JPH04217996A - ＶＩＩａ因子からの配列を含有する合成ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ＶＩＩａ因子からのある部分配
列を含有する合成ペプチド、それらの合成ならびに動物
の免疫処置および上記ペプチドに対する特異的抗体の精
製におけるこれらのペプチドの使用、さらにこれらのペ
プチドに対する抗体ならびに治療および診断におけるこ
れらの抗体およびペプチドの使用に関する。

【０００２】生体は血液凝固系によって血液の喪失から
保護されている。血液凝固カスケードの経過において、
限定された蛋白分解、多分痕跡のＸａ因子によってＶＩ
Ｉａ因子／ＴＦ複合体に変換されるＸＩＩ因子／ＴＦ複
合体が形成される。ＸＩＩａ因子／ＴＦ複合体は遊離の
ＶＩＩａ因子に比較して何倍にも増大した蛋白分解活性
を有する。 ＶＩＩ因子分子の特異的切断は、テトラペプチドＰｒｏ
−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇに続くペプチド結合に起こる
。 この切断により、１５２アミノ酸の軽鎖と２５４アミノ
酸の重鎖からなる２つの鎖のＶＩＩａ因子分子が生成す
る。この２つの鎖は互いにジスルフィド結合で連結され
ている。単一鎖ＶＩＩ因子分子の活性化、すなわち切断
によって生成する２鎖ＶＩＩａ因子分子には、ＶＩＩａ
因子分子の軽鎖または重鎖上に新たなカルボキシ末端ま
たはアミノ末端アミノ酸配列が発生する。ＶＩＩａ因子
の形成後に新たに生成したカルボキシ末端またはアミノ
末端アミノ酸配列を排他的に認識するが、天然のＶＩＩ
因子は認識しない特異的抗体を用いることにより、血液
または血漿中のＶＩＩａ因子の特異的定量を行うことが
できる。これによって外因的凝固経路の初期相に生じる
血液凝固能の定量化が可能になる。

【０００３】ＶＩＩ因子欠乏血漿を用いるＶＩＩ因子の
機能的活性の定量は公知である（Ｊｏｈｎ　Ｔ．Ｂｒａ
ｎｄｔ　ら：Ａｍ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｐａｔｈｏｌ
．，　８５：５８３〜５８９，１９８６）。この操作で
は、凝固時間の短縮における希釈血漿の効果が、ＶＩＩ
因子を除く血液凝固過程に必要なすべての因子を含有す
る系において測定される。この試験は、血漿サンプル中
で活性化されることが可能なＶＩＩ因子の完全な割合を
測定するものであるが、既に存在する活性ＶＩＩ因子の
濃度は定量できない。

【０００４】ＶＩＩ因子を、放射免疫検定または酵素免
疫検定を用いて定量する方法も公知である（Ｃ．　Ｂａ
ｙｅｒ　ら：Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍ
ｏｓｔａｓｉｓ，　５６（３）：２５０〜２５５，１９
８６）。この操作に必要な抗体は血漿から精製したＶＩ
Ｉ因子を用いて動物を免疫処置することによって発生さ
せる。得られた抗体はＶＩＩ因子の定量的測定には適し
ているが、不活性ＶＩＩ因子と活性ＶＩＩａ因子を識別
するものではない。

【０００５】本発明はしたがって、ＶＩＩａ因子に対す
る特異的な抗体を誘発する抗原の提供という目的に基づ
くものであった。さらに他の目的は、生物学的液体内の
ＶＩＩａ因子またはＶＩＩａ因子／ＴＦ複合体の高感度
かつ高精度の定量を可能にする、特異的ＶＩＩａ因子抗
体を用いる試験方法を開発することにあった。

【０００６】この目的は本発明において、ＶＩＩａ因子
のアミノ酸配列に一部同一であり、抗原性を示すアミノ
酸配列を含有する合成ペプチドによって達成される。

【０００７】本発明はしたがって、ＶＩＩ因子のＸａ因
子切断から生じるＶＩＩａ因子のカルボキシ末端または
アミノ末端と部分的に同一なアミノ酸配列を含有するペ
プチドに関する。この配列は以下のアミノ酸配列Ｈ−Ｓ
ｅｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｌａ−
Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｏ
Ｈ　および／または配列Ｈ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｖａ
ｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−
Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｖ
ａｌ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｃｙ
ｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ
−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＨのすべてまたは一部、ただし少
なくとも４個のカルボキシ末端および／またはアミノ末
端アミノ酸（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨお
よび／またはＨ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）を
含有する。

【０００８】本発明はさらに、本発明によるペプチドの
抗体を得るための利用に関する。この場合、抗体はポリ
クローナル抗血清から免疫吸着精製によって得ることが
好ましい。

【０００９】本発明はまた、本発明による抗体および／
または本発明によるペプチドの、ＶＩＩａ因子またはＶ
ＩＩａ因子／ＴＦ複合体の定量のための使用に関する。

【００１０】本発明はまた、本発明によるペプチドおよ
びそれらに対する抗体の治療目的での、とくに血液凝固
障害の治療のための使用に関する。本発明のペプチドは
、本技術分野の熟練者にはそれ自体よく知られた方法で
製造できる。たとえば保護されたアミノ酸誘導体または
ペプチドセグメントを溶液中または固相上で互いにカッ
プリングし、保護基を切断し、また固相反応の場合は担
体樹脂から切断すると、本発明のペプチドを得ることが
できる。

【００１１】一時的な保護基としては、Ｆｍｏｃ基、側
鎖の官能基にはｔ−ブチル／Ｂｏｃに基づく長期的保護
基ＡｒｇにはＰｍｃまたはＭｔｒ基、Ｃｙｓにはｔ−ブ
チルメルカプト基またはトリチル基を使用することが好
ましい。Ｃ−末端アミノ酸は、通常ペプチド合成に適し
たポリマー担体、好ましくは架橋ポリスチレンにｐ−ア
ルコキシベンジルエステル基を介して連結し固定化する
。ペプチド合成は、Ｆｍｏｃを好ましくはＤＭＦ（ジメ
チルホルムアミド）中２０％ピペリジン（ｖ／ｖ）を用
いて切断し、ついで保護アミノ酸を好ましくはＨＯＢＴ
の存在下にカルボジイミドを用いてカップリングする操
作を反復することによって行われる。この目的では、ア
ミノ酸誘導体は好ましくは３倍過剰を用いてＤＭＦ中、
１〜１．５時間カップリングさせる。Ｆｍｏｃの除去ま
たは縮合工程の各工程後、樹脂は各場合につき３回、少
量（１５ｍｌ／ｇ）のＤＭＦおよびイソプロパノールで
洗浄する。本発明のペプチドを酸加水分解によって切断
すると同時に側鎖官能基も遊離される。遊離させなけれ
ばならないスルフヒドリル基は、アルコールたとえばト
リフルオロエタノール中トリ−ｎ−ブチルホスフィンを
用いて、または水中ＤＴＴを用いて「脱保護」する。Ｃ
ｙｓ（Ｔｒｔ）脱保護の場合は、スカベンジャーとして
エタンジオールを用いれば別個の工程は不要である。ペ
プチドの精製はたとえば、イオン交換クロマトグラフィ
ー、逆相クロマトグラフィーおよびゲル透過クロマトグ
ラフィーによって実施できる。ペプチドの正しい組成お
よびそのペプチド含量はアミノ酸分析によって決定でき
る。

【００１２】動物の免疫処置に抗原として合成ペプチド
を用いると、このペプチド内の露出したハプテンに対す
る抗体の発生が起こる。この方法で発生させた抗体は、
したがって、このペプチドが誘導された全蛋白質の単一
の抗体結合部位に対してそれぞれ特異的である。合成ペ
プチドの使用は、慣用方法で精製されたＶＩＩａ因子の
使用に比較して実質的に有利である。すなわち、合成ペ
プチドは大量にしかも高純度に製造することが可能で、
したがって天然のＶＩＩａ因子の場合の複雑な単離およ
び精製は必要としない。合成ペプチドの、合成副生成物
からの精製は確立されているが、天然ＶＩＩａ因子の場
合は技術的にきわめて精巧な濃縮および精製方法によっ
ても、微量ではあるが抗原的に活性な量の望ましくない
ペプチドたとえば天然のＶＩＩ因子を含有する生成物が
常に得られる。しかも、免疫処置抗原として完全なＶＩ
Ｉ因子またはＶＩＩａ因子を用いた場合は、結局、これ
らの蛋白質の露出されたハプテンすべてに対する多数の
抗体の集団が常に得られ、この多数の異なる抗体から、
排他的にＶＩＩａ因子に向けられた特異的な抗体を見出
すことは困難である。

【００１３】Ｘａ因子の認識配列をＣ−末端またはＮ−
末端に含有するペプチドまたはポリペプチドに対する抗
体は、もっぱらＶＩＩａ因子と特異的に反応し、完全な
非切断ＶＩＩ因子とは反応しないことが見出された。Ｖ
ＩＩ因子に対するＸａ因子の作用で生じた、Ｃ−末端ま
たはＮ−末端にＸａ因子認識配列を含有する２鎖は、そ
れぞれ１５２および２５４アミノ酸から構成される。免
疫処置には、完全ポリペプチド、およびＣ−またはＮ−
末端になおＸａ因子認識配列を含有するこれらのペプチ
ドの部分配列が適当である。とくに好ましい実施態様に
おいては、たとえば配列Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｌ
ａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
またはＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａ
ｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙを含有するデカペ
プチドの使用が提供される。

【００１４】上述の場合、分子のカルボキシ末端または
アミノ末端は露出されていて免疫を生じることが重要で
ある。

【００１５】このペプチドの利用の可能性という観点か
らペプチドには、ハプテン構造を損うことがない形で反
応性の側鎖基を有するアミノ酸を導入するのが有利であ
る。この理由から、遊離のＳＨ基がチオエーテルを介し
て多くの担体にカップリングできるシステインを適宜、
Ｎ−またはＣ−末端に連結させるのが有利である。たと
えば、上述のペプチドによって表される抗原は、デカペ
プチドＣｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙ
ｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇの形で提供される
のが好ましい。

【００１６】免疫処置に使用されるペプチドのプレパレ
ーションは、本技術分野の熟練者には既知の方法により
化学的合成および遺伝子工学で得られたポリペプチドの
精製の両者によって製造することができる。

【００１７】免疫処置に使用するペプチドまたは免疫吸
着剤として使用するペプチドは、担体分子にカップリン
グするのが有利である。カップリング方法は、本技術分
野の熟練者にはそれ自体よく知られていて、文献に記載
されている（Ｎａｋａｎｅ，　Ｐ．Ｋ．　ら：Ｊ．　Ｈ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ．　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，　２２：１
０８４〜１０９１，１９７４）。本発明の目的における
担体分子は、免疫反応性接合体の製造技術分野における
熟練者によって使用されるような天然または合成巨大分
子でよく、たとえばアルブミン、オバルブミン、キーホ
ールリンペットヘモシアニンまたは多糖が使用できる。 好ましい実施態様においては、ペプチドまたはポリペプ
チドは貝類のヘモシアニン、キーホールリンペットヘモ
シアニンにカップリングされる。

【００１８】本発明の合成ペプチドを免疫吸着剤として
用いる場合には、固体マトリックスを与えるのに適当な
材料にカップリングさせるのが有利である。この目的で
の担体は、蛋白質およびペプチドの固定化の技術におけ
る熟練者が使用する不溶性ポリマーであり、たとえばポ
リスチレン、ナイロン、アガロースまたは磁化可能な粒
子である。この場合、固相は任意の所望の形状、たとえ
ばチューブ、織布、ビーズまたは微粒子とすることがで
きる。

【００１９】好ましい実施態様においては、ペプチドた
とえば上述のデカペプチドは、シアノーゲンブロミド活
性化　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　にカップリングされる。

【００２０】担体に結合させたペプチドによる適当な動
物の免疫処置は、再現性よく抗体の形成を生じる。免疫
処置および抗体の取得に好ましい動物種はこの場合ウサ
ギであり、またマウスも免疫処置に使用できる。

【００２１】本発明により、合成ペプチドを用いて動物
に発生させた抗血清から、特異的な試験に合致する免疫
グロブミン分画を、慣用の免疫吸着法によって濃縮でき
る。しかしながら、この場合免疫処置に用いたペプチド
と同様に担体にカップリングさせた同じ抗原決定部位を
有するペプチドを、免疫吸着に用いられるマトリックス
への材料として使用することが好ましい。免疫吸着精製
に用いられるペプチドは短縮アミノ酸配列を含むもので
もよい。所望の抗体の免疫吸着に精製に使用できる前提
条件は、この短縮ポリペプチド配列が所望の抗体に認識
され効果的に結合することのみである。

【００２２】抗体の免疫吸着単離に用いられるペプチド
は、たとえばデカペプチド、好ましくはＣｙｓ−Ａｒｇ
−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇである。本発明によれば、抗体は合成ペ
プチドで免疫処置することにより動物系に誘発され、免
疫吸着によって精製される。これらの抗体は、免疫処置
および免疫吸着に用いられたペプチドと特異的に反応す
る。使用したペプチドの配列によって、これらの抗体は
、ＶＩＩａ因子のみに結合するか、また天然のＶＩＩ分
子に露出されたペプチド配列を選択した場合は、完全な
ＶＩＩ因子分子にも結合する。

【００２３】免疫吸着剤として適当なペプチドを選択す
ることによりＶＩＩａ因子の抗原決定部位、すなわち、
この分子のＸａ因子切断部位の認識配列に相当する部位
と特異的に反応する抗体を選択することが可能である。 Ｃ−またはＮ−末端Ｘａ因子認識配列を有するペプチド
が免疫処置および精製の両者に用いられる。好ましい場
合には、これらの配列に対する抗体が濃縮される。しか
しながら、完全なＶＩＩ因子分子では、Ｘａ因子切断部
位が十分完全に露出していないあるいは抗原認識に必要
な高次構造をもたないので、上述の抗体は天然のＶＩＩ
因子とは反応しない。

【００２４】本技術分野の熟練者にはそれ自体既知の方
法を用い、本発明の性質を有するモノクローナル抗体も
製造できる。

【００２５】本発明によって得られる抗体は、本技術分
野の熟練者にはそれ自体既知の均一および不均一イムノ
アッセイ、たとえば酵素イムノアッセイまたは遊離もし
くはラテックス結合凝集反応に使用できる。この目的で
は、これらを固体担体にカップリングさせるのが好まし
い。このような固体担体は、本技術分野の熟練者にはそ
れ自体既知であり、たとえばマイクロタイトレーション
プレート、チューブ、ビーズ、マイクロビーズ、磁化可
能粒子等である。この場合、ポリスチレンチューブまた
はマイクロタイトレーションチューブへの固定化が好ま
しい。以下に述べるようなイムノアッセイ用に製造され
たチューブは、ついで密閉してたとえば４℃で保存する
ことができる。

【００２６】ＶＩＩａ因子含量は本発明により、サンプ
ルをこの種類の固定化抗体とプレインキュベートし、次
に第二の抗体とインキュベートして、固定化固体に結合
したＶＩＩａ因子の濃度を検知することによって測定す
ることができる。この第二の抗体は、たとえば発色団基
質の変換または結合能のような、測定可能な性質をもつ
ものでなければならない。

【００２７】第二の抗体は、たとえば酵素、蛍光性分子
たとえばフルオレセインイソチオシアネート、放射性標
識、または化学発光を利用できる分子と結合させて提供
することができる。この第二の抗体はマーカー酵素にカ
ップリングさせるのが好ましく、この酵素としてはペル
オキシダーゼがとくに好ましい。

【００２８】本発明においては、この方法で固定化され
た抗体を用いて、ＶＩＩａ因子／ＴＦ複合体の濃度も測
定することができる。前提条件としては、組織因子に対
する特異的抗体を、上述のように標識して第二の抗体と
して使用しなければならない。ＴＦ抗体は本技術分野の
熟練者にはそれ自体既知の方法により、ポリクローナル
またはモノクローナル抗体として得ることができる。Ｔ
Ｆ抗体を結合させ、ＶＩＩａ因子抗体を標識することも
可能である。

【００２９】ＶＩＩａ因子またはＶＩＩａ因子／ＴＦ複
合体は、サンプル好ましくは血漿と標識抗体の、固定化
抗体との同時インキュベーションによっても定量できる
。このほか、固定化抗体の結合部位に付して標識および
非標識ＶＩＩａ因子またはＶＩＩａ因子／ＴＦ複合体を
競合させる競合的定量法も可能である。この方法で定量
されたＶＩＩａ因子含量からは、ＶＩＩ因子活性化の程
度についても知ることができる。実施例に記載の実施態
様がとくに好ましい。

【００３０】以下の実施例は本発明を例示するものであ
って、いかなる意味においても本発明を限定するもので
はない。

【００３１】実施例には以下の略号を使用する。 ＥＬＩＳＡ　　酵素イムノアッセイ（酵素連結イムノソ
ーベントアッセイ） ＫＬＨ　　　　　　キーホールリンペットヘモシアニン
（海生貝類のヘモシアニン） ＰＢＳ　　　　　　リン酸緩衝食塩溶液Ｔｒｉｓ　　　
　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンＯＤ　　　
　　　　　吸光度（光学密度）Ｃｙｓ，Ｃ　　　システ
イン Ａｌａ，Ａ　　　アラニン Ａｒｇ，Ｒ　　　アルギニン Ｐｒｏ，Ｐ　　　プロリン Ｐｈｅ，Ｆ　　　フェニルアラニン Ｌｙｓ，Ｋ　　　リジン Ｉｌｅ，Ｉ　　　イソロイシン Ｇｌｙ，Ｇ　　　グリシン Ｇｌｕ，Ｅ　　　グルタミン酸 Ｔｈｒ，Ｔ　　　スレオニン Ｇｌｎ，Ｑ　　　グルタミン （アミノ酸はＤ−またはＬ−型で存在できるが、とくに
指定のない場合はＬ−型である） Ｂｏｃ　　　　　　ｔ−ブトキシカルボニルＦｍｏｃ　
　　　９−フルオレニルメトキシカルボニルＭｔｒ　　
　　　　４−メトキシ−２，３，６−トリメチルフェニ
ルスルホニル ＤＭＦ　　　　　　ジメチルホルムアミドＨｏＢｔ　　
　　ヒドロキシベンゾトリアゾールＤＴＴ　　　　　　
ジチオスレイトールＴｒｔ　　　　　　トリチル Ｐｍｃ　　　　　　２，２，５，７，８−ペンタメチル
クロマン−６−スルホニル

【００３２】実施例１ 免疫処置用抗原の製造 ａ）　　Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇの合成Ｆｍｏｃ
−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ｐ−アルコキシベンジルエステル
−樹脂１ｇをＤＭＦ　１５ｍｌで１分間、２回洗浄し、
Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）１５
ｍｌを用いて切断した（１×３分，１×１０分）。次に
樹脂各回ＤＭＦとイソプロパノール（各回１５ｍｌ）で
３回、ＤＭＦ　１５ｍｌで２回洗浄した。Ｆｍｏｃ−ア
ミノ酸１．５ｍｍｏｌとＨＯＢｔ２．２５ｍｍｏｌをＤ
ＭＦ　１５ｍｌに溶解して樹脂に加え、添加後ジクロロ
メタン中１Ｍジイソプロピルカルボジイミド溶液１．６
５ｍｌを加え、混合物を室温で１．５時間振盪した。ニ
ンヒドリン試験を用いて、反応が完結したか否かを試験
した。ついで樹脂を各場合ともＤＭＦまたはイソプロパ
ノール（各回とも１５ｍｌ）で３回洗浄し、新たなサイ
クルを開始した。最後のサイクルにはＢｏｃ−Ｃｙｓ（
Ｔｒｔ）を使用した。樹脂を各回１５ｍｌのイソプロパ
ノールおよびジエチルエーテルで洗浄し、高真空下に乾
燥した。樹脂１．９ｇをチオアニソール１ｍｌ、エタン
ジチオール１ｍｌおよびトリフルオロ酢酸１８ｍｌと、
室温で２時間撹拌し、濾過し、樹脂を３回、トリフルオ
ロ酢酸／ジクロロメタン（１：１）で洗浄し、濾液をエ
ーテル中で結晶化した。粗ペプチドをジエチルエーテル
で洗浄し、乾燥した。ペプチドをＲＳｅｐｈａｄｅｘ　
Ｇ２５上、０．５％酢酸を用いてクロマトグラフィーに
付した。収量：６４９ｍｇ。

【００３３】この生成物１００ｍｇを、逆相材料上調製
用ＨＰＬＣ装置を用いたクロマトグラフィーに付し、さ
らに精製した（０．１％アセトニトリル、勾配様式）。 ペプチドのプールを凍結乾燥した。収量４８ｍｇ。

【００３４】ｂ）　　接合体の製造 ＫＬＨ　２０ｍｇを０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ８．０に溶解し、γ−マレイミド酪酸のヒドロキシ
スクシンイミドエステル２ｍｇと１時間撹拌した。蛋白
質をＲＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　５０カラム（２×３０ｃ
ｍ）上クロマトグラフィーに付した（０．１Ｍリン酸ナ
トリウム，０．５０ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ６．０）。溶
出液を５ｍｌに濃縮し、ペプチド２０ｍｇと１時間イン
キュベートした。透析および凍結乾燥後、ペプチド接合
体２８ｍｇが得られた。

【００３５】実施例２ ウサギの免疫処置 ５羽のウサギを各場合とも動物あたり２ｍｇの抗原で８
週間にわたって免疫した。ペプチド−ＫＬＨ抱合体を皮
下および静脈内に投与した。ついで動物から採血し、得
られた粗抗血清を集め防腐剤で安定化した。動物あたり
収量１７５ｍｌ。

【００３６】実施例３ 免疫吸着剤の製造 粗血清のアティニティークロマトグラフィーによる精製
のためには、配列Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓ
ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇのデカ
ペプチド（例１ａのようにして製造）約３０ｍｇを固相
上に共有結合で固定化した。カップリング反応は、以前
に記載されている方法（Ａｘｅｎ，Ｒ　ら：Ｎａｔｕｒ
ｅ，　２１４：１３０２，１９６７）に従い、シアノー
ゲンブロミド−活性化　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　を用いて
行った。ついで免疫吸着剤をいずれの場合もリン酸緩衝
食塩溶液（ＰＢＳ；０．１５ｍｏｌ／ｌ，ｐＨ７．２）
および酢酸（０．５ｍｌ／ｌ，ｐＨ２．５）で洗浄した
。使用前に吸着剤をＰＢＳ中３倍容量のゲルで平衡化し
た。収量：ペプチド−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　約３０ｍｌ
。

【００３７】実施例４ 特異的抗体の単離 粗抗血清１００ｍｌをＰＢＳで平衡化したペプチド−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ３０ｍｌ（１．６×１５ｃｍ）に適用
し、ついで２８０ｎｍにおける吸収が０．０１になるま
でＰＢＳで洗浄した。ついで食塩水（１ｍｏｌ／ｌ，ｐ
Ｈ７．０）および水（ｐＨ７．０）を用いた洗浄工程を
、各場合とも３倍容量のゲルを用いて実施した。免疫吸
着剤から抗体を、酢酸（０．１ｍｏｌ／ｌ，ｐＨ２．５
）によって溶出し、抗体溶液を固体リン酸ナトリウム（
０．０１ｍｏｌ／ｌ）を用いてｐＨ７に調整し、濃縮し
（Ａｍｉｃｏｎ　膜）−７０℃に保存した。収量：抗体
約３５ｍｇ。

【００３８】実施例５ 免疫吸着で得られた抗体の試験 ａ）　　抗体皮膜チューブの製造例４で得られた抗体と
、Ｔｒｉｓ緩衝溶液（０．０２５ｍｏｌ／ｌ，ｐＨ７．
６）を用いて５μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、ポリスチレ
ンチューブに吸着させて固定化した。各チューブあたり
抗体溶液２５０μｌを加え、２０℃で２０時間インキュ
ベートし、ついで液体を吸引し、チューブを密閉して４
℃で保存した。

【００３９】ｂ）　　酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ
）の操作試験サンプルをインキュベーション緩衝液（５
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，１００ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％ア
ジド，ｐＨ７．２）を用いて１：１に希釈し、各場合と
もチューブあたり（例５ａ参照）２００μｌを加えて３
７℃で３０分間インキュベートした。ついでインキュベ
ーション溶液を除去し、チューブを各場合とも５００μ
ｌの洗浄溶液（０．０２ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム，
０．０５％Ｔｗｅｅｎ，ｐＨ７．６）で２回洗浄した。 次にペルオキシダーゼ接合抗組織因子抗体２００μｌを
加え、チューブを３７℃で３０分間インキュベートした
。接合体溶液を除去し、２回洗浄したのち、基質／発色
団溶液（過酸化水素：ｏ−フェニレンジアミン）２００
μｌを加えチューブを室温でインキュベートした。０．
５時間インキュベートしたのち、硫酸を用いてペルオキ
シダーゼを不活性化し、反応溶液の吸光度を４９２ｎｍ
で測定した。

【００４０】ｃ）　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　で形成したＶ
ｌｌａ因子／ＴＦ複合体の酵素イムノアッセイによる定
量ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　実験において、血漿にトロンボプ
ラスチン溶液を３７℃で１５０分間インキュベートした
。ついでサンプルをＰＢＳで１＋９に希釈し、生成した
Ｖｌｌａ因子／ＴＦ濃度をＥＬＩＳＡで定量した。以下
の表１に血漿サンプルの吸収値（４９２ｎｍ）をトロン
ボプラスチン添加時と添加後１５０分について示す。血
漿を加えないチューブの吸収を対照として使用した。

【００４１】

【表１】

【００４２】さらに別の実験で、Ｖｌｌａ因子に対する
抗体の特異性を試験した。クエン酸塩溶液で抗凝固処理
した血漿にトロンボプラスチン溶液を加え、混合物を３
７℃でインキュベートした。様々な時間にサンプルを採
取し、反応はクエン酸塩の添加により（最終濃度：０．
１５ｍｏｌ／ｌ）停止させた。サンプルをインキュベー
ション緩衝液を用いて１＋１に希釈し、ＥＬＩＳＡを用
いて試験した。

【００４３】表２に結果を示す。

【表２】 結果はＶｌｌａ因子／ＴＦ複合体がこの方法で定量的に
測定できることを示している。活性化反応時にＶｌｌａ
因子／ＴＦ複合体の濃度は時間とともに上昇する。

【００４４】Ｖｌｌ因子のアミノ酸配列と完全にまたは
部分的に同一で、抗原性を示すアミノ酸配列を含む本発
明のペプチドは、これらのペプチド中に存在する特定の
抗原性決定部位に対する結合特異的抗体を誘導する。こ
れらの特異的抗体はついで、同じ抗原決定部位を含有す
るペプチド上、免疫吸着によって精製できる。合成ペプ
チドの使用は絶対的に純粋な抗原が免疫処置に使用され
るので得られた抗血清中では、他の蛋白質またはＶｌｌ
因子分子の他の部分との交差反応性は全く生じないとい
う利点がある。本発明においては、Ｖｌｌ因子分子中の
Ｘａ因子切断部位のＣ−またはＮ−末端アミノ酸配列に
相当するペプチドが好ましい。このペプチドに対する抗
体を使用すれば、この抗体の認識配列には完全な天然の
Ｖｌｌ因子においては接近できないので選択的な、Ｖｌ
ｌ因子切断分子すなわちＶｌｌａ因子の検出が可能であ
る。結合した抗体の量をＥＬＩＳＡによって測定すれば
、形成されたＶｌｌａ因子またはＶｌｌａ因子／ＴＦ複
合体の直接的な定量化が可能で、したがってＶｌｌ因子
の活性化の程度を知ることができる。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ＶＩＩ因子および／またはＶＩＩａ因
   子の少なくとも一部のアミノ酸配列と同一で、抗原性で
   あるアミノ酸配列を含有する合成ペプチド。
2. 【請求項２】　　ＶＩＩ因子のＸａ因子切断から生じる
   ＶＩＩａ因子のカルボキシ末端もしくはアミノ末端と部
   分的に同一なアミノ酸配列を含有する請求項１記載の合
   成ペプチド。
3. 【請求項３】　　以下のアミノ酸配列 Ｈ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ
   −Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−
   Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌ
   ｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｃｙ
   ｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ
   −Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−
   Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａ
   ｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒ
   ｇ−ＯＨ　および／または配列Ｈ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇ
   ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙ
   ｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ
   −Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−
   Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇ
   ｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌ
   ｅ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ
   −Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−
   Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＨのすべてまたは
   一部、ただし少なくとも４個のカルボキシ末端および／
   またはアミノ末端アミノ酸を含有する請求項１記載の合
   成ペプチド。
4. 【請求項４】　　４個のカルボキシ末端（Ｐｒｏ−Ｇｌ
   ｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨ）および／またはアミノ末端
   （Ｈ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）アミノ酸を含
   有する請求項１記載の合成ペプチド。
5. 【請求項５】　　直接またはスペーサーを介して担体に
   カップリングされている請求項１記載のペプチド。
6. 【請求項６】　　遺伝子工学または化学的合成によって
   製造される請求項１記載のペプチド。
7. 【請求項７】　　請求項１記載のペプチドと免疫学的に
   反応する抗体。
8. 【請求項８】　　請求項１記載のペプチドによる動物の
   免疫処置、ついで請求項１記載のペプチドへの免疫吸着
   による精製によって得られる抗体。
9. 【請求項９】　　免疫吸着によって精製されたポリクロ
   ーナル抗体を得るための請求項１記載のペプチドの使用
   。
10. 【請求項１０】　　動物に免疫応答を発生させるための
    、請求項１および／または５記載のペプチドの使用。
11. 【請求項１１】　　請求項１記載のペプチドおよび／ま
    たは請求項７記載の抗体を使用することからなるＶＩＩ
    ａ因子またはＶＩＩａ因子／ＴＦ複合体を測定する診断
    方法。
12. 【請求項１２】　　抗体を固相に結合させ、第二の抗体
    には検出可能な官能性基を含有させる請求項１１記載の
    診断方法。
13. 【請求項１３】　　治療目的での、とくに血液凝固障害
    の治療のための、請求項１記載のペプチドおよび／また
    は請求項７記載の抗体の使用。