DE2656155C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft immunologische Reagenzien bestehend
aus enzymmarkierten Antigenen der allgemeinen Formel II
in der X und Y verschiedene Bedeutungen haben und jeweils ein
Enzym oder ein Antigen bedeuten.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Maleinimidobenzoesäure-N-hydroxysuccinimidestern
(im folgenden auch mit MBS abekürzt) der allgemeinen
Formel I
zur Herstellung der immunologischen Reagenzien der allgemeinen Formel (II).
Die vorgenannten enzymmarkierten Antigene können für enzymimmunologische Bestimmungen
eingesetzt werden.
Unter enzymimmunologischen Bestimmungen sind alle Verfahren zu verstehen,
bei denen enzymmarkierte Antigene für Antigen-Antikörper-
Reatkionen eingesetzt werden.
Das enzymimmunologische Verfahren wird im allgemeinen
so durchgeführt, daß man ein enzymmarkiertes Antigen,
ein nicht markiertes Antigen (d. h. die zu bestimmende Substanz)
und einen Antikörper in einer Pufferlösung einer kompetitiven
Antigen-Antikörper-Reaktion unterwirft, das enzymmarkierte,
an den Antikörper gebundene Antigen abtrennt und das freie enzymmarkierte
Antigen (d. h. enzymmarkiertes Antigen, an das kein Antikörper
gebunden ist) abtrennt und die Menge an nicht markiertem Antigen
(d. h. die zu bestimmende Substanz) aus der enzymatischen
Aktivität des an den Antikörper gebundenen, enzymmarkierten Antigens
oder des freien enzymmarkierten Antigens bestimmt.
Derartige Verfahren sind an sich bekannt und beispielsweise in
den US-PS 36 54 090, 38 39 153 und 38 50 752 beschrieben.
Jedoch haben die zur Durchführung von enzymimmunologischen
Bestimmungen verwendeten bekannten enzymmarkierten Antigene
bestimmte Nachteile. Aus der DE-OS 21 64 768 ist beispielsweise die
Herstellung von Antigen-Enzym-Konjugalen unter Verwendung von
Glutaraldehyd bekannt. Weitere bekannte nicht selektive,
bifunktionelle Bindungsmittel sind die folgenden:
Diese Bindungsmittel enthalten zwei gleiche funktionelle Gruppen,
so daß bei ihrem Einsatz zur Bindung von Enzym und Antigen unerwünschte
Nebenprodukte, wie Antigen-Antigen-Komplexe und/oder
Enzym-Enzym-Komplexe neben dem gewünschten Enzym-Antigen-Komplex
(d. h. dem enzymmarkierten Antigen) entstehen. Demgemäß ist es
schwierig, das gewünschte enzymmarkierte Antigen aus dem Gemisch
dieser drei Produkte zu isolieren. Insbesondere verursacht die
Anwesenheit von Enzym-Enzym-Komplexen Störungen bei enzymimmunologischen
Bestimmungen.
Aufgabe der Erfindung ist es, verbesserte Bindungsmittel zur
Verfügung zu stellen, mit denen Enzyme und Antigene selektiv
aneinander gebunden werden können.
Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß die Ester der allgemeinen
Formel I in der Lage sind, unter sehr milden Bedingungen
Enzyme und Antigene selektiv aneinander zu binden. Ferner wurde
festgestellt, daß sich unter Verwendung von MBS hergestellte
enzymmarkierte Antigene gut in enzymimmunologischen Bestimmungen
einsetzen lassen.
Erfindungsgemäß lassen sich Enzyme und Antigene selektiv unter
Verwendung von MBS der allgemeinen Formel I aneinander binden.
Auf diese Weise ergeben sich die gewünschten enzymmarkierten
Antigene. In der Literatur sind zwar Verbindungen beschrieben,
die strukturell mit MBS verwandt sind (vgl. Helvetica Chimica
Acta, Bd. 58, (1975), S. 531 bis 541). Jedoch ist in dieser
Literaturstelle die Verwendung dieser Verbindungen für enzymimmunologische
Verfahren nicht beschrieben.
Zur Herstellung einer Bindung zwischen einem Enzym und einem
Antigen werden zur Herstellung des erfindungsgemäßen Reagenz folgende Reaktionen durchgeführt:
- (a) Umsetzung eines Antigens oder Enzyms, das eine Aminogruppe, aber keine Mercaptogruppen enthält, mit dem Esterrest von MBS unter Bildung eines Produkts der allgemeinen Formel III in der X die vorstehende Bedeutung hat.
- (b) Umsetzung des Produkts der allgemeinen Formel III mit einem Enzym oder Antigen, das eine Mercaptogruppe enthält und gegebenenfalls auch Aminogruppen aufweist, wobei der Maleinimidorest von MBS im Produkt der allgemeinen Formel III einer Additionsreaktion mit dem Enzym oder Antigen unter Bildung des enzymmarkierten Antigens der allgemeinen Formel II unterliegt.
Somit ist MBS ein ausgezeichnetes bifunktionelles Bindungsmittel
von hoher Selektivität, mit dem Enzyme und Antigene in einer
zweistufigen Umsetzung unter sehr milden Bedingungen aneinander
gebunden werden können. Das erfindungsgemäße Bindungsmittel
unterscheidet sich in seiner Bindungswirkung von den herkömmlichen
Bindungsmitteln.
Als an das Enzym zu bindendes Antigen wird im allgemeinen die
gleiche Substanz verwendet, die gemessen werden soll. Dafür
kommen eine Reihe von Substanzen von hohem Molekulargewicht bis
zu niederem Molekualrgewicht in Frage, beispielsweise die sogenannten
"Hapene".
Das in der ersten Stufe (a) verwendete Antigen enthält keine
Mercaptogrupe, weist aber eine Aminogruppe oder eine in eine
Aminogruppe umwandelbare Gruppe auf. Dabei kann die Aminogruppe
im Antigen bereits ursprünglich enthalten sein oder aber
auch nachträglich chemisch eingeführt werden. Spezielle Beispiele
für Antigene, die ursprünglich eine Aminogruppe, aber
keine Mercaptogruppe aufweisen, sind Hormone, wie Angiotensin I,
Insulin, Jodthyronin und choriales Gonadotropin (HGG), Verbindungen
mit einer Aminogruppe, die in ihrer chemischen Struktur
teilweise der zu messenden Verbindung ähnlich sind, wie α,α′-
Diphenylpropylamin bei der Messung von Diphenylhydantoin, physiologische
Amine, wie Serotonin, Enzyme mit Ausnahme des zur Markierung
des Antigens verwendeten Enzyms, virusspezifische Antigene,
wie Virus-Hepatitis B, Tumorantigene, wie α-Fötoprotein,
Immunoglobuline, wie IgG und IgE. Beispiele für Antigene, die keine
Mercaptogruppe enthalten, in die aber eine Aminogruppe eingeführt
werden kann, sind Haptene, wie Steroidhormone (z. B. Östradiol).
In der ersten Reaktionsstufe (a) können alle Enzyme verwendet
werden, die eine Aminogruppe aber keine Mercaptogruppe aufweisen.
Vorzugsweise werden Enzyme verwendet, die sämtlichen oder einigen
der nachstehend angegebenen Bedingungen genügen:
- (1) Hohe Substratspezifität
- (2) Hohe Stabilität unter den Bestimmungs- und Lagerungsbedingungen
- (3) Hohe Löslichkeit
- (4) Einfaches, empfindliches, rasches und billiges Bestimmungsverfahren
- (5) Abwesenheit von biologischen Flüssigkeiten
- (6) Es sind keine Substrate, Inhibitoren und Störfaktoren aus biologischen Flüssigkeiten vorhanden.
- (7) Die biologische Aktivität bleibt nach der chemischen Umsetzung zur Bindung mit dem Antigen erhalten.
Spezielle Beispiele für entsprechende Enzyme sind Peroxidase,
Glucose-oxidase, alkalische Phosphatase und dergl.
In der zweiten Reaktionsstufe (b) können alle Enzyme verwendet
werden, die eine Mercaptogruppe enthalten. Vorzugsweise genügen
diese Enzyme sämtlichen oder einigen der vorstehend augeführten Verbindungen.
Ein Beispiel dafür ist β-D-Galactosidase. Es können
auch andere Enzyme verwendet werden, in die eine Mercaptogruppe
eingeführt wird. Die Einführung einer Mercaptogruppe in Enzyme
läßt sich beispielsweise gemäß dem in Archives of Biochemistry
and Biophysics, Bd. 96 (1962), S. 605 bis 612, beschriebenen
Verfahren durchführen.
Ferner können in der zweiten Stufe (b) Antigene verwendet werden,
die ursprünglich bereits eine Mercaptogruppe aufweisen. Es
können aber auch Antigene ohne Mercaptogruppen verwendet werden,
in die sich auf chemischem Wege eine derartige Gruppe einführen
läßt. Die Einführung von Mercaptogruppen in Protein- oder Peptid-
Antigene läßt sich nach dem vorstehend angegebenen Verfahren
durchführen. Bei Antigenen mit -S-S-Bindungen im Molekül, wie
Insulin, kann die Mercaptogrupe durch Reduktion der -S-S-Bindung
gebildet werden.
Bevorzgut wird
ein Antigen, das eine Aminogruppe, aber keine Mercaptogruppe
enthält,
in der ersten Stufe an MBS gebunden. Anschließend wird
das erhaltene Produkt in der zweiten Stufe an ein Enzym mit
einer Mercaptogruppe gebunden.
Insbesondere wird ein Antigen von vergleichsweise hohem Molekulargewicht
wie Insulin oder Angiotensin, in der ersten Stufe
an MBS gebunden. Anschließend wird das erhaltene Produkt an
β-D-Galactosidase, die eine Mercaptogruppe enthält, gebunden.
Besonders bevorzugt wird von den
drei Positionsisomeren der Verbindungen der allgemeinen Formel I,
d. h. die o-substituierte Verbindung (o-MBS), die m-substituierte
Verbindung (m-MBS) und die p-substituierte Verbindung (p-MBS),
m-MBS verwendet, da es sich durch eine besondere Stabilität
und eine ausgezeichnete Reaktivität mit der Aminogruppe auszeichnet.
Dabei wird
ein Antigen mit einem vergleichsweise hohen Molekulargewicht,
wie Insulin oder Angiotensin, zunächst an m-MBS
gebunden, wobei das erhaltene Produkt an β-D-Galactosidase,
das ursprünglich eine Mercaptogruppe enthält, gebunden wird.
Die Reaktion gemäß der ersten und zweiten Stufe kann durchgeführt
werden, indem man die Bestandteile in einem Puffer (pH-Wert
6 bis 8) bei 10 bis 40°C, vorzugsweise 20 bis 30°C, 10 bis
180 Minuten, gegebenenfalls unter Rühren, in Berührung bringt.
Diese Umsetzung wird vorzgusweise in Gegenwart einer geringen
Menge eines in Wasser löslichen organischen Lösungsmittels,
wie Tetrahydrofuran, Dioxan, Aceton oder Äthanol, durchgeführt,
wobei aber darauf zu achten ist, daß nicht eine der Komponenten,
wie das Enzym, durch das organische Lösungsmittel inaktiviert
oder denaturiert wird. Das auf diese Weise erhaltene Reaktionsprodukt
kann leicht nach üblichen Verfahren gereinigt werden,
beispielsweise durch Waschen mit einer Pufferlösung, Säulenchromatographie
an dreidimensional vernetztem Dextran,
Membranfiltration.
Das Verhältnis von Enzym zu Antigen im enzymmarkierten Antigen
der allgemeinen Formel II, das auf diese Weise erhalten wird,
hängt von der Art des Enzyms oder des Antigens und insbesondere
von der Anzahl der Amino- oder Mercaptogruppen im Enzym oder
Antigen ab.
Die neuen Verbindungen der allgemeinen Formel I lassen sich leicht
herstellen, indem man eine Maleinimidobenzoesäure der allgemeinen
Formel
mit N-Hydroxysuccinimid der Formel
bei Raumtemperatur 2 bis 3 Stunden in einem organischen Lösungsmittel,
wie Tetrahydrofuran, Dioxan, Benzol oder Aceton, in
Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid,
umsetzt.
Der Antikörper zum enzymmarkierten Antigen läßt sich durch Immunisieren
von entsprechenden Tieren, wie Kaninchen, Pferden, Ziegen,
Meerschweinchen oder Rindern, mit dem entsprechenden Antigen, das
ein Adjuvans enthält, herstellen. Dabei wird der Antikörper im
Serum gebildet. Das auf diese Weise erhaltene antikörperhaltige
Serum kann direkt, d. h. ohne weitere Reinigung, zur enzymimmunologischen
Bestimmung verwendet werden. Es kann aber auch vorher
einer Reinigung unterzogen werden. Ferner lassen sich Antikörper
(Antiseren) gegen Haptene herstellen, indem man die Haptene an
eine hochmolekulare Substanz, wie Albumin, absorbiert oder bindet
und anschließend das Tier mit dem erhaltenen Produkt zusammen mit
einem Adjuvans in entsprechender Weise immunisiert.
Die enzymimmunologische Bestimmung unter Verwendung des erfindungsgemäßen
enzymmarkierten Antigens kann beispielsweise
gemäß den Angaben der US-PS 36 54 090, 38 50 752 und 38 39 153
durchgeführt werden. Dabei wird eine kompetitive Immunreaktion
zwischen dem enzymmarkierten Antigen und einem nicht markierten
Antigen, d. h. der zu bestimmenden Substanz, in bezug auf den
Antikörper in einer Pufferlösung durchgeführt. Anschließend
wird der entstandene enzymmarkierte Antigen-Antikörper-Komplex
durch Zentrifugieren abgetrennt. Eine andere Möglichkeit besteht
darin, dem vorstehend erhaltenen Reaktionsgemisch zur Ausfällung
des enzymmarkierten Antigen-Antikörper-Komplexes einen
zweiten Antikörper zuzusetzen (sogenannte "doppelte Antikörpermethode").
Sodann wird die Aktivität des markierten Enzyms im
Niederschlag oder in der überstehenden Flüssigkeit auf herkömmliche
Weise gemessen. Schließlich wird die Menge an nicht
markiertem Antigen in der Probe berechnet, wobei eine Eichkurve
zugrundegelegt wird, die man bei der entsprechenden enzymimmunologischen
Bestimmung unter Verwendung einer vorbestimmten Menge
eines standardisierten Antigens erhält. Der zweite Antikörper
läßt sich ebenfalls auf die vorstehend beschriebene Weise herstellen,
wobei der erste Antikörper (Immunoglobuline) als Antigen
zur Herstellung des zweiten Antikörpers im Serum eines Tieres,
das nicht zur Herstellung des ersten Antikörpers verwendet
worden ist, eingesetzt wird.
Somit werden bei der enzymimmunologischen Bestimmung unter
Verwendung des erfindungsgemäßen markierten Antigens folgende
wesentliche Bestandteile verwendet:
- (a) Ein enzymmarkiertes Antigen, das durch Bindung eines Enzyms und eines Antigens mit Hilfe von MBS hergestellt worden ist.
- (b) Ein Antikörper gegen das Antigen von (a).
- (c) Ein Substrat für das Enzym von (a).
Gegebenenfalls können folgende Reagenzien verwendet werden:
- (d) Ein zweiter Antikörper.
- (e) Ein von (c) abweichendes Reagenz zur Messung der Enzymaktivität.
Die Reagenzien (a), (b) und (d) können in Form einer Pufferlösung
kühl aufbewahrt werden. Vorzugsweise werden sie aber in
gefriergetrocknetem Zustand aufbewahrt und vor der Verwendung
in Wasser oder in Puffer in Lösung gebracht. Das gefriergetrocknete
Produkt läßt sich herstellen, indem man eine entsprechende
Lösung, die gegebenenfalls mit Stabilisatoren, Füllstoffen
oder dergl. versetzt worden ist, der Gefriertrocknung
unterzieht. Die Aufbewahrung im gefriergetrockneten Zustand
ist im Hinblick auf die Stabilität und leichte Handhabbarkeit
besonders bevorzugt.
Die Beschaffenheit des Reagenz (e) hängt von der Art des Enzyms
von (a) und dem jeweiligen Verfahren ab. Beispiele fafür sind
chromogene Reagenzien, Coenzyme und Mittel zum Abbruch der enzymatischen
Reaktion.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Eine Lösung von 217 g o-, m- oder p-Maleinimidobenzoesäure in
30 ml Tetrahydrofuran wird mit 130 mg N-Hydroxysuccinimid und
224 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Gemisch wird 2
Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der ausgefällte N,N′-Dicyclohexylharnstoff
wird abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem
Druck eingeengt. Der auf diese Weise erhaltene Rückstand
wird säulenchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung
von Chloroform als Elutionsmittel gereinigt. Anschließend
wird das Produkt aus einer Mischung von Diäthyläther und Dichlormethan
umkristallisiert. Man erhält o-, m- oder p-MBS mit den
in Tabelle I angegebenen Eigenschaften.
Von den beiden funktionellen Gruppen in diesen MBS-Verbindungen
ist die Maleinimidogruppe als instabil anzusehen, während die
Estergruppe eine geringere Reaktivität für das Antigen oder
das Enzym aufweist. Die Stabilität und Reaktivität von MBS
wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in den Tabellen II und III
zusammengestellt.
Anmerkung:
Der Zahlenwert in vorstehender Tabelle gibt den Prozentsatz an zersetzten Maleinimidogruppen in MBS an. Dabei werden 10 mMol der zu untersuchenden Verbindung in 20 µl Tetrahydrofuran gelöst und gründlich mit 0,5 ml eines 0,05 m Phosphatpuffers vom pH-Wert 6,0, 7,0, 7,5 bzw. 8,0 oder eines 0,05 m Citratpuffers vom pH-Wert 5,0 vermischt. Das Gemisch wird 20 bzw. 30 Minuten inkubiert.
VerbindungReagens: Lysin
Der Zahlenwert in vorstehender Tabelle gibt den Prozentsatz an zersetzten Maleinimidogruppen in MBS an. Dabei werden 10 mMol der zu untersuchenden Verbindung in 20 µl Tetrahydrofuran gelöst und gründlich mit 0,5 ml eines 0,05 m Phosphatpuffers vom pH-Wert 6,0, 7,0, 7,5 bzw. 8,0 oder eines 0,05 m Citratpuffers vom pH-Wert 5,0 vermischt. Das Gemisch wird 20 bzw. 30 Minuten inkubiert.
VerbindungReagens: Lysin
o-MBS32,6
m-MBS41,0
p-MBS27,5
Anmerkung:
Die Zahlenwerte in der vorstehenden Tabelle geben den Prozentsatz der Acylierung von Lysin mit MBS an. 1 mMol der zu untersuchenden Verbindung wird in 10 µl Tetrahydrofuran gelöst und mit 0,1 ml einer 0,1 m Lysinlösung in 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 vermischt. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 30°C umgesetzt.
Die Zahlenwerte in der vorstehenden Tabelle geben den Prozentsatz der Acylierung von Lysin mit MBS an. 1 mMol der zu untersuchenden Verbindung wird in 10 µl Tetrahydrofuran gelöst und mit 0,1 ml einer 0,1 m Lysinlösung in 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 vermischt. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 30°C umgesetzt.
1 ml 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt
an 6 mg (1 µMol) Schweineinsulin (25,5 U/mg, Produkt der
Firma Schwarz/Mann) wird mit 75 µl einer Lösungvon m-MBS
(1,2 µMol, d. h. 5 mg/ml) in Tetrahydrofuran versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten
bei Raumtemperatur stehengelassen und dabei gelegentlich
gerührt. Das erhaltene Gemisch wird mit 1 ml 1 m Citrat-
Phosphat-Puffer vom pH-Wert 5,0 versetzt. Der gebildete
Niederschalg wird 15 Minuten bei 800 g abzentrifugiert.
Sodann wird der Niederschlag 2mal mit 0,01 m Citratpuffer
(pH-Wert 5,3, 2 ml) gewaschen und unter vermindertem Druck
getrocknet. Man erhält 5,5 mg [m-MBS]-[Insulin].
1 ml 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt
an 500 µg (0,93 nMol) β-D-Galactosidase aus Escherichia coli (Boehringer
Mannheim) wird mit 0,15 ml 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert
7,0 mit einem Gehalt an 151 µg (Maleinimidgehalt 3,6 nMol)
[m-MBS]-[Insulin], das gemäß a) erhalten worden ist, versetzt.
Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.
Sodann wird das erhaltene Gemisch auf eine mit Sepharose 6B
gepackte Säule der Abmessungen 1,8×33 cm aufgesetzt und mit
0,1 m NaCl-0,02 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 eluiert.
Dabei wird das gewünschte [β-D-Galactosidase]-[m-MBS]-[Insulin]-
Produkt von freiem Enzym und von [m-MBS]-[Insulin] abgetrennt.
Die Ausbeute beträgt 80 Prozent, berechnet aus der
enzymatischen Aktivität. Das Molverhältnis von Insulin zu
β-D-Galactosidase im Produkt beträgt etwa 1 : 1,8.
Die Hauptfraktion des [β-D-Galactosidase]-[m-MBS]-[Insulin]-
Produkts (d. h. das enzymmarkierte Antigen), das gemäß b)
erhalten worden ist, wird auf das 200fache mit Wasser verdünnt.
10 µl des verdünnten enzymmarkierten Antigens werden
mit 0,2 ml 0,02 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 (0,1 Prozent
Kaninchenserumalbumin, 1 millimolar MgCl₂, 0,1 m NaCl,
0,1 Prozent NaN₃) versetzt, das Insulin (d. h. nicht markiertes
Antigen, 0 bis 20 µU) und 50 µl Anti-Schweineinsulin-
Meerschweinchen-Antiserum (Dainabot Radioisotope Lab. Ltd.,
Japan; d. h. erster Antikörper) enthält. Das Gemisch wird
16 Stunden bei 4°C stehengelassen und anschließend mit 10 µl
Anti-Kaninchen-7s-γ-Globulin-Anti-Meerschweinchenserum
(d. h. zweiter Antikörper) versetzt. Das Gemisch wird weitere
8 Stunden bei 4°C stehengelassen und anschließend 15 Minuten
bei 800 g zentrifugiert. Die β-D-Galactosidase-Aktivität
in der überstehenden Flüssigkeit oder im Niederschlag wird
gemäß dem in d) erläuterten Verfahren gemessen. Aus den
Werten wird die in Fig. 1 dargestellte Eichkurve gewonnen.
Nach diesem enzymimmunologischen Verfahren läßt sich somit
Insulin in Mengen von 0,5 bis 20 µU messen.
0,15 ml einer Substratlösung (0,1 millimolar 4-Methylumbelliferyl-
β-D-galactosid, 0,02 m Natriumphosphat, 0,1 Prozent
Kaninchenserumalbumin, 1 millimolar MgCl₂, 0,1 m NaCl,
0,1 Prozent NaN₃, pH-Wert 7,0) werden mit 50 µl überstehender
Flüssigkeit versetzt, die nach der Antigen-Antikörper-Reaktion
von c) erhalten worden ist. Das Gemisch wird 60
Minuten bie 30°C stehengelassen.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, den gemäß c) erhaltenen
Niederschlag mit 2 ml 0,05 m Phosphatpuffer vom
pH-Wert 7,0 zu waschen und mit 0,15 ml der vorstehenden
Substratlösung zu versetzen. Dabei wird das Gemisch 30
Minuten bei 30°C stehengelassen.
Die vorstehenden Gemische werden jeweils mit 2,5 ml einer
0,1 m Glycin-NaOH-Pufferlösung vom pH-Wert 10,3 versetzt,
um die Reaktion zu beenden. Das im Reaktionsgemisch je nach
der Aktivität des enzymmarkierten Antigens gebildete 4-Methylumbelliferon
wird mit einem MPF-4-Spektrofluorometer (Hitachi,
Ltd., Japan) bei einer Erregungswellenlänge von 365 nm und
einer Emissionswellenlänge von 448 nm gemessen.
1 ml 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt
an 2 mg (1,4 µMol) Angiotensin I wird zu 0,26 ml einer Lösung
von m-MBS (4,2 µMol, d. h. 5 mg/ml) in Tetrahydrofuran gegeben.
Das Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen,
wobei es gelegentlich geschüttelt wird. Anschließend
wird das Reaktionsgemisch mit 0,5 ml 1 m Citratpuffer vom
pH-Wert 5,0 versetzt und sodann auf eine mit dreidimensional
vernetztem Dextran (Sephadex G-15) geschickte Säule der
Abmessungen 1,9×38 cm gegeben. Die Elution wird mit 0,02 m Citratpuffer
mit einem Gehalt an 0,1 m NaCl durchgeführt.
Dabei wird das gewünschte Produkt [m-MBS]-[Angiotensin I]
von nicht umgesetztem Angiotensin I und m-MBS abgetrennt.
0,5 ml eines 0,05 m Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 mit
einem Gehalt an 500 µg (0,93 nMol) β-D-Galactosidase werden
mit 0,5 ml 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0, der das
gemäß a) erhaltene [m-MBS]-[Angiotensin I] (Maleinimidogehalt:
2,8 nMol) enthält, versetzt. Das Gemisch wird 2
Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Sodann wird es
auf eine mit dreidimensional vernetztem Dextran (Sephadex
G-25) gepackte Säule der Abmessungen 1,8×42 cm aufgesetzt
und mit 0,02 m Phosphatpuffer mit einem Gehalt an 0,1 m NaCl
eluiert. Man erhält eine Hauptfraktion mit einem Gehalt an
[b-D-Galactosidase]-[m-MBS]-[Angiotensin I].
Die Hauptfraktion mit einem Gehalt an [β-D-Galactosidase]-
[m-MBS]-[Angiotensin I], d. h. das enzymmarkierte Antigen,
erhalten gemäß b), wird auf das 1000fache mit Wasser verdünnt.
10 µl verdünntes, enzymmarkiertes Antigen wird mit
0,2 ml des Puffers von Beispiel 2 c), der 0 bis 800 ng
(ng=Nanogramm) Angiotensin I, d. h. nicht markiertes Antigen,
und 50 µl Anti-Angiotensin I-Kaninchenserum, d. h. ersten
Antikörper, enthält, vermischt. Das Gemisch wird 8 Stunden
bei Raumtemperatur stehengelassen und sodann mit 10 µl Anti-
Kaninchen-7s-γ-Globulin-Ziegenantiserum, d. h. zweiter
Antikörper, versetzt. Das Gemisch wird sodann 16 Stunden
bei 4°C stehengelassen und anschließend 15 Minuten bei 800 g
zentrifugiert. Die Enzymaktivität der überstehenden Flüssigkeit
und des erhaltenen Niederschlags wird gemäß Beispiel
2 d) bestimmt. Dabei erhält man die in Fig. 2 abgebildete
Eichkurve zur enzymimmunologischen Bestimmung von Angiotensin
I. Gemäß diesem Verfahren läßt sich also Angiotensin in
Mengen von 5 bis 100 pg (pg=Picogramm=10-12 g) bestimmen.
50 µl einer 0,1 n wäßrigen NaOH-Lösung mit einem Gehalt an
0,5 µMol T₃ (Sigma Chemical Co.) werden mit 1 ml 0,05 m Phosphatpuffer
vom pH-Wert 7,0 versetzt. Die erhaltene Lösung
wird tropfenweise unter Rühren mit 25 µl einer Lösung von
0,5 µMol m-, p- oder o-MBS in Tetrahydrofuran versetzt. Das
Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt und
sodann mit 40 µl 0,2 m Citrat-Phosphat-Puffer vom pH-Wert
4,3 versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird 10 Minuten bei
800 g abzentrifugiert und mit 1 ml 0,05 m Citrat-Phosphat-
Puffer vom pH-Wert 4,3 durch Zentrifugieren gewaschen. Der
so erhalteneNiederschlag wird mit 1 ml 0,05 m Phosphatpuffer
vom pH-Wert 7,0 versetzt und sodann unter Rühren mit 100 µg
(0,19 nMol) β-D-Galactosidase versetzt. Nach 10minütigem
Rühren wird das Gemisch mit 5 ml eines 0,1 m Glycin-NaOH-
Puffers vom pH-Wert 10,3 versetzt. Das Gemisch wird durch
Diaflo PM 30 (Amicon Corp.) filtriert, um nicht umgesetztes
[m-, p- oder o-MBS]-[T₃] oder nicht umgesetztes T₃ zu
entfernen. Der erhaltene Niederschalg wird ferner 2mal mit
0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 (3 ml) gewaschen und
anschließend zu 1 ml 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert
7,0 gegeben. Sodann wird mit 0,5 ml einer 1prozentigen Rinderserumalbuminlösung
versetzt
Die gemäß a) erhaltene Fraktion von [T₃]-[m-, p- oder o-
MBS]-[β-D-Galactosidase], d. h. das enzymmarkierte Antigen,
wird auf das 100fache mit Wasser verdünnt. 10 µl verdünntes,
enzymmarkiertes Antigen werden mit 1 ml einer 0,02 m tris-
HCl-Lösung mit einem Gehalt an 0,9 Prozent NaCl vom pH-Wert
7,0, die 0 bis 50 ng Standard-T₃ und 50 µl T₃-Kaninchenantiserum
(Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), mit Wasser
auf das 100fache verdünnt, enthält, versetzt. Das Gemisch
wird 5 Stunden bei 5°C stehengelassen. Anschließend wird
mit 10 µl Anti-Kaninchen-IgG-Ziegenantiserum (Miles Laboratories
Inc.) versetzt. Das Gemisch wird 16 Stunden bei 5°C
stehengelassen und anschließend 10 Minuten bei 800 g zentrifugiert.
Der erhaltene Niederschlag wird mit 1 ml des vorstehenden
Puffers versetzt. Sodann wird das Gemisch weiter
zentrifugiert. Der Niederschlag wird mit 0,15 ml 0,1 millimolarem
4-Methylumbelliferyl-β-D-galactosid-0,02 m Phosphatpuffer
vom pH-Wert 7,0 versetzt. Das Gemisch wird 30
Minuten bei 30°C stehengelassen. Anschließend wird die β-
D-Galactosidase-Aktivität gemäß Beispiel 2d) bestimmt.
Dadurch erhält man die in Fig. 3 abgebildete Eichkurve.
somit lassen sich 200 pg bis 50 ng T₃ nach diesem enzymimmunologischen
Verfahren bestimmen.
Eine Lösung von 3,2 µMol (1,1 mg/0,16 ml) m-MBS in Tetrahydrofuran
wird mit einer Lösung von 3,2 µMol 3,3-Diphenylpropylamin
in 32 µl Äthanol versetzt. Das Gemisch wird 1
Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend werden 25 µl
des Reaktionsgemmisches mit 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert
7,0 mit einem Gehalt an 100 µg (0,19 nMol) β-D-Galactosidase
gerührt. Das Gemisch wird 10 Minuten stehengelassen und
sodann durch Diaflo PM 30 (Amicon Corp.) filtriert. Der
Rückstand wird 2mal mit 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert
7,0 (3 ml) gewaschen und filtriert. Der dabei erhaltene
Rückstand wird mit 1 ml 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert
7,0 und 0,5 ml 1prozentiger Rinderserumalbuminlösung versetzt.
10 µl des gemäß a) erhaltenen, auf das 10fache verdünnten
Lösung von [Diphenylpropylamin]-[m-MBS]-[β-D-Galactosidase],
0 bis 50 Ng Diphenylhydantoin und 10 µl mit Wasser auf das
20fache verdünntes diphenylacetyliertes Rinderalbumin-
Kaninchenantiserum (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) werden
zu 1 ml einer 0,02 m tris-HCl-Lösung mit einem Gehalt an
0,9 Prozent NaCl vom pH-Wert7,0 gegeben. Das Gemisch wird
5 Stunden bei 5°C stehengelassen. Anschliepend werden 10 µl
Anti-Kaninchen-IgG-Ziegenantiserum zugesetzt. Das Gemisch
wird 16 Stunden bei 5°C stehengelassen und anschließend 10
Minuten bei 800 g zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag
wird mit 1 ml des vorstehenden Puffers unter Zentrifugieren
gewaschen. Anschließend wird die β-D-Galactosidase-Aktivität
gemäß Beispiel 2 d) gemessen. Dabei erhält man die in Fig. 4
abgebildete Eichkurve. Somit lassen sich nach diesem enzymimmunologischen
Verfahren 0,8 bis 100 ng Diphenylhydantoin
bestimmen.
60,6 g Rinderserumalbumin, 272,7 g NaCl, 149,5 g Na₂HPO₄ · 12 H₂O,
29,7 g NaH₂PO₄ · H₂O und 30,3 g NaN₃ werdengründlich vermischt.
Jeweils 5,374 mg werden in 100 braune 15 ml fassende
Flaschen gefüllt. Vor der Verwendung wird der Flascheninhalt
auf ein Endvolumen von 300 ml Wasser aufgefüllt. Die
Lösung weist dann einen Gehalt an 0,2 Prozent Rinderserumalbumin,
0,9 Prozent NaCl, 0,1 Prozent NaN₃ und 0,02 m Phosphorpuffer
(pH-Wert 7,0) auf. (Reagenz A).
0,53 ml der gemäß Beispiel 2 erhaltenen Fraktion mit einem
Gehalt an [β-D-Galactosidase]-[m-MBS]-[Insulin] werden
auf ein Gesamtvolumen von 1060 ml mit Reagenz A (Puffer)
versetzt. Es erfolgt also eine Verdünnung auf das 200fache.
100 braune 15-ml-Flaschen werden mit jeweils 10,5 ml dieses
Gemisches gefüllt (Reagenz B).
30 µl Anti-Schweineinsulin-Meerschweinchenantiserum (37 000
Einheiten des ersten Antikörpers), hergestellt gemäß J. Clin.
Inverst., Bd. 39 (1960), S. 1157, werden mit 222 ml einer 0,5pozentigen
wäßrigen Lösung eines normalen Meerschweinchenserums
versetzt und somit auf das etwa 7400fache verdünnt.
100 braune 15-ml-Flaschen werden mit jeweils 2,2 ml dieses
Gemisches versetzt und anschließend gefriergetrocknet.
Bei der Verwendung wird dieses gefriergetrocknete Produkt
in 11,0 ml Puffer gelöst. Man erhält eine Lösung des ersten
Antikörpers in einer Konzentration von 1 U/0,1 ml (Reagenz C).
Unter 1 U (Einheit) ist die Antikörpermenge zu verstehen,
die bei der Umsetzung des Antikörpers mit 100 pg¹²⁵J-Insulin
mit 50 Prozent des mit 125 J markierten Insulins reagiert.
Jeweils 2,1 ml Anti-Meerschweinchen-IgG-Kaninchenantiserum,
hergestelt gemäß Biochem. J., Bd. 88 (1963), S. 137 werden
in 15 ml fassende braune Flaschen gefüllt und gefriergetrocknet.
Bei der Verwendung wird das gefriergetrocknete Produkt in
10,5 ml Reagenz A (Puffer) gelöst (Reagenz D). 0,1 ml dieser
Lösung weist eine ausreichende Aktivität auf, daß die Antikörperreaktion
mit 0,1 ml Reagenz C (erster Antikörper) abläuft.
100 braune 15-ml-Flaschen werden mit jeweils 1,0 ml
einer Insulinlösung mit einer Konzentration von 640 µU/ml
gefüllt und gefriergetrocknet.
Bei der Verwendung wird das gefriergetrocknete Produkt in
Wasser auf ein Endvolumen von 2,0 ml gelöst. In dieser Lösung
sind 320 µU/ml Insulin enthalten. Diese Insulin-Stammlösung
wird zur Erstellung einer Insulin-Eichkurve jeweils auf das
Doppelte verdünnt (Reagenz E).
63 mg 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactosid, 8679 mg Na₂HPO₄ · 12 H₂O,
1760 mg NaH₂PO₄, 1760 mg Rinderserumalbumin, 1760 mg
NaN₃, 352 mg MgCl₂ und 10,56 g NaCl werden gründlich vermischt.
Jeweils 227 mg dieses Gemisches werden in 100 braune
20-ml-Flaschen gegeben. Bei der Verwendung wird das Produkt
mit Wasser zu einem Endvolumen von 16,0 ml gelöst (Reagenz
F).
Jeweils 20,0 ml eines 1,5 m Glycin-NaOH-Puffers vom pH-Wert
10,3 werden in 100 braune 20 ml Flaschen gefüllt.
Bei der Verwendung wird mit Wasser auf ein Endvolumen von
300 ml verdünnt (Reagenz G).
Auf diese Weise werden 100 Testpackungen hergestellt, die
jeweils 1 Flasche der Reagenzien A bis G (im folgenden als
"Insulin EIA-Testpackung" bezeichnet), die für 100 Bestimmungen
ausreichen, erhalten.
Bei der Verwendung dieser Insulin EIA-Testpackung für die
enzymimmunologische Bestimmung von Insulin wird folgendermaßen
vorgegangen:
Ein Gemisch aus 0,5 ml Reagenz A (Puffer), 0,1 ml Reagenz B
(enzymmarkiertes Antigen), 0,1 ml Reagenz C (erster Antikörper)
und der zu untersuchenden Probe oder einer entsprechenden
Menge einer Standard-Insulinlösung wird 24
Stunden bei 4°C inkubiert. Das erhaltene Gemisch wird mit
0,1 ml Reagenz D (zweiter Antikörper) versetzt. Das Gemisch
wird 8 Stunden bei 4°C inkubiert und anschließend 15 Minuten
bei 800 g zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wird mit
2,0 ml Reagenz A (Puffer) unter Zentrifugieren gewaschen.
Anschließend wird die Enzymaktivität gemäß Beispiel 2 d)
gemessen.
Die Insulinkonzentration in den Seren von 54 Probanden,
die offensichtlich gesund sind, wird unter Verwendung der
gemäß Beispiel 6 hergestellten Insulin EIA-Testpackung und
einer handelsüblichen Insulin-Testpackung (Insulin RIA-Testpackung,
Handelsbezeichnung der Dainabot Radioisotope Lab.,
Ltd., einer Testpackung zur Messung von Insulin nach einem
radioimmunologischen Verfahren) bestimmt. Die Ergebnisse sind
in Fig. 5 zusammengestellt. Aus Fig. 5 geht hervor, daß die
nach beiden Verfahren bestimmten Insulinkonzentrationen gut
korreliert sind (Korrelationskoeffizient=0,92).
Claims (4)
1. Immunologisches Reagenz für enzymimmunoligsche Bestimmungen
der allgemeinen Formel II
in der X und Y verschieden sind und jeweils ein Enzym
oder in Antigen bedetuen.
2. Immunologisches Reagenz nach Anspruch 1 mit der folgenden
Formel IIa
in der X und Y die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1
haben.
3. Verwendung einer Verbindung mit der allgemeinen Formel I
zur Herstellung eines immunologischen Reagenzes gemäß
Anspruch 1.
4. Verwendung einer Verbindung mit der allgemeinen Formel Ia
zur Herstellung eines immunologischen Reagenzes gemäß
Anspruch 2.
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D2 | Grant after examination | ||
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8328 | Change in the person/name/address of the agent |
Free format text: DERZEIT KEIN VERTRETER BESTELLT |
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8328 | Change in the person/name/address of the agent |
Free format text: TAUCHNER, P., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT. HEUNEMANN, D., DIPL.-PHYS. DR.RER.NAT. RAUH, P., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT. HERMANN, G., DIPL.-PHYS. DR.RER.NAT. SCHMIDT, J., DIPL.-ING. JAENICHEN, H., DIPL.-BIOL. DR.RER.NAT., PAT.-ANWAELTE TREMMEL, H., RECHTSANW., 8000 MUENCHEN |