JPS60183557A - 標識メタロチオネイン及びこれを用いたメタロチオネインの測定法 - Google Patents
標識メタロチオネイン及びこれを用いたメタロチオネインの測定法Info
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- JPS60183557A JPS60183557A JP59039649A JP3964984A JPS60183557A JP S60183557 A JPS60183557 A JP S60183557A JP 59039649 A JP59039649 A JP 59039649A JP 3964984 A JP3964984 A JP 3964984A JP S60183557 A JPS60183557 A JP S60183557A
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/534—Production of labelled immunochemicals with radioactive label
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
技 術 分 野
本ざt明は標識メタロチオネイン並びにこれを用いたメ
タロチオネインの免疫学的in’l定方法及び該測定に
利用するキラl〜に関している。 背 円 技 (l″i 近年医学の進歩と共に、種々複雑な病気の診断、治療等
が可能になってきた。その反面例えば鉱工業等の発展に
伴う公害等より新たに各nの難治性疾病が生まれてぎて
いる。そのひとつに重金属汚染による重金属中毒症があ
り、該疾病の冶掠1う至予防法の確立、そのための基礎
ともなる該疾病の診断法乃至これに伴う技術の確立が斯
界7:要望されている。しかして生体は木来上記車金属
の毒性を中和する作用(毒性の発現をIIJI止する作
用)を右(る物質(メタロチオネイン)を保有すること
が知られテイル[5cicncc、 Vol、 214
。 805〜807 (1981) 、 Nord 、 z
yc+。 Tidskr 、、45.76〜82 (1964)]
。 該メタロチオネインとは分子量が1万たらずで、全組成
アミノ酸中的1/3がシスティン残基であり、重金属例
えばカドミウム、銅、亜鉛、水銀等どの新和力が非常に
強い低分子@蛋白質であり、これは生体内への上記重金
属の導入により誘導(生合成)され、上記導入に伴い特
に肝臓、腎臓を中心にぞの量が増加し、血中′ir5度
も増加する[ 、) 、B、C,、vol 236.
No 9. 2435−2442 (1961)、蛋白
質核酸酵素、vo125、No 8.46−61 (1
980)及び現代化学第40−49頁(1980年3月
)]。従って生体内の上記メタロチオネインaを正確に
測定することができれば、前記重金属中毒症の診断が可
能となり、惹いてはその治魚法も確立できると考えられ
る。かかる観点及び他の観点から、従来よりメタロチオ
ネインのmll定法としては、例えば吸光度からメタロ
チオネインの金属間の特有な結合を測定する方法、35
3−システィンのとり込みによって得られるS H基を
定量する方法、インごボにて1°9CdCQ2投与にJ
:り得られる標識メタロチオネインを標識抗原として利
用する方法及びポル1〜ンハンター試薬により0識抗原
を作成しこれを用いる免疫反応を利用する方法等が種々
提案されている。しかしながら+!2察された測定法は
いずれも尚潜足できるものではなく、その感度、精度、
再現性、試薬の調製の煩雑性等において問題があった。 本発明者らも上記メタロチオネインが抗原性を有する蛋
白質であることに着目し、免疫反応(抗原−抗体反応)
を利用して該メタロチオネインの測定を行なう方法を確
立すべく鋭小研究を単ねた。 その結果、特定の結合試薬を用いてメタロチオネインと
チロシンとを結合させ且つこのチロシンを放射性沃素で
標識化して標識メタロチオネインを製造するに成功する
と共に、かくして得られる軒識メタロチオネインを標識
抗原とづる時には、検体中の1ffiのメタロチオネイ
ンをも、高感度で再現性J:り正確に定nできることを
見い出した。本発明はこの新しい知見に基づいて完成さ
れたしのである。 発明の(R成 本発明はメタロチオネインに一般式 で表わされる結合試薬を介してチロシンが結合されてお
り、該チロシンが放射性沃素により標識されていること
を特徴とする標識メタロチオネイン並びにこれを用いて
メタロチオネインをラジオイムアッセイにより測定する
方法及び該測定のためのキラ1−に係る。 以下、本発明の標識メタロチオネインを、その製法によ
り詳述する。 本発明の標識メタロチオネインの製造において、メタロ
チオネインとしては、公知の各種起源のメタロチオネイ
ンをいずれも利用できる。椙造解析された該メタロチオ
ネインとしては、ヒ1〜及び伯の哺乳類例えばウマ、ウ
シ、ブタ、ウリーギ、ラツ1・、マウス等からの夫々二
つの主分子秤があり、他にニワ1〜りやススメ等の鳥類
、キンジョ等の魚類、貝グ1、軟体動物、芹類、カビ類
からのメタロチオネインも知られている。之等のうちで
曲孔動物のメタ[二1ヂオネインが好ましい。上記各f
I罎のメタ1]ヂオネインは、公知の方法により分雅採
取りることができる。より有利には例えばIIi乳動物
のメタロチオネインは、起源動物に重金風を投与し、こ
れにより誘導され血液中に増加されるメタロチオネイン
を、該メタロチオネインの性質を利用した各行分離手段
により分子■される。より詳細には、例えばラツI・−
メタロチオネインはラッl〜の腹腔内に塩化カドミウム
等の重金風を投与し、肝臓を摘出後9’A ’CIアン
モニウム水溶液等を加えホモシネ−1〜し、次いでよ消
を80℃で1分間加熱した後、4°Cまで冷却してセフ
ァデックスG〜75(ファルマシア社)及びDEハ1F
−セファデックスく同」]社)で精製することにより得
られる[T mmuno−cl+emistry、 1
5 、857<1978> 1 。 上記メタロチオネインとチロシンどの結合反応において
は結合試薬として上記一般式(I)で表わされる特定の
結合試斧を用いることが特に重要である。該結合試薬は
公知であり[Cb6m。 PI+arm、 Bull、、 29. ’1130
(1981) 参照]、一部ピアス社(Pierce)
より市販されており、また文献[T 、 K itag
awa他、J。 Biochem、 (Tokyo> 79. 233
(1976) ]に記載の方法に従い、アミノカルボン
酸とマレイミド誘導体との反応物に、N−ヒドロキシザ
クシンイミドを反応さけることにより容易に製造できる
。上記一般式(I>の結合試興に含まれる代表的化合物
としてはm−マレイミドベンゾイル−N−ヒト[」キシ
ザクシンイミドエステル(以下rMBsJという)を例
示できる。 上記結合試薬を用いてメタロチオネインとチロシンとを
結合させる方法は、通常の方法に従い予めチロシンと結
合試薬とを反応させた後、得られる反応物にメタロチオ
ネインを結合させる方法によるのが好ましい。上記チロ
シンと結合試薬どの反応は、例えばアルカリ水溶液又は
リン酸緩暫液、ホウ酸塩tg′ffJ液等のアンモニア
及びアミノ丼を含有しない通常の各杆紡衝液中、I)H
7,O〜9.0の条件及び約10〜4.0’Cの温度下
に、通常約10分〜10時間、一般には約10〜30分
間を要して行なわれる。チロシンに対する結合試薬の使
用割合は、適宜決定されるが、通常約4〜10倍モル量
とするのが望ましい。 かくして得られるチロシン−結合試薬結合物(以下、r
MB−Tyr−1という)は、常法に従い反応系より甲
部することもできるが、甲離覆ることなく引き続く反応
に供づ−ることもてきる。上記中部手段としては、例え
ば抽出、分配、カラムクロマトグラフィー等の通常の弔
頗!′i¥製手段を採用できる。 上記反応に引ぎ続くメタロチオネインと上記結合物MS
−Tyrとの反応は、例えば水溶液、生理食塩水もしく
はl’lH6〜8の通常の緩衝液中、好ましくはpl」
7付近の緩衝液中で、0〜40℃、好ましくは室温付近
で、好ましくは窒素気流中で行なわれる。該反応は通常
1〜24時間稈時間一般には約2〜3時間で完結する。 メタロチオネインに対するM S−T yrの使用割合
は、通常約5〜10倍モル量の範囲で選択される。緩衝
液としては、前記反応で用いたものと同じものを使用で
きる。 かくして得られるチロシン−結合試薬−メタロチオネイ
ン反応物(以下rMT−Tyr−lという)は、例えば
抽出、分配、カラムクnマドグラフィ〜、透析等により
単離箔製される。このM T〜Tyrはメタロチオネイ
ン1モルに対しチロシンが1〜3モル等角、好ましくは
1モル等C結合したものである。 本発明の標識メタロチオネインは、上記により得られる
MT−TVrに放射性沃素を導入して標識することによ
り製造される。該放gAft沃素の導入は、通常の方法
例えばクロラミンTを用いる酸化的ヨード化法[W、
M、 Hunter and F、 c。 Greenwood: Nature 、 194 、
495(1962) 、Biocl+em、 J、 、
89.114゜(1963)参照1等にJ:り行なう
ことかできる。 該方法は具体的には、適当な溶媒例えば0.2Mリン酸
緩衝液(p H=7.4)等のrd媒中、クロラミンT
の存在下室温付近にて10〜30秒程度で行なわれる。 MT−Tyr、放射性沃素及びクロラミンTの使用割合
は、例えばチロシン1個当り放射性沃素1個を導入する
場合には、MT−Tyr中に含まれるチロシン分子1ナ
ノモルに対して放射性沃素を1ミリキユ一リー程度、ク
ロラミンTを10〜100ナノモル程度用いるのがよく
、またチロシン1個当り放射性沃素2個を導入する場合
には、MT−Tyr中に含まれるチロシン分子1ナノモ
ルに対して放射性沃素を2ミリキユ一リー程度、クロラ
ミンTを10〜100ナノモル程度用いるのがよい。 かくして製造される放射性沃素により標識化されたMT
−Tyrは、通常の分離手段、例えば抽出、分配、カラ
ムクロマミルグラフィー、透析等により!’t! Pl
ft m ’Hされる。このようにして)qられる、本
発明の標識メタロチオネインは必要ならば凍結乾燥させ
て保存しておくこともできる。 本発明のmrlF−メタロチオネインは、上記の通り特
定の結合試薬を介してメタロチオネインにチロシンを結
合さ往た後・標識したものである。」−記メタロヂオネ
インと結合試薬どの結合は、メタロチオネインのSH基
と結合試薬のマレイミド基との反応により行なわれ、エ
ルマン法 (3iochemistry 、 18.690.19
79年)によるマレイミド基の消失及び吸光度の測定等
により確認される。結合試薬とチロシンどの結合は、薄
層クロマ1−グラフィー等によるニンヒドリンの消失及
び上記マレイミド基の導入数の測定により確認される。 またチロシンの標識化は放射性活性(+251)の測定
により行なわれる。 本発明の標識メタロチオネインは、上記の特徴を右する
故に、ラジオイムノアラはイ法(R1A法)により、検
体中のメタロチオネインを測定(定伝)する際の標識抗
原として有用であり、該標識抗原として、特有の顕著な
効果を秦し臂る。 即ち該標識メタロチオネインの利用によれば、RIA法
にお
タロチオネインの免疫学的in’l定方法及び該測定に
利用するキラl〜に関している。 背 円 技 (l″i 近年医学の進歩と共に、種々複雑な病気の診断、治療等
が可能になってきた。その反面例えば鉱工業等の発展に
伴う公害等より新たに各nの難治性疾病が生まれてぎて
いる。そのひとつに重金属汚染による重金属中毒症があ
り、該疾病の冶掠1う至予防法の確立、そのための基礎
ともなる該疾病の診断法乃至これに伴う技術の確立が斯
界7:要望されている。しかして生体は木来上記車金属
の毒性を中和する作用(毒性の発現をIIJI止する作
用)を右(る物質(メタロチオネイン)を保有すること
が知られテイル[5cicncc、 Vol、 214
。 805〜807 (1981) 、 Nord 、 z
yc+。 Tidskr 、、45.76〜82 (1964)]
。 該メタロチオネインとは分子量が1万たらずで、全組成
アミノ酸中的1/3がシスティン残基であり、重金属例
えばカドミウム、銅、亜鉛、水銀等どの新和力が非常に
強い低分子@蛋白質であり、これは生体内への上記重金
属の導入により誘導(生合成)され、上記導入に伴い特
に肝臓、腎臓を中心にぞの量が増加し、血中′ir5度
も増加する[ 、) 、B、C,、vol 236.
No 9. 2435−2442 (1961)、蛋白
質核酸酵素、vo125、No 8.46−61 (1
980)及び現代化学第40−49頁(1980年3月
)]。従って生体内の上記メタロチオネインaを正確に
測定することができれば、前記重金属中毒症の診断が可
能となり、惹いてはその治魚法も確立できると考えられ
る。かかる観点及び他の観点から、従来よりメタロチオ
ネインのmll定法としては、例えば吸光度からメタロ
チオネインの金属間の特有な結合を測定する方法、35
3−システィンのとり込みによって得られるS H基を
定量する方法、インごボにて1°9CdCQ2投与にJ
:り得られる標識メタロチオネインを標識抗原として利
用する方法及びポル1〜ンハンター試薬により0識抗原
を作成しこれを用いる免疫反応を利用する方法等が種々
提案されている。しかしながら+!2察された測定法は
いずれも尚潜足できるものではなく、その感度、精度、
再現性、試薬の調製の煩雑性等において問題があった。 本発明者らも上記メタロチオネインが抗原性を有する蛋
白質であることに着目し、免疫反応(抗原−抗体反応)
を利用して該メタロチオネインの測定を行なう方法を確
立すべく鋭小研究を単ねた。 その結果、特定の結合試薬を用いてメタロチオネインと
チロシンとを結合させ且つこのチロシンを放射性沃素で
標識化して標識メタロチオネインを製造するに成功する
と共に、かくして得られる軒識メタロチオネインを標識
抗原とづる時には、検体中の1ffiのメタロチオネイ
ンをも、高感度で再現性J:り正確に定nできることを
見い出した。本発明はこの新しい知見に基づいて完成さ
れたしのである。 発明の(R成 本発明はメタロチオネインに一般式 で表わされる結合試薬を介してチロシンが結合されてお
り、該チロシンが放射性沃素により標識されていること
を特徴とする標識メタロチオネイン並びにこれを用いて
メタロチオネインをラジオイムアッセイにより測定する
方法及び該測定のためのキラ1−に係る。 以下、本発明の標識メタロチオネインを、その製法によ
り詳述する。 本発明の標識メタロチオネインの製造において、メタロ
チオネインとしては、公知の各種起源のメタロチオネイ
ンをいずれも利用できる。椙造解析された該メタロチオ
ネインとしては、ヒ1〜及び伯の哺乳類例えばウマ、ウ
シ、ブタ、ウリーギ、ラツ1・、マウス等からの夫々二
つの主分子秤があり、他にニワ1〜りやススメ等の鳥類
、キンジョ等の魚類、貝グ1、軟体動物、芹類、カビ類
からのメタロチオネインも知られている。之等のうちで
曲孔動物のメタ[二1ヂオネインが好ましい。上記各f
I罎のメタ1]ヂオネインは、公知の方法により分雅採
取りることができる。より有利には例えばIIi乳動物
のメタロチオネインは、起源動物に重金風を投与し、こ
れにより誘導され血液中に増加されるメタロチオネイン
を、該メタロチオネインの性質を利用した各行分離手段
により分子■される。より詳細には、例えばラツI・−
メタロチオネインはラッl〜の腹腔内に塩化カドミウム
等の重金風を投与し、肝臓を摘出後9’A ’CIアン
モニウム水溶液等を加えホモシネ−1〜し、次いでよ消
を80℃で1分間加熱した後、4°Cまで冷却してセフ
ァデックスG〜75(ファルマシア社)及びDEハ1F
−セファデックスく同」]社)で精製することにより得
られる[T mmuno−cl+emistry、 1
5 、857<1978> 1 。 上記メタロチオネインとチロシンどの結合反応において
は結合試薬として上記一般式(I)で表わされる特定の
結合試斧を用いることが特に重要である。該結合試薬は
公知であり[Cb6m。 PI+arm、 Bull、、 29. ’1130
(1981) 参照]、一部ピアス社(Pierce)
より市販されており、また文献[T 、 K itag
awa他、J。 Biochem、 (Tokyo> 79. 233
(1976) ]に記載の方法に従い、アミノカルボン
酸とマレイミド誘導体との反応物に、N−ヒドロキシザ
クシンイミドを反応さけることにより容易に製造できる
。上記一般式(I>の結合試興に含まれる代表的化合物
としてはm−マレイミドベンゾイル−N−ヒト[」キシ
ザクシンイミドエステル(以下rMBsJという)を例
示できる。 上記結合試薬を用いてメタロチオネインとチロシンとを
結合させる方法は、通常の方法に従い予めチロシンと結
合試薬とを反応させた後、得られる反応物にメタロチオ
ネインを結合させる方法によるのが好ましい。上記チロ
シンと結合試薬どの反応は、例えばアルカリ水溶液又は
リン酸緩暫液、ホウ酸塩tg′ffJ液等のアンモニア
及びアミノ丼を含有しない通常の各杆紡衝液中、I)H
7,O〜9.0の条件及び約10〜4.0’Cの温度下
に、通常約10分〜10時間、一般には約10〜30分
間を要して行なわれる。チロシンに対する結合試薬の使
用割合は、適宜決定されるが、通常約4〜10倍モル量
とするのが望ましい。 かくして得られるチロシン−結合試薬結合物(以下、r
MB−Tyr−1という)は、常法に従い反応系より甲
部することもできるが、甲離覆ることなく引き続く反応
に供づ−ることもてきる。上記中部手段としては、例え
ば抽出、分配、カラムクロマトグラフィー等の通常の弔
頗!′i¥製手段を採用できる。 上記反応に引ぎ続くメタロチオネインと上記結合物MS
−Tyrとの反応は、例えば水溶液、生理食塩水もしく
はl’lH6〜8の通常の緩衝液中、好ましくはpl」
7付近の緩衝液中で、0〜40℃、好ましくは室温付近
で、好ましくは窒素気流中で行なわれる。該反応は通常
1〜24時間稈時間一般には約2〜3時間で完結する。 メタロチオネインに対するM S−T yrの使用割合
は、通常約5〜10倍モル量の範囲で選択される。緩衝
液としては、前記反応で用いたものと同じものを使用で
きる。 かくして得られるチロシン−結合試薬−メタロチオネイ
ン反応物(以下rMT−Tyr−lという)は、例えば
抽出、分配、カラムクnマドグラフィ〜、透析等により
単離箔製される。このM T〜Tyrはメタロチオネイ
ン1モルに対しチロシンが1〜3モル等角、好ましくは
1モル等C結合したものである。 本発明の標識メタロチオネインは、上記により得られる
MT−TVrに放射性沃素を導入して標識することによ
り製造される。該放gAft沃素の導入は、通常の方法
例えばクロラミンTを用いる酸化的ヨード化法[W、
M、 Hunter and F、 c。 Greenwood: Nature 、 194 、
495(1962) 、Biocl+em、 J、 、
89.114゜(1963)参照1等にJ:り行なう
ことかできる。 該方法は具体的には、適当な溶媒例えば0.2Mリン酸
緩衝液(p H=7.4)等のrd媒中、クロラミンT
の存在下室温付近にて10〜30秒程度で行なわれる。 MT−Tyr、放射性沃素及びクロラミンTの使用割合
は、例えばチロシン1個当り放射性沃素1個を導入する
場合には、MT−Tyr中に含まれるチロシン分子1ナ
ノモルに対して放射性沃素を1ミリキユ一リー程度、ク
ロラミンTを10〜100ナノモル程度用いるのがよく
、またチロシン1個当り放射性沃素2個を導入する場合
には、MT−Tyr中に含まれるチロシン分子1ナノモ
ルに対して放射性沃素を2ミリキユ一リー程度、クロラ
ミンTを10〜100ナノモル程度用いるのがよい。 かくして製造される放射性沃素により標識化されたMT
−Tyrは、通常の分離手段、例えば抽出、分配、カラ
ムクロマミルグラフィー、透析等により!’t! Pl
ft m ’Hされる。このようにして)qられる、本
発明の標識メタロチオネインは必要ならば凍結乾燥させ
て保存しておくこともできる。 本発明のmrlF−メタロチオネインは、上記の通り特
定の結合試薬を介してメタロチオネインにチロシンを結
合さ往た後・標識したものである。」−記メタロヂオネ
インと結合試薬どの結合は、メタロチオネインのSH基
と結合試薬のマレイミド基との反応により行なわれ、エ
ルマン法 (3iochemistry 、 18.690.19
79年)によるマレイミド基の消失及び吸光度の測定等
により確認される。結合試薬とチロシンどの結合は、薄
層クロマ1−グラフィー等によるニンヒドリンの消失及
び上記マレイミド基の導入数の測定により確認される。 またチロシンの標識化は放射性活性(+251)の測定
により行なわれる。 本発明の標識メタロチオネインは、上記の特徴を右する
故に、ラジオイムノアラはイ法(R1A法)により、検
体中のメタロチオネインを測定(定伝)する際の標識抗
原として有用であり、該標識抗原として、特有の顕著な
効果を秦し臂る。 即ち該標識メタロチオネインの利用によれば、RIA法
にお
【プるメタロチオネインの定量が可能であり、該R
I A、法の精度、感度を一更向上させることができ、
しかも上記IFa識メツメタロチオネイン自体容易つ安
価に調製できる利点がある。 従って、本発明は上記標識メタロチオネインを利用して
ラジオイムノアッセイによりメタロチオネインを測定づ
る方法をも提供するものである。 この測定法は標識抗原として上記標識メタロチオネイン
を用いる以外、基本的には通常の競合法にJ:るラジオ
イムノアッセイ法と異ならない。即ち通常の溶媒中、一
定口の標準抗原、標識抗原及び抗体を競合反応させ、次
いで抗原抗体結合物及び非結合抗原を分離し、そのいず
れか一方の標識活性を測定し、既知8度の標準抗原に対
する標準曲線を作成する。同様に標準抗原の代りに3度
未知の被検試料を使用してその標識活性を測定し、前記
標準曲線より被検試料中の使用した抗体に対重るメタロ
チオネイン但を定量することができる。 上記測定法に/ljいるメタロチオネインの標準抗原(
非標識抗原)及び該抗原に対重る抗体は、いずれも通常
の方法ににり作成することができる。 即ちメタロチオネインの抗原(免疫抗原)は、メタロチ
オネインをハブテンとし、これを適当なハブテン−担体
結合試薬の存在下に担体と反応させることにより得られ
る。 」−2に用いるメタロチオネイン(J、本発明の標識メ
タロチオネインの製造に用いるそれと同一のものを用い
るのが好ましい。該メタロチオネインと結合させる担体
としては、通常抗原のイ′1成に当り慣用される高分子
の天然もしくは合成の蛋白質を広く使用できる。該担体
どしては例えば馬面清アルブミン、牛血清アルブミン、
ウザV面清アルブミン、人血清アルブミン、ヒツジ血清
アル1ミン等の動物の血清アルブミン類:馬血清グ[1
プリン、牛血清グロブリン、つ4ツギ血消グロブリン、
人血清グロブリン、ヒツジ自消グUプリン等の動物の血
清グロブリン¥1:馬ヂ1]グ]1プリン、牛ヂログロ
ブリン、ウサギヂnグ0プリン、人ヂログロブリン、ヒ
ツジヂログ1]プリン等の動物のヂログロブリン類;馬
ヘモグロブリン、牛ヘモグ[−1ブリン、ウリギヘモグ
[]プリン、人ヘモグロブリン、ヒツジヘモグ「】プリ
ン等の動物のヘモグロブリン類;〜1−−ホールリンベ
ツ1〜ヘモシアニン(K L、 H)等の動物のヘモシ
アニン類;回虫より抽出された蛋白質(アスカ−リス抽
出1′9J、特17il昭56−1641/I号公報、
J、Immun、、111 .260〜268 (19
73)、J、Immun、、122 。 302 〜308 (197’9) 、、ノ 、 I
mn+un、。 98 .893〜900 (1967)及びΔm、、J
。 pl+ysio1.、1 9 9 .5 7 5〜b7
8 <1960)に記載されたもの又はこれらを更に精
製したちの):ポリリジン、ポリグルタミン酸、リジン
−グルタミン酸共重合体、リジン又はオルニチンを含む
共重合体等を挙げることができる。 ハブデンー担体結合試桑としては、通常抗原の作成に当
り慣用されているものを広く使用できる。 具体的にはアミノ基とアミン基とを架橋結合させる、例
えばグリオキザール、マロンジアルデヒド、ゲルタール
アルデヒド、スクシンアルデヒド、アジボアルデヒド等
の脂肪族ジアルデヒド煩;チオール基とチオール基とを
架橋結合させる、例えばN 、N’−0−フェニレンジ
マレイミド、N 。 N7 m−フェニレンジマレイミド等のシマレイミド化
合物二アミノ基とチオール基とを架橋結合させる、例え
ばメタマレイミドベンゾイル−N=ヒドロキシスクシン
イミドエステル、4−(マレイミドメチル)−シクロヘ
キサン−1−カルボキシル−N′−ヒドロキシスクシン
イミドエステル等のマレイミドカルボキシル−N−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル類二アミノ呈とカルボキ
シル基とをアミド結合させる通常のペプチド結合形成反
応に用いられる試薬、例えばN 、N−ジシクロへキシ
ルカルボジイミド、N−エチル−N’ −ジメチルアミ
ノカルボジイミド、1−エチル−3−ジイソプロピルア
ミノカルポジイミド、1−シクロへキシル−3−(2−
モルホリニル−4−エチル)カルボジイミド等のカルボ
ジイミド類等の脱水縮合剤等を挙けることができる。ま
た上記ハブテン−担体結含試イ3としては、p−ジアゾ
ニウムフェニル酸BWのジアゾニウムアリールカルボン
酸類と通常のメタ1]チオネイン結合形成反応試葵、例
えば上記説ノ1ζ縮合剤とをi1合けたものら使用可能
である。 1−記免疫抗原の製造反応は、例えば水溶波もしくはp
l」7〜10の通常のU買液中、好Aニジ<はpH8〜
9の経tr、i液中、O〜40 ’C、なj−j、しく
は室)呂t1近で行なわれる。、該反応は通常約1〜2
4時間、好ましくは3〜5時11)で完、情覆る。」−
記において用いられる代表的援丙浩どしては、次のちの
を例示できる。 0.2N水酸化す1〜リウム−0,21〜1ホウ酸−〇
、2M塩化カリウム緩尚液、 0.2M炭酸すトリウム〜0.2Mホウ酸−〇、2MJ
n化カリウム明(j液、 0.05M四小つp:2プトリウムー0.2M小つバ’
to、05M塩化すトリウム縁百液、0.1iψリン酸
二水素カリウム−0,05M四ホウ酎ナ耐リウム綴丙液 上記にJ3いてハブテン、ハブテン−損体結合試桑及び
担体の使用割合は、適宜に決定できるが、通常ハブテン
に対して担体を1〜6倍重吊程度、好ましくは1〜5倍
重琶¥jd度、及びハブテン−担体結合試薬を5〜10
倍モル程厄用いるのがよい。 上記反応によりハブテン−担体結合試薬を仲介させて担
体とハブテンとが結合したメタロヂオネインー担体複合
体からなる所望のメクロチオネイン免疫抗原が収得され
る。 反応終了後前られる免疫抗原は常法に従い、例えば透析
法、ゲル濾過法、分別沈澱法等により容易に単πf f
i’i 胃できる。また該抗原は通常の凍結乾燥法によ
り保存できる。 前クシて得られたメタ[lチオネイン免疫抗原は通常担
体1モルに対してメタロチオネインが平均10〜15モ
ル結合したしの−Cあり、いずれも引き続ぎ該抗原に対
して特異1.′4の高い所望のメタ[]チオネイン抗体
を再現牲よく製造可能とJるちのである。 上記で得られる免疫抗原によるメタ1]チオネイン抗体
の作成は、例えば以下の如くして行なわれる。即ち上記
抗原を韻乳動物に投与し、牛体内に所望抗体を産生させ
、これを捉取Mることにより実施される。 抗体の製造に供せられる11j乳動物としては、特に制
限はないが、通常ウサギやモルモツ1〜を用いるのが好
ましい。抗体の産生に当っては、上記により(ワられる
免疫抗原の所定量を生理食塩水で適当9度に希釈し、フ
ロイントの補助液 (CoIIlplete Freund ’ s Ad
juvant )と混合して懸濁液を調整し、これを哺
乳動物体に投与でればよい。例えばウサギに上記9m液
を皮内注剣(抗原の口として0.1〜511g/回)し
、以後2週間毎に2〜10ケ月、好ましくは4〜6ケ月
間投与し免疫化させればよい。抗体の採取は、上記懸濁
液のD柊投与後、抗体が多量産出される時期、通常上記
最終投与の1〜2週間経過後、免疫化された動物から採
血し、これを達心分v1後、血清を分離ツることにより
行なわれる。 以下、本発明のF mメタロチオネインと上記の如くし
て得られる免疫抗体とを用いIC本発明のメタロチオネ
インの測定方法につき一詳述する。 本発明の測定法においては、j、ず測定すべき検体を調
製する。該検体としては通常被検者の血液を帛法に従い
採血し、遠心分臼)[シて得られる血m又は血清が右利
であるが、之等に限定されず、例えば被検者の尿、組織
、体液等で8うってもよい。 」−記分陪された血漿等の検体に所定量の標識メタロチ
オネイン、抗血清(抗体)、緩tlE液を添加し、通常
4〜37℃にて6〜72時間程度インキュベー1〜する
。次に標識メタロチオネイン−抗体結合物(B)と非結
合メタロチオネイン(F)とを通常の分岨方法、例えば
デキスI〜ラン炭末法、二抗体法、固相法、ポリエチレ
ングリコール法、タルク法、硫安法、エタノール法等に
より分−1シ、それらの放射能をγ−カウンターを用い
て測定してB/(B+F)値をめ、予め作成した標準曲
線より検体中のメタロチオネインの含有g−+をめる。 尚標準曲線は、」−記において被検体に代え、既知伶の
メタロチオネインを含む溶液を用い、同様にしてめたB
/BfF値をプロワ1〜でることにより作成される。上
記測定法における倹体使用洛は100μQ程度を目安と
すればよく、該検体当り、の抗体量は100uQ前後、
緩衝液aは200μQ前後及び標準抗原最は100μQ
(10000cpm )前後とされるのが適当である。 かくして本発明の測定法によれば、検体中に微弔含まれ
るメタロチオネインをも、充分に検出測定することかで
きる。 上記本発明測定法の実施は、特に好ましくは本発明の標
識メタロチオネインを必須成分として含むキットを用い
て行なわれ、本発明はかかるメタロチオネイン測定用キ
ットをも提供する。 本発明キットは、上記標識メタロチオネイン(通常これ
は適当な緩衝剤溶液に調整される)と共に別個にメタロ
チオネインに対する抗体試薬を含む。該抗体試薬は上述
した方法により得られる抗体にグリセロールやウシ血清
蛋白のような安定化剤及び/又は保存剤を配合すること
ができ、好ましくは凍結乾燥される。また上記抗体試四
には水溶性もしくは水混和性溶媒を含有させることがで
き、更に再構成された試薬系を一定のpHに保つだめの
緩衝液を添加覆ることもできる。緩衝液はキット試薬の
必須成分とは考えられないが、本発明の測定法を実施す
る際に、pHを6〜7.8とするものを用いるのが好ま
しい。また再(育成剤は好ましくは水を含んだものであ
るが、水の一部又は全部を水と混和しつる溶媒で置き換
えることもできる。水と混和しつる溶媒は当業者に周知
であり、例えばグリセリン、アルコール類、グリコール
類、グリコールエーテル類等を使用できるが、らちるん
これらに限定されない。 好ましいキラ1へにおける試薬の配合ωは、例えば10
0検体用キツ1−の場合、本発明標識メタ[lチオネイ
ン11+++12、メタロチオネインに対重る抗体11
1IIII2、緩衝剤80回及び第二抗体(スタンダー
ド)11回どされ、標識メタロチオネイン以外は、すべ
て凍結乾燥品の形態であるのが望ましい。 斯くして本発明によりメタ[−1チオネインを有利に測
定ザることができる。工11定されたメタ「1チオネイ
ンレベルを健庫人の当該レベルど比?Rすることにより
重金属中毒を早期、的確に診断することがぐきる。 実 施 例 以下本発明を更に詳しく説明づ−るために抗体の製造例
、柳識抗原の製造例、測定例を単ける。 〈免疫抗原の製造〉 製造例1 5 ツh −メタ0 チオネ、(ンーi [Rioch
emicaland Biopl+ysical Re
5earcb Communication、。 84.907 (1978)参照」 (以下R−M1−
■と略す)20m(+とアスカ−リス抽出蛋白15mg
とを0.1Mリンlll1tj P液(D H7,0)
5aQに加え、この溶液に14%グルタルアルデヒド水
溶P2175μQを滴下し、室温で5詩間撹拌覆る。 その後反応混合物を4日間蒸留水4℃で4回透析し、凍
結乾燥して免疫抗原341[1りを得る。以下この抗原
を「抗原工」と称す。 抗原工はアスノJ−リス1モルに対してR−MT−■が
平均10モル結合したしのである。尚このR−M T
−Iどアスカ−リスとの結合率は、得られる抗原1を更
にレファデツクス(、−50(溶出液:生理食塩水、検
出:0D280ni、流出速度:3IIIQ/時間、分
取m : I IQづつ)でゲル濾過した際、未反応の
アスカ−リス及びR−M T −Iの存在は認められな
いことより、該ゲル濾過にJ:つてアスカ−リスに結合
したR−MT−Hのフラクションと他の生成体(R−M
T−Iの2員休)のフラクションどを分需[シ、R−M
T−I 21体の標準濃度の検檜線を作成して、上記2
句体の舟をめ、これを出発原料として用いたR−MT−
Hの串から差し引いた値がすべてアスカ−リスに結合し
ているとしてめたものである。以下の抗原の製造例にお
いても同様とする。 製造例 2 R−M 1−− Iの5mg及びアスカ−リス抽出蛋白
25mgを蒸留水3.0IIIQに加え、この溶液にジ
シクロへキシルカルボジイミド(DCC)200maを
加え、室温で3時間撹拌する。その後反応混合物を一夜
蒸留水で4℃下に透析し、凍結乾燥して、免疫抗原28
mQを得る。以下この抗原を「抗原■」と言う。抗原■
はアスカ−リス1モルに対してR−MT−丁が平均12
モル結合したものである。 製造例 3 前記製造例1においてR−MT−工に代えてラフ1−−
メタ[−1ヂオネインーH((B iocllemic
aland 3iophysical Re5earc
h Communication。 84.907.1978年、以下R−MT−nと略す)
を用いて同様の操作によりR−M T −IIIのアス
カ−リス結合抗原を得る。以下この抗原を「抗原■」と
称ず。抗原■はアスカ−リス1モルに対してR−M T
−Ifが15モル結合したものである。 く抗体の製造〉 ■ 抗原の製造例1で得た抗原■の100μQを1.5
−の生理食塩水に溶解後、これに70インドの補助液1
.5鵬を加えて調整した8濁液を5羽の兎(2,5〜3
.0kO)に皮下投与し2週間毎に10回同幻投与する
。最後の抗原投与後、採血し、遠心分離して抗血清(メ
タロチオネイン抗体)を得る。 6兎に対し、抗体1〜抗体Vとする。 ■ 前記抗体の製造例1において抗原■に代えて抗原の
製造例2で得た抗原■の同量を用いて同様の方法により
、5羽の兎より抗体を4「?る。6兎に対して抗体■〜
抗体Xどづる。 ■ −F記■と同様にして抗原■を用いて3羽の兎より
抗体m〜抗体双を得る。 〈標識メタロチオネインの製造〉 実施例1 ■ ヂロシン2mgを0.1Mリン酸級衝液(p)」8
.0)9.0w[にとかしメタマレインドベンゾイル−
N−ヒドロキシザクシンイミド(以下MBSと称す)1
7.4n+gをジメチルホルムアミド1回にどかしたも
のを滴下し、20分間至室温て反応させた後、HFtク
ロマトグラフィーによりニンヒドリン潤去を確認し過剰
のMBSをジクロルメタンにて抽出除去し、水層にメタ
マレイミドベンゾイルヂINシン(MB−T−yr)を
得た。 このMB−Tyrはエルマン法により−1−yrに導入
されたマレイミド基を測定(B iOcllemist
ry 。 18.690.1979年)してTyr1モル当りMB
0.9モルが結合していることが確認された。 ■ R−M 7’−Iの2II1gをO,IMリン酸紡
衝液(pH7,5)2mQにとかし、これに前記■で1
qたMB−Tyrの6BOuQ (1,32mq)をh
口え室温にて2時間反応さけた後、セファデックス(、
−50カラム(溶出液 0.1Mリン酸緩雨液、pH7
,2、カラムリーイズ1.7×83cm)に付し、各フ
ラクションを2mlづつ分取りし、フラクションNo3
5〜N054(ピークフラクションNo45)に目的物
R−M 1−−IとMS−Tyrとのカップリング化合
物(以下R−MT−I−1−yrど称す)を得た。 得られたR−MT−I−TyrはOD2aol1mでの
吸光度測定によりR−MT−11モルに対しTyr1モ
ルが導入されていることが確認されIこ。 ■ 上記■で)び7CR−MT−I−TVrをクロラミ
ン■−を用いる方法でJス下の通り標識化する。 即ちR−tvlT−I−1r541の0.5モルリン酸
塩II液(pH7,4>2011QにNa[” 5I]
<carrier free N、E、N、)1ミリ
キユーの0.5モルリ゛醜塩緩衝液20μQを加え、つ
ぎにクロラミン−T20μgを0.05モルリン酸塩緩
衝液20μQに溶解したものを加える。室温下に25秒
間撹1↑してチロシン100μgを0.05モルリン酪
基塩緩衝液00μQに溶解したものを加え反応を停止さ
せる。次いでこの反応混合物をセファデックスG−50
のカラム(IX80Cm)にかけ(溶出液0.1%ゼラ
チン、0.15モル塩化す1〜リウム及び0.02%N
aN3を含む0.05モルリン酸塩緩衝液、p H7,
4、流速7〜8.01tlQ/l+r) 、” 5 ■
raighたR −MT−I−丁yrを溶液形態で得る
。以下これを「標識抗原■」と称す。 比活性 2.25マイクロキユリ一/mQセファデック
スG−50にてゲル茅濾過しt、:結果カラムサイズ
1.6X50cn+ 流速 8鶴/hr 1フラクシヨン O: 9 mQ ビーク No47〜N054フラクシヨンメインビーク
N052フラクシヨン 溶出液 0.1Mリン酸塩緩傍液(pH7,4,)0.
15M NaCQ 実施(92 ■ 実施例1の■においてR−MT−Iに代えてR−M
T−Hを用いて、同様の操作によりR−M、T−nど
MB−Tyrどのカップリング化合物(以下R−MT−
II−’1”Vrと略す)を得た。 1すられたR−MT−II−Tyrは0D28Onll
lで吸光度測定によりR−MT−111モルに対しTV
r1モルが導入されていることが確認された。 ■ 上記■で得たR−MT−II−Tyrを用いて実施
例1の■と同様の方法により標識抗原を得る。 この標識抗原を「標識抗原■」と称す。 比活性 2.30マイクロキユリ一/mQレファデツク
スG−50にてゲル濾過した結果カラムサイズ 1.6
X50cm 流速 8鵬/1]r 1フラクシヨン 0−99鴨 ビーク No47〜N054フラクシヨンメインビーク
N052フラクション 溶出M O,IMIJンfi9塩緩丙ia (D H7
,4)0.15M Na CQ ○力価の測定 上記抗体の製造例で得られた各抗体の力価を次の通り測
定する。即ち抗体をそれぞれ生理食塩水で10.102
.103.104.105・・・・・・・・倍に希釈し
、これらのそれぞれ100μQに、125I標識抗原(
上記各実施例で得られる標識抗原を約9500cpmに
なるように希釈したもの)0.1mQ及び0.05モル
リンlli!塩緩衝液(p)I=7.4)(0,25%
BSA、10mMEDTΔ及び0.01%Na N3を
含む)0.2−を加え、4℃で24時間インキュベート
し、住成した抗体と1251標識抗原との結合体を、ポ
リエチレングリコール法及び遠心分n1法〈4℃、30
分間、3000ron+)ににり未反応(結合しない>
+2511I抗原から分訝し、その放()J綿をカラン
1〜し各希釈濃度における抗体の1251標識抗原との
結合率(%)を測定する。縦軸に抗体の1251標識抗
原との結合率(%)及び横軸に抗体の希釈倍率をとり、
各々の濃度において結合率をプロワ1−する。結合率が
50%となる抗体の希釈倍率即ち抗体の力価をめる。 又、上記と同様の方法ににリボ用1〜ルハンター法によ
り作成された125工標識抗原 (7oxicology and Applied p
l+armacolog、 。 55.94〜102.1980年、 31ocl+em
、 J 。 133.529〜539.1973年)を用いて抗体1
〜抗体Vを測定した結果を下記第1表に示す。 第1表 上記第1表より、本発明標識抗原がポル1−ンハンター
法による標識抗原より優れていることが判る。 くメタロチオネインのRIA法による測定〉0.05M
リン酸塩緩衝液0.2mQ(D l−1=7.4..0
.25%BSA、0.01MEDTA、、0.01%N
a N3及び200KIU1−ラジロール含有)に抗体
の製造例■で得た抗体Tの0.1戚(最終希釈倍率20
000) 、実施例1で得た標識抗原1の0.1回(1
0000cpm )及び被tf<F$、F2O、1mA
ヲ加工、4℃テ48時間インキベーションした後、さら
にラビット抗体(40倍希IR>0.1地、正帛つサギ
向消0.1m0(400希釈)及び0.05Mリン酸j
n1iffに15%1211度となるように溶かしたポ
リエチレングリコール0.2p、2を加え、空温にて3
0分間インキコベーションを行ない、4℃、30分間遠
心分離する。上清と沈澱物との放QJ活性を夫々γ−カ
ウンターにて測定してメタロチオネイン聞を標準曲線よ
り搾出する。尚標準曲線は、被検試第1としてR−MT
−I(標準品)を用いて上記と同様にして各希釈倍率で
の故Q1活性測定値をプロットすることによりめたもの
であり、5001)g/チューブ〜1100n/チ1−
ブの淵度内で十分な用伜−反応曲線が得られる。 上記において被験試料としてヒト尿を用い、高値を示し
た各検体(3種)につき夫々64倍まで希釈していき、
標準曲線と対比させた結果を第1図に示す。第1図にd
3いて箱軸(より/5o(B+F)%を示し、横軸はメ
タD y−オネイン濃度<ng/ヂコーブ)及び検体希
釈倍(げ1を示す。また図中(1)は標準曲線であり、
く2)〜(4)は夫々検体1〜3(ヒト尿)を示す。 第1図より検体における希釈曲線はいずれも標準曲線と
ほぼ平行しており、高感度でヒ1ヘーメタ口チオネイン
の測定が行ない()ることが判る。
I A、法の精度、感度を一更向上させることができ、
しかも上記IFa識メツメタロチオネイン自体容易つ安
価に調製できる利点がある。 従って、本発明は上記標識メタロチオネインを利用して
ラジオイムノアッセイによりメタロチオネインを測定づ
る方法をも提供するものである。 この測定法は標識抗原として上記標識メタロチオネイン
を用いる以外、基本的には通常の競合法にJ:るラジオ
イムノアッセイ法と異ならない。即ち通常の溶媒中、一
定口の標準抗原、標識抗原及び抗体を競合反応させ、次
いで抗原抗体結合物及び非結合抗原を分離し、そのいず
れか一方の標識活性を測定し、既知8度の標準抗原に対
する標準曲線を作成する。同様に標準抗原の代りに3度
未知の被検試料を使用してその標識活性を測定し、前記
標準曲線より被検試料中の使用した抗体に対重るメタロ
チオネイン但を定量することができる。 上記測定法に/ljいるメタロチオネインの標準抗原(
非標識抗原)及び該抗原に対重る抗体は、いずれも通常
の方法ににり作成することができる。 即ちメタロチオネインの抗原(免疫抗原)は、メタロチ
オネインをハブテンとし、これを適当なハブテン−担体
結合試薬の存在下に担体と反応させることにより得られ
る。 」−2に用いるメタロチオネイン(J、本発明の標識メ
タロチオネインの製造に用いるそれと同一のものを用い
るのが好ましい。該メタロチオネインと結合させる担体
としては、通常抗原のイ′1成に当り慣用される高分子
の天然もしくは合成の蛋白質を広く使用できる。該担体
どしては例えば馬面清アルブミン、牛血清アルブミン、
ウザV面清アルブミン、人血清アルブミン、ヒツジ血清
アル1ミン等の動物の血清アルブミン類:馬血清グ[1
プリン、牛血清グロブリン、つ4ツギ血消グロブリン、
人血清グロブリン、ヒツジ自消グUプリン等の動物の血
清グロブリン¥1:馬ヂ1]グ]1プリン、牛ヂログロ
ブリン、ウサギヂnグ0プリン、人ヂログロブリン、ヒ
ツジヂログ1]プリン等の動物のヂログロブリン類;馬
ヘモグロブリン、牛ヘモグ[−1ブリン、ウリギヘモグ
[]プリン、人ヘモグロブリン、ヒツジヘモグ「】プリ
ン等の動物のヘモグロブリン類;〜1−−ホールリンベ
ツ1〜ヘモシアニン(K L、 H)等の動物のヘモシ
アニン類;回虫より抽出された蛋白質(アスカ−リス抽
出1′9J、特17il昭56−1641/I号公報、
J、Immun、、111 .260〜268 (19
73)、J、Immun、、122 。 302 〜308 (197’9) 、、ノ 、 I
mn+un、。 98 .893〜900 (1967)及びΔm、、J
。 pl+ysio1.、1 9 9 .5 7 5〜b7
8 <1960)に記載されたもの又はこれらを更に精
製したちの):ポリリジン、ポリグルタミン酸、リジン
−グルタミン酸共重合体、リジン又はオルニチンを含む
共重合体等を挙げることができる。 ハブデンー担体結合試桑としては、通常抗原の作成に当
り慣用されているものを広く使用できる。 具体的にはアミノ基とアミン基とを架橋結合させる、例
えばグリオキザール、マロンジアルデヒド、ゲルタール
アルデヒド、スクシンアルデヒド、アジボアルデヒド等
の脂肪族ジアルデヒド煩;チオール基とチオール基とを
架橋結合させる、例えばN 、N’−0−フェニレンジ
マレイミド、N 。 N7 m−フェニレンジマレイミド等のシマレイミド化
合物二アミノ基とチオール基とを架橋結合させる、例え
ばメタマレイミドベンゾイル−N=ヒドロキシスクシン
イミドエステル、4−(マレイミドメチル)−シクロヘ
キサン−1−カルボキシル−N′−ヒドロキシスクシン
イミドエステル等のマレイミドカルボキシル−N−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル類二アミノ呈とカルボキ
シル基とをアミド結合させる通常のペプチド結合形成反
応に用いられる試薬、例えばN 、N−ジシクロへキシ
ルカルボジイミド、N−エチル−N’ −ジメチルアミ
ノカルボジイミド、1−エチル−3−ジイソプロピルア
ミノカルポジイミド、1−シクロへキシル−3−(2−
モルホリニル−4−エチル)カルボジイミド等のカルボ
ジイミド類等の脱水縮合剤等を挙けることができる。ま
た上記ハブテン−担体結含試イ3としては、p−ジアゾ
ニウムフェニル酸BWのジアゾニウムアリールカルボン
酸類と通常のメタ1]チオネイン結合形成反応試葵、例
えば上記説ノ1ζ縮合剤とをi1合けたものら使用可能
である。 1−記免疫抗原の製造反応は、例えば水溶波もしくはp
l」7〜10の通常のU買液中、好Aニジ<はpH8〜
9の経tr、i液中、O〜40 ’C、なj−j、しく
は室)呂t1近で行なわれる。、該反応は通常約1〜2
4時間、好ましくは3〜5時11)で完、情覆る。」−
記において用いられる代表的援丙浩どしては、次のちの
を例示できる。 0.2N水酸化す1〜リウム−0,21〜1ホウ酸−〇
、2M塩化カリウム緩尚液、 0.2M炭酸すトリウム〜0.2Mホウ酸−〇、2MJ
n化カリウム明(j液、 0.05M四小つp:2プトリウムー0.2M小つバ’
to、05M塩化すトリウム縁百液、0.1iψリン酸
二水素カリウム−0,05M四ホウ酎ナ耐リウム綴丙液 上記にJ3いてハブテン、ハブテン−損体結合試桑及び
担体の使用割合は、適宜に決定できるが、通常ハブテン
に対して担体を1〜6倍重吊程度、好ましくは1〜5倍
重琶¥jd度、及びハブテン−担体結合試薬を5〜10
倍モル程厄用いるのがよい。 上記反応によりハブテン−担体結合試薬を仲介させて担
体とハブテンとが結合したメタロヂオネインー担体複合
体からなる所望のメクロチオネイン免疫抗原が収得され
る。 反応終了後前られる免疫抗原は常法に従い、例えば透析
法、ゲル濾過法、分別沈澱法等により容易に単πf f
i’i 胃できる。また該抗原は通常の凍結乾燥法によ
り保存できる。 前クシて得られたメタ[lチオネイン免疫抗原は通常担
体1モルに対してメタロチオネインが平均10〜15モ
ル結合したしの−Cあり、いずれも引き続ぎ該抗原に対
して特異1.′4の高い所望のメタ[]チオネイン抗体
を再現牲よく製造可能とJるちのである。 上記で得られる免疫抗原によるメタ1]チオネイン抗体
の作成は、例えば以下の如くして行なわれる。即ち上記
抗原を韻乳動物に投与し、牛体内に所望抗体を産生させ
、これを捉取Mることにより実施される。 抗体の製造に供せられる11j乳動物としては、特に制
限はないが、通常ウサギやモルモツ1〜を用いるのが好
ましい。抗体の産生に当っては、上記により(ワられる
免疫抗原の所定量を生理食塩水で適当9度に希釈し、フ
ロイントの補助液 (CoIIlplete Freund ’ s Ad
juvant )と混合して懸濁液を調整し、これを哺
乳動物体に投与でればよい。例えばウサギに上記9m液
を皮内注剣(抗原の口として0.1〜511g/回)し
、以後2週間毎に2〜10ケ月、好ましくは4〜6ケ月
間投与し免疫化させればよい。抗体の採取は、上記懸濁
液のD柊投与後、抗体が多量産出される時期、通常上記
最終投与の1〜2週間経過後、免疫化された動物から採
血し、これを達心分v1後、血清を分離ツることにより
行なわれる。 以下、本発明のF mメタロチオネインと上記の如くし
て得られる免疫抗体とを用いIC本発明のメタロチオネ
インの測定方法につき一詳述する。 本発明の測定法においては、j、ず測定すべき検体を調
製する。該検体としては通常被検者の血液を帛法に従い
採血し、遠心分臼)[シて得られる血m又は血清が右利
であるが、之等に限定されず、例えば被検者の尿、組織
、体液等で8うってもよい。 」−記分陪された血漿等の検体に所定量の標識メタロチ
オネイン、抗血清(抗体)、緩tlE液を添加し、通常
4〜37℃にて6〜72時間程度インキュベー1〜する
。次に標識メタロチオネイン−抗体結合物(B)と非結
合メタロチオネイン(F)とを通常の分岨方法、例えば
デキスI〜ラン炭末法、二抗体法、固相法、ポリエチレ
ングリコール法、タルク法、硫安法、エタノール法等に
より分−1シ、それらの放射能をγ−カウンターを用い
て測定してB/(B+F)値をめ、予め作成した標準曲
線より検体中のメタロチオネインの含有g−+をめる。 尚標準曲線は、」−記において被検体に代え、既知伶の
メタロチオネインを含む溶液を用い、同様にしてめたB
/BfF値をプロワ1〜でることにより作成される。上
記測定法における倹体使用洛は100μQ程度を目安と
すればよく、該検体当り、の抗体量は100uQ前後、
緩衝液aは200μQ前後及び標準抗原最は100μQ
(10000cpm )前後とされるのが適当である。 かくして本発明の測定法によれば、検体中に微弔含まれ
るメタロチオネインをも、充分に検出測定することかで
きる。 上記本発明測定法の実施は、特に好ましくは本発明の標
識メタロチオネインを必須成分として含むキットを用い
て行なわれ、本発明はかかるメタロチオネイン測定用キ
ットをも提供する。 本発明キットは、上記標識メタロチオネイン(通常これ
は適当な緩衝剤溶液に調整される)と共に別個にメタロ
チオネインに対する抗体試薬を含む。該抗体試薬は上述
した方法により得られる抗体にグリセロールやウシ血清
蛋白のような安定化剤及び/又は保存剤を配合すること
ができ、好ましくは凍結乾燥される。また上記抗体試四
には水溶性もしくは水混和性溶媒を含有させることがで
き、更に再構成された試薬系を一定のpHに保つだめの
緩衝液を添加覆ることもできる。緩衝液はキット試薬の
必須成分とは考えられないが、本発明の測定法を実施す
る際に、pHを6〜7.8とするものを用いるのが好ま
しい。また再(育成剤は好ましくは水を含んだものであ
るが、水の一部又は全部を水と混和しつる溶媒で置き換
えることもできる。水と混和しつる溶媒は当業者に周知
であり、例えばグリセリン、アルコール類、グリコール
類、グリコールエーテル類等を使用できるが、らちるん
これらに限定されない。 好ましいキラ1へにおける試薬の配合ωは、例えば10
0検体用キツ1−の場合、本発明標識メタ[lチオネイ
ン11+++12、メタロチオネインに対重る抗体11
1IIII2、緩衝剤80回及び第二抗体(スタンダー
ド)11回どされ、標識メタロチオネイン以外は、すべ
て凍結乾燥品の形態であるのが望ましい。 斯くして本発明によりメタ[−1チオネインを有利に測
定ザることができる。工11定されたメタ「1チオネイ
ンレベルを健庫人の当該レベルど比?Rすることにより
重金属中毒を早期、的確に診断することがぐきる。 実 施 例 以下本発明を更に詳しく説明づ−るために抗体の製造例
、柳識抗原の製造例、測定例を単ける。 〈免疫抗原の製造〉 製造例1 5 ツh −メタ0 チオネ、(ンーi [Rioch
emicaland Biopl+ysical Re
5earcb Communication、。 84.907 (1978)参照」 (以下R−M1−
■と略す)20m(+とアスカ−リス抽出蛋白15mg
とを0.1Mリンlll1tj P液(D H7,0)
5aQに加え、この溶液に14%グルタルアルデヒド水
溶P2175μQを滴下し、室温で5詩間撹拌覆る。 その後反応混合物を4日間蒸留水4℃で4回透析し、凍
結乾燥して免疫抗原341[1りを得る。以下この抗原
を「抗原工」と称す。 抗原工はアスノJ−リス1モルに対してR−MT−■が
平均10モル結合したしのである。尚このR−M T
−Iどアスカ−リスとの結合率は、得られる抗原1を更
にレファデツクス(、−50(溶出液:生理食塩水、検
出:0D280ni、流出速度:3IIIQ/時間、分
取m : I IQづつ)でゲル濾過した際、未反応の
アスカ−リス及びR−M T −Iの存在は認められな
いことより、該ゲル濾過にJ:つてアスカ−リスに結合
したR−MT−Hのフラクションと他の生成体(R−M
T−Iの2員休)のフラクションどを分需[シ、R−M
T−I 21体の標準濃度の検檜線を作成して、上記2
句体の舟をめ、これを出発原料として用いたR−MT−
Hの串から差し引いた値がすべてアスカ−リスに結合し
ているとしてめたものである。以下の抗原の製造例にお
いても同様とする。 製造例 2 R−M 1−− Iの5mg及びアスカ−リス抽出蛋白
25mgを蒸留水3.0IIIQに加え、この溶液にジ
シクロへキシルカルボジイミド(DCC)200maを
加え、室温で3時間撹拌する。その後反応混合物を一夜
蒸留水で4℃下に透析し、凍結乾燥して、免疫抗原28
mQを得る。以下この抗原を「抗原■」と言う。抗原■
はアスカ−リス1モルに対してR−MT−丁が平均12
モル結合したものである。 製造例 3 前記製造例1においてR−MT−工に代えてラフ1−−
メタ[−1ヂオネインーH((B iocllemic
aland 3iophysical Re5earc
h Communication。 84.907.1978年、以下R−MT−nと略す)
を用いて同様の操作によりR−M T −IIIのアス
カ−リス結合抗原を得る。以下この抗原を「抗原■」と
称ず。抗原■はアスカ−リス1モルに対してR−M T
−Ifが15モル結合したものである。 く抗体の製造〉 ■ 抗原の製造例1で得た抗原■の100μQを1.5
−の生理食塩水に溶解後、これに70インドの補助液1
.5鵬を加えて調整した8濁液を5羽の兎(2,5〜3
.0kO)に皮下投与し2週間毎に10回同幻投与する
。最後の抗原投与後、採血し、遠心分離して抗血清(メ
タロチオネイン抗体)を得る。 6兎に対し、抗体1〜抗体Vとする。 ■ 前記抗体の製造例1において抗原■に代えて抗原の
製造例2で得た抗原■の同量を用いて同様の方法により
、5羽の兎より抗体を4「?る。6兎に対して抗体■〜
抗体Xどづる。 ■ −F記■と同様にして抗原■を用いて3羽の兎より
抗体m〜抗体双を得る。 〈標識メタロチオネインの製造〉 実施例1 ■ ヂロシン2mgを0.1Mリン酸級衝液(p)」8
.0)9.0w[にとかしメタマレインドベンゾイル−
N−ヒドロキシザクシンイミド(以下MBSと称す)1
7.4n+gをジメチルホルムアミド1回にどかしたも
のを滴下し、20分間至室温て反応させた後、HFtク
ロマトグラフィーによりニンヒドリン潤去を確認し過剰
のMBSをジクロルメタンにて抽出除去し、水層にメタ
マレイミドベンゾイルヂINシン(MB−T−yr)を
得た。 このMB−Tyrはエルマン法により−1−yrに導入
されたマレイミド基を測定(B iOcllemist
ry 。 18.690.1979年)してTyr1モル当りMB
0.9モルが結合していることが確認された。 ■ R−M 7’−Iの2II1gをO,IMリン酸紡
衝液(pH7,5)2mQにとかし、これに前記■で1
qたMB−Tyrの6BOuQ (1,32mq)をh
口え室温にて2時間反応さけた後、セファデックス(、
−50カラム(溶出液 0.1Mリン酸緩雨液、pH7
,2、カラムリーイズ1.7×83cm)に付し、各フ
ラクションを2mlづつ分取りし、フラクションNo3
5〜N054(ピークフラクションNo45)に目的物
R−M 1−−IとMS−Tyrとのカップリング化合
物(以下R−MT−I−1−yrど称す)を得た。 得られたR−MT−I−TyrはOD2aol1mでの
吸光度測定によりR−MT−11モルに対しTyr1モ
ルが導入されていることが確認されIこ。 ■ 上記■で)び7CR−MT−I−TVrをクロラミ
ン■−を用いる方法でJス下の通り標識化する。 即ちR−tvlT−I−1r541の0.5モルリン酸
塩II液(pH7,4>2011QにNa[” 5I]
<carrier free N、E、N、)1ミリ
キユーの0.5モルリ゛醜塩緩衝液20μQを加え、つ
ぎにクロラミン−T20μgを0.05モルリン酸塩緩
衝液20μQに溶解したものを加える。室温下に25秒
間撹1↑してチロシン100μgを0.05モルリン酪
基塩緩衝液00μQに溶解したものを加え反応を停止さ
せる。次いでこの反応混合物をセファデックスG−50
のカラム(IX80Cm)にかけ(溶出液0.1%ゼラ
チン、0.15モル塩化す1〜リウム及び0.02%N
aN3を含む0.05モルリン酸塩緩衝液、p H7,
4、流速7〜8.01tlQ/l+r) 、” 5 ■
raighたR −MT−I−丁yrを溶液形態で得る
。以下これを「標識抗原■」と称す。 比活性 2.25マイクロキユリ一/mQセファデック
スG−50にてゲル茅濾過しt、:結果カラムサイズ
1.6X50cn+ 流速 8鶴/hr 1フラクシヨン O: 9 mQ ビーク No47〜N054フラクシヨンメインビーク
N052フラクシヨン 溶出液 0.1Mリン酸塩緩傍液(pH7,4,)0.
15M NaCQ 実施(92 ■ 実施例1の■においてR−MT−Iに代えてR−M
T−Hを用いて、同様の操作によりR−M、T−nど
MB−Tyrどのカップリング化合物(以下R−MT−
II−’1”Vrと略す)を得た。 1すられたR−MT−II−Tyrは0D28Onll
lで吸光度測定によりR−MT−111モルに対しTV
r1モルが導入されていることが確認された。 ■ 上記■で得たR−MT−II−Tyrを用いて実施
例1の■と同様の方法により標識抗原を得る。 この標識抗原を「標識抗原■」と称す。 比活性 2.30マイクロキユリ一/mQレファデツク
スG−50にてゲル濾過した結果カラムサイズ 1.6
X50cm 流速 8鵬/1]r 1フラクシヨン 0−99鴨 ビーク No47〜N054フラクシヨンメインビーク
N052フラクション 溶出M O,IMIJンfi9塩緩丙ia (D H7
,4)0.15M Na CQ ○力価の測定 上記抗体の製造例で得られた各抗体の力価を次の通り測
定する。即ち抗体をそれぞれ生理食塩水で10.102
.103.104.105・・・・・・・・倍に希釈し
、これらのそれぞれ100μQに、125I標識抗原(
上記各実施例で得られる標識抗原を約9500cpmに
なるように希釈したもの)0.1mQ及び0.05モル
リンlli!塩緩衝液(p)I=7.4)(0,25%
BSA、10mMEDTΔ及び0.01%Na N3を
含む)0.2−を加え、4℃で24時間インキュベート
し、住成した抗体と1251標識抗原との結合体を、ポ
リエチレングリコール法及び遠心分n1法〈4℃、30
分間、3000ron+)ににり未反応(結合しない>
+2511I抗原から分訝し、その放()J綿をカラン
1〜し各希釈濃度における抗体の1251標識抗原との
結合率(%)を測定する。縦軸に抗体の1251標識抗
原との結合率(%)及び横軸に抗体の希釈倍率をとり、
各々の濃度において結合率をプロワ1−する。結合率が
50%となる抗体の希釈倍率即ち抗体の力価をめる。 又、上記と同様の方法ににリボ用1〜ルハンター法によ
り作成された125工標識抗原 (7oxicology and Applied p
l+armacolog、 。 55.94〜102.1980年、 31ocl+em
、 J 。 133.529〜539.1973年)を用いて抗体1
〜抗体Vを測定した結果を下記第1表に示す。 第1表 上記第1表より、本発明標識抗原がポル1−ンハンター
法による標識抗原より優れていることが判る。 くメタロチオネインのRIA法による測定〉0.05M
リン酸塩緩衝液0.2mQ(D l−1=7.4..0
.25%BSA、0.01MEDTA、、0.01%N
a N3及び200KIU1−ラジロール含有)に抗体
の製造例■で得た抗体Tの0.1戚(最終希釈倍率20
000) 、実施例1で得た標識抗原1の0.1回(1
0000cpm )及び被tf<F$、F2O、1mA
ヲ加工、4℃テ48時間インキベーションした後、さら
にラビット抗体(40倍希IR>0.1地、正帛つサギ
向消0.1m0(400希釈)及び0.05Mリン酸j
n1iffに15%1211度となるように溶かしたポ
リエチレングリコール0.2p、2を加え、空温にて3
0分間インキコベーションを行ない、4℃、30分間遠
心分離する。上清と沈澱物との放QJ活性を夫々γ−カ
ウンターにて測定してメタロチオネイン聞を標準曲線よ
り搾出する。尚標準曲線は、被検試第1としてR−MT
−I(標準品)を用いて上記と同様にして各希釈倍率で
の故Q1活性測定値をプロットすることによりめたもの
であり、5001)g/チューブ〜1100n/チ1−
ブの淵度内で十分な用伜−反応曲線が得られる。 上記において被験試料としてヒト尿を用い、高値を示し
た各検体(3種)につき夫々64倍まで希釈していき、
標準曲線と対比させた結果を第1図に示す。第1図にd
3いて箱軸(より/5o(B+F)%を示し、横軸はメ
タD y−オネイン濃度<ng/ヂコーブ)及び検体希
釈倍(げ1を示す。また図中(1)は標準曲線であり、
く2)〜(4)は夫々検体1〜3(ヒト尿)を示す。 第1図より検体における希釈曲線はいずれも標準曲線と
ほぼ平行しており、高感度でヒ1ヘーメタ口チオネイン
の測定が行ない()ることが判る。
第1図は本発明のラジオイノ1ノアツセイ法によるメタ
ロチオネインの測定結果を示すグラフである。 (以 上) 代理人 弁理士 三 枝 芙 二 ;、’、、、”’2
.・′
ロチオネインの測定結果を示すグラフである。 (以 上) 代理人 弁理士 三 枝 芙 二 ;、’、、、”’2
.・′
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ■ メタロチオネインに一般式 () で表わされる結合試薬を介してチロシンが結合されてお
り、該チロシンが放射性沃素により標識されていること
を特徴とする標識メタロチオネイン。 ■ メタロチオネインをラジオイムノアッセイにより定
♀するに当り、標識抗原としてメタロチオネインに一般
式 で表わされる結合試薬を介してチロシンが結合されてお
り、該チロシンが放射性沃素により標識されている標識
メタロチオネインを用いることを特徴とするメタロチオ
ネインの測定方法。 ■ メタロチオネインに一般式 で表わされる結合試薬を介してチロシンが結合されてお
り、該チロシンが放射性沃素により標識されている標識
メタロチオネインを標識抗原として含有することを特徴
とするメタロチオネイン測定用キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59039649A JPS60183557A (ja) | 1984-02-29 | 1984-02-29 | 標識メタロチオネイン及びこれを用いたメタロチオネインの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59039649A JPS60183557A (ja) | 1984-02-29 | 1984-02-29 | 標識メタロチオネイン及びこれを用いたメタロチオネインの測定法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS60183557A true JPS60183557A (ja) | 1985-09-19 |
Family
ID=12558926
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59039649A Pending JPS60183557A (ja) | 1984-02-29 | 1984-02-29 | 標識メタロチオネイン及びこれを用いたメタロチオネインの測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS60183557A (ja) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5272284A (en) * | 1975-12-12 | 1977-06-16 | Dainippon Pharmaceutical Co | Enzymeeimmunoassay reagent |
JPS5526493A (en) * | 1978-06-20 | 1980-02-25 | Commissariat Energie Atomique | Iodine compound useful as tracer and identificatin antigen in radioactive immunology |
JPS5714500A (en) * | 1980-06-30 | 1982-01-25 | Fujitsu Ltd | Method for pressed powder forming of product with cross groove |
-
1984
- 1984-02-29 JP JP59039649A patent/JPS60183557A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5272284A (en) * | 1975-12-12 | 1977-06-16 | Dainippon Pharmaceutical Co | Enzymeeimmunoassay reagent |
JPS5526493A (en) * | 1978-06-20 | 1980-02-25 | Commissariat Energie Atomique | Iodine compound useful as tracer and identificatin antigen in radioactive immunology |
JPS5714500A (en) * | 1980-06-30 | 1982-01-25 | Fujitsu Ltd | Method for pressed powder forming of product with cross groove |
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