SE436522B - Homogen specifik bindningsanalys - Google Patents

Description

“WÛ5511-:f-1 ' 2 Den först upptäckta typen av högkänslig specifik bindnings- analys var radioimmunoanalys, vid vilken man använder en radioisotcp såsom mårkningskomponent. En dylik analys måste nödvändigtvis genom- föras heterogent, eftersom mårkningssubstansens bestämningsbara egen- skap är densamma i både den fria formen och den bundna formen. På grundav olägenheterna och svårigheterna att hantera radioaktiva mate- rial har man utvecklat mânga nya analyssystem, vilka utnyttjar andra ämnen än radioisotoper såsom märkningskomponenter, t.ex. enzym, fluo- rescerande molekyler, bakteriofager, metallkomplex och metallorganiska komplrx, kounzym, enzymsubstrat, enzymínhibitorer, cykliska reaktions- komponenter och kemiluminiscens-substanser.

Flera olika heterogena bindningsreaktionssystem, vari ett en- zym användes såsom märkningskomponent, beskrives i de amerikanska pa- tentskrifterna 3 65Ä 090, 3 791 932, 3 839 153, 3 850-752 och 3 879 262 samt i J. Immunol. Methods 1:2ü7 (1972) och J; Immunol. 109:129 (1972). En heterogen bindningsanalys utnyttjande en icke ak- tiv prekursor av en spektrofotometriskt påvisbar substans såsom märk- ningssubstans beskrives i den amerikanska patentskriften 3 880 934.

Heterogena analyser beskrives dessutom i Principles of Competitive Protein-Bindning Assays, Odell och Daughaday (J.B. Líppincott Co., Philidelphia, 1972).

En immunoanalys av homogen typ utnyttjande enzym såsom märk- ningssubstans beskrivs i m¶1amerikanska patentskríften 3 817 83U.

Vid denna analys användes ett ligand-enzym-konjugat. Konjugatets bundna form har en mätbart lägre enzymatisk aktivitet än konjugatets fria form, vilket möjliggör en analys av homogen typ. I tysk Offen- legungsschrift 2 618 H19 och tysk Offenlegungsschrift 2 618 511 be- skrives användning av speciella ämnen såsom märkningssubstanser, t.ex. koenzymer, kemiluminiscensmolekyler, cykliska reaktionskomponen- ter och spjälkbara fluorescerande enzymsubstrat, vid analyser av såväl homogen som heterogen typ. Även om sökandet efter andra märkningssubstanser än radioiso- toper vid bindningsanalyser har lett fram till ett antal användbara lösningar, föreligger det fortfarande ett behov av förbättringar.

Användning av enzymer såsom märkningssubstanser föreföll först att vara den mest lovande_l§§ningen, men i praktiken har emellertid flera svårigheter visat sig. Enzymers höga molekylvikt och heterologa na- tur skapar problem vid karakterisering, stabilisering och reprodu- cerbar framställning av de märkta konjugaten. Dessa problem har övervunnits genom att enzymerna har ersatts med lågmolekylära märk- ningssubstanser, vilkavkan bestämmas med hjälp av reaktionsaktivitet. '7-'905514-1 3 Högkänsliga och mångsidiga analyser kan-genomföras med användning av dessa nya märkningssubstanser, vilka innefattar koenzym, enzymsubstrat, cykliska reaktionskomponenter och kemiluminiscensmolekyler. Bestäm- ning av dessa märkningssubstanser kräver emellertid ofta användning av sådana instrument som för närvarande icke är vanliga i kliniska laboratorier.

Det är ett huvudändamål med föreliggande uppfinning att åstad- komma en bindningsanalys, vid vilken man icke använder en radioisotop såsom märkningssubstans utan istället en märkningssubstans, vilken kan bestämmas med hjälp av standardutrustning i kliniska laboratorier.

Med hjälp av denna märkningssubstans åstadkommas en känslig och mång- sidig analys, och de märkta konjugaten är lätta att symetisera och karakterisera.

Man har enligt uppfinningen funnit, att en förbättrad specifik bindningsanalys kan åstadkommas genom användning av en specifik rest av en organisk prosufiisk grupp,nämligen flavinadenindinukleotid.såsom märkningskomponent i det märkta konjugatet i kombination med använd- ning av apoglukosoxidas såsom apoenzym. Prostetiska grupper utgör en klass av enzym-kofaktorer. En enzym-kofaktor är en icke-proteinhaltig substans, vars närvaro erfordras för att ett enzym skall uppvisa kata- lytisk aktivitet och vilken undergår en kemisk förändring under en- zymets katalytiska cykel (enzymet kallas moderenzym). Ett koenzym är en typ av enzymkofaktor, som modifieras kemiskt under den reaktion som katalyseras av moderenzymet. Regenerering av kofaktorns ursprung- liga form kräver deltagande i en separat reaktion, vilken katalyseras av ett annat enzym än moderenzymet. En prostetisk grupp är däremot en enzymkofaktor, vilken modifieras kemiskt under den reaktion som katalyseras av moderenzymet och regenereras, dvs. omvandlas, till sin ursprungliga form vid en andra reaktion katalyserad av samma moder- enzym.

Prostetiska grupper kännetecknas vanligen av att de är rela- tivt fast bundna till moderenzymets proteindel. Proteindelen kallas apoenzym, och det katalytiskt aktiva moderenzymet kallas holoenzYm~ Jämviktsreaktionen för växelverkan mellan en prostetlsk grupp och ett apoenzym kan återges på följande sätt: prostïšššk grupp + apäšgšym ï---à konjugerat(š?aX:0eller holoenzym Med termen "konjugerat enzym" avses i föreliggande beskrivning ett komplex bildat genom kombination av en prostetisk grupp och ett apoenzym, oberoende av om detta komplex uppvisar katalytisk aktivi- tet eller ej, medan termen "holoenzym" endast avser ett katalytiskt aktivt konjugerat enzym. För ytterligare upplysningar angående pro- “?90551 å a 1 stetiska grupper samt deras egenskaper och växelverkan med apoenzym kan man hänvisa till Dixon och Webb, Enzymes, 1. uppl., Longmans, Green & Öo. (London 1958). _ Uppfinningen avser sålunda en homogen specifik bindningsanalys för bestämning av en ligand i ett vätskemedium, varvid en reaktions-' blandning bildas genom att vätskemediet bringas i kontakt med reagens innefattande ett konjugat som har en märkningskomponent kopplad till en bindningskomponent,vilken kontakt ger ett bindningsreaktionssystem vari en bunden form och en fri form av konjugatet bildas, varvid an- delen av märkningskomponenten i de två formerna är en funktion av när- varon av ligand i vätskemediet, och varvid märkningskomponenten ger ett påvisbart gensvar som är olika i de två formerna, varefter det påvisbara gensvaret mätes i reaktionsblandningen, och denna analys k ä n n e t e c k n a s a v att märkningskomponenten är flavinadenindinukleotid, att reagensen även innefattar apoglukosoxidas som kan förenas med flavinadenindinukleotidtill bildning av kataly- tiskt aktivt glukosoxidas, och att glukosoxidasaktiviteten mätes i reaktionsblandingen.

Enligt föreliggande uppfinning kopplas den organiska prostetiska I gruppen flavinadenindinukleotid (FAD) till en bindningskomponent till bildning av ett märkt konjugat,vilket användes vid bindningsanalys; Ett centralt särdrag enligt uppfinningen är den resulterande växel- verkan mellan den konjugerade. prostetiska gruppen och1apoenzymet*en- ligt följande: 7 o-Pr + ' Apo -:-à O-Pr-Apo katalytiskt inaktiva aktivt komponenter holoenzym-komplex Även om den ovan angivna reaktionen är den vanligen iakttagna växelverkan, kan under vissa omständigheter det konjugerade enzym- komplexet uppvisa endast obetydlig eller ingen holoenzymaktivitet, såsom när konjugering av den prostetiska gruppen förhindrar normal växelverkan mellan holoenzym och substrat. Användbara märkta kon- jugat kan icke desto mindre erhållas, om det bundna konjugerade en- zymkomplexet uppvisar holoenzymaktivitet efter bindning av konjuga- tets bindningskomponent (representerad med symbolen <:)- ovan) i bindningsreaktionen, såsom när dylik bindning upphäver hämningen av holoenzym-substrat-växelverkan.

Det finns talrika möjliga metoder för bestämning av märkninge- substansen, av vilka en del beskrivas nedan, varvid man kan arbeta enligt olika kända, homogena metoder. Den"mäfkEa'Ebmponenf i dët märkta konjugat- som deltager i bindningsreaktionen innehåller 790551 lr - 1 0"] emellertid i samtliga fall en rest av FAD, och bestämningen innefattar bestämning av den märkta komponenten i bunden form eller fri form eller bådadera, varvid bestämningen baseras på mätning av holoenzym- aktiviteten.

Enligt uppfinningen användes sålunda flavinadenindinukleotid i kombination med apoglukosoxidas. Det holoenzym glukosokidas som bil- das av detta par är lätt att bestämma enligt den välkända väte- peroxidmetoden, som omfattar kolorimetrisk och fluorometrisk bestäm- ning. På grund av holoenzymets katalytiska natur förstärkas närvaro av märkningskomponenten många gånger i bestämningsreaktionen, vilket möjliggör en högkänslig bestämning av den ligand som skall påvisas (t.eX. i halter av storleksordningen ng/ml) med användning av relativt känslig men lättillgänglig och enkel apparatur, såsom spektrofotomet- rar eller förträdesvis kolorimetrar.

Analysförfarandet enligt uppfinningen kännetecknas av hög- känsliga bestämningsgränser, av att det lätt kan automatiseras, av att märkningssubstansen kan bestämmas med hjälp av instrument som är vanliga i kliniska laboratorier, och av att man använder märkta kon- jugat som är relativt lätta att syntetisera på reproducerbart sätt.

Nedan definieras ett antal av de termer som användes i före- liggande beskrivning. Med "ligand" avses en substans eller klass av besläktade substanser, vars närvaro eller mängd i ett vätskemedium skall bestämmas. Med "specifik bindningspartner till liganden" avses vilken som helst substans eller klass av substanser, som har en specifik bindníngsaffinitet till liganden med uteslutande av andra substanser. Med "specifik bindningsanalog till liganden" av- ses vilken som helst substans eller klass av substanser, som uppför sig på i huvudsak samma sätt som liganden vad beträffar bindnings- affiniteten till ligandens specifika bindningspartner. Med "rest" avses en del i en organisk molekyl, varvid exempelvis en rest av en prostetisk grupp i ett märkt konjugat är en organisk del i detta kon- jugat härrörande från och funktionerande på i huvudsak samma sätt som en prostetisk grupp, såsom den prostetiska gruppen minus en väte- atom i en ställning, vid vilken den prostetiska gruppen kopplas till den kvarvarande delen av det märkta konjugatet (i det märkta konju- gatet EMD-ligand betecknar FAD en rest av den prostetiska gruppen flavinadenindinukleotid). Med "reagensmedel" avses en komposition, en anordning eller en testsats innefattande de reagens som användes för genomförande av analysen. Med "bestämningsreaktion" avses en reaktion, vid vilken det märkta konjugatets märkningskomponent be- stämmas genom mätning av_n9loenzymaktiviteten. Med “lågalkylfl av- 79055144 6 7 ses en rakkedjig eller förgrenad alkylgrupp innehållande 1-6 kolato- mer, såsom metyl, etyl, isopropyl och hexyl.

Analysförfarandet enligt uppfinningen kan användas för påvi- sande av vilken som helst ligand, för vilken det finns en specifik bindningspartner. Liganden är vanligen en peptid, ett protein, ett kolhydrat, ett glykoprotein, en steroid eller någon annan organisk molekyl, för vilken en specifik bindningspartner existerar i bio- logiska system eller kan syntetiseras. Liganden väljes vanligen bland antigener och antikroppar därtill; haptener och antikroppar därtill; samt hormoner, vitaminer, metaboliter och farmakologiska medelsamt deras receptorer och bindningssubstanser. Såsom exempel på specifika ligander som kan påvisas enligt föreliggande uppfinning kan man nämna hormoner, såsom insulin, koriongonadotropin, tyroid- hormoner och estrio1;antigener och haptener, såsom ferritin, brady- kinin, prostaglandiner och tumörspecifika antigener; vitaminer, såsom biotin, vitamin B12, folinsyra, vitamin E, vitamin A och as- korbinsyra; metaboliter, såsom 3',5'-adenosinmonofosfat och 3',5'- guanosinmonofosfat; farmakologiska medel eller läkemedel, såsom anti- konvulsiva medel, bronkodilatatorer, kardiovaskulära medel och lä- kemedel av den typ som ofta missbrukas; antikroppar, såsom mikro- somala antikroppar och antikroppar till hepatit och allergener; och specifika bindningsreceptorer, såsom tyroxinbindande globulin, avidin, intrinsik faktor och transkobalamin. Förfarandet enligt uppfinningen är särskilt användbart för påvisande av haptener och analoger därtill med en molekylvikt av mellan 100 och 1000, framför allt jodtyronintyroidhormonerna tyroxin och liotyronin.

Det vätskemedium som skall analyseras kan vara en naturligen förekommande eller på konstgjord väg framställd vätska som misstänkes innehålla liganden, och vätskemediet är vanligen en biologisk vätska eller en vätska erhâllen genom utspädning eller annan behandling av en biologisk vätska. Såsom exempel på biologiska vätskor som kan analyseras enligt föreliggande uppfinning kan man nämna serum, plas- ma, urin, saliv, fostervatten och cerebrospinalvätska. Man kan även analysera andra ämnen, såsom fasta material, t.ex. vävnader, vilka först överföres i flytande form genom upplösning av det fasta ämnet i en vätska eller genom extraktion av det fasta ämnet med en vatsiàt enligt föreliggande uppfinning använda konjugatet kan repre- senteras med formeln Pr-R-L, där Pr betecknar resten av den proste- tiska gruppen(dvs FAD), R betecknar en sammanlänkningsgrupp, och L betecknar det märkta konjugatets bindningskomponent, vanligen liganden eller en bindningsanalog därtill. Bindningskomponenten och resten av 79055144 den prostetiska gruppen kopplas vanligen till varandra via samman- länkninqsgruppen på ett ställe på bindningskomponenten på avstånd från dennas specifika bindningsställe (dvs. det ställe på bindnings- komponenten som deltager i bindningsreaktionen, t.ex. ett immuno-^ kemiskt bindningsställe om bindningskomponenten är ett antigen, ett hapten eller en antikropp därtill) och på ett ställe på den pros- tetiska gruppen på avstånd från dennas aktiva bindningsställe för apoenzvmet. _ _ Det finns olika analysmetoder för bestämning av de arkta konjugaten enligt föreliggande uppfinning. I samtliga fall kopplas resten av den prostetiska gruppen kovalent till bindníngskomponenten i den märkta komponenten, och bestämningsreaktionen omfattar mätning av holoenzymaktivitet i den bundna formen eller den fria formen av det märkta konjugatet eller i båda formerna.

Nedan anges såsom exempel olika bestämningsscheman baserade pâ homogen konkurrerande bindning, men även andra homogena metoder kan naturligtvis användas.

Följande förkortningar användes i föreliggande beskrivning: _ ïerm Förkortning Rest av prostetisk grupp Pr Apoenzym Apo Sammanlänkningsgrupp R Ligand L Bindningspartner B Rest av konjugerat enzym Apo-Pr Rest av holoenzym (aktivt) lšfêatëmniflefiëßbesfla. fr: 1.- Homogen konkurrerande bindning - apoenzym införes efter initi- ering av bindningsreaktionen.

L(prov) + Pr-R-L + B -4 L-B + Pr-R-L-B ïl+ Apo (bunden form) (fri form; aktivt holoenzym) Vid denna metod bestämmes resten av den prostetiska gruppen, dvs. märkningskomponenten, genom att apoenzym tillsättes i huvudsak sam- tidigt med eller efter initiering av bindningsreaktionen, dvs. under bindningsreaktionen eller efter det att bindningsreaktionen har nått Ãämvikt och holoenzymaktivitet mätes i den slutliga reaktionsbland- ?90~551%~1 _ 8 ningen. Analysen är homogen genom att man väljer sådana betingelser, att apoenzymets bindning till resten av den prostetiska gruppen häm- _mas för den prostetiska gruppen i den bundna formen. Man kan även välja sådana betingelser, att apoenzymet kan bindas till den bundna formen av det märkta konjugatet, varvid det resulterande konjugerade enzymkomplexet icke uppvisar någon enzymatisk aktivitet beroende på hämning av växelverkan mellan enzym och substrat (denna situation visas icke i ovanstående schema). I båda fallen är den totala mängden uppmätt enzymaküvitet i systemet resultatet av ohämmad bindning av apoenzymet till fritt märkt konjugat och följaktligen en direkt Funktion av den mängd ligand i provet som är tillgänglig för konkur- g rens om bindningen till bindningspartnern. .âe at ämairaß äcsala. ara-_ Homogen konkurrerande bindning - apoenzymet införes före initiering av bindningsreaktionen.

Pr-R-L + Apo -§4.Ap0-Pa-R-L L______ (aktivt holoenzym) improv) +IFp"o'-'P“~n-L + B 4:- L-B + Apo-Pr-R-L-B (fri form; i (bunden form; aktivt inaktiverad) holoenzym) I detta schema kopplas resten av den prostetiska gruppen i märkningskomponenten till liganden och förenas med apoenzymet till en aktiv holoenzymprodukt. Resten av den prostetiska gruppen bestäm- mes genom mätning av holoenzymaktiviteten i den slutliga reaktions- blandningen. Analysen är homogen genom att man väljer sådana be- tingelser, att den efter bindning av bindningspartnern till det aktiva holoenzymkomplexet bildade bundna formen uppvisar hämmad en- zymaktivitet på grund av hämning av växelverkan mellan enzym och substrat. Den totala mängd enzymaktivitet som uppmätes i systemet härrör från den fria formen av det aktiva holoenzymkomplexet och är följaktligen en direkt funktion av den mängd ligand som är när- varande i provet.

Reaktionsschema 2 illustrerar i huvudsak enzymmärkta ana- lyser, varvid dock i motsats till vad som är förut känt enzymet såsom sådant kopplas till bindningskomponenten i det märkta konjugatet via en rest av en prostetisk grupp. 79055144 9 Vid homogen analys kan fördelningen av märkt komponent mellan den bundna formen och den fria formen bestämmas utan separation av de båda formerna. Holoenzymaktiviteten i reaktionsblandningen bestämmes därefter genom att man i åtminstone en del därav åstadkommer den ke- miska reaktion som katalyseras av holoenzymet, t.ex. en tillsätt- ning av substrat, varefter man medelst någon konventionell metod mäter den hastighet med vilken produkt bildas eller reaktionskompo- nent förbrukas eller mängden bildad produkt. Kvalitativ bestämning av liganden i vätskemediet åstadkommas genom att man jämför den upp- mätta mängden med den uppmätta mängden vid en bestämningsreaktion i ett vätskemedium fritt från ligand, varvid eventuell skillnad mellan de uppmätta värdena indikerar närvaro av ligand i det provade me- diet. Kvantitativ bestämning av liganden i vätskemediet åstadkommas genom att man jämför den uppmätta mängden med den uppmätta mängden vid en bestämningsreaktion i ett vätskemedmmlinnehållande olika kän- da mängder av liganden, t.ex. jämförelse med en standardkurva.

Vid förfarandet enligt uppfinningen kan komponenterna i den specifika bindningsreaktionen, dvs. det vätskemedhmæsom misstänkes innehålla ligand, det märkta konjugatet och i några system (dvs. konkurrerande bindningssystem) en specifik bindningspartner till liganden, kombineras i vilka som helst mängder, på vilket som helst sätt och i vilken som helst ordning, förutsatt att aktiviteten hos det märkta konjugatets märkningskomponent förändras mätbart, när vätskemediet innehåller liganden i en mängd eller koncentration som är signifikant i det aktuella fallet. Alla de komponenter som del- tager i den specifika bindningsreaktionen är företrädesvis lösliga i väskemediet.

Olika variationer av de ovan kortfattat beskrivna homogena metoderna och ytterligare detaljer rörande de diskuterade specifika metoderna, inklusive en alternativ teknik känd under namnet direkt biningsteknik, beskrives i litteraturen, t.ex. i tysk Offenlegungs- schrift 2 618 511.

Såsom ovan har angivits är prostetiska grupper en välkänd, speciell klass av enzym-kofaktorer, vilka huvudsakligen kännetecknas av att de kan regenereras till aktiv kofaktorform av moder-apoenzymet.

Enligt föreliggande uppfinning användes organiska prostetiska grupper, vilka kan kopplas kemiskt till bindningskomponenten i det märkta kon- jugatet. Bindningskonstanten för apoenzymets bindning till den pro- stetiska grupp, vars rest ingår i det märkta konjugatet enligt upp- 1 1_ finningen, är vanligen större än 106 mol_ , företrädesvis >108 mol- Den verkliga bindningsaffiniteten hos den rest av prostetisk grupp som ingår i det märkta konjugatet kan vara mindre än den fria pro- stetiska gruppens bindningsaffinitet, t.ex. nâgra få procent eller 7905511114 ' .10 så mycket som två tiopotenser, vilket dock icke påverkar denna rests användbarhet såsom märkningskomponent vid en bindningsanalys.

Bindningskonstanten för bindningen mellan den prostetiska gruppen FAD och apoglukosoxidas är >1O9; se Swoboda, Biochim. Bio- phys. Acta 175:365.(1969). W _ Vid användning av paret flavinadenindinukleotid och apoglu- kosoxidas erhålles system, vidvilka ligander, ligandanaloger och bind- ningspartner kan fästas, och det resulterande glukosoxidaset delta- ger i bestämningsreaktioner innefattande bildning av väteperoxid.

Dylika reaktioner är välkända och användes analytiskt för alstring av kolorimetriska reaktionsgensvar, vilka med fördel kan utnyttjas i kliniska laboratorier.. 7 Det bör inses att FAD kan funktionera såsom koenáym eller prostetisk grupp beroende på det enzymsystem, i vilket den placeras.

Föreliggande uppfinning avser emellertid användning av FAD endast i kombination med ett enzymsystem, vari den funktionerar såsom en prostetisk grupp enligt ovanstående definition.

Det finns naturligtvis många möjliga metoder att till den prostetiska gruppen FAD binda det märkta konjugatets bindningskom- ponent, t.ex. den ligand som skall påvisas, en bindningsanalog där- till eller en bindningspartner därtill. Sammanlänkningsgruppens speciella kemiska karaktär beror på naturen av de tillgängliga bind- ningsställena på bindningskomponenten och på den prostetiska gruppen.

Vid val av bindningsställen är följande överväganden vanligen vikti- ga. (1) Den bundna bindningskomponenten skall bibehålla sin för- måga att effektivt deltaga i det valda analyssystemet. (2) Den bundna resten av den prostetiska gruppen skall bibehålla sin förmåga att kunna kombineras med apoenzym. Denna förmåga skall bibehållas i sådan utsträckning, att en användbar analysmetod kan erhållas för den speciella ligand som analyseras och för de speciella koncentra- tioner eller mängder, i vilka liganden skall påvisas. Sammanlänk- ningsgruppen innehåller vanligen en kemisk bindning, vanligen en enkelbindning men ibland en dubbelbindning, eller en kedja innehål- ienae 1-14, företrädesvis 1-6, kelafeemer och o-s, företrädesvis 1-3 heteroatomer valda bland kväve, syre och svavel.

Både den prostetiska gruppen FAD och bindningskomponenten er- bjuder naturligtvis många olika funktionella grupper för fästande av sammanlänkningsgruppen. De funktionella grupper som kan förvän- tas vara tillgängliga för sammanlänkningsgruppen är vanligen amino, framför allt primär amino; hydroxyl; halogen, vanligen klor eller 7905514 " 1 011 brom; karboxylsyra; aldehyd; keto; isotiocyanat; ísocyanat; etc.

Den kemiska strukturen hos själva sammanlänkningsgruppen varierar följaktligen inom vida gränser, varvid sammanlänkningsgruppens änd- grupper beror på de funktionella grupper som är tillgängliga på den prostetiska gruppen och bindningskomponenten, och sammanlänknings- gruppens totala längd väljes så att de väsentliga egenskaperna hos den prostetiska gruppen och bindningskomponenten bibehâlles i det resulterande konjugatet. Vid framställning av ett konjugat avsett att användas vid homogen analys är det vanligen önskvärt att använ- da en så kort sammanlänkningsgrupp som möjligt utan att den resul- terande bindningskomponenten i konjugatet nämnvärt stör aktiviteten av daxprostetiska gruppen i koncentratet. Om bindningskomponenten har låg molekylvikt (t.ex. ett hapten med en molekylvikt mellan 100 och 1000), är sammanlänkningsgruppen företrädesvis en kemisk bind- ning eller en kedja innehâllande 1-6 atomer, såsom lågalkyl, karbo- nyl, alkylkarbonyl, amido, alkylamido och liknande. Under andra omständigheter, såsom när bindningskomponenten i konjugatet har re- lativt hög molekylvikt (t.ex. en polypeptid eller ett protein, såsom en antikroPP), är det vanligen lämpligt att använda en längre sam- manlänkningsgrupp för att förhindra steriska hinder vid apoenzymets bindningsställe i konjugatet. I sådana fall innehåller sammanlänk- ningsgruppen vanligen 1-14 kolatomer och 0-5 heteroatomer enligt ovan. Kedjor med avsevärt större längd resulterar ibland i konju- gat, i vilka bindningskomponenten tenderar att vikas tillbaka mot apoenzymets bindningsställe. Med hänsyn tagen till dessa övervä- ganden anges i nedanstående tabell 1 exempel på sammanlänknings- grupper. Speciella exempel på sammanlänkningsgrupper anges i utfö- ringsexemplen, och andra lämpliga sammanlänkningsgrupper kan lätt väljas av fackmannen. fsoss14-1 12 Tabell 1 Sammanlänkningsgrupp Kl- f - -N I - _ . - _ 1 2 _ _ prostetisk grupp*- 'R 'X'C“X"R ' ~*-bindningskomponent FAD' X X -i-R -X- där X betecknar imino, svavel eller företrädesvis syre; och där H1 och R2 oberoende av varandra betecknar lågalkylengrupper innehållan- de 1-6 kolatomer, såsom metylen, etylen, isopropylen, butylen eller hexylen. 7 Apoenzymet(apoglukosoxidas), dvs holoenzymets proteindel fri från prostetisk grupn, framställes genom att man spjälkar det konjugerade enzymet och isolerar det frigjorda apoenzym-proteinet. Spjälkningen av det konjugerade enzymet kan åstadkommas på flera olika kända sätt, t.ex. genom att enzymet anbringas i en mycket sur lösning, t.ex. en lösning med ett pH-värde lägre än 2. Utvinningen av apoenzymet kan också åstadkommas på flera kända sätt, såsom genom selektiv utfällning v9uss14-1 13 av proteinet eller selektiv adsorption av den lågmolekylära frigjorda prostetiska gruppen.

Om det föreligger risk för störning av analysen pa grund av närvaro av endogen prostetisk grupp i provet eller i något av rea- gensen eller på grund av förorening av laboratorieutrustning, glas- material eller plastmaterial, med prostetisk grupp, så kan dylik störande prostetisk grupp lätt avlägsnas enligt känd inaktiverings- teknik. FAD-störning kan t.ex. elimineras genom behandling med först perjodatlösning och sedan etylenglykollösning eller genom att man tillämpar nägon annan känd metod för inaktivering av FAD.

Uppfinningen illustreras genom följande, icke begränsande exempel.

Exempel 1. Homogen bindningsanalys för bestämning av N-2',H'- dínitrofenyl-6-aminokaproat. 7 (A) Framställning av det märkta konjugatet N6-(6-aminohexyl)- dinitrofenyl-flavinadenindinukleotid.

Flavin-N -aminohexyl-adenindinukleotid.

N6-trifluoroacetamidohexyl-adenosin-5'-monofosfat syntetise- rades enligt den metod som har beskrivits av Trayer et al., Biochem.

J. 1}9:609 (19TH). 56 mg (0,1 mmol) N -trifluoroacetamidohexyl-adencsin-5'-mono- fosfat löstes i ca 10 ml vatten, varefter 25}fl.(0,1 mmol) tri- n-butylamin tillsattes. Vattnet avlägsnades under vakuum, och åter- stoden löstes i 10 ml torr dimetylformamid, som därefter avlägsnades under vakuum. Återstoden indunstades ytterligare tre gånger i torr dimetylformamid. Den slutliga återstoden löstes i 10 ml torr dimetyl- formamid. Till den erhållna lösningen sattes 80 mg (0,5 mmol) N,N'-karbonyldiimidazol, varpå blandningen fick reagera under 1,5 timmar. Därpå tillsattes 15 Pl vatten och lösningsmedlet avlägsna- des under vakuum. Ãterstoden (NO-trifluoroacetamidohexyl-adenosin- 5'-monofosfat-imidazolid) löstes i 10 ml dimetylformamid.

BT mg (0,1 mmol) riboflavin-5'-monofosfat löstes i ca 10 ml vatten, och den erhållna lösningen sattes droppvis till 20 ml aceton innehållande H5 pl (0,1 mmol) tri-n-oktylamin. En fällning bilda- des innan tillsättningen var avslutad. Lösningsmedlet avlägsnades i en roterande indunstningsapparat till dess att riboflavin-5'-mono- fosfatet löste sig. Därefter tillsattes 5 ml aceton och 5-10 ml dimetylformamid, och den erhållna blandningen indunstades till torr- het. Återstoden löstes i 15-20 ml torr dimetylformamid, och lös- ningen indunstades till torrhet (denna procedur upprepades tre gång- er). Den slutliga återstoden löstes i 5 ml dímetylformamid, och den 'ïåâšïšilz-fl 14 härvid erhållna lösningen förenades med den ovan angivna lösningen av imidazoliden i 10 ml dimetylformamid¿ Reaktionsblandningen fick stå vid rumstemperatur över natten, varefter lösningsmedlet avlägsnades. återstoden upptogs i 50 ml vatten och anbragtes på en 2,5 x 25 cm kolonn av DEAE-cellulosa i bíkarbonatform (Whatman DE23, Reeve Angel, Clifton, New Jersey USA).

Kromatogrammet utvecklades med en linjär gradient med hjälp av två liter vatten och två liter 0,3 M ammoniumbikarbonatlösning, och frak- tioner med volymen 23 ml uppsamlades. Tunnskiktskromatografi på silikagcl 60 F25Ä (E. Merck, Darmstadt, Västtyskland) med användning av en blandning av etanol och 1M trietylammoniumbikarbonatlösning (pH 7,5) i volymförhâllandet 7:3 visade, att fraktionerna 68-73 innehöll större(Rf = 0,75) och mindre (Rf = 0,36) gula föreningar.

Dessa fraktioner förenades, och den resulterande lösningens optiska absorptionsspektrum hade maxima vid 267, 373 och H50 nm. _ Lösningsmedlet avlägsnades från fraktionsblandningen, och återstoden löstes i ca 5 ml vatten. Den resulterande lösningens ' pH-värde inställdes på 11,0 med 5 N natriumhydroxidlösning, varpå lösningen fick stå vid rumstemperatur under 9 timmar. Tunnskikts- kromatografi visade därefter, att komponenten med Rf = 0,75 hade försvunnit, under det att ett nytt gult ämne med Rf = 0,37 hade bildats. Reaktionsblandningens pH-värde inställdes på 8,0 med salt- syra, varefter blandningen anbragtes på en 2,5 x 20 cm kolonn av DEAE-cellulosa i bikarbonatform. Kromatogrammet utvecklades med en linjär gradient med hjälp av 1 l vatten och 1 l 0,2M ammoniumbi- karbonatlösning. Den gula effluenten från kolonnen uppsamlades och lösningsmedlet avlägsnades. återstoden absorberades på 2 g silika- gel, som därefter placerades på toppen av en 50 g kolonn av silika- gel, vilken hade bragts i jämvikt med en blandning av etanol och 1M trietylammoniumbikarbonatlösning (pH 7,5) i volymförhållandet 9:2. Kolonnen eluerades med en blandning av etanol och 1M trietyl- ammoniumbikarbonatlösning (pH 7,5) i volymförhållandet 8:2. Den gula komponenten med Rf = 0,37 uppsamlades, och lösningsmedlet av- lägsnadeâ. Utbytet var ca 10%, räknat på absorptionen vid H50 nm.

N -(6-aminohexyl)-dinitrofenyl-flavinadenindinukleotid.

Den ovan erhållna återstoden innehållande flavin-N6-aminohexyl- adenindinukleotid renades genom kromatografi på Sephadex G-10 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala). 1 ml av en ca 10 mM lösning av N6-FAD-derivat i vatten anbragtes på en 0,9 X 30 cm kolonn, som hade bragts i jämvikt med 25 mM natriumbikarbonatlösning (pH 7,5) vid rumstemperatur. Man uppsamlade de fraktioner, vilka gav den först eluerade toppen av material med absorption vid H50 nm. Detta material __ 1eess14-1 15 kromatograferades på nytt på Sephadex G-10, och man uppsamlade på nytt det material som gav den först eluerade toppen. 0,5 ml (0,63 pmol) av det renade N6-FAD-derivatet i 25 mM ml_etanol,-varefter etanol tillsattes natriumbikarbonatlösning (pH 7,5) blandades med 2 10 pl (6,3 umol; 50 pCi) 3H-dinitrofluorobensen i (den tritierade dinitrofluorobensenen erhölls från Radiochemical Centre, Amersham, Storbritannien). Reaktionsblandningen skakades kontinuerligt över natten i mörker vid rumstemperatur och anbragtes därefter på en 0,9 x 50 cm kolonn av Sephadex G-10, som hade bragts i jämvikt med 0,1 M fosfatbuffert(pH 7,0) innehållande 0,1% natrium- azid. Man uppsamlade det material, som gav den enda toppen och som uppvisade absorption vid H50 nm, och detta material visade sig inne- hålla 8% av den radioaktiva märkníngssubstansen.

(B) Renat glukosoxidas med låg katalasaktivitet erhållet från Framställning av apoglukosoxidas.

Research Products Division of Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana, USA dialyserades två gånger under vardera 12 timmar mot 50 volymer varje gång av en lösning innehållande 0,5 g mannítol per 100 ml. Dialysatsatser innehållande vardera 100 mg glukosoxi- daslyofiliserades och förvarades vid -2000. 200 mg oxserumalbumin löstes i 12 ml vatten, vars pH-värde hade inställts på 1,6 med koncentrerad svavelsyra. Därefter tillsat- tes 150 mg träkol (kvalitet RIA från Schwarz-Mann, Orangeburg, New York, USA), och den resulterande blandningen kyldes till 000. 100 mg lyofiliserat glukosoxidas löstes i 5,1 ml vatten, och 3 ml av den erhållna lösningen sattes till suspensionen av albumin och trä- kol under kontinuerlig omrörning i 5 minuter. Suspensionen filtrera- des därefter genom ett 0,8 pm Millipore -filter med diametern 25 mm (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA). Detta filter var monterat i en Sweenex filterapparat (Millipore Corp.) på en 50 ml engångsspruta av plast. Filtratet neutraliserades snabbt till pH 7,5 genom tillsättning av 2 ml 0,HM fosfatbuffert (pH 7,6) och där- 150 mg torrt träkol tillsattes därefter, Den resulterande efter 5N natriumhydroxid. och blandningen omrördes under 1 timme vid OOC. suspensionen filtrerades först genom ett 0,8 pm Millipore-filter och sedan genom ett 0,22 pm Millipore-filter. Till filtratet sat- tes glycerol i en mängd av 25 volym-%, och det stabiliserade apo- glukosoxidas-preparatet förvarades vid 400. 16 'ï9Û551ív1 (C) Analysreagens. 6 2 (1) Märkt konjugat: N -(6-aminohexyl)-DNP-FAD utspaddes i s0,05M fosfagbuffert (pH 7,0) till en konçentration av 118 nM. (2) Apoenzym: Apoglukosoxidas utspäddes med 0,1M fosfatbuf- fert (pH_7,0) innehållande 0,1% oxserumalbumin till en koncentration av 958 HM FÅD'bíndUínåSStäl19n- Koneentrationen av FAD-bindnings-2 ställen på apoenzympreparatet bestämdes expefimentellti ' genom mätning av den minsta mängd FAD som erfordrades för att ge maximal glukosoxidasaktivitet vid inkubering av apoenzymet. (5) )Antiserum: Antiserum mot ett dinitrofenyl-oxserumalbumin- konjugat erhölls från Miles-Yeda Ltd., Rehevot, Israel och utspäddes 31-faldigt i 0,1M fosfatbuffert (pH 7,0) innehållande 0,1% oxserum- albumin. ' ' 2 (4) Standardlösningar: Standardlösningar innehållande kända koncenrationer av N-2',ü'-dinitrofenyl-6-aminokaproat framställdes i 0,05M fosfatbuffert (pH 7,0). I (5) Bestämningsreagens: Ett glukosoxidas-reagens framställ- des genom blandning av H5 ml 0,1M fosfatbuffert (pH 7,0) innehållande 15 mM etylendiamintetraättiksyra, 9'ml av en 11,5 mM lösning av 3,5-dikloro-2-hydroxibensensulfonat i vatten, vilken lösnings pH- värde hade inställts 7 med natriumhydroxid, 9 ml av en 11,5 mM lös- ning av 4-aminoantipyrin i vatten innehållande 1,25 mg peroxidas per ml (Miles Laboratories Inc., Elkhart, Indiana, USA), och 6 ml av en 1,0M lösning av glukos i en mättad vattenlösning av bensoe- syra.

(D) Analysmetoder. (1) Tillsättning av apoenzym före initiering av bindnings- reaktionen.

Metod nr 1. Till separata reaktionskuvetter sattes i tur och ordning 0,1 ml av lösningen av märkt konjugat, 0,05 ml av en ut- vald standardlösning, 0,1 ml antiserumlösning, 2,0 ml bestämnings- reagens och 0,1 ml apoenzymlösning. Varje reaktionsblandning inku- berades under 30 minuter vid 3000, varpå absorptionen vid 520 nm mättes..

Metod nr 2. Till separata reaktionskuvetter sattes i tur och ordning 0,1 ml av lösningen av märkt koñjugat, 0,05 ml av en utvald standardlösning, 0,1 ml antiserumlösning och 0,1 ml apoenzymlösning.

Varje reaktionsblandning inkuberades under 20 minuter vid rumstempe- ratur, varefter 2,0 ml bestämningsreagens sattes till varje reaktions- blandning. Efter ytterligare inkubering under 15 minuter vid 3000 mättes absorptionen vid 520 nm i varje kuvett. 7905514-1 17 (2) Tillsättning av apoenzym efter initiering av bindnings- reaktionen.

Metod nr 3. Till separata reaktionskuvetter sattes i tur och ordning 0,1 ml av lösningen av märkt konjugat, 0,05 ml av en ut- vald standardlösning och 0,1 ml antiserumlösning. Varje reaktions- blandning inkuberades under 20 minuter vid rumstemperatur, varefter 2,0 ml bestämningsreagens och 0,1 ml apoenzymlösning sattes till varje reaktionsblandning. Efter ytterligare inkubering under 30 minuter vid 3000 mättes absorptionen vid 520 nm i varje kuvett.

Metod nr H. Till separata reaktionskuvetter sattes i tur och ordning 0,1 ml av lösningen av märkt konjugat, 0,05 ml av en utvald standardlösning och 0,1 ml antiserumlösning. Varje reaktions- blandning inkuberades under 20 minuter vid rumstemperatur, varpå 0,1 ml apoenzymlösning sattes till varje blandning. Efter ytter- ligare inkubering under 20 minuter sattes 2,0 ml bestämníngsreagens till varje kuvett. Varje reaktionsblandning ínkuberades därefter under 15 minuter vid 3000, varpå absorptionen vid 520 nm mättes i varje kuvett.

(E) Resultat.

I nedanstående tabell 2 anges de resultat som har erhållits vid bestämning av N-2',4'-dinitrofenyl-6-aminokaproat enligt de fyra olika analysmetoderna. Koncentrationerna av N-2',ü'-dinitrofenyl- 6-aminokaproat uttryckes såsom koncentrationerna i de slutliga reak- tionsblandningarna med volymen 2,35 ml. Absorptionsvärdena är medel- värden av tvâ bestämningar, varvid värdena har korrigerats för kvar- varande enzymaktivitet och bakgrundsabsorption i reagensen. För varje analysmetod anges korrektionsfaktorn nederst i tabell 2. Korrektions- faktorn har bestämts vid försök, där lösningaiavzdükt konjugat, stan- dardlösningen och antíserumlösningen samtliga har ersatts med 0,1M fosfatbuffert (pH 7,0). ?9G551h=1 18 w°H.@ @H~.° w@H.o ~«~.Q m@H.° HQH.° »~fi.@ ß=H.° mH~.o @oH.° >wfi.Q m-.o @-.o .«°H.° wm~.° -H.o ßmN.o _-H.o m~N.° .«mH.@ mmm.o mmH.° øßwho. H«H@° ~mm.° «mH.o m@m.o m@H.@ >mß.° mmH.° m«m.o «@H.° «m@.Q mßH.° mw@.o H-.o @mH.fi ßw~.° w@w.° mm~.° NQm.H ßmH.@ ~@m.° m@~.° @mm.H m°N.q @w°.H «ß~.o 3 än øopwz m ps øovmz N Q: wnpws fl Q: wopwz En omm Ufl> noflvmnownmfiwwmë wmnmwflfinom -HOUEWNQ WGOfifi-...Sw .HHOÅ umumumvmlsnvmü fißlfi w @H_ Nm <@ æNH - mm~ HHW HNQH ^2Qv pmonmwxozfiëmam|HmcmmoLwflmflø|_:Q.mnz _ >m,soflpmnu:wosoM N Hfimbmäfl 7905514-1 Av försöksresultaten framgår, att man vid en specifik bind- ningsanalys av homogen typ enligt föreliggande uppfinning kan införa apoenzymet antingen före eller efter initiering av bindningsreaktio- 19 Den.

Exempel 2. Homogen bindningsanalys för bestämning avtyroxin.

(A) Framställning av det märkta konjugatet N6 -(6-aminohexyl)- tyroxin-flavinadenindinukleotid. I " 6-(6-aminohexyl)-amino-9-(2',3'-O-isopropyliden- -D-ribofu- ranosyl)purinl ' _ 16,0 g (50 mmol) 6-kloro-9-(2',5'-0-isopropyliden-ß-{Fribo- furanosyl)purin Åfiampton et al., J. Am. Chem. Soc. 83:1501 (1961)7 sattes under omrörning till ett smält /7000) prov av nydestillerad 1,6-diaminohexan (58 gg 500 mmol). Den resulterande blandningen om- rördes under argongas vid 4000 under 18 timmar. Överskottet av di- amin avlägsnades genom destillation under förminskat tryck (60°C; 0,91 mm Hg). Den resulterande ljusgula återstoden adsorberades på på 150 g silikagel 60 (E. Merck, Darmstadt, Västtyskland), varpå det resulterande silikagelet anbragtes på toppen av en kromatografisk kolonn framställd av en uppslamning av 2 kg silikagel 60 i en bland- ning av absolut etylalkohol och 1M triammoniumbikarbonatlösning (pH 7,5) i volymförhållandet 9:1. Kolonnen eluerades med samma lösningsmedelsblandning, och 900 fraktioner med en volym av vardera 20 ml uppsamlades. Fraktionerna analyserades med hjälp av tunnskikts- kromatografi på silikagel 60, varvid man eluerade med en blandning av absolut etylalkohol och 1M trietylammoniumbikarbonatlösning (pH 7,5) i volymförhållandet 7:3. De vid kolonnkromatografin er- hållna fraktionerna 391-900 förenades och indunstades i vakuum, var- vid man erhöll 15,0 g (utbyte 7Ä%) av en glasartad återstod. 1 g av det glasartade ämnet löstes i en liten volym metylalkohol, och den resulterande lösningen anbragtes på toppen av en kolonn fram- ställd av 80 g Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala), som hade svällts i förväg i metylalkohol. Kolonnen eluerades med metylalkohol. Man uppsamlade totalt 90 fraktioner med en volym av vardera 8 ml. Fraktionerna analyserades med hjälp av tunnskikts- kromatografi på silikagel 60, varvid man eluerade med en blandning av absolut etylalkohol och 1M trietylammoniumbikarbonatlösning (pH 7,5) i volymförhâllandet 7:5. De vid kolonnkromatografin erhållna fraktionerna 19-27 förenades och indunstades i vakuum, varvid man erhöll 910 mg (utbyte 91%) av ett vitt glasartat ämne. vsassu; 1 20 Analys: Beräknat för C19H30N6Ou: _ C 56,14; H 'LiU-U N 20,68 Funnet 0 53,91; H 7,53; N 19,18 NMR (60 MHz, CDCl3); 1,H0 (s, BH, isopropyliden), 1,63 (s, BH, isopropyliden), 5,98 (d, 1H,i1'-ribos), 7,92 (s, 1H, purin), 8,36 (s, IH, purin). * ' Optisk vridning: [Q7š5 = -50,110 (c 1,0, metylalkohol)¿ N- {6-[Ü-(trifluoroacetyl)-5,3¶,5,5'-tetrajodotyronyl7amino- hexyl} -2',3'-O-isopropyliden-adenosin. j n .

En lösning av Å,36 g (5,0 mmol) d.-(N-trifluoroacetyl)amino- få'1š,5~dijodo-4-(3',5'-dijodo-4'-hydroxifenoxi)-fenylpropansyra, framställd såsom beskrivits i exempel 2 (A), och 2,2Ä~g (5,5 mmol) 6-(6-aminohexyl)amino-9-(2',3'-0-isopropyliden-ß-®-ribofuranosyl)- purin i 100 ml torr dimetylformamid framställdes vid -2000 under en atmosfär av torr argaongas. Till den resulterande kalla lösningen sattes under omrörning en lösning av 1,52 E (5,5 mmol) difenylfos- forylazid (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, USA) i 50 ml torr dimetylformamid, och därefter tillsattes 0,8 ml (5,5 mmol) torr trietylamin. Den resulterande lösningen fick stå vid rumstem- peratur under 22 timmar. Lösningen sattes därefter droppvis till 600 ml kallt vatten (0°C) under omrörning. Den resulterande vita fällningen uppsamlades genom filtrering och torkades i vakuum (6000), varvid man erhöll 4,90 g (utbyte 78%) av ett vitt fast ämne.

Ett prov av detta fasta ämne omkrístallíserades i en blandning av aceton och vatten, varvid man erhöll ett vitt fast ämne, som smälte vid 205-20700 under sönderdelning.

Analys: Beräknat för C36H38F3I4N7O8: C 3Ä,28; H 3,0Ä; N 7,77 Funnet C 34,22; H 2,99; N 7,Ä1 Mass-spektrum (20 ma) m[e: 1262 LÜHÉ7, 1164 [fi+ minus C0CF3_7.

Optisk vridning: [2§7š5 = -21,890 (c 1,0, pyridin).

N-f 6-[Ü-(trifluoroacetyl)-3,3',5,5'-tetrajodotyronyl7amino- hexyl} -3',3'~O-isopropylíden-5'-adenylsyra-monotrietylaminsalt- monohydrat.

En lösning av 1,89 g (1,5 mmol) N f-6-[fi-(trifluoroacetyl)- 3,3',5,5'-tetrajodotyronyl7aminohexyl} -2',3'-O-isopropyliden-adeno- sin i 15 ml torrt trietylfosfat framställdes vid -1000 under en at- mosfär av torr argongas. Till den erhållna kalla lösningen sattes under omrörning 0,68 ml (7,5 mmol) fosforoxiklorid. Den resulterande lösningen hölls vid ~15°C under 18 timmar och sattes därefter dropp- 7-”9055111-1 vis under omrörning till 1,5 l isvatten. Den resulterande fällning- en uppsamlades genom filtrering och torkades i vakuum, varvid man erhöll 1,91 g (utbyte 87%) av ett vitt fast ämne. Detta fasta ämne löstes i 10 ml metylalkohol, varpå 0,38 ml (2,6 mmol) trietylamin tillsattes. Lösningen indunstades i vakuum, och den resulterande återstoden omkristalliserades i en blandning av metylalkohol och etyleter. Härvid erhölls 720 mg (utbyte 33%) av ett vitt fast ämne, vilket smälte vid 151-15H°C under sönderdelning.

Analys: Beräknat för Cu2H56F3I¿N8O12P: C 34,54; H 3,86; N 7,67- Funnet c 35,24; H 3,88; N 7,75 Mass~spektrum (20 ma)- m/e: 1342 LÜHÉ7, iâflü [E+ minus COCF37. optisk vridning: 527? = -17,2o° (c 1,0, cnšon).

N- {6-¿N-(trifluoroacety1)~3;3'5,5'-tetrajodotyronyl7amino- hexyl} -5'-adenylsyra. 600 mg (0,H1 mmol) N- I6¥[N~(trifluoroacetyl)-3,3',5,5'- tetrajodotyronyl7aminohexyl} -2',3'-O-isopropyliden-5'-adenylsyra- monotrietylaminsalt-monohydrat suspenderades i 0,6 ml vatten (000), varpå 6 ml trifluoroättiksyra tillsattes droppvis under omrörning.

Efter 50 minuter erhölls en klar lösning. Lösningen hölls kallt 21 (000) under ytterligare 15 timmar och índunstades därefter i vakuum (3000). Den resulterande återstoden indunstades i vakuum 5 gånger efter upptagning i 20 ml vattenfri etylalkohol varje gång, och åter- stoden revs därefter med 30 ml vatten och tvättades med en liten volynxnetymlkohol. Det resulterande vita fasta ämnet (430 mg) om- kristalliserades i metylalkohol. Härvid erhölls 290 mg (utbyte 5U,6%) av ett vitt fast ämne, vilket smälte vid 180-18300 under sönderdelning. .

Analys: Beräknat för C33H35F3luN7O11P: C 30,U6; H 2,71; N 7,5U Funnet: C 30,77; H 2,55; N 7,29 Mass-spektrum (20 ma) m/e: 1302 ÅÜHÉ7, 120N 10+ minus COCF3_7.

Flavinadenindinukleotid-tyroxin-konjugat. 130,13 mg (0,1 mmol) N-{6-[Ü-(trifluoroacetyl)-3,3'5,5'- tetrajodotyronyl7aminohexyl}-5'-adenylsyra placerades i argonatmos- fär. Till detta prov sattes en lösning av 1U Fl (0,1 mmol) trietyl- amin i 1 ml torr dimetylformamid, och därefter tillsattes en lösning av 16,2 mg (0,1 mmol) 1,1'-karbonyldiimidazol i 1 ml torr dimetylform- amid. Efter 24 timmar tillsattes ytterligare 16,2 mg 1,1'-karbonyldi- imidazol i 1 ml torr dimetylformamid. Man lät reaktionen äga rum 'rsuswf 1 _ 22 under totalt H8 timmar vid rumstemperatur, varvid fukt utestängdes från reaktionsblandningen. Ett prov om 47,3 mg (0,1 mmol) av ammo- niumsaltet av riboflavin-5'-monofosfat omvandlades till motsvarande tri-n-oktylaminsalt på samma sätt som beskrivits i exempel 2 (A).

Detta salt löstes i 5 ml torr dimetylformamid, och den erhållna lös- ningen sattes till den ovan angivna lösningen innehållande fosfor- imidazolidatet av adenylsyra-mellanprodukten.

Den resulterande lösningen fick stå i mörker vid rumstempera- tur i frånvaro av fuktighet under 24 timmar. Lösningsmedlet avdunsta- des i vakuum och den resulterande återstoden kromatograferades på en kolonn (2,5 x 78 cm) framställd av 100 g Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala), som hade svällts i förväg under 18 timmar i en blandning av dimetylformamid och 1M trietylammoniumbikarbonat- lösning (pH 7,5) i volymförhållandet 19:1. Kolonnen eluerades med samma lösningsmedelsblandning, och man uppsamlade fraktioner med volymen 5 ml. Eluatfraktionerna analyserades med hjälp av tunn- skiktskromatografi på silaniserade RP-2-plattor av silikagel 60 (E. Merck, Darmstadt, Västtyskland). De tunnskiktskromatografiska plattorna framkallades med användning av en blandning av aceton, dkloroform, metylalkohol, vatten och trietylamin i volymförhållandet ü0:40:25:1:1.

De vid kolonnkromatografin erhållna fraktionerna 24-38 före- nades och indunstades i vakuum. Äterstoden kromatograferades på en kolonn (2,5 x 85 cm) framställd av 125 g Sephadex LH-20, som hade svällts i förväg under 18 timmar i 0,1M ammoniumbikarbonatlösning.

Kolonnen eluerades med en linjär gradient âstadkommen med 2 l 0,1M ammoniumbikarbonatlösning och 2 l vatten, och fraktioner med volymen 25 ml uppsamlades. Eluatfraktionerna analyserades med hjälp av UV-absorption vid 25H nm. Fraktionerna 170-182 förenades och in- dunstades i vakuum. Återstoden kromatograferades på en kolonn i(2,5 x 55 cm) framställd av 80 g Sephadex LH-20, som hade svällts i förväg i 0,05 M ammoniumbikarbonatlösning. Kolonnen eluerades med en linjär gradient åstadkommen med 2 l 0,05M ammoniumbikarbonat- lösning och 2 l 0,02M ammoniumbikarbonatlösning. Eluatfraktionerna analyserades medelst UV-absorption vid 25Ä nm. Elueringen fort- sattes med 2 l 0,2M ammoniumbikarbonatlösning, varvid fraktioner med volymen 25 ml uppsamlades. Totalt uppsamlades 257 fraktioner.

Fraktionerna 70-110 förenades och indunstades i vakuum, varvid man erhöll det märkta konjugatet såsom en orangegul återstod. En al- kalisk vattenlösning av denna återstod uppvisade absorptionsmaxima 7905514-1 23 i ultraviolett ljus vid följande våglängder: 270 nm, BBS nm och H50 nm. Med hjälp av absorptionen vid H50 nm beräknades utbytet till ca 5%.

Ett fosfodiesteras-preparat (Worthington Biochemical Corp.,7 Freehold, New Jersey, USA) isolerat från ormgift (Crotalus Adaman- teus) hydrolyserade den ovan framställda produkten till riboflavin- 5'-monofosfat och tyroxin-substituerad 5'-adenylsyra, där den bloc- kerande trifluoroacetyl-gruppen hade avlägsnats.

Framställning av märkta konjugat av denna typ beskrives även i den amerikanska patentansökan 917 962, som ingavs den 22 juni 1978. ' ' (B) Framställning av apoglukosoxidas, Glukosoxidas dialyserades och lyofiliserades på samma sätt som beskrivas i exempel 1 (B). En portion (80 mg) av det lyofilise- rade glukosoxidaset löstes i 20 ml 30%~ig (volymprocent) glycerol vid H00, och den erhållna lösningens pH-värde inställdes på 1,U ge- nom tillsättningav koncentrerad svavelsyra. Lösningen inkuberades vid NGC under 2 timmar och leddes därefter genom en kolonn av Sephadex 50 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala) vid H00. Kolonnen hade bragts i jämvikt med 30%-ig glycerol, vars pH-värde hade in- ställts på 1,4 med koncentrerad svavelsyra. Man uppsamlade det elu- at som gav en proteintopp (27 ml innehållande 7fl vikt-% av det ma- teríal som hade satts till kolonnen), och 200 mg oxserumalbumin löstesi.eluatet. Man tillsatte sedan 600 mg träkol (kvalitet RIA från Schwarz-Mann, Orangeburg, New York, USA), och blandningen neutralise- rades genom tillsättning av H,O ml 0,HM fosfatbuffert (pH 8,0) och tillräckligt med 2N natriumhydroxidlösning för inställning av pH- värdet på 7,0. Blandningen omrördes vid HOC under 60 minuter och filtrerades först genom ett 0,8 pm Millipore-filter och sedan genom ett 0,22 pm Millipore-filter. En natriumazidlösning (10 g/100 ml) tillsattes till en slutlig natriumazidkoncentration i blandningen av 0,1%.

(C) Analysreagens. (1) Märkt konjugat: N6-(6-aminohexyl)-tyroxin-FAD utspäddes i 0,1M fosfatbuffert (pH 7,0) innehållande 0,1 g oxserumalbumin per 100 ml till en koncentration av N00 nM. (2) Apoenxym: Apoglukosoxidas utspäddes i 0,1M fosfatbuffert (pH 7,0) innehållande 0,1 g oxserumalbumin per 100 ml till en kon- centration av U,0lfl¶ (mikronormal) FAD-bindningsställen (se avsnitt C-2 i exempel 1). (3) Antiserum: 7,5 ml mättad ammoniumsulfatlösning pumpades 7905514 "1" 24 med en hastighet av 0,1 ml/minut vid rumstemperatur in i 15 ml kanin- anti-tyroxin-antiserum, som omrördes i ett isbad. Den resulterande suspensionen fick stå under 2 timmar vid ROC utan omrörning. Den bildade fällningen uppsamlades genom centrifugering, löstes i 3 ml iskall 50 mM boratbuffert (pH 8,6) och dialyserades över natten mot 1 1 50 mM boratbuffert (pH 8,6). Immunoglobulin-lösningen inställ- des sedanpå den ursprungliga antiserumvolymen genom tillsättning av 50 mM boratbuffert (pH 8,6). Immunoglobulin-lösningen utspäddes ytterligare i 0,1M fosfatbuffert (pH 7,0) innehållande 0,1 g oxserum- albumin per 100 ml för användning vid de nedan beskrivna analyserna i de angivna proportionerna. ' (Ä) Standardlösningar: Man utgick från en stamlösning in- nehållande 1 mg_tyroxin-natriumsalt per ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA). Man titrerade till upplösning i destil- lerat vatten med hjälp av 2N natriumhydroxidlösning till ett slut- ligt pH-värde av 10,2. Man framställde standardlösningar genom utspädning av denna stamlösning i 0,1M fosfatbuffert (pH 7,0) inne- hållande 0,1 g oxserumalbumin per 100 ml. (5) Bestämningsreagens: Ett glukosoxidasreagens framställ- des genom blandning av 11 delar 0,15M fosfatbuffert (pH 7,0) inne- hållande 1,8 g oxserumalbumin per 100 ml; 2 delar 2,0 mM U-amino- antipyrin innehållande 0,6 mg oxidas per ml; 2 delar 20 mM 3,5-di- kloro-2-hydroxibensensulfonat i 0,1M fosfatbuffert (pH 7,0), och 2 delar 1,0M glukos i en mättad vattenlösning av bensoesyra.

(D) Analysmetoder: (1) Tillsättning av alla reagens utan förinkuberingssteg.

Till separata reaktionskuvetter sattes i tur och ordning 0,05 ml av lösningen av märkt konjugat, 0,05 ml av en utvald stan- dardlösning, 0,1 ml av en utspädning (lzü) av antiserumlösningen i fosfatbufferten, 1,7 ml bestämningsreagens och 0,1 ml apoenzym- lösning. Varje reaktionsblandning inkuberades under 30 minuter vid 2000, varefter vid 520 nm mättes. (2) Förinkubering med antiserum.

Till separata reaktionskuvetter sattes i tur och ordning 0,05 ml av lösningen av märkt konjugat, 0,05 ml av en utvald standard- lösning och 0,1 ml av en utspädning (1:16) av antiserumlösningen i fosfatbufferten. Varje reaktionsblandning inkuberades under 20 mirluter vid 2o°c, varpå man till varje blandning satte först 1,7 ml bestämningsreagens och därefter 0,1 ml apoenzymlösníng. Efter 79055144 25 inkubering under ytterligare 30 minuter vid 2000 mättes absorptionen vid 520 nm i varje kuvett. (5) Förinkubering med apoenzym.

Till separata reaktionskuvetter sattes i tur och ordning 0,05 ml av lösningen av märkt konjugat, 0,05 ml av en utvald standard- lösning och 0,1 ml apoenzymlösning. Varje reaktionsblandning inku- berades under 20 minuter vid 2000, och därefter tillsattes först 0,1 ml av.en utspädning (1:2) av antiserumlösningen i fosfatbuffer- ten och sen 1,7 ml bestämningsreagens. Efter inkubering under yt- terligare 30 minuter vid 2000 mättes absorptíonen vid 520 nm i var- je kuvett. (Ä) Förinkubering med först antiserum och sedan apoenzym.

Till separata reaktionskuvetter sattes i tur och ordning 0,05 ml av lösningen av märkt konjugat, 0,05 ml av en utvald standard- lösning och 0,1 ml av en utspädning (1:32) av antiserumlösningen i fosfatbufferten. Varje reaktionsblandning inkuberades under 20 mi- nuter vid 20°0, varefter 0,1 ml apoenzymlösning tillsattes. Efter inkubering under ytterligare 20 minuter vid 20°C sattes 1,7 ml be- stämningsreagens till varje kuvett, och efter inkubering vid 2000 under 50 minuter mättes absorptionen vid 520 nm i varje kuvett. (5) Förinkubering med först apoenzym och sedan antiserum.

Till separata reaktionskuvetter sattes i tur och ordning 0,05 ml av lösningen av märkt konjugat, 0,05 ml av en utvald stan- dardlösning och 0,1 ml apoenzymlösning. Varje reaktionsblandning inkuberades under 20 minuter vid 2000, varpå man till varje reak- tionsblandning satte 0,1 ml av en utspädning (1:52) av antiserum- lösningen i fosfatbufferten. Efter inkubering under ytterligare 20 minuter vid 2000 sattes 1,7 ml bestämningsreagens till varje kuvett. Efter inkubering vid 2000 under 30 minuter mättes absorp- tionen vid 520 nm i varje kuvett. (6) Förinkubering med både antiserum och apoenzym.

Till separata reaktionskuvetter sattes i tur och ordning 0,05 ml av lösningen av märkt konjugat, 0,05 ml av en utvald stan- dardlösning, 0,1 ml apoenzymlösning och 0,1 ml av en utspädning (1:32) av antiserumlösningen i fosfatbufferten. Varje reaktions- blandning inkuberades under 20 minuter vid 2000, varefter 1,7 ml bestämningsreagens tillsattes. Efter inkubering under ytterligare 30 minuter vid 2000 mättes absorptionen vid 520 nm i varje kuvett.

(E) Resultat.

Man genomförde dubbla analyser med lämpliga blindprov. Vid 790551 li -1 26 användning av metoderna 1-3 fann man, att tyrokinkoncentrationen i standardlösningen var en direkt funktion av glukosoxidasaktiviteten, under det att tyroxinkoncentrationen var en omvänd funktion av enzymaktiviteten vid användning av metoderna 4-6. Vid metoderna 1-3 hämmades enzymaktiveringen i frånvaro av tyroxin, under det att enzymaktiveringen förstärktes vid användning av metoderna 4-6.

Metoderna U-6 visade sig också vara något känsligare vid bestämning av tyroxin än de andra metoderna._ Orsaken eller orsakerna till att enzymaktiveringen hämmades eller förstärktes beroende på reaktions- följden har icke till fullo klarlagts, men resultaten visar att en homogen specifik bíndningsanalys enligt föreliggande uppfinning är användbar för bestämning av tyroxin vid användning av flera olika reaktionssekvenser. I Exempel 3. Homogen bindningsanalys för bestämning av teofyl- lin. I (A) Framställning av det märkta konjugatet teofyllin-FAD.

Till en lösning av 2,U Fmol flavin-N -aminohexyl-adenindinuk- leotid, framställd såsom beskrives i exempel 1 (A), i 200 Pl di- metylsulfoxid sattes i argongasatmosfär 0,9 må (3,62 Pmol) 1,3-di- metyl-1,6,7,8-tetrahydropyridoíï,2-ç7purin-2,Ä,9-(BH)-trion, fram- ställd enligt den metod som beskrivits av Cook et al., Res. Comm. in Chem. Pathol. and Pharm. 13:49? (1976). Efter U timmar tillsat- tes ytterligare 1,8 mg (7,3^Pmol) av den sistnämnda föreningen.

Efter omrörning över natten avdunstades lösningsmedlet under va- kuum (0,1 mm Hg), och återstoden kromatograferades på en 2,5 x 90 cm kolonn av Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala).

Man eluerade med 0,3M trietylammoniumbikarbonatbuffert (pH 7,8).

Man uppsamlade den orena produkt, vilken eluerades mellan eluatvo- lymerna 210 och 2H6 ml. Denna produkt anbragtes på en silikagel- platta (20 cm x 20 cm x 1000 um), och man eluerade med en blandning av etanol och 1M trietylammoniumbikarbonatbuffert (pH 7,8) i volym- förhållandet 8:2. Ett band som innehöll den önskade produkten (Rf = 0,77) avskrapades från plattan oduextraherades med 1M triammo- niumbikarbonatbuffert (pH 7,8). Extraktet filtrerades och koncent- rerades. Slutlig rening genom förnyad kromatografi på Sephadex LH-20 (eluering med 0,3M trietylammoniumbikarbonatbuffert) gav 1,26 umol av det märkta konjugatet, vilket motsvarar ett utbyte av 53%. Utbytet bestämdes genom absorptionsmätning vid H50 nm. 7905514-1 27 (B) Antikropp-bindningsreaktíoner.

Antikroppar producerades i kaniner med hjälp av immunogenet 8-(3-karboxipropyl)-1,3-dimetylxantin-BAS på det sätt som har be- skrivits av Cook et al., Res. Comm. in Chem. Pathol. Pharm. 13: 497 (1976)- Man genomförde antikropp-bindningsreaktioner vid rumstempera- tur i O,1M natriumfosfatbuffert (pH 7,0), och mätningar av glukos- oxidasaktiviteten genomfördes i samma buffert vid 2000.* Nedan anges de vid analysen använda reagensen.

Reagens Sammansättning A 0,1M natriumfosfatbuffert (pH 7,0) B 565 nM teofyllån-FAD (märkt konjugat) eller 160 nM N -(6-aminohexyl)-FAD (FAD-derivat) C t antiserum mot teofyllin (10-faldig . utspädning i reagens A) D apoglukosoxidas (50 nM FAD-bíndnings- * ställen per ml) E bestämningsreagens: 200 pg peroxi- das per ml; 0,71 mM H-aminoantipyrin; 7,1 mM 3,5~díklor-2~hydroxibensen- sulfcnat; 353 mM glukos; och 35 mg BSA per ml.

I separata reaktionskuvetter förenades reagensen A, B och C i de i nedanstående tabell 4 angivna proportionerna. Till varje reaktíonsblandning sattes därefter snabbt först 100 Pl av reagens D och sedan 283 ul av reagens E. Varje reaktíonsblandning inkubera- des därefter under 50 minuter vid 2000. I varje kuvett mättes ab- sorptionen vid 520 nm. De 1 nedanstående tabell N angivna resulta- ten är medelvärden av två bestämningar.

HNWQ QQH ON - ßnq .HH -.° _ _ Qw ON - _ ßflm OH «~N.Q_ . o« ON - Nmm _ Q @H~.° ON ON - ßNm w Qm@.o _ . - ON - ßmq 0 @N@.= _ OQH - OCH »mn m m Hw@.o. _ oq - _ OCH ßßq Q <«@.o_ _ CH - ._ OCH “om W «mm.Q - _ - _QoH ßñm N @«°.o - _ , - ßflw ~ AE: ommv ^E:&wmflucmv Aßmwswnoz pm>flmw© _ Aunwwmønv än :ofl»@@0wp< ^H1v U mcwwmmm pxpms « «n _ ^H V m wcmwmwm fl||||ll 1 ñfiwßma '190551 i:- - 1 79055144 29 Resultaten vid reaktionerna 2-5 visar, att antiserumet icke påverkade FAD-derivatets aktivitet (dvs. FAD-derivat icke kopplat till teofyllin). Resultaten vid reaktionerna 6-11 visar, att ökande halter av teofyllin-antiserum minskade det märkta konjugatets akti- vitet vad beträffar förmågan att kombineras med apoenzymet; (C) Konkurrerande bindningsanalyser. a Dessa reaktioner genomfördes på samma sätt som under (B) ovan förutom att bestämda mängder av teofyllin förenades med reagensen A och B före tillsättningen av reagens C. Vidare utgjordes reagens C av en 100-faldig utspädning av antiserum._ Resultaten är samman- ställda i nedanstående tabell 5.

Reaktionerna 1-3 var kontrollreaktioner, vilka visade att an- tíkroppen till teofyllin minskar det märkta konjugatets förmåga att kombineras med apoenzym. Reaktionerna H-9 visar, att FAD-aktivite- ten ökar i proportion till teofyllinhalten i reaktionsblandningen. “?9G551 la “1 30 ßßm.O OCH H.O Om CN CH«.O OCH H.C OCH CH HCCLC OCH C.H Cm CN HCm.C OCH C.H CCH CN CHO.C CCH CH CC CH OOH.C OCH CH OCH CH HCC.O OCH - - CH - NHC.C - - - ON HCC.C - - - - AE: ommv snwmfiæcmv ^2&v Aflla EaHo> Apmwswzox wxswëv =oHOCpCwC< HH C C mcwwmwm =oHOCCp=@0:oH OOOOHHHO HHÄC m wswwmmm . :HHfl>MowE å www ßmm new nam Owe Cam »me ßmm ßfiø H4 N n v m ro N w G 31 ^p%mmm§nv O ns V 4 wnmwmmm Cofivxmmm_ 79055144 ggempel 4. Homogen bindningsanalys för bestämning av humant 31 IgG.

(A) Framställning av det märkta konjugatet IgG-FAD Till 4,2H mg flavin-N6-aminohexyl-adenindinukleotid, fram- ställd såsom beskrivits i exempel 1 (A),sattes 2,5 mg dimetyladípimi- dat-dihydroklorid (Pierce Chemical Co., Éockford, Illinois, USA) i 1 ml vatten och 5 pl trietylamin. Reaktionsblandningen omrördes vid rumstemperatur under 10 minuter, varefter man tillsatte Ä0 mg humant immunglobulin (IgG) i 1 ml 0,1M natriumpyrofosfatbuffert (pH 8,5). Efter omrörning vid rumstemperatur under ytterligare 3 timmar anbragtes reaktionsblandningen på en 2,5 x 50 cm kolonn av Sephadex G-25 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala). Kolonnen hade bragts i jämvikt med O,1M natriumfosfatbuffert (7,0), och eluering genomfördes med samma buffert. Man uppsamlade de fraktioner, vilka uppvisade absorption vid H50 nm och gav den först eluerade toppen.

Dessa eluatfraktioner förenades och dialyserades, först mot Ä l 0,1M natríumfosfatbuffert (pH 7,0) under 16 timmar, därefter mot N 1 0,1M natriumfosfatbuffert (pH 7,0) innehållande 1M natriumk1o= rid under 2ü timmar, och slutligen mot 0,01M natriumfosfatbuffert (pH 7,0) under H8 timmar. Natríumazid tillsattes därefter till en koncentration av 0,1 g per 100 ml. Den resulterande lösningen filtrerades genom ett 0,22 pm Millipore-filter och lagrades däref- ter. - (B) Antikropp-bindningsreaktioner.

Nedan anges de vid analysen använda reagensen.

Reagens _ Sammansättning A 0,1M natriumfosfatbuffert (pH 7,0) B 10 mM H-aminoantipyrin c ' 1,oM glukos D 25 mM 3,5-dikloro-Ä-hydroxibensen- sulfonat i reagens A E 1,2 mg pepparrotsperoxidas/ml reagens A F " oxserumalbumin, 30 g/100 ml (Research Products Division, Miles Laboratories Inc., Elkhart, Indiana, USA) G märkt konjugat IgG-FAD i lösning (se avsnitt A ovan) H apoglukosoxidas I kanin-antiserum mot humant IgG (er- hållet från Behríng Diagnostics, Somerville, New Jersey, USA) J _ Standardlösningar: humant IgG i för- utbestämda halter i reagens A “ï-9fi551lv1 32 Reagensblandningar framställdes nå följande sätt.

Blandning nr 1:- 180 pl reagens A, 20 Pl reagens B, 100 Pl reagens D och 5 Pl reagens G (5,U pM). _ Blandnina nr 2: Olika volvmer av reagens I i enliahet med nedanstående tabell 6 samt reagens A till en total volvm av 300 pl.

Blandning nr-3:.«80 Pl reagens D, 50 pl reagens E, 53 Fl reagens F, 137 Pl reagens A och 1,6 Pl reagens H (4,2 PN FAO-bind- ningsställen). 1 -a_ g Till 300 pl av blandning nr 1 sattes 300 Pl av blandning nr 2 och 300 pl av reagens A i separata reaktionskuvetter., Efter in- kubering vid rumstemperatur under minst 10 minuter sattes 300 Pl, av blandning nr 3 till varje reaktionsblandning. Efter inkubering vid 2000 under ytterligare 30 minuter mättes absorptionen vid 520 nm i varje kuvett. Resultaten är sammanställda i nedanstående ta- bell 6. _ tabell 6 Volym (pl) antiserum-till- _' Absorption satt vid framställning av " ^ - blandning nr 2 _21 ^ '(520 nm 0 ' 0,859 2 0,750 U 0,602 6 0,H9ü 8 O,Hä§ 10 ~ 0,Ul5 12 0,408 1u 0,592 16 0,375 Av försöksresultaten framgår, att när antikropphalten ökar så minskar den glukosoxidasaktivitet som alstras av märkningssubstan- sen FAD konjugerad med IgG.

(C) Konkurrerande bindningsanalyser.

Dessa reaktioner genomfördes med användning av de reagens som anges i avsnitt (B) ovan. Bestämda halter av humant IgG i 300 Fl av reagens A förenades med blandning nr I i separata reak- tionskuvetter. Till varje kuvett sattes därefter en blandning av 12)fl_av reagens I och 288 Pl av reagens A. Efter 10 minuter till- sattes 500 pl av blandning nr 3, och de resulterande blandningarna inkuberades vid 2000 under 30 minuter. Efter denna tidsperiod mät- tes absorptionen vid 520 nm i varje kuvett. De erhållna resultaten är sammanställda i nedanstående tabell 7. 7905514-1 33 Tabell 7 g Mängd tillsatt AbS-Orption hum?nt)IgG (520 Hm) ___ßa___ i __ o ' 0,579 M 0,553 ß _ 0,751 12 ' e ' man 15 ' 0,986 gu ' 1,06 Av försöksresultaten framgår, att den specifika bindníngsana- lysen enligt uppfinningen kan användas för bestämning av en högmole- kylär ligand, såsom humant IgG, i vätskemedier.

Det torde vara uppenbart för fackmannen att de reagensmedel som användes för genomförande av förfarandet enligt uppfinningen kan ha många olika former. Reagensmedlet kan särskilt ha formen av en enhetlig testkomposition, såsom ett lämpligt fast ämne eller en lämp- lig vätska. En testkomposition för bestämning av en ligand i enlig- het med föreliggande uppfinning kan t.ex. innefatta (a) ett märkt konjugat innefattande FAD kopplad till liganden eller en bindnings- analog därtill, (b) en specifik bindningspartner till liganden, och (c)apoghfl«moxidas sm hmm förenas med FAD under bildning av glukos- oxidas. En dylik testkomposition kan även innefatta reagens för mät- ning av glukosoxidasets aktivitet, och om så önskas och är lämpligt kan det märkta konjugatet och apoenzymet vara kombinerade i form av kdfiU9erat.enzymkomplex. Testkompositionen kan naturligtvis även inne- fatta konventionella utspädningsmedel, buffertar,stabiliseringsmedel och liknande. o Reagensmedlet kan även ha formen av en testsats, dvs. en för- packad kombination av behållare innehållande de nödvändiga reagensen.

En testsats för bestämning av en ligand i enlighet med föreliggande uppfinning kan såsom exempel innefatta en eller flera behållare innehållande (a) ett märkt konjugat innefattande FAD kopplad till liganden eller en bindningsanalog därtill, (b) en specifik bindnings- partner till liganden, och (c) apoglukosoxidas som kan kombineras med FAD till bildning av glukosoxidas. En dylik testsats kan också i en eller flera av samma eller olika behållare innehålla reagens för mätning av glukosoxidasets aktivitet, och om så är önskvärt och lämpligt kan det märkta hmfiugmæt och apoenzymet vara kombinerade i form av hxfiugerat enzymkomplex. Enligt en utföringsform innefattar testsatsen minst två separata behållare, av vilka den ena innehåller det märkta konjugatet och eventuellt reagens för mätning av glukos- oxidasaktiviteten, under det att den andra innehåller bindningspart-

Claims (7)

”Iåfi551le-1 34 nern och apoglukosoxidaset. Testsatsen kan naturligtvis innehålla ¿ även andra välkända och önskvärda ämnen, såsom buffertar, utspädnings- medel, standardlösningar och liknande. Patentkrav ' '

1. '_ Homogen specifik bindningsanalys för bestämning av en ligand i ett vätskemedium, varvid en reaktionsblandning bildas genom att vätskemediet bringas i kontakt med reagens innefattande ett konjugat som har en märkningskomponent kopplad till en bind- ningskomponent, vilken kontakt ger ett bindningsreaktionssystem vari en bunden form och en fri form av konjugatet bildas, varvid andelen av märkningkomponenten i de två formerna är en funktion av närvaron av ligand i vätskemediet, och varvid mârkningskomponen- ten ger ett påvisbart gensvar som är olika i de två formerna, var- efter det pâvisbara gensvaret mätes i reaktionsblandningen, k ä n- n e t e c k n a d av att märkningskomponenten är flavinadenindi- _ nukleotid, att reagensen även innefáttár apoglukosoxidas som kan förenas med flavinadenindinukleotid till-bildning av katalytiskt aktivt glukosoxidas, och att glukosoxidasaktiviteten mätes i reak- tionsblandningen. o

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a't av att reagensen innefattar (1) ett konjugat av flavinadenindinukleo- tid kopplad till liganden eller en bindningsanalog därtill, (2) en specifik bindningspartner till liganden och (3) apoglukosoxidas.

3. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att glukosoxidasaktiviteten mätes genom en kolorimetrisk metod.

4. Förfarande enligt krav-1,-k ä n n e t e c k n a t av att liganden är ett antigen eller ett hapten. -f

5. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t_e c k n a t av att den ligand som skall bestämmas är ett antigen eller ett hapten, och att bindningspartnern är en antikropp därtill. I

6. Reagenssystem för bestämning av en ligand i ett vätskemedi- um genom förfarandet_enligt krav 1,~k ä n n e t e c k n a t av att det utgöres av (1) ett konjugat av en bindningskomponent och flavin- adenindinukleotid, och (2) apoglukosoxidas som kan förenas med flavinadenindinukleotid till bildning av aktivt glukosoxidas.

7. Reagenssystem_enligt krav 6, k~ä n n e t e c k n a t av att det innefattar (1) ett konjugat'bestående av märkningskomponen- ten flavinadenindinukleotid kopplad till en ligand eller en bind-_ ningsanalog därtill, (2) en specifik bindningspartner till liganden och (3) apoglukosoxidas. gv9oss14-1 Sammandrag Uppfinningen avser en specifik bindningsanalys för bestämning av en ligand i ett vätskemedium med användning av en rest av en or- ganisk prostetisk grupp, såsom en rest av flavinadenindinukleotid, flavinmononukleotid eller hem, såsom märkningskomponent i ett märkt konjugat. Märkningskomponenten är företrädesvis enbart resten av den prostetiska gruppen eller en holoenzymrest innehållande resten av den prostetiska gruppen i kombination med ett apoenzym i form av ett holoenzymkomplex. I det förra fallet bestämmes märkningskompo- nenten företrädesvis genom tillsättning av ett apoenzym efter initi- ering av bindningsreaktíonen och efter följande mätning av den resul- terande holoenzymaktívíteten. I det senare fallet bestämmes märk-I ningskomponenten helt enkelt genom mätning av holoenzymaktiviteten. Analysförfarandet enligt uppfinningen kan genomföras enligt konven- tionell homogen eller heterogen teknik. De företrädesvis använda apoenzymerna är apoglukosoxidas och apoperoxidas. Analysförfarandet möjliggör kolorimetrisk bestämning, och det kan lätt automatiseras. Uppfinningen avser även reagensmedel, såsom testkompositioner och testsatser, för bestämning av en ligand i ett vätskemedium samt ligander märkta med en prostetisk grupp eller ett konjugerat enzym.