FI70726C - Homogeniskt immunoanalysfoerfarande med flavinadeninnukleotid som maerkeskomponent och detektering av det med apoglukosoxidas - Google Patents

Description

rBl f11. KUULUTUSjULKAISU r,n 0 . «tilrlP B 11 UTLÄG G NIN G SSKRI FT ' J 1 6 C (45) Patentti myönnetty /&&& \3 j n,·.,,,; .·-λ ίο Ί A . . V U U Ο . . - _ Ο >> -i- Ο J_ */ ν_; Ο (51) Kv.lk.*/lnt.CI.* C 12 Q 1/00 SUOMI —FINLAND (21) Pitenttlhikemus - Patentansökning 791937 (22) Hakemispäivä · -Ansökningjdag 1 8.06.79 (FI) (23) Alkupäivä — Giltighctsdag 1 8.06.79 (41) Tullut julkiseksi — Blivit offentlig 23.12.79

Patentti- ja rekisterihallitus Nähtäväks ipanon ja kuul.julkaisun pvm. — . ns

Patent-och registerstyrelsen ' ' Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 2d.0o.öo (86) Kv. hakemus — Int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begärd prioritet 22.06.78 USA(US) 917961 (71) Miles Laboratories, Inc., P.O. Box 40, Elkhart, Indiana A6515, USA(US) (72) William Edward Hornby, Bray, Berkshire, David Lindsay Morris, Stoke Poges, Buckinghamshire, Iso-Britannia-Storbritannien(GB) (71+) Berggren Oy Ab (5^0 Homogeen i nen 1 mmunomäa r i tysmene te I mä , jossa on flaviiniadeniininukleotidi merkkikomponenttina ja sen määrittäminen käyttäen apog1ukoosioksidaasia -Homogen iskt immunoanalysförfarande med flavinadeninnukleotid som markes-komponent och detektering av det med apog1ukosoxidas Tämä keksintö koskee määritysmenetelmiä ja niissä käytettäviä reagensseja, jotka menetelmät ovat homogeenista tai heterogeenistä spesifistä sidontatyyppiä, nesteväliaineessa olevan ligandin kvalitatiiviseksi tai kvantitatiiviseksi määrittämiseksi. Aivan erityisesti keksintö koskee spesifisiä sidontamäärityksiä, joissa käytetään ei-radioisotooppisia leimoja. Edelleen keksintö koskee ei-radioisotooppisesti leimattuja konjugaatteja, jotka on tarkoitettu käytettäväksi tällaisissa määrityksissä, ja menetelmiä niiden valmistamiseksi.

Tavanomaisessa spesifisessä sidontamääritystekniikassa koenäyte yhdistetään eri koostumuksia omaaviin reagensseihin, jotka sisältävät konjugaatin, jossa on seurattava leimakomponentti ja sidonta-komponentti, joka ottaa osaa muihin reagenssien aineosiin, mikäli niitä on, muodostaen sidontareaktiosysteemin, joka tuottaa kaksi lajia tai muotoa leimattua konjugaattia, sidottua lajia ja vapaata lajia. Sen leimatun konjugaatin suhteellinen määrä tai suhde, joka joutuu sidottuun lajiin verrattuna vapaaseen lajiin, on koenäytteestä todettavan ligandin läsnäolon (tai määrän) funktio.

2 n r. <7 o r i u / z 6

Kuvaustarkoituksessa esitetään tavanomaista kilpailevaa sidonta-määritystekniikkaa. Tällaisessa tekniikassa reagenssi koostuisi (1) leimatusta konjugaatista todettavan ligandin muodossa (esim. antigeeni tai hapteeni, jolla tarkoitetaan ainetta, joka voi reagoida selektiivisesti sopivan spesifisyyden omaavien vasta-aineiden kanssa, mutta joka stimuloi näiden vasta-aineiden tuotantoa eläimessä vain ollessaan liittyneenä kantaja-aineeseen, joka ligandi muodostaa konjugaatin sidontakomponentin, joka on kemiallisesti liittynyt leimakomponenttiin, ja (2) spesifisestä ligandille tarkoitetusta sidontaosapuolesta (esim. vasta-aineesta). Yhdistettäessä koenäyte ja reagenssi, todettava ligandi ja leimatun konjugaatin sidontakomponentti kilpailisivat oleellisesti ei-selektiivisellä tavalla ei-kovalenttisesta sitoutumisesta spesifiseen sidontaosapuoleen. Tämän seurauksena joko sen leimatun konjugaatin määrä, joka joutuisi sidotuksi sidontaosapuoleen (ts. joka joutuu sidottuun lajiin) tai se määrä, joka jäisi vapaaksi (ts. sitoutumatta sidontaosapuoleen ja joka täten joutuu vapaaseen lajiin) voidaan mitata läsnäolevan kilpailevan ligandin määrän funktiona. Leimatun konjugaatin määrä, joka joutuu jompaan kumpaan lajiin, määritetään mittaamalla, ts. seuraamalla siinä olevaa leimakomponenttia.

Kun leimattu konjugaatti sidotussa lajissa ja vapaassa lajissa ovat oleellisesti erottamattomissa laitteella, jota käytetään leimakomponentin seuraamiseen, sidottu laji ja vapaa laji on erotettava fysikaalisesti määrityksen loppuunsaattamiseksi.

Tämän tyyppisestä määrityksestä käytetään alalla nimitystä "heterogeeninen". Kun leimatun konjugaatin sidotut ja vapaat lajimuodot voidaan erottaa toisistaan, voidaan käyttää "homogeenista" määritysmuotoa ja välttää erotusvaihe.

Ensimmäiseksi keksitty erittäin herkän spesifisen sidontamäärityksen tyyppi on radioimmunomääritys, jossa käytetään radioaktiivista isotooppia leimakomponenttina. Tällaisessa määrityksessä on välttämättä noudatettava heterogeenista muotoa, sillä leiman seurattava luonne on kvalitatiivisesti muuttumaton vapaassa ja sidotussa lajissa. Johtuen radioaktiivisten aineiden käsittelyn hankaluudesta ja vaikeudesta on keksitty monia uusia määrityssysteemejä, joissa käytetään leimakomponenttina muita kuin radioisotooppeja, 3 70726 kuten entsyymejä, fluoresoivia molekyylejä, bakteriofageja, metalleja ja organometallikomplekseja, koentsyymejä, entsyymialustoja, entyymi-inhibiittoreita, syklisiä reagensseja ja kemiluminesenssi-reagensseja.

Seuraavassa julkaisussa esitetään useita eri heterogeenisia sidonta-reaktiosysteemejä, joissa käytetään entsyymiä leimakomponenttina: US-patentit n:ot 3 654 090; 3 791 932; 3 839 153; 3 850 752 ja 3 879 262; J. Immunol. Methods 1:247 (1972); ja J. Immunol. 109:129 (1972). Heterogeenista sidontamääritystä, jossa käytetään spektro-fotometrisesti todettavan aineen ei-aktiivista edeltäjää leimaus-aineena, ehdotetaan US-patentissa n:o 3 880 934. Koskien heterogeenisten määritysten taustaa mielenkiintoinen on edelleen teos Principles of Competitive Protein-Binding Assays, toimittaneet Odell ja Daughaday (J. B: Lippincott Co., Philadelphia, 1972).

Homogeenista tyyppiä olevaa entsyymileimattua immunomääritystä kuvataan US-patentissa n:o 3 817 834, jossa käytetään ligandi-entsyymikonjugaattia. Konjugaatin entsymaattinen aktiivisuus sidotussa lajissa on mitattavasti pienempi kuin vapaassa lajissa, mikä sallii homogeenisen määritystavan käytön. Erityisen ainutlaatuisten materiaalien käyttöä leimausaineina, mukaanluettuna koentsyymit, kemiluminesenssimolekyylit, sykliset reagenssit ja lohkaistavat fuoresoivat entsymyymiaineet sekä homogeenisessa että heterogeenisessa määritystavassa kuvataan DE-patenteissa n:ot 2 618 419 ja 2 618 511.

Patenttijulkaisut FI C 54 034 ja US 3 879 262 koskevat "ELISA"-tyyppistä (Enzyme Linked Immunosorbant Assay) immunomääritystä, jossa käytetään entsyymi merkkiaineita, kun taas esillä olevassa keksinnössä käytetään merkkiaineena flaviiniadeniininukleotidia, jolloin voidaan suorittaa homogeeninen määritys ilman erotusvai-hetta.

US-patenttijulkaisu 4 134 792 kohdistuu koskemattomien entsyymien (aktiivisten entsyymien) modulaattorien käyttöön merkkiaineena, kun taas esillä olevassa keksinnössä käytetään merkkiaineena konju-goidun entsyymin ei-proteiinia olevaa prosteettista ryhmää. Tällainen merkkiainemuoto on määriteltävissä, kun se liitetään uudelleen inaktiivisen apoentsyyminsä proteiiniosaan, jolloin saadaan määritettävissä oleva aktiivinen entsyymi.

70726

Vaikka ei-radioisotooppisten leimojen etsintä sidontamäärityksissä on tuottanut lukuisia käyttökelpoisia ratkaisuja, jää parannuksille vielä tilaa. Entsyymileimatut lähestymistavat näyttivät aluksi olevan lupaavimpia; käytännössä kuitenkin on ilmennyt useita vaikeuksia. Entsyymien korkea molekyylipaino ja poikkeava luonne synnyttävät ongelmia leimattujen konjugaattien karakterisoinnissa, stabiloinnissa ja toistettavassa valmistuksessa. Nämä ongelmat voitettiin korvaamalla entsyymileimat molekyylipainoltaan alhaisilla leimoilla, joita voidaan seurata niiden reagoivan aineen aktiivisuuden perusteella. Näitä uusia leimoja, mukaanluettuna koentsyymit, entsyymisubstraatit, sykliset reagenssit ja kemilumi-nesenssireagenssit, voidaan käyttää erittäin herkkien ja käyttökelpoisten määritysten muodostamiseen. Näiden leimojen seuraaminen vaatii kuitenkin usein instrumentointia, jota tällä hetkellä ei yleisesti ole kliinisessä laboratoriossa.

Tämän keksinnön ensisijaisena tarkoituksena on saada aikaan ei-radioisotooppinen sidontamääritys, jossa käytetään uutta leimausta, joka on seurattavissa standardikliinisellä laboratoriolaitteistolla samalla, kun säilytetään reagenssi-leimauksen edut mitä tulee herk- 70726 kyyteen, käyttökelpoisuuteen ja leimattujen konjugaattien synteesin ja karakterisoinnin helppouteen.

Nyt on havaittu, että parannettu spesifinen sidontamääritys saadaan aikaan käyttämällä orgaanista prosteettisen ryhmän jäännöstä leimauskom-ponenttina leimatussa konjugaatissa. Prosteettiset ryhmät ovat alalla tunnettu entsyymin kofaktoreiden luokka. Entsyymin kofaktori on ei-proteiininen aine, jonka läsnäoloa vaaditaan, jotta entsyymi voisi osoittaa katalyyttisen aktiivisuutensa ja jolle tapahtuu kemiallinen muutos kyseisen entsyymin (josta käytetään nimitystä alkuperäentsyymi) katalyyttisen kierto jakson aikana. Koentsyymi on eräs entsyymin kofaktorityyppi, joka on kemiallisesti modifioi-tunut alkuperäentsyymin katalysoiman reaktion kuluessa. Kofakto^· fin alkuperäisen muodon regenerointi vaatii sen osanottoa erilliseen reaktioon, jota katalysoi muu entsyymi kuin alkuperäentsyymi. Sitävastoin prosteettinen ryhmä on entsyymin kofaktori, joka on kemiallisesti modifioitunut sen reaktion aikana, jota alkuperäentsyymi katalysoi ja se regeneroidaan, ts. muutetaan takaisin alkuperäiseen muotoonsa toisella reaktiolla, jota katalysoi sama alkuperäentsyymi.

Prosteettisille ryhmille on tavallisesti luonteeomaista, että ne ovat suhteellisen lujasti sitoutuneet alkuperäentsyymin proteiiniosaan, joka proteiiniosa tunnetaan apoentsyyminä ja joka katalyyttisesti aktiivinen alkuperäentsyymi tunnetaan holoentsyyminä. Tasapaino-reaktio prosteettisen.ryhmän ja apoentsyymin väliselle vuorovaikutukselle voidaan esittää seuraavasti:

Prosteettinen ryhmä + apoentsyymi i - -* konjugoitu tai holoentsyymi (Pr) (Apo) (Pr-Apo) Tässä käytettynä sanonta konjugoitu entsyymi viittaa kompleksiin, joka on muodostunut prosteettisen ryhmän ja apoentsyymin yhdistymisellä olipa tällä kompleksilla katalyyttistä aktiivisuutta tai ei ja sanonta holoentsyymi viittaa vain katalyyttisesti aktiiviseen konjugoituun entsyymiin. Lisätietoa koskien korvaavia ryhmiä, niiden ominaispiirteitä ja vuorovaikutuksia apoentsyymien kanssa voidaan saada viittaamalla teokseen Dixon & Webb, Enzymes, 1. painos, Longmans, Green & Co. (London 1958).

Tässä keksinnössä orgaaninen prosteettinen ryhmä liitetään sidontakcmpo-nenttiin leimatun konjugaatin muodostamiseksi sidontamäärityk- 6 70726 sissä käyttöä varten. Keksinnön keskeinen piirre on tuloksena oleva vuorovaikutus konjugoidun prosteettisen ryhmän ja apoentsyymin välillä, joka esitetään seuraavasti: Q-Pr + Apo ( (^)-Pr-Apo

Katalyyttisesti inaktii- Aktiivinen holoentsyymi- visia komponentteja kompleksi

Vaikka yllä esitetty reaktio on normaalisti havaittu vuorovaikutus, on odotettavissa että tietyissä olosuhteissa konjugoidulla entsyymi-kompleksilla on vain vähän tai ei lainkaan holoentsyymiaktiivisuutta, kuten silloin kun korvaavan ryhmän konjugointi estää normaalin holo-entsyymi-substraattivuorovaikutuksen. Tässä keksinnössä hyödyllisiä leimattuja konjugaatteja voi joka tapauksessa muodostua, jos sidottaessa konjugoidun prosteettisen ryhmän sidontakomponentti (jota edustaa symboli(^)- yllä) määrityksen sidontareaktiossa, sidotulla konjugoidulla ensyymikompleksilla tällöin on holoentsyymiaktiivisuutta, kuten silloin kun tällainen sidonta estää holo-entsyymi-substraattivuorovaikutuksen inhibointia.

On olemassa lukuisia mahdollisia leiman seurantatapoja, joista eräitä kuvataan jäljempänä, jotka seuraavat mitä tahansa tunnetuista homogeenisista ja heterogeenisista sidontaraenetelmistä. Kuitenkin kaikissa tapauksissa sen leimatun konjugaatin leimakomponentti, joka osallistuu sidontareaktioon, sisältää orgaanisen prosteettisen ryhmän jäännöksen ja seurantakaavio käsittää leimakomponentin määrityksen sidotussa lajissa tai vapaassa lajissa tai molemmissa kulloinkin tapauksen mukaan perustuen holoentsyymiaktiivisuuden mittaukseen.

Prosteettisen ryhmän jäännökset, joita on suositeltavaa käyttää tässä keksinnössä, ovat flaviiniadeniinidinukleotidin, flaviinimononuk-leotidin ja hemin jäännöksiä. Suositeltavia prosteettisen ryhmän jäännöksen ja apoentsyymin muodostamia pareja ovat flaviiniadeniinidi-nukleotidi/apoglukoosioksidaasin jäännökset ja hemi/apoperoksidaa-sin jäännökset. Tällaisista pareista muodostuneita vastaavia holo-entsyymejä on helppo seurata hyvin tunnetulla vetyperoksidimittaus-tekniikalla, johon kuuluvat kolorimetriset ja fluorimetriset menetelmät. Johtuen seuratun holoentsyymin katalyyttisestä luonteesta leimakomponentin läsnäolo vahvistetaan moninkertaisesti seuranta- 70726 reaktiossa, mikä tekee mahdolliseksi määritettävän ligandin erittäin herkän toteamisen (esim. tasoilla ng/ml) käyttäen suhteellisen epäherkkää, mutta helposti saatavissa olevaa ja yksinkertaista instrumentointia, kuten spektrofotometrejä. Yhdistelmä, jonka muodostavat kyky käyttää molekyylipainoltaan alhaista prosteettisen ryhmän molekyyliä komponenttina, jonka välityksellä leima liitetään leimatussa yhteenliittymässä olevaan sidontakomponenttiin, ja kyky saavuttaa erittäin herkkä ilmaisu spektrofotometrisella, erityisesti kolorimetrisella mittauksella, saa aikaan ainutlaatuisen edullisen spesifisen sidontamäärityksen.

Kyseessä olevalle määritykselle ovat luonteenomaisia erittäin herkät ilmaisurajat, helppo sovellettavuus automatisointiin, leiman seurannan mahdollistaminen kliinisistä laboratorioista yleisesti löytyvällä instrumentoinnilla ja leimattujen konjugaattien käyttö, jotka voidaan toistettavasti ja suhteellisen yksinkertaisesti valmistaa .

Tämän selostuksen yhteydessä seuraavat sanonnat määritellään seuraavasti ellei toisin mainita: "ligandi” on aine tai toisiaan muistuttavien aineiden luokka, joiden läsnäolo tai määrä nesteväliaineessa on määritettävä; "spesifinen ligandin sidososapuoli" on aine tai aineiden luokka, jolla on spesifinen sidosaffiniteetti ligandiin nähden muiden aineiden poissulkemiseksi; "ligandin spesifinen sidos-analogi" on mikä tahansa aine tai aineiden ryhmä, joka käyttäytyy oleellisesti samoin kuin ligandi mitä tulee spesifisen sidososapuo-len sidosaffiniteettiin ligandiin nähden; "jäännös" on osa orgaanisessa molekyylissä, esimerkiksi prosteettisen ryhmän jäännös leimatussa konjugaatissa on orgaaninen osa tällaisessa konjugaatissa, joka on peräisin prosteettisesta ryhmästä ja toimii oleellisesti sellaisena, kuten prosteettinen ryhmä ilman vetyatomia asemassa, jonka välityksellä prosteettinen ryhmä on liittynyt leimatun konjugaatin jäljellä olevaan osaan (FAD-ligandilla leimatussa konjugaatissa FAD edustaa prosteettisen flaviiniadeniininukleotidi-ryhmän jäännöstä) ; "reagenssiväline" on seos, laite tai koelaitesarja, joka sisältää määritysmenetelmän suorittamiseen käytetyt reagenssit; "seuranta-reaktio" on reaktio, jossa leimatun konjugaatin leimakomponentti määritetään mittaamalla holoentsyymiaktiivisuus; "alempi alkyyli-ryhmä" on suoraketjuinen tai haaroittunut alkyyliryhmä, joka sisältää 1-6 hiiliatomia, molemmat luvut mukaanluettuna, kuten metyy-Li-, etyyli-, isopropyyli- ja heksyyliryhmä.

8 70726

Kyseessä olevaa määritysmenetelmää voidaan soveltaa minkä tahansa ligandin ilmaisemiseen, jolle on olemassa spesifinen sidososapuoli. Ligandi on tavallisesti peptidi, proteiini, hiilihydraatti, glyko-proteiini, steroidi tai muu orgaaninen molekyyli, jolle on olemassa spesifinen sidososapuoli biologisessa systeemissä tai joka voidaan syntetisoida. Ligandi valitaan tavallisesti funktionaalisessa mielessä ryhmästä, johon kuuluvat antigeenit ja niiden vasta-aineet; hap-teenit ja niiden vasta-aineet; ja hormonit, vitamiinit, aineenvaihdunta- ja farmakologiset aineet ja niiden reseptorit ja sidosai-neet. Tyypillisiä esimerkkejä ligandeista, joita voidaan todeta käyttäen tätä keksintöä ovat hormonit, kuten insuliini, sikiön gonadotropiini, kilpirauhashormonit ja estrioli; antigeenit ja hap-teenit, kuten ferritiini, bradykiniini, prostaglandiinit ja spesifiset kasvainantigeenit; vitamiinit, kuten biotiini, vitamiini B-^, foolihappo, vitamiini E, vitamiini A ja askorbiinihappo; aineenvaihdunta-aineet, kuten 3',51-adenosiinimonofosfaatti ja 3',5’-guano-siinimonofosfaatti; farmakologiset aineet tai lääkkeet, kuten pahoin-voinninestoaineet, keuhkoputken laajentajat, sydänverisuonilääkkeet, ja väärinkäyttölääkkeet; vasta-aineet, kuten mikrosomivasta-aine ja maksatulehduksen ja allergeenien vasta-aineet; ja spesifiset sidontareseptorit, kuten tyroksiinia sitova globuliini, avidiini, sisätekijä ja transkobalamiini. Kyseessä oleva määritysmenetelmä on erityisen hyödyllinen hapteenien ja niiden analogien toteamiseen, joiden molekyylipaino on välillä 100-1000, erityisesti kilpirauhasen jodityroidihormoonien, tyroksiinin ja liotyroniinin toteamiseen.

Testattava nesteväliaine voi olla luonnossa esiintyvä tai keinotekoisesti muodostettu neste, jonka epäillään sisältävän ligandia ja tavallisesti se on biologinen neste tai neste, joka on saatu sen laimennuksesta tai muusta käsittelystä. Biologisia nesteitä, joita voidaan analysoida noudattaen kyseessä olevaa menetelmää, ovat seerumi, plasma, virtsa, sylki ja vesikalvoon kuuluvat ja aivoselkäydinnesteet. Muita materiaaleja kuten kiinteää materiaalia, esimerkiksi kudosta voidaan analysoida muuntamalla se nestemuotoon, kuten liuottamalla kiinteä aine nesteeseen tai kiinteän aineen nesteuutolla.

Leimattu konjugaatti Tämän keksinnön leimattu konjugaatti sisältää orgaanisen prosteetti-sen ryhmän jäännöksen leimakomponentissaan ja voi olla jommassa kummassa kahdessa perusmuodossa, joita esitetään kaavamaisesti seuraavasti : 70726

Kaavamainen kaava Leimakomponentti

Pr-R-L Prosteettisen ryhmän jäännös (Pr-)

Apo-Pr-R-L Holoentsyymi- tai konjugoitu entsyymi- jäännös (Apo-Pr-) joissa Pr edustaa prosteettisen ryhmän jäännöstä ja Apo apoentsyymiä, R on yhdistävä ryhmä ja L on leimatun konjugaatin sidoskompo-nentti, tavallisesti ligandi- tai sen sidosanalogi. Tavallisesti sidoskomponentti ja prosteettisen ryhmän jäännös liitetään yhteen yhdistävän ryhmän välityksellä ensinmainitun sellaisesta kohdasta, joka on erillään sen spesifisestä sidoskohdasta (ts. sidoskomponentin kohdasta, joka osallistuu määrityksen sidontareaktioon, kuten immu-nokemiallisesta sidoskohdasta, jossa sidoskomponentti on antigeeni, hapteeni tai niiden vasta-aine) ja viimeksi mainitun kohdasta, joka on erillään sen aktiivisesta, apoentsyymille tarkoitetusta sidoskohdasta .

Määritysmenetelmät Käytettävissä on erilaisia menetelmiä uusien, tämän keksinnön mukaisten leimattujen konjugaattien seuraamiseksi. Joka tapauksessa prosteettisen ryhmän jäännös on kovalenttisesti liittynyt leimatussa komponentissa olevaan sidoskomponenttiin ja seurantareaktio käsittää holoentsyymiaktiivisuuden mittaamisen sidotussa lajissa tai vapaassa lajissa tai molemmissa kulloisenkin tapauksen mukaan.

Ainoastaan kuvaamistarkoituksessa seuraavat ovat esimerkkejä useista seurantakaavioista, jotka perustuvat homogeeniseen ja heterogeeniseen kilpailevaan sidontatekniikkaan samalla, kun on ymmärrettävä, että käytännössä voidaan noudattaa muita homogeenisia ja heterogeenisia tekniikoita.

Alla olevassa esityksessä käytetään seuraavia lyhennyksiä yhdenmukaisesti jäljellä olevan kuvauksen kanssa:

Sanonta Lyhennys

Prosteettisen ryhmän jäännös Pr apoentsyymi Apo yhdistävä ryhmä r

ligandi L

sidososapuoli B

konjugoidun entsyymin jäännös Apo-Pr holoentsyymijäännös (aktiivinen) f Apo-Pr] 10 70726

Valaiseva seurantakaavio nro 1

Homogeeninen kilpaileva sidontamenetelmä - apoentsyymi liitetty sidontareaktion initioinnin jälkeen

L (näyte) + Pr-R-L + B ;» L-B + Pr-R-L-B

Λ + Apo (sidottu laji)

V

Apo + [Apo-Pr-R-L

(vapaa laji; aktiivinen holoentsyymi) Tässä kaaviossa leimakomponenttina olevaa prosteettisen rvhmän jäännöstä seurataan lisäämällä apoentsyymiä oleellisesti samanaikaisesti si-dosreaktion initioinnin kanssa tai sen jälkeen, ts. sidosreaktion aikana tai sen jälkeen, kun sidosreaktio on saavuttanut tasapainon, ja mittaamalla holoentsyymin aktiivisuus lopullisessa reaktioseok-sessa. Määritys on homogeeninen valitsemalla sellaiset olosuhteet, että apoentsyymin sitoutuminen prosteettisen ryhmän jäännökseen inhi-boituu sidotussa lajissa olevan prosteettisen ryhmän osalta. Vaihtoehtoisesti olosuhteet voidaan valita siten, että apoentsyymi voi sitoutua leimatun konjugaatin sidottuun muotoon, mutta saadulla konjugoidulla entsyymikompleksilla ei ole entsymaattista aktiivisuutta, kuten sellaista, joka johtuu entsyymi-substraattivuo-rovaikutuksen inhiboitumisesta (tätä tilannetta ei ole esitetty yllä olevassa kaaviossa). Kummassakin tapauksessa systeemissä mitattu entsyymiaktiivisuuden kokonaismäärä on tulosta apoentsyymin inhi-boitumattomasta sitoutumisesta vapaaseen leimattuun konjugaat-tiin ja tästä johtuen se on suora funktio näytteen ligandimäärästä, joka on käytettävissä kilpailuun sitoutumisesta sidososapuoleen.

Saattaisi myös sattua (mutta ei ole myöskään esitetty yllä) että, päinvastoin kuin yllä olevissa kaavioissa, leimattu konjugaatti (Pr-R-L) muodostuu siten, että sitoutuminen apoentsyymiin estyy, mutta että sidottaessa leimattu konjugaatti sidososapuoleen, tämä inhiboituminen helpottuu ja apoentsyymi kykenee sitoutumaan leimattuun konjugaattiin sidotun lajin kanssa muodostaen aktiivisen holoentsyymikompleksin. Tällaisssa tapauksessa systeemiin saatava holoentsyymiaktiivisuuden määrä on käänteinen funktio näytteessä läsnä olevan ligandin määrästä.

Valaiseva seurantakaavio n:o 2

Heterogeeninen kilpaileva sidontamenetelmä - apoentsyymi liitetty sidontareaktion initioinnin jälkeen.

70726 11

L (näyte) + Pr-R-L + B . > L-B + Pr-R-L-B

Λ + Apo

V

Apo + Apo-Pl-R-L + Apo-pj-R-L-B

(vapaa laji, (sidottu laji, aktiivinen aktiivinen holoentsyymi) holoentsyymi) v erilliset Tässä kaaviossa käytetään samoja reagensseja ja lisäysjärjestystä kuin yllä kuvatussa kaaviossa n:o 1, paitsi että olosuhteet ovat sellaiset, että apoentsyymi voi sitoutua sidotussa lajissa olevaan leimattuun konjugaattiin aktiivisen holoentsyymikompleksin muodostamiseksi, joka on kvalitatiivisesti erotettavissa siitä, joka on muodostunut sitoutumalla leimatun konjugaatin vapaaseen lajiin. Sidottu laji ja vapaa laji on erotettava toisistaan ja entsyymiaktiivisuus toisessa niistä on funktio näytteessä olevan ligan-din määrästä.

Valaiseva seurantakaavio n:o 3

Homogeeninen kilpaileva sidontamenetelmä - apoentsyymi liitetty ennen sidontareaktion initiointia

Pr-R-L + Apo -* Apo-Pr-R-L

(aktiivinen holoentsyymi)

L (näyte) + |Apo-Pr|-R-L + B ^ i L-B + Apo-Pr-R-L-B

(vapaa laji; (sidottu laji; aktiivinen inaktiivinen) holoentsyymi) Tässä kaaviossa prosteettisen ryhmän jäännös sisällytetään leimakompo-nenttiin liittämällä se ligandiin ja yhdistämällä apoentsyymiin aktiivisen holoentsyymituotteen muodossa. Prosteettisen ryhmän jäännöstä seurataan mittaamalla holoentsyymin aktiivisuus lopullisessa reaktio-seoksessa. Määritys on homogeeninen valitsemalla sellaiset olosuhteet, että sidottaessa sidososapuoli aktiiviseen holoentsyymikomp-leksiin, tuloksena olevalla sidotulla muodolla on sellainen inhiboitu entsyymiaktiivisuus, joka johtuu entsyymi-substraatti- 12 7 0 7 2 6 vuorovaikutuksen inhiboinnista. Systeemistä mitattu entsyymiaktiivisuuden kokonaismäärä on tulosta sitoutumattomasta aktiivisesta holoentsyymikompleksista, ts. vapaasta muodosta ja tästä johtuen se on suora funktio näytteessä olevan ligandin määrästä.

Saattaisi myös sattua (mutta sitä ei ole esitetty yllä) että, päinvastoin kuin yllä olevassa kaaviossa, leimatulla konjugaatilla on vain vähän tai ei lainkaan entsymaattista aktiivisuutta, mutta sidottaessa sidososapuoli sidottulajisella muodolla itse asiassa on mitattava tai parantunut entsymaattinen aktiivisuus. Tällaisessa tapauksessa systeemiin saatu holoentsyymiaktiivisuuden määrä on käänteinen funktio näytteessä olevan ligandin määrästä.

Valaiseva seurantakaavio n:o 4

Heterogeeninen kilpaileva sidontamenetelmä - apoentsyymi liitetty ennen sidontareaktion initiointia

Pr-R-L + Apo -> Apo-Pr-R-L

(aktiivinen holoentsyymi)

L (näyte) + Apo-Pr-R-L + B < .... > L-B + Apo-Pr-R-L-B

(vapaa laji; (sidottu laji; aktiivinen aktiivinen holoentsyymi) holoentsyymi) erilliset Tässä kaaviossa käytetään samoja reagensseja ja lisäysjärjestystä kuin yllä kuvatussa kaaviossa n:o 3 paitsi, että olosuhteet ovat sellaiset, että sekä sidottu että vapaa muoto ovat entsymaattisesti aktiivisia ja kvalitatiivisesti erotettavissa toisistaan. Sidottu laji ja vapaa laji on erotettava ja entsyymiaktiivisuus toisessa niistä on funktio näytteessä olevan ligandin määrästä.

Kaaviot nro 3 ja nro 4 ovat oleellisesti entsyymileimattuja määritystapoja paitsi, että päinvastoin kuin alalla aikaisemmin entsyymi sellaisenaan liitetään leimatun konjugaatin sidoskcmponenttiin pros-teettisen ryhmän jäännöksen välityksellä. Tässä suhteessa tämä keksintö tarjoaa tällöin uuden menetelmän valmistaa entsyymileimattu konjugaatti, joka käsittää vaiheet, joissa (a) kovalenttisesti 13 7 C 7 2 6 liitetään sidoskomponenttiosa (ts. todettava ligandi tai sidosana-logi tai sen osapuoli) orgaaniseen prosteettiseen ryhmään, joka kykenee yhdistymään apoentsyymin kanssa muodostaen konjugoidun entsyymin, esim. aktiivisen holoentsyymin, (b) yhdistetään saatu prosteettisella ryhmällä leimattu konjugaatti apoentsyymin kanssa ja (c) eristetään saatu konjugoidulla entsyymillä leimattu konjugaatti. Todetaan, että tällainen menetelmä on arvokkain valmistettaessa entsyymileimattuja yhteenliittymiä käytettäväksi määrityksissä johtuen siitä hallitusta tavasta, jolla molekyylipainoltaan alhainen ja hyvin karakterisoitu prosteettinen ryhmä voidaan liittää sidoskompo-nenttiin.

Yllä olevasta selostuksesta käy ilmi, että tietyille leimattujen konjugaattien ja ligandi/sidososapuolien pareille yksi tai useampi kuvatuista homogeenisista kaavioista on sopiva riippuen useista tekijöistä, kuten apoentsyymin kyvystä sitoutua leimatun konju-gaatin sidottuun muotoon ja vaikutuksesta, joka sidososapuolen sitoutumisella on konjugoituun entsyymikompleksiin. Kun leimatun konjugaatin sidotulla ja vapaalla muodolla on erotettavissa olevaa aktiivisuutta, voidaan käyttää heterogeenista tapaa hyödyllisen määrityksen aikaansaamiseen. Näin ollen vaikka olosuhteet sanelevat, mikä käsittelytapa tai -tavat kulloinkin ovat hyödyl-lisimmät, kyseessä oleva määritysmenetelmä on yleensä sovellettavissa mihin tahansa tavanomaiseen homogeeniseen tai heterogeeniseen tek-nikkaan.

Homogeeniset tekniikat

Homogeenista tekniikkaa, ts. sellaista joka ei vaadi sidotun lajin ja vapaan lajin fysikaalista erottamista voidaan käyttää, kun reaktio leimatun konjugaatin sidoskomponentin ja vastaavan sidososapuolen välillä aiheuttaa mitattavan muutoksen, joko positiivisessa tai negatiivisessa mielessä, leimatun konjugaatin leimakomponentin kykyyn osallistua seurantareaktioon, ts. leimatun konjugaatin kykyyn yhdistyä apoentsyymin kanssa ja/tai omata holoentsyymiaktiivisuutta. Tällaisessa tapauksessa makomponentin jakautuminen sidotun lajin ja vapaan lajin välillä voidaan määrittää erottamatta lajeja. Reaktioseoksessa oleva holoentsyymi-aktiivisuus määritetään sitten muodostamalla ainakin osassa sitä tällaisen holoentsyymin katalysoima reaktio, esim. lisäämällä substraattia ja mittaamalla jollakin tavanomaisella tekniikalla muodostuvan tuotteen kasauman määrä tai reagenssin kulutuksen nopeus.

14 70726

Nestevälaineessa olevan ligandin kvalitatiivinen määritys käsittää mitatun määrän vertaamisen seurantareaktion määrään nesteväliai-neessa ilman ligandia, mahdollisen eron niiden välillä ollessa osoitus tällaisen ligandin läsnäolosta testatussa nesteessä. Ligandin kvantitatiivinen määritys nestevällaineessa käsittää mitatun määrän vertaamisen seurantakaavion määrään nestevälaineissa, jotka sisältävät eri tunnettuja määriä ligandia, esim. vertaamisen standardikäy-rään.

Yleensä kun noudatetaan homogeenista määritystekniikkaa, spesifisen sidosreaktion komponentteja, ts. nestemäistä väliainetta, jonka epäillään sisältävän ligandia, leimattua konjugaattia ja joissakin systeemeissä (ts. kilpailevassa sidossysteemissä) ligandin spesifistä sidososapuolta, voidaan yhdistää mikä tahansa määrä, millä tahansa tavalla ja järjestyksessä edellyttäen, että leimatun konjugaatin leimakomponentin aktiivisuus on mitattavasti muuttunut, kun nesteväliaine sisältää ligandia merkittävän määrän tai pitoisuuden määrityksen tarkoituksiin. Edullisesti kaikki spesifisen sidosreaktion komponentit ovat liukoisia nesteväliaineeseen.

Tunnettuja muunnoksia yllä lyhyesti kuvatuista homogeenisista menetelmistä ja lisäyksityiskohtia koskien selostettua erikoistekniikkaa mukaanluettuna vaihtoehtoinen tekniikka, joka tunnetaan suorana si-dostekniikkana, on helposti löydettävissä kirjallisuudesta, esim. saksalainen patentti n:o 2 618 511.

Heterogeeniset tekniikat

Kyseessä olevien uusien leimojen käyttöä voidaan soveltaa myös tavanomaiseen heterogeenistyyppiseen määritystekniikkaan, jossa leimatun konjugaatin sidottu ja vapaa laji erotetaan ja leimakompo-nentti jommassa kummassa määritetään. Reagenssivälineet tällaisen heterogeenisen määrityksen suorittamiseksi voivat saada monia eri muotoja. Yleensä nämä välineet käsittävät kolme perusaineosaa, jotka ovat (1) todettava ligandi, (2) ligandin spesifinen sidososapuoli ja (3) leimattu konjugaatti. Sidosreaktion aineosat yhdistetään samanaikaisesti tai sarjana lisäyksiä ja sopivalla inkubointijaksolla tai -jaksoilla leimattu konjugaatti tulee sidotuksi sitä vastaaviin sidososapuoliin siten, että sitoutumisen määrä, ts. leimatun konjugaatin sidososapuolen sitoutuneen (sidottu laji) määrän suhde sitoutumattomaan (vapaa laji) määrään, on funktio läsnä olevan il 70726 ligandin määrästä. Sidottu ja vapaa laji erotetaan fysikaalisesti ja leiman määrä toisessa niistä määritetään mittaamalla siinä oleva holoentsyymiaktiivisuus ja vertaamalla sitä negatiiviseen vertailu-näytteeseen tai standardituloksiin, esim. standardikäyrään.

Erilaisia keinoja erotusvaiheen suorittamiseksi ja sidosreaktiosys-teemien muodostamiseksi on alalla käytettävissä. Erotus voi käsittää sellaisia tavanomaisia tekniikoita kuten ne, joihin liittyy se, mikä yleisesti tunnetaan kiinteäfaasisena vasta-aineena tai antigeeninä, toisena vasta-aineena tai kiinteäfaasisena toisena vasta-aineena, sekä immuunisten konpleksisaostusaineiden ja adsorntioaineiden kävttö jne. Sidosreaktiosysteemejä, joita voidaan noudattaa, ovat nk.kilpaileva sidostekniikka, peräkkäiskyllästystekniikka, "voileipä"-tek-niikka jne. Lisäyksityiskohtia koskien eri tunnettuja heterogeenisia systeemejä, on helposti löydettävissä kirjallisuudesta, esim. saksalainen patentti n:o 2 618 419.

On huomattava, että käsittelytekniikoita, joihin liittyy muita lisäys järjestyksiä ja muita sidosreaktiotapoja, voidaan keksiä homogeenisten ja heterogeenisten spesifisten sidontamääritysten suorittamiseen poikkeamatta tässä hahmotellusta keksintökäsitteestä.

Prosteettinen ryhmä

Kuten aikaisemmin mainittiin, prosteettiset ryhmät ovat alalla tunnustettu erillinen entsvymikofaktoreiden luokka, joille on ensisijaisesti ominaista, että alkuperäinen apoentsyymi kykenee regeneroimaan ne aktiiviseen kofaktorimuotoon. Tässä keksinnössä käytetään orgaanisia prosteettisia ryhmiä, jotka voidaan kemiallisesti liittää leimatussa konjugaatissa olevaan sidoskomponenttiin. Tavallisesti sidosva-kio apoentsyymin ja sen prosteettisen ryhmän yhdistämiselle, jonka jäännös sisältyy tämän keksinnön leimattuun konjugaattiin , on suurempi kuin n. 10® mol ^ ja edullisesti yli 10® mol Leimatussa konjugaatissa esiintyvän prosteettisen ryhmän jäännöksen varsinaista sidos-affiniteettia voidaan pienentää vapaan prosteettisen ryhmän af f initee-tista muutamalla prosentilla tai jopa kaksi kertaluokkaa vaikuttamatta tällaisen prosteettisen ryhmän jäännöksen hyödyllisyyteen leima-komponenttina sidontamäärityksessä.

Seuraavassa on taulukko, jossa luetellaan useita tässä keksinnössä hyödyllisiä prosteettisia ryhmiä, konjugoitu entsyymi, joka on muodos- 70726 16 tunut niiden yhdistyessä apoentsyymiin, ja sidosvakiot prosteettisen ryhmän ja apoentsyymin yhdistymiselle:

Prosteettinen Sidosvakio ryhmä Konjugoitu entsyymi (molaarisuus ) Viite flaviiniadenii- glutationireduktaasi 2 x 10^ 1,3 nidinukleotidi (ihmisen punasolut) (FAD) 9 flaviinimono- sytokromireduktaasi 10 2 nukleotidi (hiiva) (FMN) FMN NADPH: oksidoreduktaasi 3 x 10^ 2 ("vanha keltainen entsyymi") g FAD glukoosioksidaasi >10 4 (Aspergillus niger) g FAD lipoamididehydrogenaasi 4 x 10 5 7 FMN pyridoksiinifosfaatti- 5 x 10 6 oksidaasi 9 hemi peroksidaasi (pipar- >10 7 juuri) g hemi sytokromi C >10 8 1) Scott et ai., J. Biol. Chem. 238:3928 (1963) 2) Haas et ai., J. Biol. Chem. 143:341 (1942) 3) Staal et ai., Biochim. Biophys. Acta 185:39 (1969) 4) Swoboda, Biochim. Biophys. Acta 175:365 (1969) 5) Visser ja Veeger, Biochim. Biophys. Acta 206:224 (1970) 6) Arsenis ja McCormick, J. Biol. Chem. 241:330 (1966) 7) Theorell et ai., Arkiv. Kemi. Min. 0. Geol. 148:1 (1940) 8) Yonetani, J. Biol. Chem. 242:5008 (1967).

Suositeltava prosteettisen ryhmän ja apoentsyymin pari on hemi ja apo-peroksidaasi ja erityisen suositeltava on flaviiniadeniinidinukleo-tidi ja apoglukoosioksidaasi. Tällaiset prosteettiset ryhmät saavat aikaan helpon keinon kiinnittämiselle ligandeihin, ligandianalogei-hin ja sidososapuoliin ja saadut holoentsyymit osallistuvat vety-peroksidi-toteamisreaktioihin, jotka ovat hyvin tunnettuja ja analyyttisesti käytettyjä ja jotka voidaan valita synnyttämään kolori-metrisiä reaktioita, jotka ovat edullisia kliinisen laboratorion teknillisille henkilöille.

Il 1 7 70726

On ymmärrettävä, että tietty kofaktori voi toimia koentsyyminä tai prosteettisena ryhmänä riippuen siitä entsyymisysteemistä, johon se on asetettu (esim. FAD); tässä keksinnössä tarkastellaan kuitenkin tällaisen kofaktorin käyttöä vain entsyymisysteemin yhteydessä, jossa se toimii prosteettisena ryhmänä edellä määritellyllä tavalla.

Yhdistävä ryhmä

On huomattava, että on käytettävissä monia menetelmiä leimatun konjugaatin sidoskomponentin, esim. todettavan ligandin, sen sidos-analogin tai sen sidososapuolen yhdistämiseksi prosteettiseen ryhmään. Yhdistävän ryhmän kulloinenkin kemiallinen luonne riippuu sidoskompo-nentissä ja prosteettisessa ryhmässä käytettävissä olevien vastaavien liitoskohtien luonteesta. Tärkeitä seikkoja valittaessa liitoskohtia ovat tavallisesti (1) liitetyn sidoskomponentin kyvyn säilyttäminen osallistua tehokkaasti valittuun sidontamäärityssysteemiin ja (2) liitetyn prosteettisen ryhmän jäännöksen kyvyn säilyttäminen yhdistyä apoentsyymiin (tai tällaisen sidontakyvyn inhibointi, kun tätä voidaan lieventää sidottaessa leimattu konjugaatti sidososapuolen avulla - kts. valaiseva seurantakaavio n:o 1), molemmissa tapauksissa siinä määrin, että saadaan hyödyllinen määritys kulloinkin määritettävänä olevalle ligandille ja kulloisillekin väkevyyksille ja määrille, joissa tämä ligandi on määrä todeta. Tavallisesti yhdistävä ryhmä koostuu kemiallisesta sidoksesta, tavallisesti yksinkertaisesta, mutta joskus kaksoissidoksesta tai ketjusta, joka sisältää 1-14, yleisemmin 1-6 hiiliatomia ja 0-5, yleisemmin 1-3 heteroatomia, jotka on valittu typestä, hapesta ja rikistä.

Sekä prosteettinen ryhmä että sidoskomponentti tarjoavat luonnollisesti suuren vaihtelumahdollisuuden käytettävissä olevia funktionaalisia kohtia yhdistävän ryhmän kiinnittymiselle. Yleisesti funktionaaliset ryhmät, joita voidaan odottaa olevan käytettävissä yhdistävälle ryhmälle, ovat amino-, tavallisesti primäärinen amino-, hydroksyyli-, halo-, tavallisesti kloori- tai bromi-, karboksyylihappo-; aldehydi-; keto-; isotiosyanaatti; isosyanaattiryhmä jne. Näin ollen itse yhdistävän ryhmän kemiallinen rakenne vaihtelee laajasti sen pääteryhmien riippuessa prosteettisessa ryhmässä ja sidoskomponentissa olevista funktionaalisista ryhmistä ja sen kokonaispituuden ollessa valinta-seikka peruspakotteiden puitteissa, joita ovat saadun yhteenliittymän korvaavan ryhmän ja sidoskomponentin oleellisten luonteenpiirteiden ylläpitäminen. Mitä tulee yhdistävän ryhmän pituuteen valmis- 70726 18 tettaessa konjugaattia käytettäväksi homogeenisessa määritystavassa, on tavallisesti toivottavaa käyttää niin lyhyttä ryhmää kuin mahdollista ilman että muodostunut sidoskomponentti konjugaatissa häiritsee merkittävästi konjugaatin prosteettisen ryhmän aktiivisuutta. Kun sidoskomponentilla on alhainen molekyylipaino (esim. hapteeni, jonka molekyylipaino on välillä 100-1000) yhdistävä ryhmä on mieluummin kemiallinen sidos tai 1-6 atomin ketju, kuten alempi alkyyli-, karbonyyli-, alkyylikarbonyyli-, amido-, alkyyliamidi-ryhmä jne. Toisissa olosuhteissa, kuten kun konjugaatissa olevalla sidoskomponentilla on suhteellisen korkea molekyylipaino, kuten polypeptidillä tai proteiinilla (esim. vasta-aineella), pitempi yhdistävä ryhmä on tavallisesti toivottava konjugaatin apo-entsyymiä yhdistävän kohdan eteerisen esteen välttämiseksi. Näissä tapauksissa yhdistävä ryhmä käsittää tavallisesti 1-14 hiiliatomia ja 0-5 he-teroatomia, joita edellä selostettiin. Ketjut, joilla on jokin merkittävästi suurempi pituus, johtavat joskus konjugaatteihin, joissa sidoskomponentti pyrkii laskostumaan apoentsyymiä yhdistävään kohtaan. Nämä seikat huomioon ottaen esimerkkejä yhdistävistä ryhmistä esitetään seuraavassa taulukossa 1. Erikoisesimerkkejä yhdistävistä ryhmistä nähdään jäljempänä ja lisämuunnosten todetaan helposti olevan alalla vallitseva tilanne.

70726 19 TAULUKKO I Yhdistävä ryhmä "-R1-

X

1 " 9 -Ri-C-R2-

X

-R1-C-X-R2-

X

1 " 2 -R±-X-C-R-

X

1 " 9

Prosteettinen ryhmä- -R -X-C-X-R*- — sidoskomponentti

X X

Il ·« Il -C-R1-C- -R1-X-R2- -X-R1- -R1-X- -X-R1-X- 1 o ]ossa X on imino-, rikki- tai mieluummin happiryhmäj ja R ja R ovat toisistaan riippumatta 1-6 hiiliatomia sisältäviä alempia alky-leeniryhmiä, kuten metyleeni-, etyleeni-, isopropyleeni-, butylee-ni- tai heksyleeniryhir.iä.

Apoentsyymi

Apoentsyymi tai holoentsyymin proteiiniosa ilman prosteettista ryhmää, valmistetaan lohkaisemalla konjugoitu entsyymi ja eristämällä vapautettu apoentsyymiproteiini. Konjugoidun entsyymin lohkaisu voidaan suorittaa useilla tunnetuilla tavoilla, kuten asettamalla entsyymi erittäin happamaan liuokseen, esim. jonka pH on alle 2. Samoin apo-entsyymin talteenotto voidaan suorittaa useilla tunnetuilla tekniikoilla, kuten proteiinin selektiivisellä saostuksella tai molekyyli-painoltaan alhaisen vapautetun prosteettisen ryhmän selektiivisellä adsorptiolla.

20 70726

Kuten edellä mainittiin apoperoksidaasi ja apoglukoosioksidaasi ovat erityisen suositeltavia apoentsyymejä käytettäväksi tässä keksinnössä, koska niiden holoentsyymit osallistuvat analyyttisesti edullisiin vetyperoksidireaktioihin. Siitä seuraa että muille lähisukuisille konjugoiduille entsyymeille, erityisesti oksidore- auktaaseille, jotka katalysoivat vetyperoksidia tuottavia reaktioita ja jotka voidaan lohkaista inaktiivisen apoentsyymin tuottamiseksi, löytyy erityistä käyttöä tässä keksinnössä. Julkaistuja menetelmiä apoentsyymien eristämisestä on käytettävissä, erityisesti apoglukoo-sioksidaasille, Biochim. Biophys. Acta 175:365 (1969) ja apoperoksi-daasille, J. Biol. Chem. 206:109 (1953) ja Arkiv Kemi. Min. O. Geol. 148:1 (1940).

Mikäli tulisi esiin määrityksen häiriön mahdollisuus johtuen endo-geenisen prosteettisen ryhmän läsnäolosta näytteessä tai jossakin rea-genssissa tai johtuen laboratoriolaitteiston, lasitavaran tai muovi-tavaran saastumisesta prösteettisella ryhmällä tällainen häiritsevä pros-teettineh ryhmä voidaan helposti poistaa käytettävissä olevilla inak-tivointitekniikoilla. Esimerkiksi FAD-häiriö voidaan poistaa käsittelemällä peräkkäin perjodaatti- ja etyleeniglykoliliuoksilla tai käyttämällä muita FAD:n inaktivointitekniikoita.

Tätä keksintöä, joka on oheisissa vaatimuksissa tarkasti määritelty kuvataan nyt seuraavilla esimerkeillä.

Esimerkki 1

Homogeeniset sidontamääritykset N-2',4'-dinitrofenyyli-6-amino-kaproaatille A. Leimatun konjugaatin - N**-(6-aminoheksyyli)-dinitrofenyyli-flaviiniadeniinidinukleotidin valmistus

Flaviini N^-aminoheksyyli-adeniinidinukleotidi N6-trifluoriasetamidoheksyyli-adenosiini-5'-monofosfaatti syntetisoitiin menetelmällä, jonka ovat esittäneet Trayer et ai., Biochem.

J. 139:609 (1974).

Viisikymmentäkuusi milligrammaa (mg) N^-trifluoriasetamidoheksyyli-adenosiini-5'-monofosfaattia (0,1 mmol) liuotettiin n. 10 millilit-raan (ml) vettä ja 25 mikrolitraa (^ul) tri-n-butyyliamiinia (0,1 mmol) lisättiin. Vesi poistettiin tyhjössä ja jäännös liuotettiin 10 ml:an kuivaa dimetyyliformamidia (DMF), joka sitten poistettiin

II

70726 tyhjössä. Jäännös haihdutettiin kuivasta DMFrstä vielä kolme kertaa.

Lopullinen jäännös liuotettiin 10 mitan kuivaa DMFta. 80 mg N,N'- karbonyylidi-imidatsolia (0,5 mmol) lisättiin ja annettiin reagoida 1,5 tuntia. Tämän jälkeen 15 ,ul vettä lisättiin ja liuotin poistet- 6 / tiin tyhjössä. Jäännös (N -trifluoriasetamidoheksyyli-adenosiini-5'-monofosfaatti-imidatsolidi) liuotettiin 10 mitan DMFta.

47 mg riboflaviini-5'-monofosfaattia (0,1 mmol) liuotettiin n. 10 mitan vettä ja lisättiin tipottain 20 mitan asetonia, joka sisälsi 43 yUl tri-n-oktyyliamiinia (0,1 mmol). Sakka muodostui ennenkuin lisäys oli päättynyt. Liuotinta poistettiin kiertohaihduttimella, kunnes riboflaviini-5'-monofosfaatti liukeni. Tämän jälkeen 5 ml asetonia ja 5-10 ml DMF lisättiin ja seos haihdutettiin kuiviin. Jäännös liuotettiin 15-20 mitan kuivaa DMFta ja haihdutettiin kuiviin (tämä prosessi toistettiin kolme kertaa). Jäännös liuotettiin 5 mitan DMFta ja yhdistettiin yllä mainittuun 10 mitan imidatsolidin liuosta DMFtssa.

Reaktioseoksen annettiin seistä huoneen lämpötilassa yli yön ja sen jälkeen liuotin poistettiin. Jäännös liuotettiin 50 mitan vettä ja kaadettiin 2,5 x 25 senttimetrin (cm) DEAE-selluloosakolonniin, joka oli bikarbonaattimuodossa (Whatman DE 23, Reeve Angel, Clifton, New Jersey, USA). Kromatogrammi kehitettiin lineaarisella gradientil-la, joka aikaansaatiin kahdella litralla (1) vettä ja kahdella litralla 0,3-molaarista (M) ammoniumbikarbonaattia (23 ml tn jakeet otettiin talteen). Ohutlevykromatografia piidioksidigeelillä 60 F 254 (E. Merck, Darmstadt, Saksan liittotasavalta) käytettiin etanolin ja 1-M trietyyliammoniumbikarbonaatin (pH 7,5) seosta suhteessa 7t3 tilavuusttilavuus (vtv) osoitti, että jakeet ntot 68-73 sisälsivät suurempaa (Rf = 0,75) ja pienempää (R^ = 0,36) keltaista yhdistettä. Nämä jakeet yhdistettiin ja niiden optisella absorptio-spektrillä oli maksimit kohdissa 267, 373 ja 450 nanometriä (nm).

Liuotin poistettiin yhdistetystä materiaalista ja jäännös liuotettiin n. 5 ml:an vettä. Tämä liuos säädettiin pH-arvoon 11,0 5-n natriumhydroksidilla ja annettiin seistä huoneenlämpötilassa yhdeksän tuntia. Ohutlevykromatografia osoitti, että komponentti, jonka Rf = 0,75, hävisi, kun taas uusi keltainen materiaali, jonka R^ = 0,37, tuli esiin. Reaktioseos säädettiin pH-arvoon 8,0 kloorivety-hapolla ja kaadettiin 2,5 x 20 cm:n DEAE-selluloosakolonniin, joka 707 2 6 oli bikarbonaattimuodossa. Kromatogrammi kehitettiin lineaarisella gradientilla, joka muodostettiin yhdellä litralla vettä ja yhdellä litralla 0,2-M ammonimbikarbonaattia. Kolonnista saatu keltainen poistovirta yhdistettiin ja liuotin poistettiin. Jäännös adsorboitiin 2 grammaan (g) piidioksidigeeliä, joka oli asetettu 50 g:n pii-dioksidigeelikolonnin huipulle, joka oli tasapainoitettu etanolin ja 1-M trietyyliammoniumbikarbonaatin seoksella (pH 7,5) suhteessa 9:2 (tilavuus/tilavuus). Kolonni elutoitiin etanolin ja 1-M trietyyliammoniumbikarbonaatin seoksella (pH 7,5) suhteessa 8:2 (tilavuus/-tilavuus), keltainen komponentti, jonka Rf = 0,37, kerättiin talteen ja liuotin poistettiin. Saanto perustuen absorbanssiin 450 nm:ssä oli n. 10 %.

N6-(6-aminoheksyyli)-dinitrofenyyli-flaviiniadeniinidinukleotidi Yllä esitetystä saatu jäännös, joka sisälsi flaviini-N6-aminohek-syyli-adeniinidinukleotidia, puhdistettiin kromatograafisesti Sephadex G-10-hartsilla (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi). Kooltaan 0,9 x 30 cm:n kolonniin, joka oli tasapainoitettu 25 milli-molaarisella (mM) natriumbikarbonaatilla (pH 7,5) huoneenlämpötilassa, kaadettiin 1 ml N^-FAD-johdannaisen n. 10 mM liuosta vedessä.

Sen materiaalin ensimmäisenä elutoitunut piikki, joka absorboi aallonpituudella 450 nm, otettiin talteen ja kromatografoitiin uudelleen Sephadex G-10-hartsilla ja ensimmäisenä eluoitunut piikki otettiin jälleen talteen.

f.

0,5 ml (0,63 ^umol) puhdistettua N -FAD-johdannaista 25 mM natrium- bikaronaatissa (pH 7,5) sekoitettiin 2 ml:an etanolia ja 10 -ui 3 ' H-dinitrofluoribentseeniä (6,3 mol, 50 ^uCi) etanolissa lisättiin (tritiumkäsitelty dinitrofluoribentseeni saatiin Radiochemical Centre'ltä, Amersham'ista Englannissa). Reaktioseosta ravisteltiin jatkuvasti yli yön pimeässä huoneenlämpötilassa ja kaadettiin sitten 0,9 x 30 cm:n Sephadex G-10-kolonniin, joka oli tasapainoitettu 0,1-M fosfaattipuskurilla (pH 7,0), joka sisälsi 0,1 % natriumatsi-dia. Sen materiaalin ainoa piikki, joka absorboi aallonpituudella 450 nm, otettiin talteen ja havaittiin sisältävän 8 % radioaktiivista leimausainetta.

B. Apoglukoosioksidaasin valmistus

Puhdistettua glukoosioksidaasia, jolla oli alhainen katalaasiak-tiivisuus ja joka oli saatu yhtiöltä Research Products Division 70726 23 of Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana, USA, dialysoitiin kahdesti 12 tuntia 0,5 %:sta paino/tilavuus (w/v) mannitolia vastaan (30 tilavuutta kumpaakin). Dialysoitiin tasajakeita, jotka sisälsivät kukin 100 milligrammaa (mg) glukoosioksidaasia, lyofilisoitiin ja säilytettiin -20°C:ssa.

Naudan seerumialbumiinia (200 mg) liuotettiin 12 ml:an vettä, joka oli säädetty pH-arvoon 1,6 väkevällä rikkihapolla, siihen sekoitettiin 150 mg aktiivihiiltä (RIA-laatua, valmistaja Schwarz-Mann, Orangeburg, New York, USA) ja jäähdytettiin 0°C:en. Lyofilisoitu glukoosioksidaasi (100 mg) liuotettiin uudelleen 3,1 ml:an vettä ja 3 ml lisättiin sekoitettuun albumiini-aktiivihiilisuspensioon jatkeaen sekoitusta 3 minuuttia. Suspensio suodatettiin sitten 0,8 mikronin, halkaisijaltaan 25 millimetrin (mm) Millipore-suodattimen läpi (Millipore Corp., Redford, Massachusetts, USA), joka oli asennettu Sweenex-suodatinlaitteeseen (Millipore Corp.) 50 ml:n kertakäyttöiselle muovikäsiruiskulle. Suodos neutraloitiin nopeasti pH-arvoon 7,0 lisäämällä 2 ml 0,4-M fosfaattipuskuria (pH 7,6) ja sen jälkeen 5-n natriumhydroksidia. Kuivaa aktiivihiiltä (150 mg) lisättiin sitten ja sekoitettiin tunnin ajan 0°C:ssa. Saatu suspensio suodatettiin ensin 0,8 mikronin Millipore-suodattimen läpi ja sitten 0,22 mikronin Millipore-suodattimen läpi. Suodokseen lisättiin glyserolia 25 %:n (tilavuus/tilavuus) saakka ja stabiloitua apoglukoosioksidaasivalmistetta säilytettiin 4°C:ssa.

C. Määritysreagenssit 1. Leimattu konjugaatti - N6-(6-aminoheksyyli)-DNP-FAD laimennettiin 0,05-M fosfaattipuskuriin (pH 7,0) 118 nM:n väkevyyteen.

2. Apoentsyymi-Apoglukoosioksidaasi laimennettiin 0,1-M fosfaatti-puskurilla (pH 7,10), joka sisälsi 0,1 % naudan seerumialbumiinia, 958-nM FAD-sidoskohdan väkevyyteen. Apoentsyymivalmisteen FAD-sidos-kohtaväkevyys määritettiin kokeellisesti mittaamalla minimi FAD-määrä, joka vaaditaan maksimiglukoosioksidaasiaktiivisuuden saamiseen, kun sitä haudotaan apoentsyymin kanssa.

3. Antiseerumi - Antiseerumi dinitrofenyyli-naudan seerumialbumii-ni yhteenliittymää vastaan saatiin yhtiöltä Miles-Yeda Ltd., Rehevot, Israel ja laimennettiin 31-kertaisesti 0,1-M fosfaattipuskuriin (pH 7,0), joka sisälsi 0,1 % naudan seerumialbumiinia.

70726 24 4. Standardit - Standardiliuokset sisälsivät tunnetut väkevyydet N-2',4'-dinitrofenyyli-6-aminokaproaattia, valmistettuna 0,05-M fosfaattipuskuriin (pH 7,0).

5. Seurantareagenssi - Glukoosioksidaasireagenssi valmistettiin sekoittamalla keskenään 45.ml 0,1-M fosfaattipuskuria (pH 7,0), joka sisälsi 15 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa, 9 ml 11,5-mM

3,5-dikloori-2-hydroksibentseenisulfonaattia vedessä säädettynä pH-arvoon 7 natriumhydroksidilla, 9 ml 11,5-mM 4-aminoantipyriiniä vedessä, joka sisälsi 1,25 mg/ml peroksidaasia (Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana, USA) ja 6 ml 1,0-M glukoosia vesipitoisessa kyllästetyssä bentsoehappoliuoksessa.

D. Määritysmenettelyt 1. Apoentsyymin lisäys ennen sidontäreaktion initiolntia Menetelmä n:o 1 - Seuraavat lisättiin peräkkäin erillisiin reaktio-kyvetteihin: 0,1 ml leimatun konjugaatin liuosta, 0,05 ml valittua standardiliuosta, 0,1 ml antiseerumiliuosta, 2 ml seuranta-reagenssia ja 0,1 ml apoentsyymiliuosta. Jokaista reaktioseosta haudottiin 30 minuuttia 30°C:ssa ja absorbanssi 520 nm:ssa mitattiin.

Menetelmä n:o 2 - Seuraavat lisättiin peräkkäin erillisiin reaktio-kyvetteihin: 0,1 ml leimatun konjugaatin liuosta, 0,05 ml valittua standardiliuosta, 0,1 ml antiseerumiliuosta ja 0,1 ml apoentsyymiliuosta. Jokaista reaktioseosta haudottiin 20 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sen jälkeen 2,0 ml seurantareagenssia lisättiin kuhunkin. Vielä 15 minuutin inkuboinnin jälkeen 30°C: ssa absorbanssi 520 nm:ssä mitattiin kustakin kyvetistä.

2. Apoentsyymin lisäys sidontareaktion inltioinnin jälkeen Menetelmä n:o 3 - Seuraavat lisättiin peräkkäin erillisiin reaktio-kyvetteihin: 0,1 ml leimatun konjugaatin liuosta, 0,05 ml valittua standardiliuosta ja 0,1 ml antiseerumiliuosta. Jokaista reak-tiolseosta haudottiin 20 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sen jälkeen 2,0 ml seurantareagenssia ja 0,1 ml apoentsyymiliuosta lisättiin kuhunkin. Vielä 30 minuutin inkuboinnin jälkeen 30°C:ssa absorbanssi 520 nm:ssa mitattiin kustakin kyvetistä.

Menetelmä n:o 4 - Seuraavat lisättiin peräkkäin erillisiin reaktio-kyvetteihin: 0,1 ml leimatun konjugaatin liuosta, 0,05 ml va- 70726 littua standardiliuosta ja 0,1 ml antiseerumiliuosta. Jokaista reaktioseosta inkuboitiin 20 minuuttia huoneenlämpötilassa ja sen jälkeen 0,1 ml apoentsyymiliuosta lisättiin kuhunkin. Vielä 20 minuutin inkuboinnin jälkeen 2,0 ml seurantareagenssia lisättiin kuhunkin kyvettiin. Tämän jälkeen reaktioseosta inkuboitiin 15 minuuttia 30°C:ssa ja absorbanssi 520 nm:ssä mitattiin kustakin kyvetistä.

E. Tulokset

Seuraavassa on taulukko 2, joka esittää näiden neljän määritysmenet-telyn tuloksia mitattaessa N-2', 4 '-dinitrofenyyli-6-aminikaproaat-tia. N-2',4'-dinitrofenyyli-6-aminokaproaatin väkevyydet ilmaistaan väkevyyksinä lopullisissa 2,35 ml:n reaktioseostilavuuksissa. Ab-sorbanssitulokset ilmaistaan kaksoisajojen keskiarvona korjattuna reagenssissa olevien jäännösentsyymiaktiivisuuden ja taustan absor-banssin osalta. Korjauskerroin on annettu kullekin määritysmenetelmälle taulukon 2 lopussa ja se määritettiin kokeellisilla ajoilla korvaamalla 0,1-M fosfaattipuskurilla (pH 7,0) kaikki leir matun konjugaatin, standardin ja antiseerumin liuokset.

I . 70726 26 o o

(N C

tn :3 ro £ «τιΟΜνβοοΓ'-'ΤΓΟΓ'-σιίησϊ oo h rH (ΓιοηιηηηιηιηΝΗιί o rH Q) ronr-Ho>r~Lr)rofNfMfNr-i ,-h 0) 4-ϊ *.

'd Φ <—li—li—IOOOOOOOO o

3 C

3 Q)

4J S

•H

a c O ro r—( rH o ro 3 3 •H :t0 to g vo

tn rH otytoor-mrorotNooo rH

3 Φ CNrHi—1(—IrHrHrHrHr-HrHi—I (N

34-1 *.

Λ Φ OOOOOOOOOOO O

U 3 O Φ

tn S

Λ 3

3 CN

Φ

3 O

•H ··

:3 C

CN μ :3 :3 O :3 £ tyitNooo'iininvoinror'-iH oo X £ -H ooo'icrioo'fvor'-tNO'ioor^ o

Ή 0) OCTlOOOLnrOCNCNrHrHrH rH

D ,* 4J ' - >· - - - » 1-3 tn φ rHOOOOOOOOOO o O Φ 3 < .* 0)

Eh S

3 P -M

3 rH

•n

P O

O

« 3 :3

£ ^OLnrH^TinrH^rrsror^ rH

rH r^OrOCNOHCO^rrOCNCNO «sr

CU (NCNCNCNrHrHrHrHi—IrHrH CN

44 «»

CL) OOOOOOOOOOO O

3 Φ

S

tn >1 >1 I > H Φ

rH M C

>i:3 -H

>h > O

3 μ Φ 3 μ <4H -rl d) 0 4-1 μ 3 m 4*4 3 r~s rHrHlDCOHrCNVOCD^rCNO 3 •rt O S CN rH LT) CN VO <0 rH (0 c μ c o m cn rH -n •rl £1| '-r ,—| μ TJ 3 o

1 .* M

- o

«sr C

*· *r| CN §

I I

2 o 27 70726

Tulokset osoittavat, että tämä keksintö muodostaa homogeenista tyyppiä olevan spesifisen sidontamääritysmenetelmän, jossa apoentsyymi liitetään mukaan joko ennen tai jälkeen sidosreaktion initioinnin.

Esimerkki 2

Heterogeeninen sidontamääritys tyroksiinille A. Leimatun konjugaatin - N®-(2-aminoetyyli)-tyroksiinitlavii-niadeniinidinukleotidin valmistus 6-(2-aminoetyyli)-amino-9-(2',3'-O-isopropylidiini-B-D- rifcofurano- syyli) puriini__ 13,56 g (41,5 mmol) 6-kloori-9-( 2 1 ,3 '-0-isopropylideeni-|3-D-ribo-furanosyyli)puriinia /Hampton et ai., J. Am. Chem. Soc. 83:150 (1961// lisättiin sekoittaen 15 minuutin aikana kylmään, ylimäärin olevaan 1,2-diaminoetaaniin (75 ml). Saadun liuoksen annettiin seistä huoneen lämpötilassa 24 tuntia. Liuos haihdutettiin tyhjössä ja saatua keltaista öljyä sekoitettiin 50 ml:n kanssa kylmää, kyllästettyä natriumbikarbonaattia. Seos haihdutettiin tyhjössä ja saatua jäännöstä haihdutettiin edelleen toistuvasti tyhjössä ensin vedestä (3 kertaa 50 ml:sta) ja sitten 2-propanolista (4 kertaa 50 ml:sta) keltaisen lasin (15 g) saamiseksi. Osa (3 g) lasista johdettiin 25 x 55 cm:n Dowex 50W-X2-kationinvaihtokolonnin läpi, joka oli ammoniummuodossa (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA).

Kolonni elutoitiin lineaarisella gradientilla, joka synnytettiin 2 1:11a vettä ja 2 1:11a 0,5-M ammoniumbikarbonaattia. Eluointi saatettiin päätökseen käyttäen lineaarista gradienttia, joka synnytettiin 2 1:11a sekä 0,5-M että 1-M ammoniumbikarbonaattia. Kolonnista tuleva poistovirta kerättiin 19 ml:n jakeina talteen ja tarkasteltiin eluoimalla piihappogeelin muodostamilla ohutlevykromatografia-levyillä (TLC) (E. Merck, Darmstadt, Saksan liittotasavalta) etanolin ja ammoniumhydroksidin 9:1 (tilavuus/tilavuus) seoksella. Kehitetyt TLC-levyt tutkittiin ultraviolettivalossa ja ruiskutettiin sitten ninhydriinireagenssilla /Randerath, Thin Layer Chromatography, Academic Press (1966/7* Kolonnikromatografista saadut jakeet n:ot 250-350 yhdistettiin ja haihdutettiin tyhjössä, jolloin jäljelle jäi haluttua puriinia vaaleankeltaisena amorfisena lasina (1*5 g).

Analyysi: laskemalla kaavasta ^(^22^04: C 51,42; H 6,33; N 23,99 kokeellisesti: C 50,92; H 6,54; N 23,01

O Q

70726 NMR (60 MHz, CDCl^): δ 1,37 (s, 3H, isopropylideeni), 1,63 (s, 3H, isopropylideeni), 5,92 (d, 1H, l'-riboosi), 7,90 (s, 1H, puriini), 8,26 (s, 1H, puriini).

Optinen kiertokyky /*V7p° = -74,85° (c 1,0, CH3OH) .

Jäljelle jäänyt epäpuhdas tuote (12 g) puhdistettiin kromatograa-fisesti Dowex 50 W-X2-hartsilla yllä kuvatulla tavalla. Kokonaissaanto oli 8 g (55 %).

a- (N-trifluoriasetyyli) -amino-B-/3 ', 5 '-dijodi- 4- (3 ' , 5 'rdijodi-4- hydroksifenoksi)fenyyli/propionihappo_ Tämä yhdiste valmistettiin menetelmällä, jonka on esittänyt Blank, J. Pharm. Sei. 53:1333 (1964). Jäähdytettyyn (0°C), sekoitettuun suspensioon, jossa oli 5 g (6,4 mmol) L-tyroksiinia (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) 60 ml:ssa kuivaa etyyliasetaattia, lisättiin 11,5 ml trifluorietikkahappoa ja 1,9 ml trifluorietikka-happoanhydridiä. 30 minuutin kuluttua saatu kirkas liuos pestiin kolme kertaa 30 ml:11a vettä, kerran 30 ml:11a 5 %:sta natriumbikarbonaattia ja kahdesti 50 ml:11a kyllästettyä natriumkloridia. Yhdistetyt vesipesuliuokset uutettiin kahdesti 20 ml:11a etyyliasetaattia. Etyyliasetaattikerrokset yhdistettiin ja pestiin 30 ml:11a vettä ja kuivattiin sitten magnesiumsulfaatilla. Kuivattu etyyli-asetaattiliuos haihdutettiin tyhjössä, jolloin jäljelle jäi valkoinen kiinteä aine. Uudelleenkiteytys etyylieetterin ja petrolieette-rin seoksesta antoi vaaleanpunertavan valkoisen kiinteän aineen (3,95 g, 70,5 %:n saanto), joka suli 228-230°C:ssa hajaantuen.

Analyysi: laskemalla kaavasta C17H10F3J4NO5: C 23,39; H 1,15; N 1,60 kokeellisesti: C 23,00; H 1,05; N 1,65 NMR /60 MHz, DCON (CD3)2_7 67,28 (s, 2H, aromaatti), 8,03 (s, 2H, aromaatti), 9,7 (m, 1H, amido) IR (KC1) : 1700 ( > C = 0)

Optinen kiertokyky / ot_/^5 = -14,97° (c 1,0 dimetyylisulfoksidi) .

Toinen uudelleenkiteytys tuotti toisen sakan (0,95 g), sp. 224-228°C hajaantuen. Kokonaissaanto oli 87,5 %.

N-{2-/[N- (trif luoriasetyyli) -3,3 ', 5,5 '-tetrajodityronyyli7-amino-etyyli}-21,31-O-isopropylideeniadenosiini ___ 70726 29

Liuos, jossa oli 8,72 g (10,0 mmol) a-(N-trifluoriasetyyli)amino-3-/3,5-dijodidi-4-(3',5'-dijodidi-4'-hydroksifenoksi)fenyyli7propioni-happoa ja 3,86 g (11,0 mmol) 6-(2-aminoetyyli)amino-9-(2',3'-O-iso-propylideeni-B-D-ribofuranosyyli)puriinia 50 mlrssa kuivaa dimetyyli-asetamidia, valmistettiin kuivassa argonatmosfäärissä -20°C:ssa.

Tähän kylmään sekoitettuun liuokseen lisättiin liuos, jossa oli 3,04 g (11,0 mmol) difenyylifosforyyliatsidia (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, USA), 10 ml:ssa kuivaa dimetyyliasetamid ia, minkä jälkeen lisättiin 1,6 ml (11,0 mmol) kuivaa trietyyliamiinia. Liuos jätettiin huoneen lämpötilaan 22 tunniksi. Liuos lisättiin sitten tipottain 300 ml:an kylmää (0°C) vettä sekoittaen. Saatu valkoinen sakka kerättiin talteen suodattamalla ja kuivattiin tyhjössä (56°C), jolloin saatiin 13,0 g vaalean kermanväristä kiinteää ainetta. Kiinteä aine liuotettiin 500 ml:an asetonia ja liuos väke-vöitiin keittämällä. Valkoinen kiinteä aine, joka saostui kiehuvasta asetoniliuoksesta, kerättiin talteen suodattamalla kuumana. Suodok-sen jatkettu keittäminen tuotti kaksi lisäsakkaa. Nämä kolme sakkaa yhdistettiin, jolloin saatiin 8 g (66,6 %:n saalis) valkoista kiinteää ainetta, sp. 198-200°C (hajaantui).

Analyysi: laskemalla kaavasta C32H30F3J4°8: C 31,89; H 2,51; N 8,14 kokeellisesti: C 31,95; H 2,60; N 7,86 NMR £220 MHz, (CD3) 2^07 <$ 1,32 (s, 3H, isopropylideeni) , 1,55 (s, 3H, isopropylideeni), 6,14 (d, 1H, l'-riboosi), 7,02 (s, 2H, tyroksiini), 7,82 (s, 2H, tyroksiini), 8,25 (s, 1H, puriini), 8,36 (s, 1H, pu-riini), 8,41 (t, 1H, J = 6, amido), 9,64 (d, 1H, J = 8, trifluori-asetamido)

Optinen kiertokyky / a/^ = -11,82° (c 1,0, pyridiini).

N-{ 2-/N- (trifluoriasetyyli) -3,3' ,5,5' -tetrajodityronyyl^atiino-etyyli}-2',3'-0-isopropylideeni-5'-adenyylihapon monotrietyyliamii- nlsuolan monohydraatti__

Liuos, jossa oli 1,2 g (1,0 mmol) N-{2-/N-(trifluoriasetyyli)-3,3',5,5'-tetrajodityronyyli7-aminoetyyli}-2',3'-O-isopropylideeni-adenosiinia 10 ml:ssa kuivaa trietyylifosfaattia, valmistettiin kuivassa argonatmosfäärissä 0°C:ssa. Kylmään, sekoitettuun liuokseen lisättiin 0,45 ml (5 mmol) fosforioksikloridia. Saatua liuosta pidettiin 24 tuntia 0°C:ssa ja lisättiin sitten tipottain ja sekoittaen 1 l:an jäävettä. Saatu sakka kerättiin talteen suodattamalla t 70726 ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 1,23 g valkoista kiinteää ainetta. Kiinteä aine liuotettiin asetoniin ja 0,32 ml (2,2 mmol) trietyyliamiinia lisättiin. Muodostui sakka. Seos haihdutettiin tyhjössä ja saatua jäännöstä uutettiin kuivalla asetonilla ja kiteytettiin sitten uudelleen kuivan metyylialkoholin ja kuivan etyylieet-terin seoksesta, jolloin saatiin 390 mg (27,8 %:n saalis) valkoista kiinteää ainetta, sp. 173-183°C (hajaantui).

Analyysi: laskemalla kaavasta C38H48F3J4N8°12P: C 32,50; H 3,45; N 7,98 kokeellisesti: C 32,24; H 3,08; N 7,58 NMR /60 MHz, (CD3)2SO/ 61,53 (s, 3H, isopropylideeni), 6,2 (d, 1H, 1Ή-riboosi), 7,1 (s, 2H, tyroksiini aromaatti), 7,87 (s, 2H, tyroksiini aromaatti), 8,27 (s, 1H, puriini), 8,52 (s, 1H, puriini). Optinen kiertokyky / α_/^5 = -17,50° (c 1,0, CHgOH) .

N-{ 2-/N- (trif luoriasetyyli) -3,3 ' , 5,5 ' -tetra jodityronyy1^7amino- etyyli}-5'-adenyylihappo__ 200 mg (0,14 mmol) N-{2-/N-(trifluoriasetyyli)-3,3',5,5'-tetrajodityronyy li/aminoetyyli}-2',3'-0-isopropylideeni-5’-adenyylihapon monotrietyyliamiinisuolan monohydraattia suspendoitiin 1 mitan vettä (0°C) ja trifluorietikkahappoa (9 ml) lisättiin tipottain ja sekoittaen. 30 minuutin kuluttua saatiin kirkas liuos. Liuosta pidettiin kylmässä (0°C) vielä 15 tuntia ja haihdutettiin sitten tyhjössä (30°C). Saatu jäännös haihdutettiin neljä kertaa tyhjössä (250C) 20 ml:n tilavuudesta vedetöntä etyylialkoholia ja kuivattiin sitten tyhjössä (25°C), jolloin jäljelle jäi valkoinen kiinteä aine.

Kiinteää ainetta sekoitettiin 30 minuuttia 10 ml:n kanssa kylmää metyylialkoholia, kerättiin talteen suodattamalla ja kuivattiin tyhjössä (25<>C), jolloin saatiin valkoinen kiinteä aine (135 mg, 76 %:n saalis), joka suli hitaasti hajaantuen 188°C:n yläpuolella.

Analyysi: laskemalla kaavasta C29H27F3J4N7°11P: C 27,97; H 2,19; N 7,87 kokeellisesti: C 28,11; H 2,31; N 7,65.

NMR /220 MHz, (CD3)2S07 δ 5,95 (d, 1H, l'-riboosi), 7,04 (s, 2H, tyroksiini aromaatti), 7,84 (s, 2H, tyroksiini aromaatti), 8,25 (s, 1H, puriini), 8,36 (s, 1H, puriini), 8,43 (m, 1H, amido), 9,66 (d, lii, trifluoriasetamido) 31 70726

Optinen kiertokyky / α_/^ = -2,72° (c 1,0, pyridiini) .

Flaviiniadeniinidinukleotidi - tyroksiinikonjugaatti 498 mg (0,4 mmol) N-{2-/N-(trifluoriasetyyli)-3,3',5,5'-tetrajodi-tyronyyli7-aminoetyyli}-5'-adenyylihappoa liuotettiin 10 ml:an kuivaa dimetyyliformamidia ja tri-n-butyyliamiinia (96 ^ul, 0,4 mmol) lisättiin, minkä jälkeen lisättiin 1,1'-karbonyylidi-imidatsolia (320 mg, 2,0 mmol). Kun oli sekoitettu 18 tuntia huoneen lämpötilassa kosteudelta suojattuna, vettä (280 ^ul) lisättiin ja liuotin haihdutettiin sitten tyhjössä.

Saatua öljyä kuivattiin toistuvilla tyhjöhaihdutuksilla kuivasta dimetyyliformamidista (4 kertaa 10 mlrsta). Saatu fosfori-imidatsoli-daatti liuotettiin uudelleen 10 ml:an kuivaa dimetyyliformamidia ja lisättiin tipottain 0,4 mmol:in riboflaviini-5'-monofosfaatin tri-n-oktyyliamiinisuolan liuosta 10 ml:ssa kuivaa dimetyyliformamidia.

Suola valmistettiin lisäämällä riboflaviini-5'-monofosfaatin ammo-niumsuolan (192 mg, 0,4 mmol) liuosta 10 mlrssa vettä sekoitettuun liuokseen, jossa oli tri-n-oktyyliamiinia (176 ^ul, 0,4 mmol) 100 ml:ssa asetonia. 30 minuutin kuluttua saatu seos haihdutettiin tyhjössä. Jäännös kuivattiin toistetulla haihdutuksella tyhjössä kuivasta dimetyyliformamidista, jolloin suola jäi jäljelle oranssina kiinteänä aineena.

Yllä oleva liuos, joka sisälsi fosfori-imidatsolidaattia ja ribofla-viini-5'-monofosfaattisuolaa, jaettiin kahteen yhtä suureen jakee-seen 24 tunnin kuluttua ja toinen jae haihdutettiin tyhjössä. Saatu jäännös kromatografoitiin kolonnilla (2,5 x 78 cm), joka oli valmistettu 100 g:sta Sephadex LH-20-hartsia (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi), jota oli esipaisutettu (18 tuntia) dimetyyliformami-din ja trietyyliammoniumbikarbonaatin seoksella suhteessa 19:1 (tilavuus/tilavuus) (1-M, pH 7,5). Kolonni eluoitiin yllä mainitulla 19:1 (tilavuus/tilavuus)-seoksella ja 10 ml:n jakeet otettiin talteen. Kolonnista saatua poistovirtaa tarkasteltiin eluoimalla pii-dioksidigeeli 60:n silanoiduilla Rp-2 TLC-levyillä (E. Merck, Darmstadt, Saksan liittotasavalta).

TLC-levyt kehitettiin käyttäen asetonin, kloroformin, metyylialkoholin, veden ja trietyyliamiinin seosta suhteessa 40:40:25:1:1 (tilavuus/tilavuus.) Yllä mainitusta pylväskromatografiästä saadut 32 70726 jakeet n:ot 11-17 yhdistettiin ja haihdutettiin tyhjössä. Jäännös kromatografoitiin kolonnilla (2,5 x 75 cm), joka oli valmistettu 125 g:sta Sephadex LH-20-hartsia, jota oli esipaisutettu (18 tuntia) 0. 3.M ammoniumbikarbonaatissa. Kolonnia eluoitiin 0,3-M ammonium-bikarbonaatilla keräten talteen 10 ml:n jakeet. Poistovirtaa tarkasteltiin aallonpituudeltaan 254 nm olevan ultraviolettivalon absorptiolla. Jakeiden tilavuutta lisättiin 20 ml:ksi aloittaen jakeesta n:o 150. Eluentin suolaväkevyyttä pienennettiin vähitellen seuraavasti: 0,15-M ammoniumbikarbonaatti jakeesta 295, 0,075-M ammonium-bikarbonaatti jakeesta n:o 376 ja vesi jakeesta n:o 430. Yhteensä 480 jaetta otettiin talteen. Jakeet n:ot 200-235 yhdistettiin ja haihdutettiin tyhjössä, jolloin jäljelle jäi leimattu yhteenliittymä keltaoranssina jäännöksenä. Tämän jäännöksen alkalisella vesiliuoksella oli ultraviolettiabsorptiomaksimit seuraavilla aallonpituuksilla: 266 nm, 350 nm, 373 nm ja 450 nm. Saanto arvioituna absorptiosta kohdassa 450 nm oli noin 5 %.

Fosfodiesteraasivalmiste (Worthington Biochemical Corp., Freehold,

New Jersey, USA), joka oli eristetty käärmeenmyrkystä (Crotalus Adamanteus), hydrolysoi yllä mainitun tuotteen riboflaviini-5'-mono-fosfaatiksi ja tyroksiinisubstituoiduksi 51-adenyylihapoksi, josta trifluoriasetyylisuojausryhmä oli poistettu.

B. Apoglukoosioksidaasin valmistus Käytettiin apoentsyymiä, joka oli valmistettu esimerkin 1 osan B mukaisesti.

C. Määritysreagenssit 1. Leimattu konjugaatti - N®-(2-aminoetyyli)-tyroksiini-FAD laimennettiin 0,1-M fosfaattipuskuriin (pH 7) l-^,uM:n väkevyydeksi.

2. Apoentsyymi - Apoglukoosioksidaasi laimennettiin 0,1-M fosfaatti-puskurilla (pH 7) 0,6-^uM FAD-sidoskohdan väkevyyteen (määritetty kuten esimerkin 1 osassa C-2).

3. Liukenemattomaksi tehty vasta-aine - Sepharose 4B-geelin (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi) pesty, märkä kakku, joka oli aktivoitu syanogeenibromidilla sen menetelmän mukaisesti, jonka ovat esittäneet March et ai., Anal. Biochem. 60:119 (1974), 70726 33 lisättiin liuokseen, jossa oli 85 mg vasta-ainetta (eristetty tyroksiini-naudan seerumialbumiini-yhteenliittymän vastaisesta anti-seerumista) 20 mlrssa 0,1-M fosfaattipuskuria (pH 7,0) ja sekoitettiin hitaasti 36 tuntia 4°C:ssa. Liittämisreaktion päätyttyä lisättiin 1 ml 1-M alaniinia ja ravistelua jatkettiin vielä 4 tuntia reagoimattomien kohtien suojaamiseksi. Saatu Sepharose-geeliin sitoutunut vasta-aine pestiin sintterisuppilolla käyttäen 400 ml sekä 50-mM natriumasetaatti - 500 mM natriumkloridia (pH 5) että 50 mM fosfaattipuskuri - 500 mM natriumkloridia (pH 7) ja 800 ml 100-mM fosfaattipuskuria (pH 7). Kostea suotokakku suspendoitiin sitten 100-mM fosfaattipuskuriin (pH 7), joka sisälsi 0,01 % nat-riumatsidia, jolloin saatiin 22 ml n. 50 %:sta suspensiota.

4. Standardi - Tyroksiinin 1,15-mM perusliuos 5-mM natriumhydrok-sidissa laimennettiin 2-yUM::seksi 0,1-M fosfaattipuskuriin (pH 7).

5. Seurantareagenssi - Glukoosioksidaasimääritysreagenssi valmistettiin sisältämään seuraavaa seosta 130 ^ul:a kohti: 25 ^,ul 1,2 mg/ml:n peroksidaasia (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) 0,1-M fosfaattipuskurissa (pH 7), 5 yUl 10-mM 4-aminoantipyrii-niä vedessä, 20 ^ul 25-mM 3,5-dikloori-2-hydroksibentseenisulfonaat-tia 0,1-M fosfaattipuskurissa (pH 7), 30 ^ul 16,5 %:sta naudan see-rumialbumiinia 0,1-M fosfaattipuskurissa (pH 7) ja 50 ^ul 1-M glukoosia bentsoehapon kyllästetyssä vesiliuoksessa.

D. Määritysmenettely

Sidosreaktioseokset valmistettiin sekoittamalla keskenään 150 ^ul liukenemattomaksi tehtyä vasta-ainesuspensiota, 80 ^ul leimatun yhteenliittymän liuosta, eri määriä standardityroksiiniliuosta eri tyroksiiniväkevyyksien saamiseksi reaktioseoksiin ja riittävä määrä 0,1-M fosfaattipuskuria (pH 7) 500 ^ul:n kokonaistilavuuden aikaansaamiseksi. Reaktioseoksia haudottiin ravistellen kaksi tuntia 25°C:ssa. Jokainen reaktioseos tyhjösuodatettiin sitten lasivillalla tukitun, kuivan pasteur-pipetin läpi, joka oli edeltäkäsin käsitelty perjodaatti- ja etyleeniglykoliliuoksilla mahdollisen FAD-epä-puhtauden eliminoimiseksi. 300 ^ul:n jakeeseen kutakin suodosta lisättiin 130 yul seurantareagenssin ja 50 ^,ul apoentsyyn iliuosta. Yhden tunnin kuluttua jokaisen reaktioseoksen absorbanssi mitattiin aallonpituudella 520 nm.

34 E. Tulokset 7072 6

Seuraavassa on taulukko 3, joka esittää määritysmenettelyn tuloksia mitattaessa tyroksiinia. Absorbanssitulokset ilmoitetaan kaksois-ajojen keskiarvona korjattuna apoentsyymiliuoksessa olevan jäännös-entsyymiaktiivisuuden (absorbanssi 0/522) ja vasta-ainesuspensiossa olevan endogeenisen FAD:n (absorbanssi 0,142) suhteen.

TAULUKKO 3

Lisätyn tyroksiinistandardin Korjattu keskimääräinen absorbanssi tilavuus ( ,ul) aallonpituudella 520 nm 0 0,223 25 0,221 75 0,281 250 0,286

Tulokset osoittavat, että tämä keksintö muodostaa hyödyllisen heterogeenista tyyppiä olevan spesifisen sidontamääritysmenetelmän.

Esimerkki 3

Homogeeninen sidontamääritys tyroksiinille A. Leimatun konjugaatin - N6-(6-aminoheksyyli)tyroksiini-flaviiniadeniinidinukleotidin valmistus 6-(6-aminoheksyyli)-amino-9-(2',3'-O-isopropylideeni-B-D- ribofuranosyyli)puriini ____ 16,0 g (50 mmol) 6-kloori-9-(2',3'-O-isopropylideeni-8-D-ribofura-nosyyli) puriinia /Hampton et ai., J. Am. Chem. Soc. 83:1501 (1961j_7 lisättiin sekoittaen sulaan (70°C), juuri tislatun 1,6-diaminoheksaa-nin (58 g, 500 mmol) näytteeseen. Saatua seosta sekoitettiin argonin alaisena 40°C:ssa 18 tuntia. Ylimäärin oleva diamiini poistettiin tislaamalla alipaineessa (60°C, 0,91 mm Hg). Saatu vaaleankeltainen jäännös adsorboitiin 150 g:an piidioksidigeeli 60:a (E. Merck, Darmstadt, Saksan liittotasavalta) ja käytettiin yläosana kromato-grafiakolonnissa, joka oli valmistettu lietteestä, joka sisälsi piidioksidigeeli 60:a (2 kg) absoluuttisen etyylialkohlin ja tri-etyyliammlniumbikarbonaatin seoksessa (pH 7,5, 1-M) suhteessa 9:1 (tilavuus/tilavuus). Kolonnia eluoitiin yllä mainitulla 9:1 (tila-vuus/tilavuus)-liuotinseoksella ja 900 20 ml:n jaetta otettiin talteen. Jakeet tutkittiin ohutlevykromatografiällä (TLC) piidioksidi-

II

70726 35 geeli 60:11a eluoiden absoluuttisen etyylialkoholin ja trietyyli-ammoniumbikarbonaatin seoksella (pH 7,5, 1-M) suhteessa 7:3 (tila-vuus/tilavuus). Pylväskromatografiasta saadut jakeet n:ot 391-900 yhdistettiin ja haihdutettiin tyhjössä, jolloin jäljelle jäi 15,0 g lasimaista jäännöstä (74 %:n saalis). 1 g:n näyte lasia liuotettiin pieneen tilavuuteen metyylialkoholia, joka kaadettiin sitten kolonnin huipulle, joka oli valmistettu 80 g:sta Sephadex LH-20-hartsia (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi) esipaisutettuna metyylialkoholissa. Kolonni eluoitiin metyylialkoholilla. Yhteensä 90 8 ml:n jaetta otettiin talteen. Jakeet tutkittiin TLC:lla pii-dioksidigeeli 60:11a eluoiden absoluuttisen etyylialkoholin ja trietyyliammoniumkarbonaatin seoksella (pH 7,5, 1-M) suhteessa 7:3 (tilavuus/tilavuus). Pylväskromatografiasta saadut jakeet n:ot 19-27 yhdistettiin ja haihdutettiin tyhjössä, jolloin jäljelle jäi 910 mg (91 %:n talteenotto) valkoista lasia.

Analyysi: laskemalla kaavasta C^gH^NgO^: C 56,14; H 7,44; N 20,68 kokeellisesti: C 53,91; H 7,33; N 19,18.

NMR (60 MHz, CDCI3): δ 1,40 (s, 3H, isopropylideeni), 1,63 (s, 3H, isopropylideeni), 5,98 (d, 1H, l’-riboosi), 7,92 (s, 1H, puriini), 8,36 (s, 1H, puriini).

Optinen kiertokyky / α_/£ = -50,11° (c, 1,0, metyylialkoholi).

N-{6-/N-(trifluoriasetyyli)-3,3',5,5'-tetrajodityronyyli/amino- heksyyli}-2',3 '-O-isopropyLldeeniadenosiini_

Liuos, jossa oli 4,36 g (5,0 mmol) a-(N-trifluoriasetyyli)-amino-g-l_3,5-di jodi-4- (3 ' , 5 ' -di jodi-4 ' -hydroksif enoksi) - f enyylipropioni-happoa, joka oli valmistettu yllä olevassa esimerkin 2 osassa A kuvatulla tavalla ja 2,24 g (5,5 mmol) 6-(6-aminoheksyyli)-amino-9-(21,3'-O-isopropylideeni-g-D-ribofuranosyyli)puriinia 100 ml:ssa kuivaa dimetyyliformamidia, valmistettiin kuivassa argonatmosfää-rissä -20°C:ssa. Tähän kylmään, sekoitettuun liuokseen lisättiin liuos, jossa oli 1,52 g (5,5 mmol) difenyylifosforyyliatsidia (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, USA) 50 ml:ssa kuivaa dimetyyliformamidia, minkä jälkeen lisättiin 0,8 ml (5,5 mmol) kuivaa trietyyliamiinia. Liuos jätettiin huoneen lämpötilaan 22 tunniksi. Liuos lisättiin sitten tipottain 600 ml:an kylmää (0°C) vettä sekoittaen. Saatu valkoinen sakka otettiin talteen suodattamalla ja kuivattiin tyhjössä (60°C), jolloin saatiin 4,90 g (78 %:n saa- 36 70726 lis) valkoista kiinteää ainetta. Tämän kiinteän aineen näyte kiteytettiin uudelleen asetonin ja veden seoksesta, jolloin saatiin valkoinen kiinteä aine, sp. 205-207°C (hajaantui).

Analyysi: laskemalla kaavasta C36H38F3J4N7°8: C 34,28·, H 3,04$ N 7,77 kokeellisesti: C 34,22) H 2,99) N 7,41

Massaspektri (20 ma) m/e: 1262 (MH+), 1164 (M+ miinus COCF3)

Optinen kiertokyky /—= -21,89° (c 1,0, pyridiini) N-{6-/N-(trifluoriasetyyli)-3,3',5,5'-tetrajodityronyyli7aminohek-syyli}- 2^31-O-isopropylideeni-5'-adenyylihapon monotrietyyliamii- nisuolan monohydraattl_ 1 _______

Liuos, jossa oli 1,89 g (1,5 mmol) N-{6-/N-(trifluoriasetyyli)- 3,3 ', 5,5 ' - tetra jodityronyylj./aminoheksyyli} -2 ' , 3 ' -O-isopropylideeni-adenosiinia 15 ml:ssa kuivaa trietyylifosfaattia, valmistettiin kuivassa argonatmosfäärissä -10°C:ssa. Kylmään, sekoitettuun liuokseen lisättiin 0,68 ml (7,5 mmol) fosforioksikloridia. Saatua liuosta pidettiin 18 tuntia -15°C:ssa ja lisättiin sitten tipottain ja sekoittaen 1,5 1:an jäävettä. Saatu sakka kerättiin talteen suodattamalla ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 1,91 g (87 %:n saalis) valkoista kiinteää ainetta. Kiinteä aine liuotettiin 10 ml:an metyylialkoholia ja 0,38 ml (2,6 mmol) trietyyliamiinia lisättiin. Tämä liuos haihdutettiin tyhjössä ja saatu jäännös kiteytettiin uudelleen metyylialkoholin ja etyylieetterin seoksesta, jolloin saatiin 720 mg (33 %:n saalis) valkoista kiinteää ainetta, sp. 151-154°C (hajaantui).

Analyysi: laskemalla kaavasta C42H56F3J4°12F: C 34,54; H 3,86; N 7,67 kokeellisesti: C 35,24; H 3,88; N 7,75

Massaspektri (20 ma) m/e: 1342 (MH+), 1244 (M+ miinus COCF^)

Optinen kiertokyky / a_/^ = -17,20 (c 1,0, CH3OH) .

N-t6-/N-(trifluoriasetyyli)-3,3',5,5'-tetrajodityronyyli7-amino- heksyylil-51-adenyylihappo_ 600 mg (0,41 mmol) N-{6-^N-(trifluoriasetyyli)-3,3',5,5'-tetrajodi-tyronyyli7-aminoheksyyli}-2',3'-O-isopropylideeni-5'-adenyylihapon monotrietyyliamiinisiolan monohydraattia suspendoitiin 0,6 ml:an 37 70726 vettä (0°C) ja trifluorietikkahappoa (6 ml) lisättiin tipottain ja sekoittaen. 50 minuutin kuluttua saatiin kirkas liuos. Liuosta pidettiin kylmänä (0°C) vielä 15 tuntia ja haihdutettiin sitten tyhjössä (30°C). Saatu jäännös haihdutettiin tyhjössä viisi kertaa 20 ml:sta vedetöntä etyylialkoholia ja hierrettiin sitten 30 ml:n kanssa vettä ja pestiin pienellä tilavuudella metyylialkoholia. Saatu valkoinen kiinteä aine (430 mg) kiteytettiin uudelleen metyyli-alkoholista, jolloin saatiin 290 mg (54,6 %:n saalis) valkoista kiinteää ainetta, sp. 180-183°C (hajaantui).

Analyysi: laskemalla kaavasta C33H35F3J4N7°i]_p'· C 30,46; H 2,71; N 7,54 kokeellisesti: C 30,77; H 2,55; N 7,29.

Massaspektri (20 ma) m/e: 1302 (MH+), 1204 (M+ miinus COCF3).

Flaviiniadeniinidinukleotidi - tyroksiinikonjugaatti 130,13 mg (0,1 mmol) N-{6-/N-(trifluoriasetyyli)-3,31,5,51-tetra-jodityronyyli7-aminoheksyyli}-5',adenyylihappoa asetettiin argonat-mosfääriin. Tähän näytteeseen lisättiin liuos, jossa oli 14 ^ul (0,1 mmol) trietyyliamiinia 1 ml:ssa kuivaa dimetyyliformamidia, minkä jälkeen lisättiin liuos, jossa oli 16,2 mg (0,1 mmol) 1,1'-karbonyylidi-imidatsolia 1 ml:ssa kuivaa dimetyyliformamidia. 24 tunnin kuluttua lisättiin toinen ekvivalentti 1,1'-karbonyylidi-imidatsolia (16,2 mg) 1 ml:ssa kuivaa dimetyyliformamidia. Yllä esitetyn reaktion annettiin jatkua yhteensä 48 tuntia huoneenlämpö-tilassa kosteudelta suojattuna. 47,3 mg:n (0,1 mmol) näyte ribofla-viini-5'-raonofosfaatin ammoniumsuolaa konvertoitiin vastaavaksi tri-n-oktyyliamiinisuolaksi esimerkin 2 osassa A kuvatulla tavalla. Tämä suola liuotettiin 3 ml:an kuivaa dimetyyliformamidia ja lisättiin yllä mainittuun liuokseen, joka sisälsi adenyylihappoväli-tuotteen fosforimidatsolidaattia.

Saadun liuoksen annettiin seistä pimeässä huoneenlämpötilassa kosteudelta suojattuna 24 tuntia. Liuotin haihdutettiin tyhjössä ja saatu jäännös kromatografoitiin kolonnilla (2,5 x 78 cm), joka oli valmistettu 100 g:sta Sephadex LH-20-hartsia (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi), jota oli esipaisutettu (18 tuntia) dimetyy-liformamidin ja trietyyliammoniumbikarbonaatin seoksella (1-M, pH 7,5) suhteessa 19:1 (tilavuus/tilavuus). Kolonni eluoitiin yllä mainitulla 19:1 (tilavuus/tilavuus)-seoksella ja 5 ml:n jakeet 70726 38 otettiin talteen. Kolonnista saatua poistovirtaa tarkasteltiin eluoi-malla piidioksidigeeli 60:n muodostamilla silanoiduilla RP-2 TLC-levyillä (E. Merck, Darmstadt, Saksan liittotasavalta). TLC-levyt kehitettiin käyttäen asetonin, kloroformin, metyylialkoholin, veden ja trietyyliamiinin seosta suhteessa 40:40:25:1:1 (tilavuus/tila-vuus).

Pylväskromatografiasta saadut jakeet n:ot 24-38 yhdistettiin ja haihdutettiin tyhjössä. Jäännös kromatografoitiin kolonnilla (2,5 x 85 cm), joka oli valmistettu 125 g:sta Sephadex LH-20-hartsia, joka oli esipaisutettu (18 tuntia) 0,1-M ammoniumbikarbonaatissa. Kolon-ni eluoitiin lineaarisella gradientilla, joka oli muodostettu 2 l:sta 0,1-M ammoniumbikarbonaattia ja 2 l:sta vettä ja 23 ml:n jakeet otettiin talteen. Poistovirtaa tarkasteltiin ultraviolettiab-sorptiolla (254 nm). Jakeet n:ot 170-182 yhdistettiin ja haihdutettiin tyhjössä. Jäännös kromatografoitiin kolonnilla (2,5 x 55 cm) joka oli valmistettu 80 g:sta Sephadex LH-20-hartsia, jota oli esipaisutettu 0,05-M ammoniumbikarbonaatissa. Kolonni eluoitiin lineaarisella gradientilla, joka oli muodostettu 2 l:sta 0,05-M ammoniumbikarbonaattia ja 2 l:sta 0,02-M ammoniumbikarbonaattia. Poisto-virta tarkastettiin ultraviolettiabsorptiolla (254 nm). Eluointia jatkettiin 2 1:11a 0,2-M ammoniumbikarbonaattia, ottaen talteen 23 ml:n jakeet. Yhteensä 257 jaetta otettiin talteen. Jakeet n:ot 70-110 yhdistettiin ja haihdutettiin tyhjössä, jolloin jäljelle jäi leimattu yhteenliittymä keltaoranssina jäännöksenä. Tämän jäännöksen alkalisella vesiliuoksella oli absorptiomaksimit seuraavilla aallonpituuksilla: 270 nm, 345 nm ja 450 nm. Saalis arvioituna absorptiosta 450 nm:n kohdalla oli n. 5 %.

Fosfodiesteraasivalmiste (Worthington Biochemical Corp., Freehold, New Jersey, USA), joka oli eristetty käärmeenmyrkystä (Crotalus Adamanteus) hydrolysoi yllä mainitun tuotteen riboflaviini-5'-mono-fosfaatiksi ja tyroksiinisubstituoiduksi 5'-adenyylihapoksi, josta trifluoriasetyylisuojausryhmä oli poistettu.

B. Apoglukosidaasin valmistus

Glukoosioksidaasia dialysoitiin ja lyofilisoitiin kuten esimerkin 1 osassa B yllä. Osa lyofilisoidusta glukoosioksidaasista (80 mg) liuotettiin 20 ml:an 30 %:sta (tilavuus/tilavuus) glyserolia 4°C:ssa 70726 39 ja liuos säädettiin pH-arvoon 1,4 lisäämällä väkevää rikkihappoa (H2SO4). Liuosta haudottiin 4°C:ssa 2 tuntia ja johdettiin sitten Sephadex-G-50-kolonnin (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi) läpi 4°C:ssa, joka oli tasapainotettu 30 %:sella (tilavuus/tilavuus) glyserolilla, joka oli säädetty pH-arvoon 1,4 väkevällä I^SO^rlla. Eluoitu proteiinipiikki kerättiin talteen (27 ml sisältäen 74 paino-% kolonniin lisätystä materiaalista) ja 200 mg naudan seerumialbu-miinia liuotettiin yhdistettyyn eluaattiin. Aktiivihiiltä (600 mg; RIA-laatua, valm. Schwarz-Mann, Orangeburg, New York, USA) lisättiin sitten ja seos neutraloitiin lisäämällä 4,0 ml 0,4-M fosfaattipuskuria (pH 8,0) ja riittävästi 2-n natriumhydroksidia pH:n säätämiseksi arvoon 7,0. Seosta sekoitettiin 60 minuuttia 4°C:ssa ja suodatettiin peräkkäin 0,8 ^u:n ja 0,22 ^u:n Millipore-suodattimen (Milli-pore Corp., Bedford, Massaschusetts, USA) läpi. Natriumatsidia (10 % paino/tilavuus) lisättiin 0,1 %:n loppukonsentraation saamiseksi seokseen.

C. Määritysreagenssit 1. Leimattu yhteenliittymä - N®-(6-aminoheksyyli)-tyroksiini-FAD laimennettiin 0,1-M fosfaattipuskuriin, joka sisälsi 0Γ1 % (paino/-tilavuus) naudan seerumialbumiinia (pH 7,0) 400 nM:n väkevyydeksi.

2. Apoentsyymi - Apoglukoosioksidaasi laimennettiin 0,1-M fosfaattipuskuriin, joka sisälsi 0,1 % (paino/tilavuus) naudan seerumialbumiinia (pH 7,0), 4,0 mikronormaalin väkevyyteen (^uN) FAD-sidos-kohtia (kts. esimerkin 1 osa C-2).

3. Antiseerumi - Kyllästettyä ammoniumsulfaattiliuosta (7,5 ml) pumpattiin (0,1 ml/min) huoneenlämpötilassa 15 ml:an kaniinin anti-tyroksiini antiseerumia sekoittaen jäähauteella. Saadun suspension annettiin seistä 2 tuntia 4°C:ssa sekoittamatta. Sakka otettiin talteen sentrifugoimalla, liuotettiin 3 ml:an jääkylmää 50-mM boraatti-puskuria (pH 8,6) ja dialysoitiin yli yön 1 l:a vastaan 50-mM bo-raattipuskuria (pH 8,6). Immunoglobuliiniliuos täydennettiin sitten alkuperäiseen antiseerumin tilavuuteen lisäämällä 50-mM boraattipus-kuria (pH 8,6). Immunoglobuliiniliuos laimennettiin edelleen 0,1-M fosfaattipuskuriin, joka sisälsi 0,1 % naudan seerumialbumiinia (pH 7,0), käytettäväksi alla kuvatuissa määritysrnenettelyissä ilmoitetuissa suhteissa.

_ - τ 40 70726 4. Standardit - Tyroksiinin natriumsuolaa (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) käytettiin 1 mg/ml:n perusliuoksena titrattu-na liuokseksi tislattuun veteen 2-n natriumhydroksidilla loppu-pH-arvoon 10,2. Standardit valmistettiin laimentamalla tätä perusliuos-ta 0,1-M fosfaattipuskuriin, joka sisälsi 0,1 % naudan seerumialbu-miinia (pH 7,0).

5. Seurantareagenssi - Glukoosioksidaasimääritysreagenssi valmistettiin sekoittamalla keskenään 11 osaa 0,15-M fosfaattipuskuria (pH 7,0), joka sisälsi 1,8 % (paino/tilavuus) naudan seerumialbu-miinia, 2 osaa 2,0-mM 4-aminoantipyriiniä, joka sisälsi 0,6 mg/ml peroksidaasia, 2 osaa 20-mM 3,5-dikloori-2-hydroksibentseenisulfo-naattia 0,1-M fosfaattipuskurissa (pH 7,0) ja 2 osaa 1,0-M glukoosia bentsoehapon kyllästetyssä vesiliuoksessa.

D. Määritysmenettelyt 1. Kaikkien reagenssien lisäys ilman esi-d-nknh^flrrtlvaihetta Seuraavat lisättiin peräkkäin erillisiin reaktiokyvetteihin: 0,05 ml leimatun konjugaatin liuosta, 0,05 ml valittua standardiliuosta, 0,1 ml antiseerumiliuoksen 1:4-laimennusta fosfaattipuskurissa, 1,7 ml seurantareagenssia ja 0,1 ml apoentsyymiliuosta. Jokaista reaktio-seosta inkuboitiin 30 minuuttia 20°C:ssa ja absorbanssi aallonpituudella 520 nm mitattiin.

2. Esi-inkubointi antiseerumin kanssa

Seuraavat lisättiin peräkkäin erillisiin reaktiokyvetteihin: 0,05 ml leimatun konjugaatin liuosta, 0,05 ml valittua standardiliuosta ja 0,1 ml antiseerumiliuoksen laimennusta fosfaattipuskurissa suhteessa 1:16. Jokaista reaktioseosta inkuboitiin 20 minuuttia 20°C:ssa ja sen jälkeen 1,7 ml seurantareagenssia ja 0,1 ml apoentsyymiliuosta lisättiin jokaiseen peräkkäin. Vielä 30 minuutin hautomisen jälkeen 20°C:ssa absorbanssi aallonpituudella 520 nm mitattiin jokaisessa kyvetissä.

3. Esi-inkpbOittti apoentswmin kanssa

Seuraavat lisättiin peräkkäin erillisiin reaktiokyvetteihin: 0,05 ml leimatun konjugaatin liuosta, 0,05 ml valittua standardiliuosta ja 0,1 ml apoentsyymiliuosta. Jokaista reaktioseosta inkuboitiin minuuttia 20°C:ssa ja sen jälkeen lisättiin 0,1 ml antiseerumiliuoksen laimennusta fosfaattipuskurissa suhteessa 1:2 ja 1,7 ml seuranta- 41 70726 reagenssia jokaiseen peräkkäin. Vielä 30 minuutin inkuboinnin jälkeen 20OC:ssa absorbanssi aallonpituudella 520 nm mitattiin jokaisessa kyvetissä.

4. Peräkkäinen esi-inkubointi ensin antiseerumin ja sitten apoentsyymin kanssa_

Seuraavat lisättiin peräkkäin erillisiin reaktiokyvetteihin: 0,05 ml leimatun konjugaatin liuosta, 0,05 ml valittua standardi-liuosta ja 0,1 ml antiseerumiliuoksen laimennusta fosfaattipuskurissa suhteessa 1:32. Jokaista reaktioseosta inkuboitiin 20 minuuttia 20°C:ssa ja sen jälkeen jokaiseen lisättiin 0,1 ml apoentsyymiliuos-ta. Vielä 20 minuutin inkuboinnin jälkeen 20°C:ssa 1,7 ml seuranta-reagenssia lisättiin jokaiseen kyvettiin ja absorbanssi aallonpituudella 520 nm mitattiin jokaisessa 30 minuutin inkuboinnin jälkeen 20°C:ssa.

5. Peräkkäinen esi-inkubointi ensin apoentsyymin ja sitten antiseeru- min kanssa__________

Seuraavat lisättiin peräkkäin erillisiin reaktiokyvetteihin: 0,05 ml leimatun konjugaatin liuosta, 0,05 ml valittua standardi-liuosta ja 0,1 ml apoentsyymiliuosta. Jokaista reaktioseosta ihkuboi-tiin 20 minuuttia 20°C:ssa ja sen jälkeen jokaiseen lisättiin antiseerumiliuoksen laimennusta fosfaattipuskurin suhteessa 1:32. Vielä 20 minuutin inkuboinnin jälkeen 20°C:ssa jokaiseen kyvettiin lisättiin 1,7 ml seurantareagenssia ja absorbanssi aallonpituudella 520 nm mitattiin jokaisessa 30 minuutin inkuboinnin jälkeen 20°C:ssa.

6. Esi-xnkubointi sekä antiseerumin että apoentsyymin kanssa Seuraavat lisättiin peräkkäin erillisiin reaktiokyvetteihin: 0,05 ml leimatun konjugaatin liuosta, 0,05 ml valittua standardi-liuosta, 0,1 ml apoentsyymiliuosta ja 0,1 ml antiseerumiliuoksen laimennusta fosfaattipuskurissa suhteessa 1:32. Jokaista reaktioseosta inkuboitiin 20 minuuttia 20°C:ssa ja sen jälkeen jokaiseen lisättiin 1,7 ml seurantareagenssia. Vielä 30 minuutin inkuboinnin jälkeen 20°C:ssa absorbanssi aallonpituudella 520 nm mitattiin jokaisessa kyvetissä.

E. Tulokset Määritykset suoritettiin kaksinkertaisina sopivien sokeiden kokeiden kanssa. Havaittiin, että menetelmissä 1—3 tyroksiinin väkevyys 70726 42 standardiliuoksessa oli suoraan verrannollinen glukoosioksidaasi-aktiivisuuteen, kun taas menetelmissä 4-6 tyroksiiniväkevyys oli kääntäen verrannollinen entsyymiaktiivisuuteen. Menetelmissä 1-3 ilman tyroksiinia entsyymiaktiivisuus inhiboitui, kun taas menetelmissä 4-6 entsyymiaktiivisuus parani. Menetelmien 4-6 havaittiin myös olevan jonkin verren herkempiä tyroksiinille kuin muiden menetelmien. Syytä tai syitä siihen, miksi entsyymiaktivointi vaihtelevasti inhiboitui tai parani riippuen reaktiojärjestyksestä, ei täysin ymmärretä; kuitenkin tulokset osoittivat, että tämä keksintö muodostaa homogeenisen spesifisen määritysmenetelmän tyroksiinin määrittämiseksi käyttäen joukkoa erilaisia reaktiojärjestyksiä.

Esimerkki 4

Homogeeninen sidontamääritys teofylliinille A. Leimatun konjugaatin - teofylliini-FAD valmistus.

Liuokseen, jossa oli 2,4 yumol flaviini-N^-aminoheksyyliadeniinidi-nukleotidia, joka oli valmistettu esimerkin 1 kohdassa A yllä kuvatulla tavalla, 200 ^ulissa dimetyylisulfoksidia argonkaasun alaisena, lisättiin 0,9 mg l,3-dimetyyli-l,6,7,8-tetrahydropyrido/l,2-e)pu-riini-2,4,9/3H/-trionia (3,62 ^umol), joka oli valmistettu menetelmän mukaan, jonka ovat esittäneet Cook et ai., Res. Comm. in Chem. Pathol, and Pharm. 13:497 (1976), johon 4 tunnin kuluttua lisättiin vielä 1,8 mg (7,3 yumol) samaa ainetta. Kun seosta oli sekoitettu yli yön, liuotin haihdutettiin tyhjössä (0,1 mm Hg) ja jäännös kro-matografoitiin 2,5 x 90 cm:n Sephadex LH-20-kolonnilla (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi) ja eluoitiin 0,3-M trietyyliammo-niumbikarbonaattipuskurilla (pH 7,8). Epäpuhdas tuote, joka eluoi-tui poistovirran alueella 210-246 ml, otettiin talteen, asetettiin 20 x 20 cm x 1000 ^u:n piidioksidigeelilevylle ja eluoitiin etanolin ja 1-M trietyyliammoniumbikarbonaattipuskurin (pH 7,8) seoksella suhteessa 8:2. Vyöhyke, joka sisälsi haluttua tuotetta (Rf = 0,77), kaavittiin levyltä, uutettiin 1-M trietyyliammoniumbikarbonaatti-puskurilla (pH 7,8), suodatettiin ja väkevöitiin. Lopullinen puhdistus uudelleenkromatografoimalla Sephadex LH-20-hartsilla eluoiden 0,3-M puskurilla tuotti 1,26 ^umol leimattua yhteenliittymää määritettynä absorbanssimittauksella 450 nmrssä, mikä merkitsi 53 %:n saalista.

B. Vasta-aineen sidosreaktiot

Vasta-ainetta kasvatettiin kaniineissa 8-(3-karboksipropyyli)-1,3- 43 70726 dimetyyliksantiini-BSA-immunogeenia vastaan, kuten ovat kuvanneet Cook et ai., Res. Comm. in Chem. Pathol. Pharm. 13:497 (1976).

Vasta-aineen sidosreaktiot suoritettiin huoneenlämpötilassa 0,1-M natriumfosfaattipuskurissa (pH 7,0) ja glukoosioksidaasiaktiivisuu-den mittaukset tehtiin samassa puskurissa 20°C:ssa.

Määrityksessä käytetyt reagenssit olivat seuraavat:

Reagenssi Koostumus A 0,1-M natriumfosfaattipuskuri (pH 7,0) B 565-nM teofylliini-FAD leimattu yhteenliittymä tai 160-nM N -(6-aminoheksyyli) FAD (FAD-johdannainen) C teofylliinin vastaseerumi (laimennettu 10-kertaises- ti reagenssiin (A) D apoglukoosioksidaasi (50-nM FAD sidoskohtaa/ml) E seurantareagenssi: 200 ,ug peroksidaasia/ml; 0,71-mM 4-aminoantipyriiniä? 7,1-mM 3,5-dikloori-2-hydroksibentseenisulfonaattia, 353-mM glukoosia? ja 35 mg BSA/ml.

Reagenssit A, B ja C yhdistettiin erillisissä reaktiokyveteissä taulukossa 4 alla ilmoitetuissa suhteissa. Reagenssi D (100 ^ul) ja reagenssi E (283 yul) lisättiin sitten nopeasti ja peräkkäin jokaiseen reaktioseokseen, minkä jälkeen niitä haudottiin 30 minuuttia 20°C:ssa. Absorbanssi aallonpituudella 520 nm mitattiin sitten kullekin kyvetille. Taulukossa 4 esitetyt tulokset ovat kaksois-ajojen keskiarvoja.

44 70726 Ή

W

in — c S

H3C <D TT i—I en O^ID^T

XI -^OO^rrOfM Οι—Ιι—I IN IN I—I

GO O LOI O ID >D 'D ΓΟ IN IN IN 04 QCN - in lt> ooooo oooooo X — < r—\

P

*— Ή ε u 3

G

•H 0) in qj ooo ooooo men iiiHrro i-hin^covd

G "iH I—I r—I

0 44 O G G fO O —

PS

:id g >1 4-> 4-1

O -H

>S 3-H OOOOOO

P4 4-* I—I I I I I I (N CN 04 IN CN CN

D —s -U c x I—I rd cu PD P £ 04 <C \-H 44

Eh — 0 X

I—I P^- CQ —

-H

in in G — 0 c &i I 0)

G -G C

0 O -H

PS -r-1 (Ö O O O O

1C IOOOO I I I I I I

Q G 1—I 1—I ι-H I—I

< 03 Pm T3 f—i

P

\ c —

•H H G

in p r— i— t— i— i— i— i— i— 04 i— t"· ιη^4 ,—ii—ιογ'-ιτ» οοογ'γο^ηο

Gin vDLnio^rro lo lo lo lo

0 P

O CS

Π3 -- 0

OS

o •H o

4-4 G

-X 0 r-4 04 O ^ l/3 O [— 00 Oi O H

03 £ i—l i—I

0 3 OS e

II

70726 45

Reaktioiden 2-6 tulokset osoittivat, että antiseerumi ei vaikuttanut FAD-johdannaisen aktiivisuuteen (ts. ei liittynyt teofy11iiniin). Reaktiot 6-11 osoittivat, että kasvavat määrät teofylliinin anti-seerumia laskivat leimatun konjugaatin aktiivisuutta suhteessa sen kykyyn yhdistyä apoentsyymiin.

C. Kilpailevat sidontamääritykset Nämä reaktiot suoritettiin osassa B yllä hahmotellulla tavalla paitsi, että ilmoitetut määrät teofylliiniä yhdistettiin reagens-seihin A ja B ennenkuin niihin lisättiin reagenssia C ja myös että reagenssille C käytettiin antiseerumin 100-kertaista laimennusta. Tulokset esitetään taulukossa 5 alla.

Reaktiot 1-3 olivat vertailuja ja osoittivat, että teofylliinin vasta-aine huonontaa leimatun yhteenliittymän kykyä yhdistyä apoentsyymiin. Reaktiot 4-9 osoittavat, että FAD-aktiivisuus laskee suhteessa teofylliinin määrään reaktioseoksessa.

70726 46 I *H cl MW loot''' Ο οι o H’rovooH’Oco.—ir- oi C <N ocrimi—voLn^^m -O nd «-o ' ^ ^ ^ ^ ^ ^ < X) "" ooooooooo I—1 3

"— -H

u i

M

•HQ) OOOOOOO

end) I looooooo en en I—t I—I f—I r—ι i—i <—) i—i C -H CD 4-> 3 3 to d) —-C4 cn >1 —

>ιΕ O O rH f—I

>3 I I I O O ' - - -

CD rH f—H rH rH O O

PC — :3 •H > 3

H

LD -H ^

rH f—I

O rH 3 IX > \ « Ή —

D O

Ml Q)cn oooooo 3 E-ι >i £ I I ι o in o in o m *3 -P 3 ·—I 1—1 r—Ί

Eh 4-1 > :3 3 cn .—ι

•rH *rH

ι—I -P

— I

'—I 3 3 CD \Q) “ 4-> x: a >, •H 3 :3 cn4Jg ι oooooooo en 4J >ι (Νγνιγμγμγμγνιγμγμ

C 3 4-> cd ε 4-) tn -h ·η 3 d) -H

d) ι—I rH

PS --

rH

3 \

<d ή M

H 3 tn M [^Γ'ΐ^-Γ^Γ'Γ^ι^Γ'Ρ' enen ι—ι en, cts ολ -^r eri ·<ί· 33 coLn^rnra-m^ror^· (D O, tn 3 0)

PS

o •h o -P u ps a) 3 £ rHrHroTTLn^r^oOcn 0) 3 PS 3 47 7072 6

Esimerkki 5

Homogeeninen sidontamääritys ihmisen IgGrlle A. Leimatun konjugaatin - IgG-FAD valmistus 4,24 mg:an flaviini-N^-aminoheksyyli-adeniinidinukleotidiä, joka oli valmistettu yllä olevan esimerkin 1 osassa A kuvatulla tavalla, lisättiin 2,5 mg dimetyyliadipimidaatin dihydrokloridia (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) 1 ml:ssa vettä ja 5 yUl tri-etyyliamiinia. Reaktiota sekoitettiin huoneen lämpötilassa 10 minuuttia ja 40 mg ihmisen immunoglobuliinia (IgG) 1 ml:ssa 0,1-M natrium-pyrofosfaattipuskuria (pH 8,5) lisättiin sitten. Vielä 3 tunnin sekoituksen jälkeen huoneen lämpötilassa reaktioseos kaadettiin 2,5 x 50 cm:n Sephadex G-25 kolonniin (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi), joka oli tasapainotettu ja joka eluoitiin 0,1-M natriumfosfaattipuskurilla (pH 7,0). Jakeet ensimmäisenä eluoitunees-ta piikistä, jonka absorbanssi oli aallonpituudella 450 nm, otettiin talteen ja dialysoitiin peräkkäin 4 l:a vastaan 0,1-M natriumfos-faattipuskuria (pH 7,0) 16 tunnin ajan, 4 l:a vastaan 0,1-M natrium-fosfaattipuskuria (pH 7,0), joka sisälsi 1-M natriumkloridia, 24 tuntia ja 0,01-M natriumfosfaattipuskuria vastaan (pH 7,0) 48 tuntia. Natriumatsidia lisättiin sitten 0,1 %:n väkevyyteen (paino/tilavuus). Reakt ioma teriaal i suodatettiin 0,22 ^,u:n Mi lliporesuodattimen läpi ja varastoitiin.

B. Vasta-aineen sidosreaktiot Määrityksessä käytetyt reagenssit olivat seuraavat:

Reaqenssi Koostumus A 0,1-M natriumfosfaattipuskuri (pH 7,0) B 10-mM 4-aminoantipyriini C 1,0-M glukoosi D 25-mM 3,5-dikloori-4-hydroksibentseenisulfonaatti reagenssissa A ,

E 1,2 mg/ml piparjuuriperoksidaasia reagenssissa A

F 30 % (paino/tilavuus) naudan seerumialbumiini (Research Products Division, Miles Laboratories,

Inc., Elkhart, Indiana, USA) G IgG-FAD leimattu yhteenliittymä liuoksessa, jota varastoitiin yllä H apoglukoosioksidaasi I kaniinin antiseerumi ihmisen IgG:a vastaan (saatu yhtiöltä Behring Diagnostics, Somerville, New Jersey, USA) J standardit - ihmisen IgG reagenssissa A ennalta määrä tyt määrät 70726 48

Reagenssiseokset valmistettiin seuraavasti:

Seos n:o 1 - 180 ^ul reagenssia A, 20 ^ul reagenssia B, 100 ^ul reagenssia D ja 5 ^,ul reagenssia G (5,4-^uM).

Seos n:o 2-0,3 ml:n kokonaistilavuus eri suhteissa sisältäen taulukossa 6 alla esitetyt määrät reagenssia I lopputila-vuuden muodostuessa reagenssista A.

Seos n:o 3-80 ^ul reagenssia D, 50 ^ul reagenssia E, 33 ^ul reagenssia F, 137 ^,ul reagenssia A ja 1,6 ^ul reagenssia H (4,2-yUN FAD-sidoskohtaa).

300 ^ui-.an seosta n:o 1 lisättiin 300 ^,ul seosta n:o 2 ja 300 ^ul reagenssin A erillisissä reaktiokyveteissä. Vähintään 10 minuutin inkuboinnin jälkeen huoneen lämpötilassa 300 ^ul seosta n:o 3 lisättiin jokaiseen reaktioon. Vielä 30 minuutin inkuboinnin jälkeen 20° C:ssa absorbanssi 520 nm:ssa mitattiin jokaisesta kyvetistä.

Tulokset olivat seuraavat: TAULUKKO 6

Seoksen n:o 2 valmistamiseksi Absorbanssi lisätty antiseerumin tilavuus (520 nm) 0 0,859 2 0,750 4 0,602 6 0,494 8 0,443 10 0,415 12 0,408 14 0,392 16 0,375

Tulokset osoittavat, että kun vasta-ainemäärä kasvaa, FAD-leimalla konjugoidun IgG:n synnyttämä glukoosioksidaasiaktiivisuus laskee.

C. Kilpailevat sidontamääritykset Nämä reaktiot suoritettiin käyttäen osassa B yllä kuvattuja reagens-seja. Ilmoitetut määrät ihmisen IgG:a 300 ^ul:n tilavuuksissa reagenssia A yhdistettiin seokseen n:o 1 erillisissä reaktiokyveteissä. Sen jälkeen seos, jossa oli 12 ^ul reagenssia I ja 288 ^ul reagenssia A, lisättiin jokaiseen reaktioon. 10 minuutin kuluttua 300 ^ul

II

49 70726 seosta n:o 3 lisättiin ja reaktioseoksia haudottiin 20oc:ssa 30 minuuttia. Tämän ajan kuluttua absorbanssi aallonpituudella 520 nm mitattiin jokaisessa kyvetissä. Tulokset olivat seuraavat: TAULUKKO 7

Lisätyt ihmisen IgG:n Absorbanssi määrät (^ug)_ (520 nm) 0 0,579 4 0,653 3 0,751 12 0,844 16 0,986 24 1,06 Näin ollen osoitettiin, että tämä keksintö muodostaa spesifisen sidontamäärityksen molekyylipainoltaan korkean ligandin, ihmisen IgG:n määrittämiseksi nestemäisissä väliaineissa.

Reagenssiväliaineet

Kuten kyseisellä alalla työskenteleville käy ilmi edellä olevasta kuvauksesta ja esimerkistä, reagenssivälineet, joita käytetään tämän menetelmän toteuttamiseen, voivat omaksua joukon eri muotoja. Erityisesti tällaiset reagenssivälineet voivat saada yhtenäisen testikokoomuksen muodon, kuten sopivan kiinteän tai nestemäisen muodon. Esimerkkinä eräs testikokoomuksen muoto ligandin määrittämiseksi tämän keksinnön mukaisesti sisältää (a) leimatun yhteenliittymän, joka koostuu orgaanisesta korvaavasta ryhmästä, joka on liittynyt ligandiin tai sen sidosanalogiin, (b) spesifisen ligandin sidos- osapuolen ja (c) apoentsyymin, joka kykenee yhtymään korvaavan ryhmän kanssa tuottaen holoentsyymin. Tällainen testikoostumus voi sisältää myös reagensseja holoentsyymin aktiivisuuden mittaamiseksi ja haluttaessa ja kun se on sopivaa, leimattu yhteenliittymä ja apo-entsyymi voidaan yhdistää niiden konjugoidun entsyymikompleksin muotoon. Luonnollisesti tavanomaisia laimentimia, puskurointimateriaa-leja, stabilisaattoreita jne. voi myös sisältyä testikokoomuksesta.

Reagenssivälineet voivat saada myös testausvälinesarjän muodon, ts. pakatun säiliöiden yhdistelmän, jotka sisältävät tarvittavat reagenssiosat. Jälleen esimerkkinä eräs testausvälinesarjän muoto 50 70726 ligandin määrittämiseksi tämän keksinnön mukaisesti käsittää yhden tai useampia säiliöitä, joissa on (a) leimattua yhteenliittymää, joka koostuu orgaanisesta korvaavasta ryhmästä, joka on liittynyt ligandiin tai sen sidosanalogiin, (b) spesifistä ligandin sidososa-puolta ja (c) apoentsyymiä, joka kykenee yhtymään korvaavaan ryhmään muodostaen holoentsyymiä. Tällainen testausväliainesarja voi myös tarjota käytettäväksi yhdessä tai useammassa samoista tai eri säiliöistä reagensseja holoentsyymin aktiivisuuden mittaamiseksi ja haluttaessa ja kun se on sopivaa, leimattu yhteenliittymä ja apoentsyy-mi voi olla yhdistetty niiden konjugoidun entsyymikompleksin muotoon. Eräässä toteutusmuodossa testausväliainesarja käsittää vähintään kaksi erillistä säiliötä, joista toisessa on leimattua yhteenliittymää ja valinnaisesti reagensseja holoentsyymiaktiivisuuden määrittämiseksi ja toisessa on sidososapuolta ja apoentsyymiä. Luonnollisesti testausvälinesarja voi sisältää muita reagensseja, joita alalla tunnetaan ja jotka voivat olla toivottavia kaupalliselta kannalta, kuten puskureita, laimentimia, standardeja jne.

Il

Claims (5)

51 70726

1. Kvantitatiivinen homogeeninen immunomääritysmenetelmä, nestemäisessä väliaineessa olevan hapteenin ja antigeenin määrittämiseksi, jossa menetelmässä muodostetaan reaktioseos yhdistämällä nestemäinen väliaine hapteenin tai antigeenin vasta-aineen kanssa ja sellaisen merkityn konjugaatin kanssa, jossa on merkkikomponentti liittyneenä hapteeniin tai antigeeniin, joka merkkikomponentti osoittaa määritettävissä olevan reaktion, joka on erilainen merkityn konjugaatin ollessa sidottu vasta-aineella kuin jos se ei ole sidottu, ja mitataan määritettävissä oleva reaktio reaktioseoksessa, tunnettu siitä, että merkkikomponentti on flaviini-adeniinidinukleotidi ja että mainitut reagenssit myöskin sisältävät apoglukoosioksidaasia, joka kykenee liittymään flaviiniadeniinidinukleotidin kanssa muodostaen katalyytti-sesti aktiivista glukoosioksidaasia, ja että glukoosioksidaasi-aktiivisuus mitataan reaktioseoksessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että glukoosioksidaasiaktiivisuus mitataan kolorimetrisellä menetelmällä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hapteeni tai antigeeni on teofylliinia, tyroksiiniä, IgGrtä tai N-2', 4 ' -dinitrofenyyli-6-aminokaproaattia.

4. Reagenssijärjestelmä hapteenin tai antigeenin määrittämiseksi patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä, tunnettu siitä, että se sisältää 1. merkityn konjugaatin, jossa merkkikomponenttina on flaviini-adeniinidinukleotidi liittyneenä hapteeniin tai antigeeniin, 2. hapteenin tai antigeenin vasta-aineen, ja 3. apoglukoosioksidaasia.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä käytettävä merkitty konjugaatti, tunnettu siitä, että merkki-komponentti on flaviiniadeniinidinukleotidi.