JP2540362B2

JP2540362B2 - 免疫原及び抗体の取得法

Info

Publication number: JP2540362B2
Application number: JP1024081A
Authority: JP
Inventors: クリスチヤン・クライン; クリスタ・ヒユープナー‐パライツ; ハンス‐ゲーオルク・バツツ; ヴオルフガング・ロリンガー; ウルリヒ・エツシツヒ; ロレンツ・ケルシヤー
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1988-02-04
Filing date: 1989-02-03
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2011-10-02
Also published as: US5646255A; JP2717392B2; ATE124539T1; ES2078072T3; EP0329994B1; DK175191B1; EP0547029B1; DE3806198A1; DE58906510D1; US5632993A; DE58909328D1; JPH028743A; ES2061744T3; JPH0892300A; EP0329994A1; DK52589A; EP0547029A1; DK52589D0

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はHbA_1c−特異的抗体を取得するための免疫原
並びに該抗体を取得するための方法に関する。

従来の技術吸入した酸素及びCO₂運搬に作用し、赤血球中に局在
するヘモグロビンは４本の鎖からなつており、そのうち
のそれぞれ２本は同じ構造を有する。主に、２本のα−
鎖及び２本のβ−鎖からなる。このヘモグロビンは血液
中で90％より多くまでがHbA₀として示される形で存在す
る。

グリコシル化ヘモグロビンは生体内でヘモグロビンと
グルコースとの非酵素的反応により生じる。このグリコ
シル化はグルコースのアルデヒド基とヘモグロビンのア
ミノ基との間でのシツフの塩基の形成を介して経過す
る。生じたアルジミンはアマドリ（Amadori）転位によ
り転位しＮ−（１−デスオキシ−Ｄ−フルクトース−１
−イル）−基となる。この転位形においてグリコシル化
ヘモグロビンは安定である。

グリコシル化ヘモグロビンをHbA₁と呼び、これらの群
の最も重要なものをHBA_1cと呼ぶ。HbA_1cはヘモグロビン
のβ鎖のアミノ末端に存在するバリン基の遊離アミノ基
のグリコシル化により生じる。この際、Ｎ−（１−デス
オキシ−Ｄ−フルクトース−１−イル）−Ｌ−バリン基
が生じ、以降これを“フルクトース・バリン”と呼ぶ。

血中でのHbA_1c濃度は血液の糖濃度に依存する。全ヘ
モグロビンに対するHbA₁の量は通常成人において３〜６
％の範囲にある。血糖値の上昇において、全グロブリン
に対するグリコシル化ヘモグロビンの量は上昇し、15％
にまで上昇することがある。従つて、HbA_1c−量の測定
は糖代謝のコントロールのための確実なパラメーターで
ある。赤血球及びこれと共に安定はHbA₁は平均して120
日間生存するので、血中でのグリコシル化ヘモグロビン
量の測定は、特に糖尿病患者に重要である炭水化物代謝
をコントロールするための良好なパラメーターを提供す
る。このパラメーターは炭水化物の富んだ食事後の血糖
値の短時間の上昇には依存せず、こうして長時間パラメ
ーターとして働らく。

従つて、糖尿病の診断のために及び糖尿病患者の監視
のために、血中のHbA_1cの量を特異的に測定することは
重要である。

グリコシル化ヘモグロビンの分析に関しては一連の方
法がある。最も多く使用される方法は、β−鎖の遊離ア
ミノ基をグルコースと反応させる時ヘモグロビン分子中
でのプラスの電荷の喪失に基づく。特に、カラムクロマ
トグラフイー法及び電気泳動法を使用する。他の方法は
組み込まれたグルコース分子もしくはアマドリ転位によ
るフルクトース分子を比色定量法により検出する（チオ
バルビツール酸法）。

従来公知の方法は一部非常に時間を費し、煩雑であ
り、一部グリコシル化ヘモグロビンに関して十分に特異
的ではない。

従つて、全ヘモグロビン中のグリコシル化部分量を著
しく特異的に把握する簡単な測定法に対する要求があ
る。

そのような簡単な方法は専門家に公知の種々のイムノ
アツセイの変法である。均質な競合イムノアツセイにお
いては、例えば標識化HbA_1c誘導体は測定すべき試料か
らのHbA_1cと抗体を争う。標識化HbA_1c−誘導体としては
HbA_1cのエピトープである短かい合成ペプチドを使用
し、標識に結合する。正確な結果で再現性のある測定を
可能とするためには、標識化ペプチドと試料からのHbA
_1cとが実際に競合反応を行なうことができるように、こ
れらがほぼ同じ親和性で結合する抗体を使用しなければ
ならない。従つて、このイムノアツセイの実施のために
は、非常に特異的にHbA_1cを認識する抗体、すなわちHbA
_1c−β−鎖のグリコシル化Ｎ−末端が特異的に結合する
が、相応するHbA₀−β−鎖の非グリコシル化Ｎ−末端は
結合しない抗体を提供しなければならない。

競合イムノアツセイのもう１つの変法は不均一相で実
施される。この際、例えば固相に結合したHbA_1c−エピ
トープを有する合成ペプチドと試料からのHbA_1cとが特
異的抗体を競合する。固相に結合したペプチドは例えば
牛血清アルブミンと、HbA_1cのエピトープの配列を有す
る合成グリコシル化ペプチドとからの複合体であつてよ
い。この変法を実施するためにも、抗体は該ペプチド及
び試料からのHbA_1cとほぼ同程度の親和性で結合するべ
きである。

HbA_1cの検出のための、感度が良好で、特異的な方法
を実施するためには、HbA₀ではなく、特異的にHbA_1cに
結合する抗体を取得することは重要であつた。

すでに、HbA_1cの検出法、並びにこの方法に好適な抗
体は、例えばヨーロツパ特許公開第185870号明細書から
公知である。しかしながら、すべての公知の抗体は、こ
れらがHbA_1c分子に対して非常に僅かな親和性を有する
という欠点を有している。従つて、一般にHbA₁の抗原決
定基が、抗体が十分量で結合されることができる程度に
十分に遊離して存在するように、測定の実施の前に変性
を実施しなければならない。この種の方法は煩雑であ
る。

ヨーロツパ特許公開第185870号明細書による方法にお
いて使用した免疫原は、僅かに特異的な免疫応答のみが
生じるという欠点を有している。こうして、そこに記載
された方法によればHbA_1c及びHbA₀の区別に関して測定
可能な特異性を有さない、ポリクローナル羊血清及びマ
ウス血清のみが得られる。

西ドイツ国特許公開第3439610号公報から、HbA_1cに対
する抗体の取得法が公知であり、これにおいては免疫原
として糖、ヘモグロビンのβ−鎖のヘプチド基及び免疫
原担体からなる複合体を使用している。しかしながら、
この方法で得られた抗体は全く十分な選択性を示さず、
その比親和性が小さい。

発明が解決しようとする課題従つて、本発明の課題は公知技術から出発し、高い親
和性を有し、高い特異性の、HbA_1cに対するポリクロー
ナル及びモノクローナル抗体を形成する方法を提供する
ことである。

もう１つの課題は天然のHbA_1c−分子及びヘモグロビ
ンのβ−鎖のＮ−末端配列を有するペプチドに対して、
できるだけ小さいフアクターで異なる分子比親和性を有
する抗体の製造である。

課題を解決するための手段この課題は一般式Ｉ〔式中、ｍは１〜ｑ（ここで、ｑはハプテンスペーサー
基に結合する担体蛋白質の重量の25％に相当する数値を
表わす）を表わし、Ｔは担体蛋白質を表わし、Ａは一般
式II: （ここで、ＸはＳ又はNHを表わし、ｎは１〜４を表わ
し、Ｂサクシンイミド基を含有する有機基を表わす）を
有する原子数10〜20の鎖長のスペーサーを表わす〕を有
する、HbA_1c−特異的抗体を製造するための免疫原によ
り解決する。

本発明による免疫原を使用する際に高特異的抗体が得
られ、その選択性及び親和性は従来公知のHbA_1c抗体の
それらより著しくすぐれているということが確認された
ことは意外であつた。

本発明による免疫原は三つの部分（HbA_1c−蛋白質の
Ｎ−末端に相応するハプテン部、スペーサー及び免疫原
蛋白質）からなる。本発明による免疫原のハプテン部は
ヘモグロビンのβ−鎖のＮ−末端部の最初の４つのアミ
ノ酸及びフルクトース分子を有する。天然のHbA₁−蛋白
質におけるように、本発明による免疫原においてはフル
クトース分子のC₁−原子にアミノ酸であるバリン、ヒス
チジン、ロイシン及びスレオニンが結合している。

ハプテン部の製造は自体公知法で行なわれる。特に好
適であるのは固相合成である（G.Barany及びR.W.Merrif
ield著、Groβ、Meienhofer、The Peptides、第２巻、
第３〜285頁、ニユーヨーク、1978年）。このためには
α−アミノ基はＮα−フルオレニルメトキシカルボニル
基で保護される。側鎖の官能基はtert−ブチルエーテ
ル、tert−、ブチルエステルとして、もしくはtert−ブ
トキシカルボニル基として保護される。これらの保護基
は完成した合成ペプチドの担体からの加酸分解による切
断において一緒に分離する。Ｎ−（１−デスオキシ−Ｄ
−フルクトース−１−イル）−基は自体公知法でペプチ
ドとグルコースとの反応により挿入される。

引き続く、アマドリ転位により（K.Heyns及びH.Pauls
en著、J.Liebigs ann.Chem.,第627巻（1959年）、第160
〜174頁及びH.Rper等著、Carbohydrates、第116巻、1
983年、第183〜195頁参照）、所望のＮ−（１−デスオ
キシ−Ｄ−フルクトース−１−イル）−ペプチドが得ら
れる。

免疫原複合体のもう１つの本発明において重要な成分
はスペーサーであり、これはハプテンを免疫原蛋白質と
結合している。該スペーサーは本発明により原子10〜20
個の鎖長を示し、この際、該連鎖は炭素、酸素、窒素及
び／又は硫黄原子から構成されていてよい。この鎖長に
関しては、連鎖を構成する原子だけを数えていて、水素
原子又は側鎖基原子は数えない。

スペーサーはスレオニンのカルボキシル基に結合して
いる。

スペーサーは次の一般式：を示し、ここでＸはＳ又はNHを表わし、ｎは１〜４の整
数を表わす。ＸがＳを表わし、ｎが１である場合、もし
くはＸがNHを表わし、ｎが４の場合が有利である。

一般式の基Ｂは自体公知のスペーサー分子であり、こ
れはサクシンイミジル基を有する。基Ｂの構造はあまり
厳密ではないが、他のスペーサー部と一緒になつて原子
10〜20個の鎖長が得られるような連鎖分子の長さを示さ
なければならない。基Ｂとしてサクシンイミジルヘキサ
ノイル基を使用するのが有利である。

スペーサーは自体公知法で挿入される。スペーサーは
所定のペプチドのＣ−末端に結合することができ、かつ
NH₂−又はSH−基を有するアミノ基を含有する。このア
ミノ基もしくはメルカプト基を介して、担体蛋白質との
結合を仲介するサクシンイミジル基は挿入される。アミ
ノ酸としてシステイン、ホモシステイン、リジン又はオ
ルニチンを使用するのが有利である。スペーサーがアミ
ノ酸としてシステイン又はホモシステインを含有する場
合、はじめに保護されたメルカプト基を有するシステイ
ン又はホモシステインをペプチドの固相合成用出発アミ
ノ酸として使用することができ、その際保護基としてｔ
−ブチルスルフエニル基を使用するのが有利である。引
き続き、担体蛋白質をサクシンイミジル基を供給する二
官能性リンカー、例えばマレイミドヘキサノイル−Ｎ−
ヒドロキシサクシンイミドと反応させ、次いでスペーサ
ー−担体蛋白質−複合体をシステインもしくはホモシス
テインの遊離したSH−基に結合させる。スペーサーがア
ミノ酸としてリジン又はオルニチンを含有するならば、
ペプチドの固相合成のために出発アミノ酸として保護さ
れたα−アミノ基を有するアミノ酸をはじめに使用する
のが有利であり、この際保護基として有利にカルボベン
ゾキシ基を使用し、引き続きペプチドの遊離したα−ア
ミノ基を二官能性リンカーと反応させる。次いで、ペプ
チド−アミノ酸−スペーサー複合体を担体蛋白質に結合
するが、この際この結合は担体蛋白質のSH−基を介して
行なう。

担体蛋白質としては自体公知の蛋白質を使用すること
ができる。好適であるのは例えばアルブミン、例えば牛
血清アルブミン及びオバルブミン、ヘモシアニン、例え
ばキーホール・リンペツト・ヘモシアニン（Keyhole li
mpet hemocyanine）、ポリアミノ酸、例えばポリ−Ｌ−
Lys及びポリ−Ｌ−（Lys:Glu）又は酵素、例えばガラク
トシダーゼである。担体蛋白質としてはエデスチン又は
ガラクトシダーゼを使用するのが有利である。

担体蛋白質には有利に多くのハプテン・スペーサー基
が結合される。結合する基の数は担体蛋白質の大きさに
依存する。一般に、担体蛋白質の重量の最高25％がハプ
テン・スペーサー基に結合されていてよい。蛋白質とし
てエデスチンを使用する場合、ハプテンスペーサー基10
〜30個が有利に結合される。

本発明により提供された免疫原を用いて、HbA_1cに対
する高活性特異的抗体が得られる。この抗体はHbA₀との
著しく僅かな交差反応性を示す。

本発明のもう１つの課題は、HbA_1cに対する抗体の取
得法である。このためには、本発明による免疫原を好適
な生物に多数回注入し、次いで自体公知法で抗体を取得
する。抗体の獲得のためには一般に哺乳動物を免疫化す
る。好適であるのは、例えばマウス、羊、家兎、ラツテ
又はモルモツトである。免疫原を、有利に緩衝液中に溶
かし、常用の助剤の添加下に、例えばフロイントのアジ
ユバンス（Freundschen Adjuvanz）と共に宿主動物中に
注入する。高い抗体動物を得るためにはこの注射を規則
的な間隔、例えば２週間〜４週間ごとに繰り返す。宿主
動物の血液から、ポリクローナル抗体を含有する抗血清
を常法で取得する。

本発明による免疫原を用いて、高特異性モノクローナ
ル抗体も、例えばNature、第266巻、1977年、第495頁及
びScience、第208巻、1980年、第692頁以降に記載され
ている、G.Khler及びC.Milsteinの公知ハイブリツド
化法を使用して取得することができる。このためには宿
主生物の免疫化の後、免疫化動物の脾臓からＢ−リンパ
球を単離し、骨髄腫細胞と融合し、生じたハイブリドー
マ細胞をクローン化する。次いで、生じたクローンか
ら、HbA_1cと特異的に反応し、他の分子と実質的に全く
交差反応を行なわない抗体を生産する細胞系を単離す
る。この細胞系の単離は、クローンの著しく高い量が特
異的な抗体を生産するので、簡単である。この細胞系を
更に培養し、次いでこれから所望のモノクローナル抗体
を取得することができる。抗体活性は自体公知法で、血
清中又はハイブリドーマ上澄中で、酵素イムノアツセイ
を使用して常法で測定する。

本発明により得られた抗体はHbA_1cに対する高い特異
性及び親和性により優れている。グリコシル化していな
いヘモグロビンと、及び体液中に存在する他の蛋白質と
の交差反応は僅かである。従つて、この抗体は体液中の
HbA_1cの測定法に使用するために優れている。

特に好適なモノクローナル抗体はMAK′S3.609.325、
3.51.56及び3.230.140である。相応するハイブリドーマ
細胞系はヨーロピアン・コレクシヨン・オブ・アニマル
・セル・カルチヤーズ（European Collection of Anima
l Cell Cultures）、プロトン・ダウン（Proton Dow
n）、GBに、ECACC87120801、ECACC88122302及びECACC88
122301という番号で寄託されている。

実施例次に本願発明を図面及び実施例につき詳細に説明す
る。

例１ペプチドフルクトースVal−His−Leu−Thr−Cys−OH
を合成した。固相合成をラボルテツク社（Firma Labort
ec;Budendorf、Schweiz在）の半自動ペプチド合成機（s
emi−automatishen peptidsynthesizer）中で実施し
た。

Ｎα−アミノ保護基としてはFmoc−基（Fluorenyl−m
ethoxycarbonyl gruppe）を使用した。このペプチド合
成法の記載はマイエンホーフアー（J.Meyen hofer）等
著、Int.J.Peptid Protein Res.、第13巻、第35〜42頁
（1979年）にある。

マイエンホーフアーにより記載されているように、Ｃ
−末端Fmoc−アミノ酸をｐ−アルキルオキシベンジルア
ルコール樹脂（Firma Bachem.Budeudorf、Schweiz）に
結合した。

合成サイクルに関する合成方法：工程８〜11による結合のために、Fmoc−アミノ酸及び
DCCは出発樹脂の負荷に対してそれぞれ３倍モル量で使
用する。HoBtは4.5倍モル量で使用する。

最後のＮ−末端Fmoc−アミノ酸の結合の後、Fmoc−保
護基の脱離のために、合成サイクルの工程１〜５を実施
する。その後、この樹脂を15倍容量のジクロルメタン
（DCM）／トリフルオル酢酸（TFA）1:1中で２時間室温
で振盪する。濾過し、DCM/TFA4:1で更に２回この樹脂を
洗浄し、すべての濾液を合し、真空中25℃でトルエン添
加下に濃縮する。残分にジエチルエーテルを加える。固
体を濾別し、乾燥する。

前記の概要法によりペプチドであるフルクトース−Va
l−His−Leu−Thr−Cys（StBu）OHが合成された。出発
樹脂としては0.6mMol/gで負荷されたFmoc Cys（StBu）
ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂10gを使用し
た。合成サイクルにおいて次のFmoc−アミノ酸を順次使
用した： 1. Fmoc Thr（tBu） 6.2g 2. Fmoc Leu 6.4g 3. Fmoc His（Trt） 11g 4. Fmoc Val 6.1g 次の短縮形を使用した： tBu:トリエチルブチルエーテル Trt:トリチル StBu:t−ブチルチオエーテル OtBu:t−ブチルエステル Z:ベンジルオキシカルボニル −Cys（StBu）:t−ブチルスルフエニルシステイン樹脂の脱離後の粗収率はHval−His−Leu−Thr−Cys
（StBu）OH3.29gである。DC:（シリカゲルHPTLC Merc
k、溶離剤：エタノール／氷酢／水6:2:2）Rf＝0.62。ニ
ンヒドリンスプレー0.1％（Merck）での噴霧及び120℃
で５分間での顕色により赤紫色となる。0.4％レゾルシ
ンメタノール溶液200ml及び5N硫酸40mlからなる混合物
（レゾルシン硫酸）での噴霧及び５〜10分間の120℃で
の顕色により発色しない。

粗ペプチド1gをグルコース540mg及びピリジン／氷酢5
0mlを添加し、５日間室温で撹拌した。次いで室温で真
空中濃縮し、引き続き残分を３回水50mlで取り込み、再
び蒸発乾固する。残分を水50ml中に取り込み、デユウエ
ツクス（Dowex）50WX ８（H⁺−型、50×3.5cm）を有す
るカラム上にのせ、全グルコースが溶離されるまで水で
洗浄した。その後、生成物を1Nアンモニアで溶離し、凍
結乾燥した（810mgが得られる）。凍結乾燥物を0.1Mト
リエチルアンニウムアセテート緩衝液、pH8.5中に取り
込み、アフイゲル（Affigel）601（Biorad、５×26cm）
を有するカラム上で0.1Mトリエチルアンモニウムアセテ
ート緩衝液、pH8.5 2で、及びその後水２で洗浄す
る。次いで、該生成物を0.1％蟻酸で溶離し、凍結乾燥
する。このように得られた凍結乾燥物をポリゴシル（Po
lygosil）C18、５μ（Macherey and Nagel）でクロマト
グラフイーを行なう（水柱の0.1％TFA〜65％イソプロパ
ノール水溶液中の0.1％TFAの傾斜溶液）。フルクトース
・Val−His−Leu−Thr−Cys（StBu）OH283mgが得られ
る。DC（シリカゲル、溶離剤、同上）;Rf＝0.58。ニン
ヒドリンでの着色：茶褐色。レゾルシン硫酸での着色：
赤褐色。Fab−MS（Fast Atom Bombardiment MS）（ポジ
テイブ）:MH⁺＝822。

システイン保護基の脱離のためには、前記の得られた
ペプチドを0.1M燐酸カリウム緩衝液、pH8.5、130ml中に
溶かし、多数回脱ガスし、再び窒素を吹きつける。次い
で、この溶液にジチオトライトール（Dithiotreitol）7
78mgを加え、窒素雰囲気下に24時間放置する。引き続
き、HClでpH5にし、ポリゴシルC18でクロマトグラフイ
ーにより精製した（前記のような傾斜溶液）。

フルクトース−Val−His−Leu−Thr−Cys OH178mgが
得られる、FabMS:ポジテイブ:MH⁺＝734。

例２例１に記載した合成工程により、ペプチドであるフル
クトース−ValHisLeuThrLysOHが合成された。出発樹脂
としては0.48m mol/gで負荷されたFmoc Lys（Ｚ）ｐ−
アルコキシベンジルアルコール樹脂10mgを使用した。合
成サイクル中で次のFmoc−アミノ酸を順次使用する： 1. Fmoc Thr（tBu） 5g 2. Fmoc Leu 5.1g 3. Fmoc His（Trt） 8.9g 4. Fmoc Val 4.9g 樹脂の脱離後の粗収量:3.2g DC:（シリカゲルHPTLC、溶離剤例1.3参照）:Rf＝0.58 粗ペプチドを室温でグルコース1.6gと共にピリジン／
氷酢1:1 150ml中で撹拌した。反応溶液を蒸発し、例1.
3に記載したように、デユウエツクス50WX 8H⁺及びアフ
イゲル601で精製した。

フルクトース−ValHis Leu Thr Lys（Ｚ）OH1.7gが得
られた。

DC:（シリカゲルHPTLC、溶離剤例１参照）:Rf＝0.58、
硫酸スプレー試薬での着色：赤褐色、 ¹H−NMR（300Mhz,D₂O）：δ＝0.85（d,J＝5.1Hz,3
H）;0.89（d,J＝4.9Hz,3H）;0.96（d,J＝7.1Hz,3H）;1.
04（d,J＝6.8Hz,3H）;1.20（d,J＝1.20,3H）;1.3〜1.9
（m,9H）;2.3（m,2H）;3.0〜3.3（m,6H）;3.63〜4.1
（m,5H）;4.1〜4.29（m,4H）;4.32（d,J＝5.4Hz,1H）;
4.45（m,1H）;4.48（m,2H）;5.09（s,2H）;7.32（s,1
H）;7.4（“s",5H）;8.63ppm（s,1H）。

前記の得られた生成物400mgをメタノール／水5:1 50
ml中でパラジウム／活性炭で水素添加した。触媒を濾過
し、濃縮し、ポリゴシルC18でクロマトグラフイーを行
なう。

収量:300mg DC（シリカゲルHPTLC、溶離剤例１参照）:Rf＝0.09硫酸
スプレー試薬での着色：赤褐色。

例３例２からのフルクトースValHisLeuThrLysOH10mgを0.1
M燐酸カリウム緩衝液、pH7、1ml中に取り込んだ。エタ
ノール2ml中のマレイミドヘキサン酸−Ｎ−ヒドロキシ
サクシンイミドエステル6.2mgを添加した。反応溶液を
室温で14時間撹拌し、ポリゴシルC18で精製した。純粋
なフラクシヨンの凍結乾燥の後、フルクトースValHisLe
uThrLys（マレイミドヘキサノイル）OH4.3mgが得られ
た。

FAB−MS、ポジテイブ;MH⁺:952¹H−NMR（300MHz,DMSO
（D₆）/CD₃OD）：＝0.83〜1.06（m,12H;Leu−CH₃,Val−
CH₃;1.04（d,J＝6.5Hz,3H;Thr−CH₃）;2.01（t,J＝6.5H
z,2H;MH−CO−CH₂）及び6.92ppm（s,2H;MH−CH＝CH）。

例４麻の種子からのエデスチン（Roth）5gを0.1M燐酸カリ
ウムpH7.0 500ml中で撹拌し、エタノール100ml中のマ
レイミドヘキサン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエ
ステル500mgの溶液と混合する。該溶液を室温で90分間
撹拌し、固体を吸引濾過し、水各100mlで２回、エタノ
ール各100mlで４回及びもう１度水各100mlで２回洗浄す
る。固体を水150ml中に懸濁させ、凍結乾燥する。

収量:4.34g エデスチン１モルあたりのマレインイミド基:17個。
マレインイミド基の数は次のように決定する：溶液A:水柱1mMシステイン、0.5mM EDTA 溶液B:0.1M燐酸カリウム緩衝液、pH8.0中の10mM5,5′−
ジチオビス（２−ニトロベンゾエート）（Ellmann's試
薬）溶液C:1Mトリス・HCl、ph8.2 マレイミドヘキサノイル−エデスチン8mgを0.05Mカリ
ウム燐酸緩衝液39ml中に取り込み、超音波浴中で15分間
処理する。

その後、溶液A1mlを添加し、25℃で10分間恒温保持す
る。

溶液C3.2mlと共に25℃で２分間撹拌し、次いで溶液B2
00μを加え、37℃で10分間恒温保持する。試料を25℃
で15分間遠心分離する。

上澄に関して405nmにおける吸光度を測定する。盲検
値はマレイミドヘキサノイル−エデスチン−試料の添加
なしに同様な方法を実施することにより得られる。n mo
lにおけるマレイミド基の数はであり、この際ΔＥは盲検値と試料値との間の吸光度差
である。エデスチンの量（mol）は正確な秤量と、31000
0のエデスチンの比モル−質量で得られる：このようにして得られたマレイミドヘキサノイル−エ
デスチン250mgをアルゴン雰囲気下に0.1M燐酸カリウム
緩衝液、pH6.5 20mlと混合した。例１により得られた
フルクトースValHisLeuThrCysOH34mgを酸素遮断下に添
加し、室温で29時間撹拌した。該溶液を遠心分離し、沈
殿を水で３回洗浄し、そのつど遠心分離を繰り返す。固
体残分を水10ml中に懸濁させ、凍結乾燥した。フルクト
ースValHisLeuThrCys OH及ぎマレイミドヘキサノイル−
エデスチンからの複合体175mgが得られ、これを免疫原
１とする。

前記のように、なお遊離のマレイミド基を測定した。
最初の負荷に対する差から、該免疫原がエデスチン１モ
ルあたりペプチド14.6モルを含有していることが明らか
になる。

例５ β−ガラクトシダーゼ（EIA−品質、ベーリンガー・
マンハイム社）48mgをアルゴン雰囲気下にアルゴンを通
気した0.1M燐酸カリウム緩衝液、pH7.0に溶かした。酸
素遮断下に、例３により得られたフルクトースValHisLe
uThrLys（MH）OH5mgをこれに添加し、室温で１時間撹拌
した。

AcA202−カラム（２×24cm）をアルゴン飽和0.9％NaC
lで平衡にした。全反応溶液をカラム上に担持した。ア
ルゴン飽和0.9％NaClで溶離し、蛋白質フラクシヨンを
集めた。免疫原溶液、ｃ＝3.1mg/ml、15mlが得られる。
免疫原での負荷は試料とエルマン（Ellman）の試薬との
反応により測定することができる:SH−基１モルあたり
カルボキシニトロチオピリドン１モルが遊離される（λ
_max＝412nm、ε＝13600、pH8.0において） β−ガラクトシダーゼ、EIA−品質は分子あたりSH−
基14個を有する。ペプチドとの反応の後、遊離SH基２個
が見い出された、すなわち負荷はβ−ガラクトシダーゼ
１モルあたりペプチド12モルである。

フルクトースValHisLeuThrLys（MH）OHとβ−ガラク
トシダーゼとから得られた複合体を免疫原２とする。

例６比較のためにより長いペプチド鎖を有する免疫原を製
造した。このためには、まず例１に記載された合成法に
よりペプチドであるValHisLeuThrProGluGluCysOHを合成
した。

例１の合成法により、ペプチドHValHisLeuThrProGluG
luCys（StBu）OHを製造する。出発樹脂としては0.5ミリ
モル/gの負荷を有するFmoc Cys（StBu）ｐ−アルコキシ
ベンジルアルコール樹脂10gを使用する。合成サイクル
においては次のアミノ酸を使用する。

1. Fmoc Glu（OtBu） 6.4g 2. Fmoc Glu（OtBu） 6.4g 3. Fmoc Pro 5.1g 4. Fmoc Thr（tBu） 6g 5. Fmoc Le 5.3g 6. Fmoc His（Trt） 9.3g 7. Fmoc Val 5.1g;この結合を１回繰り返す。

樹脂の脱離後の粗収量:4.2g、粗成物を例１に記載し
たようにポリゴシルC18でクロマトグラフイーを行なつ
た。収量はHValHisLeuThrProGluGluCys（StBu）OH880mg
であつた。DC（シリカゲル、例１におけると同じ溶離
剤）:Rf＝0.53。次いで、このペプチド800mgを例１に記
載されているようにグルコースと反応させ、デユウエツ
クス50W×8H⁺−型、その後アフイゲル601で精製した。
ポリゴシルC18でクロマトグラフイーを行なつた後、生
成物150mgが得られた。Fab MS、ポジテイブ:MH⁺＝117
7。次いで例１と同様にしてシステイン保護基をジチオ
トライトールの添加により切断した。フルクトースValH
isLeuThrProGluGluCysOH78mgが得られた。FabMSポジテ
イブ:MH⁺＝1087。

このように得られたペプチドをマレイドヘキサノイル
エデスチン322mgと、例４に記載したように反応させ
る。免疫原200mgが得られ、これを比較免疫原V1として
使用した。

例７もう１つの比較免疫原としてはフルクトースValHisLe
uThrCysとピリジルジチオプロピオニルエデスチンとか
ら複合体を製造した。ペプチドを例２に記載したように
製造した。

ピリジルジチオプロピオニルエデスチンの製造のため
には大麻の種子からのエデスチン1gを0.1M燐酸カリウム
緩衝液、pH7.5、150ml中に取り込む。この溶液に、エタ
ノール12.5ml中に溶かしたサクシンイミジル−３（２−
ピリジルジチオ）−プロピオネート10mgを撹拌下に添加
した。２時間撹拌し、次いで固体を吸引濾過し、それぞ
れ３回水100ml、エタノール100ml及びもう１回水100ml
で洗浄した。固体を水100ml中に取り込み、凍結乾燥し
た。

このようにして得られたピリジルジチオプロピオニル
エデスチン352mgにアルゴン雰囲気下に0.05M燐酸カリウ
ム緩衝液、pH6.0、100mlを混合する。同様に、酸素遮断
下にペプチドであるフルクトースValHisLeuThrCys49.5m
gを添加し、室温で23時間撹拌する。引き続き、遠心分
離し、沈殿を３回各50mlの水で、２回各50mlのエタノー
ルで、更に１回水で洗浄し、そのつど遠心分離を繰り返
す。固体の残分を水50ml中に取り込み、凍結乾燥させ
る。負荷の測定のためには、第１の遠心分離の上澄液中
で遊離したチオピリドンを測定した。フルクトースValH
isLeuThrCysとピリジルジチオプロピオニルエデスチン
から、比較免疫原V2と呼ばれる複合体300mgが得られ
た。負荷はエデスチン１モルあたりペプチド39モルであ
つた。

例８抗−HbA_1c−抗体に関するスクリーニングテストの実
施のためにポリハプテンを製造する。ポリハプテン１を
HValHisLeuThrProGluGluCysOHとピリジルジチオプロピ
オニル−牛血清アルブミンとから製造する。

牛血清アルブミン1gを0.1M燐酸カリウム緩衝液、pH7.
5、30ml中に溶かした。この溶液にエタノール15ml中に
溶かしたサクシンイミジルピリジルジチオプロピオネー
ト226mgを加えた。室温で40分間撹拌し、全反応溶液をA
CA202（31×3cm）を介してクロマトグラフイーにかけ
た；溶離剤、0.1M燐酸カリウム緩衝液、pH6.0。蛋白質
溶液、ｃ＝6.6mg/ml、152mlが得られた。該溶液をジチ
オトライトール280.5mgと混合し、0.1M燐酸カリウム緩
衝液、pH7.5で10mlとした。フアクター約６に希釈し
た。遊離するチオピリドンの濃度は使用したジチオピリ
ジル基の濃度に相応した。340nmにおけるチオピリドン
に関する吸光係数8080及びエデスチンの比分子量310000
から負荷を決定することができる。負荷は蛋白質１モル
あたり36モルである。

ピリジルジチオプロピオニル牛血清アルブミン及び例
６により得られたHValHisLeuThrProGluGluCysOH47mgか
ら得られた溶液10.5mlをアルゴン雰囲気下（酸素遮断
下）に１日撹拌した。負荷は遊離チオピリドンの測定に
よりペプチド33モル/1モル蛋白質で計算された。残りの
反応性基をシステイン1.7mgの添加により飽和する。全
反応溶液をACA202−カラム（31×3cm）を介してクロマ
トグラフイーにかけ、蛋白質フラクシヨンを１夜かけて
H₂Oに対して透析し、凍結乾燥する。得られた生成物を
ポリハプテン１とする。

収量:85mg 例９ポリハプテン２の製造のために（例８参照）、例６に
記載されているようにして得られたピリジルジチオプロ
ピオニル牛血清アルブミン溶液7mlを使用した。ペプチ
ド成分としては、アミノ酸Valにフルクトースを担持す
る、例６により製造されたペプチド7.8mgを使用する。
このためには例６により得られたペプチドHValHisLeuTh
rProGluGluCysOH800mgを例１に記載されたようにグルコ
ースと反応させ、デユウエツクス50WX H−型、その後ア
フイゲル600で精製する。ポリゴシルC18でクロマトグラ
フイーを行なつた後、グリコシル化ペプチド150mgが得
られた。Fab MSポジテイブ、MH⁺＝1177。システイン保
護基をジチオトライトールで脱離した後、グリコシル化
ペプチド100mgから所望の生成物78mgが得られた。Fab M
SポジテイブMH⁺＝1089。このように得られた生成物をポ
リハプテン２とする。

例10 免疫化されたマウス又はハイブリツド細胞の培養上澄
液又は腹水中のHbA_1cに対する抗体の存在及び特異性を
知るために、エリザ（Elisa）法をテスト原理として使
用した：微量滴定プレートをポリハプテン２ 10μｇ又はポリ
ハプテン１ 10μg/ml積層緩衝液（0.2M炭酸ナトリウム
／炭酸水素ナトリウム、pH9.3〜9.5）で、室温で１時間
振盪下に積層した。次いで、0.9％塩化ナトリウム溶液
及び１％アルブミン溶液で後処理した。引き続き、0.9
％塩化ナトリウム溶液で洗浄した。その後室温で、約１
時間試料100μで恒温保持し、新たに0.9％塩化ナトリ
ウム溶液で洗浄した。引き続き、羊−Fab−抗マウスFc
γ−ペルオキシダーゼ複合体200U/mlと共に１時間恒温
保持した。0.9％塩化ナトリウム溶液を用いる新たな洗
浄工程の後、ペルオキシダーゼ活性を室温で15分間ABTS
と反応させることにより常法で測定する。

その後、吸光度差、405nmにおける差mE、を測定す
る。

本発明により、例４により得られた免疫原１での免疫
化により得られた抗血清は、免疫化マウス100匹全部に
おいてポリハプテン２との結合を示し、かつポリハプテ
ン１との係合を示さないか、もしくは非常に僅かにのみ
示すにすぎない。すなわち、ポリハプテン２と結合性の
抗体が選択的に得られた。

本発明により、例６により製造された免疫原２により
得られた抗血清において、免疫化マウスから得られた血
清18個のうちの６個がポリハプテン２と反応し、ポリハ
プテン１とは反応しなかつた。この際ポリハプテン２へ
の結合は免疫原１においてと同様に良好であつた。ここ
でも選択的な抗体が得られた。

比較のために実施した、比較免疫原V1での免疫化にお
いては100匹のマウスから、ポリハプテン２と優先的に
反応する抗血清１つが得られ、この際他の99すべての抗
血清は両方のポリハプテンと同じように良好に反応す
る。ここでは、ポリハプテン２と選択的に結合性の抗体
を得ることができなかつた。

比較免疫原V2での免疫化においては全く差異をつける
マウス抗血清を得ることはできなかつた。マウス100匹
から得られたすべての抗血清は両方のポリハプテンと同
じように良好に反応する。この際、ポリハプテンへの結
合は、本発明による免疫原１及び２で得られた血清にお
いてよりフアクター10だけ弱い。

例11 生後８〜12週のBalb/c−及びB10.D2−マウスを完全フ
ロインドのアジユバンス（CFA）中のHbA_1c（β１〜4Cy
s、MHS）−エデスチン（免疫原１）100μｇで腹膜内
（i.p）に第１回免疫化を行なつた。６週間及び10週間
後に、更に２回の免疫化を実施した。この際、不完全フ
ロイントのアジユバンス（IFA）中の免疫原100μｇを投
与した。最後の免疫化の10日後に、血清から抗体滴定量
を測定するために血液を採取した。融合前４日及び３日
目にマウスをもう１度緩衝液中の免疫原100μｇで静脈
内免疫化を行なつた。

融合のためにはギヤルフレ（Galfr′e;Methods in En
zymology、第73巻、1981年、第３頁）による方法と同様
にして、免疫化マウスの脾臓細胞10⁸と骨髄腫細胞２×1
0⁷（P3×63Ag8−653、ATCC−CRL8375）とを１回で混合
し、引き続き10分間遠心分離を行なう（300g、４℃）。
細胞をもう１回BSS（平衡塩類溶液）で洗浄し、尖端を
有する管50ml中400gで遠心分離する。上澄を除去した。
細胞沈殿物をほぐし、60％PEG−溶液（分子量4000、メ
ルク社）1mlと混合した。水浴中で１分後、室温で胎児
性子牛血清（FKS）を含有しないPRMI1640培地（RPM＝Ro
sewell Parker Memory Institut）5mlを４〜５分間かけ
て滴加し、十分に混合し、培地で50mlとし、かつ引き続
き10分間400g、４℃で遠心分離した。分離した細胞を10
％FKSを含有するRPMI1640−培地に取り込んだ。24孔−
細胞培地プレート（Nunc社）上に脾臓細胞各10⁵を接種
する。各培地に腹腔浸出液−細胞５×10⁴を飼料用細胞
として添加した。翌日にヒポキサンチン−アザセリン−
選択培地（110mMヒポキサンチン、１μg/mlアザセリ
ン）を添加した。

約７〜10日後、すでに多くのクローンが可視となつ
た。第１次培地の上澄を例10に記載したエリザ法により
試験した。HbA₀とほとんど交差反応を示さないか、又は
全く示さない第１次培地を螢光活性化細胞種（FACS）を
用いて96孔−細胞培地プレート（Nunc社）上で更にクロ
ーン化した。飼料用細胞としては孔あたり腹腔−浸出液
細胞１×10⁴を使用した。

このようにして、例えばハイブリドーマ細胞系を単離
することができ、これはヨーロピアン・コレクシヨン・
オブ・アニマル・セル・カルチヤーズ（European Colle
ctionof Animal Cell Cultures）において寄託番号
（1.）ECACC87120801、（2.）ECACC88122302及び（3.）
ECACC88122301で寄託されている。この細胞系からモノ
クローナル抗体（1.）3.6093.25（2.）3.51.56及び
（3.）3.230.140を得ることができる。

腹水の生産のためには、あらかじめプリスタン（Pris
tan）0.5mlで１〜２回前処理した、ハイブリツド細胞５
×10⁶マウスを腹腔内注射した。その後１〜３週間で、
このマウスから５〜20mg/mlのIgG−濃度を有する腹水液
がマウスから得られた。ここから常法で抗体を単離する
ことができた。このモノクローナル抗体はHbA_1cに対し
て特異的に反応し、HbA₀とは全く交差反応を示さない
か、又は僅かに示すだけである。

例12 材料微量滴定プレート:A:NUNC4−42404II B:NUNC2−69620 12管−ピペツト：ダイナテク（Dynatech），カタログ番
号、77−887−00 プレート振盪機：フロー・ラポラトリーズ（Flow Labor
atories）、テイターテク（Titertek）、カタログ番号7
7−471−00 カバーシート：ダイナテクプレート・シーラー（Dynate
ch Plate Sealers）、カタログ番号M30 エリザ読み取り機：ダイナテクMR700 積層緩衝液:50mM炭酸ナトリウム、pH9.6 試料緩衝液:10mM燐酸ナトリウム、pH7,4,0.9％NaCl,0.1
％ツウイーン20.1％クロテインＣ洗浄緩衝液:0.9％NaCl、0.1％ツウイーン20 抗体／酵素複合体：マウス−IgGのFcγ−部に反応す
る、羊からのポリクローナル抗体のFab−フラグメント
とペルオキシダーゼとからの複合体、試料緩衝液中25mU
/ml 基質:100m mol/燐酸塩−クエン酸塩−緩衝液pH4.4 3.2m mol/過硼素酸ナトリウム 1.9m mol/ABTS（2,2′−アジノ−ジ−〔３エチ
ル−ベンズチアゾリン−スルホン酸−（６）〕ジアンモ
ニウム塩）抗体:MAK3.609.325（ECACC87120801）ポリハプテン：例８によるポリハプテン１例９によるポリハプテン２抗原:HbA_1c天然 HbA₀天然予備実験において、本来の特異性実験に使用すべき抗
体量を決めた。

このためには、微量滴定プレートをポリハプテン１も
しくはポリハプテン２で積層した。各窪み100μを積
層緩衝液1mlあたりポリハプテン１μｇを１時間室温で
恒温保持する。その後、該溶液を吸引濾過し、洗浄緩衝
液で３回洗浄する。

引き続き、固相に結合したポリハプテンに抗体3.609.
325（腹水）の希釈列を添加するが、この際試料緩衝液
での希釈は1:100から４段階で行なつた。それぞれ100μ
／窪で、１時間室温で恒温保持し、最後に洗浄した。

ポリハプテンに結合した抗体はマウス−IgGのFCγ一
部に反応する、羊からのポリクローナル抗体のFab−フ
ラグメントとペルオキシダーゼとからの複合体の添加に
より、ペルオキシダーゼと添加した基質との反応を介し
て測定された。複合体100μ／窪を添加し、室温で１
時間恒温保持した。検出反応をすべての窪中に基質100
μ／窪の添加により開始した。この測定をエリザ読み
取り機中405nmで行なう（参照波長490nm）半最大結合が行なわれる抗体希釈が滴定液として定義
された。この抗体量を次の実験に使用した。

モノクローナル抗体の特異性を実験した。このために
は、個々の抗体の反応性を溶液中に存在する種々の成分
と比較した。

１％クロテイン（Crotein）Ｃで予積層した微量滴定
プレート中に、滴定液の２倍濃縮液中のモノクローナル
抗体の溶液50μ及び抗原溶液（希釈剤、下を参照）50
μをそれぞれピペツトで入れ、混合し、室温で30分間
恒温保持した。その後、ポリハプテンで積層した微量滴
定プレート中の該混合物の分割量100μを移転する。

希釈剤：測定すべき物質の半最高結合に属する濃度（mol/）
をモル比親和性と定義する。

モノクローナル抗体と種々の成分との反応性の比較の
ためには成分フルクトースValHisLeuThrProGluGluCys
（Stbu）OHのためのモノクローナル抗体の比親和性を10
0％とする。交差反応とも呼ばれる、他の成分との反応
性は次のように比親和性の商から次のように得られる：個々の成分に関して得られた値を次の第１表に記載し
た。

この際、種々の同様にして得られた抗体で得られた結
果も評価した。

この表は、特異的にHbA_1cと結合するが、HbA₀とは結
合しない多数のモノクローナル抗体を本発明による免疫
原で製造することができることを示す。比較免疫原V1の
使用下に得られた抗体又はヨーロツパ特許公開第185870
号公報から公知の抗体と比較すると、本発明により得ら
れた抗体は特別な変性なしに著しく高い親和性でHbA_1c
を認識する。従つて、本発明により得られた抗体は競合
イムノアツセイに非常に好適である。

例13 例12に記載したように、１％クロテインＣで予め積層
した微量滴定プレート中に２倍濃縮滴定液中のMAK3.60
9.325の溶液50μ及びHbA_1c−溶液50μをそれぞれピ
ペツトで入れ、混合し、室温で30分間恒温保持する。種
々の濃度のHbA_1cを使用する。

その後ポリハプテン２で積層した微量滴定プレート中
にこの混合物100μ−分割量を導入する。ポリハプテ
ン２に結合した抗体を例12に記載したように、マウス−
IgGのFcγ−部に反応する羊からのポリクローナル抗体
のFab−フラグメントとペルオキシダーゼとからの複合
体を用いて検出する。

試料溶液中にHbA_1c多量に存在すればする程、少量の
抗体がポリハプテンに結合する、すなわち、測定した吸
光度は小さくなる。図１中にはHbA_1cの測定において得
られた曲線が示されている。

例14 完全フロイントのアジユバンズ中の本発明による免疫
原１もしくは２で各10匹の羊を免疫化した。投与量は第
１回目の及びそれに続く免疫化において動物１匹あたり
免疫原各200μｇであつた。免疫化は１ケ月の間隔で行
なわれた。

得られた血清を、例12に記載されているようにHbA_1c
に対する抗体の存在及び特異性に関して実験した。この
ためには、微量滴定プレートをポリハプテン２ 0.04μ
g/mlで積層した。抗体−酵素−複合体としてはペルオキ
シダーゼと家兎−抗羊−免疫グロブリンからの複合体を
使用した。この複合体の使用濃度は150mU/mlであつた。
抗原としてはHbA_1c及びHbA₀天然を使用し、ペプチドと
してはHValHisLeuThrProGluGluCysOH及びフルクトースV
alHisLeuThrProGluGluCysOHを使用する。

この方法は、例12に記載したように実施した。

次の試料を実験した：プール1:本発明による例４からの免疫原で処理した10匹
の動物すべての血清試料の部分量からなる混合物（最初
の免疫化後45日で採血）プール2:本発明による例５からの免疫原で処理した10匹
の動物すべての血清試料の部分量からなる混合物（最初
の免疫化後45日で採血）試料a:本発明による例４からの免疫原１で処理した羊32
27の血清試料（最初の免疫化後165日で採血）試料b:本発明による例４からの免疫原１で処理した羊32
33の血清試料（最初の免疫化後165日で採血）試料c:本発明による例５からの免疫原２で処理した羊32
72の血清試料（最初の免疫化後75日で採血）滴定測定は次の結果を示す：プール1: 1:5400 プール2: 1:8400 試料a: 1:3700 試料b: 1:3600 試料c: 1:2600 第２図は抗血清濃度に依存する吸光度に関する例を示
す。

例15 例14中に記載されているように、グリコシル化及び非
グリコシル化抗原に対する抗体の親和性及び特異性を測
定した。結果を第２表及び第３表並びに第３図に示し
た。

第３図中では次のことを示す：曲線抗原最大使用濃度（nmol/l）１ペプチドＡ 5340 ２ペプチドＢ 16000 ３ HbA_1c 2670 ４ HbA₀ 2670 該表は本発明による免疫原で、非常に特異的にHbA_1c
と結合するが、HbA₀とは結合しない、著しく特異的なポ
リクローナル抗体を製造することができることを示す。
このポリクローナル抗体HbA_1cが変性なしで、高い親和
性で認識されるということが示される。更に、本発明に
より得られた免疫原での処理によりそれぞれ羊10匹から
得られたポリクローナル抗体の混合物からなる種々のプ
ールの結果から、本発明による免疫原を使用する際に非
常に高い率の免疫化動物が好適な抗体を生産するという
ことが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図はモノクローナル抗−HbA_1c−抗体（MAK3.609.32
5）のHbA_1cに対する反応性の標準曲線を示すグラフ図で
あり、第２図は例14により得られた抗血清に関する滴定
測定値（二回測定）を示すグラフ図であり、第３図はペ
プチド及びヘモグロビンに対する抗体の比親和性を示す
図であり、第１、第２、第３及び第４曲線はそれぞれ抗
原としてペプチドＡ、ペプチドＢ、HbA_1c及びHbA₀を用
いた結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者ハンス‐ゲーオルク・バツツドイツ連邦共和国トウツイング・トラウビンガー‐シユトラーセ 63 (72)発明者ヴオルフガング・ロリンガードイツ連邦共和国ヴアイルハイム・ベーレンミユールヴエーク 98 (72)発明者ウルリヒ・エツシツヒドイツ連邦共和国ガウチング・ヴアルトプロメナーデ 28ベー (72)発明者ロレンツ・ケルシヤードイツ連邦共和国ペンツベルク・パウル‐レーベ‐シユトラーセ 21

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式I: ［式中、ｍは１〜ｑ（ここで、ｑはハプテンスペーサー
基に結合する担体蛋白質の重量の25％に相当する数値を
表わす）を表わし、Ｔは担体蛋白質を表わし、Ａは一般
式II: （ここで、ＸはＳ又はNHを表わし、ｎは１〜４を表わ
し、Ｂサクシンイミド基を含有する有機基を表わす）を
有する原子数10〜20の鎖長のスペーサーを表わす］を有
する、HbA_1c−特異的抗体を取得するための免疫原。
【請求項２】基Ａが原子数12〜18の鎖長を有する請求項
１記載の免疫原。
【請求項３】ｍが３〜20を表わす請求項１又は２記載の
免疫原。
【請求項４】Ｂがサクシンイミジル−ヘキサノイル基を
表わす請求項１から３までのいずれか１項記載の免疫
原。
【請求項５】特異的にグリコシル化ヘモグロビンを結合
する抗体を取得するために、一般式Ｉ［式中、ｍは１〜ｑ（ここで、ｑはハプテンスペーサー
基に結合する担体蛋白質の重量の25％に相当する数値を
表わす）を表わし、Ｔは担体蛋白質を表わし、Ａは一般
式II: （ここで、ＸはＳ又はNHを表わし、ｎは１〜４を表わ
し、Ｂはサクシンイミド基を含有する有機基を表わす）
を有する原子数10〜20の鎖長のスペーサーを表わす］の
免疫原を、抗体を形成する能力のある生物（人を除く）
に注射し、次いで自体公知法で抗体を取得することを特
徴とする抗体の取得法。
【請求項６】免疫原として請求項２から４までのいずれ
か１項記載の免疫原を使用する請求項５による取得法。