平-人纤维蛋白原偶联物和L1缓冲液组成,所述L2试剂由抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒和L2缓冲液组成;
所述的氯氮平-人纤维蛋白原偶联物由上述的氯氮平衍生物与人纤维蛋白原偶联而成,其结构式如式Ⅵ所示:
式Ⅵ;
所述L1缓冲液为含有牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸、PEG-8000、乙基汞硫代硫酸钠的Tirs-HCl缓冲液;
所述的抗氯氮平特异性抗体3为氯氮平人血清白蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体;所述的氯氮平人血清白蛋白免疫原,由上述的氯氮平衍生物与人血清白蛋白偶联而成,其结构式如式Ⅶ所示:
式Ⅶ;
所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种;
所述胶乳颗粒为表面带有羧基、氨基、羟基、酰肼基或氯甲基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒,直径范围为50-450nm;
所述L2缓冲液为含有牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸二钠、Triton X-100、乙基汞硫代硫酸钠的硼酸盐缓冲液。
九、提供一种如上所述的氯氮平胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法,包含以下步骤:
(1)将浓度为0.05-2 mg/mL的氯氮平-人纤维蛋白原偶联物溶解于浓度为10-100mmol/L、pH值为7.0-8.0的Tirs-HCl缓冲液中,然后添加质量分数为0.1%-2.0%的牛血清白蛋白、0.25%-1.0%的氯化钠、0.1%-0.5%的吐温-20、1.0%-5.0%的丙三醇、0.1%-1.0%的乙二胺四乙酸、1.0%-5.0%的PEG-8000以及0.01%-0.1%的乙基汞硫代硫酸钠,搅拌均匀,调节pH=7.5,制成L1试剂;
(2)将质量分数为0.05-1.0%的抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒加入浓度为20-100 mmol/L的硼酸盐缓冲液中,然后添加质量分数为0.1%-2.5%的牛血清白蛋白、0.25%-1.0%的氯化钠、0.1%-0.5%的吐温-20、1.0%-5.0%的丙三醇、0.1%-1.0%的乙二胺四乙酸二钠、0.1-1.0%的Triton X-100以及0.01%-0.1%的乙基汞硫代硫酸钠,搅拌均匀,制成L2试剂;
所述的氯氮平-人纤维蛋白原偶联物的制备方法,包含以下步骤:
a.称取2.0-5.0 g磷酸二氢钾、3.0-6.0 g磷酸氢二钠、7.5-15.0 g氯化钠、1.0-2.5 g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5 L去离子水中,调节pH至7.8-8.3,制成缓冲溶液E;
b.称取3.0-6.0 mg人纤维蛋白原,0-8℃下溶解于3.0-6.0 ml上述缓冲溶液E中,制成人纤维蛋白原载体溶液;
c.称取3.0-8.0 mg上述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800 μl上述缓冲溶液E中,制成氯氮平衍生物溶液E;
d.当上述氯氮平衍生物溶液E刚变澄清时,将其逐滴加入上述人纤维蛋白原载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液E进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平-人纤维蛋白原偶联物溶液,在氯氮平-人纤维蛋白原偶联物溶液中加入质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于-20℃下储存。
所述的抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒的制备方法,包含以下步骤:
a.将0.5-1.5 mg直径为50-450 nm的聚苯乙烯胶乳颗粒加入1.5-4.5 mL、0.08 mol/L、pH=6.2的MES缓冲液中,然后加入5.0 mg碳二亚胺与2.5 mgN-羟基琥珀酰亚胺,在37℃下搅拌1小时,15000 r/min离心15分钟后去除上清液,然后用15 ml浓度为0.1mol/L、PH=8.2的磷酸盐缓冲液将沉淀物重悬,制成胶乳颗粒溶液;
b.将0.5-1.5mg抗氯氮平特异性抗体3用1.5-4.5 mL、0.1mol/L、pH=8.2的硼酸盐缓冲液稀释后,立即加入到上述胶乳颗粒溶液中,在37℃下振荡反应12小时,然后加入1.0-3.0mL、0.1 mol/L、pH=8.5的甘氨酸缓冲液搅拌2小时,反应结束后加入0.5-1.5 mg牛血清白蛋白,搅拌均匀后室温静置12小时,然后9000 r/mim离心15分钟,去除上清液,再将沉淀物用10 mL、50 mmol/L、pH=8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤3次,最后用25 mL、50 mmol/L、pH=8.5的甘氨酸缓冲液将沉淀物重悬,即为抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒悬浊液;
所述抗氯氮平特异性抗体3的制备方法,包含以下步骤:
a. 将氯氮平人血清白蛋白免疫原用PBS缓冲液稀释至2.0-5.0 mg/ml,得到抗原溶液,然后将2.0-5.0 ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;
b. 1-4周后,再用2.0-5.0 ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔1-4周注射一次,共计注射3-8次;
c.对免疫后的实验动物取血,分离纯化抗血清,得到抗氯氮平特异性抗体3。
所述的氯氮平人血清白蛋白免疫原的制备方法,包含以下步骤:
a.称取2.0-5.0 g磷酸二氢钾、3.0-6.0 g磷酸氢二钠、7.5-15.0 g氯化钠、1.0-2.5 g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5 L去离子水中,调节pH至7.8-8.3,制成缓冲溶液F;
b.称取3.0-6.0 mg人血清白蛋白,0-8℃下溶解于3.0-6.0 ml上述缓冲溶液F中,制成人血清白蛋白载体溶液;
c.称取3.0-8.0 mg上述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800 μl上述缓冲溶液F中,制成氯氮平衍生物溶液F;
d.当上述氯氮平衍生物溶液F刚变澄清时,将其逐滴加入上述人血清白蛋白载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液F进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平人血清白蛋白免疫原溶液,在氯氮平人血清白蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于-20℃下储存。
所述的氯氮平胶乳增强免疫比浊检测试剂的使用方法与上述的氯氮平均相酶免疫检验试剂的使用方法基本相同。
所述的校准品是由浓度分别为0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、1600ng/ml的氯氮平,质量分数为0.1-1.0%的氯化钠、0.2-2.0%的牛血清白蛋白、0.25-1.5%的乙二胺四乙酸、0.01%-0.1%的乙基汞硫代硫酸钠,50mmol/L pH=7.2的Tris-HCl缓冲液组成的一组校准品。
本发明利用一种新型氯氮平衍生物研制的系列抗氯氮平特异性抗体可以用于制备多种灵敏度高、特异性强、检测效果好的氯氮平免疫检验试剂。本发明还提供了3种氯氮平免疫检验试剂的制备方法及相应的使用方法。本发明提供的3种氯氮平免疫检测方法操作方便、检测快速、结果准确、灵敏度高、特异性强,能够对人体血清、血浆等样本中的氯氮平含量进行定量检测。克服了现有技术中氯氮平检测方法存在的操作复杂、自动化程度低等缺陷,能有效指导临床个体化合理用药。
附图说明
图1是氯氮平均相酶免疫检测试剂的校准曲线;
图2是氯氮平ELISA检测试剂的校准曲线;
图3是氯氮平胶乳增强免疫比浊检测试剂的校准曲线。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施方式,对本发明做进一步描述,这些附图均为简化的示意图,仅以示意方式说明本发明的基本结构,因此其仅显示与本发明有关的构成。除非特别指明,以下实施例中所用的试剂、仪器、设备、耗材均可从正规渠道商购买获得。
实施例1. 氯氮平衍生物的合成
氯氮平衍生物的化学结构如式Ⅰ所示:
式Ⅰ。
上述氯氮平衍生物的合成方法的具体路线如下所示:
具体的合成步骤如下:
1.化合物2的合成
在50 mL DMF中加入3.44 g t-BuOK和5 g化合物1制成悬浮液,然后将3.5g 5-溴戊酸乙酯溶解于50 mL DMF制成5-溴戊酸乙酯溶液,再将5-溴戊酸乙酯溶液逐滴加入上述悬浮液中制成反应液,将此反应液在室温下搅拌过夜,然后用饱和NH4Cl水溶液将反应液中的混合物淬熄,反应后所得溶液用150 mL EA进行萃取,重复3次,将有机层合并后用100 mL卤水冲洗干净,重复2次,用Na2SO4干燥,在真空中浓缩,得到的粗产物经D/M=100:1洗脱的硅胶柱进行纯化,得到3.2 g黄色油状化合物2,产率80%。
2.化合物3的合成
将3.2 g化合物2与564 mg氢氧化钠一起溶解于由20 mL THF与10 mL H2O共同组成的溶剂中制成反应液,将此反应液加热回流过夜,用6mol/L的HCl将上述反应液的pH值调节至2,然后将反应液用150 mL EA进行萃取,重复3次,将萃取得到的水相在真空中浓缩,得到4g黄色固体状化合物3粗品。
3.化合物4的合成
将1 g化合物3、2.6 g HATU及900 mg DIEA共同溶解于20 mL的DMF中制成反应液,然后将此反应液在室温下搅拌5小时,再将563mg叔丁基2-氨基乙基氨基甲酸酯加入上述反应液中,再将反应液在室温下搅拌1.5小时,搅拌结束后用纯化水将反应液中的混合物淬熄,反应后所得溶液用50 mL EA萃取,重复3次,将有机层合并后用100 mL卤水冲洗干净,重复3次,通过Na2SO4干燥,并在真空中浓缩,得到的粗产物经硅胶柱纯化,得到900 mg黄色固体状化合物4,产率:69%。
4.化合物5的合成
将6 g化合物4溶解于由20 mL TFA与100 mL DCM组成的溶剂中制成反应液,然后将此溶液在室温下搅拌1小时,搅拌结束后用纯化水将反应液中的混合物淬熄,然后用150 mLDCM萃取,重复3次,再用1mol/L NaOH溶液将萃取所得水相的pH值调节到8,再用150 mL DCM进行萃取,重复3次,将得到的有机相在真空中浓缩,得到1.5 g黄色固体状化合物5 ,产率97%。
5.氯氮平衍生物的合成
在10ml DCM中加入314 mg呋喃- 2,5 -二酮制成悬浮液,然后将由1.5 g化合物5溶解于30 mL DCM中制成的溶液在5℃下逐滴加入上述悬浮液中,制成反应液,将此反应液在室温下搅拌2小时,将搅拌后所得溶液在真空中浓缩,然后用乙酸酐稀释浓缩产物制成反应混合物,将此反应混合物在130°C下搅拌1小时,然后用纯化水淬熄,得到的溶液用150 mL EA萃取,重复3次,将萃取得到的有机层合并后用100 mL Na2CO3饱和水溶液冲洗,重复5次,再将有机层用100 mL卤水洗涤,重复2次,通过Na2SO4进行干燥,在真空中浓缩,得到的粗产物经D/M=50:1洗脱的硅胶柱进行纯化,得到600 mg黄色固体状的氯氮平衍生物,产率96%。
利用Bruker Avance III plus 400 MHz和VARIAN MERCURY plus 300M对上述黄色固体氯氮平衍生物进行核磁共振光谱扫描,采用TMS作为内标,结果如下:1H-NMR (400MHz, DMSO_d6): 1.46-1.54 (4H, m), 1.90-1.94 (2H, m), 2.19 (3H, s), 2.30 -2.32(2H, t), 2.41 (2H, s), 3.12-3.17 (2H, m), 3.32 (4H, m), 3.38-3.46 (4H, m),3.66-3.69 (1H, m), 6.88-6.97 (4H, m), 7.11-7.22 (3H, m), 7.42-7.46 (1H, m),7.80-7.83 (1H, m)。
采用质谱技术对得到的氯氮平衍生物进行分析鉴定,结果显示:MS Calcd.:548;MS Found: 549 (M+1)。
实施例2. 氯氮平均相酶免疫检测试剂的制备
氯氮平均相酶免疫检测试剂的制备方法,具体步骤如下:
(1)将0.25%牛血清白蛋白、50mmol/L葡萄糖-6-磷酸及50mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型依次加入50mmol/L Tris缓冲液中搅拌溶解制成R1缓冲液,再将抗氯氮平特异性抗体1以1∶1500的体积比加入到上述R1缓冲液中混匀,再用6 mol/L的盐酸调节pH至8.0,制成R1试剂;
(2)将0.25%牛血清白蛋白加入100mmol/L Tris缓冲液中搅拌溶解制成R2缓冲液,再将氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物以1∶3000的体积比加入到上述R2缓冲液中混匀,再用6 mol/L的盐酸调节pH至7.6,制成R2试剂;
所述抗氯氮平特异性抗体1的制备方法,包含以下步骤:
a. 将氯氮平人转铁蛋白免疫原用PBS缓冲液稀释至3.5 mg/ml,得到抗原溶液,然后将3.5 ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;
b. 2周后,再用3.5 ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔2周注射一次,共计注射5次;
c.对免疫后的实验动物取血,分离纯化抗血清,得到抗氯氮平特异性抗体1。
所述的氯氮平人转铁蛋白免疫原的制备方法,包含以下步骤:
a.称取3.25 g磷酸二氢钾、4.5 g磷酸氢二钠、10.5 g氯化钠、1.75 g氯化镁,共同溶解于2.0 L去离子水中,调节pH至8.1,制成缓冲溶液A;
b.称取5.0 mg人转铁蛋白,0-8℃下溶解于5.0 ml上述缓冲溶液A中,制成人转铁蛋白载体溶液;
c.称取7.5 mg上述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于750 μl上述缓冲溶液A中,制成氯氮平衍生物溶液A;
d.当上述氯氮平衍生物溶液A刚变澄清时,将其逐滴加入上述人转铁蛋白载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌6小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液A进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平人转铁蛋白免疫原溶液,在氯氮平人转铁蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.15%的硫柳汞,于-20℃下储存。
所述的氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物的制备方法,包含以下步骤:
a.称取2.25 g磷酸二氢钾、3.45 g磷酸氢二钠、12.5 g氯化钠、1.75 g氯化镁,共同溶解于2.0 L去离子水中,调节pH至7.9,制成缓冲溶液B;
b.称取4.5 mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,0-8℃下溶解于4.5 mL上述缓冲溶液B中,制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液;
c.称取6.25 mg上述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于625 μl上述缓冲溶液B中,制成氯氮平衍生物溶液B;
d.当上述氯氮平衍生物溶液B刚变澄清时,将其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌5小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液B进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物溶液,在氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物溶液中加入质量分数0.75%的BSA和质量分数0.15%的硫柳汞,于0~8℃下储存。
实施例3.氯氮平校准品的制备
将氯氮平纯品粉末分别加入6份浓度为50mmol/L pH=7.2的Tris-HCl缓冲液中,搅拌溶解,至终浓度分别为0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、1600ng/ml,然后在每份溶液中分别加入质量分数为0.5%的氯化钠、1.0%的牛血清白蛋白、0.75%的乙二胺四乙酸、0.05%的叠氮钠,搅拌均匀,即为氯氮平校准品(一组6个浓度)。
实施例4. 氯氮平均相酶免疫检测试剂校准曲线制作及质控实验
1. 制作均相酶免疫检测校准曲线:
在迈瑞 BS480全自动生化分析仪中放入R1试剂、R2试剂及校准品,然后对生化分析仪进行反应参数设置,具体参数详见表1;实际操作过程中需不断调整R1试剂和R2试剂的体积比例,同时调整测光点,最后由生化分析仪自动得出均相酶免疫检测校准曲线,如图1所示。
表1. 迈瑞 BS480全自动生化分析仪反应参数
项目名称 | 氯氮平 |
R1试剂 | 160µl |
R2试剂 | 40µl |
样本量 | 5µl |
定标方法 | 终点法 |
主波长 | 340nm |
次波长 | 405nm |
反应时间 | 10分钟 |
温育时间 | 8分钟 |
反应方向 | 上升 |
结果 | ng/ml |
结果精度 | 0.01 |
拟合方法 | Line graph |
校准品浓度 | 0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、1600ng/ml |
2. 质控实验:
将氯氮平纯品粉末溶解于甲醇中制成1mg/mL 的储存液,并将此储存液稀释于不含氯氮平的健康人血浆中,至终浓度分别为0.00、150.00、600.00、1200.00ng/mL,制成空白、低、中、高浓度的质控样本。利用上述的氯氮平均相酶免疫检测方法,对质控样本进行测定,并根据步骤1中制作的均相酶免疫检测校准曲线,计算每个质控样本中氯氮平的含量,每个质控样本重复测定10次,检测结果及数据分析详见表2。
表2. 氯氮平均相酶免疫检验试剂检测结果及数据分析
质控样品 | 空白 | 低 | 中 | 高 |
样品浓度 (ng/ml) | 0.00 | 150.00 | 600.00 | 1200.00 |
测试1 | 0.00 | 152.52 | 605.08 | 1216.27 |
测试2 | 0.00 | 150.79 | 607.77 | 1193.91 |
测试3 | 0.00 | 149.88 | 603.99 | 1207.80 |
测试4 | 0.00 | 148.49 | 606.25 | 1211.26 |
测试5 | 0.00 | 152.00 | 595.81 | 1189.09 |
测试6 | 0.00 | 151.85 | 599.46 | 1210.33 |
测试7 | 0.00 | 153.30 | 593.18 | 1202.14 |
测试8 | 0.00 | 149.03 | 598.76 | 1195.50 |
测试9 | 0.00 | 150.26 | 600.16 | 1192.72 |
测试10 | 0.00 | 148.87 | 597.64 | 1206.98 |
平均值(ng/ml) | 0.00 | 150.70 | 600.81 | 1202.60 |
标准差(SD) | / | 1.67 | 4.79 | 9.27 |
精密度(CV%) | / | 1.11 | 0.80 | 0.77 |
回收率(%) | / | 100.47 | 100.14 | 100.22 |
实验结果表明:测定不同浓度质控样品中氯氮平含量的CV值均低于5%,回收率均在95%-105%之间,说明本发明的氯氮平均相酶免疫检测试剂测定生物样本中氯氮平含量的精密度较高,结果准确。
实施例5. 氯氮平 ELISA检测试剂中关键组分的制备
(1)抗氯氮平特异性抗体2的制备方法,包含以下步骤:
a. 将氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原用PBS缓冲液稀释至3.75 mg/ml,得到抗原溶液,然后将3.75 ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;
b. 3周后,再用3.75 ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔3周注射一次,共计注射6次;
c.对免疫后的实验动物取血,分离纯化抗血清,得到抗氯氮平特异性抗体2。
所述的氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原的制备方法,包含以下步骤:
a.称取3.8 g磷酸二氢钾、5.2 g磷酸氢二钠、9.0 g氯化钠、1.8 g氯化镁,共同溶解于2.0 L去离子水中,调节pH至8.0,制成缓冲溶液C;
b.称取5.2 mg人甲状腺球蛋白,0-8℃下溶解于5.2 ml上述缓冲溶液C中,制成人甲状腺球蛋白载体溶液;
c.称取6.8 mg上述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于680 μl上述缓冲溶液C中,制成氯氮平衍生物溶液C;
d.当上述氯氮平衍生物溶液C刚变澄清时,将其逐滴加入上述人甲状腺球蛋白载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌8小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液C进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原溶液,在氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.15%的硫柳汞,于-20℃下储存。
(2)氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物的制备方法,包含以下步骤:
a.称取2.6 g磷酸二氢钾、4.2 g磷酸氢二钠、12.0 g氯化钠、2.4 g氯化镁,共同溶解于2.0 L去离子水中,调节pH至7.9,制成缓冲溶液D;
b.称取4.0 mg辣根过氧化物酶,0-8℃下溶解于4.0 mL上述缓冲溶液D中,制成辣根过氧化物酶溶液;
c.称取6.0 mg上述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于600 μl上述缓冲溶液B中,制成氯氮平衍生物溶液D;
d.当上述氯氮平衍生物溶液D刚变澄清时,将其逐滴加入上述辣根过氧化物酶溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌5小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液D进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物溶液,在氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物溶液中加入质量分数0.75%的BSA和质量分数0.15%的硫柳汞,于0~8℃下储存。
实施例6.氯氮平 ELISA检测试剂性能评估实验
1.氯氮平 ELISA检测校准曲线的制作
(a)将抗氯氮平特异性抗体2用磷酸盐缓冲液按1∶10000的比例进行稀释,制成抗体溶液,将抗体溶液按 100μL/孔的用量包被在96孔酶联板上,4℃过夜;
(b)用磷酸盐缓冲液洗涤3次后,加入200μL/孔的0.5%的牛血清白蛋白溶液,4℃封闭过夜,磷酸盐缓冲液洗涤3次;
(c)加入20μL/孔的校准品;
(d)加入100μL/孔工作浓度的氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物;
(e)室温下孵育30分钟,磷酸盐缓冲液洗板5次;
(f)每孔加入100μL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺,室温孵育30分钟;
(g)每孔加入100μL 的浓度为2mol/L的硫酸,终止反应;
(h)使用酶标仪测定450nm波长的吸光值;
(i)根据不同浓度校准品的吸光值制作校准曲线,如图2所示。
2.质控实验
将氯氮平纯品粉末溶解于甲醇中制成1mg/mL 的储存液,并将此储存液稀释于不含氯氮平的健康人血浆中,至终浓度分别为0.00、150.00、600.00、1200.00ng/mL,制成空白、低、中、高浓度的质控样本。利用上述的氯氮平ELISA检测方法,测定上述空白、低、中、高浓度的质控样本在450nm 的吸光值。对照图2所示的氯氮平ELISA检测的校准曲线,计算每个质控样本中氯氮平的含量,每个质控样本重复测定3次,根据测定结果计算回收率,检测数据详见表3。
表3. 氯氮平 ELISA检测试剂性能评估数据
质控样品 | 空白 | 低 | 中 | 高 |
样品浓度(ng/mL) | 0.00 | 150.00 | 600.00 | 1200.00 |
测试1 | 0.00 | 150.34 | 585.52 | 1222.35 |
测试2 | 0.00 | 150.79 | 594.00 | 1213.70 |
测试3 | 0.00 | 152.16 | 603.68 | 1225.22 |
平均值(ng/mL) | 0.00 | 151.10 | 594.40 | 1220.42 |
回收率(%) | / | 100.73 | 99.06 | 101.70 |
实验结果显示:本发明氯氮平ELISA检测试剂测定不同浓度样品中氯氮平含量的回收率都在95%-105%的范围之内,说明本发明的氯氮平ELISA检测试剂测定生物样本中氯氮平含量的准确度较高。
实施例7.氯氮平胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备
氯氮平胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法,包含以下步骤:
(1)将浓度为1.25 mg/mL的氯氮平-人纤维蛋白原偶联物溶解于浓度为50 mmol/L、pH值为7.6的Tirs-HCl缓冲液中,然后添加质量分数为0.12%的牛血清白蛋白、0.55%的氯化钠、0.25%的吐温-20、3.0%的丙三醇、0.75%的乙二胺四乙酸、2.25%的PEG-8000以及0.05%的乙基汞硫代硫酸钠,搅拌均匀,调节pH=7.5,制成L1试剂;
(2)将质量分数为0.5%的抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒加入浓度为80 mmol/L的硼酸盐缓冲液中,然后添加质量分数为1.25%的牛血清白蛋白、0.45%的氯化钠、0.25%的吐温-20、3.0%的丙三醇、0.65%的乙二胺四乙酸二钠、0.5%的Triton X-100以及0.05%的乙基汞硫代硫酸钠,搅拌均匀,制成L2试剂;
所述的氯氮平-人纤维蛋白原偶联物的制备方法,包含以下步骤:
a.称取4.1 g磷酸二氢钾、3.9 g磷酸氢二钠、11.6 g氯化钠、1.8 g氯化镁,共同溶解于2.0 L去离子水中,调节pH至8.0,制成缓冲溶液E;
b.称取5.0 mg人纤维蛋白原,0-8℃下溶解于5.0 ml上述缓冲溶液E中,制成人纤维蛋白原载体溶液;
c.称取6.5 mg上述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于650 μl上述缓冲溶液E中,制成氯氮平衍生物溶液E;
d.当上述氯氮平衍生物溶液E刚变澄清时,将其逐滴加入上述人纤维蛋白原载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液E进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平-人纤维蛋白原偶联物溶液,在氯氮平-人纤维蛋白原偶联物溶液中加入质量分数0.15%的硫柳汞,于-20℃下储存。
所述的抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒的制备方法,包含以下步骤:
a.将1.2 mg直径为250 nm的聚苯乙烯胶乳颗粒加入3.6 mL、0.08mol/L、pH=6.2的MES缓冲液中,然后加入5.0 mg碳二亚胺与2.5 mgN-羟基琥珀酰亚胺,在37℃下搅拌1小时,15000 r/min离心15分钟后去除上清液,然后用15 ml浓度为0.1mol/L、PH=8.2的磷酸盐缓冲液将沉淀物重悬,制成胶乳颗粒溶液;
b.将1.0 mg抗氯氮平特异性抗体3用3.0 mL、0.1mol/L、pH=8.2的硼酸盐缓冲液稀释后,立即加入到上述胶乳颗粒溶液中,在37℃下振荡反应12小时,然后加入3.0 mL、0.1mol/L、pH=8.5的甘氨酸缓冲液搅拌2小时,反应结束后加入1.0 mg牛血清白蛋白,搅拌均匀后室温静置12小时,然后9000 r/mim离心15分钟,去除上清液,再将沉淀物用10 mL、50mmol/L、pH=8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤3次,最后用25 mL、50 mmol/L、pH=8.5的甘氨酸缓冲液将沉淀物重悬,即为抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒悬浊液;
所述抗氯氮平特异性抗体3的制备方法,包含以下步骤:
a. 将氯氮平人血清白蛋白免疫原用PBS缓冲液稀释至4.0 mg/ml,得到抗原溶液,然后将4.0 ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;
b. 3周后,再用4.0 ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔4周注射一次,共计注射5次;
c.对免疫后的实验动物取血,分离纯化抗血清,得到抗氯氮平特异性抗体3。
所述的氯氮平人血清白蛋白免疫原的制备方法,包含以下步骤:
a.称取3.75 g磷酸二氢钾、4.25 g磷酸氢二钠、12.5 g氯化钠、1.65 g氯化镁,共同溶解于2.0 L去离子水中,调节pH至8.0,制成缓冲溶液F;
b.称取6.0 mg人血清白蛋白,0-8℃下溶解于6.0 ml上述缓冲溶液F中,制成人血清白蛋白载体溶液;
c.称取4.0 mg上述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于400 μl上述缓冲溶液F中,制成氯氮平衍生物溶液F;
d.当上述氯氮平衍生物溶液F刚变澄清时,将其逐滴加入上述人血清白蛋白载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌7小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液F进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平人血清白蛋白免疫原溶液,在氯氮平人血清白蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.15%的硫柳汞,于-20℃下储存。
实施例8.氯氮平胶乳增强免疫比浊检测试剂校准曲线制作及质控实验
1. 制作胶乳增强免疫比浊检测试剂校准曲线:
在奥林巴斯AU480全自动生化分析仪中放入R1试剂、R2试剂及校准品,然后对生化分析仪进行反应参数设置,具体参数详见表4;实际操作过程中需不断调整R1试剂和R2试剂的体积比例,同时调整测光点,最后由生化分析仪自动得出胶乳增强免疫比浊检测校准曲线,如图3所示。
表4. 奥林巴斯AU480全自动生化分析仪反应参数
项目名称 | 氯氮平 |
R1试剂 | 200µl |
R2试剂 | 50µl |
样本量 | 10µl |
定标方法 | 终点法 |
主波长 | 570nm |
次波长 | 412nm |
反应时间 | 10分钟 |
温育时间 | 8分钟 |
反应方向 | 下降 |
结果 | ng/ml |
结果精度 | 0.01 |
拟合方法 | logit-log(5p) |
校准品浓度 | 0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、1600ng/ml |
2. 质控实验:
将氯氮平纯品粉末溶解于甲醇中制成1mg/mL 的储存液,并将此储存液稀释于不含氯氮平的健康人血浆中,至终浓度分别为0.00、150.00、600.00、1200.00ng/mL,制成空白、低、中、高浓度的质控样本。利用上述的胶乳增强免疫比浊检测方法,对质控样本进行测定,并根据步骤1中制作的胶乳增强免疫比浊检测校准曲线,计算每个质控样本中氯氮平的含量,每个质控样本重复测定10次,检测结果及数据分析详见表5。
表5. 氯氮平胶乳增强免疫比浊试剂检测结果及数据分析
质控样品 | 空白 | 低 | 中 | 高 |
样品浓度 (ng/ml) | 0.00 | 150.00 | 600.00 | 1200.00 |
测试1 | 0.00 | 152.36 | 602.15 | 1216.09 |
测试2 | 0.00 | 154.78 | 605.93 | 1223.45 |
测试3 | 0.00 | 149.29 | 603.26 | 1182.26 |
测试4 | 0.00 | 150.20 | 606.01 | 1208.43 |
测试5 | 0.00 | 153.80 | 596.83 | 1199.18 |
测试6 | 0.00 | 154.90 | 597.95 | 1210.94 |
测试7 | 0.00 | 150.11 | 603.78 | 1203.50 |
测试8 | 0.00 | 151.87 | 605.92 | 1195.82 |
测试9 | 0.00 | 148.43 | 600.08 | 1238.75 |
测试10 | 0.00 | 153.69 | 607.39 | 1211.00 |
平均值(ng/ml) | 0.00 | 151.94 | 602.94 | 1208.91 |
标准差(SD) | / | 2.34 | 3.64 | 15.48 |
精密度(CV%) | / | 1.54 | 0.60 | 1.28 |
回收率(%) | / | 101.29 | 100.49 | 100.74 |
实验结果表明:测定不同浓度质控样品中氯氮平含量的CV值均低于5%,回收率均在95%-105%之间,说明本发明的氯氮平胶乳增强免疫比浊检测试剂测定生物样本中氯氮平含量的精密度较高,结果准确。
以上述依据本发明的理想实施例为启示,通过上述的说明内容,相关技术人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内,进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容,必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (10)
3.一种氯氮平均相酶免疫检测试剂,其特征在于,由R1试剂与R2试剂组成,所述R1试剂包含抗氯氮平特异性抗体1与R1缓冲液,所述R2试剂包含氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物与R2缓冲液;所述抗氯氮平特异性抗体1为氯氮平人转铁蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体;所述的氯氮平人转铁蛋白免疫原,由权利要求1所述的氯氮平衍生物与人转铁蛋白偶联而成,其结构式如式Ⅱ所示:
式Ⅱ;
所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种;
所述的R1缓冲液含有酶底物、辅酶、牛血清白蛋白及Tris缓冲液,所述的酶底物为葡萄糖-6-磷酸,所述的辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型;
所述的氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物由权利要求1所述的氯氮平衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联而成;其结构式如式Ⅲ所示:
式Ⅲ;
所述的R2缓冲液为含有牛血清白蛋白的Tris缓冲液。
4.一种如权利要求3所述的氯氮平均相酶免疫检测试剂的制备方法,其特征在于,所述的制备方法包含以下步骤:
(1)将0.25%牛血清白蛋白、50mmol/L葡萄糖-6-磷酸及50mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型依次加入50mmol/L Tris缓冲液中搅拌溶解制成R1缓冲液,再将抗氯氮平特异性抗体1以1∶500-1∶5000的体积比加入到上述R1缓冲液中混匀,再用6 mol/L的盐酸调节pH至8.0,制成R1试剂;
(2)将0.25%牛血清白蛋白加入100mmol/L Tris缓冲液中搅拌溶解制成R2缓冲液,再将氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物以1∶1000-1∶8000的体积比加入到上述R2缓冲液中混匀,再用6 mol/L的盐酸调节pH至7.6,制成R2试剂;
所述抗氯氮平特异性抗体1的制备方法,包含以下步骤:
a. 将氯氮平人转铁蛋白免疫原用PBS缓冲液稀释至2.0-5.0 mg/ml,得到抗原溶液,然后将2.0-5.0 ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;
b. 1-4周后,再用2.0-5.0 ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔1-4周注射一次,共计注射3-8次;
c.对免疫后的实验动物取血,分离纯化抗血清,得到抗氯氮平特异性抗体1;
所述的氯氮平人转铁蛋白免疫原的制备方法,包含以下步骤:
a.称取2.0-5.0 g磷酸二氢钾、3.0-6.0 g磷酸氢二钠、7.5-15.0 g氯化钠、1.0-2.5 g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5 L去离子水中,调节pH至7.8-8.3,制成缓冲溶液A;
b.称取3.0-6.0 mg人转铁蛋白,0-8℃下溶解于3.0-6.0 ml上述缓冲溶液A中,制成人转铁蛋白载体溶液;
c.称取3.0-8.0 mg权利要求1所述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800 μl上述缓冲溶液A中,制成氯氮平衍生物溶液A;
d.当上述氯氮平衍生物溶液A刚变澄清时,将其逐滴加入上述人转铁蛋白载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液A进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平人转铁蛋白免疫原溶液,在氯氮平人转铁蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于-20℃下储存;
所述的氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物的制备方法,包含以下步骤:
a.称取1.0-3.0 g磷酸二氢钾、1.0-5.0 g磷酸氢二钠、7.5-15.0 g氯化钠、1.0-3.0 g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5 L去离子水中,调节pH至7.8-8.3,制成缓冲溶液B;
b.称取3.0-6.0 mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,0-8℃下溶解于3.0-6.0 mL上述缓冲溶液B中,制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液;
c.称取3.0-8.0 mg权利要求1所述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800 μl上述缓冲溶液B中,制成氯氮平衍生物溶液B;
d.当上述氯氮平衍生物溶液B刚变澄清时,将其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液B进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物溶液,在氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物溶液中加入质量分数0.5-1.0%的BSA和质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于0~8℃下储存。
5.一种如权利要求3所述的氯氮平均相酶免疫检测试剂的使用方法,其特征在于,包括以下操作步骤:
(1)在全自动生化分析仪中加入校准品、R1试剂,混匀,37℃温育3-5分钟;加入R2试剂,混匀,37℃恒温5-10分钟后,340nm主波长/405nm次波长进行检测,连续监测3分钟内的吸光度变化率,由全自动生化分析仪制作校准曲线;
(2)在全自动生化分析仪中加入待测样本、R1试剂,混匀,37℃温育3-5分钟;加入R2试剂,混匀,37℃恒温5-10分钟后,340nm主波长/405nm次波长进行检测,连续监测3分钟内的吸光度变化率,由全自动生化分析仪根据步骤(一)中制作的校准曲线自动计算待测样本中氯氮平的含量;
所述试剂R1与试剂R2按1:1~4:1的体积比使用;所述的待测样本为血清、血浆、尿液、唾液、组织液或脑脊液中的任意一种。
6.一种氯氮平ELISA检测试剂,其特征在于,该检测试剂含有:抗氯氮平特异性抗体2、氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物及反应底物;
所述抗氯氮平特异性抗体2为氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体;所述的氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原,由权利要求1所述的氯氮平衍生物与人甲状腺球蛋白偶联而成,其结构式如式Ⅳ所示:
式Ⅳ;
所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种;
所述的氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物由权利要求1所述的氯氮平衍生物与辣根过氧化物酶偶联而成;其结构式如式Ⅴ所示:
式Ⅴ;
所述的反应底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺;
所述抗氯氮平特异性抗体2的制备方法,包含以下步骤:
a. 将氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原用PBS缓冲液稀释至2.0-5.0 mg/ml,得到抗原溶液,然后将2.0-5.0 ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;
b. 1-4周后,再用2.0-5.0 ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔1-4周注射一次,共计注射3-8次;
c.对免疫后的实验动物取血,分离纯化抗血清,得到抗氯氮平特异性抗体2;
所述的氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原的制备方法,包含以下步骤:
a.称取2.0-5.0 g磷酸二氢钾、3.0-6.0 g磷酸氢二钠、7.5-15.0 g氯化钠、1.0-2.5 g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5 L去离子水中,调节pH至7.8-8.3,制成缓冲溶液C;
b.称取3.0-6.0 mg人甲状腺球蛋白,0-8℃下溶解于3.0-6.0 ml上述缓冲溶液C中,制成人甲状腺球蛋白载体溶液;
c.称取3.0-8.0 mg权利要求1所述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800 μl上述缓冲溶液C中,制成氯氮平衍生物溶液C;
d.当上述氯氮平衍生物溶液C刚变澄清时,将其逐滴加入上述人甲状腺球蛋白载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液C进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原溶液,在氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于-20℃下储存;
所述的氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物的制备方法,包含以下步骤:
a.称取1.0-3.0 g磷酸二氢钾、1.0-5.0 g磷酸氢二钠、7.5-15.0 g氯化钠、1.0-3.0 g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5 L去离子水中,调节pH至7.8-8.3,制成缓冲溶液D;
b.称取3.0-6.0 mg辣根过氧化物酶,0-8℃下溶解于3.0-6.0 mL上述缓冲溶液D中,制成辣根过氧化物酶溶液;
c.称取3.0-8.0 mg权利要求1所述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800 μl上述缓冲溶液B中,制成氯氮平衍生物溶液D;
d.当上述氯氮平衍生物溶液D刚变澄清时,将其逐滴加入上述辣根过氧化物酶溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液D进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物溶液,在氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物溶液中加入质量分数0.5-1.0%的BSA和质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于0~8℃下储存。
7.一种如权利要求6所述的氯氮平ELISA检测试剂的使用方法,其特征在于,包括以下操作步骤:
(a)将抗氯氮平特异性抗体2用磷酸盐缓冲液按1∶1000-1∶20000的比例进行稀释,制成抗体溶液,将抗体溶液按 100μL/孔的用量包被在96孔酶联板上,4℃过夜;
(b)用磷酸盐缓冲液洗涤3次后,加入200μL/孔的0.5%的牛血清白蛋白溶液,4℃封闭过夜,磷酸盐缓冲液洗涤3次;
(c)加入20μL/孔的校准品及待测样本;
(d)加入100μL/孔工作浓度的氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物;
(e)室温下孵育30分钟,磷酸盐缓冲液洗板5次;
(f)每孔加入100μL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺,室温孵育30分钟;
(g)每孔加入100μL 的浓度为2mol/L的硫酸,终止反应;
(h)使用酶标仪测定450nm波长的吸光值;
(i)根据不同浓度校准品的吸光值制作校准曲线,并根据校准曲线与待测样本的吸光值计算待测样本中氯氮平的含量;
所述的待测样本为血清、血浆、尿液、唾液、组织液或脑脊液中的任意一种。
8.一种氯氮平胶乳增强免疫比浊检测试剂,其特征在于,包括:L1试剂与L2试剂;
所述L1试剂由氯氮平-人纤维蛋白原偶联物和L1缓冲液组成,所述L2试剂由抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒和L2缓冲液组成;
所述的氯氮平-人纤维蛋白原偶联物由权利要求1所述的氯氮平衍生物与人纤维蛋白原偶联而成,其结构式如式Ⅵ所示:
式Ⅵ;
所述L1缓冲液为含有牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸、PEG-8000、乙基汞硫代硫酸钠的Tirs-HCl缓冲液;
所述的抗氯氮平特异性抗体3为氯氮平人血清白蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体;所述的氯氮平人血清白蛋白免疫原,由权利要求1所述的氯氮平衍生物与人血清白蛋白偶联而成,其结构式如式Ⅶ所示:
式Ⅶ;
所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种;
所述胶乳颗粒为表面带有羧基、氨基、羟基、酰肼基或氯甲基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒,直径范围为50-450nm;
所述L2缓冲液为含有牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸二钠、Triton X-100、乙基汞硫代硫酸钠的硼酸盐缓冲液。
9.一种如权利要求8所述的氯氮平胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法,其特征在于,所述的制备方法包含以下步骤:
(1)将浓度为0.05-2 mg/mL的氯氮平-人纤维蛋白原偶联物溶解于浓度为10-100mmol/L、pH值为7.0-8.0的Tirs-HCl缓冲液中,然后添加质量分数为0.1%-2.0%的牛血清白蛋白、0.25%-1.0%的氯化钠、0.1%-0.5%的吐温-20、1.0%-5.0%的丙三醇、0.1%-1.0%的乙二胺四乙酸、1.0%-5.0%的PEG-8000以及0.01%-0.1%的乙基汞硫代硫酸钠,搅拌均匀,调节pH=7.5,制成L1试剂;
(2)将质量分数为0.05-1.0%的抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒加入浓度为20-100 mmol/L的硼酸盐缓冲液中,然后添加质量分数为0.1%-2.5%的牛血清白蛋白、0.25%-1.0%的氯化钠、0.1%-0.5%的吐温-20、1.0%-5.0%的丙三醇、0.1%-1.0%的乙二胺四乙酸二钠、0.1-1.0%的Triton X-100以及0.01%-0.1%的乙基汞硫代硫酸钠,搅拌均匀,制成L2试剂;
所述的氯氮平-人纤维蛋白原偶联物的制备方法,包含以下步骤:
a.称取2.0-5.0 g磷酸二氢钾、3.0-6.0 g磷酸氢二钠、7.5-15.0 g氯化钠、1.0-2.5 g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5 L去离子水中,调节pH至7.8-8.3,制成缓冲溶液E;
b.称取3.0-6.0 mg人纤维蛋白原,0-8℃下溶解于3.0-6.0 ml上述缓冲溶液E中,制成人纤维蛋白原载体溶液;
c.称取3.0-8.0 mg权利要求1所述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800 μl上述缓冲溶液E中,制成氯氮平衍生物溶液E;
d.当上述氯氮平衍生物溶液E刚变澄清时,将其逐滴加入上述人纤维蛋白原载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液E进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平-人纤维蛋白原偶联物溶液,在氯氮平-人纤维蛋白原偶联物溶液中加入质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于-20℃下储存;
所述的抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒的制备方法,包含以下步骤:
a.将0.5-1.5 mg直径为50-450 nm的聚苯乙烯胶乳颗粒加入1.5-4.5 mL、0.08mol/L、pH=6.2的MES缓冲液中,然后加入5.0 mg碳二亚胺与2.5 mgN-羟基琥珀酰亚胺,在37℃下搅拌1小时,15000 r/min离心15分钟后去除上清液,然后用15 ml浓度为0.1 mol/L、PH=8.2的磷酸盐缓冲液将沉淀物重悬,制成胶乳颗粒溶液;
b.将0.5-1.5 mg抗氯氮平特异性抗体3用1.5-4.5 mL、0.1mol/L、pH=8.2的硼酸盐缓冲液稀释后,立即加入到上述胶乳颗粒溶液中,在37℃下振荡反应12小时,然后加入1.0-3.0mL、0.1 mol/L、pH=8.5的甘氨酸缓冲液搅拌2小时,反应结束后加入0.5-1.5 mg牛血清白蛋白,搅拌均匀后室温静置12小时,然后9000 r/mim离心15分钟,去除上清液,再将沉淀物用10 mL、50 mmol/L、pH=8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤3次,最后用25 mL、50 mmol/L、pH=8.5的甘氨酸缓冲液将沉淀物重悬,即为抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒悬浊液;
所述抗氯氮平特异性抗体3的制备方法,包含以下步骤:
a. 将氯氮平人血清白蛋白免疫原用PBS缓冲液稀释至2.0-5.0 mg/ml,得到抗原溶液,然后将2.0-5.0 ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;
b. 1-4周后,再用2.0-5.0 ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔1-4周注射一次,共计注射3-8次;
c.对免疫后的实验动物取血,分离纯化抗血清,得到抗氯氮平特异性抗体3;
所述的氯氮平人血清白蛋白免疫原的制备方法,包含以下步骤:
a.称取2.0-5.0 g磷酸二氢钾、3.0-6.0 g磷酸氢二钠、7.5-15.0 g氯化钠、1.0-2.5 g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5 L去离子水中,调节pH至7.8-8.3,制成缓冲溶液F;
b.称取3.0-6.0 mg人血清白蛋白,0-8℃下溶解于3.0-6.0 ml上述缓冲溶液F中,制成人血清白蛋白载体溶液;
c.称取3.0-8.0 mg权利要求1所述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800 μl上述缓冲溶液F中,制成氯氮平衍生物溶液F;
d.当上述氯氮平衍生物溶液F刚变澄清时,将其逐滴加入上述人血清白蛋白载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液F进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平人血清白蛋白免疫原溶液,在氯氮平人血清白蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于-20℃下储存。
10.根据权利要求5或7中任一项所述的校准品,其特征在于,所述校准品是由浓度分别为0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、1600ng/ml的氯氮平,质量分数为0.1-1.0%的氯化钠、0.2-2.0%的牛血清白蛋白、0.25-1.5%的乙二胺四乙酸、0.01%-0.1%的乙基汞硫代硫酸钠,50mmol/L pH=7.2的Tris-HCl缓冲液组成的一组校准品。
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