DD144461A5 - Spezifisches bindungsanalyseverfahren zur bestimmung eines liganden in einem fluessigen medium - Google Patents

Description

Spezifische Bindungsanalyse mit einer prosthebischen Gruppe als Ivlarkierungskomponente

Die Erfindung betrifft Nachweisverfahren und Reaktionsmittel für den Einsatz dabei vom homogenen oder heterogenen spezifischen Bindungstyp zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium. Die Erfindung betrifft insbesondere spezifische Bindungsanalysen unter Einsatz nicht-radioisotoper Markierungen. Weiterhin betrifft die Erfindung nichb-radioisotop markierte konjugierte Verbindungen für die Anwendung bei derartigen Analysen und Verfahren für deren Herstellung.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen: Bei herkömmlichen spezifischen Bindungsanalysetechniken wird die Testprobe mit Reaktionsmitteln der verschiedensten Zusammensetzungen vereinigt, die eine konjugierte Verbindung mit einer verfolgbaren Markierungskomponente und einer Bindungskomponente enthalten, die mit anderen Bestandteilen, wenn vorhanden, der Reaktionsmittel an der Bildung eines Bindungsreaktionssystems, eine gebundene Spezies und eine freie Spezies, erzeugt, beteiligt ist. Die relative Menge oder der relative Anteil der markierten konjugierten Verbindung, die (der) zur gebundenen Spezies im Ver-. hältnis zur freien Spezies führt, ist dem Vorhandensein (oder der Menge) des in der Testprobe nachzuweisenden Liganden abhängig.

Zur Erläuterung wird anschließend ein herkömmliches Konkurrenz-Bindungsanalyseverfahren beschrieben. Bei einen derartigen Verfahren würde das Reaktionsmittel bestehen aus (1) einer markierten konjugierten Verbindung in Porm des nachzuweisenden Liganden (z. Bc einem Antigen oder Hapten), wobei ein solcher Ligand die Bindungskomponente der konjugierten Verbindung, chemisch an eine Markierungskoniponante gebunden, darstellt, und (2) einem spezifischen Bindungspartner für den Liganden (z. B. einem Antikörper). Kacli der Vereinigung der Testprobe und des Reaktionsmibtels wiirdsn der nachzuweisende Ligand und die Bindung skompo-

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nente der markierten konjugierten Verbindung in einer im wesentlichen nicht scharf zu unterscheidenden Weise um die nicht-kovalente Bindung an den spezifischen Bindungspartner konkurrieren« Infolgedessen kann entweder die Menge der markierten konjugierten Verbindung, die an den BindungspartnQr gebunden werden würde (d. Iu die zur gebundenen Spezies führt) oder die Menge, die frei bleiben würde (d. h, nicht an den Bindungspartner gebunden ist und daher zur freien Spezies führt) in Abhängigkeit von der Menge des vorhandenen konkurrierenden Liganden gemessen werden. Die Menge der markierten konjugierten Verbindung, die au beiden Spezies führt, wird durch Messen bestimmt;, d_e h· durch Verfolgen, der darin anwesenden markierten iiomponenta.

Wenn die markierte konjugierte Verbindung in der gebundenen Spezies und die in der freien Spezies im wesentlichen durch die zur Verfolgung der markierten Komponenten angewandten Techniken nicht unterschieden werden können, müssen die gebundene Spezies und die freie Spezies physikalisch getrennt werden, um die analyse zum Abschluß zu bringen. Diese Art der Analyse wird im Fachgebiet als "heterogen" bezeichnet. Wenn die Formen von gebundener Spezies und freier Spezies der markierten konjugierten Verbindung unterschieden werden können, dann kannein ^1?homoge~ ner" Weg eingeschlagen und der irennschritt vermieden werden.

Die zuerst entdeckte Art einer sehr sensitiven spezifischen Bindungsanalyse war die Radioimmurioanalyse, bei der als Markierungskomponente ein radioaktives Isotop verwendet wird. Sine derartige Analyse muß unbedingt in der heterogenen Form durchgeführt werdenj da der nachweisbare Charakter dor Markierung qualitativ in der freien und der gebundenen Speaies unverändert ist. Infolge der Schwierigkeiten beim Umgang mit radioaktiven Stoffen sind viele neue Ana Iy se sy sterne unter Anwendung anderer Stoffe außer Radioisotopen als Markierungskomponente, und zwar von Enzymen, fluoreszierenden Ivlolekülen, Bakteriophagen, Metallen und Organoiaetallkoiaplexan, Koeasymen. Enzym substrat en, Enzyminhibitoren, zyklischen Reaktanzen und chaEiilominiszenten Reaktanten vorgeschlagen worden.

Im folgenden werden mehrere unterschiedliche heterogene Bindungsreaktionssysterne beschrieben, in denen ein Enzym als Markierungskomponente verwendet wird: US-PS ITr. 5.654.09O₅ 3·791.952; 3·339.1531 3.850.752 und 3-879.262; J. Immunol. Methods 1:247 (1972) und J. Immunol. 109:219 (1972). Sine heterogene Bindungsanalyse unter ,Anwendung eines nicht-aktiven Vorläufers einer spektrophotometrisch nachweisbaren Substanz als Markierungssubstanz wird in der US-PS Nr. 3.880.934- vorgestallt. Sine weitere heterogene Analysen betreffende interessante Quelle sind Principles of Competitive Protein-Binding ,assays, Herausgeber Odell undLau^iaday (J.B. Lippincott Go., Philadelphia, 1972).

Bine enzym-iaarkierte Iiinnunoanalyse des homogenen Typs wird in US-PS Nr. 3.817.834 beschrieben, bei der eine konjugierte Ligand-Enzym-Verbindung verwendet wird. Die enzymatisch^ Aktivität der konjugierten Verbindung in der gebundenen Spezies ist weniger meßbar als in der freien Spezies, wodurch ein homogener Weg eingeschlagen werden kann. Die .Anwendung von besonders einmaligen Stoffen als Markierungssubstanzen z. B. von Koenzymen, ehemilumineszenten Molekülen, zyklischen Heaktanten und spaltbaren fluroeszierender Enzymsubstraten sowohl bei der homogenen als auch, der heterogenen Form wird in den auf den US-Patentanmeldungen, Anmeldeaktenzeichen Nr. 667.982 und 667.996, eingereicht am 18c März 1976 basierenden; DE-OS Nr. 2·618.419 und 2.618.511 beschrieben.

Wenn die Suche nach, nicht-radioisotopen Markierungen für Bindungsanalysen eine Seihe brauchbarer Lösungen gebracht hat, so bleibt doch noch viel Saum für Verbesserungen. Die Versuche mit Enzymmarkierung erschienen zunächst sehr vielversprechend, aber in der Praxis zeigten sich verschiedene Schwierigkeiten. Die hohe Molekülmasse und die heterologe Beschaffenheit von Enzymen führen zu Problemen bei der Charakterisierung, Stabilisierung und dor wiederholbaren Darstellung markierter konjugierter Verbindungen, Diese Probleme konnten durch den Srsats der Enzym-Markierungen durch Markierungen mit geringer Molekülmesse,

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die durch ihre Aktivität als Reaktant verfolgt werden konnten, beseitigt werden. Diese neuen Markierungen einschließlich der Koenzyme, Enzymsubstrate, zyklischen Reaktanten und chemiluminiszenten Reaktanzen können zur Durchführung von Analysen mit hoher Sensibilität und Vielseitigkeit verwendet werden. Die Verfolgung dieser Markierungen macht oftmals Instrumente notwendig, die zui' Zeit im klinischen Labor nicht unbedingt zu finden sind. - ;

Ziel der Erfindung*

Der Erfindung liegt die Hauptaufgabe zugrunde, eine nicht-radioisotope Bindungsanalyse zur Verfugung zu stellen, bei der eine neuartige Markierung verwendet wird, die mit der normalen klinischen Standardausrüstung verfolgt werden kann, wobei die Vorteile der Reaktant-Markierung wie Sensibilität, Vielseitigkeit und leichte Synthese und Charakterisierung markierter konjugierter Verbindungen erhalten bleiben«

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Bs ¥/urde jetzt entdeckt, daß eine verbesserte spezifische Bindungsanalyse durch die Verv/endung eines Restes einer organischen prosthetischen Gruppe als Markierungskomponente in der markierten konjugierten Verbindung möglich ist. Prosthetische Gruppen sind eine im Fachgebiet anerkannte Klasse von Enzymkofaktor en. Unter einem Enzymkofaktor ist eine Hichtprotein-Substanz zu verstehen, deren Anwesenheit erforderlich ist, damit "ein Enzym seine katalytisch^ Aktivität erreichen kann, und die eine chemische Veränderung während des katalytischen Zyklus des betreffenden Enzyms (als Ausgangsenzym bezeichnet) durchmacht. Ein Koenzym ist eine Art Enaymkofaktor, der im Laufe der durch das-Äusgangsenzym katalysierten Reaktion chemisch modifiziert wird. Die Wiederherstellung der ursprünglichen Form des Eofaktors macht seine Teilnahme in einer getrennten Reaktion, die durch ein. anderes Enzym als Ausgangsenzym katalysiert wird, erforderlich. Im Gegensatz dazu ist eine prosthetische Gruppe ein Enjaymkofaktor, der im Laufe der durch das Au.sgangs8nzym katalysierten Reaktion chemisch modifisiert wird.und durch eina zweita, durch das gleiche Aus gang se na ym katalysierte Reaktion regeneriert wird.

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Pro s the ti sehe Gruppen werden im allgemeinen so charakterisiert, daß sie in relativer Beziehung fest an den Proteinanteil des Äusgangsenzyms gebunden sind, wobei ein derartiger Proteinanteil als das isoenzym bekannt ist und das katalytisch aktive Ausgangsenzym als das Holoenzym bekannt ist. Die Gleichgewichtsreaktion für die Wechselwirkung zwischen einer pro sthe ti sehen Gruppe und einem Apoenzym kann folgendermaßen dargestellt werden;

Prosthetische Gruppe + Apoenzym konjugiertes oder HoIoenz;

(Pr) -(APO) (Pr-ipo)

Die hier verwendete Bezeichnung konjugiertes Enzym bezieht sich auf einen Komplex, der durch die Kombination der pro st he ti sehen Gruppe und· des Äpoenzyms gebildet wurde, gleich ob ein solcher Komplex katalytische Aktivität zeigt, und die Bezeichnung Holoan zym betrifft nur ein katalytisch aktives konjugiertes Enzym. Weitere Einzelheiten über prosthetische Gruppen, ihre Eigenschaf ten und ihre Wechselwirkungen mit Apoenzymensind aus Dixon und Webb, Enzyme, 1. Aufl. Longmans, Grenn & Oo (London 1958) zu entnehmen. - ·

Bei der vorliegenden Erfindung wird eine organische prosthetische Gruppe mit einer Bindungskomponente zur Bildung einer markierten konjugierten Verbindung für den Einsatz bei Bindungsanalysen gekoppelt. Ein Hauptmerkmal dar Erfindung ist die sich ergebende Wechselwirkung zwischen der konjugierten prosthetischen Gruppe und dem .4poenzym nach folgender Darstellung:

+ Apo · O-EP -

katalytisch inaktive aktiver Holenzym-

Komponenten Komplex

Da es sich bei der oben dargestellten Reaktion um die normale Wechselbeziehung handelt, ist anzunehmen, daß der konjugierte Enzymkomplex unter bestimmten umständen nur geringe oder gar keine HoIoenzym-Aktivitat aufweisen wird, wie es der Pail 1st, wenn die Konjugation der pro sthe ti scha η Gruppe die normals

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Holoenzym-ßubstrat-Wechselwirkung verhindert. Markierte konjugierte Verbindungen, die für die Erfindung geeignet sind, können sich dennoch ergeben, wenn der gebundene konjugierte Enzyinkoniplex nach dem Binden der Bindungskomponente (dargestellt durch das Symbol Q-' oben) der konjugierten prosthetischen Gruppe in der Anaiysebindungsreaktion dann Holoenzymaktivität aufweist, und zwar eine solche, als ob eine derartige Bindung die Inhibition der Ho3.oenz3?m~Substrat-Wechselwirkung auf he bt_e

Es gibt zahllose mögliche Markierungs-Verfolgungs-Schemata, von denen einige später dargestellt werden, die nach irgendeiner der verschiedenen bekannten homogenen und heterogenen Bindungsformen ablaufen* In allen Fällen enthält ja doch die Markierungskoniponente der markierten konjugierten Verbindung, die an der Bindungsreaktion beteiligt ist, den Rest einer organischen prosthetischen Gruppe, und das Verfolgungsschema besteht in der Bestimmung der Markierungskomponente in der gebundenen Spezies oder der freien Spezies oder beiden, je nachdem wie der Fall liegt, auf der Basis von Messungen der HoIoenzymaktivitat.

Bei den Resten pro sthe fei scher Gruppen, die vorzugsweise beider Erfindung eingesetzt werden, handelt es sich um Reste von S¹Iavinadsnindinucleotid, Plavinmononucleotid und Harn. Bevorzugte Paare aus einem Rest der prosthetischen Gruppe und Jipoen;zym sind Reste von Plavinadenindinuclaotid/Apoglucoseoxidase und Reste von Ham/Äpoperoxidase. Die jeweils von solchen Paaren gebildeten Holoensyme lassen sich mit den allgemein bekannten Wasserstoffperoxid-Meßtechniken, die kolorimetrisch und fluorometrische Methoden umfassen, leicht verfolgen. Infolge der kataiytischen Beschaffenheit des verfolgten Holoenzyms wird die anwesenheit der Markierungskomponante bei der Verfolgungsreaktion vielfach verstärkti so daß der hoch empfindliche Nachweis das analysierten Ugandan (ζ. B. bei Mangen von ng/ml) unter ünweDdung relativ wenig sensitiver, aber immer zur Verfügung stehender und einfacher Instrumente v?ie SpektropHotometerj möglich ist. Die Kombination der Möglichkeit, ein Molekül der prosthetischen Gruppa mit geringer Moleküimasse als Komponente, durch die die Mar-

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kierung an die Bindungskomponente in der markierten konjugierten Verbindung-gebunden ist, verwenden zu können, mit der Möglichkeit, einen überaus sensitiven Nachweis mit spektrophotometrischer, vor allem koIorimetrischer Anzeige zu erlangen, ergibt eine einmalig vorteilhafte spezifische Bindungsanalyse.

Die vorliegende Analyse ist gekennzeichnet durch überaus sensitive Nachweisgrenzen durch die einfache Anpassung für die automatische Durchführung, durch die Möglichkeit, daß die Markierung mit Instrumenten, wie sie normalerweise in klinischen Labors zur Verfügung stehen, verfolgt werden kann, und durch die Anwendung markierter konjugierter Verbindungen, die reproduzierbar und relativ einfach synthetisiert werden können.

Im Zusammenhang mit der Beschreibung sollen die folgenden Bezeichnungen folgende Bedeutung haben, wenn nichts anderes angegeben wirdj "Ligand" ist die Substanz oder Klasse verwandter Substanzen, deren Vorhandensein oder deren Menge in einem flüssigen Medium bestimmt werden soll; "spezifischer Bindungspartner des Liganden" ist jede beliebige Substanz, oder Klasse von Substanzen, die eine spezifische Bindungsaffinität für den Liganden unter Ausschluß anderer Substanzen hat j ^Mspezifisches-Bindungsanalogon des Liganden⁵* ist jede Substanz oder Klasse von Substanzen, die sich-im wesentlichen ebenso wie der Ligand in bezug auf die Bindung saff inität des spezifischsn Bindungspartners für ^-den Liganden verhält} «Rest·¹ ist ein Anteil in einem organischen Molekül, zum Beispiel ist der Rest einer prosthetischen Gruppe in einer markierten konjugierten Verbindung ein organischer Anteil in einer derartigen konjugierten Verbindung, abgeleitet von einer prosthetischen Gruppa und im wesentlichen wie diese funktionier rend, ζ. B. die prosthetische Gruppe minus ein Wasserstoffafeom an einer Stelle, durch die die prosthetische Gruppe an den übrigen ΐθϋ der markierten konjugierten Verbindung gebunden ist (in einer markierten konjugierten FAB-Liganden-Verbindung stellt PAD einen Rest der prosthetischen Gruppe Flavinadenindinucleotid dar)ι ^ltReaktionsmitcel" ist eine Zusammensat zung_s ein Gerät oder

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eine fest ausrüstung, die die zur Durchführung des Analyseverfahrens benutz bah Reagenzien enthalten; "Verfolgungsreaktion*¹ ist die Reaktion, bei der die Markierungskomponente der markier~ ten konjugierten Verbindung durch Messen der Holoenzymaktivität bestimmt wird5 '' 'niederes Alkyl" ist eine geradkettige oder verzweigfc-kettige A Iky !gruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen wie Methyl, Äthyl, I3opropyl und Hexyl.

Die dargestellte Analyse kann für den Nachweis jedes beliebigen Liganden j für den ein. spezifischer Bindungspartner vorhanden ist, eingesetzt; werden. Bei dem Liganden handelt es sich gewöhnlich um ein Peptid, Protein, Kohlenhydrat, Glycoprotein, Steroid oder ein anderes organisches Molekül, für das ein spezifischer Bindungspartner in biologischen Systemen vorhanden ist oder synthetisiert werden kann. Der Ligand wird hinsichtlich der Punktion meist aus der Gruppe ausgewählt, die umfaßt: Antigene und Antikörper dafür; Haptene und Antikörper dafürj sowie Hormone , Vitamine, Metaboliten und pharmakologische Mittel und deren Rezeptoren und Bindungssubstansen. Spezifische Beispiele für Liganden, die mit Hilfe der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden können, sind Hormone wie Insulin, chorionisches Gonadotropin, Thyroidhormone und Estriolj Antigene und Haptena wie Ferritin, Bradykinin, Prostaglandine.uod tumorspezifische Antigene! Vitamine wie Biotin, Vitamin Β,,ρ» Folsäure, Vitamin E, Vitamin α und Ascorbinsäure j Metabolitea wie J¹^'-Adenosinmonophosphat and 3¹ >5^t^uanosinmonophosphatj pharmakologische Mittel oder Drogen wie Antikonvulsiva, Bronchodialatoren, Kardiotonika und Entwöhnungsmittal (? drugs of abuse), Antikörper wie Microsomalantikörper und Antikörper gegen Hepatitis und Allergien 5 und spezifische Bindungsrezeptoren wie Thyroxin-Bindeglobulin, Avidin, Hämogenase und Transcobalamin. Die Analyse ist besonders für den nachweis von Haptenen .uh& Analoga davon mit Biner zwischen 100 und 1000 liegenden Molekülmasse, besonders für die Jodthyroninfchyroidhormone Thyroxin und lio thy ronin geeignet. · -

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Das zu tastende flüssige Medium kann eine natürlich vorkommende, · oder künstlich hergestellte Flüssigkeit sein, von der vermutet wird, daß sie den Liganden enthält, und sie ist gewöhnlich eine biologische Flüssigkeit oder eine Flüssigkeit, die aus einer Verdünnung oder einer anderen Behandlung derselben resultiert. Zu biologischen Flüssigkeiten, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Methode analysiert werden können, gehören Serum, Plasma, Urin, Saliva und amniotische und cerebrospinale Flüssigkeiten. Andere Stoffe wie feste Substanzen, zum Beispie 1-Gewebe, können analysiert werden, indem sie in eine flüssige Form gebracht werden, wie durch Auflösen des Feststoffes in einer Flüssigkeit oder durch Flüssigextraktion des Feststoffes.

Markierte konjugierte Verbindung

Die erf indungsgemäße markierte konjugierte Verbindung weist einen Rest einer organischen pro sthe ti sehen Gruppe in ihrer Markier ungskomponente auf und kann in einer von zwei grundlegenden Formen vorliegen, die schematisch wie folgt dargestellt werden

Sehe ma tische Formel . Markierungskomponente

-Er-E-L Rest der pro sthe ti scha η Gruppe (Pr-

Apo - Pr - R - L Holoenzym oder konjugierter Enzym

rest (üpo -Pr-)

worin Pr den Rest der pro sthe tische η Gruppe und Apo das Apoenzym darstellen, R eine Verkettungsgruppe ist und L die Bindungskompohente der markierten konjugierten Verbindung, gewöhnlich der Ligand oder ein Bindungsanalogon davon ist. Normalerweise werden die Bindungskoaponente und der Rest der pro sthe ti se he η Gruppe durch die Verkettungsgruppe an einer Stelle der ersteren, die von ihrer spezifischen Bindungsstelle entfernt liegt (d. h. der Stelle an der Bindungskomponente, die an der Analysebindungsreaktion beteiligt ist, wie eine immuno chemise he Bindungsstelle, an der die Bindungskomponente ein Antigen, Hapten oder Antikörper dafür ist) und an einer stelle der letzteren, die von ihrer aktiven BindungsstβUe für das ipoenzym entfernt liegt,

gekoppelt.

Anal^semethode η

Es stehen verschiedene Methoden für die Verfolgung der neuartigen erfind ungsgemäßen markierten konjugierten Verbindungen zur Verfügung. In jedem Pail ist der Hest der prosthetischan Gruppe kovalent an die Bindungskomponente in der markierten Komponente gekoppelt, und die Verfolgungsreaktion besteht im Messen der HoIoenzymaktivität in der gebundenen Spezies oder der freien Spezies oder beiden, je nachdem wie der fall, liegte

Lediglich zur Erläuterung werden die folgenden Beispiele rnahrarer Verfolgungsschemata, die auf homogenen und heterogenen Konkurrenzbindungstechniken basieren, angeführt, wobei es klar sein dürfte, daß andere homogene oder heterogene Verfahren in der Praxis angewandt werden können, .

3?ür die folgenden Darstellungen werden die folgenden Abkürzungen verwendet, die auch in der übrigen Beschreibung Anwendung finden:

Boz^ei^chnu^	Abkürzung
Rest der prosthetis ehe η Gruppe Apoenzym Verkettungsgruppe Ligand	Br Apo R L
Bindungspartner konjugierter Enzyicrest Eoloenz^mrest (aktiv)	B Apo-Pr Apo-B?
Erläuterndes Verfolgungsschema Nr. 1

Homogene Zonkurrensbindungsmethode -

Apoenzym nach Sinlsitung der Bindungsreaktion eingeführt

L (Probe) + ED-H-Ii + B < ^v L-B + Br-R

^Λ + Apo - (gebundene Spezies)

Apo

-R-L

(freie Spezies; aktives Holoenzym)

In diesem Schema wird der Rest der pro st he ti sehen Gruppe als Markierungskomponente durch die Zugabe von Apoenzym, und zwar etwa gleichzeitig mit oder nach dem Beginn der Bindungsredition, d. h. während der Bindungsreaktion oder nachdem die Bindungsreaktion Gleichgewicht erreicht hat, nach^väesaa und die HoIoenzymaktivität in dem endgültigen Reakfcionsgemisch gemessen. Die .Analyse ist homogen, da solche Bindungen gewählt -werden, bei denen die Bindung von Äpoenzym mit dem Rest der pros the ti sehe η Gruppe in der gebundenen Spezies für die prosthetische Gruppe inhibiert wird. Oder es können Bedingungen gewählt werden, bei denen sich das Apoensym an die Form der gebundenen Spezies der markierten konjugierten Verbindung binden kann, aber der resultierende konjugierte Enzymkomplex keine enzymatisch^ Aktivität infolge der Inhibition der Enzyro-Substrat-Wechsetoirkung zeigt ( diese Situation ist in dem obigen Schema nicht gezeigt). In beiden Fällen ist die gesamte in dem System gemessene Enzymaktivität das Ergebnis nicht-inhibierter Bindung von isoenzym an die freie markierte konjugierte Verbindung und ist somit eine direkte Funktion der aus der Probe für die Konkurrenzbiod ung an den Bindungspartner zur Verfügung stehenden Ligandenmenge.

Es kann auch vorkommen (ist aber auch nicht oben gazeigt), daß im Gegensatz zu den obigen Schemata die markierte konjugierte Verbindung (Pr-R-L) so gebildet wird, daß die Bindung mit dem Apoenzym inhibiert ist, daß aber nach der Bindung der markierten konjugierten Verbindung durch den Bindungspartner diese Inhibition aufgehoben ist und das isoenzym sich mit der gebundenen Speziesfomi der markierten konjugierten Verbindung zur Bildung eines aktiven HoIoenzymkomplexes verbinden kann. In einem sol-

-li

Pall ist die Stärke der Holoenzymaktivität, die sich, in dem System ergibt, eine umgekehrte Funktion der in der Probe vorhandenen Ligandenmenge.

Erläuterndes Verfolgungsschenia Hr. 2

Heterogene Konkurrenzbindungsniethode - .

ipoenzym nach Beginn der Bindungsreaktion eingeleitet

L (Probe) + Bp-H-L + B £

L-B

Pr-R-L-B

Apo + ipo-Pr -H-L + (freie Spezies, aktives HoIoenzym)

Apo-Pr -H-Ir-B (gebundene Spezies, aktives HoIoenzym)

trennen

Dieses Schema umfaßt die gleichen Reagenzien und die gleiche Reihenfolge der Zugabe wie das oben beschriebene Schema Nr. 1 mit dem Unterschied, daß die Bedingungen so .sind, daß sißh das üpoenzym an die markierte konjugierte Verbindung in der gebundenen Spezies binden kann, um einen aktiven· Holognzymkomples: zu bilden, der qualitativ von dam, der durch dia Bindung der freien Speziesform der markierten konjugierten Verbindung gebildet wurde, nicht unterscheidbar ist. Die gebundene Spezies und die freie Spezies müssen getrennt werden, und die Enzymaktivität in einer davon ist von der Menge des in der Probe vorhandenen Liganden abhängig.

Ö/ /U

Erläuterndes Verfolgungsschema Nr. 3

Homogene Konkurrenz bindungsnethode -

Äpoenzym vor dem Beginn der Bindungsreaktion eingeführt.

Pr-R-L + Apo » Apo-Pr

-H-L

(aktives Holoenzym)

L (Probe) + Apo-Pr -S-L + B - ' L-B + Apo-Pr-R-L-B

- - (freie Speziesj - . (gebundene Spe-

aktives HoIoenzym) ziesj

inaktiviert)

In diesem Schema befindet sich der Rest der pro sthe tische η Gruppe in der Markicrungskomponente, da er an den Liganden gekoppelt und mit dem Apoenzym in Porin eines aktiven Holoenzymproduktes kombiniert ist. Der Rest der prosthetischan Gruppe wird durch Messen der Holoenzymaktivität im fertigen Rea^tionsgemisch verfolgt. Die Analyse ist homogen, da solche Bedingungen gewählt wurden, daß die sich nach dem Binden des Bindungspartners an den aktiven HoIoenzymkomplex ergebende gebundene Speziesform eine inhibierte Snzymaktivität infolge der Inhibition der Enzym~Substrat-Wechselv7ii?kung aufv/eist. Die gesamte Stärke der in dem System gemessenen Snzymaktivität ist das Ergebnis von ungebundenem aktivem HoIoenzymkomplex, d. h. der freien Speziesforn, und ist infolgedessen direkt von der Menge des in der Probe anwesenden Liganden abhängig.

Es kann auch vorkommen (ist aber oben nicht gezeigt), Gegensatz zum obigen Schema die markierte konjugierte Verbindung geringe oder keine enzymatische Aktivität aufweist, daß aber die gebundene Speziesform nach der Bindung des Bindungspartners tatsächlich eine meßbare oder verstärkte enzymatische Aktivität aufweist. In einem solchen Fall ist die sich in dem System er-· gebende stärke der Holoenzymaktivität umgekehrt von der Menge des in der Probe vorhandenen Liganden abhängig.

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Erläuterndes Verfolgungsschema Nr, 4-

Heterogene Konkurrenzbindungsmethode -

.Apoenzym vor Beginn der Bindungsreaktion eingeleitet

Ep-E-L +

^ _Apo-B? -H-L

(aktives Holoenzyin)

L (Probe) +, lApo-Be T-R-L + B - -·. - .. (freie Spezies; ... aktives Holoenzym)

t L-B + Apo-Pr μΗ-L B

(gebundene Spezies? aktives Holoenzym)

trennen

Dieses Schema umfaßt die gleichen Reagenzien und die gleiche Reihenfolge der Zugabe wie das oben beschriebene Schema Nr. 3 mit dem Unterschied, daß die Bedingungen so sied, daß sowohl die gebundene Speziesfoim als auch die freie Speziesform enzymatisch aktiv und qualitativ nicht unterscheidbar sind. Die gebundene Spezies und die freie Spezies müssen getrennt werden und die Enaymaktivität in einer davon ist von der Menge des in der Probe vorhandenen Liganden abhängig.

Schema Nr. 3 und Nr. 4· sind im wesentlichen enzym-markierte Analysen, nur daß im Gegensatz zur bisherigen Praxis das Enzym als solches durch den Best einer prosthetischen. Gruppe an die Bindungskomponente der markierten konjugierten Verbindung gebunden ist. In. dieser Beziehung wird durch dia Erfindung ein neuartiges Verfahren für die Darstellung einer enzynwaarkierten konjugierten Verbindung zur Verfügung gestellt, das folgende Schritte umfaßts (a) kovalente Kopplung des Bindungskomponente ante ils (d. h. des nachzuweisenden Liganden oder eines Bindungsanalogons oder Partners davon) an eine organische prosthetische Gruppe, die sich mit einem Apoenzym zur Erzeugung eines konjugierten Snzyms, z. B. eines aktiven Holoenzyms, vereinigen kann; (b) Vereinigen der resultierenden markierten konjugierten Verbindung der prosthetischen Gruppe mit dem ^poenzym und (c) Isolieren der

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resultierenden konjugierten enzym-markierten Verbindung. Es wird angenommen, daß ein derartiges Verfahren überaus wertvoll bei der Darstellung enzym-iaarkierter konjugierter Verbindungen für die Verwendung bei Analysen ist, und zwar wegen der gesteuerten Weise, in der die gut gekennzeichnete prosthetische Gruppe mit geringer Molekülmasse mit der Bindungskomponente gekoppelt werden kann.

.aus der obigen Diskussion geht hervor, daß für einige markierte konjugierte Verbindungen und Ligand/Bindungspartner-Paare eines oder mehrere der beschriebenen homogenen Schemata in. Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren angemessen sind, wozu die Fähigkeit des Apoenzyms, sich an die gebundene Speziesform der markierten konjugierten Verbindung zu binden, und die Wirkung dar Bindung das Bindungspartners an den konjugierten Snzymkomplex gehören. Wenn die gebundene Spezies- und die freie Speaiesform der markierten konjugierten Verbindung eine nicht unterscheidbare Aktivität aufweisen, kann ein heterogener Weg zur Erzielung einer nützlichen Analyse eingeschlagen werden. Daher ist„ wenn auch die Umstände diktieren können, welches besondere manipulierbare Schema oder welche Schemata am nützlichsten sind, die vorliegende Analysemethode im allgemeinen für jede herkömmliche homogene oder heterogene Technik geeignet.

Homogene Techniken

Sine homogene Technik, d. h. eine, bei der eine physikalische Trennung der gebundenen Spezies und der freien Spezies nicht erforderlich ist j ist dann gegeben, wenn die Reaktion zwischen der Bindungskomponente der markierten konjugierten Verbindung und einem entsprechenden Bindungspartner eine meßbare Veränderung, entweder im positiven oder im negativen Sinne, in der Fähigkeit der Markierungskomponente der markierten konjugierten Verbindung, an der Verfolgungsreaktion teilzunehmen, auftritt, zum Beispiel in der Fähigkeit der markierten konjugierten Verbindung, eich mit dem Apoenzym zu vereinigen und/oder HoIoenzymaktivität aufzuweisen» la einem solchen Falle kann die Verte ilung der markierten

- Ab - &

Komponente auf dia gebundene Spezies und die freie" Spezies ohne Trennung der Spezies be stimmt, wer den. Die Holoensyiaaktivität in dem Reaktionsgemisch wird dann dadurch bestimmt, daß zumindest in einem 3)eil desselben die durch Holoenzym katalysierte Reaktion gebildet wird, z. B. durch die Zugabe von Substrat, und daß mit Hilfe einer beliebigen herkömmlichen Technik die Geschwindigkeit oder die Aggregatmenge der Produkt erzeugung oder des Reagenzienverbrauches gemessen werden. Die qualitative Bestimmung des Liganden in dem flüssigen Medium verlangt den Vergleich der gemessenen Menge mit der der Verfolgungsreaction in einem flüssigen Medium ohne Liganden, wobei jede auftretende Differenz ein Anzeichen für die Anwesenheit eines solchen Liganden in der getesteten Flüssigkeit ist. Die quantitative Bestimmung des Liganden in dem flüssigen BÄedium umfaßt einen Vergleich der gemessenen Menge mit der der Verfolgungsrsaktion im flüssigen Medium, das verschiedene bekannte Mengen Ligand enthält, z_e B. einen Vergleich mit einer Standardkurve«, - -

.Im, allgemeinen können bei der Anwendung einer homogenen Analysetechnik die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion, d. Jb.« das flüssige Medium, von dem angenommen wird, daß es den Liganden enthält, die markierte konjugierte Verbindung und in einigen Systemen (ά. h. einem Konkurrenz bindungs sy stern) ein spezifischer Bindungspartner des Liganden in jeder beliebigen Menge, Weise und Reihenfolge vereinigt werden, vorausgesetzt, daß.die Aktivität der markierten Komponente der markierten konjugierten Verbindung meßbar verändert wird, wenn das flüssige Medium den Liganden in einer für die Zwecke der Analyse aussagekräftigen Menge oder Konzentration enthält. Alle Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion sind vorzugsweise in dan flüssigen Medium löslich.

Bekannte Abwandlungen der oben kurz beschriebenen homogenen Methoden und weitere Einzelheiten hinsichtlich der erläuterten spezifischen Techniken, sowie einer alternativen als die direkte Bindungstechnik bekannten Technik sind au.s der Literatur zu ent-

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nehmen, ζ. B. der deutschen OLS Nr. 2.618.511» die der US-Patentanmeldung, anmeldeaktenzeicheη Nr. 667.996, eingereicht am 18· März 1976, entspricht.

Heterogene Techniken

Der Einsatz der dargelegten neuartigen Markierungen kann auch für herkömmliche Analysetechniken der heterogenen Art erfolgen, bei denen die gebundene und freie Spezies der markierten konjugierten Verbindung getrennt werden und die markierte Komponente in der einen oder anderen bestimmt wird. Dis für die-Durchführung einer solchen heterogenen .Analyse verwendeten Reaktionsmittel können die verschiedensten Formen aufweisen. Im allgemeinen enthalten solche Mittel drei Grundbestandteile, bei denen es sich um (1) den Liganden, der nachgewiesen werden soll, (2) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden und (3) die markierte konjugierte Verbindung handelt. Die Bestandteile der Bindungsreaktion werden gleichzeitig miteinander vereinigt oder durch eine Serie von Zugaben, und nach einer entsprechenden Inkubationszeit wird die markierte konjugierte Verbindung so an ihren entsprechenden Bindungspartner gebunden, daß die Bindungsstärke, d_e h. das Verhältnis zwischen der Menge markierter, an einen Bindungspartner gebundener konjugierter

Verbindung(gebundener Spezies) und der ungebundener (freier Spezies) eine Funktion der Menge des anwesenden Liganden ist. Die gebundene und die freie Spezies werden physikalisch ge trennt, und die Menge der in einer Spszißs vorhandeneη Markierung wird durch Messen der darin auftretenden HoIoenzymaktivitat bestimmt, und diese wird mit einer negativen Kontrolle oder Standardergebnissen, z. B. einer Standardkurve, verglichen.

Im Fachgebiet gibt es verschiedene Möglichkeiten zur Durchführung des Trennungsschrittes und zur Bildung des Bindungsreakr tionssystens. Für die (trennung können solche üblichen Verfahren angewandt werden, für die die allgemein als Festphasen-Antikörper oder -antigen, ein zweiter Antikörper oder ein Festphasenzweiter-Antikörper bekannten Mittel eingesetzt werden, sowie die

Anwendung von Izornunkomplex-Ausfälluiigsmitteln und -adsorptionsmittel und dergleichen erfolgen kann. Anzuwendende Bindungsreak~ tionssysteme umfassen die sogenannte Konkurrenz-Bindung st echnik, die sequentielle Sättigungstechnik, die «Sandwichs-Technik usw.« Weitere Einzelheiten hinsichtlich verschiedener bekannter heterogener Systeme sind der Literatur zu entnehmen, z. B. der deutschen OLS Nr. 2β618·4ΐ9, die der US-Patentanmeldung, Anmeldeaktenzeichen Hr. 667«,982, eingereicht am 18. März 1976, entspricht.

Es ist zu beachten, daß manipulative Techniken, die andere Reihenfolgen der Zugabe und andere Bindung sreakt ions ab laufe umfassen j für die Durchführung homogener und heterogener spezifischer Bindungsanalysen angewandt werden können, ohne daß vom hier dargelegten erfindungsgemäßen Gedanken abgewichen wird,

prosthetische Gruppe

Wie bereits erwähnt wurde, handelt es. sich bei pro sthe ti sehen Gruppen um eine fachspezifische Klasse von Enzymkofaktoren, die grundsätzlich durch ihre Fähigkeit, daß sie durch das Ausgangsapoenzym zur Form des aktiven Kofaktors regeneriert werden können, gekennzeichnet sind. Pur die Erfindung werden organische prosthetische Gruppen verwendet, die chemisch mit der Bindungskomponente in der markierten konjugierten Verbindung gekoppelt werden können. Im. allgemeinen liegt die Bindungskonstante für die Vereinigung des Apo8nzyms und der pro sthe ti sehen "Gruppe , deren Rest in der erfindungsgemäßen markierten konjugierten Ver-

6 1

bindung enthalten ist, über etwa 10 Mol ' und vorzugsweise

8 —1

10 Mol '« Die tatsächliche Bindungsaffinität des in der markierten konjugierten Verbindung erscheinenden Restes der prosthetischon Gruppe kann um einige irozent gegenüber der der freien pro sthe tischen Gruppe oder bis auf zwei Größenordnungen verringert sein, ohne daß die Brauchbarkeit eines derartigen Restes der pro sthe tischen Gruppe als Markierungskomponente in einer Bindungsanalyse beeinträchtigt wird»

Es folgt eine Tabelle, die verschiedene für die Erfindung nütz-

- IS-

213770

liehe prosthetisehe Gruppen, das durch die Kombination mit Apoenzym erzeugte konjugierte Enzym und Bindungskonstanten für die Vereinigung der prosthetisehen Gruppe und des Apoenzyms enthält:

Prosthebische Gruppe	konjugiertes Enzym	Bind ung skon st an t e (MoI"1)	Hinweis
Falvinadenin- dinucleotid (FAD)	Glutathionre- duktase (Ery throzyten von Menschen)	2 x 106	1,3
F1 ävinmononuc— Ieotid (FMN)	Cytochromre- duktase (Hefe)	109	2
BIN	NADPH: Oxidore duktase ("Al tes gelbes Enzym")	3 χ 107	2
FAD	Glucoseoxidase (Aspergillus niger)		4
FAD	Lipo amidde hydro- genase	M- X 106
FMN	Pyr id ox inpho s- phatoxidase	5 x 107	6

PeroxidasQ (Meerrettich)

Oytochrom G

Ein bevorzugtes Paar aus pro sthe ti scher Gruppe und Apoenzym ist Harn und Apoperoxidase, und besonders bevorzugt werden Flavinadenindinucleotid und Apoglucoseoxidase. Durch diese prosthetischen Gruppsn wird eine einfache Möglichkeit für die Bindung an Liganden, Ligandenanaloga und Bindungspartner geschaffen, und die resultierenden Holoenzyme sind an Wasserstoffperoxid-Nachweisreaktionen beteiligt, die allgemein bekannt sind und analy-

- so - 2137 7 0

tisch angewandt werden und so gewählt werden können, daß sie kolorimetrische Anzeigen ergeben, die für den Techniker im klinischen Labor vorteilhaft sind.

Es sollte beachtet werden, daß ein bestimmter Kofaktor als Koenzym oder eine prosthetische Gruppe wirken kann, und zwar in Abhängigkeit von dem Snzymsystem, in das er gebracht wird (z. B. 3JVtD), allerdings wird in der vorliegenden Erfindung die Anwendung eines derartigen Kofaktors nur in Verbindung mit einem Snzymsystem in Betracht gezogen, in dem er als prosthetische Gruppe nach obiger Definition wirkt,

V erke 11 ungs$c 0.PPe₁

Man wird einsehen, daß es viele Methoden für die Verkettung der Bindungskomponente der markierten konjugierten Verbindung, z. B. des nachzuweisenden Liganden, eines Bindungsana logons davon oder eines Bindungspartners dafür, mit der prosthetischen Gruppe gibt. Die betreffende chemische Eigenart der Verkettungsgruppe wird von der Beschaffenheit der jeweiligen verfügbaren Verkettungsstellen an der Bindungskomponante und der prosthetischen Gruppe abhängig sein. Wichtige Gesichtspunkte bei der Auswahl der Verkettungs st eilen sind gewöhnlich (1) die Aufrecht erhalt ung der Fähigkeit der verketteten Bindungskomponente, wirksam in dem gewählten Bindungsanalyse sy st em mit ζ uv? ir ken, und (2) Aufrechterhaltung der Fähigkeit des verketteten Restes der prosthetischen Gruppe, -sich mit dem Apoenzym zu vereinigen (oder Inhibition einer derartigen Bindungsfähigkeit, wenn auf diese nach der Bindung der markierten konjugierten Verbindung durch einen Bindungspartner verzichtet werden kann - siehe erläuterndes Verfolgungsschema Nr. 1), und zwar in beiden Fällen bis zu dem Ausmaß, daß sich eine brauchbare Analyse für den betreffenden analysierten Liganden und für die betreffenden Konzentrationen oder Mengen, in denen ein solcher Ligand nachgewiesen werden soll, ergibt. Normalerweise wird die Verkettungsgruppe, eine chemische Bindung, gewöhnlich eine einfache, manchmal aber aush eine Doppelbindung, oder eine Kette mit 1 bis 14-, gewöhnlich aber 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, und 0 bis 5_S gewöhnlich aber 1 bis 5, unter stick-

21 - Al ι" ' ^w

stoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewählten Heteroatomen aufweisen.

Sowohl die prosthetische Gruppe als auch die Bindungskoraponente werden selbstverständlich eine große Vielseitigkeit verfügbarer Funktionalitäten für die Anfügung der Verkettungsgruppe aufweisen. Gewöhnlich handelt es sich bei den Funktionalitäten, die erwartungsgemäß für die Verkettungsgruppe zur Verfügung stehen müßten, um Amino, gewöhnlich primäres Amino * Hydroxyl; Halogen, gewöhnlich Chlor oder Brom; Carbonsäure} Aldehyd- Ketoj Isothiocyanat; Isocyanat usvj... Daher wird die chemische Struktur der Verkettungsgruppe selbst stark in ihren Endgruppen in Abhängigkeit von den an der prosthetischen Gruppe und der Bindungskomponente verfügbaren Funktionalitäten variieren, wobei ihre Gesamtlänge eine Angelegenheit der Wahl innerhalb der grundlegenden Grenzen, den speziellen Charakter der prosthetischen Gruppe und der Bindungskomponente der resultierenden konjugierten Verbindung zu erhalten, ist. Hinsichtlich der länge der Verkettungsgruppe wird es bei der Herstellung einer konjugierten Verbindung für die Verwendung bei einem homogenen Analyseverfahren gewöhnlich zweckmäßig sein, eine möglichst kurze Gruppe zu verwenden, damit die resultierende Bindungskomponente in der konjugierten Verbindung die Aktivität der prosthetischen Gruppe der konjugierten Verbindung nicht erheblich stören kann. Wenn die Bindungskomponente eine geringe Molekülmasse hat (z. B. ein Hapton mit einer zwischan 100 und 1000 liegenden Molekülmasse ist) ist die Verkottungsgruppe vorzugsweise eine chemische Bindung oder eine Kette mit 1 bis 6 Atomen, wie niederes Alkyl, Carbonyl, Alkyl car bony 1, Amido, Alkylamid und dergleichen. In anderen Fällen, zum Beispiel wenn die Bindungskoraponente in der konjugierten Verbindung eine relativ hohe Molekülmasse hat, wie bei einem Polypeptid oder Protein (z. B. einem Antikörper) ist eine längere Verkettungsgruppe normalerweise besser, um sterische Hinderung der das Apoenzym vereinigenden Stelle der konjugierten Verbindung auszuschalten. In diesen Fällen wird die Verkettungsgruppa gewöhnlich 1 bis 14 Kohlenstoff a tome und 0 bis 5 Heteroatome wie oben erwähnt aufweisen. Ketten mit einer erheblich größeren länge ergeben manchmal

1 3770

konjugierte Verbindungen, in denen die Bindungskoraponent e sich möglicherweise zurück in die Apoenzynianschlußstelle biegt. Unter Berücksichtigung dieser Gesichfespunkte sind die Beispiele für Verkettungsgruppen in der folgenden !Tabelle 1 gezeigt. Besondere Beispiele für Verkettungsgruppen werden später aufgeführt und -weitere Abwandlungen sind leicht als fachgerecht zu erkennen,

Tabelle 1

Verkettungsgruppe

Prosthetische· Gruppe

X 1 Il 2

1 ' 2

-R -C-X-H-

-R -X-C-H-X

-H¹ -X-C-X-H²-X X

-C-R ~ä-

-X-R¹-

-X-R -X«.

-Bindungskoaponente

- 11-

10//

worin X Imino, schwefel oder vorzugsweise Sauerstoff ist5 und r'¹ und R² unabhängig ein niederes Alkylen mit 1 bis 6 Kohlenstoff atomen wie Methylen, Äthylen, Isopropylen, Butylen oder Eexylen sind«.

Das Apoenzym, oder der Proteinanteil des Holoenzyms ohne die prosthetische Gruppe, wird durch Aufspalten des konjugierten Enzyms und Isolierung des freigesetzten Apoenzymproteins hergestellt. Die Aufspaltung des konjugierten Enzyms kann nach einer Reihe bekannter Maßnalmen erfolgen, wie die Einführung des Enzyms in eine stark saure Lösung, z, B. mit einem unter 2 liegenden pH-Wert. Die Wiedergewinnung des Apoenzyms kann gleichermaßen mit Hilfe zahlreicher bekannter Techniken vorgenommen werden, einschließlich der selektiven Ausfällung des Proteins oder der selektiven Adsorption der freigesetzten prosthetischeη Gruppe mit geringer Llolekülmasse.

Wie bereits erwähnt, sand- Apoperoxidase und Apoglucosaoxidase besonders bevorzugte Apoenzyme für die Verwendung bei der.Erfindung, da ihre Koloenzyme an den analytisch vorteilhaften Wasserstoffperoxidreaktionen beteiligt sind. Daraus folgt, daß andere verwandte konjugierte Enzyme, vor allem-die Oxidoreduktasen, d*ü3 Wasserstoffperoxid erzeugende Reaktionen katalysieren und die aufgespalten werden können, um ein inaktives Apoenzym zu erhalten, besondere Anwendung für die vorliegende Erfindung finden. Veröffentlichte Methoden für die Isolierung von Apoenzymen, besonders für Apoglucoseoxidase stehen in Biochira. Biphys. Acta. 175j365 (1969) und für Apoperoxidase in J. Biol. Chem. 206:109 (1953) und Arkiv,- Komi. Min. 0. Geol. 148:1-(1940) zur- Verfugung.

Sollte sich die Möglichkeit der Interferenz bei der Analyse infolge der Anwesenheit einer endogenen pro sthe ti sehen Gruppe in der Probe oder in irgendeinem der Heaktionsmittel oder dadurch ergeben, daß die prosthetische Gruppe die La bor einrichtung, Glasgegenstände oder Pia st ge gen stände verunreinigt hat, so kann eine solche störende prosthetisehe Gruppe leicht mit Hilfe zur Verfü-

- 213770

gung stehender'Inaktivierungstechniken ausgeschieden werden. Beispielsweise kann FiD-Interferenz durch aufeinanderfolgende Behandlung mit Perjodat- und Ithylenglycollösungen oder durch die Verwendung anderer F^D-Inaktivierungstechniken beseitigt werden.

üusführungsbeispiele:

Die Erfindung wird anschließend durch die folgenden Beispiele erläutert, aber nicht eingeschränkt»

Beispiel 1s

Homogene Bindungsanalysen für ΕΓ-2¹,4^f-Dinifcrophenyl-6-amninQCaproat

A. Darstellung der markierten konjugierten Verbindung - N -(6-üminohexyl)-dinibrophenyl-flavinadenindinucleotid

Flavin.N. -aminohe^yl-adenindinucleοtid

N -2rifluoracetamidohexyl-adenosin-5'-monophosphat wurde nach der Methode von prayer u. a. Biochem. J. 139:609 (1974) synthetisiert. · . ......

56 Milligramm (mg) N -Trifluoracetamidohexyl-adenosin-5^l-monophosphat (0,1 mMol) wurden in etwa 10 ml Wasser gelöst und 25 Hikroliter QiI) Iri-n-butylamin (0,1 mMol) wurden zugesetzt. Das Wasser wurde unter Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in 10 ml trockenem Dimethylformamid (DMF) gelöst, das anschließend unter Vakuum entfernt wurde. Der Rückstand wurde weitere dreimal aus trockenem DMF verdampft. Der endgültige Rückstand wurde in 10 ml trockenem DMF gelöst. 80 mg !!,IT'-Carbonyldiioiidazol (0,5 wurden zugesetzt und 1,5 Stunden lang zur Reaktion stehen

gelassen. Dann wurden 15 /Ul Wasser zugegeben, und das Lösungsmit tel wurde unter Vakuum entfernt. Der Rückstand (ß -Trifluoraceta midohe:ij'^rl-adenosin-5^t~2ionophosphat-2imidazolid) wurde in 10 ml DMP gelöst.

47 mg -Riboflavin-5*-ΐ&οηορ1ιοsphat (0,1 mMol) wurden in etwa 10 ml Wasser gelöst und tropfenweise zu 20 ml ac ebon, das ^Lxo /ul Tri-n-

- isr-

1 37 7

octylamin (0,1 mivlol) enthielt, gegeben. Vor Beendigung der Zugabe bildete sich ein Präzipitat. Das Lösungsmittel wurde mit Hilfe eines Drehverdampfers entfernt, bis das Ri boflavin-5'-monophosphat gelöst war. Dann wurden 5 J&l Aceton und 5 bis 10 ml DIvIP zugesetzt, und das Gemisch wurde zur !Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 15 bis 20 ml trockenem DIvIE gelöst und zur Trockne eingedampft (dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt). Der Rückstand wurde in 5 ml DMP gelöst und mit der oben genannten 10-ml-Lösung von Imidazolid in DMP zusammengenommen.

Das Haaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann wurde das Lösungsmittel entfernt. Der Rückstand wurde in 50 ml V/asser aufgenommen und auf eine 2,5 x 25 cm messende Säule von DSüS-Cellulose in der Hydrogencarbonatfozm gegeben (Whatman DS23, Raeve Angel, Clifton, New Jersey, USA). Das Chromatogramm wurde mit einem mit zwei Liter (1) Wasser und zwei Liter 0,3M Ammoniumhydrogencarbonat erzeugten linearen Gradienten entwickelt (23 ml Fraktionen wurden gesammelt). DünnschichtChromatographie auf Silicagel 60 F254 (S. Merck, Darmstadt, West-Deutschland) unter Verwendung eines 7:3-Gemischs (Volumenteile) von Äthanol und 1M Triäthylammoniimhydrogencarbonat (pH-Y/ert 7»5) ergab, daß die mit 68 bis 73 numerierten Fraktionen gelbe Haupt-(Rf ~ 0,75) und Neben- (B^ = 0,36) Verbindungen enthielten. Diese Fraktionen wurden zusammengenommen, und das optische Absorptionsspektrum hatte Maxiiaa bei 267, 373 imd 4-50 Nanometer (ma).

Das lösungsmittel wurde aus dem gesammelten Material entfernt, und der Rückstand wurde in etwa 5 ml Wasser gelöst. Diese Lösung wurde nit $11 Natriumhydroxid auf einen ·pH-Wert von 11,0 eingestellt und neun Stunden lang bei Raumtemperatur stehen gelassen* Die Dünnschichtchromatographie zeigte, daß die Komponente mit R_f =0,75 verschwand, während ein neues gelbes Material mit R^ = 0,37 erschien. Der pH-Wert des Reaktionsgemische wurde mit Chlorwasserstoff säure auf 8,0 eingestellt, und das Geraisch wurde auf eine 2,5 x 20 cm-Säule von DEAS-Cellulose in dar Hydrogencarbonatform aufgegeben«, Das Chromatogramm wurde mit einem mit einem Liter Wasser und einem Liter 0,2.i Ammöniunhydrogencarbonat erzeug-

ten linearen Gradienten entwickelt. Der gelbe Auslauf aus dor Säule wurde gesammelt und das Lösungsmittel wurde entfernt. Der Rückstand wurde auf 2 Gramm (g) Silicagel adsorbiert, das oben auf eine 50-g-Säule von Silicagel aufgegeben wurde, die mit einem 9:2-(Volumenteile) Gemisch von Ithanol und 1M Triä thy lamm oniumhydrogencarbonat (pH-Wert 7i5) äquilibriert worden έar. Die Säule wur~ de mit einem 8:2-Gemisch (Volumenteile) von Äthanol und 1 M Triäthylammoniuiohydrogencarbonat (pH-Wert 7,5) elulert, die gelbe Komponente mit R^ ~ 0,37 wurde gesammelt und das Lösungsmittel entfernt. Die auf dem Absorptionsvermögen bei 450-mn basierende Ausbeute betrug etwa 10 %_e

⁽3-3.fii_|fcropheny 1-f 1 avinadenindinucIeοtid

Der Plavin-K -aminohexyl-adenindinucleotü enthaltende Rückstand von oben wurde durch Chromatographie auf Sephadex G-10 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsalaj Schweden) gereinigt. Auf eine mit 25 Millimol (mlvl) Natriumhydrogencarbonat (pH-^iert 7»5) ä^uilibrierte 0,9^30-cm-»Säule vjurde bei Raumtemperatur 1 ml einer annähernd 10 niM Lösung des N -PAD-Derivats in Wasser gegeben. Der erste eluierte-Peak von bei 450 nm absorbierendem Material wurde gesammelt und erneut auf Sephydex G-10 chromatographiert, und der zuerst eluierte Peak wurde wieder gesammelt«

0,5 ml (0,63^1) des gereinigten N -PAD-Derivats in 25 mtfi Natriumhydrogencarbonat (pH-Wert 7,3) wurde-mit 2 ml Äthanol vermischt und 10 μΐ ^H-Dinitrofluorbenzol (6,3/uM, 50 _;aGi) in Äthanol wurden zugesetzt (das tritiierte Dinitrofluorbenzol wurde vom Radiochemical Centre, Amersham, GB bezogen).

Das Seaktionsgemisch wurde kontinuierlich über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur geschüttelt und anschließend auf eine 0,9 x 30-CEi~Säule von Sephadex G-IO gegeben, die mit 0,1M Phosphatpuffer (pH 7,0)t der 0,1 % Hatriumazid enthielt, äquilibriert worden war. Der einzige Peak von bei 4-50 nm absorbierendem Material wurde gesammelt, und es wurde fast gestellt, daß er 8 % der radioaktiven Markierung enthielte

1 37 7 O

B. Darstellung von Apoglucoseoxidase

Gereinigte Gluco'sooxidase mit geringer Katalaseaktivität, die von Research Products Division of Miles Laboratories, Inc·, Elkhart, Indiana, USA geliefert worden war, wurde zweimal 12 Stunden lang gegen 0,5 Masse#:Vol Mannitol (jeweils 30 Volumen) dialysiert. Aliquoten des Dialysats, die je 10CO Milligramm (mg Glucoseoxidase enthielten, wurden jeweils lyophilisiert und boi -20 ⁰C aufbewahrt.

Rindersarumaibumin (200 mg) wurde in 12 ml Wasser, das mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 1,6 eingestellt worden war, gelöst, mit 150 mg künstlicher Kohle (RIA-qualität von Schwarz-Mann, Orangeburg, New York., USA) vermischt und auf 0 C gekühlt * Lyophilisierte Glucoseoxidase (100 mg) wurde erneut in 5,1 ml Wasser gelöst, und 3 ml wurden in die gerührte Albumin-Holzkohle-Suspension gegeben, und das Rühren wurde über einen Zeitraum von 5 Minuten fortgesetzt. Die Suspension wurde danach durch ein Millipore-FiIter von 0,8 Mikrometer und einem Durchmesser von 25 Millimeter (mm) (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts» USA)» das in einer Sweenex-Filter-Apparatür (Millipore Corp.) auf einer 50-ml-Sinw e g-Kuns fest off spritze ange bracht war, filtriert. Das Piltrat wurde schnell auf einen pH-Wert von 7 »5 durch die Zugabe von 2 ml 0,4-M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) und anschließend JH Natriumhydroxid neutralisiert. -150 mg trockene Holzkohle wurden dann zugesetzt, und es wurde 1 Stunde lang bei 0 G gerührt. Die entstandene Suspension wurde zuerst· durch ein Millipore-FiIter von 0,8 Mikrometer um dann durch ein Millipore~]?ilter von 0,22 Mikrometer filtriert. Dem Piltrat wurde Glycerin bis 25% (Volumenteile) zugesetzt, und das stabilisierte ApoglucoseoxidasG-Beäparat wurde bei 4· ⁰G aufbewahrt.

C» Analysereagenzian

1« Markierte konjugierte Verbindung - N -(6-AminoheXyI)-DHB-FAD wurde mit 0,03ä. Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) auf eine Konzentration von. 118 niS verdünnt»

2· Apoensym - Apo glue ο se oxid a se wurde mit 0,1M Phophastpuffer (pH-Wert 7,0), dsr-0,1 fo Rinderscrumalbuiain enthielt, bis auf·

- 28- Zl ΰ/ / U

eine Konzentration von '958 nM FAD-Bindungsstellen verdünnt. Die Konzentration der FAD-Bindungssteilen des Apoenzympräparateß wurde-experimentell durch Messen der Mindestmenge FAD, die aur Erzielung maximaler Glucoseozidase-^ktivität erforderlich ist, wenn die Inkubation mit Apoenzym erfolgt, gemessen. 3e Antiserum - Das Antiserum gegen eins konjugierte Dinitrophenyl-Hinderserumalbumin-V er bindung wurde von Miles-Xeda, Ltd., Eehevot, Israel, bezogen und 31fach in 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7»0), der 0,1 % Rinderserumalbumin enthielt, verdünnt«, 4« Standards - Die Standardlösungen enthielten bekannte Konzentrationen von N~2^l74^lDinitrophen^l-6-aminocaproat, hergestellt in 0,05M Phosphatpuffer (pH-Wert 7»0) 5. Verfolgungsreagens - Sin Gluco se oziaa se -Reagens wurde durch -

Vermischen von 45 ml 0,1M Phosphatpuffer (pH-Wert 7»0), der 15 eM Ethylendiamintetraessigsäure enthielt, 9 ml 11 j5 mM 3,5~Dichlor-2~hydrqxybenzolsulfonat in Wasser, auf einen pH-Wert von 7 mit Hatriumhydroxid eingestellt, 3 ml 11,5 noantipyrin in Wasser, das 1,25 mg/ml (Miles Laboratories, Inc., Klkhart, Indiana, USA) enthielt, und 6 ml 1,OM Glucose in wäßriger ge- sättigter Benzoesäurelösung hergestellt.

D. Analyseverfahren

1. Zugabe von Apoenzyra vor Einleitung der Bindungsreaktion

Methode Nr. 1 - Folgende stoffe wurden nacheinander in einzelne Heaktionsküvetten gegeben: 0,1 ml Lösung der markierten konjugierten Verbindung, 0,05 &1 ausgewählte Standardlösung, 0,1 ml mtiserumlösung, 2,0 ml Verfolgungsreagens und 0,1 ml Apoenzynilösung. Jedes Re actions gemisch wurde 30 Minuten lang bei 30 G inkubiert, und das Absorptionsvermögen bei 53D ³^ wurde gemessen.

Methode Kr₆ Z- Folgende Stoffe wu3?den nacheinander in einzelne Reaktionsküvetfcen gegeben: 0,1 mi lösung der markierten konjugierten Verbindung, 0,05 ml ausgavsählfee Standardlösung,

21 37 7

0,1 ml jUibisarumlösung 'und 0,1 ml Apoenzymlösung. Jedes Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert;, und anschließend -wurden jeweils 2,0 ml Verfolgungsreagens sugesatzt« ilacii einer weiteren Inkubationszeit von 15 Minuten bei 30 ⁰C wurde das Absorptionsvermögen bei 520 nm in jeder Küvette gemessen,

2. Zugabe von .Apoenz^m^nach isinlei b ung der Madimgsrealition Methode Nr. 3 - Folgende stoffe wurden nacheinander in einzelne Reaktionsküvetten gegeben: 0,1 ml Lösung der markierten konjugierten Verbindung, 0,05 Jal ausgewählte Standardlösung, 0,1 ml Antiserumlösung. Jedes Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, worauf jeweils 2,0 ml Verfolgungsreagens und 0,1 ml Apoenzymlösung augesetzt wurden« Nach einer weiteren Inkubationszeit von 30 Minuten bei 30 ⁰C wurde das Absorptionsvermögen bei 520 nm in jeder Küvette gemessen.

Methode Hr. 4 - Die folgenden Stoffe -wurden nacheinander in einzelne Reaktionsküvetten gegeben: 0,1 ml Lösung der markierten konjugierten Verbindung, 0,05 &1 ausgewählte Standardlösung und 0j1 ml der Ant iss rural ö sung. Jedes Resit tionsgemisch wurde 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und danach wurde jeweils 0,1 ml Apoenzymlösung zugesetzt. Nach einer weiteren Inkubationszeit von 20 Minuten wurden in jede Küvette 2,0 ml Verfolgungsreagens gegeben. Dann wurde jedes Reaküionsgemisch 15 Minuten lang bei 30 ⁰C inkubiert und das Absorptionsvermögen bei 520 nm wurde in. jeder Küvette gemessen,,

E« Ergebnisse

Ss folgt Tabelle 2, die die Ergebnisse der vier Analyseverfahren zur Messung von IT-2¹ ,^'-Dinitrophenyl-ö-aminocaproat zeigt* Die Konzentrationen von N-2¹,4^f-Dinitrophenyl-°&~asinocaproat werden als die Konzentrationen in den endgültigen 2_s35~^l~Voiuraiii3 &^Θ3 Reaktionsgeisischs angegebene Die Ergebnisse des Absorptionsvermögens, werden als der Mittelwert von Doppolversuchen, korrigiert hinsieht Ii oh von Hestenzynakfcivität und Hint ergrund a bsoiept ions-

-3,0- 2137 7 0

vermögen in den Reaktionsmitteln ausgedrückt. Der Korrektionsfaktor ist für jede ünal^seraethode am Snde von Tabelle 2 angegeben und wurde durch, experimentelle Versuche ermittelt, bei denen 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) für alle 'lösungen von markierter konjugierter Verbindung, Standard und Äntiserum eingesetzt wurde.

Tabelle 2

Iioriuentration von

a in i η ο G a ρ j? ο a t (ηΐ.ΐ) 1021

511

25.5 128

32

, 16 8

X IC X Z X X X X

Korrekti oasfaktor

Korrigiertes Mittleres gen bei 520 nra

.„et bode ±>. '	1 l.-eti'iode Nr. 2	' Leohode Ur.	3	I.lethocle i-ir.zj
0,274	1,089	0,205 .		1,399
0,263	0,992	0,197		1,302
0,235	0,898	0,187		1,136
0,221	0,689	0,173		0,958
0,194	0,545	0,155		0,737
0,165	0,365	0,134		0,534
0,141	0,276	0,133		0,353
0,134	0,225	0,122		0,257
0,122	0,193	0,104		0,229
0,123	0,187	0,109		0,215
0,107	0,171	0,101		0,199

0,108

0,216

- η- 21 3//υ

Die Ergebnisse zeigen, daß duroh die Erfindung eiae spezifische Biodungsanalyseiaethode der homogenen .Art zur Verfügung gestellt wird, bei der ipoenzym entweder vor oder nach Einleitung der Bindungsreaktion eingeführt wird.

Beispie 1 2 Heterogene Bindungsanalyse für Thyroxin

JU Darstellung der markierten konjugierten Verbindung . - IT -(2"-Aminoäthyl)-thyroxin~flavinadenindinucieotid

6-(2~Aminoäthyl)~amino-9-(2^l,3'-Ö-isopropylidin-ß-D-ribofurano-

13,56 g (4-1,5 mMol) 6-Chlor-9-(2^f ^'-O-isopropyliden-ß-D-ribofuranosyl)purin (Hampton u«, a., J. Am. ahem. Soc. 83:150 (1961)) wurden unter Rühren über einen Zeitraum von 15 Minuten zu einem kalten Überschuß von 1,2 Diaminoäthan (75 ml) gegeben. Die entstandene Lösung wurde bei Bäumtemperatür 24 Stunden lang stehen gelassen.-Die Lösung wurde unter Vakuum eingedampft und das gewonnene gelbe Öl vjurde mit 50 ml kaltem gesättigtem Natriumhydrogencarbonat gerührt. Das Gemisch wurde unter Vakuum eingedampft, und der entstandene Rückstand wurde weiterhin wiederholt unter Vakuum eingedampft, zuerst aas V/asser (dreimal aus 50 ml) und dann aus S-EcopanoüL (viermal aus 50 ml), um ein gelbes Glas (15 s) zu erhalten. Ein feil (3 g) des Glases wurde durch eine Dowex 50W-S2-Kationenaustauschersäule in J¹Ona von Ammonium (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA) mit den Abmessungen 25-2 55 ca geleitet.

Die Säule wurde mit einem mit 2 1 Wasser und 2 1 0,5&i Ammoniumhydrogencarbonat erzeugten linearen Gradienten eluiert, Die Sluierung wurde unter Verwendung eines mit jeweils 2 1 O,fSvi und H AEflnoniumhydrogencarbonat erzeugten linearen Gradienten beendet. Der Ablauf aus der Säule wurde in 1 9-ml-Praktionen gesammelt und durch Sluierung auf Silicagel-Dünnschichtchromatographie (TLO)-Platten (E, Merck, Darmstadt, West-Deutschland) mit einem 9*1 Voiumentaile)-Gemisch von Äthanol und Aamoniumhydroxid verfolgt. Die'entwickelten TLCKPlatten wurden unter ultraviolettem Licht

untersucht;, danach mit Niiihydrin-Reagens (Randaratii, Thin Chromatography, „Academic Fress (1966)) besprüht. Die nit 250 bis 350 numerierten" Fraktionen von der Säulenchromatographie wurden zusammengenommen und unter Vakuum eingedampft, so daß das vorgesehene Purin in Porm eines schwach gelben amorphen Glases (1,5 s) zurückblieb» · -

Analyse ι Berechnet für C^5H₂₂^¹'5Ο4Ϊ C 51,42j

H 6,33i H, 23,99

Gefunden% C 50,92? H, 6,54; N, 23,01

MR (60 MHz, ODCI^): o^ri,37 (s, 5H, Isopropyliden), 1,63 (s, 3H, Isopropyliden), 5,92 (d, 1H, 1^f~Ribose), 7,90 (s, 1H, Purin), 8,26 (s, 1H, Purin) Optische Drehung ClI |° = -74,85° (c 1,0, CH₅OH)

Das zurückbleibende Hohprodulct wurde mit Hilfe der Chromatographie aurfl Dowex 50W-X2 wie oben beschrieben gereinigt. Die Ge samt ausbeute betrug 8 g (55 %)*

-'.^ f~3,5»di_ti

Diese Verbindung wurde nach der Methode von Blank. J. Pharm« Sei. 53s1333 (1964) hergestallt. Zu einer gekühlten (0 C) und gerührten Suspension von 5 g (6,4 12M0I) L-Thyroxin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) in 60 ml-trockenem Äthylacetat wurden 11,5-ml 'ürifluor essigsäur e und 1,9 ml Trifluor essig sä ure anhydrid gegeben. Mach 30 Minuten wurde die entstandene klare Lösung dreimal mit 30 ml y/assor, einmal mit 30 ml 5%igemliatriumhydrogen-Carbonat und sweimal mit 50 ml gesä-ttigtem Natriumchlorid ga~ waschen. Die zusammengenommenen wäßrigen V/ascliabgänge wurden zweimal mit 20 ml ilthylacetat extrahiert. Die Äühylacet at schichte η wurden zusammengenommen und mit 30 ml Wasser gewaschen, dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Die getrocknete Äthylacetatlöaing wurde unter Vakuum eingedampft, und as blieb ein weißer Peststoff zurück. Rekristallisation aus einem Gemisch von Ä thy lather und Petroläther ergab einen rosa-waiBen Peststoff (3,95 g, 70,5 % Aus-

beute), mit einem Schmelzpunkt von 228 bis 230 G mit Zersetzung»

Analyse: Berechnet für C^nH^B^I^HOc*- G, 23»39;

H, 1,15? N, 1,60

Gefunden: O, 23,00; H, 1,05s N, 1,65 MR (60 MHz, DOOK(ODj)₂-) c^r 7,28| (s, 2H, aromatisch). ⁸»03 (s,* 2H, aromatisch), 9,7 (m, ΊΗ, Amido) 3S (KOl): 1700 ( ^ C=O)

Optische Drehung £ζ/ ψ = -14,97° (c 1,0, Dimethylsulf- - oxid) - . . -

Eine zweite Rekristallisation ergab ein zweites Eräzipitat (0,95 mit einem Schmelzpunkt von , samtausbeute betrag 87,5 %»

mit einem Schmelzpunkt von 224· bis 228 ⁰C mit Zersetzung. Die Ge-

N-{ 2- (~ N-(IErJf luoracetyl)-^^¹ ^^'-tetrajodothyronyljf aminoäthyl? .-2|f ,3^t"^>p-"isopropylidenadenosin

Eine Lösung von 8,72 g (10,0 mMol) d -(N-CDrifluoracetyl)aniinoß- £3}5⁼-⁽ϊίϋθα.ο-4~(3^ι ,5^t-ai3odo-4-'-h7dro2phenozy)-phen7l] propansäure und 3,86 g (11,0 mJiol) 6-(2-Aminoäthyl)amino-9~(2^t ,3^f-isopropyliden-ß~D~ribof uranosyl)purin in 50 ml trockenem-Dime thy 1-acetamid -wurde unter einer trockenen Argonatmosphäre bei -20 ⁰G zubereitet. Zu dieser kalten gerührten Lösung wurde eine Lösung von 3,04- g (11,0 mMol) Diphenylphosphor^lazid (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, USA) in 10 ml trockenem Dim ethy lacetamid gegeben, worauf die Zugabe von 1,6 ml (11,0 mMol) trockenem Iriäthylamin folgte. Die Lösung wurde 22 Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten. Die Lösung wurde anschließend tropfenweise zu. 300 ml kaltem (0- C)-Wasser unter Rühren gegeben. Das resultierende weiße Ecäzipitat wurde durch Filtration gesammelt und unter Vakuum (56. G) getrocknet uni ergab 13,0 g eines hell cremefarbigen Feststoffes. Der Feststoff wurde in 500 ml Aceton gelöst, und die Lösung wurde durch sieden eingeengt. Der weiße Feststoff, der sich aus der siedenden Acetonlöaing absetzte, wurde noch heiß durch Filtration gesammelt. Weiteres Sieden des FiI-trats ergab zwei weitere iräzipitate. Die drei Präzipitate wur-

21 37 7 0

den vereinigt und ergaben 8 g (Ausbeute 66,6 <?o) eines weißen Feststoffes mit einem Schmelzpunkt von 193 bis 200 G (Zersetzung).

Analyse; Berechnet für C₅₂H₅₀IiVI ITnOg: C, 21,89$

H, 2,51 { Η/ 8,14

Gefunden: G, 31,95; H, 2,60; N, 7,86 NMR (220 MHz, (CDz)₂SO) cTi,32 (s, 3H₁

Isopropyliden), 6,14- (d, 1H, 1'-Ribose), 7,02 (s, 2H, Thyroxin), 7,82 (s,' 2H, Thyroxin), 8,25 (s, 1H, Purin), 8,36 (s, 1H, Purin), 8,41 (t, 1H, J=6, Amido), 9,64 (d, 1Ξ, J=8, Trifluoracetaiaido) - .

Optische Drehung: LAl ψ = -11,82°(c 1,0, Pyridin)

2- TH-(TrJf luorace07/1)3,3* ^,^'-tetrajodo thy_ronyi7 aminoäthyl \ 2} , 3^t-0-isopro,pyliden-5^t.-adenyl

Eine lösung von 1,2 g (1,0 mliol) N-1 2- [jT-Trifluoracety 1-3,3^f,

J -aminoäthylj- -2^! ,3'-O-isopropylidenade-r

no sin in 10 nl trockenem Triä thy !phosphat wurde bei 0 ⁰G unter einer trockenen Argonatmosphäre zubereitet. Der kalten gerührten Lösung wurden 0,45 ^l (5 eMoI) Phosphorous Chlorid zugesetzt» Die entstandene Lösung wurde 24 Stunden lang auf 0 ⁰G gehalten und dann tropfenweise unter Rühren zu 1 1 Eiswasser gegeben. Das resultierende Präzipitst wurde durch filtration gesannnelt und-unter Vakuum getrocknet und ergab 1,23 S in IOm eines weißen Feststoffes. Der Feststoff wurde in Aceton gelöst und 0,32 ml (2,-2 mMol) Triäthylamin wurden zugesetzt« Ss entstand ein Präzipitat. Das Gemisch wurde unter Vakuum eingedampft und der entstandene Rückstand wurde rait trockenen Aceton ausgelaugt, anschließend aus einem Gemisch von trockenem Methylalkohol und trockenem Äthyl äther rekristallisiert und ergab 390 mg (Ausbeute 27,8 fo) in Form eines weißen Feststoffes mit einem Schmelzpunkt von 173 bis 183 ⁰C (Zersetzung)*

Analyseϊ Berechnet für ^C5₈ ^H48^F3^I4^N8⁰12^{Pi G|}

H, 3,4-5;. N, 7,98

Gefunden: G, 32,24; H, 3,08; N, 7»58

EME (60MHz, (CDj)₂SO-) J~1,53 (s, 3H₁ Isopropyliden), 6,2 (d, 1K, I'H-Ribose), 7,1 (s, 2H, Thyroxin, aromatisch), 7,87 (s, 2H, Thyroxin, aromatisch) 8,27 (s, 1H, Purin), 8,52 (s, 1H, Purin) Optische Drehung £<j 25 . -17,50° (c,-1,0, CH3OH)

^*^¹'!?* 5'~^tQ tra jodo thyron;yl7 aiainoäthy l

200 mg (0,14- mMol) N-{2- rN-(Trifluoracetyl-3j3' ,5>5^t-tetraoodothyronylj -aminoäthylV -2' ,3'-0-isopiopyliden-5^l-adenylsäuremonotriäthylaiiiinsalzmonohydrat wurden in 1 ml Wasser (0 ⁰C) suspendiert, und Trifluoressigsäure wurde tropfenweise unter Rühren zugegeben. Nach 30 Minuten wurde eine klare Lösung gewonnen. Die Lösung wurde weitere 15 Stunden lang kalt gehalten (0 ⁰G), dann unter Yakuum (30 G) eingedampft. Der entstandene Rückstand wurde viermal unter Yakuum (25 ⁰C) aus-20-ml-Portionen wasserfreien Äthylalkohols, eingedampft und dann unter Vakuum.(25 ⁰C) getrocknet, -wobei ein weißer Feststoff zurückblieb.

Der Feststoff wurde 30 Minuten lang mit 10 ml kaltem Methylalkohol-gerührt, dann durch Filtration gesammelt und unter Vakuum (25 ⁰Q) getrocknet und ergab einen weißan Feststoff (135 ^mS» Ausbeute 76 fo)_t dar bei über 188 ⁰G langsam unter Zersetzung schmolz.

Analyse* Berechnet für G₂9^H27^:E13¹4^N7°ii^Pi °> ²^ »97*

H 2,19; N, 7,87

Gefunden: C, 28,11; H, 2,31; U, 7*65 HMR- f220 IAHz, (GD^)₂SOJ ei 5,95 (d, 1H, I'-Ribose), 7,04 (s, 2H, Thyroxin, aromatisch) _? 7,84-(s, 2PI, Thyroxin, aromatisch), 8,25 (s, 1H, Purin), 8,36 (s, ΊΗ, Purin) , 8,43 (m, 1H, Amido), 9,66 (d, 1H, Trifluoracetamido) -

'£ 1 3 ί / υ

Optische Drehung Κ]])⁵ - ~2,72^Ρ (ο 1,0, Fyridin)

Konjugierte fflavinadeniridinucle οtid-TIi^roxin-Y er bindung

498 mg (0,4 ibMoI) N- £ 2- £K-CDrifluo£acetyl)-3,3^f ,5,5'~fcQtrajodothyronylj -aminoäfchylj -5'-sdenylsäure wurden in 10 ml trockenem Dime thy If ormamid gelöst ua.d üri-n-butylamin (96/ul, 0,4 nEol) wurde zugesetzt, worauf die Zugabe von 1,1'-Carbonyldiimidazo 1 (320 mg, 2,0 mMol) folgte. Nach 28-stündigem Rühren bei Rauiatemperatur ohne feuchtigkeit wurde Wasser (280 μΐ) zugesetzt and danach das Lösungsmittel unter Vakuum eingedampft.

Das entstandene Öl wurde durch wiederholtes Eindampfen unter Vakuum von trockenem Dimethylformamid (viermal von 10 ml) getrocknet« Das resultierende Phosphorimidazolidat wurde erneut in 10 ml trockenem Dimethylformamid gelöst und tropfenweise au einer 0,4 mMol-Iösung von Tri-n-octylaminsalz von Riboflavin^'^nionophosphat in 10-ml trockenem Dimethylformamid gegeben. Das Salz wurde durch Zugabe einer Lösung des Ammoniumsalzes von Hiboflavin-5'-monophosphat (192 mg, 0,4 mMol) in 10 ml Wasser zu einer gerührten Lösung von Sri-n-octylamin (170 All, 0,4 J£Mol) in 100 ml Aceton hergestellt. Kach 30 Minuten wurde das resultierende Gemisch unter Vakuum eingedampft. Der !Rückstand wurde durch wiederholtes Eindampfen unter Vakuum von trockenem Dimethylformamid getrocknet, wobei das Salz in Form eines orangefarbenen Feststoffes zurückblieb. -

Die obige das Phosphorimidazolidat und das Hibofiavin-p'-monophosphatsalz enthaltende Lösung wurde nach 24 Stunden in zwei gleiche Aliquoten geteilt, und eine ill oxo te wurde unter Vakuum eingedampft. Der gewonnene Rückstand wurde auf einer Säule (2,5 χ 78 cm) chromatographiert, die aus 100 g Sephadex LH-20 (Pharmacia 3fine Chemicals, .Uppsala, Schweden), das (18 Stunden) in einem 19i1-Gemi sch (Volum ent eile) von Dime thy If ormamid und iEriäthylaniaoniuahydrogencarbonat (1M, pH-Wert 7 »5) vorgequollen worden war, bestand. Die Säule wurde mit dem oben genannten i9i1~G6misch (VoI urne nt eile) eluierfe, und es wurden 10-ml-Frakfeionen ge-samir^lt. Der Ablauf sus der Säule wurde durch Eluierung

auf silanisierten RP-2-TLO-Platten von Silicagel 60 (S. Merck, Darmstadt, Westdeutschland) verfolgt.

Die TLC-Platten wurden unter Verwendung eines 40:40:35:1:1 (Volumen teile)-Gemischs von Aceton, Chloroform, Methylalkohol, Wasser und Triäthylamin entwickelt. Die aus der oben genannten Säulenchromatographie stammenden Fraktionen mit den Nummern 11 bis 17 wurden vereinigt und unter Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde auf einer Säule (2,5 χ 75 cm) chromatographiert, die aus 125 S Sephadex LH-20 bestand, das (18 Stunden lang) in 0,3M Ammoniumhydrogencarbonat vorgequollen worden war. Die Säule wurde mit 0,3M Ammoniumhydrogencarbonat eluiert, wobei 10-ml-Fraktionen gesammelt wurden. Der Ablauf wurde durch Absorption von ultraviolettem Licht bei 254 nm verfolgt. Das Volumen der Fraktionen wurde auf 20 ml erhöht, indem mit der Fraktion Nr. 150 begonnen wurde. Die Salzkons ent rat ion des .Eluierungsmitfcels wurde schrittweise folgendermaßen verringert: O,15M Animoniumhydrogencarbonat bei Fraktion Nr. 295, 0,073IiI immoniuinhydrogencarbonat bei Fraktion Nr₆ 376 und Wasser bei Fraktion Nr. 430. Insgesamt wurden 480 Fraktionen gesammelt. Die mit 200 bis 235 numerierten Fraktionen wurden vereinigt und unter Vakuum eingedampft und hinterließen die markierte konjugierte Verbindung in Form eines gelborangefarbenen Rückstande Se Sine alkalische v^äßrige Lösung dieses Rückstandes zeigte Ultraviolett-Absorptionsmaxima beiden folgenden Wellenlängen: 266 nm, 350 nm, 373 nm und 450 mm Die aus der Absorption bei 450 geschätzte Ausbeute betrug etwa 5 %·

Sin Phosphodiesteras8~Präparat (Worthington Biochemical Corp., Freehold, New Jersey, USA), das von Schlangengift (Crotalus Adamanteus) isoliert worden war, hydrolisierta das obige Produkt zu Riboflavin^*-monophosphat und der thyroxin-substituierten 5'-Ädenylsäure_i aus der die Trifluoracetyl-Blockierungsgruppa entfernt worden war₉

Eine weitere Beschreibung der Herstellung von markierten konjugierten Verbindungen dieser irt ist in der US-Patentanmeldung zu finden, die zum gleichen Zeitpunkt angemeldet wurde und den

Titel "Konjugierte Plavin-Jidenin-DirLUcleοtid-Jodotliyronin-Verbindungen" (Docket Nr₀ 11795) trägt.·

B. Darstellung von Apoglucoseoxidase

Ss wurde gemäß Teil B von Beispiel 1 hergestelltes Apoenzym verwendet»

C. Analysereaganzien - . '

1. Markierte konjugierte Verbindung - H -(2~Aminoäthyl)~thyroxin-PAD wurde mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7) auf eine Konzentration von 1 ßli verdünnt«, ' - · .

2. Aροenzym - Apoglucoseozidase wurde mit 0,1M Phosphatpuffer (pH-Wert 7) auf eine Konzentration von 0,6ßM FAD-Bindungsstellen verdünnt (gemäß Definition in Teil 0 - 2 von Beispiel

3. Insolubilisierte .Antikörper - Bin gewaschener feuchter Kuchen von Sepiiarose-Gel 4B (Pharmacia Pine Chemicals, Uppsala, Schweden), der nach der Methode von March, u. a. Anal. Eiochenu 60j119 (1974·) durch Cyanogen aktiviert worden war, wurde zu einer Lösung von 85 mg Antikörper (isoliert von Anbiserum gegen e ine -, kon j ugiert e Thyrox in-Rinderserunial bumin-V erbindung ) in 20 mi 0,1li Phosphatpuffer (pH-V/erf 7»0.) gegeban lind 36 Stunden lang langsam bei 4 ⁰G bewegt. Nach Beendigung der Kopplungsreaktion wurde 1 ml 1M Alanin zugesetzt, und das Schütteln wurde 4 stunden lang fortgesetzt, um nicht reagierte Stellen zu blockieren» Der resultierende an Sephadex gebundene Antikörper wurde auf einem gesinterten !Trichter mit jeweils 4CO ml 50 KM Katriumacetat - 500 mid Natriumchlorid (pH-Wert

5) und 50 ffilvl Phosphatpuffer - 500 mM Natriumchlorid (pH-Wert 7) gewaschen.

Dös? feuchte Filterkuchen wurde dann in 100 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7) suspendiert, der 0,01 % ITatriuniazid enthielt, um ' 22 ml einer etwa 50 Zlgen Suspension au erhalten* 4«. Standard - Eine 1,15M Vorratslösung von 'l^!hyrc:;in in 5 "iriM E'ah^&roxia wurde auf 2 -UM in 0,1Li Phosphatpuff er (pH-Werfc 7)

-*>-, 2137

verdünnt.

5. Yerfolgungsreagens ~ Ein Glucoseoxidase-Analysereagens wurde so hergestellt, daß es folgendes Gemisch pro 13O₁Ul enthielt? 25/U.l 1,2mg/nil Peroxidase (Sigma Chemical Co., St·,. Louis,

Missouri, USA) in 0,1M Phosphatpuffer (pH-v7ert. 7), 5/il 10 BtI Aminoantipyrin in Wasser, 20/ul 25 oM 3,5-3ichlor-2-hydroxyir benzolsulfonat ia O,1M Phosphatpuffer (pH-ftert 7), 30/ul 16,5 %iges Rinderserumalbumin in 0,1M Phosphatpuffer (pH-Wert 7) und 50'/Ul 1H Glucose in wäßriger gesättigter Benzoesäurelösung. . . ·

Bindungsraaktionsgemischa wurden hergestellt, indem 150 All dar insolubilisierten /,ntikörpersuspension, 80 /al Lösung der markierten konjugierten Verbindung, verschiedene Mengen der Standard-Thyrosinlösung, um unterschiedliche Konzentrat ionen von Thyroxin in den Reaktionsgeraisehen zu erzielen, und eine ausreichende Menge von 0,1M Phosphatpuffer (pH-Wert 7) vermischt wurden, um ein Gesamtvolumen von 500 ,/ul zu erzielen. Die Reaktionsgemische wurden durch zweistündiges Schütteln bei 25 0 in kubiert» Jedes Reaktionsgemisch wurde anschließend durch eine trockene Pasteur-Pipette mit Glaswollestopfen, die zuvor mit Perjodat-. und Ithylenglycollö'sungen zur. Entfernung möglicher Pi\D-Verunreinigungen behandelt worden war, vakuumfiltriert. Zu einer 300-}Ul-.Aliquote jedes 3?iltrats wurden 130 μΐ de"s Ye rf Ό1« gungsreagQns und ^O jal der ipoenzymlösung gegeben. Nach einer Stunde wurde das Absorptionsvermögen jedes Heaktionsgeinischs bei 520 nm gemessen«

E, Ergebnisse

Ja der folgenden Tabelle 3 werden die Ergebnisse des Analyse-Verfahrens zur'Messung von Thyroxin wiedergegeben. Die Ergebnis se des Absorptionsvermögens werden als Mittelwert von Duplikafcversuoiiea, korrigiert hinsichtlich der zurückbleibenden Bnzymaktivität .in der Apoenzymlösung (Absorbanz von 0,522) und endogener FAU ia dor j\nt.ikörpersuspension (ibsorbanz 0,142) ange-

21

führt.

Tabelle 3

Volumen von zugesetztem Thyroxin-standard (,ul)

25 75

250

Korrigiertes mittleres Absorptionsvermögen bei 520 am'

0,223 0,221 0,281 0,286

Die Ergebnisse beweisen, daß durch, die Erfindung eine nützliche spezifische Bindungsanalysemethode des heterogenen Typs zur Verfugung gestellt wird,

E ei sp ie 13«

Homogene Bindungsanalyse für Thyroxin

iki. Barsteilung der markierten konjugierten Verbindung Aminohexyl)-th.yroxin-f lavin adenindinucle ot id

N⁶-(6-

6^ ₁ (G-Aminohexyl) amino-9~_(2^f ,3*-O-isopropyliden-ß-D-ribof uranosyl)....

16,0. g (50 rüMol) 6~Chlor-9-(2^l ,3'~0-isoprophyliden~ß-D-ribof uranosyl)purin (Hampton, u. a·, J. im. Ghem. Soc. 83:1501 (1961) wurden unter Rühren zu einer flüssigen Probe (70 ⁰C) von frisch destilliertem 1,6-Diaminohexaii (58 g, 500 n&Iol) gegeben. Das entstandene Gemisch -wurde 18 Stunden lang unter Argon bei 40 ⁰O gerührt«, Das überschüssige Diamin wurde durch Destillation unter reduziertem Druck (60 ⁰G, 0,91 rom Hg) entfernt. Der'resultierende schwach gelba Rückstand wurde auf 150 Silicagel 60 (S. Merck, Darmstadt, Westdeutschland) absorbiert und oben auf eine Ohr oma t o-graphiasäule aus einer Aufschlämmung von Silicagel 60 (2 kg) in einem 9*1 (VoIuseπte ils) Gemisch von wasserfreiem Äthylalkohol

1377 0

und Triäthylamrnoniuiiihydrogencarbonat (pH-Wea?t 7»5j 1M) gegeben. Die Säule wurde mit dem obigen 9:1 (YoIumentaila) Lö songs mitt elgemisch eluierfc und es wurden 900 20-ml-Frakbionen gesammelt. Die Fraktionen wurden mit Hilfe der Dünn scMcht Chromatographie (TLG) auf Silicagel 60 unter Sluierung mit einem 7*3 (Volunienteile)-Gemisch von wasserfreiem Äthylalkohol und Triäthylammoniumhydrogencarbonat (pH-Wert 7,5, 1M) untersucht. Die'von der Säulenchromatographie stammenden Fraktionen mit den Nummern 391 bis wurden vereinigt und unter Vakuum eingedampft, so daß 15>O g eines glasartigen Rückstandes gewonnen wurden (.Ausbaute 74-%)· Sine 1-g-Probe des Glases wurde in einer geringen Menge Methylalkohol gelöst und dann oben auf eine Säule von 80 g Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals? Uppsala, Schweden), das in Methylalkohol vorgequollen worden war, aufgegeben. Die Säule wurde mit Methylalkohol eluiert. Insgesamt wurden neunzig 8-ml~Fraktionen gesammelte Die Fraktionen wurden mit Hilfe von TLO aif Silica gel 60 unter Sluierung mit einem 7s3-Gemisch (Volumenteile) von wasserfreiem Äthylalkohol und Triäthylammoniuiahydrogencarbonat (pH-Wert 7 »5 1M) untersucht. Die mit 19 bis 27 numerierten, aus der Säulenchromatographie stammenden Fraktionen wurden vereinigt und unter Vakuum eingedampft, so daß 910 mg (91 % Rückgewinnung) eines /weißen Glases surückblieben. -

Analyse: Berechnet für O₁^o¹W 0, 56,14_} H, 7,44{ N, 20,68.

Gefunden? G, 53,91* H, 7,33j N₁ 19|18 MS (60 MHz, GDCl₅): ^1,40 (s, 3H, Isopropyliden) , ·- 5» 98 (d, 1H, 1^f-Ribose), 7,92 (s, 1H, Pur in),

8*36 (s, 1H_S Purin) - .

Optische Drehung LoC] & = -50,11° (c 1,0, Methylalkohol).. , -

H-/ 6»» fN-Trifluoracet;?!)-^^* ^,S'-tetranodothyronylf aminohaxyll -2" ,3^t3-0»isoprop7lidenadenosin

Eine Lösung von 4,36 g (5,0 mMol) <X,-(N-Trifiuoracetyl)aminoß-[3-,5-di30do~4-(3^! ,5^t-dijodo-4^i!-hydroxyph9noxy)-phenylpropansäure, hergestellt nach der Beschreibung in Teil A von Beispiel 2 oben, und 2,24 g {5i5 mMol) 6-(6-j\iainohexyl)amino-9-

-te- 2137 70

(2¹,3'-0-isopropyliden-ß-D-ribofuranosyl)puriii in 100 ml trockenem Dime thy If or raamid wurde bei 20 ⁰C unter einer trockenen Argon atmosphäre hergestellt. Dieser kalten gerührten Lösung wurde eine Lösung von 1,52 g (5,5 mMol) Diphenylphosphorylazid (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, USA) in 50 ml trockenem Dimethylformamid und anschließend 0,8 ml (5,5 aMol) trockenes Triäfehylamin. zugesetzt. Die Lösung wurde 22 Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten. Die Lösung wurde danach tropfenweise unter Rühren zu 600 ml kaltem (0 C) Wasser gegeben. Das resultierende weiße Präaipitat wurde durch Filtration gesammelt und unter Vakuum (60 ⁰C) getrocknet und ergab 4,90 g (Ausbeute 78 %) weißen Peststoff«, Eine Probe dieses Peststoffes wurde aus einem Gemisch von Aceton und Wasser rekristallisiert und ergab einen weißen feststoff mit einem Schmelzpunkt von 205 bis 207 ⁰C (Zersetzung).

Analyses Berechnet für C^5^3^I4N7Ogi C, 34,28_{ H, 3,04; N, 7s77

Gefunden: C, 34,22$ H, 2,99? IT, 7,41

Massenspektruia (20 ma) m/e: 1262 LMH⁺J , 1164 [M⁺ minus

GOGF Sl Optische Drehung I₀Q jp = -21,89° (c 1,0, Pyridia)

^7.1.)-3j3' > 3» 5/ _i ~tgfc^a_tiodo_ithyrouy_l'| _aainohe:;ylj·

1 aminsa Izraono hvdra t

Eine lösung von 1_S89 g (1,5 riiol) H-{ 6-:£N-Trifluoracetyl)-3»3' » 5s5^t-fcetraöodothyronylj aminohexylj -2',3'-0-isopropylidenadenosin in 15 ml trockenem Triä thy !phosphat wurden bei -10 ⁰C un~ ter einer trockenen ArgonatmoSphäre hergestellt. Der kalten gerührten lösung wurden 0,68 ml C? ^ mlaol) Phosphor oxy chi or id zugesetzt.-Die resultierende Lösung wurde 18 Stunden lang bei -15 G gehalten und danach tropfenweise unter Rühren zu 1 ,5 1 Siswasser gegeben. Das entstandene Präzipitafc wurde durch Filtration ge sam-, molt und unter Vakuum getrocknet und ergab 1 ,91 g (Ausbeute 87 %) weißen !feststoff. Der feststoff wurde in 10 ml Methylalkohol gelöst, und 0,38 ml (2.6-mMol) Triethylamin wurden zugesetzt. Diese lösung wurde' unter Vakuum eingedampft, und der resultierende Rückstand wurde aus einem Gemisch von Methylalkohol und Athyläther

-«- 213770

rekristallisiert, wodurch. 720 mg (.Ausbeute 33 %) weißer Feststoff mit einem gewonnen wurden.

stoff mit einem Schmelzpunkt von 151 bis 154 ⁰G (Zersetzung)

analyse: Berechnet für O₄₂S₅₆F₅I₄NgO₁ ^i C, 34»545 ^H> 3*86$ N*

7,67i

Gefundens 0, 35,24 j H, 3,88$ N, 7,75

Massenspektrum (20 ma) m/e: 1342 /mh*} » 1244 [m⁺ minus

GOCF₅] Optische Drehung £/] |⁵"= -17,20° (c 1,0, CH₅OH)

6- fN~CTrifluoracetyl)~3;3S5)5^t-tetra jodoth7/ron^lj aiaino-

600 mg (0,41 aMol) N- [ 6- [iT-[Drifluoracetyl-3,3^f 5,5'~tetr3;iodothyronylj aminohexyl }-2' ,3^l~O-isopropyliden-5'-a^<ienylsäurenionotriäthylaiainsalzuionohj'drat wurde in 0,6 ml Wasser (0 G) suspendiert, und Irifluoressigsaure (6 ml) wurde tropf em? eise unter Rühren zugesetzt. Nach 50 Minuten wurde eine klare Lösung gewonnen. Die Lösung wurde weitere 15 Stunden lang kalt (0 ⁰G) gehalten und dann unter Vakuum (30 ⁰G) eingedampft. Der resultierende Rückstand wurde fünfmal aus 20-al-Portionen wasserfreien Äthylalkohols eingedampft, und danach mit 30 ml V/asser fcrituriert und mife einer geringen Menge Methylalkohol gewaschen. Der entstandene weiße Feststoff (43Ο mg) wurde aus Methylalkohol· rekristallisiert und ergab 290 mg (ausbeute 54,6 %) weißen Feststoff mit.einem Schmelzpunkt von 180 bis 183 G (Zersetzung)*

Analyses Berechnet für G₃₇H₃₅F₅I₄N₇O₁₁Ps G, 30,46_{ H, 2,71i

H, 7,54 ·

Gefunden: G, 30,77% H, 2,55? N₁ 7,29

Massenspektrum (20 ma) m/es 1302 [ülH⁺J , 1204 JlK⁺ minus cogfJ

Konjugierte ^gIaviiiadenind^

130,13 mg (0,1 mMol) N-{ 6- [li-{a?rifluoracetyl^3,3^!5₅5^!-tetra™

-«- 213770

jodothyronyll andnohe:iyl~? -5' adenylsäure wurden in eine Argonatnosphäre gebracht. Dieser Probe wurde eine Lösung von 14· ^uI (0,1 H¹HoI) Triethylamin in 1 ml trockenem Dimethylfοrmamid zugesetzt, worauf die Zugabe einer-Lösung von 16,2 mg (0,1 mMol) 1,1^f~0arbonylaiiiaidazol in 1 ml trockenem Dimethylformamid folgte* Nach 24 Stunden wurde ein zweites .Äquivalent von 1,1' ~C ar bony 1-diimidafcol (16,2 mg) in 1 ml trockenem-Dimethylformamid zugegeben. Die obige Reaktion ließ nan insgesamt 48 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Ausschluß von !Feuchtigkeit ablaufen. Sine Probe von 47,3 ^S (0,1 mtiol) des inmioniumsalze s von Hiboflavin-5^s-iaonophosphat -wurde in das entsprechende Tri-n-octylaininsalz nach der Beschreibung in Teil A von Beispiel 2 umgewandelt. Dieses Salz wurde in 3 ml trockenem Dimethylformamid gelöst und zu der obigen Lösung gegeben, die das Phospiioriniidazolidat der Adeny!säureZwischenverbindung enthielt.

Die resultierende Lösung wurde im Dunkeln 24 Stunden lang bei Kaum tempera tür unter Ausschluß von Feuchtigkeit stehen gelassen. Des lösungsmittel wurde unter Vakuum verdampft und der resultierende Feststoff -wurde auf einer (2,5 χ 73 cm) Säule von 100 g Sepiiadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden), das (13 Stunden lang in einem 19i1-Genisch (VoIumenteile) von Dimethylformamid und {Eriätiiylamraoniuiahydrogencarbonat (1M, pH~ Wert 7>5) vorgequollen worden war, chromatοgraphiert. Die Säule wurde mit dem obigen 19:1- .(Volumenteile)-Gemisch eluiert, und es wurden ^ml-Fraktionen gesarimelt. Der .Ablauf ar^s der Säule wurde durch 2luierung auf silaaisierten EP-2-TlC-Platten von Silicagel 60 (S'. Morck, Darmstsdt, Westdeutschland) verfolgt. Die ILG-PIatten wurden unter Verwendung eines Gemischs von Aceton, Chloroform, Methylalkohol, Wasser und Triethylamin im Volumenverhältnis von 4G:40i?_5;isi

Die aus der Säulenchromatographie stammenden mit 24 bis 38 numerierten Fraktionen wurden zusammengenommen und unter Vakuum eingedanpft* Der Rückstand wurde auf einar (2,5 χ 85 cm) Säule von 125 S *3sph.adex LH-20, das (1'8 Stunden lang) in 0,1M Ammonium.-hydrogGncarboiist vorgequollen'worden v;ar, chroma tographiert. Die

21377

Säule wurde mit einem von 2 1 0,1M Ainmonitunhydro gen carbon at und 2 1 Wasser erzeugten linearen Gradienten eluiert, und 23 ml Fraktionen wurden gesammelt. Der ablauf wurde mit Hilfe der UV-Absorption (254 nm) verfolgt. Die mit 170 bis 182 numerierten Fraktionen wurden vereinigt und unter Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde auf einer (2,5 χ 55 cm) säule von 80 g Sephadex IH-20, das in 0_s05 M Ammoniumhydrogencarbonat vorgequollen worden war, chrosistograpniert. Die Säule wurde mit einem aus 2 1 0,05 M immoniumhydrogencarbonat und 2 1 0,02 M Ammoniumhydrogencarbonat erzeugten linearen Gradienten eluiert. Der ablauf wurde mit Hilfe von UV-Absorption (254 nm) verfolgt* Die Eluierung wurde mit 2 1 0,21t Amoniumhydrogencarbonat fortgesetzt, wobei 23-ml-Fraktionen gesammelt wurden. Ihsgessnt wurden 257 Fraktionen gesanmelte Die mit 70 bis 110 numerierten Fraktionen wurden zusammengenommen, und unter Vakuum eingedampft, wobei die markierte konjugierte Verbindung in Form eines gelb-orangefarbenen Rückstandes zurückblieb. Eine alkalische wäßrige Lösung dieses Rückstandes zeigte UV-Absorptionsmaxima bei folgenden Wellenlängen: 270 nm, 34-5 nm und 450 nm. Die aus der Absorption bei 45O nm geschätzte Ausbeute betrug etwa 5 %·

Ein Phosphodiesterase-Präparat (Worthington Biochemical Corp., Freehold, New Jersey, USA), isoliert von Schlangengift (Orotalus Mamanteus), hydrolysierte das obige Produkt zu Riboflavin-" 5'mono phosphat und der thyroxin substituier te η 5^t-^denylsäure , worin die Trifluoracetyl-Blockierungsgruppe entfernt worden war.

Weitere Beschreibung der Darstellung markierter konjugierter Verbindungen dieses !Typs ist in der US-Patentanmeldung, Anmeldeaktenzeichen Nr. 917.962, eingereicht am 22· Juni 1978, zu finden.

B«. Darstellung von Apoglucoseoxidase

Glucoseosidase wurde wie in Seil B von Beispiel 1 oben dialysie.rfc und lyophilisiert. Ein Teil der iyophiiisierten Glucoseoxidase (80 mg) wurde in 20 ml 30%igem (Volumenteile) Glycerin bei 4

- kt- 213770

gelöst, una der pH-tfert der Lösung wurde durch, die Zugabe von konzentrierter Soiiwaf el säure (H₂SO^) auf 1,4 eingestellt. Die Lösung wurde 2 Stunden lang bei 4 ⁰G inkubiert, danach, durch, eine Säule von öephadex G-50 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala_} Schnöden) von 4 ⁰G, geschickt, die mit 30 % (Volinenteile) Glycerin äquilibriert und mit konzentrierter H-SO^ auf einen pH-Wert von 1,4 eInga stellt worden war. Der eluierte Proteinpeak wurde gesammelt (27 ml,-die 74 Massel-der Säule aufgegebenes Material enthielten), und 200 mg Einderserumalbumin wurden in dem aufgefangenen I?Iust gelöst. Holzkohle (600 mg, RIA-Sorte von Schwarz-Mann, Orangeburg, Hew York, USA) wurde danach zugesetzt, und das Gemisch wurde durch die Zugabe von 4,0 ml 0,4M Phosphatpuffer (pH-Wert '8,O) und ausreichend 2IT Natriumhydroxid zur Einstellung des pH-Y/ertes auf 7>0 neutralisiert. Das Gemisch wurde 60 Minuten lang bei 4 ⁰G gerührt und nacheinander durch 0,8/L und 0,22 ^it Millipore-Filter (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USi) filtriert. Zur Erzielung einer endgültigen Konzentration des Gemischs von 0,1 % wurde Natriumazid (10 Massel/ YoI) zugesetzt. . '

C» Analysereagenzien

1..Markierte konjugierte Verbindung -N -(6-lminohexyl)thyroxin-PuD wurde in O₉IiVl Phosphatpuffer, der 0,1 % (MassesVol) Sinder se run al bumin (pH-Wert 7»0) enthielt, auf eine Konzentration von 400 ηΐ,ά verdünnt _β

2. ipoenzym - üpoglucoseo::idase wurde in 0,1M Phosphat puffer, dea:. 0,1 % (Hasse sVol) Rinder se rumal bumin (pH-Wert 7*0) enthielt, auf eine Konzentration von 4,0 mikronormalen QaIT) Bindungsstellen verdünnt (siehe Teil 0-2 von Beispiel 1).

3* AntisGrum - Gesättigte Amaoniumsulfatlöaing (7$5 ml) wurde bei Raumtemperatur mit 0,1 ml/Minute in 15 ml Kaninchen-üntothyroxjji-Antiserum unter Rühren aif einem Sisbad gepumpt. Die resultierende Suspension wurde 2 Stunden lang bei 4 ⁰C ohne Rühren stehen gelassen. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren gesammelt, in 3 ml eiskaltem 50 eil Boratpuffer (pH-Wert? 8,6) gelöst und über Nacht gegen 1 1 50 ΐηΐ,ΐοΐ Boratpuf-

213770

fer (pH-Wert 8,6) dialysiert. Die Jinmuno globulin lösung wurde dann durch die Ziigabe von 50 mM Boratpuffer (pH-Wert 8,6) auf das ursprüngliche ^ntiserum-Volumen aufgefüllt. Die Ioniunoglobulinlösung -wurde vjeiterhin in 0,1IvI Phosphatpuffer, der 0,1 % Masse/Volc) Rinderserumalbuiain (pH-*Wert 7,0) enthielt, zur Verwendung in den anschließend beschriebenen inalyseverfahren in den angegebenen Mengen verdünnt»

4_e Standards - Thyroxinnatriumsalz (Sigma Chemical Co., St. Louis_s Missouri» USA) wurde als eine .1-mg/ml -Vorratslösung, in Lösung in destilliertem V/asser mit 2N Natriumhydroxid auf einen endgültigen pH-Wert von 10,2 titriert, verwendet. Standards wurden durch Verdünnen dieser Vorratslösung in 0,11 Phosphatpuffer, der 0,1 % (Masse/Vol.) Rinderserumalbumin (pH-Wert 7,0) enthielt, hergestellt.

5· Verfolgungsröagens - Bin Glucoseoxidase-lnalysereagens wurde durch. Vermischen von 11 Teilen 0,15M Phosphat puffer (pH-Wert 7»0), der 1,8 % (¥iasse/Vol) Rinderserumalbuiain enthielt, 2 Teilen 2,0 mM 4-^minoantipyrin, das 0,6 mg/ml Peroxidase enthielt, 2 -Teilen 20 nM 3,5 Dichlor-2-hydroxybenzolsulf ona t in 0,1M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) und 2 Teilen 1,OM Glucose in ¥Jäßriger gesättigter Benzoesäure lösung hergestellt.

1. Zugabe aller Reagenzien ohne Vorinkubationsstufe

Folgende Stoffe wurden nacheinander in einzelne Reactionsküvetten gegeben: 0,05 ml Lösung der markierten konjugierten Verbindung, 0,05 ml ausgewählte Stsndardlösung, 0,1 ml einer 1 j4~Yerdünnung der Antiserumlösung in dem Phosphatpuffer, 1,7 sil Verfolgungsreagens und 0,1 ml j\poenzymlösung. Jedes Reaktionsgemisch wurde 30 Hinuten lang bei 20 ⁰C inkubiert , und das Absorptionsvermögen bei 520 nm wurde gemessen. 2· Vor^^kub^at ion mit j\ntiserum

Die folgenden Stoffe wurden nacheinarjier in einzelne Reaktionsküvetten gegeben: 0,05 ml Lösung der markierten konjugierten Verbindung, 0,05 ml ausgewählte Sfcandacdlösung und

- te,- 21 37 7

O_t1 ml einer 1:16-Verünhung der Antiseruinlösung· in dem Phosphatpuffer. Jedes Reaktionsgemisch wurde 20 Miautaα lang bei 20 ⁰C inkubi-ert, und danach, wurden nacheinander jeweils 1,7 nil Verfolgungsreagens und 0,1 ml Apoenzymlösung zugesetzt. Nach einer weiteren Inkubationszeit von 30 Minuten bei 20 ⁰G wurde das Absorptionsvermögen bei 520 nm in jeder Küvette gemessen. Vor·"Tnlcubation rait Appenaym

Die folgenden stoffe wurden nacheinander in einzelne Reaktionsküvetten gegeben: 0,05 ml Lösung der markierten konjugierten Verbindung, 0,05 ml ausgewählte Standardlösang und 0,1 ml Apoenzymlösung. Jedes Se akt ions gemisch wurde 20 Minuten lang bei 20 ⁰G inkubiert, danach.wurden jeweils 0,1 ml einer Is2-Verdünnung der Antiserumlösung in dem Phosphatpuffer und 1,7 ml Verfolgungsreagens nacheinander zugesetzt. Iiach einer weiteren Inkubationszeit von 30 Minuten be i 20 ⁰C wurde das Absorptionsvermögen bei 520 nm in jeder Küvette gemessen. rfolgende Vor-Inkubation· zunächst mit Antiserum und

darauf mit

Die folgenden Stoffe wurden nacheinander in einzelne Reaktionsküvetten gegeben: 0,05 ml Lösung der markierten konjugierten Verbindung, 0,05 ml ausgewählte Standardlösing und 0,1 ml mit einer 1:32-Verdünnung von Antiserumlösung in dem Phosphatpuffer. Jedes Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten lang bei 20 G inkubiert und danach wurden jeweils 0,1 ml ipoenzymlösung zugesetzt. Nach einer weiteren Inkubationszeit von 20 Minuten bei 20 ⁰G wurden in jede Küvette 1,7 ml Verfolgungsraagens gegeben, und das Absorptionsvermögen bei 520 um wurde jeweils nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten bsi 20 C gemessen, 5· Aufeinanderfolgende Vor-Inkubation mit zunächst Apoenzym, und dann Antisarum

Die folgenden Stoffe wurden nacheinander in einzelne Reactionsküvebten gegeben: 0,05 ml Lösung der markierten konjugierten Verbindung, 0,05 ml ausgewählte Standardlösung und 0,01 mi Apoenzymlösunge Jedes Re akt ions ge mi sch wurde 20 Minuten lang bei 20 C inkubiert, und danach wi^rde 0,1 ml einer 1:32-Verdünnung der Antiserumlösung in dem Phosphatpaffer jeweils zu-

g-esetzt· Nach einer weiteren Inkubationszeit von 20 Minuten bei 20 G. wurden 1,7 ml Verfolgungsreagens in jede Küvette gegeben, und das Absorptionsvermögen bei 520 nm wurde jeweils nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten bei 20 C gemessen. ^* ypP~3nj£u.bation mit Anti serum und Apo enzym

Die folgenden Stoffe wurden nacheinander in einzelne Reaktion or küvetten gegeben: 0,05 ml Lösung der markierten konjugierten Verbindung, 0,05 ml ausgewählte Standardlösung, 0,1 ml Apoenzymlösung und 0,1 ml einer 1:32-Verdünnung der Antiserumlör sung in dem Phosphatpuffer. Jedes Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten lang bei 20 ⁰O inkubiert, und danach wurden 1,7 ml Verfolgungsreagens jeweils zugesetzt. Nach einer weiteren Inkubationszeit von 30 Minuten bei 20 ⁰G wurde das Absorptionsvermögen bei 520 nm in jeder Küvette gemessen.

E. Ergebnisse

Die Analysen wurden doppelt mit entsprechenden Blindlösungen durchgeführt. Es wurde festgestellt, daß bei den Verfahren 1 bis 3 <3.ie Konzentration von Thyroxin in der Standardlösung mit Glucoseoxidase-Aktivität in direkter Beziehung stand, während die Thyroxinkonzentration bei den Verfahren 4 bis 6 im umgekehrten Verhältnis zur Snzymaktivität stand. Ohne Thyroxin war die Enzymaktivierung bei den Verfahren 1 bis 3 inhibiert, dagegen war die Enzymaktivierung bei den Verfahren 4 bis 6 verstärkt. Es ergab sich auch, daß die Verfahren 4- bis 6 etwas sensitiver gegenüber Thyroxin waren als die anderen Verfahren. Der Grund oder die Gründe für die unterschiedliche Inhibition oder Verstärkung der Enzymaktivierung in Abhängigkeit von der Reaktionsfolge ist noch nicht vollkommen bekannt, wenn auch die Ergebnisse zeigten, daß durch die Erfindung ein Verfahren für eine homogene spezifische Bindungsanalyse zur Bestimmung von Thyroxin unter Anwendung einer größen Vielzahl- von Heaktionsfolgen zur Verfügung gestellt wird,

Beispiel 4-

Homogene Bindungsanalyse für Theophyllin

A. Darstellung der markierten konjugierten Verbindung - Theophyllin-

Zu einer Lösung von 2,4/τΙώοΙ .Flavin N -Aminohexyl-adenindinucleotid, hergestellt nach der Beschreibung in Teil A von Beispiel 1 oben, in 20OpI Dimathylsulfoxid unter Argongas wurden 0,£ mg 1,3-Dimethyl-1,6,7,8-tatrahydropyrido [i,2-e J pur in- 2,4-9 (3H)-fcrion (3,62 yUKol), hergestallt nach der Methode von Cook, u, a.» Ses. Comin. in Ghem, Pathol. and Phara. 13:497 (1976) gegeben, worauf nach 4 Stunden die Zugabe von weiteren 1,8 mg (7»3 jt&Iol) des gleichen Stoffes folgte. Nach Rühren über Hacht wurde das Lösungsmittel unter Vakuum eingedampft (0,1 mm Hg), und der Rückstand wurde auf einer 2,5 χ 90 cm Säule von Sephadex LH--20 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) chroma tographiere, wobei mit 0,3M Triäthylammoniumhydrogencarbonatpuffer (pH-Wert 7»8) eluiert wurde. Das zwischen 210 und 260 ml des Ablaufs oluierte roha Produkt wurde gesanmolt und auf eine Silicagalplatte von 2O χ 20 cm χ 1000 pl aufgebracht und mit einem 8i2-Gemisch von Äthanol und 1M Triäthylammoniumhydrogencarbonatpuffer (pH-Wert 7,8) eluiert. Die das vorgesehene Produkt (R_r = 0,77) enthaltende Bande wurde von der Platte abgeschabt, mit 1il Triäthylaamoniunihydrogencarbonatpuffer (pH-Wert 7,8) extrahiert, filtriert und eingeengt. Die endgültige Reinigung durch ReChromatographie auf Sephüdex LH-20 ergab unter Bluierung mit dem puffer bei 0,2M 1,26 fMol-der markierten konjugierten Verbindung, wie durch Messung des Absorptionsvermögens bei 4.50 nm bestimmt wurde und eine Ausbeute von 53 % darstellte.

B. Antikörper-Bindung Reaktionen

Antikörper wurde bei Kaninchen gegen das Immunugen S-(3~Carbos^- propyl)-1,3-dLmethyl2aafcMn-BSA eingesetzt, wie von Cook, u. a» in Hes· Comm, in Chem. Pathol. .Pharm. 13?947 (1975) beschrieben wird* .._... ., ·

Antikörper-Bindungsreaktionen wurden bei .Raumtemperatur in O,1M K'atriuaphosphatpuffer (pH-Wert 7,0) durchgafülirt und die Messungen aer^Glucüsöoxidasa-Aktivität erfolgten in dem gleichen Puf-

- 5X

fer bei 20 °G«

Bei der Analyse wurden die folgenden Reagenzien verwendet:

A 0,1M Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,0)

B 565 aM markierte konjugierte Theophyllin-

FAT)-V en bindung oder 160 nivl N ~(6-Aminohexyl)

PAD (das FAD-Derivat)

0 Änfeiserum gegen Theophyllin (Ίο-fach in

Reagens A verdünnt)

D ipoglucoseoxidase (50 nM FiD-Bindungsstallen

pro ml) ...-.

E Verfolgungsreagens s 200 /ig Peroxide se/ml |

0,71 TtM 4-Aminoantipyrinj 7j1 EM 3,5^iChIoT-2-hydroxybenzolsulfonat^ 353 ¹^l Glucose und 35 mg BSi/ml

Die ßeaktionsmittel A₁ B und G wurden in einzelnen Reakfeionskü» vetten in den in der folgenden Tabelle 4 angeführten Anteilen vereinigt. Reagens D (100 μΐ) und Reagens Ξ (283 A¹I) wurden dann schnell und nacheinander in jedes Re actions gemisch gegeben, viorauf eine Inkubat ions dauer von 30 Minuten bei 20 ⁰C folgte. Das Absorptionsvermögen bei 520 nm wurde dann bei jeder Küvebfca gemessen. Die in Tabelle 4 ζ us ammenga stellten Ergebnisse sind die Mittelwerte von Duplikatversuchen.

Reaktion

Reagens Δ (/il) (PufferU

617 517

507

-477

357

Reagens B (/αϊ) (ffAD-Derivat) "(Mark.

1Ü0 100 100 100 Reagens C (iul) U i serum)'

10

40

160

Absorptionsverrn. (320 nm)(Extinktion^

0,046

0,584

0,644 0,631 o,629

497 587 577 532 517 437

10

20

40

80

160

0,690

0,314

0,216

0,224

0,22

0,21

21 37.7

Die Ergebnisse aus den Reaktionen 2 bis 5 zeigen, daß das Antiserum die Aktivität des FAD-Derivats nicht beeinflußte (d. h. nicht an Theophyllin koppelte)· Die Reaktionen 6 bis 11 zeigten, daß die Aktivität der markierten konjugierten Verbindung hinsichtlich ihrer Fähigkeit, sich mit dem isoenzym, zu vereinigen, durch größere Mengen Theophyllin-Antiserum verringert wurde.

Ce Konkurrenz-Bindungsanalysen

Diese Raktionen wurden'nach äer Beschreibung in Teil B oben ausgeführt, mit dem Unterschied, daß die angegebenen Mengen Theophyl lin mit den Reaktionsmitteln A und B vereinigt vsurden, bevor Reagens G zugesetzt wurde, und daß bei Reagens 0 eine 100-fache Verdünnung von üntiserum vervjendet v?urde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 5 enthalten. -

Die Reaktionen 1 bis 3 war en Kontrollen, die zeigten, daß durch den Antikörper für Theophyllin die Fähigkeit der markierten konjugierten Verbindung, sich mit den isoenzym zu. vereinigen, verringert wird. Die Reaktionen 4 bis 9 zeigen, daß die FAD-Akti» vität im Verhältnis zur Theophyllinmenge in dem Re akt ions gemisch zunimmt.

Tabelle

Reaktion Reagens Λ

Nr. (Puffer)

1 617

2 597

3 497

4 397

5 447

6 397

7 447

8 397

9 ' 447

Reagens B ζ (mark. Icon j

Verbindung)

20 20 20 20 20 20 20 20

Theophyllin

Zug. Menge Konzentr.

100 50

100 50

100 50

10 10 1,0 1,0 0,1 0,1

Reagens C Cdi	Absorptions
(Antiserum)	vermögen ($ xünMion
	( 520 ma)
_	0,047
-	0,932
100	0,364
100	0,703
100	0,649
100	0,507
100	0,481
100	0,418
100	0,377

-st- 213770

Beispiel 5 _

Homogene BindungsaaaIyse für Menschen-IgG

A. Darstellung der markierten konjugierten Verbindung - IgG- -

Zu 4,24 mg Flavin N -aminoheicyl-adenindinucleotid, das wie in Teil A von Beispiel 1 oben beschrieben hergestellt worden war, wurden 2,5 mg Dirnetiiyladipimidatdüiydrochlorid (Pierce Chemical Co., Bockford, Illinois, USA) in 1 ml Wasser und 5 ^uI Triethylamin gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, und danach wurden 40 mg Immunglobulin (IgG) des Menschen in 1 ml Ο,ΊΜ Natriuiiipyrophosphatpuffer (pH-Wert 8,5) zugesetzt. Nach weiterem 3-stündigem Rühren bei Rauntemperatur wurde das Reaktionsgemisch auf eine 2,5 x 50-cm-3äule von Sephadex G-25 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) gegeben, die äquilibiert worden war und mit Ο,ΊΜ Natriiomohosphatpuffer (pH-^/ert 7»0) eluiert wurde. Fraktionen von dem ersten eluierten Peak mit optischer Extinktion bei 450 nm wurden gesammelt und nacheinander gegen 4 1 O,1M Natriumphosphat puffer (pH-Wert 7jO$ 16 Stunden lang, 4 1 O,1M Natriumphosphat ρ uff er (pH-i7ert 7,0-)» der 1M Natriumchlorid enthielt, 24 Stunden lang, und 0,0111 Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7₅O) 48 Stunden lang dialysiert, Natriumazid wurde dann bis zu 0,1 % (MasseA^ol) augesetzt. Das Reaktionsmaterial wurde durch einen 0,22-_fu-Millipore-Filter filtriert und aufbewahrt.

B. intikörper-Bindungsreaktionen

Bei dieser analyse wurden die folgenden Reaktionsmittel verwendet? · ...

Reak_tionsmi t t e 1 Zusammen se taung

A O,1M Natriumphosphatpuffer (pH-Wert

7,0)

B " 10 mM 4-Aminoantipyrin

G 1,OM Glucose

D 25 EiM 3,5-Dichlor~4-h;ydroxybenzol-

sulfonat in Reagens A

E 1,2 mg/ml Eeerrettich-Peroxidase in

.Reagens A

P 30 % (Masse/VoI) Rinderserumalbumin

(Research Froducts Division, Miles Laboratories, Inc., Ellchart, In., USAi)

G markierte konjugierte IgG-P AD-Ver-

bindung in lösung von oben aufbewahrt

H Apoglucoseoiidase

Ϊ Kaninchenantiserum gegen Menschen-IgG

(bezogen von Benring Diagnostics, Soinerville, New Jersey, USA)

J Standards - IgG des Menschen in Reagens

A, in festgelegten Mengen

Reaktionsmittelgeniische wurden folgendermaßen hergestellt:

Gemisch Nr. 1 - 180 _;ul Reagens A, 20/al Reagens B, 100 /al Reagens

D und 5 yul Reagens G (5,4/utä)

Gemisch Nr₅, 2 - 0,3 ^l Gesamtmenge verschiedener Verhältnisse,

die die in der folgenden Tabelle 6 angegebene Menge von Reagens I enthält, wobei den Rest der Menge Reagens A bildet.

Gemisch ITr. 3 - 80/ul Reagens D, 50 /ul Reagens E, 33/ul Reagens

P. 137/al Reagans A und 1,6 /ul Reagens H (4,2 /al PAD-3inaungs3fcellen)

Zu 300 /al von Gemisch'Kr_c 1 wurden 300 /ul Gemisch Nr. 2 und 300/ul

. 2t 3770

Reagens A in einzelnen Reaktionsküvetten gegeben. Nach einer Inkubationszeit von mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden zu jeder Reaktion 300 -pl Gemisch. Nr. 3 gegeben. Nach einer weiteren Inkubationszeit von JO Minuten bei 20 G wurde das Absorptionsvermögen bei 520 nm in jeder Küvette gemessen. Die Ergebnisse waren folgendermaßen:

Tabelle 6

Zugesetzte Menge i^ntiserum Absorptionsvermögen

zur Darstellung von Gemisch Hr. 2 (520 nm) (F:TtinktionI

0 0,859

2 0,750

4 0,602

6 0,494

8 0,445

10 0,415

12 0,408

14 0,392

16 0,375

Die Ergebnisse zeigen, daß die durch die markierte konjugierte PAD-Verbindung erzeugte Glucoseosidase-Aktivität gegen IgG mit zunehmender Antikörpermenge abnimmt.

C. Konkurrenz-Bindungsanalysen

Diese Reaktionen wurden unter Verwendung der in Teil B oben beschriebenen Reaktionsmittel durchgeführt. Bestimmte Mengen Menschen-IgG in 300 xil-Portionen von Reagens A wurden mit Gemisch Nr. 1 in einzelnen Reaktionsküvetten vereinigt. Dann wurde jedem Reaktionsgemisch ein Gemisch auf 12 All Reagens I und 288 /Ul Reagens- A' zugesetzt, Nach 10 Minuten wurden 300 /ul Gemisch Nr.3 zugegeben und die Reaktionsgemische wurden 30 Minuten lang bei 20 G inkubiert* Nach Ablauf dieses Zeitraumes wurde das Absorptionsvermögen bei 520 nm in jeder Küvette gemessen. Ss wurden folgende Ergebnisse erzielt s . · .

2137 7

Tabelle 7

Zugegebene Menge .Absorptionsvermögen

M en sehen- IgG (/ng) (520 nm) (Extinktion)

0" 0,579

4 0,653

8 0,751

12 0,844

16 0,986

24 1,06

Damit ?jurde demonstriert, daß durch die Erfindung eine spezifische Bindungsanalyse für die Bestimmung des Liganden mit hoher Molekülmasse - Menschen-IgG - in flüssigem Medium zur Verfügung gestellt wird.

Reaktionsmittel

Fachleuten der betreffenden Gebiete ist aus der vorstehenden Beschreibung und den Beispielen bekannt, daß die zur Durchführung der vorgelegten lüethode verwendeten Reaktionsmittel eine Vielfalt von Formen aufweisen können. Solche Reaktionsmittel können insbesondere in Form einer einheitlichen Testzusammensetzung vorliegen, z. B. als entsprechender Feststoff oder als Flüssigkeit. Zur Verdeutlichung umfaßt eine Form einer (Pestzusaainensetzung zur erfind ungsge maß en Bestimmung eines Liganden; (a) eine markierte konjugierte Verbindung einer organischen, an den Liganden oder ein Bindungsanalogon dafür gekoppelte prosthetische Gruppe, (b) einen spezifischen Bindungspartner des Liganden und (c) ein üpoenzym, das sich mit der prosthetischen Gruppe zur Erzeugung eines Holoenzyms vereinigen kann. Eine derartige Testzusannnenseüzung kann auch Reagenzien zur Messung der Aktivität des Eoloenzyms umfassen, und in Fällen, in denen es wünschenswert und angemessen erscheint, können die markierte konjugierte Verbindung und das jipoenzym in der Form ihres konjugierten Enzymkomplexes vereinigt sein. Natürlich können auch herköisnliche Verdünnungsmittel, Puf~ ferstcffe, Stabilisatoren usw. in der Testzusanmensetzung enthalten, sein.

Das Tesbreaktion.smittel kgnn auch in Fo im einer Test ausrüstung vorliegen, d. h. als verpackte Kombination von Behältern, die die notwendigen Reagenselemente · enthalten. Zur Veranschaulichung kann eine Form einer Test ausrüstung zur erfindungsgemäßen Bestimmung eines Liganden aus einem oder'mehreren Behältern bestehen mit (a) einer markierten konjugierten Verbindung einer organischen, an den Liganden oder ein Bindungsanalogen dafür gekoppelten prosthetischen Gruppe, (b) einem spezifischen Bindungspartner des Liganden, und (c) einem Apoenzym, das-sich mit der prostheti sehen Gruppe zur Erzeugung eines Holoenzyms vereinigen kann, Eine solche Testausrüstung kann auch in einem oder mehreren verschiedenen Behältern Heaktionsmitbel.zur Messung der aktivität des Holoenzyms aufweisen, und falls es erwünscht oder angemessen ist, können die markierte konjugierte Verbindung und das ,Apoenzyra in Form ihres konjugierten Enzymkomplexes vereinigt sein. Ih einer Ausführungsform umfaßt eine Sestausrüstung mindestens zwei einzelne Behälter, von denen der eine die markierte konjugierte Verbindung und wahlweise Reaktionsmittel zur Messung der Holoenzym-üktivität und der andere den Bicdungspartner und das Apoenzym enthält. Natürlich können in der (Castausrüstung auch noch andere im Fachgebiet bekannte Seaktionsmittel enthalten sein, die vom kommerziellen und Verbraucherstandpunkt wünschenswert erscheinen mögen wie Puffer, Verdünnungsmittel, Standards und dergleichen« . .

7 ί; ii^r·' iü i

Claims (34)

1. GZ: 12411 57

   1. Spezifisches Bindungsanalyseverfahren zur Bestimmung eines Ligariden in einem flüssigen Medium, gekennzeichnet dadurch, daß es folgende Schritte umfaßt: Zusammenbringen eines flüssigen Liediums mit

   (a) Reaktionsmittel, das ein markiertes konjugiertes Radikal enthält, das eine' markierte Komponente aus einem Rest einer organischen prosthetischen Gruppe· sovjie eine Bindekomponente aufweist, wobei durch das Zusammenbringen ein Bindungsreaktionssystem entsteht, in dem eine gebundene Spezies und. eine freie Spezies des markierten konjugierten Radikals gebildet werden, wobei der Anteil von markierter Komponente in den beiden gebildeten Spezies von der Anwesenheit des Liganden in dem flüssigen Hedium abhängig ist, und

   (b) einem Apοenzym, das sich mit der prosthetischen Gruppe zur Bildung eines Holoenzyms vereinigen kann, und

   Bestimmung des Anteils markierter Komponente in den beiden gebildeten Spezies durch Llessen der Holoenzymaktivität in der gebundenen Spezies oder freien Spezies oder beiden.

   2» Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das flüssige Liedium nach dem Kontakt mit dem Reaktionsmittel mit dem Apοenzym zusammengebracht wird.
2. 5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das flüssige Liedium im wesentlichen gleichzeitig mit dem Reaktionsmittel und dem Apoenzym zusammengebracht wird.

   4, Verfahren nach Punkt 3> gekennzeichnet dadurch, daß das Reaktionsmittel und das Apoenzym mit dem flüssigen Medium als getrennte Substanzen zusammengebracht werden,

   5· Verfahren nach irunkt 3» gekennzeichnet dadurch, daß das Reaktionsmittel. und das Apoenzym mit dem flüssigen Medium so zusammen gebracht werden, daß als markierte Komponente in dem -markierten konjugierten Radikal ein Rest eines konjugierten Enzyms, das aus der mit dem Apoenzym vereinigten prosthetischen Gruppe gebildet wird, angewendet wird.

   6» Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Bindungskonstante für die Vereinigung des Apoenzyms und der prosthetischen Gruppe, deren Rest in dem'markierten konjugierten Radikal enthalten ist, über etwa 10° jiiol" beträgt.

   7» Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Bindungskonstante für die Vereinigung des Apoenzyms und der prosthetischen Gruppe, deren Rest in dem-markierten konjugierten Radikal enthalten ist, über etwa 10 Ivlol beträgt.

   8«, Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Rest der prosthetischen Gruppe um einen Rest von IFlavinadenindinucleotid, Flavinmononucleotid oder Harn handelt.

   W ΙΟ/ /

   9· Verfahren naoii Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß
   es sich bei dem Rest der prosthetischen Gruppe um einen Rest von Flavinadenindinucleotid oder Kam handelt und
   bei denr Apoenzya, mit dem er sich vereinigt, um Apoglucoseoxidase bzvr. ^poperozidase.

   10» Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Hast der prosthetischen Gruppe um einen. Eest von ü'lavinadenindinucleotid handelt.

   11· Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Apoenzym, mit dem sich der Rest der prosthetischen Gruppe vereinigt, um Apoglucoseoxidase handelt.

   12· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem zu bestisiiaenden Liganden um ein Antigen oder Antikörper dafür; ein Hapten oder einen Antikörper dafür; oder ein Hormon, Vitamin, Metabolit oder eine
   Droge, oder einen Rezeptor oder eine Bindungssubstanz dafür handelt»

   13· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Liganden um ein Hapten mit einer zwischen 100 und 1000 liegenden Molekülmasse handelt.

   14· Spezifisches Bindungsanalyseverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium, gekennzeichnet dadurch, daß es folgende Schritte umfaßt:

   .'-«- 21377

   Zusammenbringen des flüssigen Mediums mit Reaktionsmittel, das (1) ein markiertes konjugiertes Radikal, das eine an den Liganden oder ein Bindungsanalogon dafür gekoppelte prosthetische Gruppe aufweist, und (2) einen spezifischen Bindungspartner des Liganden enthält, wobei durch dieses Zusammenbringen eine Bindungsreaktion entsteht, in der gebildet werden:

   eine gebundene Spezies des markierten konjugierten Radikals, worin der. gekoppelte Ligand oder das Analogon in dem konjugierten Radikal an den Bindungspartner gekoppelt ist, und

   eine freie Spezies des markierten konjugierten Radikals, worin der gekoppelte Ligand oder das Analogon in dem konjugierten Radikal nicht an den Bindungspartner gebunden ist,

   wobei der Anteil der prosthetischen Gruppe in den beiden gebildeten Spezies von der Anwesenheit des Liganden in dem flüssigen üedium abhängig ist:

   Zusammenbringen der gebildeten gebundenen Spezies und der freien Spezies oder beider mit einem Apoenzym, das sich mit der prosthetischen Gruppe zur Bildung eines Holoenzyms vereinigen kann; und

   Bestimmung des Anteils der prosthetischen Gruppe in den .beiden gebildeten Spezies durch !'.lessen der Eoloenzyraaktivitat in den Spezies, mit denen das Apoenzym zusammengebracht wurde·

   15« Verfahren nach Punkt 14, gekennzeichnet dadurch, daß die Fähigkeit der gekoppelten prosthetischen· Gruppe in dem markierten konjugierten Radikal, sich mit dem Apoenzym zur Erzeugung eines Produktes mit iloloenzymaktivität zu vereinigen, verschieden ist, wenn das markierte konjugierte Radikal in der gebundenen Spezies vorhanden ist als wenn es in der freien Spezies vorhanden 1st«.

   1 377
3. 16. Verfahren nach Punkt 15 in dor homogenen Form, gekennzeichnet dadurch, daß das Apoenzym mit der gebundenen Spezies und der freien Spezies vereinigt zusammengebracht wird und die Holoenzymaktivität darin gemessen wird»

   17· Verfahren nach punict 14 in der heterogenen Form, gekennzeichnet dadurch, daß die gebundene Spezies und die freie Spezies physikalisch getrennt sind, das Apοenzym, mit einer davon zusammengebracht wird und die Holoenzymaktivität darin gemessen wird.
4. 18. Verfahren nach den Punkten 14».»17, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der prosthetischen Gruppe um Flavinadenindinucleotid, Flavinmomonucleotid oder Eäm handelt»

   19· Verfahren nach den Punkten 14...17» gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der prosthetischen Gruppe am Flavinadenindinucieotid oder Harn handalt und bei dem Apοenzym, mit dem sie sich vereinigt, um Apoglucoseoxidase bzw. Apoperoxidase.
5. 20. Verfahren nach Punict.14, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der prosthetischen Gruppe um Flavinadenindinucleotid handelt. V
6. 21. Verfahren nach Punkt 20, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Αροenzym, mit dem sich die prosthetische Gruppe vereinigt, um Apoglucoseoxidase handelt.

   -«- 213770
7. 22. Verfahren nacli Punkt 21, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Liganden um ein JOdthyroninthyroiähorraon handelt.

   23· Verfahren nach Punkt 14·, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem zu bestimmenden Liganden um ein Antigen
   oder ein Hapten und bei dem Bindungspartner·um einen Antikörper dafür handelt.
8. 24. Verfahren nach Punkt 23, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei deia Liganden um ein Hapten mit einer zwischen 100 und 1000 liegenden ilolkülmasse handelt.
9. 25. Spezifisches Bindungsanalyseverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen IvIedium, gekennzeichnet dadurch, daß es folgende Schritte umfaßt:

   Zusammenbringen des flüssigen Mediums mit -Reaktionsmittel, das (1) ein markiertes konjugiertes Radikal, das eine an den Liganden oder ein Bindungsanalogon dafür gekoppelte
   organische prosthetische Gruppe aufweist, (.2) einen
   spezifischen Binäungspartner des Liganden und (3) ein
   Apoenzym,. das sich mit der prosthetischen Gruppe zur
   Bildung eines Hoioenzyms vereinigen kann, enthält, wobei dieses Zusammenbringen eine Bindungsreaktion erzeugt, in der gebildet werden

   eine gebundene Spezies des markierten konjugierten
   Radikals, in der der gekoppelte Ligand oder das
   Analogon in dem konjugierten Radikai an den Bindungspartner gebunden ist, und

   eine freie Spezies des markierten konjugierten Radikals, in der der gekoppelte Ligand oder das Analogon in dem konjugierten Radikal nicht an den Bindungspartner gebunden ist,

   - a- 21 37/0

   wobei der Anteil der prosthetischen Gruppe in den beiden gebildeten Spezies von der Anwesenheit des Liganden in dem flüssigen Medium abhängig ist; und

   Bestimmung des Anteils der prosthetischen.Gruppe in den beiden gebildeten Spezies durch Messen der Koloenzymaktivität in der gebundenen Spezies oder der freien Spezies oder beiden.
10. 26. Verfahren nach Punkt 25, gekennzeichnet dadurch, daß die Fähigkeit der gekoppelten prosthetischen Gruppe in dem markierten konjugierten Radikal, sich mit dem Apoenzym zur Erzeugung eines Produktes mit Holoenzymaktivität zu vereinigen, verschieden ist, wenn sich das markierte konjugierte Radikal in. der gebundenen Spezies als wenn es sich in der freien Spezies befindet.
11. 27. Verfahren nach Punkt 26 in der homogenen Porm, gekennzeichnet dadurch, daß die Holoenzymaktivität ohne Trennung der gebundenen Spezies und der freien Spezies gemessen wird.
12. 28. Verfahren nach Punkt 25 in der heterogenen Porm, gekennzeichnet dadurch, daß die gebundene Spezies und die freie Spezies physikalisch getrennt sind und die Holoenzymaktivität in einer dieser gemessen wird.
13. 29. Verfahren nach den Punkten 25...28, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der prosthetischen Gruppe um Plavinadenindinucleotid, Plavinmononucleotid oder Harn handelt.

    30· Verfaiiren nach den Punkten 25· ··28, gekennzeichnet
    dadurch, daß es sich bei der prosthetischen Gruppe um
    i'lavinadenindinucleotid oder Harn handelt und bei dem.
    Apoenznym, mit dem sie sich vereinigt, um Apoglucoseoxidase bzw. Apoperoxidase.

    31· Verfahren nach Punkt 25, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der prosthetischen Gruppe um üflavinadenindinucleotid handelt»

    32» Verfahren nach Punkt 3I, gekennzeichnet dadurch, daß es. sich bei dem Apοenzym, mit dem sich die prosthetische Gruppe vereinigt, um Apoglucoseoxidase handelt.

    33» Verfahren nach Punkt 32, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Liganden um ein iodthyroninthyroidhormon handelt♦

    Verfahren nach Punkt 25> gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem zu "bestimmenden Liganden um ein Antigen
    oder ein Hapten und bei dem Bindungspartner um einen
    Antikörper dafür handelt.

    35» Verfahren nach Punkt .?4, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Liganden um ein Hapten mit einer zwischen 100 und 1000 liegenden Llolekülmasse handelt.

    36» Spezifisches Bihdungsanalyseverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen läedium, gekennzeichnet dadurch, daß es folgende Schritte umfaßt:

    - 69- di 47

    Zusammenbringen des flüssigen LIediums mit Reaktionsmittel, das (1) ein markiertes konjugiertes Radikal, das (a) einen Komplex einer organischen prosthetischen Gruppe und eines 'ApοQiYAjas, die sich zur Bildung eines Holoenzyms vereinigen, und (d) den Liganden oder ein rdndungsanalogon dafür, durch die prosthetische Gruppe an den Komplex gekoppelt, aufweist, und (2) einen spezifischen Bindungspartner des Liganden enthält, wobei durch das Zusammenbringen eine Bindungsreaktion entsteht, in der gebildet werden:

    eine gebundene Spezies des markierten konjugierten Radikals, in der der gekoppelte Ligand oder das Analogon in dem konjugierten Radikal an den Bindungspartner gekoppelt ist, und

    eine freie Spezies des markierten konjugierten Radikals, in der der gekoppelte Ligand oder das Analogon in dem konjugierten Radikal nicht an den Bindungspartner gebunden ist

    wobei der .anteil des !Compexes in den beiden gebildeten Spezies von der Anwesenheit des Liganden in dem flüssigen Medium abhängig ist, und

    Bestimmung des Anteils durch Hessen der Holoenzymaktivität in der gebundenen Spezies oder der freien Spezies oder beiden.

    57* Verfahren nach Punkt p6, gekennzeichnet dadurch, daß die lioloenzymaktivität des Komplexes in dem markierten konjugierten Radikal verschieden ist, wenn das markierte konjugierte Radikal in der gebundenen Spezies vorhanden ist als wenn.es in der freien Spezies vorhanden ist.

    ^6. Verfahren nach Punkt 37 in der homogenen Form, gekennzeichnet dadurch, daß die lioloenzymaktivität in der gebundenen und freien Spezies vereinigt gemessen wird.

    137 7

    39·' Verfahren nach. Punkt 3o in der heterogenen Form, gekennzeichnet dadurch, daß der Komplex Koloenzymaktivität besitzt und daß die gebundene üpezies und die freie Spezies physikalisch getrennt und die Holoenzyniaktivität in einer davon geraessen wird.
14. 40. Verfahren nach den Punkten 36...39, gekennzeichnet
    dadurch, daß es sich bei der prosthetischen Gruppe um
    Iflavinadenindinucleotid oder Harn handelt und bei dein.
    Apoenzym, mit dem sie sieh vereinigt, um apoglucosoxidase bzw. Apoperoxidase.
15. 41. Verfahren nach den Punkten 36«·· «39, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der prosthetischen Gruppe um Flavinadenindinucleotid und bei dem Apoenzym, mit dem sie sich vereinigt, um Apoglucoseoxidase handelt.
16. 42. Verfahren nach Punkt 36, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Liganden um ein Jodthyroninthyroidhormon handelt.
17. 43. Verfahren nach Punkt 36, gekennzeichnet dadurch, daß des sich bei dem zu bestimmenden Liganden um ein Antigen oder Ilapten handelt und bei dem üindungspartner um einen Antikörper dafür.

    44, Verfahren nach Punkt 43, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Liganden-um ein Hapten mit einer zwischen 100 und 1000 liegenden Molekulmasse. handelt.

    21 377
18. 45. Verbesserung bei einem zur .bestimmung eines Liganden in einem flüssigen medium verwenceten rieaktionsiaittel, das ein konjugiertes nadikal mit einer markierten Komponente und einer Bindungsiconioonente aufweist, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der markierten Komponente um den Best einer organischen prosthetischen Gruppe handelt und das Mittel außerdem ein Apοenzym enthält, mit dem sich der liest der prosthetischen Gruppe zur Bildung eines konjugierten Enzymkomplexes vereinigt»

    46, Verbesserung bei einem zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen medium verwendeten Keaktionsmittel, das ein konjugiertes radikal mit einer markierten Komponente und einer Bindungskomponente aufweist, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der markierten Komponente um den liest eines konjugierten Enzyms handelt, das aus dem Best einer organischen prosthetischen Gruppe in Verbindung mit einem isoenzym gebildet vvird, wobei die Bindungskomponente durch die prosthetische Gruppe mit dem Rest des konjugierten Enzyms gekoppelt wird.
19. 47. Reaktionsmittel nach x'unkt 45 oder 45, gekennzeichnet dadurch, daß die Bindungskonstante für die Vereinigung des iipoonzyms und der prosthetischen Gruppe, deren Best in dem markierten konjugierten radikal enthalten ist, über etiia 10° mol beträgt.
20. 43.. ileaktionsmittel nach j^unkt 45 oder 46, gekennzeichnet dadurch, daB der konjugierte Enzyiakompleix Holoenzymaktivitat aufweist.
21. 1.3770

    49· Reaktionsmittel nach Punkt 45 oder 46, gekennzeichnet dadurch, daß es sich "bei der Bin&ungskoraponente in dem markierten konjugierten Radikal um den Liganden oder ein Bindungsanalogon davon'handelt.

    50* Reaktionsmittel nach Punkt 49, gekennzeichnet dadurch, daß der Ligand oder das Analogon dafür und die -prosthetis ehe Gruppe an einer Stelle am Liganden oder dem Analogon, die von seiner spezifischen Bindungsstelle entfernt ist, und ah einer Stelle an der prosthetischen Gruppe, die von ihrer aktiven Bindungsstelle für das Apoenzym entfernt ist, gekoppelt werden.

    51» Reaktionsmittel nach Punkt 45 oder 46, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dein Rest der prosthetischen Gruppe um einen Rest von Flavinadenindinucleotid, Flavinraononucleo· tid oder Harn handelt.
22. 52. Reaktionsraittel nach Punkt 45 oder 46, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Rest der prosthetischen Gruppe um einen Rest von Flavinadenindinucleotid oder Harn handelt und bei dem Apoenzym, mit dem er sich vereinigt, um Apoglucoseoxidase bzw. Apoperoxidase.

    53· Reaktionsniittel nach Punkt 45 oder 46, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Rest der prosthetischen Gruppe um einen Rest von Flavinadenindinucleotid handelt.
23. 54. Reaktionsmittel nach Punkt 53 > gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem üpoenzym, mit dem sich der Rest der prosthetischen Gruppe vereinigt,. uia Aooglucoseoxidase handelt»

    55· Iieaktionsmittel nach Punkt 54, gekennzeichnet dadurch, daß es sicii "bei dein Liganden um ein Jodthyroninthyroidlioriiion handelt*

    56» Keaktionsmittel nach Punkt 45 oder 46, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem zu bestimmenden Liganden mti ein Antigen oder einen Antikörper dafür; ein Ilapten oder einen Antikörper dafür; oder 'ein Hormon, Vitamin, Met about oder eine Droge oder einen Rezeptor oder eine Bindungssubstanz dafür handelt.

    57* Keaktionsiiittel nach Punkt 45 oder 46, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Liganden um ein Ilapten mit einer zwischen 100 und 1000 liegenden Holekülmasse handelt.

    5ü_r Testzusamraensetzung zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen !.!edium, gekennzeichnet dadurch, daß sie enthält: (a) ein markiertes konjugiertes Radikal, das eine an den Liganden oder ein Bindungsanalogon dafür gekoppelte organische prosthetische Gruppe aufweist, (b) einen spezifischen Bindungspartner des Liganden und (c) ein Apοenzym, das sich zur Bildung eines Holoenzyms mit der procthetischen Gruppe vereinigen kann.

    59» "lestzusammensetzung nach Punkt 5S, gekennzeichnet dadurch, daß sie zusätzlich Reaktionsmittel zur Messung der Aktivität des Iioloenzyms enthält.

    60· Testzusamniensetzung nach Punkt 58, gekennzeichnet dadurch, daß das markierte konjugierte Radikal und das Apoenzyo. in i'orn ihres konjugierten iiinzymkomplexes vereinigt sind»

    61· Testzusammensetzung nach Punkt 58₃ gekennzeichnet dadurch, daß die Bindungskonstante für die Vereinigung des
    Apoenzyms und der prosthetischen Gruppe, deren Rest in

    dem'markierten konjugierten Radikal enthalten ist, über

    6 —1

    etY/a 1ü üiol liegt.
24. 62. Testzusammensetzung nach Punkt 58, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Liganden um ein Antigen oder
    ein Ilapten handelt und bei dem Bindungspartner um einen
    Antikörper dafür.

    6j). Test zusammensetzung nach- Punkt 58» gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Rest der prosthetischen Gruppe um einen Rest von i'lavinadenindinucleotid, Flavinmomonucleotid oder Harn handelt. :^:
25. 64. Testzusammensetzung nach Punkt 58, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Rest der prosthetischen Gruppe um einen Rest von Flavinadenindinucleotid oder Harn handelt und bei dem Apoenzyra, mit dem er sich vereinigt, um
    Apoglucoseoxidase bzw. Apoperoxidase.

    65* Testzusammensetzung nach Punkt 5Q> gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dein Rest der prosthetischen Gruppe um einen Rest von Flavinadenindinucleotid handelt.
26. 66. Testzusaromensetzung nach Punkt 65, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Apοenzym, mit dem sich der Rest der prosthetischen Gruppe vereinigt, ura Apoglucoseoxidase handelt.

    67· Testausstattung zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium, gekennzeichnet dadurch, daß sie in einer packungskombination einen oder mehrere Behälter mit folgendem Inhalt aufweist:
    (Ί) einem markiertem konjugierten Radikal einer organischen Gruppe, gekoppelt mit dem Liganden oder einem Bindungs-

    analogon dafür,

    (2) einen spezifischen Bindungspartner des Liganden, und

    (3) ein Apοenzym, das sich zur Bildung eines Holoenzyms mit der prosthetischen Gruppe vereinigen kann.

    66» Testausstattung nach Punkt 67, gekennzeichnet dadurch, daß ein oder mehrere Behälter zusätzlich Heaktionsmittel zur ivlessung der Aktivität des Holoenzyms enthalten.

    69· Testausstattung nach Punkt 67, gekennzeichnet dadurch, daß das markierte konjugierte itadikal und das Ap ο enzym in i'orm ihres konjugierten iinzymkomplexes vereinigt sind.

    70* Testausstattung nach Punkt 67, gekennzeichnet dadurch, daß mindestens zwei einzelne Behälter vorhanden sind, von denen einer das markierte konjugierte Radikal und der andere den Bindungspartner und das Apοenzym enthält.

    71· Testausstattung nach Punkt 67, gekennzeichnet dadurch, daß die Bindungskonstante für die Vereinigung des Apoenzyms und der prosthetischen Gruppe, deren Rest in dem markierten konjugierten Kadikal enthalten ist, über etwa 10° idol beträgt.

    1 37 7 0

    72, Testausstattung nach Punkt 67, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dera Liganden um ein Antigen oder ein liapten und tiei dem Bindungspartner um einen Antikörper dafür handelt,
27. 73. Testausstattung nach Punkt 67, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Rest der prosthetischen Gruppe um einen Rest von Flavinadenindinucleotid, Flavinnononucleotid oder Harn handelt»

    74-· Testausstattung nach Punkt 67, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Rest der prosthetischen Gruppe um einen Rest von Flavinadenindinucleotid oder Harn handelt und bei dem Apοenzym, mit dem er sich vereinigt, um Apoglucoseoxidase bzw. Apoperoxidase.

    75· Testausstattung nach Punkt 67, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Rest der prosthetischen Gruppe um einen Rest von Flavinadenindinucleotid handelt.
28. 76. Testausstattung nach Punkt 75» gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Apοenzym, mit dem sich der Rest der prosthetischen Gruppe vereinigt, um Apoglucoseoxidase handelt,

    77» Markierter Ligana einer prosthetischen Gruppe der Formel:

    Pr-R-L

    gekennzeichnet dadurch, daß Pr'eine organische prosthetische Gruppe ist, R eine Bindungsgruppe ist und L ein spezifisch bindbarer Ligand oder ein ßindungsanalogon dafür ist. - .

    I O / - rf-
29. 78. Markierter Ligand nach Punkt 77, gekennzeichnet dadurch, daß der Ligarid oder das ünalogon dafür und die prosthetis ehe Gruppe an einer Stelle am Liganden oder den Analogon, die von der spezifischen bindungsstelle entfernt ist, und an einer Stelle an der prosthetischen Gruppe, die von ihrer aktiven. Bindungsstelle für ein Apoenzym entfernt ist, gekoppelt sind.

    79♦ Markierter Ligand von konjugiertem Enzym der !formel:

    Apo -Pr-R-L

    gekennzeichnet dadurch, daß Pr eine organische prosthetische Gruppe darstellt, Apo ein Apoenzym ist, das mit der prosthetischen Gruppe zur Bildung eines konjugierten Enzymkomplexes vereinigt ist, R eine Bindungsgruppe ist und L ein spezifisch Toindbarer Ligand oder ein Bindeanalogon dafür ist.

    SO. Markierter Ligand nach Punkt 79, gekennzeichnet dadurch, daß der Ligand oder das Analogon dafür und die prosthetis ciie Gruppe durch die Bindungsgruppe an einer Stelle am Liganden oder .analogon, die von seiner spezifischen Bindungsstelle entfernt ist, und an einer Stelle an der prosthetischen Gruppe, die von ihrer aktiven Bindungsstellung für das .^po enzym entfernt ist, gekoppelt sind»
30. 81. Markierter Ligand nach Punkt 79, gekennzeichnet dadurch, daß der konjugierte Enzymkomplex Holoenzymaktivität auf viel st.
31. 82. Markierter lägand nach Punkt 79, gekennzeichnet dadurch, daß die Bindungskonstante für die Vereinigung des

    6 -1

    Apoerizyms mit der prostxie tischen Gruppe über etvia 10 Mol

    egt.

    2137 7 0

    Ö3· Markierter Ligand nacli Punkt 77 oder 79, gekennzeichnet dadurch, daß es'sich bei der prosthetischen Gruppe um Flavinadenindinucleotid, Flavinmononucleotid oder Harn handelt. "'
32. 84. Markierter Ligand nach Punkt 77 > gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der prosthetischen Gruppe um Flavinadenindinucleotid handelt.

    Markierter Ligand nach Punkt 77» gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Liganden um ein Antigen oder einen imtikörper dafür; ein Hapten oder einen Antikörper dafür; oder ein Hormon,'Vitamin, Metabolit oder eine Droge oder einen Rezeptor oder eine Bindungssubstanz dafür handelt.

    86» Markierter Ligand nach Punkt 85, gekennzeichnet -dadurch, daß es sich bei der ßindungsgruppe um eine Kette mit 1 bis 14- Kohlenstoffatomen und 0 bis 5 Heteroatomen, ausgewählt unter Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel, handelt.

    Q7» idarkierter Ligand nach Punkt 77» gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei.dem bindbaren Liganden um ein Hapten mit einer zwischen 100 und 1000 liegenden Holkülmasse oder ein Analogem dafür handelt.
33. 88. Markierter Ligand nach Punkt 87, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei.Hapten um ein Jodthyroninthyroidhormon handelt. ' ·

    89· Markierter Ligand nach Punkt 88, gekennzeichnet dadurch, daß es sich, bei dem Tliyroidhormon um Thyroxin handelt.

    90· Markierter Ligand nach den Punkten 87··»89, gekennzeichnet dadurch, dai3.es sich bei der prosthetischen Gruppe um Flavinadenindinucleotid handelt»

    91· Markierter Ligand nach Punkt 79, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der prosthetischen Gruppe um E'lavinadenindinucleotid oder Harn und bei dem Apoenzym um Apoglucoseoxidase bzw. Apoperoxidase handelt.

    92· Markierter Ligand nach Punkt 79» gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Liganden um ein Antigen oder einen Antikörper dafür; ein Hapten oder einen Antikörper dafür; ein Hormon, Vitamin, Lietabolit oder eine Droge oder eine Rezeptor oder eine Bindungssubstanz dafür handelt.

    9i» Markierter Ligand nach Punkt 92, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der Bindungsgruppe um eine Kette mit 1 bis 14 Kohlenstoffatomen und- Q bis 5 Heteroatomen, ausgewählt unter Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel, handelt.
34. 94. LIarkierter Ligand nach Punkt 79, gekennzeichnet"dadurch, daß es sich bei dem Liganden um ein Hapten mit einer zwischen 100 und 1000 liegenden üolekülmasse handelt.

    95· lüarkierter Ligand nach Punkt 94, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Liganden um Jothyroninthyroidhormon handelt·

    9<5. Markierter Ligand nach Punkt 95> gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Thyroidhormon um Thyroxin handelt.

    -so,- *

    97· Markierter Ligand nach den Punkten 94..»96, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der prosthetischen Gruppe uiu jflavinadenindinucleotid und dem Ap ο enzym um Apoglucoseoxidase handelt.