JPS61172064A - 変性されたタンパク質分析物、とくにＨｂ Ａ↓１ｃの免疫アツセイ、およびそれに対する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、あるタンパク質を抗体試薬と結合する方法、
例えば、免疫アッセイの実施においてなされるような前
記方法に関する。とくに、本発明は抗体、その断片など
をタンパク質およびポリペプチド中の特異的線状ペプチ
ドエピトープに結合することに関する０本発明は、分析
的に意味のあるタンパク質、例えば、ＨｂＡｔｃとして
知られているヘモグロビンのグリコシル化された形態の
決定において有用である０個体の血液中のヘモグロビン
のグルコキシル化の程度の決定は、糖尿病のグルコース
レベルの調節の有用な指数を提供する。さらに、ＨｂＡ
１ｃ中のグリコシル化Ｎ−末端ペプチド残基を特異的に
認識するモノクローナル抗体が提供される。

タンパク質、とくに分析的に意味のあるタンパク質に結
合する抗体の特異性を改良することは絶えず必要とされ
ている。生物額的試料、例えば、血液の特異性検出は、
タンパク質の接近可能な独特の結合部位またはエピトー
プへ向けられる抗体試薬を得る能力により限定される。

特定のタンパク質の特異的検出のために最も望ましいエ
ピトープが抗体試薬への結合のために接近不可能である
か、あるいは限定された接近可能性をもつだけである場
合が存在する。

糖尿病の患者の血液試料中のＨｂＡｌｃとして知られて
いるヘモグロビンのグリコシル化された形態の決定は一
例である。ヘモグロビンはアミノ酸の４つまでのｆｉ（
サブユニット）から構成れたタンパク質のテトラマーで
あり、鎖の各々は約１４３単位でありかつ約６４．００
０の合計分子量を有する。この分子の１端（ベーターサ
ブユニットのＮｌ２−末端）に、グルコースと反応しう
るバリン単位が存在する。ヘモグロビンのグルコキシル
化は、グルコースＬおよびバリンのフルファーアミン基
を含む酵素でない反応により起こる。反応成分間のシッ
ク塩基の生成は、グルコースはｌ−デオキシフルクト−
バリンを形成するアマトリ転位を行う、この複合体は共
有結合でありかつ木質的に非可逆的ある。グルコキシル
化反応は、反応成分、例えば、ヘモグロビンおよびグル
コースの濃度により支配される。正常（糖尿病ではない
）個体において、合計のヘモグロビンのほぼ３％はグル
コキシル化されている。ベーター鎖のＮ−末端上に１−
デオキシフルクト−バリンをもつヘモグロビンテトラマ
ーは、グルコキシル化されているまたはＡｌ　ｃヘモグ
ロビンとして識別される。

糖尿病患者におけるグルコースレベルは血液中のグルコ
ースレベルに直接依存してグルコキシル化の速度を増加
させるために十分に高く、そして糖尿病の状態のひどさ
を反映する。ヘモグロビンでは、Ａ□　Ｃレベルは約５
〜１２％に上昇する。

ヘモグロビンの循環寿命は約１２０日であるので、グル
コキシル化ヘモグロビンの測定はその期間について平均
のグルコースレベルを反映する値を与えるであろう、特
に、グルコース分が高い食事は高いグルコキシル化ヘモ
グロビンまたは血清アルブミンレベルにおいて反映され
ないであろう、こうして、グルコキシル化ヘモグロビン
分の測定は平均の循環グルコースレベルのより正しい状
況を与え、こうして患者の病気の状態のより正しい状況
を与える。

米国特許第４，２４７，５３３号は、ＨｂＡ１ｃに対す
る抗体がＨｂＡｌ　ｃの注射により特別のヒツジにおい
てレイズされ（ｒａｉｓｅｄ）かつグルコキシル化され
ていないヘモグロビンで吸収されて、ＨｂＡｌｃとグル
コキシル化されていないＨｂとの間を区別するポリクロ
ーナル抗体を形成したと報告されている分析技術を開示
している６次いで、抗体は試料中のグルコキシル化ヘモ
グロビンの比率を決定する試験のための基準を形成する
。しかしながら、試験は適当な特異的を獲得するために
適当な免疫化ヒツジと抗体吸収を必要にする。したがっ
て、特定のポリクローナル抗体を生産することは経費が
かかりかつ困難である。この吸収のアプローチにより生
産される抗体調製物は、力価が低いことが報告されてい
る。このアプローチの再現性はまた問題を有する。なぜ
なら、ヒトヘモグロビンの臨床的試料の分析のための使
用を記載する最近の報告は存在しない。

ＨｂＡｌｃに対して特異的の抗体を得る他の試みは、米
国特許第４，４７８，７４４号に記載されている。これ
らの研究者は、正常のヘモグロビン分子の代わりに合成
ペプチドの免疫原を免疫化剤として使用した。この物質
を、通常血液流中にＨｂＡ１ｃをもたない動物、例えば
、ヒツジに注射した。この合成ペプチドの免疫原は、Ｎ
−末端ヘモグロビン配列中に最初の４〜ｌＯアミノ酸の
間に相当するアミノ酸配列を有するグルコキシル化ペプ
イチド残基から構成されていた。下に報告する引き続く
研究により、合成ペプチド免疫原に対してレイズされた
ヒツジポリクローナル抗面清は、グルコキシル化形態、
ＨｂＡ１ｃに対する検出可能な特異性をもたないことが
発見した。

したがって、問題のタンパク質への抗体試薬の特異的結
合を可能とする抗体試薬および結合条件を設計するため
のアプローチを開発する必要はまだ満足されていない、
グルコキシル化タンパク質１例えば、ＨｂＡ１ｃのよう
な特定のタンパク質の決定のための免疫アッセイを、先
行の研究者は案出することができなかったことが明らか
である。

定１ １ｊ−ム鮪　　　　　　　　　　１号 アルギニン　　　　　　　　　　Ａｒｇアスパラギン　
　　　　　　　　Ａｓｐグルタミン酸　　　　　　　　
　　Ｇｌｕ、ジｙ　　　　　　　　　　　　　Ｌｙｓセ
リン　　　　　　　　　　　Ｓｅｒ アスパラギン　　　　　　　　　　Ａｓｎグルタミン　
　　　　　　　　　　Ｇｌｎグリシン　　　　　　　　
　　　Ｇ１７プロリン　　　　　　　　　　　　Ｐｒ。

スレオニン　　　　　　　　　　　Ｔｈｒアラニン　　
　　　　　　　　　Ａ、　ａヒスチジン　　　　　　　
　　　　Ｈｉｓシスティン　　　　　　　　　　Ｃｙｓ
メチオニン　　　　　　　　　　Ｍｅｔバリン　　　　
　　　　　　　Ｖａｌ イソロイシン　　　　　　　　　Ｉｌｅロイシン　　　
　　　　　　　　Ｌｅｕチロシン　　　　　　　　　　
　Ｔｈｒフェニルアラニン　　　　　　　　Ｐｈｅトリ
プトファン　　　　　　　　　Ｔｒｐ特定のタンパク質
への高度に特異的な免疫結合は、前記タンパク質中の線
状ペプチドエピトープに対する抗体試薬を形成し、そし
て前記タンパク質を十分に変性してその中の線状ペプチ
ドエピトープを露出するかあるいは露出を増加した後。

前記抗体試薬を前記タンパク質と接触させることによっ
て達成できることが今回発見された。標的とされる線状
ペプチドエピトープは、一般原則として、少なくとも２
つ、通常１５より少ないアミノ酸単位からなる。エピト
ープはペプチド鎖のＮ−またはＣ−末端に現れることが
でき、あるいはタンパク質中のペプチド鎖に沿って現れ
ることができ、そしてペプチドではない基および側鎖、
例えば、炭水化物、例えば、モノ−、オリゴ−１および
多糖基、リン酸塩、脂質、硫酸基、カルバミル、スルホ
キシドなど、およびタンパク質に主鎖へ共有結合するこ
とを発見することができる他の化学的基を包含する基で
変性することができる。

このような基は、後翻訳修飾（ｐｏｓ’ｔ−ｔｒａｎｓ
ｌａｔｉｏｎａｌ　　ｍｏｄｆｆ１ｃａｔｆ。

ｎ）により付加することができるものを包含し、前記修
飾は酵素が仲介するものであるか、酵素でない化学的反
応の結果であることができ、それゆえ環境的露出により
引き起こされるタンパク質中で自然に起こりうる修飾を
包含する。抗体試薬は１通常、免疫原担体物質、通常問
題のタンパク質と異る物質へ結合した線状ペプチドエピ
トープからなる合成ペプチドに対してレイズされるであ
ろう、モノクローナルでありかつ線状ペプチドエピトー
プに対して高い特異性について選択される抗体を得るた
めの体細胞の交雑技術を用いることがとくに好ましいで
あろう。

タンパク質の変性は、タンパク質の有意量を溶液中に維
持しながら、抗体の結合のために選択されたペプチドエ
ピトープを露出するか、あるいはその露出を増加する木
質的に任意の方法で達成することができる。物理的処理
または化学的処理、後者はタンパク質の消化を含む、を
最適な変性条件の選択に利用できる。必要な変性の程度
は、各タンパク質についてかつ得られる免疫結合の意図
する用途の各々、例えば、所望の免疫アッセイの条件に
ついて本質的に経験的に決定されるであろう、変性の効
果は、少なくとも選択されたペプチドエピトープが存在
するタンパク質の区域を実質的に直線化しかつそれを抗
体試薬への結合に十分な取囲む水性培地へそれを露出す
ることである。

本発明は、タンパク質がその自然状態にあるとき、免疫
結合に対して実質的に接近不可能であるか、あるいはそ
のための制限された接近可能性を有する線状ペプチドエ
ピトープに、抗体試薬を結合させることによって、タン
パク質を決定する免疫アッセイの実施および試薬系の調
製を可能とする。とくに、グルコキシル化タンパク質、
例えば、グルコキシル化ヘモグロビンおよびアルブミン
、とくに血液のような生物学的流体中のＨｂＡＩＣの高
度に特異的な決定のための手段が提供される。ＨｂＡｌ
ｃ中に現れる合成グリコシル化Ｎ−末端ペプチド残基に
対してレイズされたモノクローナル抗体は、ヘモグロビ
ンのグルコキシル化ベーターサブユニット中のこのよう
な残基へ特異的に結合することがわかった。抗体は慣用
のモノクローナル技術に従い種々の方法で調製すること
ができる０Ｍ理的には、免疫Ｍ担体へ化学的に結合した
所望のＮ−末端ペプチド残基からなる合成的に誘導され
た免疫原に対する抗体を調製し、前記グルコキシル化ペ
プチドは少なくとも２つ、好ましくは約５〜１５のＨｂ
Ａ１ｃに対応するアミノ酸単位を有する。得られる抗体
はグルコキシル化合成ペプチドおよびヘモグロビンＡＩ
Ｃ分子中の対応する露出されたエピトープに対して特異
的である。

ポリペプチドまたは調製は、溶液中で３次元の構造を形
成するアミノ酸の直線の配列として存在する。タンパク
質のこの３次元構造の自発的獲得を制御する因子は、次
のものを包含する：１、　　ＣおよびＣ′炭素原子のま
わりの制限された回転（ψ結合の回転）およびＮ−Ｃ窒
素−炭素結合のまわりのａｍされ た回転（φ結合の回転）を有するペプチド結合の平担な
・構造、この制限された回転はペプチド結合のまわりの
運動を制限しかつ可能な立体配座を減少する。

２、　すべてのシス−ポリペプチドは側鎖の原子のため
の利用−可能な立体配座の空間をきびしく制限するであ
ろうから、アミノ酸側鎖（Ｒ−基）はトランス配向を有
する。

３、　ペプチドの主鎖および側鎖の興る官能基間の相互
作用はポリペプチドの３次元の折りたたみの原・因とな
り、そしてこれらの相互作用゛の合計はタンパク質がこ
の立体配座を保持するエネルギーを提供す る。

これらの相互作用は“、吹のものを包含する： （ａ）　　分散力−ここで振動する２極は隣接原子間を
結合して、２つの 原子間の吸引力を生成する。こ れらの力は電子の外殻の反発に より反作用を受ける（すなわ ち、２つの原子は同一空間を占 めることができる）。

（ｂ）　　水素結合−ここで水素原子の全体の電子の外
殻は、水素が拘束 される原子（水素受容体）、ｆ：に シフトする。

（ｃ）　　静電力−ここで異る型の原子は非対称電子分
布を有し、これに より反対電荷をもつ原子と相互 作用しうる部分的電荷をもつ。

この相互作用は、簡単な２極相 工作用であることができ、ある いは塩橋として存在することが できる。

（ｄ）　　二硫化物の結合−システィアミノ酸のＳＨ基
間の前記二硫化物 の結合はタンパク質の立体配座 な安定化する。二硫化物の結合 は、前述の分散力、水素結合お よび静電力により開始されるタ ンパク質の３次元の折りたたみ に対して二次的である。

４、　　タンパク質と水性の環境との間の相互作用は、
水溶性タンパク質のセルファセンブリ−の有機化に強力
な効果を有する。

極性の水分子はタンパク質の表面上の疎水性基を溶媒和
し、そして分子の内部の中への疎水性アミノ酸側鎖のキ
レート化合物の形成に熱力学的に有利である（その結果
、水分子は同様な疎水性環境中に存在す□る）、既知の
タンパク質の最近の研究において、ａ水性アミノ酸Ｐｈ
ｅ、Ｌｅｕ、１１ｅ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒは中
性または極性アミノ酸よりも多い埋没された表面積を有
する［サイエンス（Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ）２２９　：　
８３４・　　　−８３８，１９８５）］。

タンパク買の表面の表面上の残基の多くは疎水性である
ことおよび埋没される残基は極性であるか、あ・るいは
帯電していさえすることができることにも注意すべきで
ある。埋没された極性基はタンパク質の内部の水素結合
の要件を満足し、七゛　　　してすべての内部の極性基
の９０％程度に多くは水素結合に含まれる。同様に、タ
ンパク質の内部中の帯電したアミノ酸塩橋中に最も含ま
れやすい。

タンパク質の立体配座は、次のような構造の階層に分割
することができる： ｌ、　−次構造はポリペプチドの線状アミノ酸配列であ
る。

２、　二次構造は、ポリペプチド鋼が水素結合により安
定化される方法に起因する。

３、　三次構造は、ポリペプチド鎖のその３次元構造へ
のポリペプチド鋼の折りたたみである。この構造は水素
結合、静電相互作用、疎水性相互作用により、および二
硫化物の結合により安定化される。

４、　四次構造は、２つのポリペプチド鋼・が相互作用
するとき、形成される構造に起因する。相互作用の型は
、三次構造についてのものと同一である。

前述のポリペプチドとポリペプチドとの相互作用および
ポリペプチドと水性環境との相互作用は、自然タンパク
質分子の複雑な折りたたみおよび生ずる３次元構造の原
因である。この折りたたみの情報は、ポリペプチドのア
ミノ酸配列（−次構造）中に暗号化される。多くの場合
において。

自然タンパク質は物理的または化学的変性により完全に
変性されることができ（二次構造、三次構造および四次
積増の欠損により証明される）そして変性剤を除去する
と、構造および機能が自然タンパク質と区別されえない
分子に再び折りたたまれるであろう［アドバンシズーイ
ン・プロティン・ケミストリー（Ａｄｖ、　　Ｒｒｏｔ
、　　Ｃｈｅｍ、）２９　：　２０５−２９９．１９７
５；ジャーナル・オブ・バイオロジカル−ケミストリー
（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ
、）２５１　：　３１５４−３１５７．１９７６］　。

折りたたみ過程はエネルギー的に有利であり、そして得
られる自然３次元の立体配座はその最小エネルギー状態
にある（かあるいは少なくともそれに近い）、ポリペプ
チドの３次元の立体配座への折りたたみの結果、あるア
ミノ酸は分子の表面上において懸濁溶媒中に自由に接近
可能であり、−力値のアミノ酸は埋込まれておりかつ溶
媒へ接近不可能である。この概念は大量の生物学的デー
タにより、およびまたタンパク質の内部中のアミノ酸に
対するタンパク質の表面上のアミノ酸の化学的反応性の
差により支持される。

３次元の立体配座は決して合成の構造ではない、＃述の
相互作用のほと元どは比較的弱く、そして絶えず破壊し
かつリフォームされつつある（しかしながら、一度に合
計の結合のほんのわずかの百分率が破壊されるだけであ
る）、最小の相゛　工作用をもつペプチドセグメントは
より大きい数の相互作用をもつペプチドセグメントより
も大きい移動性をもつことを期待できるであろう、より
大きい移動性をもつセグメントはより大きい数の立体配
座をもつことができ、それらの１つは抗体と相互作用す
ることができる。自然タンパク質のこれらの移動性部分
は最も抗原性である部分であることが示唆された［ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１２：１２７−１２４．１９
８４］。

抗原と抗体との間の相互作用は、タンパク質構造を安定
化するものと同一である（すなわち、水素、帯電性、疎
水性結合）、特異的でありかつ十分に親和性である相互
作用のためには、２つの相互作用する表面の相補性およ
び反対に帯電した基の適当な並置を維持して塩橋、水素
結合の共与体および受容体および疎水性ポケットを形成
することが必要である［アニュアル・リビューズｅオブ
・イムノロジー（Ａｎｎ、　　Ｒｅｖ、　　Ｉｍｍｕｎ
ｏ　１　、）１　：８７−１１７．１９８３１　、相補
性が変化したとき（例えば、アミノ酸の置換）、抗原に
対する抗体の親和性は劇的に変更されうる。

抗原上の接触部位は２つの郡（１）直線または連続（ｓ
ｅｑｕｅｎｔｉａｌ）のものおよび立体配座のもあに分
割することができる［アニュアル・リビューズφオブ・
イムノロジー（Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）２：６７−１０１．１
９８４］、　　　　・ 直線または連続の決定因子は、はぼ２〜２５の範囲のア
ミノ酸、通常１０より少ないアミノ酸を有するタンパク
質配列の単一の直線のセグメント上に全体の抗原決定因
子が存在するものである。

立体配座の決定因子は、連続に距離をもって存在するペ
プチドの部分がタンパク質の抗原の３・次元の折りたた
みにより密接に接触しているものである。したがって、
抗原決定因子またはエピトープはタンパク質の抗原の１
より多い部分から形成されている０例えば、リソチーム
およびリンチームに対するモノクローナル抗体を用いる
Ｘ回折の研究により、その抗体はリソチームと位１ｉ２
９−３７および１１６−１２９において接触することが
示された。−これらのアミノ酸は連続的に分離されてい
るが、リソチーム分子の表面上においてほぼ２０Ｘ２５
Ａの連続的パッチ（ｐｉｔｃｈ）を形成し、そして抗体
結合部位の多数の原子と相互１作用する［ネイチ−１−
−（Ｎａｔ　ｕ　ｒｅ）　３１３　：１５８−１５８．
１９８５］、また、立体配座の・　決定因子を認識する
抗体はタンパク質の変性された形態を認識しないであろ
うということがいえる。

抗タンパク賀抗体を発生するための免疫化の慣用の手順
において、自然または半自然のタンパク質を動物に注射
し、この動物は時間が経過すると免疫原に対する免疫グ
ロブリンを生産する。ポリクローナル抗血清は、連続お
よび立体配座の両者の抗原決定因子を認識する抗体を含
有する可能性が最も強い、これらの決定因子は、自然タ
ンパク質の表面上に位置する可能性が最も強い０例えば
、インフルエンザのウィルスの赤血球秦集素の膜の糖タ
ンパク質は４つの主要な抗原決定因子を有し、それらの
３つは糖タンパク質の表面に対して局在化されている［
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２８９　：　３６６−３７
３および３７３−３７８．１９８１］。

合成ペプチドまたは自然分子からの小さいペプチドを免
疫原として使用すると、得られる応答は連続の決定因子
（およびペプチドが到達できる限定された数の立体配座
）に対するもののみであることができる。自然タンパク
質（合成ペプチドと同一の配列を有する）へ結合を有す
る抗体応答を生成する免疫原として合成ペプチドを使用
する試みにおいて、研究者らはいくつかの極性アミノ酸
を有する区域について自然タンパク質の配列を通してサ
ーチすることによって、免疫原を最初に設計した［Ｒｅ
ｖ−サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２９：９３２−９
４０．１９８５］、これらの配列は自然タンパク質の表
面上に存在する可能性が統計学的により大きく、そして
抗体分子を自由に反応することができるであろう、しか
しながら、これらの親木性残基は疎水性ペプチドよりも
免疫原性に劣り、それゆえ他の合成された免疫原は、こ
れらの疎水性配列が表面の抗原上に露出されることを希
望して、疎水性に基づいたことが、また、考えられた０
両者の場合において、これらの方法により生産される抗
体の高い比率は見掛上自然の抗原と反応し、これにより
合成ペプチドが自然タンパク質の表面上において見出さ
れうる配列に相当するかぎり、合成ペプチドに対してレ
イズされる抗体は自然抗原と反応性であることが示唆さ
れる［ネイチ＋−（Ｎａｔ　ｕｅ）２９９　＝　５９２
−５９６，１９８２］、見掛上自然のタンパク質と反応
するタンパク貿内に埋込まれると理ｍすべきペプチドに
相当するある場の合成ペプチドに対して生産される抗体
についての報告がいくつか存在する（ＰＮＡ５　８Ｇ＝
４９４９−４９５３．１９８３）、この観察にどんな機
構が原因となっているか明らかでない。

本発明に従い、自然タンパク質を目的をもって変性して
最適に連続または線状の抗原決定因子を露出して、この
ような決定因子に対して生産された抗体と相互作用する
ようにさせる。とくに、真に自然の抗原を含有する新鮮
な試料を必要とするアッセイにおいて、抗原の変性は絶
対の要件であろう、自然のタンパク質のエゼトープが表
面にあるいはその付近に存在し、したがって抗体の相互
作用のために部分的に露出されると、変性はその移動性
を増加しかつそれが獲得することができる可能な立体配
座の数を増加することができ、これにより抗体−抗原相
互作用を促進する。

多くの存在する免疫アッセイのフォーマットは、低濃度
の洗浄剤１例えば、トリトンおよびツイーン−２０の使
用を包含して、古典的な抗体抗原反応における反応成分
の非特異的吸着を防止し、生物学的膜からタンパク質を
解離させ、あるいは脂質タンパク質からの脂質を解離し
て脱脂質されたタンパク質の均質試料を提供する［バイ
オへミカ２・エト・バイオフィジヵ・アクタ（Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ａｃｔａ）６２０
：４４７−４５３，１９８０；クリニカル・ケミストリ
ー（Ｃ１ｉｎ、　　Ｃｈｅｍ、）２８：１９９−２０４
，１９８１］、本発明の表現された目的は、物理的およ
び／または化学的変性剤を使用して自然タンパク質の二
次的、三次的および四次的構造を変性することによりタ
ンパク質抗原のタンパク質または糖タンパク質の決定因
子を露出することである０次いで、露出されたペプチド
エピトープは開放され、そして合成ペプチドの立体配座
をとることができ、それに対して抗体が生産された。

抗体試薬の立体的接近は、任意の効果的方法において傅
ることができる。無傷のタンパク質中のエピトープの露
出は、物理的または化学的変性または消化により少なく
ともエピトープの区域において達成されると理解される
。このような変性または消化はエピトープの区域に位置
することができるか、あるいはタンパク質の三次、およ
びさらに二次構造のより一般的な、あ６いは実質的に完
全な変性、あるいはタンパク質の部分的または完全な消
化を含むことができる。

変性は種々の方法で達成することができ、このような方
法は物理的手段、例えば、熱、音波処理、高いもしくは
低いＰＨによるタンパク質の慣用の処理および、好まし
くは、消化または溶液中のチャオドローピック剤（ｃｈ
ａｏｔ　ｒｏ　ｐ　ｉ　ｃａｇｅｎｔ）もしくはチャオ
トロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）との相互作用による化
学的変性を包含する。有用なチャオドローピック剤は、
次のものを包含するが、これらに限定されない：グアニ
ジン、尿素、および種々の洗浄剤、例えば、ドデシルＷ
ｔ＃ナトリウム（ｓ　ｎ　ｓ）および他のもの（これら
に限定されない）、例えば、デオキシコレートそしであ
る種の胆汁酸塩類、３−（３−コラミドプロピル）−ジ
メチル−アンモニオループロパンスルホネート、有機溶
媒１例えば、メタノール、プロパツール、アセトニトリ
ルおよびある種の塩類、例えば、千オシアン酸カリウム
、１＃イオン性洗浄剤、例えば、トリトンＸ、ツイーン
、ノジデット（ｎｏｎｉ　ｄｅｔ）ＮＰ−４０およびオ
クチル−グルコシド類は、また、タンパク質変性剤とし
て機能することができる。二硫化結合を還元する試薬（
例えば、メルカプトエタノールまたはジチオスレイトー
ル）を含有させて、変性過程を有効に促進することがで
きる。化学的および／または化学的および物理的手段の
組み合わせ（例えば、グアニジンおよび熱、グアニジン
および５０５．またはグアニジンおよびジチオスレイト
ール）を使用すると、タンパク質の変性は最も効果的に
達成することができる。とくに、強いチャオトロープ、
例えば、グアニジンは最も好ましい、もちろん、タンパ
ク質の実質的の凝集、不溶性化または沈殿を生じさせて
、露出された無意味の量が抗体結合のために溶液に接近
可能となるような変性条件は回避されるであろう、有意
量のタンパク質は溶液または懸濁液の中に残留して、有
用な免疫結合を得るようにしなくてはならない、可溶化
の必要性の程度は、意図するまたは所望の結合の環境に
依存するであろう。

特定の試験試料中の所望のタンパク質の有意量を、前記
試料を存在するチャオトロープの水溶液と生ずる水性混
合物中のタンパク質の有意量を変性するために十分な濃
度において組み合わせることにより、変性して抗体結合
のためにペプチドエピトープを露出することができる。

全血が）ｆｂＡ１ｃの決定における試料である場合、チ
ャオトロープは、また、赤血球を溶解し、Ｈｂを開放し
かつプロテアーゼを不活性化する役目をする。グアニジ
ンの場合において、混合物中の濃度は好ましくは約１モ
ルよりも大きく、約３モルの濃度はとくに有用である。

変性過程は混合物を短、時間加熱することによって有意
に加速される。３７℃以下の温度において、チャオトロ
ープによる変性はｌ−数時間を要することがあり、これ
に対して５０℃以上の温度において、十分な変性は一分
以内で達成することができる。抗体および引続いて混合
物に添加すべき他のタンパク賀試薬の変性を防止するた
めに、試料−チャオトロープの混合物を、通常、別の工
程として、あるいは試薬溶液の添加により、希釈し、希
釈のレベルはチャオトロープがこのような試薬の変性に
実質的に無効で゛　あり、しかも問題のタンパク質の有
意な正常化を防止することによりエピトープの暴露を保
存する、（うなレベルである。グアニジンについて、こ
れは好ましくは約１．０モル以下の濃度への希釈を必要
とし、約０．３モルはとくに好ましい。

消化のために本発明において使用するタンパク質加水分
解酵素の非制限的例は、トリプシン、キモトリプシン、
プロリン特異的エンドプロテアーゼ、ペプシンおよびパ
パインを包含する。免疫アッセイの実施において、タン
パク質加水分解酵素の阻害剤を、既知のように、アッセ
イ混合物に十分な量で添加してタンパク質のアッセイ剤
の消化を防止する。

本発明は、本質的にいかなる所望のタンパク質にも適用
することができ、このようなタンパク質は低分子量を有
するもの、例えば、５０００ダルトン以下のもの（ここ
で使用するとき、タンパク質という用語はそれらの分子
量のためポリペプチドと呼ぶことができる化合物を包含
する）ならびに数ｌＯ万以上の分子量を有するものを包
含する。タンパク質の代表的な部類は、プロタミン類、
ムコタンパク質類、糖タンパク質類、グロブリン類、ア
ルブミン類、リンタンパク質、ヒストン類、リポタンパ
ク質、クロモタンパク質、およびヌクレオタンパク質を
包含する０本発明のとくに有利な面は、医学および獣医
学の診断学の分野におけるような問題のタンパク質の結
合の特異性および検出の改良への一般的アプローチを提
供するということである０本発明は、高度の免疫原性な
らびに抗体結合の特異性および親和性を与えることがで
きるエピトープのためのタンパク質中のそうでなけれが
接近不可能であるかあるいは未知の線状ペプチド断片を
スフｌ）−ニングする機会を提供する。したがって、本
発明の応用は、特定のタンパク質を抗体試薬に結合しよ
うとする場合および前記タンパク質のための変性条件を
それ自体与える場合を包含する。

本発明は、とくに、特定のタンパク質分析物の特異的決
定のための免疫アッセイおよび試薬計への適用可能であ
る０本発明は、新しい有用な線状ペプチドエピトープを
発見しかつ問題のタンパク質中のこのようなエピトープ
の接近可能性を増加する機会を提供する。それは生物学
的または分析学的意味のあるペプチドでない修飾により
特徴づけられるタンパク質の検出においてとくに適用す
ることができる０本発明の方法は、抗体試薬を設計しか
つ結合条件を確立して、特徴づけるエピトープが自然タ
ンパク質中の抗体結合へ接近不可能であるかあるいは限
定されたそれへの接近可能性のみをもつ場合において、
タンパク質の特異的検出を成功させあるいは改良するこ
とを可能とする機会を提供する。とくに医学および診断
学の分野において、このようなタンパク質の例はそれら
自体を示唆し、そしてグルコキシル化タンパク質、例え
ば、グルコキシル化ヘモグロビン（飼犬ば、Ｈｂ　　Ａ
１ｃ）およびグルコキシル化アルブミンを包含するであ
ろう０本発明は、さらに、より特異的でありおよび／ま
たはタンパク質の通常露出された部分上の抗体の形成お
よび結合に利用可能であるものよりも高い結合親和性を
有するタンパク質中のエピトープの発見において応用で
きる。所望のウマ動物を適当に変性された形態のタンパ
ク質またはその断片で免疫化することにより、得られる
免疫応答を所望の特異性および／または親和性を示す抗
体について検査することができる。この応用の拡張は、
纒胞分析物１例えば、血球、およびバクテリアおよびウ
ィルスを包含する微生物などの特異的検出においてであ
る０表面タンパク質抗原への抗体の結合により提供され
る検出の特異性を改良することが望ましい場合において
、表面タンパク質および／または細胞内のりンパク質を
変性して改良された抗体応答を捜すことにより内部のエ
ピトープを検査することができる。

試験試料またはアッセイ媒質中のタンパク賀分析物を変
性して、線状ペプチドエピトープに対して特異性である
本発明の抗体試薬を使用するタンパク質分析物の免疫ア
ッセイ決定は、本質的にいかなる慣用の技術に従うこと
もできる。このような技術は、免疫拡散、免疫電気泳動
、凝集技術、および補体固定、ならびにより普通に用い
られている技術、例えば、放射線免疫アッセイおよび非
同位元素法のような特異的に検出可能な標識の使用を包
含する０本発明を用いるタンパク質分析物の免疫アッセ
イの実施は、含まれる水性試験試料を処理してその中の
このようなタンパク質の有意量を効果的に変性して所望
の線状ペプチドエピトープを露出し、変性された試料を
抗体試薬と接触させ、そしてこのようなタンパク質への
抗体試薬の結合を決定する必須工程を含む、決定工程は
、もちろん、含まれる基本的免疫アッセイ技術に従って
変化するであろう、この決定を実施する普通の技術は標
識試薬の使用を包含し、そして前記標識試薬は分析物ま
たは抗体試薬のいずれかと相互作用しかつ分析物と抗体
試薬との間の免疫複合体の形成を示し、あるいはこのよ
うな形成と拮抗（ｃｏｍｐｅｔｅ）させる方法で使用さ
れる。

後者の技術は広い種々のフォーマットで、例えば、標識
結合試薬をつくって抗体試薬への結合について調製分析
物と拮抗させる拮抗的結合フォーマットで実施すること
ができる。抗体試薬へ結合する標識試薬、またはそのよ
うに結合しない標識試薬からなる遊離種の量は、適当に
適当に測定され、そして試料中のタンパク質暗試薬の量
に関数的に関係ずけることができる０本発明の抗体試薬
はタンパク質分析物中の線状エピトープへ向けられるの
で、標識試薬変性されたタンパク質または変性されたそ
の断片の標識付けされた形態、あるいは、好ましいよう
に、アミノ酸の線状エピトープ配列からなるペプチド残
基の標識付けされた形態であることができる。後者の好
ましい試薬は入手可能な合成ペプチドの方法および装置
により調　。

製することができ、そしてタンパク質分子量自体の単離
、精製および変性を必要としない。

タンパク賀分析物の他の有用な免疫アッセイ技術は、サ
ンドイッチ技術として知られたものである。この方法に
おいて、２組の抗体試薬を使用し、それらの一方は標識
付けされており、そして他方はタンパク質分析物へ結合
された究極的に標識付けされた第１抗体試薬を結合しな
いものから分離するために適合するであろう、標識付け
されない第２抗体試薬は、典型的には、この分野におい
て知られているように、固定化された形態または固定化
可能な形態である。

放射線免疫アッセイにおいて、遊離種および結合種は物
理的に区別するかあるいは分離して標識を測定するよう
にしなくてはならない、なぜなら、標識により発生され
る信号は両者の種において性質的に同一であるからであ
る。このような技術は、相分離を必要とするので、不均
質としてこの分野におい−て知られている。他の不均質
免疫アッセイ技術が知られており、その例は酵素標識免
疫アッセイ（時にはＥＬＩＳＡ技術と呼ばれる）（米国
特許第３，６５４，０９０号参照）および蛍光免疫アッ
セイ（米国特許第４，２０１゜７６３号、米国特許第４
．１３３，６３９号および米国特許第３，９９２，６３
１号参照）である。

かなり最近において、多数の免疫アッセイ技術が開発さ
れた。それらは結合相手、例えば、抗体による標識試薬
の結合時に検出可能な信号が変調される標識の使用によ
り分離工程を排除する。このような技術は均質として知
られるようになり。

そして利用可能であるとき、分離が不必要でありかつ放
射性同位元素が含まれないので、本発明における使用に
好ましい、いくつかのこのような技術は蛍光のクエンチ
ング（ｑｕｅｎｃｈｉ　ｎｇ）および増大（米国特許第
４，１６０，０１６号参照）、エネルギー伝達免疫アッ
セイ（米国特許第３．９９６．３４５号参照）および二
重抗体立体障害免疫アッセイ（米国特許第３　、９３５
　、０７４号および米国特許第３．９３５．９４３号参
照）である、とくに好ましい均質免疫アッセイは、酵素
−触媒反応に参加する標識を用いるものである０例は基
質−触媒免疫アッセイ（米国特許第４，２７９，９９２
号および米国特許第１，５５２．６０７号参照）、補欠
分子族（ＦＡＤ）−標識免疫アッセイ（米国特許＄４，
２３８，５６５号参照）、酵素モジュレーターー標識免
疫アッセイ、例えば、阻害剤標識を使用するもの（米国
特許第４，１３４，９７２号および米国特許第４．２７
３．８６６号参照）および酵素−標識免疫アッセイ（米
国特許第３．８１７，８３７号参照）である。

本発明の抗体試薬は、問題の特定のタンパク質中の線状
ペプチドエピトープについてのその特異的結合親和性に
より特徴づけられる。したがって、ここで使用するとき
、用語「抗体試薬」はこのようなペプチドエピトープに
ついて特異的である抗体結合部位を含むいかなる方法で
得らる物質をも意味する。したがって、このような表現
は抗体全体ならびにそれらの適当な断片または多官能化
形態を包含する。抗体全体の形態にあるとき、それは既
知の免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの綱
および亜綱に属することができる。ペプチドエピトープ
について特異的結合親和性を保持するこのような免疫グ
ロブリンのいずれの断片、例えば、従来Ｆａｂ、Ｆａｂ
’およびＦ（ａｂ’）２として知られているＩｇＧの断
片をも使用することができる。さらに、免疫グロブリン
の凝集体、ポリマー、誘導体、複合体、および雑種また
はそれらの断片は適当ならば使用することができる。

抗体試薬の免疫グロブリン源は、利用可能な方法、例え
ば、慣用の抗血清およびモノクローナル技術において得
ることができる。抗血清はよく確立された手順、例えば
、動物、例えば、マウス、ウサギ、モルモットなどを適
当な免疫原で免疫化する手順によって得ることができる
。免疫グロブリンは、また、体細胞の交雑により得るこ
ともでき、このようにして得られるものはモノクローナ
ル抗体と普通に呼ばれている。

モノクローナル抗体試薬は特に好ましい、ハイブリドー
マ細胞系統をレイズしてタンパク質全体に対するよりは
むしろタンパク質分子の線状ペプチドエピトープ部分に
対してのみ抗体を生産し、そしてこのような細胞系統お
よびそれらの抗体をスクリーニングして所望のエピトー
プと選択的に反応するモノクローナル抗体を同定しかつ
単離する。

このような抗体を生産する１つの方法において、天然に
産出する線状ペプチドエピトープ配列に相当しかつそれ
からなる、タンパク質類の断片タンパク質担体へ結合し
そして実験動物に注入して免疫応答を引き出す、あるい
は、免疫原はタンパク質またはその断片の直線化または
変性された形態からなることができる。リンパ球、例え
ば、免疫化動物からの肺細胞を骨髄腫細胞と融合してハ
イブリドーマを生産し、これを培養しかつモノクローナ
ル抗体の生産についてスクリーニングする。モノクロー
ナル抗体をペプチドエピトープに対して選択的であるも
のについてスクリーニングし、そして特定の細胞系統を
クローニングして。

それ以上の量のモノクローナル抗体の生産に使用する。

実験動物、例えば、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス、ラ
ットなどにおける合成ペプチド免疫原に対する抗体を生
産するために、所望のエピトープからなるペプチドを生
産しかつ天然に産出するタンパク質から単離するか、あ
るいは化学的に合成しかつ精製する。このようなタンパ
ク質の断片は所望のエピトープの臨界的アミノ酸単位の
すべてを含み、そして追加のアミノ酸単位を含むことが
でき、それらの一部またはすべては問題のタンパク質の
アミノ酸配列に相当してもよい。

エピトープ含有ペプチド断片が最適に抗原性であること
を確保するために、それを複数で免疫原担体物質へ結合
することが有利であることがある。免疫Ｍ担体物質はペ
プチド残基への結合に利用可能である官能基を有する従
来知られたもののいずれから選択することもできる。多
くの場合において、担体はタンパク質またはポリペプチ
ドであるが、十分な大きさおよび免疫原性を有する他の
物質、例えば、炭水化物、多糖、リポ多糖、核酸などを
同様に使用することができる。大部分について、免疫原
タンパク質およびポリペプチドは４．０００〜１０，０
００，０００、好ましくは１５．０００より大きく、よ
り通常５０，０００より大きい分子量を有するであろう
、一般に、動物種から採取したタンパク質は、他の種の
血液流中に導入したときに免疫原であろう、とくに有用
であるタンパク質はアルブミン類、グロブリン類、ヘモ
シアニン類、グロブリン類などである。

慣用の免疫原担体物質およびそれへハプテンを結合する
技術に関する技術状態については、次の文献を参照する
ことができる：バー力−（Ｐａｒｋｅｒ）、生物学的に
活性な化合物の放射線免疫アッセイ（Ｒａｄｉ　ｏｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙｏｆ　　Ｂｉｏｌｏｇ１ｃａｌｌｙ
　　ＡｃｔｉｖｅＣｏｍｐｏｕｎｄ）、プレンチスーホ
ール（Ｐｒｅｎｔ　ｉ　ｃｅ−Ｈａｌ　１）（ｚングル
ウッドｅクリ−／７ス（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ　　Ｃｌ　
　ｉ　ｆ　ｆＳ）、米国ニュージャージ州、１９７６年
］　；パトラ−（Ｂｕｔｌｅｒ）、ジャーナル・オブ・
イムノロジカル・メッソッド（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｌ　、　
　Ｍｅｔ　ｈ、）７：　１−２４　（１９７４）；ウニ
インリブ（Ｗｅｉｎｒｙｂ）およびシュロフフ（Ｓ　ｈ
　ｒ　ｏ　ｆ　ｆ）−ドラッグ・メタポリズム・リビュ
ーズ（Ｄｒｕｇ　　Ｍｅｔａｂ、　　Ｒｅｖ、）ｌｏ：
２７１−２８３　（１９７４）；プラーフトン（Ｂｒｏ
ｕｇｈｔｏｎ）およびストロング（Ｓｔｒｏｎｇ）、ク
リニカル・ケミストリー（ＣＩ　ｉ　ｎ、　　Ｃｈｅｍ
、）２２ニア２６−−７３２　（１９７Ｂ）：およびプ
レイフェアー（Ｐｌａｙｆａｉｒ）ら、ブリティッシュ
拳メディカル・ブレチン（Ｂｒ、　　Ｍｅｄ、　　Ｂｕ
ｌ　１　、）３０　：　２４−３１　（１９７４）。

所定の免疫Ｍ担体物質へ結合するエピトープの数は、担
体上の有効結合部位の穀によってのみ制限され、そしで
ある種の高分子量の合成ポリペプチド、例えば、ポリリ
ジンの場合において数１０００程度に高くあることがで
きる。特定の担体上のエピトープの密度は相体の分子量
および有効結合部位の密度に依存する。最適のエピトー
プ密度は、免疫原の合成の容易さおよび再現性および抗
体の応答を考慮すると、含まれる担体上の有効結合基の
約ｌθ％〜約５０％の間に入る。

ペプチド断片は慣用の結合法により担体物質へ結合され
る。断片中の自然アミノ酸上の官能基または断片の化学
的修飾により導入される官能基を通常使用して、担体上
の官能基へ直接にあるいは二官能性結合剤を介して結合
する。担体への明瞭な結合を得るために単一の独特に反
応性の官能基を有するように、ペプチド断片を設計する
ことが好ましいであろう。

とくに、本発明は、今回、生物学的流体、例えば、全血
の中のグルコキシル化ヘモグロビンの高度に特異的な免
疫アッセイ決定のための手段を提供する。ＨｂＡ、Ｃ中
に現れる合成グリフシル化Ｎ−末端ペプチド残基に対し
てレイズされたモノクローナル抗体は、ヘモグロビンの
グルコキシル化ベーターサブユニット中のこのような残
基に特異的に結合することがわかった。抗体は慣用のモ
ノクローナル技術に従い種々の方法でｒｌＩｗすること
ができる。免疫原担体へ化学的に結合した所望のグリコ
シル化Ｎ−末端ペプチド残基からなる合成的に誘導され
た免疫原に対する抗体が調装され、前記グルコキシル化
ペプチドはＨｂＡ１ｃに相当するアミノ酸単位を少なく
とも２つ、好ましくは約５〜１５有する。得られるモノ
クローナル抗体！±グルコキシル化合成ペプチドおよび
ヘモグロビンＡｌ　ｃ分子についての対応する露出した
エピトープに対して特異的である。

ヒト血液中に存在する）ｌｂＡｌｃに対して特異的なモ
ノクローナル抗体は、合成ペプチド免疫原で免疫化した
動物から採取したリンパ球と骨髄腫細胞との融合から誘
導されるハイブリドーマにより分泌される０合成ペプチ
ド免疫原は、好ましくは次の式をもつであろう： ［Ｇｌｙｃｏ−（ＮＨ）Ｖａｌ−Ｈｉｓ−−ＡＡ−Ｒ−
］　ｎ−Ｃａｒｒｉ　ｅ　ｒ式中、Ｇｌ　ｙｃｏ−（Ｎ
Ｈ）Ｖａｔは非酵素的にグルコキシル化されたバリン残
基を表わし、Ｈｉｓは自然ベーターサブユニットＨｂ配
列を表わし、ＡＡは結合あるいは１または２以上のアミ
ノ酸残基であり、Ｒは適当な結合基であり、Ｃａｒｒｉ
ｅｒは免疫原担体物質であり、モしてｎ（エピトープ密
度）は平均１ないしＣａｒｒｉｅｒ上の有効結合部位の
数である。結合基Ｒは任意の所望の結合試薬から成るこ
とができ、モしてＡＡはヒトヘモグロビンのベーターサ
ブユニットのＮ−末端を有する炭水化物に相当するｌま
たは２以上の追加のアミノ酸残基を含むことができる０
例えばＡＡ−はロイシン単位で開始する次のアミノ酸配
列またはその任意の連続的断片から選択することができ
るニ ーＬｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−さらに、
結合基Ｒは正常のヒトヘモグロビン中に存在しない追加
のアミノ酸単位から成ることができるが、前記アミノ酸
単位は便利にはペプチド合成法により付加することがで
きかつ担体物質への結合のために有用な官能基として働
くことができる。とくに有用な結合基は−Ｔｈｒ−Ｔｈ
ｒ−Ｃｙｓであり、これは担体物質へグルコキシル化ペ
プチド単位を制御して結合するための固有のチオール基
を提供する。

本発明のモノクローナルＨｂＡ１ｃ抗体は、主として、
ヒトヘモグロビンのベーターサブユニットのＮ−末端ペ
プチド配列のグルコキシル化形態を結合するためのその
特異性によって特徴づけられる。このグルコキシル化残
基はＨｂ　　Ａ。

Ｃの区別されうる構造の面である０本発明の抗体は、グ
ルコースと末端アミンどの間の反応生成物の７マドリ転
位時に形成する１−デオキシフルクトシル炭水化物単位
を最小比率で含むエピトープまたは決定部位と、自然Ｈ
ｂ　　Ａ□Ｃ配列に相当する位置においてＨｂＡｌｃの
Ｎ−末端配列のアミノ酸単位の少なくとも１つからなる
それから延びるペプチド配列とを必要とする。このエピ
トープを特徴づけるペプチド配列中の他のアミノ酸単位
は、自然ＨｂＡ１ｃ配列中に現れるものと同一であるか
あるいは異ることができる。このようにして、このエピ
トープは抗体との少なくとも２つの接触部位または結合
部位により特徴づけられ、前記部位はグルコキシル化Ｎ
−末！ＷｂＡＩＣ配列に対して独特である。好ましくは
、抗体あは次の式のグルコキシル化ペプチド残基と特異
性に結合するであろう： Ｇｌｙｃｏ−（ＮＨ）Ｖａｌ−Ｈｉｓ−ＡＡ一式中、Ｇ
ｌｙｃｏ−（ＮＨ）ＶａｌおよびＡＡは上に定義した通
りである。とくに好ましいモノクローナル抗体は、ＡＡ
の性質に無関係にグルコキシル化ジペプチド残基につい
て特異的であることがわかった。より大きい長さのグル
コキシル化ペプチド配列を特徴とする特異性をもつ抗体
がまた得られ、ＡＡはヒトヘモグロビンのベーターサブ
ユニットのＮ−末端に相当する１−１２、好ましくは１
〜６アミノ酸の配列である。モノクローナル抗体のこの
ような特異性は、１（ｂＡ１ｃの露出したグルコキシル
化Ｎ−末端ペプチド残基の特別の検出を可能とし、ヘモ
グロビンおよびヒト血液流に対して自然である他のタン
パク賀およびペプチドの上の他のグルコキシル化エピト
ープを実質的排除する。

自然ＨｂＡ１ｃ分子上のグルコキシル化Ｎ−末端ペプチ
ド残基は、アッセイすべき試料中のタンパク質の適当な
変性または消化により本発明のモノクローナル抗体また
はその断片に接近可能とされる。先行技術の試みが失敗
した特異的抗体を得ることにおける本発明の成功につい
ての基本的仮説をここで説明するが、その正当性は本発
明の発明性に対して臨界的であると解釈すべきではない
。

ヒトヘモグロビンのベーターサブユニットのＮ−末端配
列はマウスヘモグロビンの対応する配列に非常に類似し
、最初の４つのアミノ酸は同一である。第２に、マウス
ヘモグロビンはヒトヘモグロビンとほぼ同程度にグルコ
キシル化されている。こうして、自然ヒトヘモグロビン
分子において、ベーターサブユニー／　）のＮ−末端配
列はマウスにより異質であると見られず、そして免疫応
答は期待されないであろう、これは先行技術の研究者ら
の論理であり、彼らはそれに応じて非常に異るヘモグロ
ビンタンパク質配列をもち、かつ免疫応答を得ることを
希望して、グルコキシル化されない動物（ヒツジ）を選
択した。しかしながら、本発明によると、グルコキシル
化Ｎ−末端残基を合成ペプチド免疫原の形態でマウス免
疫系に暴露すると、マウスが免疫学的に応答することが
できる形状でエピトープが提示されることが明らかにさ
れた０体細胞のクローニングに技術により、高度に特異
的な抗体を分泌するハイブリドーマを単離することがで
きる０分泌された抗体は、自然ヘモグロビン分子中のグ
リコシル化Ｎ−末端ペプチド残基へ、それが抗体上の結
合部位との相互作用のために十分に露出された場合、結
合するであろう、エピトープの露出の方法を下の詳述す
る。

詳しくは、ハイブリドーマ細胞系統をレイズして全体の
タンパク質よりはむしろヘモグロビン分子のグルコキシ
ル化部分に対してのみ抗体を生産しそしてこのような細
胞系統およびそれらの抗体をスクリーニングして、その
後グルコキシル化ＨｂＡ１ｃエピトープと選択的に反応
するであろうモノクローナル抗体を同定しかつ単離する
。

このような抗体を生産するために、天然に産出するグル
コキシル化ペプチド配列に相当する、タンパク質鎖の断
片をタンパク質担体へ結合し、そして実験動物に注入し
て免疫応答を引き出す、免疫化動物からの牌細胞のよう
なリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生
産し、これを培養しかつモノクローナル抗体の生産につ
いてスクリーニングする。モノクローナル抗体をグルコ
キシル化ペプチドエピトープに対して選択的なものにつ
いてスクリーニングし、そして特定の細胞系統をクロー
ニングして追加量のモノクローナル抗体の生産に使用す
る。

実験室の動物、例えば、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス
、チー２トなどの中に抗体を生産するために、グルコキ
シル化ヘモグロビン断片を生産しかつ天然に産出するヒ
トヘモグロビンから単離するか、あるいは化学的に合成
しかつ精製しなくてはならない。

ヘモグロビン断片は１−デオキシフルクトース残基およ
び少なくとも２つ、好ましくは３．４．５またはそれよ
り多いヘモグロビンのベーターサブユニットのＮ−末端
（バリン−ヒスチジン）に相当するアミノ酸残基を含む
べきである。有利には、それは約５〜１５、好ましくは
約７〜ｌＯ単位を含む。

グルコキシル化ペプチド断片が最適に免疫原性であるこ
とご確保するために、それを有利には担体物質へ結合す
ることができ、この担体物質は大きい免疫原分子、例え
ば、ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）またはキーホー
ルリンペットへモジアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　　ｌｉｍ
ｐｅｔ　　ｈｅｍ。

ｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）からなる、この断片は、また
、グルコース−バリン反応の自然の転位付加物を有すべ
きであり、この付加物は単離された天然に産出するヘモ
グロビン断片の場合におけるよに、最初から存在するこ
、とができ、あるいは、好ましくは、合成ペプチドの合
成の間にあるいはそのペプチドを大きいタンパク質担体
へ結合する前にそのペプチド上に形成することができる
。担体は断片の抗原性を破壊しない方法で添加すること
ができる。

グルコキシル化断片は天然に産出するＨｂ、例えば、Ａ
ｌｃの化学的または酵素的消化により生産することがで
きる。この断片は担体へ古典的結合手順を使用して、例
えば、グルタルアルデヒドまたはカーポジイミドを使用
して結合することができ、そして複合体を免疫原として
使用することができる。

既知のヘモグロビン配列の一部を化学的に合成する好ま
しい方法は、１または２以上のアミノ酸単位（正常の配
列中に存在しない）を付加してその抗原性および結合性
質を最適化することを含む、この場合において、最後の
単位はチオール（Ｓ　Ｈ）基を有し、これによりそれを
配位子へ慣用法により、例えば、二官能性結合試薬、例
えば、ｍ−マレイミドベンゾイルＮ−スルホスクシンイ
ミドエステル（ＭＢＳ）との反応により結合することが
できる。

好ましい実施態様に従い、８単位ＮＨ，−バリン−ヒス
チジン−ロイシン−スレオニン−プロリン−グルタミン
酸−グルタミン酸−リジン−Ｃ００Ｈを有する合成Ｈｂ
断片のリジン端へ、チロシン、チロシンおよびシスティ
ンを付加して、ｌｌ一単位のシスティン−末端ペプチド
を得た。

これは慣用法でグルコースとの非酵素的反応によりグル
コキシル化するとができる。その後、グリコペプチドを
大きい担体へ結合して抗原を生産し、これを投与して抗
体を生産する。グルコース化ペプチドエピトープに対す
る抗体を生産する動物からのリンパ球を次に慣用法で融
合してハイブリドーマを生産し、そしてこれをクローニ
ングし、そして所望の規格のモノクローナル抗体を生産
するものをさらにサブクローニングする。グルコキシル
化されないＷｂと対照的に、モノクローナル抗体がグル
コキシル化エピトープに対して最大の選択性を示すｌま
たは２以上の細胞系統を、次いで、増殖しそして抗体を
収穫する。このようなモノクローナル抗体の技術につい
ては、次の文献を参照することができる：リンパ球のハ
イブリドーマ類（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　　Ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａｓ）、メルチャーズ（Ｍｅｌｃｈｅｒｓ）ら編
、スプリンガーーベルラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ　
ｒ　ｌ　ａｇ）　　にニーヨーク１９８フ）。

ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）２６６：４９５　（１９７
７）：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０８：６９２　
（１９８０）　：およびメソッズーイン・エンジモロジ
ー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　ＥｎｚＶｍＯＩＯｇＦ
）７４（部Ｂ）：３−４６　（１９８１）。

次いで、抗体を慣用法に従い既知量のグルコキシル化Ｈ
ｂを含有する血液試料と反応させ、そして反応の程度を
目盛定め標準と比較してグルコキシル化の程度を決定す
ることができる。読出しは、蛍光により、免疫アッセイ
などにより、適当な読むことができる基をモノクローナ
ル抗体べ既知の方法に従い、ＨｂＡＩｃ中のグルコキシ
ル化エピトープについてのそれらの結合力を損失せずに
、接合することによって実施することができる。

あるいは、試薬の試験ストリップに基づくアッセイを実
施することができ、ここでカルボキシル基を有する物質
、例えば、カルボキシメチル−セルロースを木材または
プラスチック上に被覆する０次いで、このストリップを
溶解しかつ変性した未知の血液試料中に浸漬し、これに
よりグルコキシル化されてるかあるいはされていないヘ
モグリビンを吸着する０次いで、このストリップを、Ｈ
ｂＡ１ｃエピトープとの結合を妨害しない部位において
標識付けされた（例えば、酵素、蛍光、コファクターな
どで）適当なモノクローナル抗体の溶液中に浸漬する。

結合した抗体の量をストリップ上の標識の量により決定
し、そしてこれは既知の試料中のグルコキシル化Ｈｂの
量の指示である。標識の取り付けおよびその読出しは慣
用方法に従い実施する。

上の式中の結合基Ｒは本質的に任意の便利な安定構造で
あることができる。このような結合基Ｒは通常１〜２０
個の炭素原子を有し、水素を排除し、かつ異種原子、例
えば、窒素、酸素、およびイオウを含む詣肪族鎖の形態
であろう、グルコキシル化残基は種々の基、例えば、メ
チレン、エーテル、千オニーチル、イミノなどを介して
接合して結合鎖Ｒを形成することができる。当業者は広
い種類の結合基を有し、その中から選択して免疫原をつ
くることができるであろう０通常、グルコキシル化ペプ
チドは担体分子中の適当な基への結合反応において活性
である官能基、例えば、アミノ、カルボキシル、チオー
ル、ヒドロキシル、またはマレイミドにおいて終るよう
に調製されるであろう。

次の実施例により１本発明をさらに説明する。

実施例１ ＨｂＡ１ｃ中のグリコペプチドエピトーブに・　　　　
　・　　　び　　づけ ａ　）　８　Ｎ　−末ｔ４単位のベーターヘモグロビン
＋２単位のチロシン＋１単位のシスティンからなる１１
−アミノ酸ペプチドを、グッテ（Ｇｕｔｔｅ）、Ｂおよ
びＲ，Ｂ、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｆｅｌｄ、）
；ジャーナル・オブ・アメリカンｅケミカル拳ソサイア
ティ（Ｊ、　　Ａｍ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、）、
９１：２，５０１　　（１９６９）に従い合成して、次
のペプチドを得た：ＮＨ２−／＜リン−ヒスチジン−ロ
イシン−スレオニン−プロリン−グルタミン酸−グルタ
ミン酸−リジン−チロシン−チロシン−システィン−Ｃ
ＯＯＨ。

このペプチドをグルコキシル化するため、２００ｍｇの
この精製したペプチドを２０ｍ１の無水ピリジン中の０
．２５モルのグルコースと４８時間室温において暗所で
反応させる。この混合物を真空乾燥する。得られるシロ
ッープを２０ミリモルのリン酸カリウム、ｐＨ２，９５
中に再懸濁し、モしてＨＰＬＣにより精製する。

ポリペプチドを含有する分画をｏ、１モルの酢酸トリエ
チルアンモニウム、ｐＨ８，５中に溶解し、モしてアフ
ィゲル（Ａｆ　ｆ　ｉ　ｇｅ　ｌ）　−６０。

１ボロネート親和雅樹脂［バイオラド（Ｂ　ｉ　ｏ　ｒ
ａｄ）］のクロマトグラフィーにかけ、これによりグリ
コペプチドを選択的に吸着させる。この樹脂を０．１モ
ルの酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ８，５で洗浄し、
そしてグリコペプチドを０゜１モルの酢酸トリエチルア
ンモニウムＰＨ８，５で溶離する。溶離液を凍結乾燥す
る。

生成物を１ｍｌの水中に再懸濁し、５００倍モルの過剰
のジチオスレイトールと反応させ（システィンのＳＨ基
を回復し）そして還元されたペプチドをＨＰＬＣにより
再精製し、そして凍結乾燥する。このグリコペプチドを
一２０℃においてＮ２中でさらに使用するまで貯蔵する
。

ｂ）ＫＬＨ−ＭＢＳ複合体（ＣＯｎｊｕｇａｔｅ）、ラ
ーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）、Ｒら、プロシーディング・オ
ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ
ｒｏｃ、　　Ｎａｔ　ｌ　。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、）７８：３４０３（１９８１）
に以前に記載された、を（ａ）の生成物と２倍モル比の
グリコペプチド対マレイミドにおいて担体上で５０ミリ
モルのリン酸カリウムｐＨ７。

２中で１時間室温において反応させる。

Ｃ）（ｂ）における溶液を等体積のフロイント完全アジ
ュバントと混合して油中木型エマルジョンを形成し、そ
して２００ＩＬｇの複合体をＢＡＩ。

Ｂ　／　ｃ　Ｂ　ｙマウスに注入する。マウスを３０日
および６０日において促進し、殺し、モして肺臓を：ｌ
−５−　（Ｋｏｈｌｅｒ）およびマイルスティン（Ｍｉ
　１ｓｔｅｉｎ）ｌネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５
６　：４９５　（１９７５）に従う融合に使用し、多数
のハイブリドーマを生産する。／＼イブリドーマをスク
リーニングして、グルコキシル化ペプチドエピトープに
対して特異的であるモノクローナル抗体を生産する。

ＡＨｃ特異的モノクローナル抗体についてのスクリーニ
ングをＥＬＩ　ＳＡＡｔ−マットを使用して実施し、こ
こで抗体をポリスチレンのマイクロタイター板（ｍ１ｃ
ｒｏｔｉｔｅｒ　　ｐ　　ｌ　　ａ　ｔｅ）［リンプロ
（Ｌｉｎｂｒｏ）］上に吸着させる。抗体は精製された
ヒ）Ａｔ　Ｃおよびグルコキシル化されていないＡ、ヘ
モグロビンである。

ＡＩＣを赤血球溶血物から２つの異るクロマトグラフィ
ー手順により精製する。第１精製は、ピアース・ケミカ
ル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ　　Ｃｈｅｍ１ｃａｌ　
　Ｃｏ、、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、１１１　ｉ　ｎｏ　ｔ　
ｓ　、Ｕ、Ｓ、Ａ、製品番号４２．０００）に記載され
るようなポロネート親和性樹脂上にグルコキシル化ヘモ
グロビンを結合させることから成る。典型的には、１〜
５ｇのへモグロビンをｌｏｏｍｌのポロネート樹脂へ適
用し、そして結合した（糖ヘモグロビン）分画をピアー
ス・ケミカル中カンパニー、グリコテスト・プレチン（
ＧｌｙｂｃｏＴｅｓｔ　　ｂｕｌｌｅｔｉｎ）、製品番
号４２，０００に記載されるように溶離する。溶離され
たグリコヘモグロビン分画を、マクドナルド（ＭｃＤｏ
ｎａｌｄ）、Ｍ、ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、
）、２５３：２３２７−２３３２　（１９８７）に記載
されるようにして、低イオン強度の緩衝液中で平衡化し
、そしてイオン交換樹脂のクロマトグラフィーにかける
。Ａｌ　ｃ　ｒピーク」を等電集束（ｉｓｏｅｌｅｃｔ
ｒ１ｃ　　ｆｏｃｕｓｉｎｇ）によりおよびチオバルビ
ッル酸を使用する炭水化物分析により分析し、そして結
果はその精製された物質中で超純粋Ａ１ｃヘモグロビン
を生産したこの精製が、両者の炭水化物を有し、かつ等
電点において正常Ａ０ヘモグロビンと異ることを確証す
る。同様にへ〇ヘモグロビンは、ポロネート親和性樹脂
へ結合しない性質およびイオン交換クロマトグラフィー
精製におけるＡｏ　「ビーク」としてイオン交換による
クロマトグラフ、イーによって精製される。純粋なＡｌ
ｃおよびＡ、ヘモグロビンを、４℃において一夜別々の
マイクロタイター板［２ｕ、ｇ／１００マイクロリット
ルＰＢＳ／ウェル（ｗｅ　１１）　］上に吸着する。板
をＰＨ３中の１％のＢＳＡ中で室温においてブロッキン
グし、次いでＰＨ３中で４回洗浄する。各ハイブリドー
マ細胞系統からの上澄みをＡ１ｃおよびＡｏ板に添加し
、室温において６０分間インキュベーションする。板を
ＰＨ３中で４回洗浄し、そして二次抗体［ウサギ抗マウ
ス−ＩｇＧ−ペルオキシダーゼ、マイルス・ラボラトリ
ーズ会インコーボレーテッド（Ｍｉｌｅｓ　　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、Ｅｌｋｈａｒｔ、Ｉｎｄ
ｉａｎａ　　Ｕ。

Ｓ、Ａ、）、ＰＨ３中の１％ＢＳＡ中のｌ：５０００希
釈］を適用し、そして室温において６０分間インキュベ
ーションする。この板をＰＨ３中で４回洗浄し、そして
２００マイクロタイターの基質溶液を添加する（２４．
３ミリモルのクエン酸、ｐＨ５，３，２，２ミリモルの
。−）二二レンジアミンおよび５．２ミリモルの過酸化
水素を含有する）、この反応を２０分後５０マイクロタ
イターの８モルのＨ２ＳＯ，の添加により停止し、そし
てペルオキシダーゼ反応の生成物を４９２ｎｍにおいて
読む。

ヘモグロビンに対する抗体を生産する２００の出発ハイ
ブリドーマから、９はＡｌｃに対して特異的であるとし
て同定され、これに対して１９１はＡＨｃおよびグルコ
キシル化されないヘモグロビンの両者と反応する。予備
免疫化マウス血清はＥＬＩＳＡ手順によりＡｏまたはＡ
１　ｃに応答する検出可能な抗体をもたないので、主要
な免疫応答はＡ、およびＡ１　ｃに共通に所有されてい
る８ペプチド配列に対するものである０合成ペプチド免
疫原はヘモグロビン配列の８アミノ酸残基から成るので
、主要マウス免疫応答はペプチドに対して向けられ、炭
水化物には向けられない（２００ハイブリドーマのうち
１９１はＡＯおよびＡｔｃの両者と反応する）０期待さ
れるように、免疫マウス血清は、また、ＡＯおよびＡｌ
ｃの両者と反応性の広く交差反応性の抗体を有し、これ
によりハイブリドーマがＡｌｃに対して反応性であるが
ＡＯに対して反応性でないことについてスクリーニング
されないかぎり、ＡＩＣに対する特異性は得られないこ
とが示唆される。Ａｒｃハイブリドーマに対する抗体を
生産する好ましいハイブリドーマおよびＡｏヘモグロビ
ンに対する抗体を生産しない好ましいハイブリドーマは
、それぞれＡＴＣＣＨＢ　　８６３９およびＡＴＣＣＨ
Ｂ８６６９と表示されて１９８４年１０１１日および１
９８５年７月１０日にＡＴＣＣに受託された。

ｄ）抗体にへの結合についてＡ、Ｈｅ拮抗するペプチド
の同定： グルコキシル化１１−アミノ酸親ペプチドＧｌｙｃｏ−
Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｓ−Ｔｙｓ−Ｃｙｓ（グリコペプチ
ド１） を酵素消化により、次のペプチド類を発生させる： すべてのペプチド断片をＨＰＬＣにより精製し。

そしてアミノ醜配列により定量する。前記親ペプチドの
チロシン消化は、 Ｇｌｙｃｏ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ　（グリコペプチド２） を生産する。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、 Ｇｌｙｃｏ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ
（グリコペプチド３） を生産する。ペプチドＧｌｙｃｏ−Ｖａｔ−Ｈｉｓ−Ｆ
ＡＤ（グリコペプチド４）（ここでジペプチドをＮａ−
７ミノヘキシルＦＡＤに結合し、次いでグルコキシル化
される）は、カリニおよびジョンソンへの米国特許第４
，２５５，５６６号によりつくられ、モしてアメス・デ
ィビジョン。

マイル・スラボラトリーズ（Ａｍｅｓ　　Ｄｉｖｉｓｉ
ｏｎ、Ｍｉｌｅｓ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎ
ｃ、、ＥｌｌＣｈａｒｔ、ＩｎｄｉａｎａＵ、Ｓ、Ａ、
）（７）キン９イツプ（Ｋｉｎ　　Ｙｉｐ）博士および
Ｒ，バラフラー（Ｂｕｃｋｌｅｒ）博士により提供され
る。

典型的な拮抗アッセイにおいて、１００＃１のＰＢＳ−
７，２ミリモル（７）Ｎａ２　ＨＰＯ４、２。

８ミリモルのＮａＨ２ＰＯ略、１２７ミリモルのＮａＣ
１％　ｐＨ中の各ペプチドの８ナノモル〜８ピコモルを
１００１Ｌｌのモノクローナル細胞上澄み液とともに６
０分間室温においてインキュベーションする。この混合
物をＩｇｌのＡＨｃヘモグロビン／ウェルで被覆された
ポリスチレンのマイクロタイター板に添加する。ペプチ
ドを抗体と拮抗させると、抗体は固定化Ａ１ｃへ自由に
結合しない、この板をＰＢＳで４回洗浄する。第２抗体
（セイヨウワサビのペルオキシダーゼと結合したウサギ
抗マウスＩｇＧ）を３０分間添加し、そして板をＰＢＳ
中で洗浄する。基質（０−フェニレンジアミン２．２モ
ル）および過酸化水素（０゜０１２％）を添加し、そし
て生成した生産物を４９２ｎｍにおいて測定する。生産
物の定量は拮抗の程度を反映し、例えば、生産物なしは
拮抗するペプチドが固定化ＡＨｃへの結合に対して抗体
を完全にブロック（ｂｌｏｃｋ）したことを示す。

結果は、Ｇ　ｌ　ｙｃｏ−Ｖａｌ−Ｈｉ　５−ＦＡＤを
包含する前述のグリコペプチドのすべて４種類が有効な
拮抗体であることを示す、抗体の１つ、Ａｂ−４、はＡ
ｌｃへの結合に対してグリコペプチド１〜４により完全
にブロックされる（第１図〜第３図参照）、他の抗体、
Ａｂ−３、はグリコペプチド１〜３によりブロックされ
るが、グリコペプチド４によりブロックされない（第１
図〜第３図参照）。

炭水化物を欠損するペプチドは拮抗阻害を示さず、これ
により炭水化物がエピトープの必須成分でありかつＡ１
ｃヘモグロビンの抗体の認識について特異性を提供する
ことを示唆する（第１図参照）。

実施例２ Ｈｂ　　Ａ　　ｃについ　　　　　　　アーセイこの拮
抗的免疫アッセイ（ｃｏｍｐｅｔ　ｉ　ｔ　ｉｖｅ　　
ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）は、溶解全血中のＡｌ　ｃと
固定化抗体への結合について拮抗するハ゛ブテンー標識
の固定量の使用に基づく（実施例５に記載するように）
、抗体はＡ１ｃおよびハプテンの両者を認識するので、
標本中のＡＨｃのレベルは抗体へ結合するハプテンの量
を決定する。

抗体は固定化されるので、すべての結合しない反応成分
は簡単な洗浄工程により除去される０次いで、結合した
ー識を測定し、モしてもとの血液試料中のＡＨｃの定量
について標準と比較する。

全血を標本として使用す゛るアッセイを開発し、そして
これを下記の工程の分割することができる： （１）ヘモグロビン　′　または　　Ｉ最終のアッセイ
は０．３マイクロタイターより少ない全血を必要とする
ので、精確にピペ−／　トで取ることのできる血液［フ
ィンガー拳スティック（ｆｉｎｇｅｒ　　５ｔ１ｃｋ）
または全血からの５〜５ｏｐＨを変性溶液（３モルのグ
アニジンＭＣＩ、１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ　　ｐ
　　Ｈ７，５）中に希釈し、２〜１５分間５６℃に加熱
する。より低い温度も有効であるが、追加の時間を試料
の変性に必要とするであろう、この変性は（ＪＬ）試料
が抗凝固剤中で調製しない場合、凝血機構を不活性化す
る；　（ｂ）赤血球を溶解する：（Ｃ）プロテアーゼ、
酵素などを変性し、そしてヘモグロビン上のＡＩ　Ｃエ
ピトープを最適に露出する；　（ｄ）試料を非無菌的に
調製しかつ取扱う（例えば、フィンガー・スティックか
らの血液）場合でさえ、変性された血液試料中の微生物
の生長を滅菌または阻害するように思われる：および（
ｅ）最終のアッセイを影響を及ぼさないで室温において
数日間貯蔵することができる。

（２）亙水上１１１１ 変性された全血のアリコートを、ハプテン−標識を含有
する緩衝液の４倍体積中にピペットで入れる。これは効
果的にヘモグロビンを希釈してアッセイに適当な濃度に
し、そして変性物を低濃度に希釈して抗体または酵素の
活性を混乱さ゛せる０次いで、抗体で被覆したビーズを
特定した時間の間添加し、その間抗体はＡｌ　ｃヘモグ
ロビンまたはハプテン−ＨＲＰに結合する。

（３）Ｌｉ上主互１３ 拮抗的インキュベーションに引続いて、ビーズを洗浄し
、そして標識を適当な基質の添加後読む０次いで、信号
を標準および決定したもとの全血血液試料中に存在する
Ａｌｃの量と比較する。

使用したアッセイの詳細を下に要約する：く二！四１Ｌ
１王１ ポリスチレンビーズ［０，６３５ｃｍ（１／４インチ）
の直径、鏡面仕上げ（ｓｐｅｃｕｌａｒｆｉｎｉｓｈ）
］をプリーシジョン・ボール・カンパニー（Ｐｒｅｃｉ
ｓｉｏｎ　　Ｂａ１ｌ　　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｃｈ１ｃａ
ｇｏ、ｌ１ｌｆｎｏｉｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）から入手する
。ロフトを同一試料の多数回の免疫アッセイの決定にお
ける最低の変動を提供するビーズについてスクリーニン
グする。被覆の前に、ビーズを無水メタノールで洗浄し
、次いで水で洗浄する。メタノールの洗浄は、同一試料
の多数回の決定について変動の補正を有意に低下させる
ように思われた０次いで、抗体溶液（０，２モルのホウ
酸ナトリウムｐＨ８。

５．０．０２％のアジ化ナトリウム中の５ＪＡ−ｇ抗体
／１００ＩＬ１）を添加してビーズを湿潤させ、そして
ビーズを４℃において一夜回転させた０次いで、ビーズ
を洗浄し、０．０２％のアジ化ナトリウムを含有する１
％のＢＳＡでブロックする。

典型的には、５００〜１０００個のビーズを一度に被覆
し、そして１週間使用し、抗体活性の損失の証拠は存在
しない、放射性抗体を用いる被覆は、０．５ｐｇ／ビー
ズの抗体の結合を示す。

これらのビーズは比較的高い量の蛋白質を結合する性質
をもつため、これらのビーズをこの免疫アッセイにおい
て使用する。ポリスチレン上への蛋白質の疎水性吸収は
便利であるが、蛋白質がポリスチレン、官能化樹脂、ま
たはシリカへ便利に結合するいくつかの手順の１つを代
わりに使用できることは確かである。また、ポリスチレ
ンは管またはキュベツトの形であることもできる。

作業のプロトコール（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）は、次に要約
する通りである： （ａ）５０１Ｌｌの全血を１．Ｏｍｌの変性溶液（３モ
ルのグアニジンＨＣ１，ｌＯミリモルのトリスｐＨ７，
５）中に希釈し、５６℃に１５分間加熱し、再び１００
　＃Ｌ　ｌ　＠　ｌ　、　Ｏｍ　ｌの変性剤中に希釈す
る。

（ｂ）ｓｏ＝ｔの上の溶液を０．５ｍｌのハプテン−Ｈ
ＲＰ化合物温度リン酸塩緩衝化塩類溶液（ＰＢＳ）ｐＨ
７，５へ添加する。インキュベーション、洗浄および酵
素反応を４８ウエルのポリスチレン組織培養根中に便利
に実施される。

（Ｃ）抗体被覆ビーズを添加し、そして３０分間周囲温
度において揺動しながらインキュベーションする。

（ｄ）ビーズを緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄する（通常３〜
１ｍｌの交換）。

（ｅ）０−フェニレンジアミン基質および過酸化水素を
添加する。

（ｆ）２０分後、この反応を停止しそして２０分後生産
物を読む、上のアνセイを使用して、後述の臨床的デー
タを確立する。グリコペプチドｌを使用する拮抗を第５
図に示す、正常の共与体および糖尿病の共与体の評価を
第６図に示す、ボロネートの親和性決定を、ピアース・
ケミカル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ　　Ｃｈｅｍ１ｃ
ａｌ　　Ｃ０、）（グリコテスト、製品番号４５，００
０）に精確に記載するように実施する。

実施例３ Ａ　Ｃエピトープ　　　な ヒトＡｌｃエピトープの最適な反応性は、エピトープを
抗体結合部位へ露出する手順または試薬を使用する自然
ヘモグロビン（全血または溶血物中）の処理後に見られ
る。エピトープの最適な露出は、物理的変性（熱、音波
処理など）により、古典的変性剤を含む化学的手順（尿
素、グアニジン、５０５、プロテアーゼ）により、ある
いは物理的手順および化学的手順の組み合わせにより達
成することができる。全血（５０ＩＬｌ）を３モルのグ
アニジン塩酸塩、ｌＯミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７，４の１ｍｌの溶液へ添加し、そして５６℃に１分以
上加熱する。得られる試料はＡｌ　Ｃエピトープについ
ての引続く免疫アッセイにおいて最適にはたらく、この
溶液を１０倍に緩衝液中に希釈し、効果的にグアニジン
は０．３モルに希釈され、この濃度は、正常抗体−抗原
相互作用および酵素活性へ、なんらかへ影響を及ぼした
としても、それがほんのわずかでり、引続く免疫アッセ
イへの適当な媒質を提供する。

実施例２の拮抗的免疫アッセイを用いる。全血試料を３
．０モルのグアニジン中に２０℃、３７℃または５６℃
において０〜３２０分間入れる。

結果（第７図）は時間とともに２０℃または３７℃にお
いてエピトープが露出され、こうしてハプテン−ＨＲＰ
複合体と効果的に拮抗することを示す、５６℃において
、エピトープは５分後に最高に露出され、最も早い点が
このアッセイにおいて決定される。この結果は、自然ヘ
モグロビンＡＩＣテトラマー中において、エピトープは
埋込まれ、接近不可能であり、そして線状合成グリコペ
プチド−ＨＲＰ複合体と拮抗しないことを示す。

しかしながら、ヘモグロビンＡ１ｃが変性されると、新
しく露出されるエピトープは線状グリコペプチド−酵素
複合体について効果的な拮抗体となる。

実施例４ 抗体特異性−ヒツジポリクローナル応答対マスモノクロ
ーナル・　− ヒツジ（５ｈｅｅｐ）を、フロイント完全アジュバント
中で、実施例１　（ｂ）のグリコペプチド−ＫＬＨ複合
体（４ｍｇ）で免疫化、５部位、ＩＭ、する。促進注射
を同様に３０日後および６０日後に実施する。６０日の
促進はフロインド不完全アジュバント中で実施する。予
備免疫血清、および免疫血清を、実施例１　（ｃ）に記
載するように、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてそのＡｌｃ
８よびＡｏの特異性について力価決定する。結果（第７
図参照）は、合成グリコペプチドが免疫応答をヒトヘモ
グロビンに対して刺激するが、免疫グロブリン類がＡ１
ｃについて特異的でないことを示す。これと対照的に、
Ａ１ｃについてのマウスモノクローナル抗体は、同一ア
ッセイにおいて測定したとき（実施例１ｃのＥＬＩＳＡ
アッセイ−第８図参照）、Ａｌｃについて非常に特異的
である。ヒツジ抗血清からのＡｌｃについて特叉的であ
る抗体を免疫親和性精製する試みは成功しなかった。

実施例５ ハプーン　　　　　の・ グリコペプチド１　（ＨＲＰ）の複合体を調製した。１
５ｍｇのセイヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
をＩＯＸモル過剰のＭＢＳ（実施例１ｂ参照）と５０ミ
リモルのリン酸ナトリウム、１ミリモルのＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ７，０中で反応させることにより、ハプテン−ＨＲＰ
を調製した０ＭＢＳ−ＨＲＰ複合体をゲル濾過（上の緩
衝液を使用する）により精製し、そして０．３４ｍｇの
グリコペプチドハプテン（ペプチドｌ）を添加した。最
後のハプテン−ＨＲＰ複合体をＨＰＬＣのゲル濾過によ
り精製し、そして実施例３の拮抗的免疫アッセイにおい
てｌ　：　１０００〜１：ｌＯｏ　、ｏｏｏの希釈で使
用した。

実施例６ Ｈｂ　　Ａ　　ｃ　　ス　リーブ　　アーセａ）０．１
モルのホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８，５中の実施例
１（Ｃ）のモノクローナル抗体を、２００倍モル過剰の
蛍光性インチオシアネー）（ＦＩＴＣ）と混合し、そし
て室温において３０分間反応させた。蛍光標識モノクロ
ーナル抗体はゲル濾過により精製することができる。

ｂ）ＣＯＯＨを有するストリップ（ポリスチレン、セル
ロースなど）を０　、５　ｍ　ｌの未知の変性溶血物、
ｐＨ７，５中に浸漬する。ストリップを緩衝液でｐＨ７
，５においてすすぎ、そして緩衝化溶液中の（ａ）の蛍
光性モノクローナル抗体中に５分間室温において浸漬す
る。このストリップを再びすすぎ、そしてこのストリッ
プの蛍光の程度は未知の試料中のＨｂＡ１ｃの程度を示
す。

実施例７ 試薬ストリップへのモノクローナル抗体の結合び　　　
アーセ　　に　　番 ワットマン＃１濾紙（７ｃｍ）を２０　ｍ　ｌの氷冷Ｄ
−１（２０中に入れ、そしてこの溶液のｐＨを５モルｃ
７）Ｎ　ａＯＨ？１０．５〜ｌ　ｌ　、　５に調節する
。溶液を活性１把により連続的に監視し、そしてＰＨを
５モルのＮａＯＨの滴下により１Ｏ６５〜１１゜、５に
維持する。小さい撹拌棒を、濾紙を含有するビーカーの
底に配置する０次いで、ビーカーを氷を充填したペトリ
皿内に入れ、これを磁気攪拌機上に配置する。１ｇの固
体ＢｒＣＮをビーカーに添加し、そしてこれを攪拌しな
がら２０分間インキュベーションする（氷上）、濾紙を
溶液から取り出し、モして溶液１００ｍ１の水冷蒸留水
（ｄ　−Ｈ２０）中で洗浄する０次いで、それを水冷０
．２モルのＮａ２　ＨＰＯ，−クエン酸緩衝液、ｐＨ６
，８中で洗浄する。抗体（０，２モルのＮａ２　ＨＰＯ
，−クエン酸緩衝液、　　ＰＨ６，８中の１ｍｇ／ｍｌ
）添加し、そして抗体の結合を１時間進行させる。エタ
ノールアミン（ｌミリモルの溶液の１０ｍ１）を添加し
て未反応部位をブロックしく１５分間）そして紙リン酸
塩類溶液（ＰＢＳ、１０ミリ％ルのＮａ２１（ＰＯ４，
１４０ミリモルのＮａＣ１，ｐＨ７，５）　で洗浄して
未反応成分を除去する。

この試薬ストリップを、Ａ１ｃヘモグロビンについて抗
体結合の標識成分を含有する標準化量の未知の変性溶血
物中に浸漬する０便利な拮抗体は、セイヨウワサビのペ
ルオキシダーゼ（ハプテン−ＨＲＰ）へ共有結合したグ
リコペプチド（グリコペプチド１）である、ストリップ
を除去し、そしてＰＢＳで洗浄する。ストリップへ結合
したヘモグロビンの量を測定しくこの量は試料中のＡｌ
ｃと逆比例する）モしてＡＨｃヘモグロビンを標準試料
と比較することにより定量することができる。

実施例８ Ａ　Ｃについ　　　　　　　　　アーセ固定体積の変性
血液貧血物（１００ＩＬｌ）を、ポリスチレンのマイク
ロタイター板へ添加し、そして室温において６０分間反
応させる。この板を０．０５％のツイーン−２０（ＰＢ
ＳＴ）中で４回洗浄する。モノクローナル抗体（セイヨ
ウワサビのペルオキシダーゼ）をＰＢＳＴ中に添加しく
１００ｐｌ、ＩＩＬｇ／ｍｌ）、そして室温において３
０分間反応させる。過剰の抗体を４回ＰＢＳＴで除去す
る。ＰＢＳ中の基質（０−フェニレンジアミン、２．２
ミリモル）およびＨ２Ｏ２（０、ＯＬ　２％）を添加し
、そして反応生産物を４９２ｎｍにおいて測定する。カ
ラー濃度は、標準値と比較したとき、溶血物中に存在す
るＡｌｃの量を反映する。

実施例９ Ａ　Ｃについ　　　　アーセ ＩＯθマイクロタイターの変性血液の溶解物（２２０ナ
ノモルのヘモグロビン）を７ナノモルのヨウ素化 Ｇｌｙｃｏ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ＴｈｒＰｒｏ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｓ−Ｔｙｓ−Ｃｙｓ　（
５００，０００ｃｐｍ／７ナノモル）と混合する。血液
溶解物が正常の（はぼ３％）Ａｒｃヘモグロビンを含有
するとき、モノクローナル抗体をグルコキシル化ペプチ
ドの５０％と結合するために十分な量で添加する。より
高いヘモグロビンＡＨｃ値はペプチドについて拮抗し、
これにより抗体により結合された計数の合計数を減少さ
せる。抗体は第２抗体（ウサギ抗マウスＩｇＧ）で免疫
沈殿させることにより、あるいは蛋白質Ａ被覆粒子上に
吸着させることにより回収することができる。抗体へ結
合したヨウ素化ペプチドは、ガンマ同位元素カウンター
で定量することができ、そ１て、標準物質と比較したと
き。

血液溶解物中に存在するＡ、Ｃの量を反映する。

【図面の簡単な説明】

図面はＨｂＡＩＣの免疫検出に関する上の実施例中に記
載する実施例からのデータを表わすグラフである。 第１図は、グリコペプチド１（ペプチド１）によるＡ１
ｃへのＡｂ−３の結合の阻害を表わすプロットである。 抗体をグリコペプチドとともに予備インキュページ、ン
した後、Ａ１ｃ被覆マイククロタイター板へ移した。Ａ
ＬＣへ結合するモノクローナル抗体を二次抗体−酵素を
使用した検出した。結果を阻害百分率として第１図にプ
ロットし、ここで０％の阻害は対抗物質を使用しないで
得られる値である。Ｏ−０線は炭水化物を欠く同一ペプ
チドからのものであり、炭水化物が抗体結合に必須であ
ることを示す、すべての点は３＠の反復実験の測定値の
平均である。 第２図は、グリコペプチド３（ペプチド３）によるＡ１
ｃへのＡｂ−３の結合の阻害を表わすプロットである。 対抗実験は第１図について記載したようにして実施した
。 第３図は、グリコペプチド４（ペプチド４）によるＡ１
ｃの結合についてのＡｂ−３およびＡｂ−４の阻害を表
わすプロットである。対抗実験は第１図について記載し
たようにして実施した。 第４図は、最適アッセイ条件を用いる典型的な標準曲線
である。正常の共与体からの全血（３゜８３％のＡ１　
ｃ）を使用するＨＰＬＣイオン交換により測定して、１
２．６６％のＡ１ｃを有する糖尿病患者からの変性全血
の異る比を用いて全血標準を調製した。すべての点は３
回の反復実験の測定値の平均である。 第５図は、合成のペプチド標準を使用する標準、曲線で
ある。アッセイは第４図について記載するようにして実
施したが、異る量の合成グリコペプチドを対抗物質とし
て使用した。３回の反復実験のすべての値をプロットし
た。 第６図は、免疫アッセイ法と共与体のホウ酸塩親和性法
との比較を表わすプロットである。３回の反復実験の平
均値を免疫アッセイの座標にプロットする。 第７図は、変化する変性条件下にＨｂＡ１ｃエピトープ
の露出を明らかにするプロットである。 第８図は、実施例１　（ｂ）の合成グリコペプチドでヒ
ツジを免疫化する結果を表わすプロットである。 第９図は、マウスのモノクローナル抗体がＡ□Ｃヘモグ
ロビンについて特異的であることを明らかにするプロッ
トである。 特許出願人　モレキュラー・ダイアグノスティックス会
インコーポレーテツド ＷＡ勉へ　メ、 グソコシル化へｅ　７′’ｏビンのａ準グリコシル化４
？ＸＡＩ＠デ＋１の宋１準隼５図 迦にアラ叱イＪ寸ボロネート 竿６図 ヒツジ抗イ事のｎｙ性

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水性試験試料を処理して前記試料中の存在するかも
   知れない特定のタンパク質の有意量を変性し、変性され
   た試料を前記特定のタンパク質中の線状ペプチドエピト
   ープを結合するために特異的な抗体試薬と接触させ、そ
   して前記タンパク質への抗体試薬の結合を決定すること
   を特徴とする水性試料中の特定のタンパク質分析物を決
   定する免疫アッセイ法。 ２、前記線状ペプチドエピトープが自然タンパク質中の
   抗体の結合に対して実質的に接近不可能であり、そして
   変性工程は前記タンパク質中の少なくともペプチドエピ
   トープの区域を十分に露出して、それを検出可能な抗体
   の結合のために十分に接近可能とするように実施するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、変性工程が、水性試験試料を存在するチャオトロー
   プの水溶液と、形成される混合物中の特定のタンパク質
   分析物のいずれかの十分な量を変性するための十分な濃
   度および十分な温度において組み合わせることにより実
   施し、そして得られる変性された混合物をそれと引き続
   いて接触された抗体試薬へ有意な変性効果をもたないレ
   ベルにチャオトロープの濃度を減少させるために十分な
   温度に維持しかつ希釈し、その間生成されたタンパク質
   分析物の変性された形態の再変性を実質的に防止するた
   めに十分に高い温度およびチャオトロープの濃度を維持
   することを特徴とする特許請求の範囲第１または２項記
   載の方法。 ４、抗体試薬がモノクローナルであり、そして免疫原担
   体物質へ結合されている線状ペプチドエピトープの残基
   からなる合成ペプチド免疫原で動物を免疫化することか
   ら誘導されることを特徴とする特許請求の範囲第１〜３
   項のいずれかに記載の方法。 ５、抗体試薬がモノクローナル抗体、または抗体結合部
   位を含むその断片であり、前記抗体結合部位はヒトヘモ
   グロビンのベーターサブユニット中のグリコシル化Ｎ−
   末端ペプチド配列へ特異的に結合することを特徴とする
   決定すべき特定のタンパク質分析物がＨｂ　Ａ＿１　ｃ
   でありかつ試験試料が血液である特許請求の範囲第１〜
   ４項のいずれかに記載の方法。 ６、構成成分、 （１）水性試験試料中の特定のタンパク質分析物中の線
   状ペプチドエピトープを結合するために特異的である抗
   体試薬、および （２）前記試料中の存在するかも知れない前記タンパク
   質の有意な量を変性することができる化学的物質、 からなることを特徴とする水性試験試料中の特定のタン
   パク質分析物の免疫アッセイの決定のための試薬系。 ７、前記化学的物質がチャオトロープである特許請求の
   範囲第６項記載の試薬系。 ８、抗体試薬が免疫原担体物質へ結合されている線状ペ
   プチドエピトープの残基からなる合成ペプチド免疫原で
   動物を免疫化することから誘導されることを特徴とする
   特許請求の範囲第６項記載の試薬系。 ９、標識付けされた形態の線状ペプチドエピトープをさ
   らに含むことを特徴とする試薬系。 １０、抗体試薬がモノクローナル抗体、または抗体結合
   部位を含むその断片であり、前記抗体結合部位はヒトヘ
   モグロビンのベーターサブユニット中のグリコシル化Ｎ
   −末端ペプチド配列へ特異的に結合することを特徴とす
   る決定すべき特定のタンパク質分析物がＨｂ　Ａ＿１　
   ｃでありかつ試験試料が血液である特許請求の範囲第１
   〜４項のいずれかに記載の試薬系。 １１、モノクローナル抗体が、式： ［Ｇｌｙｃｏ−（ＮＨ）Ｖａｌ−Ｈｉｓ−−ＡＡ−Ｒ−
   ］ｎ−Ｃａｒｒｉｅｒ 式中、Ｇｌｙｃｏ−（ＮＨ）Ｖａｌは酵素ではないグリ
   コシル化バリン残基を表わし、ＡＡは結合であるかある
   いは１または２以上の追加のアミノ酸残基であり、Ｃａ
   ｒｒｉｅｒは免疫原担体物質であり、そしてｎは平均し
   て１ないし担体上の有効結合部位の数である、 の合成ペプチドの免疫原で免疫化した動物からのリンパ
   球と骨髄腫細胞との融合から誘導されたハイブリドーマ
   から得られる特許請求の範囲第６〜１０項のいずれかに
   記載の試薬系。 １２、ヒトヘモグロビンのベーターサブユニット中のグ
   リコシル化Ｎ−末端ペプチド配列へ特異的に結合するこ
   とを特徴とするモノクローナル抗体、または抗体結合部
   位を含むその断片。 １３、式： Ｇｌｙｃｏ−（ＮＨ）Ｖａｌ−Ｈｉｓ−ＡＡ− 式中、Ｇｌｙｃｏ−（ＮＨ）Ｖａｌは酵素ではないグリ
   コシル化バリン残基を表わし、そしてＡＡは結合である
   かあるいは１または２以上の追加のアミノ酸残基である
   、 のグリコシル化ペプチド残基へ特異的に結合することを
   特徴とする特許請求の範囲第１２項記載のモノクローナ
   ル抗体またはその断片。 １４、ＡＡがヒトヘモグロビンのベーターサブユニット
   にＮ−末端に相当する１〜１２アミノ酸の配列であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１３項記載のモノクロ
   ーナル抗体またはその断片。 １５、免疫原担体物質へ化学的に結合したグリコシル化
   ペプチドからなる免疫原に対してレイズされており、そ
   してグリコシル化ペプチドはヘモグロビンのベーターサ
   ブユニットのＮ−末端に相当する少なくとも２つのアミ
   ノ酸単位を有する特許請求の範囲第１２〜１４項のいず
   れかに記載のモノクローナル抗体またはその断片。 １６、ヒトヘモグロビンのベーターサブユニット中のグ
   リコシル化Ｎ−末端ペプチド配列へ特異的に結合するモ
   ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系列。