DK168710B1 - Monoklont antistof eller fragment deraf, immunogen, immunanalysefremgangsmåde til bestemmelse af glycosyleret nativt humant albumin, peptid samt immunanalysesæt - Google Patents

Description

DK 168710 B1

Den foreliggende opfindelse angår et monoklont antistof eller fragment deraf, et immunogen, en immunanalyse-fremgangsmåde til bestemmelse af glycosyleret albumin i en human blodprøve under anvendelse af det monoklone antistof 5 eller fragment deraf, et peptid samt et immunanalysesæt, der omfatter et antistof ifølge opfindelsen.

Bestemmelsen af albumins glycosylering i et individs blod er et anvendeligt mål for glucosekoncentrationskontrol hos diabetikere.

10 Albumin er det overvejende serumprotein i blod og har en halveringstid i kredsløbet på 10 dage. En ikke- enzymatisk glycosyleringsreaktion resulterer i cova* lent kobling af glucose til en lille procentdel albuminmolekyler hos alle individer. Eftersom den ikke-enzyma-15 tiske glycosyleringsrate afhænger af glucoses cirkulationsniveau, har diabetikere med et højere gennemsnitsniveau en forøgelse af glycosyleret albumin. Den diabetiske lidelses sværhedsgrad afspejles derfor i procentindholdet af glycosyleret albumin.

20 En analog reaktion finder sted mellem glucose og hæmoglobin og producerer hæmoglobin Alc plus andre glycosylerede hæmoglobiner. Hæmoglobin har en levetid på 120 dage, og bestemmelse af glycosylerede hæmoglobinværdier afspejler derfor det gennemsnitlige cirkulerende gluco-25 seniveau i denne periode, hvorimod en glycoalbuminbe-stemmelse repræsenterer et gennemsnitligt cirkulerende glucoseniveau i 10 dage. Betydningen af glycosylerede hæmoglobinværdier er i stort omfang blevet accepteret som klinisk afgørende for en nøjagtig bedømmelse af den 30 diabetiske lidelse. Det har været forholdsvis let at udvikle prøver for glycosyleret hæmoglobin, fordi hæmoglobinmolekylet er farvet og derfor let at mængdebestemme ved hjælp af billige spektrofotometre. Albumin er farveløst, og fremgangsmåder til mængdebestemmelse af 35 glycoalbumin kræver, at carbonhydratet derivatiseres til et farvet produkt, eller at glycoalbumins proteindel omsættes til fremstilling af et farvet produkt. Derfor DK 168710 B1 2 o findes der ingen glycoalbuminprøver i stor målestok i anvendelse på kliniske laboratorier for tiden.

Der har været foreslået an række glycoalbuminprøver i litteraturen. De vigtigste blandt disse er dem, 5 der er baseret på boronat-chromatografi og thiobarbitur-prøver. Boronat-chromatografimetoden omfatter en kolori-metrisk bestemmelse af bundet protein, f.eks. bundet til "Glycogel" fra Pierce Chemical Co. Ved denne prøve påføres serum på en boronat-affinitetskolonne, hvor alle 10 cis-diol-holdige stoffer (f.eks. glycoalbumin og andre glycoproteiner) bindes. Disse stoffer elueres derpå, og eluatfraktioner mængdebestemmes efter tilsætning af et farvestof, som reagerer med proteiner, der producerer et farvet produkt. De største ulemper ved denne metode 15 er, at mange ikke-albumin-proteiner i serum er glycoproteiner (f.eks. immunglobuliner), som derfor bindes_og måles ved boronat-chromatografiprøven;, kolonneprocessen omfatter flere trin til adskillelse og analyse og kan ikke let automatiseres; og der findes data, der tyder på, at glu-20 cose griber ind i boronatbindingen. Ved thiobarbiturprø-ven omdannes ketoamin-protein-adduktet til 5-hydroxyme-thylfurfural ved hydrolyse med oxalsyre, hvilket giver et farvet produkt. De største ulemper her er, at hydrolyse kræver 2-4 timer ved 100°C eller mere; baggrundfar-25 ve skal korrigeres; og for øjeblikkes findes der ingen standarder eller kalibratorer.

Glucoses reaktion med albumin indebærer (a) dannelse af en Schiff'sk base mellem glucosens C-l og en aminogruppe i albumin og (b) en Amadori-omlejring^der gi-30 ver et 1-deoxyfructosyl-carbonhydrat, der er koblet covalent med nitrogenet i aminogruppen. Albuminmolekylet har 60 potentielle steder (aminogrupper) til ikke-enzy-matisk glycosylering. Dette består af 59 epsilon-amino-grupper i lysinrester og én α-aminogruppe på proteinets 35 N-endestilling. Af de 60 potentielle steder vides kun én lysin at blive glycosyleret i det naturlige molekyle; 0 3 DK 168710 B1 imidlertid kan andre lysiner blive glycosyleret i forskelligt omfang. Det kendte lysin er blevet identificeret som lysin 525 (den 525'nde aminosyre, når der tælles af proteinets N-endestilling, Garlick m.fl., J. Biol.

5 Chem. 258, 6142 (1983)),og stillingen er blevet bekræftet her. Grunden til dette lysins specifikke glycosylering og albumins hurtige glycosylering er ikke fuldstændig klarlagt. Specificiteten for lysin 525 skyldes sandsynligvis (a) et tilstødende lysins nærhed i stilling 10 524, hvorved é-aminogruppens pKa i lysin 525 sænkes, hvilket gør det mere reaktivt i glycosyleringsreaktionen, (b) at lysin 525's sidekæde udsættes for albuminmolekylets vandige ydre, og/eller (c) albuminmolekylets 3-di-mensionale struktur, som ved en ukendt mekanisme forø-15 ger lysin 525's reaktivitet i glycosyleringsreaktionen.

Monoklone antistoffer har vist sig at have en præcis specificitet for binding med en række forskellige organiske forbindelser, herunder syntetiske peptider.

Til trods for denne teknik og et anerkendt behov for en 20 immunanalyse for glycoalbumin foreligger der dog indtil nu ingen rapporter om, at man er på vej til at opnå antistoffer, der kan anvendes til bestemmelse af glycoalbumin.

Følgende definitioner vil blive anvendt i be-25 skrivelsen med hensyn til aminosyreenheder i peptider.

Aminosyre Forkortelse

Arginin Arg

Asparaginsyre Asp 30 Glutaminsyre Glu

Lysin Lys

Serin Ser

Asparagin Asn

Glutamin Gin 35 Glycin Gly

Prolin Pro DK 168710 B1 4 o

Aminosyre Forkortelse

Threonin Thr

Alanin Ala

Histidin His 5 Cystein Cys

Methionin Met

Valin Val

Isoleucin Ile

Leucin Leu 10 Tyrosin Tyr

Phenylalanin Phe

Tryptophan Trp α-Aminosmørsyre Aba 15 Der er således opfindelsens formål at tilvejebrin ge et monoklont antistof, der er specifikt for binding med glycoalbumin, hvilket kan tjene som basis for en immunanalyse til bestemmelse af glycoalbumin i humane blodprøver. Der findes et bredt anerkendt, men hidtil udækket 20 behov for en sådan immunanalyse, der ville tilvejebringe et forholdsvis enkelt og pålideligt middel til bedømmelse af den diabetiske tilstand.

Det er især opfindelsens formål at producere et monoklont antistof, der bindes specifikt med humant 25 albumin, som glycosyleres i lysinresten i stilling 525, dvs. den 525nde aminosyre i peptidenkæden, når der tælles fra den ende, der har den frie N-endestillede amino-gruppe. Som udtrykket anvendes her refererer en glyco-syleret aminosyre til en aminosyre med en aminogruppe, 30 som er blevet modificeret med en 1-deoxyfructosyl-rest ved ikke-enzymatisk reaktion med glucose.

Den foreliggende opfindelse opfylder disse og andre formål og fordele ved at tilvejebringe en fremgangsmåde til opnåelse af somatiske cellehybridomer, som 35 udskiller monoklone antistoffer med den ønskede glyco-albumin-specificitet. Sådanne hybridomer dannes ud fra 5 DK 168710 B1 konventionelle fusioner mellem myelomceller og lymphocyt-ter fra et dyr, fortrinsvis en mus, som er blevet immuniseret med et immunogen bestående af et passende glyco-syleret peptid, der er kemisk bundet med et immunogent 5 bæremateriale. Det glycosylerede peptid i immunogenet fås syntetisk eller ved proteolyse og omfatter for det første en lysinrest, hvis £,-aminogruppe er glycosyle-ret ikke-enzymatisk, og for det andet mindst én anden aminosyreenhed i en stilling svarende til peptidsekven-10 sen i humant albumin, der støder op til lysinresten i stilling 525.

Det monoklone antistof eller fragment deraf ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det omfatter et antistof-kombinerende sted, som bindes specifikt til en epitop 15 i glycosyleret nativt humant albumin, hvilken epitop indeholder den glycosylerede form af lysinresten i stilling 525, og antistoffet eller fragmentet deraf er ifølge en foretrukken udførelsesform for opfindelsen ejendommelig ved, at det bindes specifikt til en glycosyleret peptidepitop 20 med formlen

Glyco-(NH) —AA]_-Lys-AA2— 25 hvor Glyco-(NH) er en ikke-enzymatisk glycosyleret e-amino-gruppe i lysinresten, og et af eller begge symbolerne AA^ og AA2 er en sekvens af aminosyrer, svarende til aminosyresekvensen i 30 humant albumin stødende op til lysinresten i stilling 525, og hvis kun den ene af ΑΑχ og AA2 er en sådan sekvens, er den anden en binding, en endestillet amino- eller carboxylgruppe eller yderligere amino-syrerester.

35 Yderligere foretrukne udførelsesformer for det mono- klone antistof eller fragment fremgår af krav 3's og 4's kendetegnende dele.

DK 168710 B1 6

Foruden de ovenfor beskrevne xnonoklone antistoffer, herunder fragmenter deraf, der omfatter et antistof-kombinerende sted, omfatter den foreliggende opfindelse også en immunanalysefremgangsmåde til bestemmelse af glycosyleret 5 albumin i en human blodprøve, såsom helblod, serum eller plasma. Ved fremgangsmåden kontaktes blodprøven med det monoklone antistof eller fragmentet deraf ifølge opfindelsen. Hvis det er nødvendigt eller ønskeligt, behandles blodprøven først for at denaturere eller på anden måde blotlægge epi-10 topen i lysin 525 i signifikant mængde for eventuelt glyco-albumin, der er til stede i prøven. Derefter bestemmes bindingen af antistofreagenset med glycosyleret albumin fra prøven ved hjælp af en hvilken som helst gængs immunanalyse-protokol som en funktion af glycoalbuminmængden i den ana-15 lyserede prøve, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er således ejendommelig ved det i krav 6's kendetegnende del angivne. Den foreliggende opfindelse angår også nye og anvendelige peptider og glycosylerede former deraf fremstillet syntetisk eller ved proteolyse af glycoalbumin eller ikke-20 -glycosyleret albumin, der kan tjene som peptidrest i det her omhandlede immunogen, eller som er precursorer derfor.

Immunogenet ifølge opfindelsen er som angivet i krav 5, og peptiderne ifølge opfindelsen er defineret i krav 8 og 9.

25 På tegningen viser fig. 1 og 2 nogle af de foretrukne glycosylerede peptidfragmenter eller rester, der kan bindes med et gængs immunogent bæremateriale til dannelse af et immunogen, der kan anvendes ved den foreliggende opfindelse. Strukturerne (1) og (2) viser hhv.

30 glycoalbumins partielle sekvens i lysin 525's region og spaltningsstederne for de proteolytiske enzymer trypsin (udfyldte trekanter) og V8-protease (blanke trekanter). Stjernen over lysin 525 viser stedet for in vivo-glyco-sylering. Strukturerne (3)-(12) viser peptidfragmenter, 3^ som kan fremstilles syntetisk. Stjernerne ud over ved lysin 525 viser steder for potentiel yderligere glyco- 7 DK 168710 B1 sylering under in vitro-syntese. Sekvenserne vises på tegningen, og også i beskrivelsen, fra N-endestilling til venstre til C-endestilling til højre. Yderligere detaljer og forklaringer findes i nedenstående eksempler.

5 Det monoklone antistof ifølge opfindelsen er i hovedsagen ejendommeligt ved sin. specificitet for binding af den glucosylerede peptidsekvens i lysin 525's region i humant albumin. Denne glycosylerede rest er glycoalbumins karakteristiske strukturelle træk. Et an-10 tistof ifølge opfindelsen kræver et epitop- eller determinantsted omfattende i det mindste den med 1-deoxy-fructosyl modificerede lysinenhed dannet efter Amadori--omlejring af produktet af reaktionen mellem glucose og 6--aminogruppen i lysin,samt en peptidsekvens, der stræk-15 ker sig derfra omfattende mindst én af aminosyreenheder-ne i stillingen, der svarer til glycoalbuminsekvensen, der støder op til lysin 525. De andre aminosyreenheder i peptidsekvensen, der er ejendommelige for epitopen, kan være ens eller forskellige som dem, der forekommer 20 i den naturlige glycoalbuminsekvens. På denne måde er epitopen ejendommelig ved at bestå af en carbonhydrat-og peptid-sekvens, hvortil antistoffet bindes, og er unik for den glycolyserede lysin-525-sekvens i glyco-albumin. Fortrinsvis bindes antistoffet specifikt med 25 en glycosyleret peptidrest med formlen som angivet i det foregående, jf. også krav 2's kendetegnende del.

Fortrinsvis er en af eller både AA^ og AA2 en sekvens på fra 1 til 12 aminosyrer, som svarer nøjagtigt til amino-syresekvensen, der støder op til lysinresten i glycoalbumins 30 stilling 525.

Glycoalbumins sekvens omfattende 12 aminosyrer på hver side af lysin 525 er som følger (i retningen fra N-endestilling til C-endestilling: 35 DK 168710 B1 8 — Ile-Cys-Thr-Leu-Ser-Glu-Lys- -Glu-Arg-Gln-Ile-Lys-Lys(525)- -Gln-Thr-Ala-Leu-Val-Glu-Leu- -Val-Lys-His-Lys-Pro— 5 Særlig foretrukket bindes det monoklone antistof ifølge opfindelsen specifikt med aminosyrerester med formlen (A) ovenfor, hvor AA^ og AA2 er valgt blandt 10 AA^: -Lys-Glu-Arg-Gln-Ile-Lys-, -Glu-Arg-Gln-Ile-Lys-, -Arg-Gln-Ile-Lys-, -Gin-Ile,Lys-, 15 -Ile-Lys-,

Lys- eller en binding, og AA^: -Gln-Thr-Ala-Leu-Val-G-lu--Gln-Thr-Ala-Leu-Val--Gln-Thr-Ala-Leu-2Q -Gln-Thr-Ala- -Gln-Thr- -Gln-, eller en binding.

Til fremstilling af antistoffer ifølge krav 1 kobles 25 et fragment af proteinkæden svarende til den naturligt forekommende glycosylerede peptidsekvens med en bærer og injiceres i et forsøgsdyr for at fremkalde en immunreaktion. Lymphocytter, såsom miltceller, fra det immuniserede dyr fusioneres med myelomceller til fremstilling af hybridomer, 30 som dyrkes og screenes for produktion af monoklone antistoffer. De monoklone antistoffer screenes for dem, der er selektive over for den glycosylerede peptid-epitop, og den bestemte cellelinie klones til brug ved fremstilling af yderligere mængder af det monoklone antistof. Gennemgang af 35 sådanne monoklone antistofmetoder findes hos Melchers m.fl., Lymphocyte Hybridomas, Springer-Verlag, New York, (1978), 9 DK 168710 B1

Nature 266, 495 (1977), Science 208, 692 (1980), og Methods in Emzymology 73 (del B) 3-46 (1981).

Til fremstilling af et passende immunogen til injektion i forsøgsdyr, f.eks. BALB/c-mus, rotter eller 5 lignende, skal der enten fremstilles og isoleres et gly-cosyleret albuminfragment fra naturligt forekommende humant albumin eller glycoalbumin, eller det skal syntetiseres kemisk og renses. Det glycosylerede peptidfragment, der kan anvendes ved den foreliggende opfindelse, 10 og dets ikke-glycosylerede former eller precursorer har formlen (QNH) (NH,) (Cys) -(Tyr) -AA -Lys-AA -(Tyr)s-(Cys)t(C00H) (B) 15 hvor mindst ét af symbolerne AA^ og AA2 er en sekvens på fra 1 til 12 aminosyrer svarende til peptidsekvensen, der støder op til lysin 525 i humant albumin, og hvis kun et af symbolerne AA^ og AA2 er en sådan sekvens, er 20 den anden en binding, q og t er hver 0 eller 1, r og er hver 0, 1 eller 2, QNH er £ -aminogruppen i lysin, og Q er 1-deoxyfructosyl, og den N-endestillede aminogruppe i (NH2)AA^ og eventuelle lysinenheder i AA^ eller AA2 kan være glycosylerede eller ikke-glycosylerede. Fortrinsvis er 25 Q den eneste glycosylering i fragmentet. Hvis et af symbolerne q og t er 1, er det andet normalt 0, og når endvidere q eller t er 0, så er r eller s også 0.

Ved en foretrukken udførelsesform isoleres glycoalbumin fra humant blod og spaltes med et passen-30 de protease-enzym eller -enzymer, så at der fås peptid-fragmenter med en bekvem størrelse omfattende glycosyle-ret lysin 525 og de tilstødende aminosyrer. Da albumin i det væsentlige er resistent over for proteolyse i sin naturlige udformning, er det i reglen nødvendigt at de-35 naturere proteinet i det omfang, der er nødvendigt, for at den ønskede proteolyse kan finde sted. De opnåede o DK 168710 B1 10 glycopeptidfragmenter isoleres ved gængse metoder, såsom chromatografi på geler med selektiv affinitet for car-bonhydrat-rester og højtydende væskechromatografi (HPLC). Fremstilling af ikke-glycosylerede peptidfragmenter ved 5 spaltning af ikke-glycosyleret albumin med efterfølgende glycosylering af fragmenterne er også mulig, men klart meget mindre ønskelig på grund af muligheden for glycosylering i steder ud over lysin-525, f.eks. andre lysin-enheder og den N-endestillede aminogruppe. De foretruk-10 ne glycosylerede peptidfragmenter, der fremstilles ved proteolyse af humant albumin, er

QNH

(NH2)Lys-Gln-Thr-Ala-Leu-Val-Glu-Leu-Val-Lys (COOH) og 15 QNH

. (NH2) Arg-Gln-Ile-Lys-Lys-Gln-Thr-Ala-Leu-Val-Glu(COOH) 2o hvor Q er 1-deoxyfructosyl. Kemisk syntese kan også anvendes til fremstilling af peptidfragmenter med den ønskede sekvens ved hjælp af gængse metoder og ved anvendelse af peptidsyntese-anlæg på markedet. Efter peptidsyntese glycosyleres det opnåede peptid under passende 25 betingelser, f.eks. glucose-mættet pyridin eller gluco-se-mættet pyridin/eddikesyre = 1:1 i 48 timer ved stuetemperatur. Under en sådan in-vitro-glycosylering kan den N-endestillede aminogruppe og £-aminogrupperne i alle lysinenheder i det bestemte peptid^ herunder og 30 foruden den, der svarer til lysin' 525, glycosyleres.

En sådan yderligere glycosylering kan under immunisering tolereres forskelligt af dyret, der ikke reagerer specifikt med hensyn til en sådan glycosylering, på grund af en sådan glycosylerings fjerne beliggehed eller 35 dens orientering i peptidfragmentet, eller den kan fjernes selektivt, f.eks. ved protease-spaltning af en o 11 DK 168710 B1 eller flere endestillede aminosyrer, især den potentielt glycosylerede N-endestillede aminosyre. De foretrukne glycosylerede og ikke-glycosylerede peptidfragmenter der fremstilles ved peptidsyntese, er 5 * (QNH) (NH2)AAg-Gln-Ile-Lys-Lys-Gln-Thr-Ala-Leu-Val--Tyr-AA4(C00H), * (QNH) (NH2)AA4-Glu-Arg-Gln-Ile-Lys-Lys-Gln-Thr-Ala--Leu(COOH), * (QNH) (NH^)Gln-Ile-Lys-Lys-Gln-Thr-Ala-Leu-Val-Glu--Leu-AA4(COOH), * (QNH)

15 * I

(NH2)AA5-Gln-Ile-Lys-Lys-Gln-Thr-Ala-Leu-Val- -Glu (COOH) (QNH) (NH2)AAg-Lys-Gln-Thr-Ala-Leu-AA^(COOH), 99·' (QNH) 20 * i (NH^AAg-Arg-Gln-Ile-Lys-Lys-Gln-Thr, hvor Q er 1-desoxyfructosyl, ΑΑ^ er Lys-Glu-Arg, Arg eller en binding, 25 AA4 er Cys eller en binding, AA- er Arg eller en binding, ik. 4* Φ AAg er Gln-Ile-Lys, Ile-Lys, Lys eller en binding, AA^ er Tyr-Tyr-Cys, Tyr-Cys, Cys eller en binding, AAg er Cys-Tyr-Tyr, Cyr-Tyr, Cys eller en binding, 30 og hvor den N-endestillede aminogruppe og eventuelle Lysenheder i peptidet er glycosylerede eller ikke-glycosylerede. I de mest anvendelige glycosylerede peptider med ovenstående formler er Q 1-deoxyfructosyl, og den N-endestillede aminogruppe og eventuelle andre Lys-enheder er 35 ikke-glycosylerede.

0 12 DK 168710 B1

Der fås en mere specifik glycosylering af lysinet, der svarer til lysin 525> ved kombinationer af opløsnings- og fast-fase-peptidsyntese koblet med med a-amino-bloke- eret £-amino-l-deoxyfructosyl-lysin. Ved denne syntese fremstilles AA0-(Tyr) -(Cys) -(COOH) ved konventionel 5 ^ Γ ^ syntese. Lysin (med ct-amino blokeret C -deoxyfructosyl--lysin) fremstilles separat og kobles ved hjælp af klassisk opløsningsfase-kemi med et sådant peptids aminoende-stilling, hvilket giver 10

QNH

(B)-Lys-AA2-(Tyr)g-(Cys)(COOH) hvor B er en blokerende gruppe på lysins a-aminogruppe, såsom tert.butyloxycarbonyl (t-BOC), dinitrophenyl (DNP),

1 O

p-fluorenylmethoxycarbonyl (fMOC) eller andre egnede blokerende grupper, der kan fjernes uden at ændre QNH--Lys (1-deoxyfructosyl-lysin). Den blokerende gruppe kan fjernes ved særlige former for kemi (baseret på den 20 særlige blokerende gruppe), som ikke ændrer lysin 1-de-oxyfructosyl-struktur. Dette peptid kan anvendes direkte som immunogen eller ved en immunanalyse eller kan forlænges ved tilføjelse af NH2-(Cys) -(Tyr) -AA^, hvorved fås ^

25 QHN

NH--(Cys) -(Tyr) -AA.-Lys-AA«-(Tyr) -(Cys) -(COOH) 2 q £ 1 Z 5 £

Tilføjelsen kan ske ved en trinvis forlængelse ved hjælp 30 af klassisk opløsnings- eller fast-fase-peptidsyntese eller ved hjælp af en segment-kondensation, hvor forud dannet NH2(Cys) -(Tyr)r~AA^ kondenseres på S.

QHN-Lys-AAl-(Tyr) -(Cys)t~(COOH) hvilket giver slutproduktet.

35 0 13 DK 168710 B1

Introduktionen af endestillede Cys-enheder muliggør selektiv kobling af peptidet på immunogene bærematerialer, såsom ved bifunktionelle bindingsmidler, der er kendt, f.eks. m-maleimidobenzoyl-N-sulfosuccinimide-5 stere (MBS). Alternativt kan peptidfragmenterne kobles via den C-endestillede carboxylgruppe ved hjælp af gængse peptid-kondensationsmetoder, f.eks. carbodiimidkoblings-reagenser, Andre sammenbindingsmetoder, der er kendt, kan også anvendes.

10 Man vil i reglen også foretrække at indføre én, to eller flere Tyr-enheder enten som endestillede enheder på peptidet eller op til den albumin-specifikke sekvens og/eller den endestillede aminosyre, der anvendes til kobling af peptidet med immunogene bærematerialer, 15 f.eks., ved siden af_en endestillet Cys-enhed. Tilstedeværelsen af Tyr-enheder i peptid-restens ikke-specifikke region menes at forøge immunogeneiciteten hos pepti-dets glycosylerede specifikke region, hvorved antistofresponset stimuleres.

20 Ved særlig foretrukne udførelsesformer vil AA1 og AA2 i formlerne derfor hhv. begynde med sekvensen Cys-(Tyr) - og slutte med sekvensen -(Tyr) -Cys, hvor r og s er hele tal fra 1 til op til 10 eller mere, for-trinsvis 1 eller 2.

25 Det immunogen, der anvendes til at stimulere produktion af passende immunglobuliner i den mest crene-relle betydning, vil omfatte én eller flere af de glycosylerede peptid-rester kemisk bundet med et immunogent bæremateriale. Den almene formel for et sådant immuno- 30 gen er

Glyco-(NH) bærer __r —aa. -Lys-AA —R - - bærer (C)

m m 1 2 £ O

L Jp hvor Glyco-(NH), AA^ og AA2 er som tidligere defineret, 35 0 14 DK 168710 B1 forudsat at AA^ og AA£ kan være endestillede amino- eller carboxylgrupper, når m eller £ er 0, R er en binding eller forbindelsesgruppe, bærer er et immunogent bæremateriale, 5 et af symbolerne m_og n^er 1, og det andet er 0, og £ er gennemsnitlig 1 til antallet af tilgængelige koblingssteder på bæreren, og resterne AA^ og AA2 kan omfatte Tyr- og Cys-enheder som omtalt ovenfor.

10 Det immunogene bæremateriale kan vælges blandt dem, der almindeligvis vides at have funktionelle grupper, der er til rådighed for kobling med den glycosylerede peptid-rest. I de fleste tilfælde vil bæreren være et protein eller et polypeptid, men også andre materialer kan 15 anvendes, såsom carbonhydrater, polysaccharider, lipo-polysaccharider, nucleinsyrer og lignende5med tilstrækkelig størrelse og immunogenicitet. For det meste har immunogene proteiner og polypeptider en molekylvægt mellem 4.000 og. 10.000.000, fortrinsvis over 15.000 og i 20 reglen over 50.000. I reglen vil proteiner, der tages fra den ene dyreart, være immunogene, når de indføres i blodbanen på en anden art. Særlig anvendelige proteiner er albuminer, globuliner, enzymer, hæmocyaniner, gluteliner, proteiner med signifikante ikke-proteinagti-25 ge bestanddele og lignende. Yderligere omtale af teknikkens stade vedrørende gængse immunogene bærematerialer og metoder til kobling af haptener dermed kan findes følgende steder: Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, 30 New Jersey, USA) (1976) ; Butler, J. Immunol. Meth. 7, 1-24 (1976); Broughton og Strong, Clin. Chem. 22, 726-732 (1976), Playfair m.fl., Br. Med, Bull. 30, 24-31 (1974) og Weinryb og Shroff, Drug Metab. Rev. 10, 271-283 (1974).

Bogstavet jd i formlen C repræsenterer det an-35 tal glycosylerede rester, som er konjugeret med bæreren, dvs. immunogenets epitopiske densitet, og vil ligge fra 0 15 DK 168710 B1 1 til antallet af tilgængelige koblingssteder på bæreren og kan være helt op til 5000, når det drejer sig om visse syntetiske polypeptider med høj molekylvægt , såsom po-lylysin. Den epitopiske densitet på en bestemt bærer 5 afhænger af bærerens molekylvagt og densiteten af tilgængelige koblingssteder. Optimale epitopiske densite-' ter, under hensyn til en bekvem og reproducerbar syntese af immunogenet og antistofresponset, ligger mellem ca.

10% og ca. 50% af de til rådighed stående koblingsgrup-10 per på den pågældende bærer.

Forbindelsesgruppen R kan være så godt som enhver bekvem og stabil struktur. En sådan forbindelsesgruppe R forekommer i reglen i form af en binding eller en aliphatisk kæde omfattende mellem 1 og ca. 20 atomer, 15 undtagen hydrogen, og omfattende heteroatomer, såsom nitrogen, oxygen og svovl. Den glycosylerede rest kan sammensættes ved en række forskellige grupper til dannelse af forbindelseskæden R, herunder methylen, ether, thioether, imino og lignende. Fagmanden har en række 20 forskellige forbindelsesgrupper, som han kan vælge imellem ved fremstilling af immunogenet. I reglen fremstilles det glycosylerede peptid, så at det ender med en funktionel gruppe, såsom amino, carboxyl, thiol, hydroxyl eller maleimido, som er aktive under en koblingsreak-25 tion med en passende gruppe i bærermolekylet.

Særlig foretrukne immunogener med formlen C er sådanne, hvor (a) AA^ er en endestillet aminogruppe, AA2 er Gln-Thr-Ala-Leu-Val-Glu-Leu-Val-Cys, m er 0, og er 1, 30 (b) AA^ er (NH2)Arg-Gln-Ile-Lys, AA2 er Gln-Thr-

Ala-Leu-Val-Glu, m er 0, og n er 1, r*r . r' ψ (c) AA^ er (NH2)Lys-Glu-Arg-Gln-Ile-Lys, AA2 er Gln-Thr-Ala-Leu-Val-Tyr-Cys, m er 0, og β. er 1, (d) AA^ er Cys-Glu-Arg-Gln-Ile-Lys, og AA2 er 35 Gln-Thr-Ala-Leu(COOH), m er 1, og n er 0, hvor Lys er en glycolyseret eller ikke-glycolyseret lysinenhed, o 16 DK 168710 B1 (e) AA^ er Gln-Ile-Lys, Ile-Lys, Lys eller en endestillet aminogruppe, AA2 er Gln-Thr-Ala-Leu-Tyr-Tyr-Cys, i er 0, og n er 1, *\Λ (f) AA1 er Cys-Tyr-Tyr-Arg-Gln-Ile-Lys, AA2 er c Gln-Thr, m er 1, og n er 0.

Det antistof, der vælges til brug ved en immunanalyse, kan være af en hvilken som helst immunglobu-lin-klasse, f.eks. IgG, IgM osv. og af enhver underklasse heraf. I reglen vil antistoffet være af IgG-klassen, 10 og om ønsket kan et hvilket som helst fragment af et sådant antistof anvendes,når det blot indeholder et antistof-kombinerende sted, f.eks. Fab, F(ab') og Fiab'^·

Det valgte antistofreagens kan anvendes ved enhver immunanalysemetode med henblik på at bestemme glycoalbu-15 min i en biologisk væske. Sådanne immunanalysemetoder omfatter de mere klassiske metoder, såsom immundiffusion, immunelektrophorese, agglutineringsmetoder og komplementbinding samt mere aktuelle metoder omfattende anvendelse af specifikt påviselige mærkestoffer, såsom radioimmunana-20 lyse og ikke-radioisotope metoder. De sidstnævnte metoder kan praktiseres ved hjælp af en lang række forskellige systemer, såsom konkurrerende binding, hvor et mærket reagens bringes til at konkurrere med den glycosylerede analyt om binding med antistofreagenset. Den mængde mær-25 ket reagens, der er bundet til antistofreagenset, eller den frie type, der består af det mærkede reagens, der ikke er således bundet, måles på passende måde og kan relateres funktionelt til mængden af glycosyleret analyt i prøven.

30 Ved radioimmunanalyser skal man kunne skelne fysisk mellem den frie type og den bundne type, eller de skal kunne adskilles for at måle mærkestoffet, eftersom det signal, der dannes af mærkestoffet, kvalitativt er det samme hos begge typer. En sådan metode er kendt 35 på området som heterogen på grund af kravet om faseadskillelse. Der kendes andre heterogene immunanalysemetoder, herunder enzym-mærkede immunanalyser, undertiden o 17 DK 168710 B1 kaldet ELISA-metoder (jfr. USA patentskrift nr.

3.654.090) og fluorescerende immunanalyser (jfr. USA patentskrifterne nr. 4.201.763, 4.133.639 og 3,992,631), især fluorescerende partikelkoncentrationsimmunanalyser 5 (jfr. offentliggjort Europa-patentansøgning nr. 124.050).

For ikke så længe siden er der blevet udviklet talrige immunanalysemetoder, der undgår adskillelsestrinnet ved anvendelse af et mærkestof, hvis påviselige signal moduleres, efter at det mærkede reagens er bundet 10 af en bindingspartner, f.eks. antistof. Sådanne metoder er blevet kendt som homogene og kan med fordel anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse, fordi der ikke kræves adskillelser, og radioisotoper ikke er involverede. Nogle andre metoder af denne type er fluore-15 scensdæmpning og -forstærkning (jfr. USA patentskrift nr. 4.160.016), energioverførsels-immunanalyse (jfr.

USA patentskrift nr. 3.996.345) og dmmunanalysen med dobbelt antistof-sterisk hindring (jfr. USA patentskrifter-ne nr. 3.935.074 og 3.998.943). Særlig foretrukne homo-20 gene immunanalysemetoder er dem, ved hvilke der anvendes et mærkestof, som deltager i en enzym-katalyseret reaktion. Eksempler er substrat-mærket immunanalyse (jfr.

USA patentskrift nr. 4.279.992 og engelsk patentskrift nr. 1.552.607), den med en prosthetisk gruppe(FAD) mær-25 kede immunanalyse (jfr. USA patentskrift nr. 4.348.565), den med enzym-modulator mærkede immunanalyse, f.eks. ved hjælp af inhibitor-mærkestoffer (jfr. USA patentskrifter nr. 4.134.972 og 4.273.866) og enzym-mærket immunanalyse (jfr. USA patentskrift nr. 3.817.837) .

30 De raonoklone antistoffer ifølge opfindelsen er specifikke for binding med den glycosylerede peptidrest, der omfatter lysin 525 i humant albumin. Det kan i nogle tilfælde være nødvendigt^ eller det kan være særlig ønskeligt for at forbedre analyseeffektiviteten at eksponere 35 den glycosylerede lysin-525-epitop i det naturlige albuminmolekyle for at udføre den ønskede immunanalyse. Ste- 0 18 DK 168710 B1 risk adgang til epitopen kan opnås på en hvilken som helst effektiv måde. Blotlæggelse af epitopen i det intakte protein skal forstås udført ved hjælp af en fysisk eller kemisk denaturering eller fordøjelse i det mindste 5 i epitopens region. En sådan denaturering eller fordø-· jelse kan lokaliseres til epitopens region eller kan indebære en mere almen eller endog i det væsentlige komplet denaturering af proteinets tertiære og yderligere sekunf dære struktur eller partiel eller komplet fordøjelse af 10 proteinet.

Når det er nødvendigt eller ønskeligt, kan denaturering ske på en række forskellige måder, herunder konventionel behandling af proteinet ved hjælp af fysiske midler, såsom varme, lydbølgebehandling, højt eller 15 lavt pH og, som det foretrækkes, kemisk denaturering ved samspil med et chaotropt middel eller chaotrop i opløsning. Anvendelige chaotrope midler omfatter i reglen, uden begrænsning, guanidin, urinstof og forskellige detergenter, såsom natriumdodecylsulfat (SDS) og andre, u-20 den begrænsning, herunder deoxycholat og visse galdesure salte, 3-(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio-l-propan-sulfonat, organiske opløsningsmidler, såsom methanol, propanol, acetonitril^og visse salte, såsom kaliumthiocyanat. Ikke-ioniske detergenter, såsom "Triton X-100", nonidet-25 NP-40 og octyl-glucosider, kan også fungere som protein- -denatureringsmidler. Inkludering af reagenser (f.eks* mereaptoethanol eller dithiothreitol), som reducerer'di-sulfidbindinger, kan være effektive promotorer for denatureringsprocessen. Proteindenaturering kan i reglen 30 foretages på den mest effektive måde, hvis der anvendes kombinationer af kemiske og/eller kemiske og fysiske midler (f.eks. guanidin og varme, guanidin og SDS, eller guanidin og dithiothreitol). Naturligvis bør man undgå denatureringsbetingelser, der resulterer i væsentlig uop-35 løseliggørelse, aggregering eller fældning af proteinet, således at kun en ubetydelig mængde af den eksponerede 19 DK 168710 B1

C

epitop er tilgængelig for opløsning med henblik på antistofbinding. Der skal være en tilstrækkelig mængde denatureret protein tilbage i opløsning eller suspension for at opnå en anvendelig immunbinding. Graden af oplø-. seliggørelse, der er nødvendig, afhænger af omstændig hederne med hensyn til den tilsigtede eller ønskede virkning.

Opfindelsen vil i det følgende blive belyst ved hjælp af eksempler, der ikke skal fortolkes som be-1C crænsende.

Eksempel 1

Isolering af naturligt forkommende albumin og glycoalbumin Helblod fra en normal human donor opsamles i 15 en citrat/dekstrose-opløsning og adskilles i røde blodlegemer og plasma ved hjælp af centrifugering. Plasmafraktionen chromatograferes på en 100 ml boronat/agarose--kolonne (“Glycogel", Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) i 0,25 M ammoniumacetat, 50 mM MgCl2, pH 8,0.

20 Den bundne fraktion (indeholdende hovedsagelig glycoalbumin og immunglobuliner) elueres med 0,1 M Tris, 0,2 M sorbitol og 10 mM EDTA, pH 8,0. For at skille glycoalbumin fra immunglobuliner dialyseres den bundne fraktion i 50 mM natriumphosphat, pH 8,0, og fyldes på en 100 ml 20 DEAE-"Affi-gel-blue"-kolonne (Bio-Rad Laboraotires, Rich mond, CA, USA). Kolonnen elueres med 50 mM natriumphos-phat-puffer, pH 8,0, indeholdende en gradient af 0-1,4 M NaCl. Eluatet monitoreres ved 280 nm, og glycoalbuminet identificeres ved hjælp af SDS-polyacrylamid-gel-elekto-30 phorese. Ved nogle eksperimenter chromatograferes plasmaet på DEA£-"Affi-gel-blue" før "Glycogeln-kolonnen. Adskillelsesrækkefølgen påvirker ikke albuminet eller glycoalbuminets endelige renhed.

Ikke-glycosyleret albumin renses fra den af 35 "Glycogel" ikke-bundne fraktion, som derefter fraskilles på en DEAS-"Affi-gel-blue"-kolonne som ovenfor. Albumi- 0 20 DK 168710 B1 net og glycoalbuminet dialyseres i phosphatpufret saltvandsopløsning (PBS, 7,2 mM Na2HP0^, 2,8 mM NaH2?0^ og 127 mM NaCl, pH 7,4) indeholdende 0,05% natriumazid, lyo-philiseres og opbevares ved -80°C indtil videre anvendelse.

5

Eksempel 2

Dannelse og isolering af enzymatisk spaltede glycopepti-der fra glycoalbumin

Humant serumalbumin har 59 lysin-rester, hvor-10 af én er det primære glycosyleringssted i det naturlige molekyle. For at fremstille et peptid, der indeholder det glycosylerede lysin (i stilling 525) anvendes en kendt proteinsekvens i albumin koblet med den unike specificitet hos de to proteaser trypsin og Staphylococ-15 cus aureus V8-protease. Trypsin spalter peptidbindingen på carboxysiden i lysin og arginin, men spalter ikke på carboxylsiden af et glycosyleret lysin. Staph. V8 spalter på carboxylsiden i asparagin- og glutaminsyre. Derfor vil en tryptisk fordøjelse eller en V8-fordøjelse 20 producere de respektive peptider indeholdende det glycosylerede lysin i stilling 525 (jfr. strukturerne (1) og (2) på tegningen - de udfyldte og blanke trekanter viser spaltningsstederne for hhv. trypsin og V8-protease).

I sin naturlige udformning er albumin i det 25 væsentlige resistent over for proteolyse. For på optimal måde at eksponere proteinet for proteaserne denatureres glycoalbumin i 8 M urinstof, 5 mM dithiothreitol (DTT) og 0,1 M ammoniumbicarbonat, pH 7,85, i 2 timer ved omgivelsernes temperatur. Den denaturerede proteinopløs-30 ning sættes langsomt til 0,1 M ammoniumbicarbonat, pH 7,85, indeholdende et forhold på 1:50 (vægt af enzym: vægt af glycoalbumin) protease:protein. Den resulterende endelige urinstofkoncentration er 0,8 M, og opløsningen holdes ved 37°C i 16 timer. Derpå tilsættes 35 enzym (svarende i vægt til den første tilsætning), og opløsningen inkuberes i 8 timer. Opløsningen påføres på o 21 DK 168710 B1 en boronat-"Affi-gel 601"-kolonne (BioRad, Richmond, CA, USA) for selektivt at binde de carbonhydrat-holdige peptider. Kolonnen vaskes omhyggeligt i 50 mM ammoniumbi-carbonat, og de bundne peptider elueres med 0,1M eddike-5 syre. De eluerede peptider tørres, resuspenderes i 20 mM kaliumphosphat, pH 7,0, og injiceres på en "Altex-ODS" (4,1 mm x 25 cm) HPLC-kolonne (Rainin, Emeryville, CA, USA). En gradient på 1% acetonitril/minut til en slut-koncentration på 60% acetonitril i ovennævnte puffer 10 anvendes til at eluere de bundne komponenter. Fraktioner opsamles, tørres og hydrolyseres under argon i 24 timer i 6N HCl indeholdende 0,02% phenol. Hydrolysa-terne tørres og analyseres ved hjælp af en OPA-præko-lonne-derivatiseringsmetode [Benson og Hare, Proc. Natl.

15 Acad. Sci. 72, 619-622 (1975)] og adskillelse af amino- syre/OPA-addukter på HPLC "C-18"-kolonne (Supelco, Belle-fonte, PA, USA). Aminosyrer identificeres og mængdebestemmes ved sammenligning med kendte standarder ("Standar H", Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA).

20 De forventede og fundne værdier for tryptiske og V8--peptider ses i tabel I.

25 30 35 DK 168710 B1 0 22

Tabel I

Staph-V8-Protease-peptid 5

Aminosyre Forventet Fundet GLU 3 3,1 THR 1 1.0 ARG 1 1.2 • / ALA 1 1,0 10 VAL 1 1.0 ILE 1 0,7 LEU 1 1,0 LYS 2 1,9 15 Tryptisk peptid

Aminosyre Forrentet Fundet.

GLU 2 2,1 THR 1 1,0 20 ALA 1 1,2 VAL 2 1,8 LEU 2 2,0 LYS 2 2.)0 25 30 35 0 23 DK 168710 B1

Eksempel 3

Kobling af proteolytisk spaltede glycopeptider med bærerprotein

Den C-endestillede carboxylsyre aktiveres se-5 lektivt og kobles med aminerne i bærerproteiner [Cell 34 587-596 (1983)]. 2 mg EDCI [l-ethyl-3-(3-dimethylamino- propyl) -carbodiimid, Pierce Chemical Co.] i 200^uliter Ο,ΟΙΝ HC1 sættes til 2 mg af det tørre glycopeptid fra eksempel 1. Denne opløsning sættes hurtigt til 6 mg 10 nøglehuls-klæberhæmocyanin (KLH) i 2 ml vand, hvilket resulterer i et bundfald. Opløsningens pH hæves til 9,0 med 0,1 mM ammoniumcarbonat, omrøres i 3 timer og dialyseres derpå mod PBS. Thiobarbitursyreprøven[Fluc-kinger og Winterhalter, FEBS Letters 71, 356-360 (1976) 15 viser mindst to carbonhydrater/molekylvægt 100.000 af KLH med fructose som standard.

Eksempel 4

Kemisk syntese af albuminpeptider 20 (a) Peptider syntetiseres på Applied Biosystems "430A Peptide Synthesizer" (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Den carboxylendestillede aminosyre kobles med harpiksen ved hjælp af en phenylacetamidomethylbinding 25 med en substituering på 0,7 mmol pr. g harpiks. Typisk produceres 0,5 mmol peptid pr. syntese. Det N-endestil-led t-BOC fjernes med 60% trifluoreddikesyre (TFA) i di-chlormethan (DCM), og α-aminen neutraliseres med 10% diisopropylethylamin i dimethylformamid (DMF). t-BOC-a-30 minosyrer (2 mmol) omdannes til præformede symmetriske anhydrider ved tilsætning af 1 mmol dicylohexylcarbodi-imid i 2 ml dichlormethan. Sidekæderne i t-BOC-aminosy-rerne beskyttes på følgende måde: Arg(TOS), Asp(OBzl) ,

Cys(4-CH Bzl), Glu(OBzl), His(TOS), Lys(Cl-Z), Ser(Bzl), 35 Thr(Bzl) og Tyr(Br-Z). t-BOC-aminosyrerne Ala, Asn,

Gin, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp og Val beskyttes 0 24 DK 168710 B1 ikke. Dicyclohexylaminsaltet af t-BOC-L-His(Tos) omdannes til den frie syre ved ionbytning på "AQ—50-X8. (H+) "-harpiks (BioRad) inden for §n time efter kobling. t-BOC-aminosyren Asn, Arg og Gin (2 mmol) kobles ved hjælp af 5 præformede hydroxybenztriazol-(HOBt)-aktive estere dannet ved tilsætning af 2 mmol HOBt og 2 mmol DCC. N-ende-stillet t-BOC fjernes fra det kompletterede peptid, og peptidharpiksen tørres natten over i vakuum.

Beskyttelsen fjernes helt fra peptiderne, som 10 spaltes fra harpiksen ved behandling med vandfrit HF indeholdende 10% anisol i 60 minutter ved 0°C. Harpiksen vaskes med ethylacetat, og peptidet ekstraheres fra harpiksen med 1,0N eddikesyre. Ekstrakten fryses straks i flydende nitrogen, lyophiliseres og opbevares ved -20°C 15 til senere brug.

(b) ALB K14C

LYS-GLU-ARG-GLN-ILE-LYS-LYS-GLN-THR-ALA-LEU-VAL-TYR-CYS Dette peptid på 14 aminosyrer har en albuminsekvens på 12 aminosyrer med TYR som næstsidst og C-en-20 destillet CYS. CYS1 sulfhydryl kan selektivt kobles med bærere eller med fluorescerende reagenser (se eksemplerne 6 og 9). Under in-vitro-glycolysering vil de N-endestil-lede og £-aminogrupperne i det N-endestillede lysin sandsynligvis blive glycosyleret (jfr. struktur (3) på teg-25 ningen]. Imidlertid vil proteolytisk fordøjelse med V8 fjerne endestillet LYS-GLU, eller fordøjelse med trypsin vil fjerne endestillet LYS-GLU-ARG, hvilket resulterer i et kortere peptid, som mangler det potentielt glycosylerede N-endestillede lysin.

30 (c) ALB Cl IL

CYS-GLU-ARG-GLN-ILE-LYS-LYS-GLN-THR-ALA-Leu

Dette peptid har 10 aminosyrer i albuminsekvensen plus en N-endestillet CYS til selektiv kobling. Den N-endestillede aminogruppe i CYS vil sandsynligvis blive 35 glycosyleret, men eftersom den er nærmest ved bæreren eller mærkestoffet, skulle det ikke have nogen indvirkning DK 168710 Bl 0 25 produktionen af antistoffer, der er specifikke for gly-coalbumin [jfr. struktur (4) på tegningen]. Dette peptid manger de C-endestillede hydrofobe aminosyrer VAL og TYR og har større opløselighed i vandige og pyridin-5 puffere.

(d) ALB Q12C

GLN-ILE-LYS-LYS-GLN-THR-ALA-LEU-VAL-GLU-LEU-CfS

Dette peptid har 11 aminosyrer i albuminsekvensen plus en C-endestillet CYS til selektiv kobling [jfr.

10 struktur (5) på tegningen]. Den ønskede lysin-epitop (525) er anbragt 4 aminosyrer fra N-endestillingen, hvorved dens eksposition og antigenicitet forøges.

(e) ALB R11E

ARG-GLN-ILE-LYS-LYS-GLN-THR-ALA-LEU-VAL-GLU 15 Dette peptid har 11 aminosyrer i albuminsekven sen [jfr. struktur (6) på tegningen]. Den N-endestille-de ARG kan fjernes ved hjælp af trypsin, hvis den N-en-destillede aminogruppe bliver glycosyleret under in-vi-tro-glycosylering. Den ønskede lysin-epitop (525) vil 20 være 4 aminosyrer fra N-endestillingen, hvorved dens eksposition og antigenicitet forøges. Dette peptid har også god opløselighed i vandige og pyridinpuffere.

(f) ALB Q9C

L&-GLN-THR-ALA-LEU-VAL-GLU-LEU-VAL-CYS

25 N-t-BOC-L-Lysin (Sigma Chemical Co., St. Louis, M0, USA) inkuberes i 95% pyridin, 5% eddikesyre eller 10% pyridin i absolut methanol mættet med glucose i 7 dage ved 50°C. Opløsningen tørres til en sirup, og N-t-BOC- -£ -1-deoxyfructosyl-lysin renses ved HPLC på en C-18-30 ("Altex ODS", 4,1 mm x 25 cm)-kolonne (opløsningsmiddel A = 50 mM triethylaminacetat, pH 6,0; opløsningsmiddel B = A:acetonitril = 50:50). Produktet har R^ på 0,81 på silicagel med chloroform/methanol/eddikesyre - 14:5:1 og er ikke reaktivt med amin-påvisende reagenser, med-35 mindre det i kort tid udsættes for HCl-dampe og opvarmning til 100°C.

0 26 DK 168710 B1 N-t-BOC- L· -1-deoxyfructosyl-lysinen kobles', med N-ende-stillingen af det syntetiserede peptid GLN-THR-ALA-LEU--VAL-GLU-LEU-VAL-CYS. Dette peptid har otte aminosyrer i albuminsekvensen plus en C-endestillet CYS til kob-5 ling [jfr. struktur (7) på tegningen]. Efter fjernelse af t-BOC har det resulterende peptid glycosyleret lys in 525 udelukkende på £- amino gruppen. Til kobling omsættes 1 ækvivalent N-t-BOC-£-deoxyfructosyl-lysin i dichlormethan med 0,5 ækvivalent dicyclohexylcarbodi-10 imid i 15 minutter ved stuetemperatur under argon. Et lige så stort volumen dimethylformamid tilsættes efterfulgt af 0,25 ækvivalent mol syntetiseret peptid. Efter 30 minutter tørres opløsningen, resuspenderes i 25% TFA i dichlormethan i 30 minutter, tørres igen, og pro-15 duktet renses véd HPLC på en C-28-kolonne.

(g) Tryptisk kondensation af det glycosylerede produkt af ALB Q9C (AA^) med AA^

Det N-endestillede forlængelsespeptid B-GLN--ILE-LYS syntetiseres ved konventionel opløsnings- el- 20 ler fast-fast-peptidsyntese. Det ved HPLC rensede peptid inkuberes med med TPCK behandlet trypsin (Cooper Biomedical, Malvern, PA, USA) i 30% isopropanol eller et andet passende organisk opløsningsmiddel [Fruton, Advances in Enzymology 53, 239-306 (1981)],og ækvimolære mæng-25 der af LYS-GLN-THR-ALA-LEU-GLU-LEU-VAL-CYS (produktet i eksempel 4(f)) tilsættes. Efter 24 timer isoleres det opnåede produkt B-GLN-ILE-LYS-LYS-GLN-THR-ALA-LEU-VAL--GLU-LEU-VAL-CYS ved HPLC. Den endestillede blokerende gruppe (B) kan fjernes ved hjælp af metoder, der ikke 30 påvirker 1-deoxyfructosyl-resten på lysin 525.

(h) ALB Q7C

L^S-GLN-THR-ALA-LEU-TYR-TYR-CYS

Dette peptid anvendes i forsøg, der er analoge med dem, der er beskrevet for (f) ALB Q9C, hvor N-t-BOC-35 c - c-1-deoxyfructosyl-lysin kobles med den N-endestillede GLN ved hjælp af dicyclohexylcarbodiimid som beskrevet i 0 27 DK 168710 B1 (f). Dette peptid (ALB Q7C) har i C-endestillingen en TYR-TYR-CYS-struktur, som menes at potensere immun-responset mod et syntetisk peptid-immunogen. Den lille størrelse på sekvensens (5 aminosyrer) albumindel skul-5 le give en epitop med begrænset størrelse og derved fokusere immun-responset på den glycosylerede lysin-rest.

(i) ALB K8C

LYS-GLN-THR-ALA-LEU-TYR-TYR-CYS

ALB K8C er et lille peptid indeholdende det øn-10 skede glycosylerede lysin på N-endestillingen og ikke- -albumin TYR-TYR-CYS-sekvensen i C-endestillingen. Dette peptid er let opløseligt i 0,1% TFA og absolut me-chanol, hvilket muliggør, at det kan renses ved HPLC og glycolyseres i de respektive opløsningsmidler.

15 (j) ALB K9C

LYS-LYS-GLN-THR-ALA-LEU-TYR-TYR-CYS

ALB K9C har ALB K8C's egenskaber plus en yderligere lysinrest i N-endestillingen

(k) ALB I10C

20 ILE-LYS-LYS-GLN-THR-ALA-LEU-TYR-TYR-CYS

ALB HOC har (j) ALB K9C's egenskaber, men en yderligere ILE-rest i N-endestillingen.

(l) ALB Q11C

GLN-ILE-LYS-LYS-GLN-THR-ALA-LEU-TYR-TYR-CYS 25 ALB Q11C har (k) HOC s egenskaber, men har en yderligere GLN-rest i N-endestillingen.

(m) ALB ClOT

CYS-TYR-TYR-ARG-GLN-ILE-LYS-LYS-GLN-THR

ALB C10T syntetiseres med ikke-albuminsekven-' 30 sen (CYS-TYR-TYR) på N-endestillingen for at begunstige antistoffer, som fortrinsvis bindes med det glycoly-serede lysin og dette peptids C-endestillingssekvens.

35 28 DK 168710 B1 o

Eksempel 5

Glycosylering af syntetiske peptider

De fire syntetiske peptider, der er anført i tabel II, glycosyleres som anført. Q9C-peptidet frem-5 stilles ved glycosylering som beskrevet i eksempel 4(f).

Tabel II

K14C C11L Q12C RllE

(a) Pyridin, 0,25 M glucose + + + + ίο (b) 50% pyridin, 50% vand, 0,125 M glucose + + + (c) PBS, 1,0 M glucose + + + + (d) 95% pyridin, 5% eddikesyre, 0,25 M glucose, pH 7,0 + + + + 15

Reaktionerne sker fra omgivelsernes temperatur til 50°C og i 1-20 dage. Prøver tørres til en sirup og injiceres på en “Altex C-18" (1 x 25 cm) ved anvendelse af en 0,1% TFA til 0,1% TFA, 60% acetonitil-gra-20 dient. Spidsfraktioner samles, analyseres for carbon-hydrat og anvendes ved fremstillingen af glycopeptid--MBS-bærer-protein-immunogener.

De ikke-glycolyserede peptider kobles også med KLH-MBS og glycosyleres derpå in-vitro i PBS indeholden-25 de 1,0 M glucose (pH 9,5 eller 7,4) ved 37°C i 7-14 dage. Thiobarbitursyre-analyse viser 10-40 carbonhydrater/KLH molekylvægt 100.000.

Peptider fra eksempel 4(i)-(m) glycosyleres ved forhøjede temperatur (50-80°) 70°C i glucose-mættet 30 methanol i 24 timer. Methanolen fjernes ved negativt tryk, og glycopeptidet renses ved HPLC. Dette har vist sig at være yderst effektivt til at binde glucose med lysin-aminogrupperne i syntetiske peptider og med N-t--BOC-L-Lysinet i eksempel 4(f).

35 Glycosylering af N-t-BOC-L-Lysin i glucose-mæt tet methanol ved 50-80°C i 24 timer er særlig effektiv.

0 29 DK 168710 B1

Sekvens-analyse (eksempel 6 nedenfor) identificerer produktet (efter fjernelse af den a-amin-beskyttende gruppe) som £-deoxyfructosyl-lysin. Massespektroskopi med hurtigt atombombardement giver også den forudsagte mole-5 kylvægt af det glycosylerede N-t-BOC-L-Lysin-derivat.

Eksempel 6

Sekvensanalyse til bestemmelse af position og mængde af glycosylerede lyslner 10 Der er udviklet en metode til bestemmelse af position og mængde af glycosylerede lysin-rester ved hjælp af automatisk Edman-gasfase-nedbrydningssekvens-bestemmelsesmetoder. Under konventionel sekvens-analyse er begge aminogrupper på lysin reaktive med PITC (phe-15 nylisothiocarbamyl), der danner en lysin med en PTC-grup- pe (phenylthiocarbamyl) på £-aminogruppen og en PTH (phenyl thiohydantoin) på α-aminogruppen. Den glycosylerede lysin vil dog ikke have PTC-gruppen på £,-aminogruppen, fordi car-bonhydratet blokerer denne amin i at reagere med PITC.

20 Lysinproduktet er derfor PTH-lysin. Ved se kvensanalysen af de naturligt forkommende glycoalbumin--peptider i eksempel 2 er PTH-lysin-resten blevet identificeret, eftersom den har en unik chromatografisk retentionstid på omvendt-fase-C-18-kolonnen, der anvendes 25 til at adskille og mængdebestemme de forskellige PTH-a-minosyrer. Alle glycosylerede syntetiske peptider sekvensbestemmes for at identificere den særlige glycosylerede lysin i multi-lysin-peptider og for at mængdebestemme forholdet mellem lysin og glycolysin. Resul-30 taterne viser, at mere end 75% af lysinerne har det korrekte glycosylerings-reaktionsprodukt på lysin, når glycosy leringen foretages i methanol.

Eksempel 7 35 Kobling af syntetiske glycopeptider med bæreproteiner

Syntetiske glycopeptider indeholdende CYS kobles med bærere som beskrevet af Lerner m.fl. [Proc.

0 30 DK 168710 B1

Natl. Acad. Sci. 78, 3403 (1981)]. Kort fortalt omsættes KLH med et 50 fold molært overskud af sulfo-MBS (Pierce Chemical Co.) i 25 minutter ved omgivelsernes temperatur i 50 mM natriumphosphat, pH 6,2, og KLH/MBS-5 -konjugatet skilles fra ureageret sulfo-MBS ved gelfiltrering i den samme puffer. KLH/MBS-konjugatet sættes straks til det tørrede glydopeptid (2 fold molært overskud af glycopeptid i forhold til bærerens maleimid) og omsættes natten over ved stuetemperatur.

10 Por peptider, der mangler CYS, kobles den C-en- destillede carboxylsyre med bæreproteinernes aminogrup-per som beskrevet i eksempel 3.

Eksempel 8 15 Immunisering

Det udvalgte glycopeptid-MBS/KLH-konjugat fra eksempel 7 emulgeres med et lige så stort volumen Freund's komplette adjuvans. Mus (BALB/cBy) injiceres med 200^,ug konjugat og boostes efter 30 og 60 dage med konjugat i 20 ukomplet adjuvans. Tre dage før fusion injiceres mus med 50yUg IV. Musene aflives, og deres milt anvendes til fusioner ifølge Kohier og Milstein, Nature 256, 495 (1975) . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Eksempel 9 2

Screening af hybridomoverfaser for antistoffer, der er 3 specifikke for glyco-albumin 4 (a) ELISA-analyse 5

Albumin og glycoalbumin fra eksempel 1 udstry- 6 ges på separate polystyren-mikrotiterplader (2^,ug pr.

7 100 mikroliter/fordybning) natten over ved 4°C. Pla 8 der vaskes med PBS, 0,05% "Tween-20". Overfaser fra 9 hver cellelinie inkuberes i albumin-eller glycoalbumin- 10 strøgne plader i 60 minutter. Pladerne vaskes 4 gange 11 med PBS + 0,05 ”Tween-20", og 200 mikroliter sekundært antistof sættes til hver fordybning (1:2000 fortynding 0 31 DK 168710 B1 af kanin-antimuse-IgG-peroxidase, Miles Laboratories,

Inc., Elkhart, Indiana, USA). Efter 60 minutter vaskes pladerne 4 gange i PBS + 0,05% "Tween", og der tilsættes 200 mikroliter substratopløsning (24,3 mM 5 citronsyre, 51,4 mM natriumphosphat, pH 5,3, indeholdende 2,2 mM o-phenylendiamin og 5,2 mM hydrogenper-oxid). Reaktionen afsluttes efter 20 minutter ved tilsætning af 50 mikrolitfer 8 M ^SO^, og peroxidase-re-aktionens produkt aflæses ved 492 nm. De monoklone an-10 tistoffer, som er specifikke for glycoalbumin, reagerer med glycoalbumin og ikke albumin.

(b) Fluorescerende partikelkoncentrationsimmunana-lyse

Albumin og glycoalbumin udstryges på separa-15 te polystyrenpartikler (Pandes Laboratories, Mundelein, Illinois, USA). Hybridomoverfaser (20 mikroliter) sættes til hver fordybning;, efterfulgt af 20 mikroliter med albumin eller glycoalbumin overtrukne partikler.

Efter 30 minutter tilsættes en 1:5000 fortynding af ge-20 de-anti-muserr'IgG-FITC (jfr. eksempel 10) , og inkubationen fortsættes i yderligere 30 minutter. Alle de ikke-bundne reaktanter fjernes ved filtrering, og fluorescensen måles. Ved et specifikt respons bindes antistoffer i hybridomoverfasen med glycoalbumin- men ikke albumin-25 overtrukne partikler.

(c) Fluorescerende partikelkoncentrationsimmunanalyse med forudgående dissociering af albumin/glyco-albumin fra monoklont antistof

Gede-anti-muse-partikler (Pandex Laboratories) 30 inkuberes med hybridom-overfaser for at fange muse-antistofferne. En procentdel af monoklone muse-antistoffer bindes med det naturligt forekommende glycoalbumin i de celledyrkningsmedier, der anvendes for at dyrke hybridomcellerne. Ikke-bundne komponenter fraskilles 35 ved filtrering, hvilket efterlader gede-anti-muse-par- tiklerne med bundne muse-immunglobuliner fra hybridom- 0 32 DK 168710 B1 medierne, og igen bindes glycoalbuminet med muse-immunglo-bulinet. 20 mikroliter 100 mM glycin, pH 3,0, tilsættes for at dissociere alle komplekser. 20 minutter senere tilsættes 20 mikroliter 50 mM Tris-base indehol-5 dende glycoalbumin mærket med fluorescein ved hjælp af sulfhydryl-specifikt fluorescein-5-maleimidc Det resulterende pH på 7,5 renaturerer muse-immunglobulinet, som fortrinsvis bindes med overskudet af fluorescerende glycoalbumin. Muse-immunglobulin/fluorescerende glyco-10 albumin-komplekset opfanges af eksisterende gede-anti-mu-separtikler eller ved tilsætning af friske gede-anti-mu-se-Ig-partikler. De ikke-bundne reagenser fjernes ved filtrering, og signalet er proportionalt med de muse--anti-glycoalbumin-antistoffer, der forekommer i hybri-15 domoverfasen.

(d) Forbedret vækstmedium

Kalvefosterserum (20%) , der anvendes til at opretholde og dyrke myelomceller og hybridomceller, har en signifikant koncentration af oksealbumin og formodentlig 20 glycoalbumin, som vides at have den samme aminosyre-se-kvens som humant albumin, der omgiver den glycolyserede lysin i stilling 525. Det er derfor yderst sandsynligt, at den lille mængde anti-glycoalbumin-antistoffer, der udskilles i vævsdyrkningsmediet, straks bindes med de 25 glycosylerede albuminmolekyler og ikke kan påvises ved standard-ELISA-analysen.

For at eliminere bindingen af antistof til mediets glycoalbumin tilpasses myelomceller og hybridomceller til vækst i serum- og (albumin-)frit medium.

30 Det medium, der for tiden anvendes, fås i handelen ("HL-l", Ventrex, Portland, Main, USA). Screeningen af hybridom-overfaser i "HL-l"-mediet forenkler identifikationen af kloner, der udskiller anti-glycoalbumin-antistoffer.

(e) Vækst af hybridomceller i glycoalbumin-holdigt 35 medium

Som omtalt i eksempel 9(d) kan tilstedeværelsen 0 33 DK 168710 B1 af glycoalbumin i mediet forhindre påvisning af anti-gly-coalbumin-specifikke antistoffer. Det er derfor nødvendigt at fjerne glycoalbuminet fra mediet ved en udvælgelsesadsorptionsproces. Dette sker ved selektivt at ab-5 sorbere albuminet og glycoalbuminet fra kalvefosterse-rum ved passage ned gennem en "Affi-Gel-blue"-kolonne (BioRad Labs, Richmond/ CA.USA) ved hjælp af fabrikantens anvisninger. Albuminfraktionen har affinitet for det reaktive blå farvestof under disse betingelser, men 10 kan elueres ved hjælp af 1,4 M natriumchlorid. Den elu-erede fraktion, der indeholder ca. 90% albumin og 10% glycoalbumin, påføres på en "Glyco-Gel B" (boronat-ko-lonne, Pierce Chemical Co., Rockford Illinois, USA).

Denne kolonne binder selektivt glycoalbumin. Den ikke-15 -bundne fraktion indeholder ikke-glycoalbumin og sættes igen til den "Affi-Gel"-ikke-bundne fraktion, som indeholder alle serumkomponenter undtagen albumin. Slutblandingen er kalvefosterserum uden glycoalbumin og anvendes til at fremstille mediet til vækst af hybri-20 domer, der producerer anti-glycoalbumin-specifikke antistoffer.

Eksempel 10

Fluorescerende mærkning af syntetiske glycopeptider 25 Glycopeptiderne kan mærkes bekvemt ved hjælp af sulfhydryl-specifikke fluorescein-konjugater. Et to fold overskud af fluorescein—5-maleimid i dimethyl-formamid (40 mg/ml) sættes til glycopeptid (10 mg/ml) i 100 mM natriumphosphat, 5 mM EDTA, pH 7,1. Prøven 30 inkuberes i 20 timer ved stuetemperatur. Glycopeptid/- fluorescein-konjugatet renses ved HPLC på en "Altex C-18" 4,1 mm x 25 cm kolonne ved hjælp af 20 mM natriumphosphat til 20 mM natriumphosphat, 50% acetonitrilgradient.

35 DK 168710 Bl 0 34

Eksempel 11

Immunanalyse for glycoalbumin i kliniske prøver

Antistof, der er specifikt for glycoalbumin, påføres på polystyrenpartikler (0,8^um) (Pandex Laborato-5 ries). De med antistof overtrukne perler (20 mikroliter) inkuberes med en passende fortyndet blodprøve, f.eks.

1:800. Prøven kan være serum, plasma eller helblod. Fortyndingsmidlet kan være i fysiologiske puffere eller denaturerende opløsninger, der lyser røde blodlegemer og 10 optimalt eksponerer glycoalbumin-epitopen. Efter passende inkubation (f.eks. 5 minutter) tilsættes syntetisk glycopeptid-fluorescein-konjugat (eksempel 10) for at bindes med ikke-optagne antistof-bindesteder på partiklerne. Efter yderligere inkubation (f.eks. 20 minutter).

15 fjernes alle ikke-bundne reaktanter ved filtrering, og fluoresceinet mængdebestemmes. Fluoresceinsignalet er derfor omvendt proportionalt med mængden af konkurrerende glycoalbumin i den kliniske prøve.

20 25 30 35

Claims (10)

1. Monoklont antistof eller fragment deraf, kendetegnet ved, at det omfatter et antistof-kombinerende sted, som bindes specifikt til en epitop i glycosyleret 5 nativt humant albumin, hvilken epitop indeholder den glyco-sylerede form af lysinresten i stilling 525.

2. Monoklont antistof eller fragment deraf ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det bindes specifikt 10 til en glycosyleret peptidepitop med formlen Glyco-(NH) —AA1-Lys-AA2— 15 hvor Glyco-(NH) er en ikke-enzymatisk glycosyleret e-amino-gruppe i lysinresten, og et af eller begge symbolerne AA^ og AA2 er en sekvens af aminosyrer svarende til aminosyresekvensen i humant 20 albumin stødende op til lysinresten i stilling 525, og hvis kun den ene af AA^ og AA2 er en sådan sekvens, er den anden en binding, en endestillet amino- eller carboxylgruppe eller yderligere aminosyrerester.

3. Monoklont antistof eller fragment ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det bindes specifikt til epitopen i glycosyleret nativt humant albumin, der er blevet behandlet ved fysisk eller kemisk denaturering eller digestion til blotlæggelse af epitopen til binding. 30

4. Monoklont antistof eller fragment ifølge krav 3, kendetegnet ved, at epitopen er blotlagt til binding ved denaturering med et chaotropt middel.

5. JP hvor Glyco-(NH) er en ikke-enzymatisk glycosyleret e-ami-nogruppe i lysinresten, det ene eller begge symbolerne AA^ og AA2 er en se-10 kvens af aminosyrer svarende til aminosyresekvensen i humant albumin, der støder op til lysinresten i stilling 525, og hvis kun en af AA^ og AA2 er en sådan sekvens, er den anden en binding, en endestillet amino- eller carboxylgruppe eller yderligere amino-15 syrerester, R er en binding eller forbindende gruppe, bærer er et immunogent bæremateriale, et af symbolerne m og n er 1, og det andet er 0, og p er gennemsnitlig 1 til antallet af til rådighed 20 stående koblingssteder på bæreren.

5. Immunogen med formlen 36 DK 168710 B1 Glyco-(NH) “ » bærer-· R —AA. -Ly s-AA ^—R--*— bærer m m 1 J 2 n ji

6. Immunanalysefremgangsmåde til bestemmelse af glycosyleret albumin i en human blodprøve, kendetegnet ved, at 25 (a) blodprøven kontaktes med et monoklont antistof eller et fragment deraf ifølge krav 1, og (b) det monoklone antistofs eller dettes fragments binding til glycosyleret humant albumin bestemmes som en funktion af mængden deraf i den analyserede prøve. 30

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at blodprøven behandles til fysisk eller kemisk denaturering eller digestion af glycosyleret albumin deri til blotlæggelse af epitopen til binding, fortrinsvis ved 35 behandling med et chaotropt middel. 0 37 DK 168710 B1

8. Peptid, kendetegnet ved, at det har formlen (QNH) 5 (NHJ (cys) -(Tyr) -ΑΑ,-Lys-RA -(Tyr)s-(Cys)t{COOH) Z CT i χ *·*«** hvor mindst ét af symbolerne AA^ og AA2 er en sekvens på 1-12 aminosyrer svarende til aminosyresekvensen, 10 der støder op til lysinresten i stilling 525 i humant albumin, og hvis kun en af AA^ og AA2 er en sådan sekvens, er den anden en binding, og den N-endestillede aminogruppe i (N^JAA^ og enhver lysinrest i AA, og AA~ eventuelt er glycosyle- 15 ret, ^ og t> hver er 0 eller 1, r og s, hver er 0, 1 eller 2, QNH er £-aminogruppen i Lys, og Q er l-deoxyfructosyl. 20 --------

9. Peptid, kendetegnet ved, at det er valgt blandt 25 (a) QNH (NH2)Lys-Gln-Thr-Ala-Leu-Val-Glu-Leu-Val-Lys(C00H) 30 hvor Q er l-deoxyfructosyl, 35 0 38 DK 168710 B1 (b) (QNH) i 5 (NH2) Ar9“G^-n'"Ile“Iiys-Lys-Gln-Thr-Ala-Leu-Val- -Glu(COOH) hvor Q er 1-deoxyfructosyl, (c) 10 (QNH) * I (NH^AA^-Gln-Ile-Lys-Lys-Gln-Thr-Ala-Leu-Val--aa4(COOH) 15 hvor Q er 1-deoxyfructosyl, & AA^ er Lys-Glu-Arg, Arg eller en binding, og AA4 er Tyr-Cys eller en binding, og hvor den N-endestillede aminogruppe i (NH„)AA^ og ^ o enhver Lys-enhed i peptidet eventuelt er glycosy-20 leret, (d) (QNH) (NH2)AA^-Glu-Arg-Gln-Ile-Lys-Lys-Gln-Thr-Ala- -Leu(COOH) 25 hvor Q er 1-deoxyfructosyl, AA. er Cys eller en binding, og hvor den N-endestillede aminogruppe i (NH2)AA,- og Lys-3Q -enheden i peptidet eventuelt er glycosyleret, (e) (QNH) (NH^)Gin-Ile-Lys-Lys-Gln-Thr-Ala-Leu-Val-Glu-Leu-35 -AA4(COOH) 0 39 DK 168710 B1 hvor Q er 1-deoxyfructosyl, AA^ er Cys eller en binding, og den N-endestillede aminogruppe i (NH2)Gln og Lys-enheden i peptidet eventuelt er glycosyleret, 5 (f) (QNH) * I (NH2)AAg-Gln-Ile-Lys-Lys-Gln-Thr-Ala-Leu-Val--Glu(COOH) 10 hvor Q er 1-deoxyfrucotsyl, AAj. er Arg eller en binding, og den N-endestillede aminogruppe i (NH2)AA5 og Lysenheden i peptidet eventuelt er glycosyleret, 15 (g) (QNH) (NH2) AA6-Lys-Gln-Thr-Ala-Leu-AA7 (COOH) 20 hvor Q er 1-deoxyfructosyl, AAg er Gln-Ile-Lys, Ile-Lys, Lys- eller en binding, AA? er Tyr-Tyr-Cys, Tyr-Cys, Cys eller en binding, og den N-endestillede aminogruppe i (NH0)AA, og

25 X ^ D Lys-enheder i peptidet eventuelt er glycosyleret, og (h) (QNH) (NH2) AAg-Arg-Gln-Ile-Lys-Lys-Gln-Thr 30 hvor Q er 1-deoxyfructosyl, AAg er Cys-Tyr-Tyr, Cys-Tyr-Cys eller en binding, og den N-endestillede aminogruppe (N^JAAg og Lys eventuelt er glycosyleret.

10. Immunanalysesæt, kendetegnet ved, at det omfatter et antistof ifølge hvert af kravene 1-4. 35