JPH0892300A - ポリクローナル抗体 - Google Patents
ポリクローナル抗体Info
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- JPH0892300A JPH0892300A JP7261421A JP26142195A JPH0892300A JP H0892300 A JPH0892300 A JP H0892300A JP 7261421 A JP7261421 A JP 7261421A JP 26142195 A JP26142195 A JP 26142195A JP H0892300 A JPH0892300 A JP H0892300A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
- G01N33/721—Haemoglobin
- G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＨｂＡ1cに高親和性を示すポリクローナル抗
体 【解決手段】 ＨｂＡ1cに高親和性を示すポリクローナ
ル抗体を、一般式Ｉ： 【化１】 の免疫原を、抗体を形成する能力のある生物に注射し、
次いでこの生物から抗体を取得することにより獲得す
る。
体 【解決手段】 ＨｂＡ1cに高親和性を示すポリクローナ
ル抗体を、一般式Ｉ： 【化１】 の免疫原を、抗体を形成する能力のある生物に注射し、
次いでこの生物から抗体を取得することにより獲得す
る。
Description
【発明の属する技術分野】本発明はＨｂＡ1c−特異的抗
体に関する。
体に関する。
【従来の技術】吸入した酸素及びＣＯ2の運搬に作用
し、赤血球中に局在するヘモグロビンは４本の鎖からな
っており、そのうちのそれぞれ２本は同じ構造を有す
る。主に、２本のα−鎖及び２本のβ−鎖からなる。こ
のヘモグロビンは血液中で９０％より多くまでがＨｂＡ
0として示される形で存在する。グリコシル化ヘモグロ
ビンは生体内でヘモグロビンとグルコースとの非酵素的
反応により生じる。このグリコシル化はグルコースのア
ルデヒド基とヘモグロビンのアミノ基との間でのシッフ
の塩基の形成を介して経過する。生じたアルジミンはア
マドリ（Ａｍａｄｏｒｉ）転位により転位しＮ−（１−
デスオキシ−Ｄ−フルクトース−１−イル）−基とな
る。この転位形においてグリコシル化ヘモグロビンは安
定である。グリコシル化ヘモグロビンをＨｂＡ1と呼
び、これらの群の最も重要なものをＨｂＡ1cと呼ぶ。Ｈ
ｂＡ1cはヘモグロビンのβ鎖のアミノ末端に存在するバ
リン基の遊離アミノ基のグリコシル化により生じる。こ
の際、Ｎ−（１−デスオキシ−Ｄ−フルクトース−１−
イル）−Ｌ−バリン基が生じ、以降これを“フルクトー
ス・バリン”と呼ぶ。血中でのＨｂＡ1cの濃度は血液の
糖濃度に依存する。全ヘモグロビンに対するＨｂＡ1の
量は通常成人において３〜６％の範囲にある。血糖値の
上昇において、全グロブリンに対するグリコシル化ヘモ
グロビンの量は上昇し、１５％にまで上昇することがあ
る。従って、ＨｂＡ1c−量の測定は糖代謝のコントロー
ルのための確実なパラメーターである。赤血球及びこれ
と共に安定なＨｂＡ1は平均して１２０日間生存するの
で、血中でのグリコシル化ヘモグロビン量の測定は、特
に糖尿病患者に重要である炭水化物代謝をコントロール
するための良好なパラメーターを提供する。このパラメ
ーターは炭水化物の富んだ食事後の血糖値の短時間の上
昇には依存せず、こうして長時間パラメーターとして働
らく。従って、糖尿病の診断のために及び糖尿病患者の
監視のために、血中のＨｂＡ 1cの量を特異的に測定する
ことは重要である。グリコシル化ヘモグロビンの分析に
関しては、一連の方法がある。最も多く使用される方法
は、β−鎖の遊離アミノ基をグルコースと反応させる時
ヘモグロビン分子中でのプラスの電荷の喪失に基づく。
特に、カラムクロマトグラフィー法及び電気泳動法を使
用する。他の方法は組み込まれたグルコース分子もしく
はアマドリ転位によるフルクトース分子を比色定量法に
より検出する（チオバルビツール酸法）。従来公知の方
法は一部非常に時間を費し、煩雑であり、一部グリコシ
ル化ヘモグロビンに関して十分に特異的ではない。従っ
て、全ヘモグロビン中のグリコシル化部分量を著しく特
異的に把握する簡単な測定法に対する要求がある。その
ような簡単な方法は専門家に公知の種々のイムノアッセ
イの変法である。均質な競合イムノアッセイにおいて
は、例えば標識化ＨｂＡ1c誘導体は測定すべき試料から
のＨｂＡ1cと抗体を争う。標識化ＨｂＡ1c−誘導体とし
てはＨｂＡ1cのエピトープである短かい合成ペプチドを
使用し、標識に結合する。正確な結果で再現性のある測
定を可能とするためには、標識化ペプチドと試料からの
ＨｂＡ1cとが実際に競合反応を行なうことができるよう
に、これらがほぼ同じ親和性で結合する抗体を使用しな
ければならない。従って、このイムノアッセイの実施の
ためには、非常に特異的にＨｂＡ1cを認識する抗体、す
なわちＨｂＡ1c−β−鎖のグリコシル化Ｎ−末端が特異
的に結合するが、相応するＨｂＡ0−β−鎖の非グリコ
シル化Ｎ−末端は結合しない抗体を提供しなければなら
ない。競合イムノアッセイのもう１つの変法は不均一相
で実施される。この際、例えば固相に結合したＨｂＡ1c
−エピトープを有する合成ペプチドと試料からのＨｂＡ
1cとが特異的抗体を競合する。固相に結合したペプチド
は例えば牛血清アルブミンと、ＨｂＡ1cのエピトープの
配列を有する合成グリコシル化ペプチドとからの複合体
であってよい。この変法を実施するためにも、抗体は該
ペプチド及び試料からのＨｂＡ1cとほぼ同程度の親和性
で結合するべきである。ＨｂＡ1cの検出のための、感度
が良好で、特異的な方法を実施するためには、ＨｂＡ0
ではなく、特異的にＨｂＡ1cに結合する抗体を取得する
ことは重要であった。すでに、ＨｂＡ1cの検出法、並び
にこの方法に好適な抗体は、例えばヨーロッパ特許公開
第１８５８７０号明細書から公知である。しかしなが
ら、すべての公知の抗体は、これらがＨｂＡ1c分子に対
して非常に僅かな親和性を有するという欠点を有してい
る。従って、一般にＨｂＡ1の抗原決定基が、抗体が十
分量で結合されることができる程度に十分に遊離して存
在するように、測定の実施の前に変性を実施しなければ
ならない。この種の方法は煩雑である。ヨーロッパ特許
公開第１８５８７０号明細書による方法において使用し
た免疫原は、僅かに特異的な免疫応答のみが生じるとい
う欠点を有している。こうして、そこに記載された方法
によればＨｂＡ1c及びＨｂＡ0の区別に関して測定可能
な特異性を有さない、ポリクローナル羊血清及びマウス
血清のみが得られる。西ドイツ国特許公開第３４３９６
１０号公報から、ＨｂＡ1cに対する抗体の取得法が公知
であり、これにおいては免疫原として糖、ヘモグロビン
のβ−鎖のヘプチド基及び免疫原担体からなる複合体を
使用している。しかしながら、この方法で得られた抗体
は全く十分な選択性を示さず、その比親和性が小さい。
し、赤血球中に局在するヘモグロビンは４本の鎖からな
っており、そのうちのそれぞれ２本は同じ構造を有す
る。主に、２本のα−鎖及び２本のβ−鎖からなる。こ
のヘモグロビンは血液中で９０％より多くまでがＨｂＡ
0として示される形で存在する。グリコシル化ヘモグロ
ビンは生体内でヘモグロビンとグルコースとの非酵素的
反応により生じる。このグリコシル化はグルコースのア
ルデヒド基とヘモグロビンのアミノ基との間でのシッフ
の塩基の形成を介して経過する。生じたアルジミンはア
マドリ（Ａｍａｄｏｒｉ）転位により転位しＮ−（１−
デスオキシ−Ｄ−フルクトース−１−イル）−基とな
る。この転位形においてグリコシル化ヘモグロビンは安
定である。グリコシル化ヘモグロビンをＨｂＡ1と呼
び、これらの群の最も重要なものをＨｂＡ1cと呼ぶ。Ｈ
ｂＡ1cはヘモグロビンのβ鎖のアミノ末端に存在するバ
リン基の遊離アミノ基のグリコシル化により生じる。こ
の際、Ｎ−（１−デスオキシ−Ｄ−フルクトース−１−
イル）−Ｌ−バリン基が生じ、以降これを“フルクトー
ス・バリン”と呼ぶ。血中でのＨｂＡ1cの濃度は血液の
糖濃度に依存する。全ヘモグロビンに対するＨｂＡ1の
量は通常成人において３〜６％の範囲にある。血糖値の
上昇において、全グロブリンに対するグリコシル化ヘモ
グロビンの量は上昇し、１５％にまで上昇することがあ
る。従って、ＨｂＡ1c−量の測定は糖代謝のコントロー
ルのための確実なパラメーターである。赤血球及びこれ
と共に安定なＨｂＡ1は平均して１２０日間生存するの
で、血中でのグリコシル化ヘモグロビン量の測定は、特
に糖尿病患者に重要である炭水化物代謝をコントロール
するための良好なパラメーターを提供する。このパラメ
ーターは炭水化物の富んだ食事後の血糖値の短時間の上
昇には依存せず、こうして長時間パラメーターとして働
らく。従って、糖尿病の診断のために及び糖尿病患者の
監視のために、血中のＨｂＡ 1cの量を特異的に測定する
ことは重要である。グリコシル化ヘモグロビンの分析に
関しては、一連の方法がある。最も多く使用される方法
は、β−鎖の遊離アミノ基をグルコースと反応させる時
ヘモグロビン分子中でのプラスの電荷の喪失に基づく。
特に、カラムクロマトグラフィー法及び電気泳動法を使
用する。他の方法は組み込まれたグルコース分子もしく
はアマドリ転位によるフルクトース分子を比色定量法に
より検出する（チオバルビツール酸法）。従来公知の方
法は一部非常に時間を費し、煩雑であり、一部グリコシ
ル化ヘモグロビンに関して十分に特異的ではない。従っ
て、全ヘモグロビン中のグリコシル化部分量を著しく特
異的に把握する簡単な測定法に対する要求がある。その
ような簡単な方法は専門家に公知の種々のイムノアッセ
イの変法である。均質な競合イムノアッセイにおいて
は、例えば標識化ＨｂＡ1c誘導体は測定すべき試料から
のＨｂＡ1cと抗体を争う。標識化ＨｂＡ1c−誘導体とし
てはＨｂＡ1cのエピトープである短かい合成ペプチドを
使用し、標識に結合する。正確な結果で再現性のある測
定を可能とするためには、標識化ペプチドと試料からの
ＨｂＡ1cとが実際に競合反応を行なうことができるよう
に、これらがほぼ同じ親和性で結合する抗体を使用しな
ければならない。従って、このイムノアッセイの実施の
ためには、非常に特異的にＨｂＡ1cを認識する抗体、す
なわちＨｂＡ1c−β−鎖のグリコシル化Ｎ−末端が特異
的に結合するが、相応するＨｂＡ0−β−鎖の非グリコ
シル化Ｎ−末端は結合しない抗体を提供しなければなら
ない。競合イムノアッセイのもう１つの変法は不均一相
で実施される。この際、例えば固相に結合したＨｂＡ1c
−エピトープを有する合成ペプチドと試料からのＨｂＡ
1cとが特異的抗体を競合する。固相に結合したペプチド
は例えば牛血清アルブミンと、ＨｂＡ1cのエピトープの
配列を有する合成グリコシル化ペプチドとからの複合体
であってよい。この変法を実施するためにも、抗体は該
ペプチド及び試料からのＨｂＡ1cとほぼ同程度の親和性
で結合するべきである。ＨｂＡ1cの検出のための、感度
が良好で、特異的な方法を実施するためには、ＨｂＡ0
ではなく、特異的にＨｂＡ1cに結合する抗体を取得する
ことは重要であった。すでに、ＨｂＡ1cの検出法、並び
にこの方法に好適な抗体は、例えばヨーロッパ特許公開
第１８５８７０号明細書から公知である。しかしなが
ら、すべての公知の抗体は、これらがＨｂＡ1c分子に対
して非常に僅かな親和性を有するという欠点を有してい
る。従って、一般にＨｂＡ1の抗原決定基が、抗体が十
分量で結合されることができる程度に十分に遊離して存
在するように、測定の実施の前に変性を実施しなければ
ならない。この種の方法は煩雑である。ヨーロッパ特許
公開第１８５８７０号明細書による方法において使用し
た免疫原は、僅かに特異的な免疫応答のみが生じるとい
う欠点を有している。こうして、そこに記載された方法
によればＨｂＡ1c及びＨｂＡ0の区別に関して測定可能
な特異性を有さない、ポリクローナル羊血清及びマウス
血清のみが得られる。西ドイツ国特許公開第３４３９６
１０号公報から、ＨｂＡ1cに対する抗体の取得法が公知
であり、これにおいては免疫原として糖、ヘモグロビン
のβ−鎖のヘプチド基及び免疫原担体からなる複合体を
使用している。しかしながら、この方法で得られた抗体
は全く十分な選択性を示さず、その比親和性が小さい。
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は公知技術から出発し、高い親和性を有し、高い特異性
の、ＨｂＡ1cに対するポリクローナル及びモノクローナ
ル抗体を提供することである。
は公知技術から出発し、高い親和性を有し、高い特異性
の、ＨｂＡ1cに対するポリクローナル及びモノクローナ
ル抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】この課題は一般式Ｉ
【化３】 ［式中、ｍは１〜ｑ（ここで、ｑはハプテンスペーサー
基に結合する担体蛋白質の重量２５％に相当する数値を
表わす）を表わし、Ｔは担体蛋白質を表わし、Ａは一般
式ＩＩ：
基に結合する担体蛋白質の重量２５％に相当する数値を
表わす）を表わし、Ｔは担体蛋白質を表わし、Ａは一般
式ＩＩ：
【化４】 （ここで、ＸはＳ又はＮＨを表わし、ｎは１〜４を表わ
し、Ｂはサクシンイミド基を含有する有機基を表わす）
を有する原子数１０〜２０の鎖長のスペーサーを表わ
す］の免疫原を、抗体を形成する能力のある生物に注射
し、次いでこの生物から抗体を取得することにより得る
ことができ、かつＨｂＡ1cに高親和性を示し、かつＨｂ
Ａ0を結合しないことを特徴とするＨｂＡ1cに対するポ
リクローナル抗体により解決する。本発明において免疫
原を使用する際に高特異的抗体が得られ、その選択性及
び親和性は従来公知のＨｂＡ1c抗体のそれらより著しく
すぐれているということが確認されたことは意外であっ
た。本発明に使用する免疫原は三つの部分（ＨｂＡ1c−
蛋白質のＮ−末端に相応するハプテン部、スペーサー及
び免疫原蛋白質）からなる。本発明に使用した免疫原の
ハプテン部はヘモグロビンのβ−鎖のＮ−末端部の最初
の４つのアミノ酸及びフルクトース分子を有する。天然
のＨｂＡ1−蛋白質におけるように、本発明による免疫
原においてはフルクトース分子のＣ1−原子にアミノ酸
であるバリン、ヒスチジン、ロイシン及びスレオニンが
結合している。ハプテン部の製造は自体公知法で行なわ
れる。特に好適であるのは固相合成である（Ｇ．Ｂａｒ
ａｎｙ及びＲ．Ｗ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ著、Ｇｒｏｓ
ｓ、Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ、第２巻、第３〜２８５頁、ニューヨーク、１９７８
年）。このためにはα−アミノ基はＮα−フルオレニル
メトキシカルボニル基で保護される。側鎖の官能基はｔ
ｅｒｔ−ブチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルエステルと
して、もしくはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基として
保護される。これらの保護基は完成した合成ペプチドの
担体からの加酸分解による切断において一緒に分離す
る。Ｎ−（１−デスオキシ−Ｄ−フルクトース−１−イ
ル）−基は自体公知法でペプチドとグルコースとの反応
により挿入される。引き続く、アマドリ転位により
（Ｋ．Ｈｅｙｎｓ及びＨ．Ｐａｕｌｓｅｎ著、Ｊ．Ｌｉ
ｅｂｉｇｓ ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．，第６２７巻（１９５
９年）、第１６０〜１７４頁及びＨ．Ｒｏｅｐｅｒ等
著、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ、第１１６巻、１９８
３年、第１８３〜１９５頁参照）、所望のＮ−（１−デ
スオキシ−Ｄ−フルクトース−１−イル）−ペプチドが
得られる。免疫原複合体のもう１つの本発明において重
要な成分はスペーサーであり、これはハプテンを免疫原
蛋白質と結合している。該スペーサーは本発明により原
子１０〜２０個の鎖長を示し、この際、該連鎖は炭素、
酸素、窒素及び／又は硫黄原子から構成されていてよ
い。この鎖長に関しては、連鎖を構成する原子だけを数
えていて、水素原子又は側鎖基原子は数えない。スペー
サーはスレオニンのカルボキシル基に結合している。ス
ペーサーは次の一般式：
し、Ｂはサクシンイミド基を含有する有機基を表わす）
を有する原子数１０〜２０の鎖長のスペーサーを表わ
す］の免疫原を、抗体を形成する能力のある生物に注射
し、次いでこの生物から抗体を取得することにより得る
ことができ、かつＨｂＡ1cに高親和性を示し、かつＨｂ
Ａ0を結合しないことを特徴とするＨｂＡ1cに対するポ
リクローナル抗体により解決する。本発明において免疫
原を使用する際に高特異的抗体が得られ、その選択性及
び親和性は従来公知のＨｂＡ1c抗体のそれらより著しく
すぐれているということが確認されたことは意外であっ
た。本発明に使用する免疫原は三つの部分（ＨｂＡ1c−
蛋白質のＮ−末端に相応するハプテン部、スペーサー及
び免疫原蛋白質）からなる。本発明に使用した免疫原の
ハプテン部はヘモグロビンのβ−鎖のＮ−末端部の最初
の４つのアミノ酸及びフルクトース分子を有する。天然
のＨｂＡ1−蛋白質におけるように、本発明による免疫
原においてはフルクトース分子のＣ1−原子にアミノ酸
であるバリン、ヒスチジン、ロイシン及びスレオニンが
結合している。ハプテン部の製造は自体公知法で行なわ
れる。特に好適であるのは固相合成である（Ｇ．Ｂａｒ
ａｎｙ及びＲ．Ｗ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ著、Ｇｒｏｓ
ｓ、Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ、第２巻、第３〜２８５頁、ニューヨーク、１９７８
年）。このためにはα−アミノ基はＮα−フルオレニル
メトキシカルボニル基で保護される。側鎖の官能基はｔ
ｅｒｔ−ブチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルエステルと
して、もしくはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基として
保護される。これらの保護基は完成した合成ペプチドの
担体からの加酸分解による切断において一緒に分離す
る。Ｎ−（１−デスオキシ−Ｄ−フルクトース−１−イ
ル）−基は自体公知法でペプチドとグルコースとの反応
により挿入される。引き続く、アマドリ転位により
（Ｋ．Ｈｅｙｎｓ及びＨ．Ｐａｕｌｓｅｎ著、Ｊ．Ｌｉ
ｅｂｉｇｓ ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．，第６２７巻（１９５
９年）、第１６０〜１７４頁及びＨ．Ｒｏｅｐｅｒ等
著、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ、第１１６巻、１９８
３年、第１８３〜１９５頁参照）、所望のＮ−（１−デ
スオキシ−Ｄ−フルクトース−１−イル）−ペプチドが
得られる。免疫原複合体のもう１つの本発明において重
要な成分はスペーサーであり、これはハプテンを免疫原
蛋白質と結合している。該スペーサーは本発明により原
子１０〜２０個の鎖長を示し、この際、該連鎖は炭素、
酸素、窒素及び／又は硫黄原子から構成されていてよ
い。この鎖長に関しては、連鎖を構成する原子だけを数
えていて、水素原子又は側鎖基原子は数えない。スペー
サーはスレオニンのカルボキシル基に結合している。ス
ペーサーは次の一般式：
【化５】 を示し、ここでＸはＳ又はＮＨを表わし、ｎは１〜４の
整数を表わす。ＸがＳを表わし、ｎが１である場合、も
しくはＸがＮＨを表わし、ｎが４の場合が有利である。
一般式の基Ｂは自体公知のスペーサー分子であり、これ
はサクシンイミジル基を有する。基Ｂの構造はあまり厳
密ではないが、他のスペーサー部と一緒になって原子１
０〜２０個の鎖長が得られるような連鎖分子の長さを示
さなければならない。基Ｂとしてサクシンイミジルヘキ
サノイル基を使用するのが有利である。スペーサーは自
体公知法で挿入される。スペーサーは所定のペプチドの
Ｃ−末端に結合することができ、かつＮＨ2−又はＳＨ
−基を有するアミノ酸を含有する。このアミノ基もしく
はメルカプト基を介して、担体蛋白質との結合を仲介す
るサクシンイミジル基は挿入される。アミノ酸としてシ
ステイン、ホモシステイン、リジン又はオルニチンを使
用するのが有利である。スペーサーがアミノ酸としてシ
ステイン又はホモシステインを含有する場合、はじめに
保護されたメルカプト基を有するシステイン又はホモシ
ステインをペプチドの固相合成用出発アミノ酸として使
用することができ、その際保護基としてｔ−ブチルスル
フェニル基を使用するのが有利である。引き続き、担体
蛋白質をサクシンイミジル基を供給する二官能性リンカ
ー、例えばマレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシサ
クシンイミドと反応させ、次いでスペーサー−担体蛋白
質−複合体をシステインもしくはホモシステインの遊離
したＳＨ−基に結合させる。スペーサーがアミノ酸とし
てリジン又はオルニチンを含有するならば、ペプチドの
固相合成のために出発アミノ酸として保護されたα−ア
ミノ基を有するアミノ酸をはじめに使用するのが有利で
あり、この際保護基として有利にカルボベンゾキシ基を
使用し、引き続きペプチドの遊離したα−アミノ基を二
官能性リンカーと反応させる。次いで、ペプチド−アミ
ノ酸−スペーサー複合体を担体蛋白質に結合するが、こ
の際この結合は担体蛋白質のＳＨ−基を介して行なう。
担体蛋白質としては自体公知の蛋白質を使用することが
できる。好適であるのは例えばアルブミン、例えば牛血
清アルブミン及びオバルブミン、ヘモシアニン、例えば
キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌ
ｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ）、ポリア
ミノ酸、例えばポリ−Ｌ−Ｌｙｓ及びポリ−Ｌ−（Ｌｙ
ｓ：Ｇｌｕ）又は酵素、例えばガラクトシダーゼであ
る。担体蛋白質としてはエデスチン又はガラクトシダー
ゼを使用するのが有利である。担体蛋白質には有利に多
くのハプテン・スペーサー基が結合される。結合する基
の数は担体蛋白質の大きさに依存する。一般に、担体蛋
白質の重量の最高２５％がハプテン・スペーサー基に結
合されていてよい。蛋白質としてエデスチンを使用する
場合、ハプテンスペーサー基１０〜３０個が有利に結合
される。前記免疫原を用いて、ＨｂＡ1cに対する高活性
特異的抗体が得られる。この抗体はＨｂＡ0との著しく
僅かな交差反応性を示す。本発明の抗体を取得するため
には、前記免疫原を好適な生物に多数回注入し、次いで
自体公知法で抗体を取得する。抗体の獲得のためには一
般に哺乳動物を免疫化する。好適であるのは、例えばマ
ウス、羊、家兎、ラッテ又はモルモットである。免疫原
を、有利に緩衝液中に溶かし、常用の助剤の添加下に、
例えばフロイントのアジュバンス（Ｆｒｅｕｎｄｓｃｈ
ｅｎ Ａｄｊｕｖａｎｚ）と共に宿主動物中に注入す
る。高い抗体動物を得るためにはこの注射を規則的な間
隔、例えば２週間〜４週間ごとに繰り返す。宿主動物の
血液から、ポリクローナル抗体を含有する抗血清を常法
で取得する。本発明による免疫原を用いて、高特異性モ
ノクローナル抗体も、例えばＮａｔｕｒｅ、第２６６
巻、１９７７年、第４９５頁及びＳｃｉｅｎｃｅ、第２
０８巻、１９８０年、第６９２頁以降に記載されてい
る、Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎの公
知ハイブリッド化法を使用して取得することができる。
このためには宿主生物の免疫化の後、免疫化動物の脾臓
からＢ−リンパ球を単離し、骨髄腫細胞と融合し、生じ
たハイブリドーマ細胞をクローン化する。次いで、生じ
たクローンから、ＨｂＡ1cと特異的に反応し、他の分子
と実質的に全く交差反応を行なわない抗体を生産する細
胞系を単離する。この細胞系の単離は、クローンの著し
く高い量が特異的な抗体を生産するので、簡単である。
この細胞系を更に培養し、次いでこれから所望のモノク
ローナル抗体を取得することができる。抗体活性は自体
公知法で、血清中又はハリブリドーマ上澄中で、酵素イ
ムノアッセイを使用して常法で測定する。本発明により
得られた抗体はＨｂＡ1cに対する高い特異性及び高い親
和性により優れている。グリコシル化していないヘモグ
ロビンと、及び体液中に存在する他の蛋白質との交差反
応は僅かである。従って、この抗体は体液中のＨｂＡ1c
の測定法に使用するために優れている。特に好適なモノ
クローナル抗体はＭＡＫ′ｓ ３．６０９．３２５、
３．５１．５６及び３．２３０．１４０である。相応す
るハリブリドーマ細胞系はヨーロピアン・コレクション
・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅ
ａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃ
ｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、プロトン・ダウン（Ｐｒ
ｏｔｏｎ Ｄｏｗｎ）、ＧＢに、ＥＣＡＣＣ８７１２０
８０１、ＥＣＡＣＣ８８１２２３０２及びＥＣＡＣＣ８
８１２２３０１という番号で寄託されている。
整数を表わす。ＸがＳを表わし、ｎが１である場合、も
しくはＸがＮＨを表わし、ｎが４の場合が有利である。
一般式の基Ｂは自体公知のスペーサー分子であり、これ
はサクシンイミジル基を有する。基Ｂの構造はあまり厳
密ではないが、他のスペーサー部と一緒になって原子１
０〜２０個の鎖長が得られるような連鎖分子の長さを示
さなければならない。基Ｂとしてサクシンイミジルヘキ
サノイル基を使用するのが有利である。スペーサーは自
体公知法で挿入される。スペーサーは所定のペプチドの
Ｃ−末端に結合することができ、かつＮＨ2−又はＳＨ
−基を有するアミノ酸を含有する。このアミノ基もしく
はメルカプト基を介して、担体蛋白質との結合を仲介す
るサクシンイミジル基は挿入される。アミノ酸としてシ
ステイン、ホモシステイン、リジン又はオルニチンを使
用するのが有利である。スペーサーがアミノ酸としてシ
ステイン又はホモシステインを含有する場合、はじめに
保護されたメルカプト基を有するシステイン又はホモシ
ステインをペプチドの固相合成用出発アミノ酸として使
用することができ、その際保護基としてｔ−ブチルスル
フェニル基を使用するのが有利である。引き続き、担体
蛋白質をサクシンイミジル基を供給する二官能性リンカ
ー、例えばマレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシサ
クシンイミドと反応させ、次いでスペーサー−担体蛋白
質−複合体をシステインもしくはホモシステインの遊離
したＳＨ−基に結合させる。スペーサーがアミノ酸とし
てリジン又はオルニチンを含有するならば、ペプチドの
固相合成のために出発アミノ酸として保護されたα−ア
ミノ基を有するアミノ酸をはじめに使用するのが有利で
あり、この際保護基として有利にカルボベンゾキシ基を
使用し、引き続きペプチドの遊離したα−アミノ基を二
官能性リンカーと反応させる。次いで、ペプチド−アミ
ノ酸−スペーサー複合体を担体蛋白質に結合するが、こ
の際この結合は担体蛋白質のＳＨ−基を介して行なう。
担体蛋白質としては自体公知の蛋白質を使用することが
できる。好適であるのは例えばアルブミン、例えば牛血
清アルブミン及びオバルブミン、ヘモシアニン、例えば
キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌ
ｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ）、ポリア
ミノ酸、例えばポリ−Ｌ−Ｌｙｓ及びポリ−Ｌ−（Ｌｙ
ｓ：Ｇｌｕ）又は酵素、例えばガラクトシダーゼであ
る。担体蛋白質としてはエデスチン又はガラクトシダー
ゼを使用するのが有利である。担体蛋白質には有利に多
くのハプテン・スペーサー基が結合される。結合する基
の数は担体蛋白質の大きさに依存する。一般に、担体蛋
白質の重量の最高２５％がハプテン・スペーサー基に結
合されていてよい。蛋白質としてエデスチンを使用する
場合、ハプテンスペーサー基１０〜３０個が有利に結合
される。前記免疫原を用いて、ＨｂＡ1cに対する高活性
特異的抗体が得られる。この抗体はＨｂＡ0との著しく
僅かな交差反応性を示す。本発明の抗体を取得するため
には、前記免疫原を好適な生物に多数回注入し、次いで
自体公知法で抗体を取得する。抗体の獲得のためには一
般に哺乳動物を免疫化する。好適であるのは、例えばマ
ウス、羊、家兎、ラッテ又はモルモットである。免疫原
を、有利に緩衝液中に溶かし、常用の助剤の添加下に、
例えばフロイントのアジュバンス（Ｆｒｅｕｎｄｓｃｈ
ｅｎ Ａｄｊｕｖａｎｚ）と共に宿主動物中に注入す
る。高い抗体動物を得るためにはこの注射を規則的な間
隔、例えば２週間〜４週間ごとに繰り返す。宿主動物の
血液から、ポリクローナル抗体を含有する抗血清を常法
で取得する。本発明による免疫原を用いて、高特異性モ
ノクローナル抗体も、例えばＮａｔｕｒｅ、第２６６
巻、１９７７年、第４９５頁及びＳｃｉｅｎｃｅ、第２
０８巻、１９８０年、第６９２頁以降に記載されてい
る、Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎの公
知ハイブリッド化法を使用して取得することができる。
このためには宿主生物の免疫化の後、免疫化動物の脾臓
からＢ−リンパ球を単離し、骨髄腫細胞と融合し、生じ
たハイブリドーマ細胞をクローン化する。次いで、生じ
たクローンから、ＨｂＡ1cと特異的に反応し、他の分子
と実質的に全く交差反応を行なわない抗体を生産する細
胞系を単離する。この細胞系の単離は、クローンの著し
く高い量が特異的な抗体を生産するので、簡単である。
この細胞系を更に培養し、次いでこれから所望のモノク
ローナル抗体を取得することができる。抗体活性は自体
公知法で、血清中又はハリブリドーマ上澄中で、酵素イ
ムノアッセイを使用して常法で測定する。本発明により
得られた抗体はＨｂＡ1cに対する高い特異性及び高い親
和性により優れている。グリコシル化していないヘモグ
ロビンと、及び体液中に存在する他の蛋白質との交差反
応は僅かである。従って、この抗体は体液中のＨｂＡ1c
の測定法に使用するために優れている。特に好適なモノ
クローナル抗体はＭＡＫ′ｓ ３．６０９．３２５、
３．５１．５６及び３．２３０．１４０である。相応す
るハリブリドーマ細胞系はヨーロピアン・コレクション
・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅ
ａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃ
ｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、プロトン・ダウン（Ｐｒ
ｏｔｏｎ Ｄｏｗｎ）、ＧＢに、ＥＣＡＣＣ８７１２０
８０１、ＥＣＡＣＣ８８１２２３０２及びＥＣＡＣＣ８
８１２２３０１という番号で寄託されている。
【実施例】次に本願発明を図面及び実施例につき詳細に
説明する。 例 １ ペプチドフルクトースＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ
−Ｃｙｓ−ＯＨを合成した。固相合成をラボルテック社
（Ｆｉｒｍａ Ｌａｂｏｒｔｅｃ；Ｂｕｄｅｎｄｏｒ
ｆ、Ｓｃｈｗｅｉｚ在）の半自動ペプチド合成機（ｓｅ
ｍｉ−ａｕｔｏｍａｔｉｓｈｅｎ ｐｅｐｔｉｄｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｚｅｒ）中で実施した。Ｎα−アミノ保護基
としてはＦｍｏｃ−基（Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ−ｍｅｔｈ
ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ｇｒｕｐｐｅ）を使用した。
このペプチド合成法の記載はマイエンホーファー（Ｊ．
Ｍｅｙｅｎｈｏｆｅｒ）等著、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉ
ｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、第１３巻、第３５〜４
２頁（１９７９年）にある。マイエンホーファーにより
記載されているように、Ｃ−末端Ｆｍｏｃ−アミノ酸を
ｐ−アルキルオキシベンジルアルコール樹脂（Ｆｉｒｍ
ａ Ｂａｃｈｅｍ．Ｂｕｄｅｎｄｏｒｆ、Ｓｃｈｗｅｉ
ｚ）に結合した。 合成サイクルに関する合成方法： 工程 時 間 試 薬 ／ 溶 剤 １ ２×１分 ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド） ２ １×３分 ピペリジン／ＤＭＦ １：４ ３ １×７分 ピペリジン／ＤＭＦ １：４ ４ ４×１／２分 ＤＭＦ ５ ２×１／２分 イソプロパノール ６ 中 止 ニンヒドリンテスト ７ ２×１分 ＤＭＦ ８ 中 止 ＤＭＦ中の次のＦｍｏｃ−アミノ酸及びＨＯＢｔ （１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）の添加 ９ ２ 分 振盪 １０ 中 止 ＤＣＭ（ジクロルメタン）中のＤＣＣ（ジシクロヘ キシルカルボジイミド）の添加 １１ ９０分 結合 １２ ３×１分 ＤＭＦ １３ ２×１分 イソプロパノール １４ 中 止 ニンヒドリンテスト 工程８〜１１による結合のために、Ｆｍｏｃ−アミノ酸
及びＤＣＣは出発樹脂の負荷に対してそれぞれ３倍モル
量で使用する。ＨｏＢｔは４．５倍モル量で使用する。
最後のＮ−末端Ｆｍｏｃ−アミノ酸の結合の後、Ｆｍｏ
ｃ−保護基の脱離のために、合成サイクルの工程１〜５
を実施する。その後、この樹脂を１５倍容量のジクロル
メタン（ＤＣＭ）／トリフルオル酢酸（ＴＦＡ）１：１
中で２時間室温で振盪する。濾過し、ＤＣＭ／ＴＦＡ
４：１で更に２回この樹脂を洗浄し、すべての濾液を合
し、真空中２５℃でトルエン添加下に濃縮する。残分に
ジエチルエーテルを加える。固体を濾別し、乾燥する。
前記の概要法によりペプチドであるフルクトース−Ｖａ
ｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）ＯＨ
が合成された。出発樹脂としては０．６ｍ Ｍｏｌ／ｇ
で負荷されたＦｍｏｃ Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）ｐ−アルコ
キシベンジルアルコール樹脂１０ｇを使用した。合成サ
イクルにおいて次のＦｍｏｃ−アミノ酸を順次使用し
た： １． Ｆｍｏｃ Ｔｈｒ（ｔＢｕ） ６．２ｇ ２． Ｆｍｏｃ Ｌｅｕ ６．４ｇ ３． Ｆｍｏｃ Ｈｉｓ（Ｔｒｔ） １１ｇ ４． Ｆｍｏｃ Ｖａｌ ６．１ｇ 次の短縮形を使用した： ｔＢｕ ：トリエチルブチルエーテル Ｔｒｔ ：トリチル ＳｔＢｕ：ｔ−ブチルチオエーテル ＯｔＢｕ：ｔ−ブチルエステル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル −Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）：ｔ−ブチルスルフェニルシステ
イン 樹脂の脱離後の粗収率はＨｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｈｒ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）ＯＨ ３．２９ｇである。Ｄ
Ｃ：（シリカゲルＨＰＴＬＣ Ｍｅｒｃｋ、溶離剤：エ
タノール／氷酢／水 ６：２：２）Ｒｆ＝０．６２。ニ
ンヒドリンスプレー０．１％（Ｍｅｒｃｋ）での噴霧及
び１２０℃で５分間での顕色により赤紫色となる。０．
４％レゾルシンメタノール溶液２００ｍｌ及び５Ｎ硫酸
４０ｍｌからなる混合物（レゾルシン硫酸）での噴霧及
び５〜１０分間の１２０℃での顕色により発色しない。
粗ペプチド１ｇをグルコース５４０ｍｇ及びピリジン／
氷酢５０ｍｌを添加し、５日間室温で撹拌した。次いで
室温で真空中濃縮し、引き続き残分を３回水５０ｍｌで
取り込み、再び蒸発乾固する。残分を水５０ｍｌ中に取
り込み、デュウエックス（Ｄｏｗｅｘ）５０ＷＸ８（Ｈ
+−型、５０×３．５ｃｍ）を有するカラム上にのせ、
全グルコースが溶離されるまで水で洗浄した。その後、
生成物を１Ｎアンモニアで溶離し、凍結乾燥した（８１
０ｍｇが得られる）。凍結乾燥物を０．１Ｍトリエチル
アンモニウムアセテート緩衝液、ｐＨ８．５中に取り込
み、アフィゲル（Ａｆｆｉｇｅｌ）６０１（Ｂｉｏｒａ
ｄ、５×２６ｃｍ）を有するカラム上で０．１Ｍトリエ
チルアンモニウムアセテート緩衝液、ｐＨ８．５２ｌ
で、及びその後水２ｌで洗浄する。次いで、該生成物を
０．１％蟻酸で溶離し、凍結乾燥する。このように得ら
れた凍結乾燥物をポリゴシル（Ｐｏｌｙｇｏｓｉｌ）Ｃ
１８、５μ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ ａｎｄ Ｎａｇｅｌ）
でクロマトグラフィーを行なう（水中の０．１％ＴＦＡ
〜６５％イソプロパノール水溶液中の０．１％ＴＦＡの
傾斜溶液）。フルクトース・Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−
Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）ＯＨ ２８３ｍｇが得られ
る。ＤＣ（シリカゲル、溶離剤、同上）；Ｒｆ＝０．５
８。ニンヒドリンでの着色：茶褐色。レゾルシン硫酸で
の着色：赤褐色。 Ｆａｂ−ＭＳ（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｉ
ｍｅｎｔ ＭＳ）（ポジティブ）：ＭＨ+＝８２２。 システイン保護基の脱離のためには、前記の得られたペ
プチドを０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．５、１
３０ｍｌ中に溶かし、多数回脱ガスし、再び窒素を吹き
つける。次いで、この溶液にジチオトライトール（Ｄｉ
ｔｈｉｏｔｒｅｉｔｏｌ）７７８ｍｇを加え、窒素雰囲
気下に２４時間放置する。引き続き、ＨＣｌでｐＨ５に
し、ポリゴシルＣ１８でクロマトグラフィーにより精製
した（前記のような傾斜溶液）。フルクトース−Ｖａｌ
−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ ＯＨ１７８ｍｇが
得られる、ＦａｂＭＳ：ポジティブ：ＭＨ+＝７３４。 例 ２ 例１に記載した合成工程により、ペプチドであるフルク
トース−ＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＬｙｓＯＨが合成さ
れた。出発樹脂としては０．４８ｍ ｍｏｌ／ｇで負荷
されたＦｍｏｃ Ｌｙｓ（Ｚ）ｐ−アルコキシベンジル
アルコール樹脂１０ｍｇを使用した。合成サイクル中で
次のＦｍｏｃ−アミノ酸を順次使用する： １． Ｆｍｏｃ Ｔｈｒ（ｔＢｕ） ５ｇ ２． Ｆｍｏｃ Ｌｅｕ ５．１ｇ ３． Ｆｍｏｃ Ｈｉｓ（Ｔｒｔ） ８．９ｇ ４． Ｆｍｏｃ Ｖａｌ ４．９ｇ 樹脂の脱離後の粗収量：３．２ｇ ＤＣ：（シリカゲルＨＰＴＬＣ、溶離剤例１．３参
照）：Ｒｆ＝０．５８ 粗ペプチドを室温でグルコース１．６ｇと共にピリジン
／氷酢１：１ １５０ｍｌ中で撹拌した。反応溶液を蒸
発し、例１．３に記載したように、デュウエックス５０
ＷＸ８Ｈ+及びアフィゲル６０１で精製した。フルクト
ース−ＶａｌＨｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ（Ｚ）Ｏ
Ｈ １．７ｇが得られた。 ＤＣ：（シリカゲル ＨＰＴＬＣ、溶離剤例１参照）：
Ｒｆ＝０．５８、硫酸スプレー試薬での着色：赤褐色、1 Ｈ−ＮＭＲ（３００Ｍｈｚ，Ｄ2Ｏ）：δ＝０．８５
（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，３Ｈ）；０．８９（ｄ，Ｊ＝
４．９Ｈｚ，３Ｈ）；０．９６（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，
３Ｈ）；１．０４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；１．
２０（ｄ，Ｊ＝１．２０Ｈｚ，３Ｈ）；１．３〜１．９
（ｍ，９Ｈ）；２．３（ｍ，２Ｈ）；３．０〜３．３
（ｍ，６Ｈ）；３．６３〜４．１（ｍ，５Ｈ）；４．１
〜４．２９（ｍ，４Ｈ）；４．３２（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈ
ｚ，１Ｈ）；４．４５（ｍ，１Ｈ）；４．４８（ｍ，２
Ｈ）；５．０９（ｓ，２Ｈ）；７．３２（ｓ，１Ｈ）；
７．４（“ｓ”，５Ｈ）；８．６３ｐｐｍ（ｓ，１
Ｈ）。 前記の得られた生成物４００ｍｇをメタノール／水
５：１ ５０ｍｌ中パラジウム／活性炭で水素添加し
た。触媒を濾過し、濃縮し、ポリゴシルＣ１８でクロマ
トグラフィーを行なう。 収量：３００ｍｇ ＤＣ（シリカゲル ＨＰＴＬＣ、溶離剤例１参照）：Ｒ
ｆ＝０．０９硫酸スプレー試薬での着色：赤褐色。 例 ３ 例２からのフルクトースＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＬｙ
ｓＯＨ １０ｍｇを０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ
７、１ｍｌ中に取り込んだ。エタノール２ｍｌ中のマレ
イミドヘキサン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエス
テル６．２ｍｇを添加した。反応溶液を室温で１４時間
撹拌し、ポリゴシルＣ１８で精製した。純粋なフラクシ
ョンの凍結乾燥の後、フルクトースＶａｌＨｉｓＬｅｕ
ＴｈｒＬｙｓ（マレイミドヘキサノイル）ＯＨ４．３ｍ
ｇが得られた。 ＦＡＢ−ＭＳ、ポジティブ；ＭＨ+：９５２1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ（Ｄ6）／ＣＤ3
ＯＤ）：＝０．８３〜１．０６（ｍ，１２Ｈ；Ｌｅｕ−
ＣＨ3，Ｖａｌ−ＣＨ3）；１．０４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈ
ｚ，３Ｈ；Ｔｈｒ−ＣＨ3）；２．０１（ｔ，Ｊ＝６．
５Ｈｚ，２Ｈ；ＭＨ−ＣＯ−ＣＨ2）及び６．９２ｐｐ
ｍ（ｓ，２Ｈ；ＭＨ−ＣＨ＝ＣＨ）。 例 ４ 麻の種子からのエデスチン（Ｒｏｔｈ）５ｇを０．１Ｍ
燐酸カリウムｐＨ７．０ ５００ｍｌ中で撹拌し、エタ
ノール１００ｍｌ中のマレイミドヘキサン酸−Ｎ−ヒド
ロキシサクシンイミドエステル５００ｍｇの溶液と混合
する。該溶液を室温で９０分間撹拌し、固体を吸引濾過
し、水各１００ｍｌで２回、エタノール各１００ｍｌで
４回及びもう１度水各１００ｍｌで２回洗浄する。固体
を水１５０ｍｌ中に懸濁させ、凍結乾燥する。 収量：４．３４ｇ エデスチン１モルあたりのマレインイミド基：１７個。
マレインイミド基の数は次のように決定する： 溶液Ａ：水中１ｍＭシステイン、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ 溶液Ｂ：０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０中の
１０ｍＭ５，５′−ジチオビス（２−ニトロベンゾエー
ト）（Ｅｌｌｍａｎｎ′ｓ試薬） 溶液Ｃ：１Ｍトリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．２ マレイミドヘキサノイル−エデスチン８ｍｇを０．０５
Ｍカリウム燐酸緩衝液３９ｍｌ中に取り込み、超音波浴
中で１５分間処理する。その後、溶液Ａ１ｍｌを添加
し、２５℃で１０分間恒温保持する。溶液Ｃ３．２ｍｌ
と共に２５℃で２分間撹拌し、次いで溶液Ｂ２００μｌ
を加え、３７℃で１０分間恒温保持する。試料を２５℃
で１５分間遠心分離する。上澄に関して４０５ｎｍにお
ける吸光度を測定する。盲検値はマレイミドヘキサノイ
ル−エデスチン−試料の添加なしに同様な方法を実施す
ることにより得られる。ｎ ｍｏｌにおけるマレイミド
基の数は ΔＥ［ｍＥ］・４３．４／１３．３であり、
この際ΔＥは盲検値と試料値との間の吸光度差である。
エデスチンの量（ｍｏｌ）は正確な秤量と、３１０００
０のエデスチンの比モル−質量で得られる：試料ｍｇ／
０．３１＝ｎ ｍｏｌエデスチン このようにして得られたマレイミドヘキサノイル−エデ
スチン２５０ｍｇをアルゴン雰囲気下に０．１Ｍ燐酸カ
リウム緩衝液、ｐＨ６．５ ２０ｍｌと混合した。例１
により得られたフルクトースＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒ
ＣｙｓＯＨ３４ｍｇを酸素遮断下に添加し、室温で２９
時間撹拌した。該溶液を遠心分離し、沈殿を水で３回洗
浄し、そのつど遠心分離を繰り返す。固体残分を水１０
ｍｌ中に懸濁させ、凍結乾燥した。フルクトースＶａｌ
ＨｉｓＬｅｕＴｈｒＣｙｓＯＨ及びマレイミドヘキサノ
イル−エデスチンからの複合体１７５ｍｇが得られ、こ
れを免疫原１とする。前記のように、なお遊離のマレイ
ミド基を測定した。最初の負荷に対する差から、該免疫
原がエデスチン１モルあたりペプチド１４．６モルを含
有していることが明らかになる。 例 ５ β−ガラクトシダーゼ（ＥＩＡ−品質、ベーリンガー・
マンハイム社）４８ｍｇをアルゴン雰囲気下にアルゴン
を通気した０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０に
溶かした。酸素遮断下に、例３により得られたフルクト
ースＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＬｙｓ（ＭＨ）ＯＨ ５
ｍｇをこれに添加し、室温で１時間撹拌した。ＡｃＡ２
０２−カラム（２×２４ｃｍ）をアルゴン飽和０．９％
ＮａＣｌで平衡にした。全反応溶液をカラム上に担持し
た。アルゴン飽和０．９％ＮａＣｌで溶離し、蛋白質フ
ラクションを集めた。免疫原溶液、ｃ＝３．１ｍｇ／ｍ
ｌ、１５ｍｌが得られる。免疫原での負荷は試料とエル
マン（Ｅｌｌｍａｎ）の試薬との反応により測定するこ
とができる：ＳＨ−基１モルあたりカルボキシニトロチ
オピリドン１モルが遊離される（λmax＝４１２ｎｍ、
ε＝１３６００、ｐＨ８．０において）。β−ガラクト
シダーゼ、ＥＩＡ−品質は分子あたりＳＨ−基１４個を
有する。ペプチドとの反応の後、遊離ＳＨ基２個が見い
出された、すなわち負荷はβ−ガラクトシダーゼ１モル
あたりペプチド１２モルである。フルクトースＶａｌＨ
ｉｓＬｅｕＴｈｒＬｙｓ（ＭＨ）ＯＨとβ−ガラクトシ
ダーゼとから得られた複合体を免疫原２とする。 例 ６ 比較のためにより長いペプチド鎖を有する免疫原を製造
した。このためには、まず例１に記載された合成法によ
りペプチドであるＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌ
ｕＧｌｕＣｙｓＯＨを合成した。例１の合成法により、
ペプチドＨＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌ
ｕＣｙｓ（ＳｔＢｕ）ＯＨを製造する。出発樹脂として
は０．５ミリモル／ｇの負荷を有するＦｍｏｃ Ｃｙｓ
（ＳｔＢｕ）ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂１
０ｇを使用する。合成サイクルにおいては次のアミノ酸
を使用する。 １． Ｆｍｏｃ Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ） ６．４ｇ ２． Ｆｍｏｃ Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ） ６．４ｇ ３． Ｆｍｏｃ Ｐｒｏ ５．１ｇ ４． Ｆｍｏｃ Ｔｈｒ（ｔＢｕ） ６ｇ ５． Ｆｍｏｃ Ｌｅｕ ５．３ｇ ６． Ｆｍｏｃ Ｈｉｓ（Ｔｒｔ） ９．３ｇ ７． Ｆｍｏｃ Ｖａｌ ５．１ｇ；この結合を１回
繰り返す。 樹脂の脱離後の粗収量：４．２ｇ、粗成物を例１に記載
したようにポリゴシルＣ１８でクロマトグラフィーを行
なった。収量はＨＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌ
ｕＧｌｕＣｙｓ（ＳｔＢｕ）ＯＨ ８８０ｍｇであっ
た。ＤＣ（シリカゲル、例１におけると同じ溶離剤）：
Ｒｆ＝０．５３。次いで、このペプチド８００ｍｇを例
１に記載されているようにグルコースと反応させ、デュ
ウエックス５０ＷＸ８Ｈ+−型、その後アフイゲル６０
１で精製した。ポリゴシルＣ１８でクロマトグラフィー
を行なった後、生成物１５０ｍｇが得られた。Ｆａｂ
ＭＳ、ポジティブ：ＭＨ+＝１１７７。次いで例１と同
様にしてシステイン保護基をジチオトライトールの添加
により切断した。フルクトースＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈ
ｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓＯＨ ７８ｍｇが得られ
た。Ｆａｂ ＭＳポジティブ：ＭＨ+＝１０８７。この
ように得られたペプチドをマレイドヘキサノイルエデス
チン３２２ｍｇと、例４に記載したように反応させる。
免疫原２００ｍｇが得られ、これを比較免疫原Ｖ１とし
て使用した。 例 ７ もう１つの比較免疫原としてはフルクトースＶａｌＨｉ
ｓＬｅｕＴｈｒＣｙｓとピリジルジチオプロピオニルエ
デスチンとから複合体を製造した。ペプチドを例２に記
載したように製造した。ピリジルジチオプロピオニルエ
デスチンの製造のためには大麻の種子からのエデスチン
１ｇを０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５、１５
０ｍｌ中に取り込む。この溶液に、エタノール１２．５
ｍｌ中に溶かしたサクシンイミジル−３（２−ピリジル
ジチオ）−プロピオネート１０ｍｇを撹拌下に添加し
た。２時間撹拌し、次いで固体を吸引濾過し、それぞれ
３回水１００ｍｌ、エタノール１００ｍｌ及びもう１回
水１００ｍｌで洗浄した。固体を水１００ｍｌ中に取り
込み、凍結乾燥した。このようにして得られたピリジル
ジチオプロピオニルエデスチン３５２ｍｇにアルゴン雰
囲気下に０．０５Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、
１００ｍｌを混合する。同様に、酸素遮断下にペプチド
であるフルクトースＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＣｙｓ４
９．５ｍｇを添加し、室温で２３時間撹拌する。引き続
き、遠心分離し、沈殿を３回各５０ｍｌの水で、２回各
５０ｍｌのエタノールで、更に１回水で洗浄し、そのつ
ど遠心分離を繰り返す。固体の残分を水５０ｍｌ中に取
り込み、凍結乾燥させる。負荷の測定のためには、第１
の遠心分離の上澄液中で遊離したチオピリドンを測定し
た。フルクトースＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＣｙｓとピ
リジルジチオプロピオニルエデスチンから、比較免疫原
Ｖ２と呼ばれる複合体３００ｍｇが得られた。負荷はエ
デスチン１モルあたりペプチド３９モルであった。 例 ８ 抗−ＨｂＡ1c−抗体に関するスクリーニングテストの実
施のためにポリハプテンを製造する。ポリハプテン１を
ＨＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓ
ＯＨとピリジルジチオプロピオニル−牛血清アルブミン
とから製造する。 牛血清アルブミン１ｇを０．１Ｍ燐
酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５、３０ｍｌ中に溶かし
た。この溶液にエタノール１５ｍｌ中に溶かしたサクシ
ンイミジルピリジルジチオプロピオネート２２６ｍｇを
加えた。室温で４０分間撹拌し、全反応溶液をＡＣＡ２
０２（３１×３ｃｍ）を介してクロマトグラフィーにか
けた；溶離剤、０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．
０。蛋白質溶液、ｃ＝６．６ｍｇ／ｍｌ、１５２ｍｌが
得られた。該溶液をジチオトライトール２８０．５ｍｇ
と混合し、０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で
１０ｍｌとした。ファクター約６に希釈した。遊離する
チオピリドンの濃度は使用したジチオピリジル基の濃度
に相応した。３４０ｎｍにおけるチオピリドンに関する
吸光係数８０８０及びエデスチンの比分子量３１０００
０から負荷を決定することができる。負荷は蛋白質１モ
ルあたり３６モルである。ピリジルジチオプロピオニル
牛血清アルブミン及び例６により得られたＨＶａｌＨｉ
ｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓＯＨ ４７ｍ
ｇから得られた溶液１０．５ｍｌをアルゴン雰囲気下
（酸素遮断下）に１日撹拌した。負荷は遊離チオピリド
ンの測定によりペプチド３３モル／１モル蛋白質で計算
された。残りの反応性基をシステイン１．７ｍｇの添加
により飽和する。全反応溶液をＡＣＡ２０２−カラム
（３１×３ｃｍ）を介してクロマトグラフィーにかけ、
蛋白質フラクションを１夜かけてＨ2Ｏに対して透析
し、凍結乾燥する。得られた生成物をポリハプテン１と
する。 収量：８５ｍｇ 例 ９ ポリハプテン２の製造のために（例８参照）、例６に記
載されているようにして得られたピリジルジチオプロピ
オニル牛血清アルブミン溶液７ｍｌを使用した。ペプチ
ド成分としては、アミノ酸Ｖａｌにフルクトースを担持
する、例６により製造されたペプチド７．８ｍｇを使用
する。このためには例６により得られたペプチドＨＶａ
ｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓＯＨ
８００ｍｇを例１に記載されたようにグルコースと反応
させ、デュウエックス５０ＷＸＨ−型、その後アフィゲ
ル６００で精製する。ポリゴシルＣ１８でクロマトグラ
フィーを行なった後、グリコシル化ペプチド１５０ｍｇ
が得られた。Ｆａｂ ＭＳポジティブ、ＭＨ+＝１１７
７。システイン保護基をジチオトライトールで脱離した
後、グリコシル化ペプチド１００ｍｇから所望の生成物
７８ｍｇが得られた。Ｆａｂ ＭＳポジティブＭＨ+＝
１０８９。このように得られた生成物をポリハプテン２
とする。 例１０ 免疫化されたマウス又はハイブリッド細胞の培養上澄液
又は腹水中のＨｂＡ1cに対する抗体の存在及び特異性を
知るために、エリザ（Ｅｌｉｓａ）法をテスト原理とし
て使用した：微量滴定プレートをポリハプテン２ １０
μｇ又はポリハプテン１ １０μｇ／ｍｌ積層緩衝液
（０．２Ｍ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム、ｐＨ
９．３〜９．５）で、室温で１時間振盪下に積層した。
次いで、０．９％塩化ナトリウム溶液及び１％アルブミ
ン溶液で後処理した。引き続き、０．９％塩化ナトリウ
ム溶液で洗浄した。その後室温で、約１時間試料１００
μｌで恒温保持し、新たに０．９％塩化ナトリウム溶液
で洗浄した。引き続き、羊−Ｆａｂ−抗マウスＦｃγ−
ペルオキシダーゼ複合体２００Ｕ／ｍｌと共に１時間恒
温保持した。０．９％塩化ナトリウム溶液を用いる新た
な洗浄工程の後、ペルオキシダーゼ活性を室温で１５分
間ＡＢＴＳと反応させることにより常法で測定する。そ
の後、吸光度差、４０５ｎｍにおける差ｍＥ、を測定す
る。本発明により、例４により得られた免疫原１での免
疫化により得られた抗血清は、免疫化マウス１００匹全
部においてポリハプテン２との結合を示し、かつポリハ
プテン１との結合を示さないか、もしくは非常に僅かに
のみ示すにすぎない。すなわち、ポリハプテン２と結合
性の抗体が選択的に得られた。本発明により、例６によ
り製造された免疫原２により得られた抗血清において、
免疫化マウスから得られた血清１８個のうちの６個がポ
リハプテン２と反応し、ポリハプテン１とは反応しなか
った。この際ポリハプテン２への結合は免疫原１におい
てと同様に良好であった。ここでも選択的な抗体が得ら
れた。比較のために実施した、比較免疫原Ｖ１での免疫
化においては１００匹のマウスから、ポリハプテン２と
優先的に反応する抗血清１つが得られ、この際他の９９
すべての抗血清は両方のポリハプテンと同じように良好
に反応する。ここでは、ポリハプテン２と選択的に結合
性の抗体を得ることができなかった。比較免疫原Ｖ２で
の免疫化においては全く差異をつけるマウス抗血清を得
ることはできなかった。マウス１００匹から得られたす
べての抗血清は両方のポリハプテンと同じように良好に
反応する。この際、ポリハプテンへの結合は、本発明に
よる免疫原１及び２で得られた血清においてよりファク
ター１０だけ弱い。 例１１ 生後８〜１２週のＢａｌｂ／ｃ−及びＢ１０．Ｄ２−マ
ウスを完全フロインドのアジュバンス（ＣＦＡ）中のＨ
ｂＡ1c（β１〜４Ｃｙｓ、ＭＨＳ）−エデスチン（免疫
原１）１００μｇで腹膜内（ｉ．ｐ）に第１回免疫化を
行なった。６週間及び１０週間後に、更に２回の免疫化
を実施した。この際、不完全フロイントのアジュバンス
（ＩＦＡ）中の免疫原１００μｇを投与した。最後の免
疫化の１０日後に、血清から抗体滴定量を測定するため
に血液を採取した。融合前４日及び３日目にマウスをも
う１度緩衝液中の免疫原１００μｇで静脈内免疫化を行
なった。融合のためにはギャルフレ（Ｇａｌｆｒ′ｅ；
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第７３
巻、１９８１年、第３頁）による方法と同様にして、免
疫化マウスの脾臓細胞１０8と骨髄腫細胞２×１０7（Ｐ
３×６３Ａｇ８−６５３、ＡＴＣＣ−ＣＲＬ８３７５）
とを１回で混合し、引き続き１０分間遠心分離を行なう
（３００ｇ、４℃）。細胞をもう１回ＢＳＳ（平衡塩類
溶液）で洗浄し、尖端を有する管５０ｍｌ中４００ｇで
遠心分離する。上澄を除去した。細胞沈殿物をほぐし、
６０％ＰＥＧ−溶液（分子量４０００、メルク社）１ｍ
ｌと混合した。水浴中で１分後、室温で胎児性子牛血清
（ＦＫＳ）を含有しないＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭ
＝Ｒｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋｅｒ Ｍｅｍｏｒｙ Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔ）５ｍｌを４〜５分間かけて滴加し、十
分に混合し、培地で５０ｍｌとし、かつ引き続き１０分
間４００ｇ、４℃で遠心分離した。分離した細胞を１０
％ＦＫＳを含有するＲＰＭＩ １６４０−培地に取り込
んだ。２４孔−細胞培地プレート（Ｎｕｎｃ社）上に脾
臓細胞各１０5を接種する。各培地に腹腔浸出液−細胞
５×１０4を飼料用細胞として添加した。翌日にヒポキ
サンチン−アザセリン−選択培地（１００ｍＭヒポキサ
ンチン、１μｇ／ｍｌアザセリン）を添加した。約７〜
１０日後、すでに多くのクローンが可視となった。第１
次培地の上澄を例１０に記載したエリザ法により試験し
た。ＨｂＡ0とほとんど交差反応を示さないか、又は全
く示さない第１次培地を蛍光活性化細胞種（ＦＡＣＳ）
を用いて９６孔−細胞培地プレート（Ｎｕｎｃ社）上で
更にクローン化した。飼料用細胞としては孔あたり腹腔
−浸出液細胞１×１０4を使用した。このようにして、
例えばハイブリドーマ細胞系を単離することができ、こ
れはヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セ
ル・カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅｓ）において寄託番号（１．）ＥＣＡＣＣ ８７１２
０８０１、（２．）ＥＣＡＣＣ ８８１２２３０２及び
（３．）ＥＣＡＣＣ ８８１２２３０１で寄託されてい
る。この細胞系からモノクローナル抗体（１．）３．６
０９３．２５（２．）３．５１．５６及び（３．）３．
２３０．１４０を得ることができる。腹水の生産のため
には、あらかじめプリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎ）０．５
ｍｌで１〜２回前処理した、ハイブリッド細胞５×１０
6でマウスを腹腔内注射した。その後１〜３週間で、こ
のマウスから５〜２０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ−濃度を有す
る腹水液がマウスから得られた。ここから常法で抗体を
単離することができた。このモノクローナル抗体はＨｂ
Ａ1cに対して特異的に反応し、ＨｂＡ0とは全く交差反
応を示さないか、又は僅かに示すだけである。 例１２ 材料 微量滴定プレート：Ａ：ＮＵＮＣ ４−４２４０４ＩＩ Ｂ：ＮＵＮＣ ２−６９６２０ １２管−ピペット：ダイナテク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ），カタログ番号、７７−８ ８７−００ プレート振盪機 ：フロー・ラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ）、テイターテク（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）、カタログ番号 ７７−４７１−００ カバーシート ：ダイナテク・プレート・シーラー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｐｌ ａｔｅ Ｓｅａｌｅｒｓ）、カタログ番号Ｍ３０ エリザ読み取り機：ダイナテクＭＲ７００ 積層緩衝液 ：５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６ 試料緩衝液 ：１０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ７．４，０．９％ＮａＣｌ， ０．１％ツウィーン２０、１％クロテインＣ 洗浄緩衝液 ：０．９％ＮａＣｌ、０．１％ツウィーン２０ 抗体／酵素複合体：マウス−ＩｇＧのＦｃγ−部に反応する、羊からのポリクロ ーナル抗体のＦａｂ−フラグメントとペルオキシダーゼとか らの複合体、試料緩衝液中２５ｍＵ／ｍｌ 基 質 ：１００ｍ ｍｏｌ／ｌ 燐酸塩−クエン酸塩−緩衝液pH４． ４ ３．２ｍ ｍｏｌ／ｌ 過硼素酸ナトリウム １．９ｍ ｍｏｌ／ｌ ＡＢＴＳ（２，２′−アジノ−ジ− ［３エチル−ベンズチアゾリン−スルホン酸−（６）］ ジアンモニウム塩） 抗 体 ：ＭＡＫ ３．６０９．３２５（ＥＣＡＣＣ ８７１２０８０ １） ポリハプテン ：例８によるポリハプテン１ 例９によるポリハプテン２ 抗 原 ：ＨｂＡ1c天然 ＨｂＡ0 天然 予備実験において、本来の特異性実験に使用すべき抗体
量を決めた。このためには、微量滴定プレートをポリハ
プテン１もしくはポリハプテン２で積層した。各窪み１
００μｌを積層緩衝液１ｍｌあたりポリハプテン１μｇ
を１時間室温で恒温保持する。その後、該溶液を吸引濾
過し、洗浄緩衝液で３回洗浄する。引き続き、固相に結
合したポリハプテンに抗体３．６０９．３２５（腹水）
の希釈列を添加するが、この際試料緩衝液での希釈は
１：１００から４段階で行なった。それぞれ１００μｌ
／窪で、１時間室温で恒温保持し、最後に洗浄した。ポ
リハプテンに結合した抗体はマウス−ＩｇＧのＦＣγ−
部に反応する、羊からのポリクローナル抗体のＦａｂ−
フラグメントとペルオキシダーゼとからの複合体の添加
により、ペルオキシダーゼと添加した基質との反応を介
して測定された。複合体１００μｌ／窪を添加し、室温
で１時間恒温保持した。検出反応をすべての窪中に基質
１００μｌ／窪の添加により開始した。この測定をエリ
ザ読み取り機中４０５ｎｍで行なう（参照波長４９０ｎ
ｍ）。半最大結合が行なわれる抗体希釈が滴定液として
定義された。この抗体量を次の実験に使用した。モノク
ローナル抗体の特異性を実験した。このためには、個々
の抗体の反応性を溶液中に存在する種々の成分と比較し
た。１％クロテイン（Ｃｒｏｔｅｉｎ）Ｃで予積層した
微量滴定プレート中に、滴定液の２倍濃縮液中のモノク
ローナル抗体の溶液５０μｌ及び抗原溶液（希釈列、下
を参照）５０μｌをそれぞれピペットで入れ、混合し、
室温で３０分間恒温保持した。その後、ポリハプテンで
積層した微量滴定プレート中の該混合物の分割量１００
μｌを移転する。 希釈列： フルクトースＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＣｙｓ（Ｓｔｂ
ｕ）ＯＨ（例１による） フルクトースＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧ
ｌｕＣｙｓ（ＳｔＢｕ）ＯＨ（例６による） フルクトース・バリン ［５μｇ／ｍｌ試料緩衝液から試料緩衝液を用いて４段
階で］ ＨＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓ
（ＳｔＢｕ）ＯＨ（例６による） ＨｂＡ1c ＨｂＡ0 ［１００μｇ／ｍｌ試料緩衝液から４段階で］ 測定すべき物質の半最高結合に属する濃度（ｍｏｌ／
ｌ）をモル比親和性と定義する。モノクローナル抗体と
種々の成分との反応性の比較のためには成分フルクトー
スＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓ
（Ｓｔｂｕ）ＯＨのためのモノクローナル抗体の比親和
性を１００％とする。交差反応とも呼ばれる、他の成分
との反応性は次のように比親和性の商から次のように得
られる：
説明する。 例 １ ペプチドフルクトースＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ
−Ｃｙｓ−ＯＨを合成した。固相合成をラボルテック社
（Ｆｉｒｍａ Ｌａｂｏｒｔｅｃ；Ｂｕｄｅｎｄｏｒ
ｆ、Ｓｃｈｗｅｉｚ在）の半自動ペプチド合成機（ｓｅ
ｍｉ−ａｕｔｏｍａｔｉｓｈｅｎ ｐｅｐｔｉｄｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｚｅｒ）中で実施した。Ｎα−アミノ保護基
としてはＦｍｏｃ−基（Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ−ｍｅｔｈ
ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ｇｒｕｐｐｅ）を使用した。
このペプチド合成法の記載はマイエンホーファー（Ｊ．
Ｍｅｙｅｎｈｏｆｅｒ）等著、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉ
ｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、第１３巻、第３５〜４
２頁（１９７９年）にある。マイエンホーファーにより
記載されているように、Ｃ−末端Ｆｍｏｃ−アミノ酸を
ｐ−アルキルオキシベンジルアルコール樹脂（Ｆｉｒｍ
ａ Ｂａｃｈｅｍ．Ｂｕｄｅｎｄｏｒｆ、Ｓｃｈｗｅｉ
ｚ）に結合した。 合成サイクルに関する合成方法： 工程 時 間 試 薬 ／ 溶 剤 １ ２×１分 ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド） ２ １×３分 ピペリジン／ＤＭＦ １：４ ３ １×７分 ピペリジン／ＤＭＦ １：４ ４ ４×１／２分 ＤＭＦ ５ ２×１／２分 イソプロパノール ６ 中 止 ニンヒドリンテスト ７ ２×１分 ＤＭＦ ８ 中 止 ＤＭＦ中の次のＦｍｏｃ−アミノ酸及びＨＯＢｔ （１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）の添加 ９ ２ 分 振盪 １０ 中 止 ＤＣＭ（ジクロルメタン）中のＤＣＣ（ジシクロヘ キシルカルボジイミド）の添加 １１ ９０分 結合 １２ ３×１分 ＤＭＦ １３ ２×１分 イソプロパノール １４ 中 止 ニンヒドリンテスト 工程８〜１１による結合のために、Ｆｍｏｃ−アミノ酸
及びＤＣＣは出発樹脂の負荷に対してそれぞれ３倍モル
量で使用する。ＨｏＢｔは４．５倍モル量で使用する。
最後のＮ−末端Ｆｍｏｃ−アミノ酸の結合の後、Ｆｍｏ
ｃ−保護基の脱離のために、合成サイクルの工程１〜５
を実施する。その後、この樹脂を１５倍容量のジクロル
メタン（ＤＣＭ）／トリフルオル酢酸（ＴＦＡ）１：１
中で２時間室温で振盪する。濾過し、ＤＣＭ／ＴＦＡ
４：１で更に２回この樹脂を洗浄し、すべての濾液を合
し、真空中２５℃でトルエン添加下に濃縮する。残分に
ジエチルエーテルを加える。固体を濾別し、乾燥する。
前記の概要法によりペプチドであるフルクトース−Ｖａ
ｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）ＯＨ
が合成された。出発樹脂としては０．６ｍ Ｍｏｌ／ｇ
で負荷されたＦｍｏｃ Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）ｐ−アルコ
キシベンジルアルコール樹脂１０ｇを使用した。合成サ
イクルにおいて次のＦｍｏｃ−アミノ酸を順次使用し
た： １． Ｆｍｏｃ Ｔｈｒ（ｔＢｕ） ６．２ｇ ２． Ｆｍｏｃ Ｌｅｕ ６．４ｇ ３． Ｆｍｏｃ Ｈｉｓ（Ｔｒｔ） １１ｇ ４． Ｆｍｏｃ Ｖａｌ ６．１ｇ 次の短縮形を使用した： ｔＢｕ ：トリエチルブチルエーテル Ｔｒｔ ：トリチル ＳｔＢｕ：ｔ−ブチルチオエーテル ＯｔＢｕ：ｔ−ブチルエステル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル −Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）：ｔ−ブチルスルフェニルシステ
イン 樹脂の脱離後の粗収率はＨｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｈｒ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）ＯＨ ３．２９ｇである。Ｄ
Ｃ：（シリカゲルＨＰＴＬＣ Ｍｅｒｃｋ、溶離剤：エ
タノール／氷酢／水 ６：２：２）Ｒｆ＝０．６２。ニ
ンヒドリンスプレー０．１％（Ｍｅｒｃｋ）での噴霧及
び１２０℃で５分間での顕色により赤紫色となる。０．
４％レゾルシンメタノール溶液２００ｍｌ及び５Ｎ硫酸
４０ｍｌからなる混合物（レゾルシン硫酸）での噴霧及
び５〜１０分間の１２０℃での顕色により発色しない。
粗ペプチド１ｇをグルコース５４０ｍｇ及びピリジン／
氷酢５０ｍｌを添加し、５日間室温で撹拌した。次いで
室温で真空中濃縮し、引き続き残分を３回水５０ｍｌで
取り込み、再び蒸発乾固する。残分を水５０ｍｌ中に取
り込み、デュウエックス（Ｄｏｗｅｘ）５０ＷＸ８（Ｈ
+−型、５０×３．５ｃｍ）を有するカラム上にのせ、
全グルコースが溶離されるまで水で洗浄した。その後、
生成物を１Ｎアンモニアで溶離し、凍結乾燥した（８１
０ｍｇが得られる）。凍結乾燥物を０．１Ｍトリエチル
アンモニウムアセテート緩衝液、ｐＨ８．５中に取り込
み、アフィゲル（Ａｆｆｉｇｅｌ）６０１（Ｂｉｏｒａ
ｄ、５×２６ｃｍ）を有するカラム上で０．１Ｍトリエ
チルアンモニウムアセテート緩衝液、ｐＨ８．５２ｌ
で、及びその後水２ｌで洗浄する。次いで、該生成物を
０．１％蟻酸で溶離し、凍結乾燥する。このように得ら
れた凍結乾燥物をポリゴシル（Ｐｏｌｙｇｏｓｉｌ）Ｃ
１８、５μ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ ａｎｄ Ｎａｇｅｌ）
でクロマトグラフィーを行なう（水中の０．１％ＴＦＡ
〜６５％イソプロパノール水溶液中の０．１％ＴＦＡの
傾斜溶液）。フルクトース・Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−
Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）ＯＨ ２８３ｍｇが得られ
る。ＤＣ（シリカゲル、溶離剤、同上）；Ｒｆ＝０．５
８。ニンヒドリンでの着色：茶褐色。レゾルシン硫酸で
の着色：赤褐色。 Ｆａｂ−ＭＳ（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｉ
ｍｅｎｔ ＭＳ）（ポジティブ）：ＭＨ+＝８２２。 システイン保護基の脱離のためには、前記の得られたペ
プチドを０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．５、１
３０ｍｌ中に溶かし、多数回脱ガスし、再び窒素を吹き
つける。次いで、この溶液にジチオトライトール（Ｄｉ
ｔｈｉｏｔｒｅｉｔｏｌ）７７８ｍｇを加え、窒素雰囲
気下に２４時間放置する。引き続き、ＨＣｌでｐＨ５に
し、ポリゴシルＣ１８でクロマトグラフィーにより精製
した（前記のような傾斜溶液）。フルクトース−Ｖａｌ
−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ ＯＨ１７８ｍｇが
得られる、ＦａｂＭＳ：ポジティブ：ＭＨ+＝７３４。 例 ２ 例１に記載した合成工程により、ペプチドであるフルク
トース−ＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＬｙｓＯＨが合成さ
れた。出発樹脂としては０．４８ｍ ｍｏｌ／ｇで負荷
されたＦｍｏｃ Ｌｙｓ（Ｚ）ｐ−アルコキシベンジル
アルコール樹脂１０ｍｇを使用した。合成サイクル中で
次のＦｍｏｃ−アミノ酸を順次使用する： １． Ｆｍｏｃ Ｔｈｒ（ｔＢｕ） ５ｇ ２． Ｆｍｏｃ Ｌｅｕ ５．１ｇ ３． Ｆｍｏｃ Ｈｉｓ（Ｔｒｔ） ８．９ｇ ４． Ｆｍｏｃ Ｖａｌ ４．９ｇ 樹脂の脱離後の粗収量：３．２ｇ ＤＣ：（シリカゲルＨＰＴＬＣ、溶離剤例１．３参
照）：Ｒｆ＝０．５８ 粗ペプチドを室温でグルコース１．６ｇと共にピリジン
／氷酢１：１ １５０ｍｌ中で撹拌した。反応溶液を蒸
発し、例１．３に記載したように、デュウエックス５０
ＷＸ８Ｈ+及びアフィゲル６０１で精製した。フルクト
ース−ＶａｌＨｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ（Ｚ）Ｏ
Ｈ １．７ｇが得られた。 ＤＣ：（シリカゲル ＨＰＴＬＣ、溶離剤例１参照）：
Ｒｆ＝０．５８、硫酸スプレー試薬での着色：赤褐色、1 Ｈ−ＮＭＲ（３００Ｍｈｚ，Ｄ2Ｏ）：δ＝０．８５
（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，３Ｈ）；０．８９（ｄ，Ｊ＝
４．９Ｈｚ，３Ｈ）；０．９６（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，
３Ｈ）；１．０４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；１．
２０（ｄ，Ｊ＝１．２０Ｈｚ，３Ｈ）；１．３〜１．９
（ｍ，９Ｈ）；２．３（ｍ，２Ｈ）；３．０〜３．３
（ｍ，６Ｈ）；３．６３〜４．１（ｍ，５Ｈ）；４．１
〜４．２９（ｍ，４Ｈ）；４．３２（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈ
ｚ，１Ｈ）；４．４５（ｍ，１Ｈ）；４．４８（ｍ，２
Ｈ）；５．０９（ｓ，２Ｈ）；７．３２（ｓ，１Ｈ）；
７．４（“ｓ”，５Ｈ）；８．６３ｐｐｍ（ｓ，１
Ｈ）。 前記の得られた生成物４００ｍｇをメタノール／水
５：１ ５０ｍｌ中パラジウム／活性炭で水素添加し
た。触媒を濾過し、濃縮し、ポリゴシルＣ１８でクロマ
トグラフィーを行なう。 収量：３００ｍｇ ＤＣ（シリカゲル ＨＰＴＬＣ、溶離剤例１参照）：Ｒ
ｆ＝０．０９硫酸スプレー試薬での着色：赤褐色。 例 ３ 例２からのフルクトースＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＬｙ
ｓＯＨ １０ｍｇを０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ
７、１ｍｌ中に取り込んだ。エタノール２ｍｌ中のマレ
イミドヘキサン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエス
テル６．２ｍｇを添加した。反応溶液を室温で１４時間
撹拌し、ポリゴシルＣ１８で精製した。純粋なフラクシ
ョンの凍結乾燥の後、フルクトースＶａｌＨｉｓＬｅｕ
ＴｈｒＬｙｓ（マレイミドヘキサノイル）ＯＨ４．３ｍ
ｇが得られた。 ＦＡＢ−ＭＳ、ポジティブ；ＭＨ+：９５２1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ（Ｄ6）／ＣＤ3
ＯＤ）：＝０．８３〜１．０６（ｍ，１２Ｈ；Ｌｅｕ−
ＣＨ3，Ｖａｌ−ＣＨ3）；１．０４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈ
ｚ，３Ｈ；Ｔｈｒ−ＣＨ3）；２．０１（ｔ，Ｊ＝６．
５Ｈｚ，２Ｈ；ＭＨ−ＣＯ−ＣＨ2）及び６．９２ｐｐ
ｍ（ｓ，２Ｈ；ＭＨ−ＣＨ＝ＣＨ）。 例 ４ 麻の種子からのエデスチン（Ｒｏｔｈ）５ｇを０．１Ｍ
燐酸カリウムｐＨ７．０ ５００ｍｌ中で撹拌し、エタ
ノール１００ｍｌ中のマレイミドヘキサン酸−Ｎ−ヒド
ロキシサクシンイミドエステル５００ｍｇの溶液と混合
する。該溶液を室温で９０分間撹拌し、固体を吸引濾過
し、水各１００ｍｌで２回、エタノール各１００ｍｌで
４回及びもう１度水各１００ｍｌで２回洗浄する。固体
を水１５０ｍｌ中に懸濁させ、凍結乾燥する。 収量：４．３４ｇ エデスチン１モルあたりのマレインイミド基：１７個。
マレインイミド基の数は次のように決定する： 溶液Ａ：水中１ｍＭシステイン、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ 溶液Ｂ：０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０中の
１０ｍＭ５，５′−ジチオビス（２−ニトロベンゾエー
ト）（Ｅｌｌｍａｎｎ′ｓ試薬） 溶液Ｃ：１Ｍトリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．２ マレイミドヘキサノイル−エデスチン８ｍｇを０．０５
Ｍカリウム燐酸緩衝液３９ｍｌ中に取り込み、超音波浴
中で１５分間処理する。その後、溶液Ａ１ｍｌを添加
し、２５℃で１０分間恒温保持する。溶液Ｃ３．２ｍｌ
と共に２５℃で２分間撹拌し、次いで溶液Ｂ２００μｌ
を加え、３７℃で１０分間恒温保持する。試料を２５℃
で１５分間遠心分離する。上澄に関して４０５ｎｍにお
ける吸光度を測定する。盲検値はマレイミドヘキサノイ
ル−エデスチン−試料の添加なしに同様な方法を実施す
ることにより得られる。ｎ ｍｏｌにおけるマレイミド
基の数は ΔＥ［ｍＥ］・４３．４／１３．３であり、
この際ΔＥは盲検値と試料値との間の吸光度差である。
エデスチンの量（ｍｏｌ）は正確な秤量と、３１０００
０のエデスチンの比モル−質量で得られる：試料ｍｇ／
０．３１＝ｎ ｍｏｌエデスチン このようにして得られたマレイミドヘキサノイル−エデ
スチン２５０ｍｇをアルゴン雰囲気下に０．１Ｍ燐酸カ
リウム緩衝液、ｐＨ６．５ ２０ｍｌと混合した。例１
により得られたフルクトースＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒ
ＣｙｓＯＨ３４ｍｇを酸素遮断下に添加し、室温で２９
時間撹拌した。該溶液を遠心分離し、沈殿を水で３回洗
浄し、そのつど遠心分離を繰り返す。固体残分を水１０
ｍｌ中に懸濁させ、凍結乾燥した。フルクトースＶａｌ
ＨｉｓＬｅｕＴｈｒＣｙｓＯＨ及びマレイミドヘキサノ
イル−エデスチンからの複合体１７５ｍｇが得られ、こ
れを免疫原１とする。前記のように、なお遊離のマレイ
ミド基を測定した。最初の負荷に対する差から、該免疫
原がエデスチン１モルあたりペプチド１４．６モルを含
有していることが明らかになる。 例 ５ β−ガラクトシダーゼ（ＥＩＡ−品質、ベーリンガー・
マンハイム社）４８ｍｇをアルゴン雰囲気下にアルゴン
を通気した０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０に
溶かした。酸素遮断下に、例３により得られたフルクト
ースＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＬｙｓ（ＭＨ）ＯＨ ５
ｍｇをこれに添加し、室温で１時間撹拌した。ＡｃＡ２
０２−カラム（２×２４ｃｍ）をアルゴン飽和０．９％
ＮａＣｌで平衡にした。全反応溶液をカラム上に担持し
た。アルゴン飽和０．９％ＮａＣｌで溶離し、蛋白質フ
ラクションを集めた。免疫原溶液、ｃ＝３．１ｍｇ／ｍ
ｌ、１５ｍｌが得られる。免疫原での負荷は試料とエル
マン（Ｅｌｌｍａｎ）の試薬との反応により測定するこ
とができる：ＳＨ−基１モルあたりカルボキシニトロチ
オピリドン１モルが遊離される（λmax＝４１２ｎｍ、
ε＝１３６００、ｐＨ８．０において）。β−ガラクト
シダーゼ、ＥＩＡ−品質は分子あたりＳＨ−基１４個を
有する。ペプチドとの反応の後、遊離ＳＨ基２個が見い
出された、すなわち負荷はβ−ガラクトシダーゼ１モル
あたりペプチド１２モルである。フルクトースＶａｌＨ
ｉｓＬｅｕＴｈｒＬｙｓ（ＭＨ）ＯＨとβ−ガラクトシ
ダーゼとから得られた複合体を免疫原２とする。 例 ６ 比較のためにより長いペプチド鎖を有する免疫原を製造
した。このためには、まず例１に記載された合成法によ
りペプチドであるＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌ
ｕＧｌｕＣｙｓＯＨを合成した。例１の合成法により、
ペプチドＨＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌ
ｕＣｙｓ（ＳｔＢｕ）ＯＨを製造する。出発樹脂として
は０．５ミリモル／ｇの負荷を有するＦｍｏｃ Ｃｙｓ
（ＳｔＢｕ）ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂１
０ｇを使用する。合成サイクルにおいては次のアミノ酸
を使用する。 １． Ｆｍｏｃ Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ） ６．４ｇ ２． Ｆｍｏｃ Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ） ６．４ｇ ３． Ｆｍｏｃ Ｐｒｏ ５．１ｇ ４． Ｆｍｏｃ Ｔｈｒ（ｔＢｕ） ６ｇ ５． Ｆｍｏｃ Ｌｅｕ ５．３ｇ ６． Ｆｍｏｃ Ｈｉｓ（Ｔｒｔ） ９．３ｇ ７． Ｆｍｏｃ Ｖａｌ ５．１ｇ；この結合を１回
繰り返す。 樹脂の脱離後の粗収量：４．２ｇ、粗成物を例１に記載
したようにポリゴシルＣ１８でクロマトグラフィーを行
なった。収量はＨＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌ
ｕＧｌｕＣｙｓ（ＳｔＢｕ）ＯＨ ８８０ｍｇであっ
た。ＤＣ（シリカゲル、例１におけると同じ溶離剤）：
Ｒｆ＝０．５３。次いで、このペプチド８００ｍｇを例
１に記載されているようにグルコースと反応させ、デュ
ウエックス５０ＷＸ８Ｈ+−型、その後アフイゲル６０
１で精製した。ポリゴシルＣ１８でクロマトグラフィー
を行なった後、生成物１５０ｍｇが得られた。Ｆａｂ
ＭＳ、ポジティブ：ＭＨ+＝１１７７。次いで例１と同
様にしてシステイン保護基をジチオトライトールの添加
により切断した。フルクトースＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈ
ｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓＯＨ ７８ｍｇが得られ
た。Ｆａｂ ＭＳポジティブ：ＭＨ+＝１０８７。この
ように得られたペプチドをマレイドヘキサノイルエデス
チン３２２ｍｇと、例４に記載したように反応させる。
免疫原２００ｍｇが得られ、これを比較免疫原Ｖ１とし
て使用した。 例 ７ もう１つの比較免疫原としてはフルクトースＶａｌＨｉ
ｓＬｅｕＴｈｒＣｙｓとピリジルジチオプロピオニルエ
デスチンとから複合体を製造した。ペプチドを例２に記
載したように製造した。ピリジルジチオプロピオニルエ
デスチンの製造のためには大麻の種子からのエデスチン
１ｇを０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５、１５
０ｍｌ中に取り込む。この溶液に、エタノール１２．５
ｍｌ中に溶かしたサクシンイミジル−３（２−ピリジル
ジチオ）−プロピオネート１０ｍｇを撹拌下に添加し
た。２時間撹拌し、次いで固体を吸引濾過し、それぞれ
３回水１００ｍｌ、エタノール１００ｍｌ及びもう１回
水１００ｍｌで洗浄した。固体を水１００ｍｌ中に取り
込み、凍結乾燥した。このようにして得られたピリジル
ジチオプロピオニルエデスチン３５２ｍｇにアルゴン雰
囲気下に０．０５Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、
１００ｍｌを混合する。同様に、酸素遮断下にペプチド
であるフルクトースＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＣｙｓ４
９．５ｍｇを添加し、室温で２３時間撹拌する。引き続
き、遠心分離し、沈殿を３回各５０ｍｌの水で、２回各
５０ｍｌのエタノールで、更に１回水で洗浄し、そのつ
ど遠心分離を繰り返す。固体の残分を水５０ｍｌ中に取
り込み、凍結乾燥させる。負荷の測定のためには、第１
の遠心分離の上澄液中で遊離したチオピリドンを測定し
た。フルクトースＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＣｙｓとピ
リジルジチオプロピオニルエデスチンから、比較免疫原
Ｖ２と呼ばれる複合体３００ｍｇが得られた。負荷はエ
デスチン１モルあたりペプチド３９モルであった。 例 ８ 抗−ＨｂＡ1c−抗体に関するスクリーニングテストの実
施のためにポリハプテンを製造する。ポリハプテン１を
ＨＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓ
ＯＨとピリジルジチオプロピオニル−牛血清アルブミン
とから製造する。 牛血清アルブミン１ｇを０．１Ｍ燐
酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５、３０ｍｌ中に溶かし
た。この溶液にエタノール１５ｍｌ中に溶かしたサクシ
ンイミジルピリジルジチオプロピオネート２２６ｍｇを
加えた。室温で４０分間撹拌し、全反応溶液をＡＣＡ２
０２（３１×３ｃｍ）を介してクロマトグラフィーにか
けた；溶離剤、０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．
０。蛋白質溶液、ｃ＝６．６ｍｇ／ｍｌ、１５２ｍｌが
得られた。該溶液をジチオトライトール２８０．５ｍｇ
と混合し、０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で
１０ｍｌとした。ファクター約６に希釈した。遊離する
チオピリドンの濃度は使用したジチオピリジル基の濃度
に相応した。３４０ｎｍにおけるチオピリドンに関する
吸光係数８０８０及びエデスチンの比分子量３１０００
０から負荷を決定することができる。負荷は蛋白質１モ
ルあたり３６モルである。ピリジルジチオプロピオニル
牛血清アルブミン及び例６により得られたＨＶａｌＨｉ
ｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓＯＨ ４７ｍ
ｇから得られた溶液１０．５ｍｌをアルゴン雰囲気下
（酸素遮断下）に１日撹拌した。負荷は遊離チオピリド
ンの測定によりペプチド３３モル／１モル蛋白質で計算
された。残りの反応性基をシステイン１．７ｍｇの添加
により飽和する。全反応溶液をＡＣＡ２０２−カラム
（３１×３ｃｍ）を介してクロマトグラフィーにかけ、
蛋白質フラクションを１夜かけてＨ2Ｏに対して透析
し、凍結乾燥する。得られた生成物をポリハプテン１と
する。 収量：８５ｍｇ 例 ９ ポリハプテン２の製造のために（例８参照）、例６に記
載されているようにして得られたピリジルジチオプロピ
オニル牛血清アルブミン溶液７ｍｌを使用した。ペプチ
ド成分としては、アミノ酸Ｖａｌにフルクトースを担持
する、例６により製造されたペプチド７．８ｍｇを使用
する。このためには例６により得られたペプチドＨＶａ
ｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓＯＨ
８００ｍｇを例１に記載されたようにグルコースと反応
させ、デュウエックス５０ＷＸＨ−型、その後アフィゲ
ル６００で精製する。ポリゴシルＣ１８でクロマトグラ
フィーを行なった後、グリコシル化ペプチド１５０ｍｇ
が得られた。Ｆａｂ ＭＳポジティブ、ＭＨ+＝１１７
７。システイン保護基をジチオトライトールで脱離した
後、グリコシル化ペプチド１００ｍｇから所望の生成物
７８ｍｇが得られた。Ｆａｂ ＭＳポジティブＭＨ+＝
１０８９。このように得られた生成物をポリハプテン２
とする。 例１０ 免疫化されたマウス又はハイブリッド細胞の培養上澄液
又は腹水中のＨｂＡ1cに対する抗体の存在及び特異性を
知るために、エリザ（Ｅｌｉｓａ）法をテスト原理とし
て使用した：微量滴定プレートをポリハプテン２ １０
μｇ又はポリハプテン１ １０μｇ／ｍｌ積層緩衝液
（０．２Ｍ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム、ｐＨ
９．３〜９．５）で、室温で１時間振盪下に積層した。
次いで、０．９％塩化ナトリウム溶液及び１％アルブミ
ン溶液で後処理した。引き続き、０．９％塩化ナトリウ
ム溶液で洗浄した。その後室温で、約１時間試料１００
μｌで恒温保持し、新たに０．９％塩化ナトリウム溶液
で洗浄した。引き続き、羊−Ｆａｂ−抗マウスＦｃγ−
ペルオキシダーゼ複合体２００Ｕ／ｍｌと共に１時間恒
温保持した。０．９％塩化ナトリウム溶液を用いる新た
な洗浄工程の後、ペルオキシダーゼ活性を室温で１５分
間ＡＢＴＳと反応させることにより常法で測定する。そ
の後、吸光度差、４０５ｎｍにおける差ｍＥ、を測定す
る。本発明により、例４により得られた免疫原１での免
疫化により得られた抗血清は、免疫化マウス１００匹全
部においてポリハプテン２との結合を示し、かつポリハ
プテン１との結合を示さないか、もしくは非常に僅かに
のみ示すにすぎない。すなわち、ポリハプテン２と結合
性の抗体が選択的に得られた。本発明により、例６によ
り製造された免疫原２により得られた抗血清において、
免疫化マウスから得られた血清１８個のうちの６個がポ
リハプテン２と反応し、ポリハプテン１とは反応しなか
った。この際ポリハプテン２への結合は免疫原１におい
てと同様に良好であった。ここでも選択的な抗体が得ら
れた。比較のために実施した、比較免疫原Ｖ１での免疫
化においては１００匹のマウスから、ポリハプテン２と
優先的に反応する抗血清１つが得られ、この際他の９９
すべての抗血清は両方のポリハプテンと同じように良好
に反応する。ここでは、ポリハプテン２と選択的に結合
性の抗体を得ることができなかった。比較免疫原Ｖ２で
の免疫化においては全く差異をつけるマウス抗血清を得
ることはできなかった。マウス１００匹から得られたす
べての抗血清は両方のポリハプテンと同じように良好に
反応する。この際、ポリハプテンへの結合は、本発明に
よる免疫原１及び２で得られた血清においてよりファク
ター１０だけ弱い。 例１１ 生後８〜１２週のＢａｌｂ／ｃ−及びＢ１０．Ｄ２−マ
ウスを完全フロインドのアジュバンス（ＣＦＡ）中のＨ
ｂＡ1c（β１〜４Ｃｙｓ、ＭＨＳ）−エデスチン（免疫
原１）１００μｇで腹膜内（ｉ．ｐ）に第１回免疫化を
行なった。６週間及び１０週間後に、更に２回の免疫化
を実施した。この際、不完全フロイントのアジュバンス
（ＩＦＡ）中の免疫原１００μｇを投与した。最後の免
疫化の１０日後に、血清から抗体滴定量を測定するため
に血液を採取した。融合前４日及び３日目にマウスをも
う１度緩衝液中の免疫原１００μｇで静脈内免疫化を行
なった。融合のためにはギャルフレ（Ｇａｌｆｒ′ｅ；
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第７３
巻、１９８１年、第３頁）による方法と同様にして、免
疫化マウスの脾臓細胞１０8と骨髄腫細胞２×１０7（Ｐ
３×６３Ａｇ８−６５３、ＡＴＣＣ−ＣＲＬ８３７５）
とを１回で混合し、引き続き１０分間遠心分離を行なう
（３００ｇ、４℃）。細胞をもう１回ＢＳＳ（平衡塩類
溶液）で洗浄し、尖端を有する管５０ｍｌ中４００ｇで
遠心分離する。上澄を除去した。細胞沈殿物をほぐし、
６０％ＰＥＧ−溶液（分子量４０００、メルク社）１ｍ
ｌと混合した。水浴中で１分後、室温で胎児性子牛血清
（ＦＫＳ）を含有しないＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭ
＝Ｒｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋｅｒ Ｍｅｍｏｒｙ Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔ）５ｍｌを４〜５分間かけて滴加し、十
分に混合し、培地で５０ｍｌとし、かつ引き続き１０分
間４００ｇ、４℃で遠心分離した。分離した細胞を１０
％ＦＫＳを含有するＲＰＭＩ １６４０−培地に取り込
んだ。２４孔−細胞培地プレート（Ｎｕｎｃ社）上に脾
臓細胞各１０5を接種する。各培地に腹腔浸出液−細胞
５×１０4を飼料用細胞として添加した。翌日にヒポキ
サンチン−アザセリン−選択培地（１００ｍＭヒポキサ
ンチン、１μｇ／ｍｌアザセリン）を添加した。約７〜
１０日後、すでに多くのクローンが可視となった。第１
次培地の上澄を例１０に記載したエリザ法により試験し
た。ＨｂＡ0とほとんど交差反応を示さないか、又は全
く示さない第１次培地を蛍光活性化細胞種（ＦＡＣＳ）
を用いて９６孔−細胞培地プレート（Ｎｕｎｃ社）上で
更にクローン化した。飼料用細胞としては孔あたり腹腔
−浸出液細胞１×１０4を使用した。このようにして、
例えばハイブリドーマ細胞系を単離することができ、こ
れはヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セ
ル・カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅｓ）において寄託番号（１．）ＥＣＡＣＣ ８７１２
０８０１、（２．）ＥＣＡＣＣ ８８１２２３０２及び
（３．）ＥＣＡＣＣ ８８１２２３０１で寄託されてい
る。この細胞系からモノクローナル抗体（１．）３．６
０９３．２５（２．）３．５１．５６及び（３．）３．
２３０．１４０を得ることができる。腹水の生産のため
には、あらかじめプリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎ）０．５
ｍｌで１〜２回前処理した、ハイブリッド細胞５×１０
6でマウスを腹腔内注射した。その後１〜３週間で、こ
のマウスから５〜２０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ−濃度を有す
る腹水液がマウスから得られた。ここから常法で抗体を
単離することができた。このモノクローナル抗体はＨｂ
Ａ1cに対して特異的に反応し、ＨｂＡ0とは全く交差反
応を示さないか、又は僅かに示すだけである。 例１２ 材料 微量滴定プレート：Ａ：ＮＵＮＣ ４−４２４０４ＩＩ Ｂ：ＮＵＮＣ ２−６９６２０ １２管−ピペット：ダイナテク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ），カタログ番号、７７−８ ８７−００ プレート振盪機 ：フロー・ラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ）、テイターテク（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）、カタログ番号 ７７−４７１−００ カバーシート ：ダイナテク・プレート・シーラー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｐｌ ａｔｅ Ｓｅａｌｅｒｓ）、カタログ番号Ｍ３０ エリザ読み取り機：ダイナテクＭＲ７００ 積層緩衝液 ：５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６ 試料緩衝液 ：１０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ７．４，０．９％ＮａＣｌ， ０．１％ツウィーン２０、１％クロテインＣ 洗浄緩衝液 ：０．９％ＮａＣｌ、０．１％ツウィーン２０ 抗体／酵素複合体：マウス−ＩｇＧのＦｃγ−部に反応する、羊からのポリクロ ーナル抗体のＦａｂ−フラグメントとペルオキシダーゼとか らの複合体、試料緩衝液中２５ｍＵ／ｍｌ 基 質 ：１００ｍ ｍｏｌ／ｌ 燐酸塩−クエン酸塩−緩衝液pH４． ４ ３．２ｍ ｍｏｌ／ｌ 過硼素酸ナトリウム １．９ｍ ｍｏｌ／ｌ ＡＢＴＳ（２，２′−アジノ−ジ− ［３エチル−ベンズチアゾリン−スルホン酸−（６）］ ジアンモニウム塩） 抗 体 ：ＭＡＫ ３．６０９．３２５（ＥＣＡＣＣ ８７１２０８０ １） ポリハプテン ：例８によるポリハプテン１ 例９によるポリハプテン２ 抗 原 ：ＨｂＡ1c天然 ＨｂＡ0 天然 予備実験において、本来の特異性実験に使用すべき抗体
量を決めた。このためには、微量滴定プレートをポリハ
プテン１もしくはポリハプテン２で積層した。各窪み１
００μｌを積層緩衝液１ｍｌあたりポリハプテン１μｇ
を１時間室温で恒温保持する。その後、該溶液を吸引濾
過し、洗浄緩衝液で３回洗浄する。引き続き、固相に結
合したポリハプテンに抗体３．６０９．３２５（腹水）
の希釈列を添加するが、この際試料緩衝液での希釈は
１：１００から４段階で行なった。それぞれ１００μｌ
／窪で、１時間室温で恒温保持し、最後に洗浄した。ポ
リハプテンに結合した抗体はマウス−ＩｇＧのＦＣγ−
部に反応する、羊からのポリクローナル抗体のＦａｂ−
フラグメントとペルオキシダーゼとからの複合体の添加
により、ペルオキシダーゼと添加した基質との反応を介
して測定された。複合体１００μｌ／窪を添加し、室温
で１時間恒温保持した。検出反応をすべての窪中に基質
１００μｌ／窪の添加により開始した。この測定をエリ
ザ読み取り機中４０５ｎｍで行なう（参照波長４９０ｎ
ｍ）。半最大結合が行なわれる抗体希釈が滴定液として
定義された。この抗体量を次の実験に使用した。モノク
ローナル抗体の特異性を実験した。このためには、個々
の抗体の反応性を溶液中に存在する種々の成分と比較し
た。１％クロテイン（Ｃｒｏｔｅｉｎ）Ｃで予積層した
微量滴定プレート中に、滴定液の２倍濃縮液中のモノク
ローナル抗体の溶液５０μｌ及び抗原溶液（希釈列、下
を参照）５０μｌをそれぞれピペットで入れ、混合し、
室温で３０分間恒温保持した。その後、ポリハプテンで
積層した微量滴定プレート中の該混合物の分割量１００
μｌを移転する。 希釈列： フルクトースＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＣｙｓ（Ｓｔｂ
ｕ）ＯＨ（例１による） フルクトースＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧ
ｌｕＣｙｓ（ＳｔＢｕ）ＯＨ（例６による） フルクトース・バリン ［５μｇ／ｍｌ試料緩衝液から試料緩衝液を用いて４段
階で］ ＨＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓ
（ＳｔＢｕ）ＯＨ（例６による） ＨｂＡ1c ＨｂＡ0 ［１００μｇ／ｍｌ試料緩衝液から４段階で］ 測定すべき物質の半最高結合に属する濃度（ｍｏｌ／
ｌ）をモル比親和性と定義する。モノクローナル抗体と
種々の成分との反応性の比較のためには成分フルクトー
スＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓ
（Ｓｔｂｕ）ＯＨのためのモノクローナル抗体の比親和
性を１００％とする。交差反応とも呼ばれる、他の成分
との反応性は次のように比親和性の商から次のように得
られる：
【数１】 個々の成分に関して得られた値を次の第１表に記載し
た。この際、種々の同様にして得られた抗体で得られた
結果も評価した。この表は、特異的にＨｂＡ1cと結合す
るが、ＨｂＡ0とは結合しない多数のモノクローナル抗
体を本発明による免疫原で製造することができることを
示す。比較免疫原Ｖ１の使用下に得られた抗体又はヨー
ロッパ特許公開第１８５８７０号公報から公知の抗体と
比較すると、本発明により得られた抗体は特別な変性な
しに著しく高い親和性でＨｂＡ1cを認識する。従って、
本発明により得られた抗体は競合イムノアッセイに非常
に好適である。
た。この際、種々の同様にして得られた抗体で得られた
結果も評価した。この表は、特異的にＨｂＡ1cと結合す
るが、ＨｂＡ0とは結合しない多数のモノクローナル抗
体を本発明による免疫原で製造することができることを
示す。比較免疫原Ｖ１の使用下に得られた抗体又はヨー
ロッパ特許公開第１８５８７０号公報から公知の抗体と
比較すると、本発明により得られた抗体は特別な変性な
しに著しく高い親和性でＨｂＡ1cを認識する。従って、
本発明により得られた抗体は競合イムノアッセイに非常
に好適である。
【表１】 例１３ 例１２に記載したように、１％クロテインＣで予め積層
した微量滴定プレート中に２倍濃縮滴定液中のＭＡＫ
３．６０９．３２５の溶液５０μｌ及びＨｂＡ1c−溶液
５０μｌをそれぞれピペットで入れ、混合し、室温で３
０分間恒温保持する。種々の濃度のＨｂＡ1cを使用す
る。その後ポリハプテン２で積層した微量滴定プレート
中にこの混合物１００μｌ−分割量を導入する。ポリハ
プテン２に結合した抗体を例１２に記載したように、マ
ウス−ＩｇＧのＦｃγ−部に反応する羊からのポリクロ
ーナル抗体のＦａｂ−フラグメントとペルオキシダーゼ
とからの複合体を用いて検出する。試料溶液中にＨｂＡ
1cが多量に存在すればする程、少量の抗体がポリハプテ
ンに結合する、すなわち、測定した吸光度は小さくな
る。図１中にはＨｂＡ1cの測定において得られた曲線が
示されている。 例１４ 完全フロイントのアジュバンス中の本発明による免疫原
１もしくは２で各１０匹の羊を免疫化した。投与量は第
１回目の及びそれに続く免疫化において動物１匹あたり
免疫原各２００μｇであった。免疫化は１ケ月の間隔で
行なわれた。得られた血清を、例１２に記載されている
ようにＨｂＡ1cに対する抗体の存在及び特異性に関して
実験した。このためには、微量滴定プレートをポリハプ
テン２ ０．０４μｇ／ｍｌで積層した。抗体−酵素−
複合体としてはペルオキシダーゼと家兎−抗羊−免疫グ
ロブリンからの複合体を使用した。この複合体の使用濃
度は１５０ｍＵ／ｍｌであった。抗原としてはＨｂＡ1c
及びＨｂＡ0天然を使用し、ペプチドとしてはＨＶａｌ
ＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓＯＨ及び
フルクトースＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧ
ｌｕＣｙｓＯＨを使用する。 次の試料を実験した： プール１：本発明による例４からの免疫原で処理した１
０匹の動物すべての血清試料の部分量からなる混合物
（最初の免疫化後４５日で採血） プール２：本発明による例５からの免疫原で処理した１
０匹の動物すべての血清試料の部分量からなる混合物
（最初の免疫化後４５日で採血） 試料ａ ：本発明による例４からの免疫原１で処理した
羊３２２７の血清試料（最初の免疫化後１６５日で採
血） 試料ｂ ：本発明による例４からの免疫原１で処理した
羊３２３３の血清試料（最初の免疫化後１６５日で採
血） 試料ｃ ：本発明による例５からの免疫原２で処理した
羊３２７２の血清試料（最初の免疫化後７５日で採血） 滴定測定は次の結果を示す： プール１： １：５４００ プール２： １：８４００ 試料ａ ： １：３７００ 試料ｂ ： １：３６００ 試料ｃ ： １：２６００ 第２図は抗血清濃度に依存する吸光度に関する例を示
す。 例１５ 例１４中に記載されているように、グリコシル化及び非
グリコシル化抗原に対する抗体の親和性及び特異性を測
定した。結果を第２表及び第３表並びに第３図に示し
た。第３図中では次のことを示す： 曲 線 抗 原 最大使用濃度（ｎｍｏｌ／ｌ） ────────────────────────────────── １ ペプチドＡ ５３４０ ２ ペプチドＢ １６０００ ３ ＨｂＡ1c ２６７０ ４ ＨｂＡ0 ２６７０ ────────────────────────────────── 該表は本発明による免疫原で、非常に特異的にＨｂＡ1c
と結合するが、ＨｂＡ0とは結合しない、著しく特異的
なポリクローナル抗体を製造することができることを示
す。このポリクローナル抗体ＨｂＡ1cが変性なしで、高
い親和性で認識されるということが示される。更に、本
発明により得られた免疫原での処理によりそれぞれ羊１
０匹から得られたポリクローナル抗体の混合物からなる
種々のプールの結果から、本発明による免疫原を使用す
る際に非常に高い率の免疫化動物が好適な抗体を生産す
るということが明らかである。 第 ２ 表 グリコシル化及び非グリコシル化抗原への抗体の親和性 ──────────────────────────────────── 比親和性（nmol／l） 交差反応 試料 ペプチドＡ* ペプチドＢ** ＨｂＡ1c ＨｂＡ0 ＨｂＡ0/ＨｂＡ1c ──────────────────────────────────── プール１ 21 ≫ 16000 30 ≫ 2670 ≪ 1.1％ 試料ａ 33 ≫ 16000 115 ≫ 2670 ≪ 4.3％ プール２ 15 ≫ 16000 18 ≫ 2670 ≪ 0.7％ 試料ｃ 21 ≫ 16000 134 ≫ 2670 ≪ 5.0％ ──────────────────────────────────── ＊ ペプチドＡ：フルクトース ＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓ （ＳｔＢｕ）ＯＨ ＊＊ ペプチドＢ：ＨＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓ （ＳｔＢｕ）ＯＨ 第 ３ 表 ＨｂＡ1cに対するポリクローナル抗体の特異性実験結果： ────────────────────────────────── 反応性+ プール１ 試料ａ プール２ 試料ｃ ポリハプテン２ ＋ ＋ ＋ ＋ ペプチドＡ １００ １００ １００ １００ ＨｂＡ1c天然 ７０ ２８.６ ８３.３ １５.７ ────────────────────────────────── ポリハプテン１ − − − − ペプチドＢ ≪０.１３ ≪０.２ ≪０.０９ ≪０.１３ ＨｂＡ0天然 ≪０.８ ≪１.２ ≪０.５ ≪０.８ ────────────────────────────────── ＋プール１，試料ａ： 例４の免疫原１から製造 プール２，試料ｃ： 例５の免疫原２から製造
した微量滴定プレート中に２倍濃縮滴定液中のＭＡＫ
３．６０９．３２５の溶液５０μｌ及びＨｂＡ1c−溶液
５０μｌをそれぞれピペットで入れ、混合し、室温で３
０分間恒温保持する。種々の濃度のＨｂＡ1cを使用す
る。その後ポリハプテン２で積層した微量滴定プレート
中にこの混合物１００μｌ−分割量を導入する。ポリハ
プテン２に結合した抗体を例１２に記載したように、マ
ウス−ＩｇＧのＦｃγ−部に反応する羊からのポリクロ
ーナル抗体のＦａｂ−フラグメントとペルオキシダーゼ
とからの複合体を用いて検出する。試料溶液中にＨｂＡ
1cが多量に存在すればする程、少量の抗体がポリハプテ
ンに結合する、すなわち、測定した吸光度は小さくな
る。図１中にはＨｂＡ1cの測定において得られた曲線が
示されている。 例１４ 完全フロイントのアジュバンス中の本発明による免疫原
１もしくは２で各１０匹の羊を免疫化した。投与量は第
１回目の及びそれに続く免疫化において動物１匹あたり
免疫原各２００μｇであった。免疫化は１ケ月の間隔で
行なわれた。得られた血清を、例１２に記載されている
ようにＨｂＡ1cに対する抗体の存在及び特異性に関して
実験した。このためには、微量滴定プレートをポリハプ
テン２ ０．０４μｇ／ｍｌで積層した。抗体−酵素−
複合体としてはペルオキシダーゼと家兎−抗羊−免疫グ
ロブリンからの複合体を使用した。この複合体の使用濃
度は１５０ｍＵ／ｍｌであった。抗原としてはＨｂＡ1c
及びＨｂＡ0天然を使用し、ペプチドとしてはＨＶａｌ
ＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓＯＨ及び
フルクトースＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧ
ｌｕＣｙｓＯＨを使用する。 次の試料を実験した： プール１：本発明による例４からの免疫原で処理した１
０匹の動物すべての血清試料の部分量からなる混合物
（最初の免疫化後４５日で採血） プール２：本発明による例５からの免疫原で処理した１
０匹の動物すべての血清試料の部分量からなる混合物
（最初の免疫化後４５日で採血） 試料ａ ：本発明による例４からの免疫原１で処理した
羊３２２７の血清試料（最初の免疫化後１６５日で採
血） 試料ｂ ：本発明による例４からの免疫原１で処理した
羊３２３３の血清試料（最初の免疫化後１６５日で採
血） 試料ｃ ：本発明による例５からの免疫原２で処理した
羊３２７２の血清試料（最初の免疫化後７５日で採血） 滴定測定は次の結果を示す： プール１： １：５４００ プール２： １：８４００ 試料ａ ： １：３７００ 試料ｂ ： １：３６００ 試料ｃ ： １：２６００ 第２図は抗血清濃度に依存する吸光度に関する例を示
す。 例１５ 例１４中に記載されているように、グリコシル化及び非
グリコシル化抗原に対する抗体の親和性及び特異性を測
定した。結果を第２表及び第３表並びに第３図に示し
た。第３図中では次のことを示す： 曲 線 抗 原 最大使用濃度（ｎｍｏｌ／ｌ） ────────────────────────────────── １ ペプチドＡ ５３４０ ２ ペプチドＢ １６０００ ３ ＨｂＡ1c ２６７０ ４ ＨｂＡ0 ２６７０ ────────────────────────────────── 該表は本発明による免疫原で、非常に特異的にＨｂＡ1c
と結合するが、ＨｂＡ0とは結合しない、著しく特異的
なポリクローナル抗体を製造することができることを示
す。このポリクローナル抗体ＨｂＡ1cが変性なしで、高
い親和性で認識されるということが示される。更に、本
発明により得られた免疫原での処理によりそれぞれ羊１
０匹から得られたポリクローナル抗体の混合物からなる
種々のプールの結果から、本発明による免疫原を使用す
る際に非常に高い率の免疫化動物が好適な抗体を生産す
るということが明らかである。 第 ２ 表 グリコシル化及び非グリコシル化抗原への抗体の親和性 ──────────────────────────────────── 比親和性（nmol／l） 交差反応 試料 ペプチドＡ* ペプチドＢ** ＨｂＡ1c ＨｂＡ0 ＨｂＡ0/ＨｂＡ1c ──────────────────────────────────── プール１ 21 ≫ 16000 30 ≫ 2670 ≪ 1.1％ 試料ａ 33 ≫ 16000 115 ≫ 2670 ≪ 4.3％ プール２ 15 ≫ 16000 18 ≫ 2670 ≪ 0.7％ 試料ｃ 21 ≫ 16000 134 ≫ 2670 ≪ 5.0％ ──────────────────────────────────── ＊ ペプチドＡ：フルクトース ＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓ （ＳｔＢｕ）ＯＨ ＊＊ ペプチドＢ：ＨＶａｌＨｉｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓ （ＳｔＢｕ）ＯＨ 第 ３ 表 ＨｂＡ1cに対するポリクローナル抗体の特異性実験結果： ────────────────────────────────── 反応性+ プール１ 試料ａ プール２ 試料ｃ ポリハプテン２ ＋ ＋ ＋ ＋ ペプチドＡ １００ １００ １００ １００ ＨｂＡ1c天然 ７０ ２８.６ ８３.３ １５.７ ────────────────────────────────── ポリハプテン１ − − − − ペプチドＢ ≪０.１３ ≪０.２ ≪０.０９ ≪０.１３ ＨｂＡ0天然 ≪０.８ ≪１.２ ≪０.５ ≪０.８ ────────────────────────────────── ＋プール１，試料ａ： 例４の免疫原１から製造 プール２，試料ｃ： 例５の免疫原２から製造
【図１】モノクローナル抗−ＨｂＡ1c−抗体（ＭＡＫ
３．６０９．３２５）のＨｂＡ1cに対する反応性の標準
曲線を示すグラフ図。
３．６０９．３２５）のＨｂＡ1cに対する反応性の標準
曲線を示すグラフ図。
【図２】例１４により得られた抗血清に関する滴定測定
値（二回測定）を示すグラフ図。
値（二回測定）を示すグラフ図。
【図３】ペプチド及びヘモグロビンに対する抗体の比親
和性を示す図。第１、第２、第３及び第４曲線はそれぞ
れ抗原としてペプチドＡ、ペプチドＢ、ＨｂＡ1c及びＨ
ｂＡ0を用いた結果を示す。
和性を示す図。第１、第２、第３及び第４曲線はそれぞ
れ抗原としてペプチドＡ、ペプチドＢ、ＨｂＡ1c及びＨ
ｂＡ0を用いた結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クリスタ ヒユープナー−パライツ ドイツ連邦共和国 トウツイング マリエ ンシユトラーセ 11 (72)発明者 ハンス−ゲーオルク バツツ ドイツ連邦共和国 トウツイング トラウ ビンガー−シユトラーセ 63 (72)発明者 ヴオルフガング ロリンガー ドイツ連邦共和国 ヴアイルハイム ベー レンミユールヴエーク 98 (72)発明者 ウルリヒ エツシツヒ ドイツ連邦共和国 ガウチング ヴアルト プロメナーデ 28ベー (72)発明者 ロレンツ ケルシヤー ドイツ連邦共和国 ペンツベルク パウル −レーベ−シユトラーセ 21
Claims (1)
- 【請求項１】 一般式Ｉ 【化１】 ［式中、ｍは１〜ｑ（ここで、ｑはハプテンスペーサー
基に結合する担体蛋白質の重量の２５％に相当する数値
を表わす）を表わし、Ｔは担体蛋白質を表わし、Ａは一
般式ＩＩ： 【化２】 （ここで、ＸはＳ又はＮＨを表わし、ｎは１〜４を表わ
し、Ｂはサクシンイミド基を含有する有機基を表わす）
を有する原子数１０〜２０の鎖長のスペーサーを表わ
す］の免疫原を、抗体を形成する能力のある生物に注射
し、次いでこの生物から抗体を取得することにより獲得
することができ、かつＨｂＡ1c に高親和性を示し、か
つＨｂＡ0を結合しないことを特徴とするＨｂＡ1cに対
するポリクローナル抗体。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3803330.5 | 1988-02-04 | ||
| DE3803330 | 1988-02-04 | ||
| DE3806198.8 | 1988-02-26 | ||
| DE3806198A DE3806198A1 (de) | 1988-02-04 | 1988-02-26 | Immunogen und seine verwendung zur gewinnung von antikoerpern gegen hba(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)c(pfeil abwaerts) |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| JP2717392B2 JP2717392B2 (ja) | 1998-02-18 |
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|---|---|---|---|
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| JP7261421A Expired - Lifetime JP2717392B2 (ja) | 1988-02-04 | 1995-10-09 | ポリクローナル抗体 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1024081A Expired - Lifetime JP2540362B2 (ja) | 1988-02-04 | 1989-02-03 | 免疫原及び抗体の取得法 |
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| DK (1) | DK175191B1 (ja) |
| ES (2) | ES2061744T3 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP2007003411A (ja) * | 2005-06-24 | 2007-01-11 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法及びヘモグロビンＡ１ｃ測定用キット |
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| US4727036A (en) * | 1985-08-08 | 1988-02-23 | Molecular Diagnostics, Inc. | Antibodies for use in determining hemoglobin A1c |
| DE3439610A1 (de) * | 1984-10-30 | 1986-04-30 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Immunogene, verfahren zu deren herstellung sowie damit gewonnene antikoerper gegen glykosiliertes haemoglobin |
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| DE3532868A1 (de) * | 1985-09-14 | 1987-03-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur bestimmung von glykosiliertem haemoglobin sowie hierzu geeignete verbindungen und verfahren zu deren herstellung |
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- 1989-02-02 DE DE58909328T patent/DE58909328D1/de not_active Expired - Lifetime
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