JP2001226371A - ダイオキシン誘導体およびこれを使用した測定法 - Google Patents
ダイオキシン誘導体およびこれを使用した測定法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】免疫測定法本来の利点を保持したダイオキシン
類の高感度な測定・検出技術およびこれに用いる標識体
を提供する。 【解決手段】一般式（１）： 【化１】 （式中、Ｘは水素原子または塩素原子を、Ｒ1はビオチ
ン残基を、Ｒ2は同一または相異なってアルギニン残基
またはリジン残基を、ｎは１〜５の整数を、またｍは１
〜３の整数を、それぞれ示す）で表わされるビオチン化
ダイオキシン誘導体、および該誘導体を標識体として利
用することを特徴とするダイオキシン類の免疫測定法。
類の高感度な測定・検出技術およびこれに用いる標識体
を提供する。 【解決手段】一般式（１）： 【化１】 （式中、Ｘは水素原子または塩素原子を、Ｒ1はビオチ
ン残基を、Ｒ2は同一または相異なってアルギニン残基
またはリジン残基を、ｎは１〜５の整数を、またｍは１
〜３の整数を、それぞれ示す）で表わされるビオチン化
ダイオキシン誘導体、および該誘導体を標識体として利
用することを特徴とするダイオキシン類の免疫測定法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ダイオキシン類、
特に２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイ
オキシン（以下「2,3,7,8,-TCDD」という）の改良され
た免疫測定法、および該測定法に利用する新規なビオチ
ン化ダイオキシン誘導体に関する。
特に２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイ
オキシン（以下「2,3,7,8,-TCDD」という）の改良され
た免疫測定法、および該測定法に利用する新規なビオチ
ン化ダイオキシン誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】ダイオキシン類とは、ポリ塩化ジベンゾ
−ｐ−ダイオキシン類（polychlorinated dibenzo-p-di
oxins: PCDDs）およびその類似物質であるポリ塩化ジベ
ンゾフラン類（polychlorinated dibenzofurans: PCDF
s）の総称であり、塩素原子の位置と数により多くの異
性体が存在している。これは、含塩素有機化合物の焼却
などにより工場、焼却炉から排出し、大気、河川、土壌
に拡散される。
−ｐ−ダイオキシン類（polychlorinated dibenzo-p-di
oxins: PCDDs）およびその類似物質であるポリ塩化ジベ
ンゾフラン類（polychlorinated dibenzofurans: PCDF
s）の総称であり、塩素原子の位置と数により多くの異
性体が存在している。これは、含塩素有機化合物の焼却
などにより工場、焼却炉から排出し、大気、河川、土壌
に拡散される。
【０００３】このダイオキシン類が注目されたのは、そ
の毒性であり、特に２，３，７，８−ＴＣＤＤは毒性が
高く、ヒト、家畜、家禽の臓器、生理機能などに悪影響
を及ぼし、これが国内、国外を問わず大きな社会問題と
なっている。
の毒性であり、特に２，３，７，８−ＴＣＤＤは毒性が
高く、ヒト、家畜、家禽の臓器、生理機能などに悪影響
を及ぼし、これが国内、国外を問わず大きな社会問題と
なっている。
【０００４】従来より、ダイオキシン類の検出・測定
は、このような含塩素有機化合物の場合に一般的である
高速液体クロマトグラフィー、ＧＣ−マススペクトロス
コピー、ＬＣ−マススペクトロスコピーなどの物理化学
的機器を使用した方法により実施されている。しかしな
がら、このような方法は、用いられる機器類が高価であ
るばかりでなく、検体（サンプル）量、検体の処理能力
にも限界があり、これに代わる、より簡便でしかも多数
の検体を正確且つ迅速に測定・検出できる方法の開発が
望まれていた。
は、このような含塩素有機化合物の場合に一般的である
高速液体クロマトグラフィー、ＧＣ−マススペクトロス
コピー、ＬＣ−マススペクトロスコピーなどの物理化学
的機器を使用した方法により実施されている。しかしな
がら、このような方法は、用いられる機器類が高価であ
るばかりでなく、検体（サンプル）量、検体の処理能力
にも限界があり、これに代わる、より簡便でしかも多数
の検体を正確且つ迅速に測定・検出できる方法の開発が
望まれていた。
【０００５】一方、免疫測定法は、一般に、測定の時間
短縮化、簡便化、低コスト化および多数検体の同時処理
などの多くの利点があり、ダイオキシン類の検出・測定
においてもかかる免疫測定法の応用が考えられ、当該測
定系に利用される特異抗体の作成やそれらを利用した測
定系の開発が試行されてきている（Toxicology, 45,229
-243 (1987)；Anal. Chem., 70, 1092-1099 (1998)；米
国特許４２３８４７２号明細書；同５４２９９２５号明
細書；同５６７４６９７号明細書；特開昭６３−１４６
９１号公報；同６３−７４４９４号公報など参照）。
短縮化、簡便化、低コスト化および多数検体の同時処理
などの多くの利点があり、ダイオキシン類の検出・測定
においてもかかる免疫測定法の応用が考えられ、当該測
定系に利用される特異抗体の作成やそれらを利用した測
定系の開発が試行されてきている（Toxicology, 45,229
-243 (1987)；Anal. Chem., 70, 1092-1099 (1998)；米
国特許４２３８４７２号明細書；同５４２９９２５号明
細書；同５６７４６９７号明細書；特開昭６３−１４６
９１号公報；同６３−７４４９４号公報など参照）。
【０００６】しかしながら、これらの測定系は、被検試
料に極めて低濃度に存在するダイオキシン類の特異的な
測定・検出法としては、尚充分ではなく、斯界において
は、ダイオキシン類のより高感度な免疫測定法の確立、
提供が望まれている（The Science of the Total Envir
onment, 239, 1-18 (1999)）。
料に極めて低濃度に存在するダイオキシン類の特異的な
測定・検出法としては、尚充分ではなく、斯界において
は、ダイオキシン類のより高感度な免疫測定法の確立、
提供が望まれている（The Science of the Total Envir
onment, 239, 1-18 (1999)）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来技
術の課題を解決したダイオキシン類の高感度な免疫測定
法を提供することを目的とする。より詳しくは、本発明
は、免疫測定法本来の上述した利点は保持したままで、
斯界で望まれているダイオキシン類をより高感度で測定
・検出できる改良された方法およびこれに用いられる標
識体を提供することをその主要な目的とする。
術の課題を解決したダイオキシン類の高感度な免疫測定
法を提供することを目的とする。より詳しくは、本発明
は、免疫測定法本来の上述した利点は保持したままで、
斯界で望まれているダイオキシン類をより高感度で測定
・検出できる改良された方法およびこれに用いられる標
識体を提供することをその主要な目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意研究を
重ねた結果、下記一般式（１）で表わされる新規なビオ
チン化ダイオキシン誘導体が、上記目的に合致するダイ
オキシン類の免疫測定系における標識体として有用であ
ることを見出した。また、本発明者は、かかる誘導体の
利用によって、実際に、従来技術に比してより高感度で
ダイオキシン類の測定・検出を行ない得る測定系を確立
するに成功した。本発明は、かかる新知見を基礎として
完成されたものである。
重ねた結果、下記一般式（１）で表わされる新規なビオ
チン化ダイオキシン誘導体が、上記目的に合致するダイ
オキシン類の免疫測定系における標識体として有用であ
ることを見出した。また、本発明者は、かかる誘導体の
利用によって、実際に、従来技術に比してより高感度で
ダイオキシン類の測定・検出を行ない得る測定系を確立
するに成功した。本発明は、かかる新知見を基礎として
完成されたものである。
【０００９】本発明によれば、一般式（１）：
【００１０】
【化２】
【００１１】（式中、Ｘは水素原子または塩素原子を、
Ｒ1はビオチン残基を、Ｒ2は同一または相異なってアル
ギニン残基またはリジン残基を、ｎは１〜５の整数を、
またｍは１〜３の整数を、それぞれ示す。）で表わされ
るビオチン化ダイオキシン誘導体、特に、Ｘが水素原
子、ｎが４およびｍが２である上記誘導体が提供され
る。
Ｒ1はビオチン残基を、Ｒ2は同一または相異なってアル
ギニン残基またはリジン残基を、ｎは１〜５の整数を、
またｍは１〜３の整数を、それぞれ示す。）で表わされ
るビオチン化ダイオキシン誘導体、特に、Ｘが水素原
子、ｎが４およびｍが２である上記誘導体が提供され
る。
【００１２】また、本発明によれば、上記ビオチン化ダ
イオキシン誘導体を標識体として利用することを特徴と
する、ダイオキシン類の免疫測定法が提供される。
イオキシン誘導体を標識体として利用することを特徴と
する、ダイオキシン類の免疫測定法が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明のビオチン化ダイオキシン
誘導体は、免疫測定系の液相に可溶性である（水溶性で
ある）ことによって特徴付けられる。従って、これはダ
イオキシン類の免疫測定系における標識体として極めて
有用である。
誘導体は、免疫測定系の液相に可溶性である（水溶性で
ある）ことによって特徴付けられる。従って、これはダ
イオキシン類の免疫測定系における標識体として極めて
有用である。
【００１４】ビオチンは、ビオチン／アビジンの特異結
合を利用した間接標識剤として慣用されており、また一
般の酵素類と比較して、低分子（分子量２４４．３１）
であることより、免疫測定系における標識体としての利
用が好ましいものの、それ自体水溶性に欠けており、水
溶性に欠けるダイオキシンとの結合体は、当然に水不溶
性であるため上記免疫測定系には採用することができな
い。
合を利用した間接標識剤として慣用されており、また一
般の酵素類と比較して、低分子（分子量２４４．３１）
であることより、免疫測定系における標識体としての利
用が好ましいものの、それ自体水溶性に欠けており、水
溶性に欠けるダイオキシンとの結合体は、当然に水不溶
性であるため上記免疫測定系には採用することができな
い。
【００１５】これに対して、本発明のビオチン化ダイオ
キシン誘導体は、ダイオキシン類の免疫測定法への利用
に適した水溶性を具備しており、しかも抗ダイオキシン
抗体との交差反応性を消失しないものであり、これらの
点より、斯界で要望されるダイオキシン類の免疫測定系
への利用に適したものである。
キシン誘導体は、ダイオキシン類の免疫測定法への利用
に適した水溶性を具備しており、しかも抗ダイオキシン
抗体との交差反応性を消失しないものであり、これらの
点より、斯界で要望されるダイオキシン類の免疫測定系
への利用に適したものである。
【００１６】本発明測定法の好ましい１態様は、後述す
るとおりであり、例えば、この好ましい１態様としての
酵素免疫測定法によれば、約０．１〜１００ｎｇ/ｍＬ
の範囲のダイオキシン類が測定可能である。この濃度範
囲は、例えばヒト尿および血漿中におけるダイオキシン
類の濃度に相当する。即ち、本発明は、かかるヒト尿な
どを検体として、その中のダイオキシン類を測定でき
る、非常に高感度な測定系を提供するものである。
るとおりであり、例えば、この好ましい１態様としての
酵素免疫測定法によれば、約０．１〜１００ｎｇ/ｍＬ
の範囲のダイオキシン類が測定可能である。この濃度範
囲は、例えばヒト尿および血漿中におけるダイオキシン
類の濃度に相当する。即ち、本発明は、かかるヒト尿な
どを検体として、その中のダイオキシン類を測定でき
る、非常に高感度な測定系を提供するものである。
【００１７】本発明のビオチン化ダイオキシン誘導体
は、ダイオキシン類、例えばその毒性がよく知られてい
る、２，３，７，８−ＴＣＤＤを代表とする７種のポリ
塩化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンおよび／または２，
３，７，８−トリクロロジベンゾフランを代表とする１
０種のポリ塩化ジベンゾフランの任意の各種免疫測定法
における標識体として有用であり、殊に、２，３，７，
８−ＴＣＤＤを測定対象として含むダイオキシン類の免
疫測定法に好ましく利用することができる。
は、ダイオキシン類、例えばその毒性がよく知られてい
る、２，３，７，８−ＴＣＤＤを代表とする７種のポリ
塩化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンおよび／または２，
３，７，８−トリクロロジベンゾフランを代表とする１
０種のポリ塩化ジベンゾフランの任意の各種免疫測定法
における標識体として有用であり、殊に、２，３，７，
８−ＴＣＤＤを測定対象として含むダイオキシン類の免
疫測定法に好ましく利用することができる。
【００１８】また、一般式（１）中、Ｘが水素原子であ
る本発明のビオチン化ダイオキシン誘導体は、毒性が極
めて低く、従ってかかる誘導体を利用する本発明測定法
は、その操作中の安全性が高く保たれる利点もある。
る本発明のビオチン化ダイオキシン誘導体は、毒性が極
めて低く、従ってかかる誘導体を利用する本発明測定法
は、その操作中の安全性が高く保たれる利点もある。
【００１９】以下、本発明ビオチン化ダイオキシン誘導
体につき詳述すれば、該誘導体は、前記一般式（１）で
表わされる。
体につき詳述すれば、該誘導体は、前記一般式（１）で
表わされる。
【００２０】但し、該一般式（１）において、Ｒ1で示
されるビオチン残基とＲ2で示されるアミノ酸残基（Ｒ1
基と直接結合する基）との結合は、ビオチンのカルボキ
シル基とアミノ酸のアミノ基とのアミド結合であるもの
とする。また、Ｒ2で示されるアミノ酸残基（Ａｒｇお
よびＬｙｓ）は、特に断らない限り、Ｄ体およびＬ体の
両者を包含するものとする。
されるビオチン残基とＲ2で示されるアミノ酸残基（Ｒ1
基と直接結合する基）との結合は、ビオチンのカルボキ
シル基とアミノ酸のアミノ基とのアミド結合であるもの
とする。また、Ｒ2で示されるアミノ酸残基（Ａｒｇお
よびＬｙｓ）は、特に断らない限り、Ｄ体およびＬ体の
両者を包含するものとする。
【００２１】本発明ビオチン化ダイオキシン誘導体は、
例えば、下記一般式（２）で示される化合物のヒドラジ
ドと、一般式（３）で示される化合物との縮合反応によ
り製造することができる。
例えば、下記一般式（２）で示される化合物のヒドラジ
ドと、一般式（３）で示される化合物との縮合反応によ
り製造することができる。
【００２２】
【化３】
【００２３】（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｘ、ｍおよびｎは前記
に同じ。） ここで一般式（３）の化合物は、通常の液相法および固
相法を包含する一般的なペプチド化学合成法に従い、例
えば、ビオチンおよび所望のアミノ酸の１種を、または
２種以上を順次、縮合反応させることにより製造するこ
とができる。該合成法において、採用される縮合反応
も、公知の各種縮合反応に従うことができる。
に同じ。） ここで一般式（３）の化合物は、通常の液相法および固
相法を包含する一般的なペプチド化学合成法に従い、例
えば、ビオチンおよび所望のアミノ酸の１種を、または
２種以上を順次、縮合反応させることにより製造するこ
とができる。該合成法において、採用される縮合反応
も、公知の各種縮合反応に従うことができる。
【００２４】該合成法に採用される縮合反応方法として
は、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活
性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホス
ホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド、Ｎ
−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキ
シイミドなど）、ウッドワード法などを例示できる。
は、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活
性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホス
ホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド、Ｎ
−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキ
シイミドなど）、ウッドワード法などを例示できる。
【００２５】これら各方法に利用される溶媒も、この種
のペプチド縮合反応に慣用される各種の溶媒から適宜選
択することができる。その例としては、例えばＮ−メチ
リピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などおよびこ
れらの混合溶媒などを例示できる。
のペプチド縮合反応に慣用される各種の溶媒から適宜選
択することができる。その例としては、例えばＮ−メチ
リピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などおよびこ
れらの混合溶媒などを例示できる。
【００２６】尚、上記縮合反応において、反応に関与し
ない官能基は、常法に従い、通常の保護基により保護で
き、これらは反応終了後に脱離できる。これら各反応方
法は公知であり、それらに用いられる試薬類も公知のも
のから適宜選択できる。
ない官能基は、常法に従い、通常の保護基により保護で
き、これらは反応終了後に脱離できる。これら各反応方
法は公知であり、それらに用いられる試薬類も公知のも
のから適宜選択できる。
【００２７】例えば、アミノ基の保護基としては、ベン
シルオキシカルボニル、第三級ブトキシカルボニル（Ｂ
ｏｃ）、イソボルニルオキシカルボニル、ｐ−メトキシ
ベンジルオキシカルボニルなどを例示できる。また、カ
ルボキシル基の保護基としては、例えばメチルエステ
ル、エチルエステル、第三級ブチルエステルなどの低級
アルキルエステルやベンジルエステルやｐ−メトキシベ
ンジルエステルなどを形成し得る基を例示することがで
きる。
シルオキシカルボニル、第三級ブトキシカルボニル（Ｂ
ｏｃ）、イソボルニルオキシカルボニル、ｐ−メトキシ
ベンジルオキシカルボニルなどを例示できる。また、カ
ルボキシル基の保護基としては、例えばメチルエステ
ル、エチルエステル、第三級ブチルエステルなどの低級
アルキルエステルやベンジルエステルやｐ−メトキシベ
ンジルエステルなどを形成し得る基を例示することがで
きる。
【００２８】アルギニンのグアニジノ基の保護基として
は、例えば２，２，５，７，８−ペンタメチルクロモン
−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、２，２，４，６，７−ペ
ンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐ
ｂｆ）、ニトロ、ベンジルオキシカルボニル、Ｂｏｃ、
ｐ−トルエンスルホニルなどを例示できる。
は、例えば２，２，５，７，８−ペンタメチルクロモン
−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、２，２，４，６，７−ペ
ンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐ
ｂｆ）、ニトロ、ベンジルオキシカルボニル、Ｂｏｃ、
ｐ−トルエンスルホニルなどを例示できる。
【００２９】これら保護基の脱離反応もまた慣用される
方法、例えば、接触還元法や、液体アンモニア／ナトリ
ウム、フッ化水素、臭化水素素、塩化水素、トルフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）、酢酸、メタンスルホン酸などを用い
る方法などに従い実施できる。
方法、例えば、接触還元法や、液体アンモニア／ナトリ
ウム、フッ化水素、臭化水素素、塩化水素、トルフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）、酢酸、メタンスルホン酸などを用い
る方法などに従い実施できる。
【００３０】一般式（２）の化合物のヒドラジドは、例
えばＢｏｃ、ベンジルオキシカルボニル、Ｔｒｏｃなど
の任意の保護基で保護されたヒドラジンと一般式（２）
の化合物とを、上記と同様に縮合反応させ、次いで得ら
れる化合物の保護基を脱離反応させることにより製造す
ることができる。
えばＢｏｃ、ベンジルオキシカルボニル、Ｔｒｏｃなど
の任意の保護基で保護されたヒドラジンと一般式（２）
の化合物とを、上記と同様に縮合反応させ、次いで得ら
れる化合物の保護基を脱離反応させることにより製造す
ることができる。
【００３１】かくして得られる一般式（２）の化合物の
ヒドラジドと一般式（３）の化合物の縮合反応も、上記
した縮合反応に準じて実施することができ、保護基の導
入と脱離も同様にして行うことができる。
ヒドラジドと一般式（３）の化合物の縮合反応も、上記
した縮合反応に準じて実施することができ、保護基の導
入と脱離も同様にして行うことができる。
【００３２】尚、一般式（２）の化合物は、公知の方法
（Toxicology and Applied pharmacology, 50, 137-146
(1979)など）に従い容易に製造することができる。
（Toxicology and Applied pharmacology, 50, 137-146
(1979)など）に従い容易に製造することができる。
【００３３】かくして得られる本発明の一般式（１）で
表わされるビオチン化ダイオキシン誘導体は、常法に従
い、高速液体クロマトグラフィーなどの各種の精製手段
により適宜その精製を行うことができる。
表わされるビオチン化ダイオキシン誘導体は、常法に従
い、高速液体クロマトグラフィーなどの各種の精製手段
により適宜その精製を行うことができる。
【００３４】本発明のビオチン化ダイオキシン誘導体の
利用によれば、通常の免疫測定法、例えば酵素イムノア
ッセイ（ＥＩＡ）や酵素イムノメトリックアッセイ（Ｅ
ＬＩＳＡ）などの各種免疫分析方法に従って、ダイオキ
シン類、特に２，３，７，８−ＴＣＤＤの特異的且つ高
感度な測定・検出が可能である。
利用によれば、通常の免疫測定法、例えば酵素イムノア
ッセイ（ＥＩＡ）や酵素イムノメトリックアッセイ（Ｅ
ＬＩＳＡ）などの各種免疫分析方法に従って、ダイオキ
シン類、特に２，３，７，８−ＴＣＤＤの特異的且つ高
感度な測定・検出が可能である。
【００３５】かかる本発明の免疫測定法は、本発明のビ
オチン化ダイオキシン誘導体を測定系の標識体として利
用することを必須とし、それ以外は、通常の各種免疫分
析方法に従い実施することができる。
オチン化ダイオキシン誘導体を測定系の標識体として利
用することを必須とし、それ以外は、通常の各種免疫分
析方法に従い実施することができる。
【００３６】測定系の抗ダイオキシン抗体は、所望によ
り、各種の任意の固相に固定化して用いることができ
る。当該固相としては、この種の技術分野において慣用
の各種の固相が利用できる。該固相への抗体の固定化
も、特に制限はなく、通常の物理的結合および化学的結
合のいずれによっても実施することができる。
り、各種の任意の固相に固定化して用いることができ
る。当該固相としては、この種の技術分野において慣用
の各種の固相が利用できる。該固相への抗体の固定化
も、特に制限はなく、通常の物理的結合および化学的結
合のいずれによっても実施することができる。
【００３７】免疫反応も特に制限はなく、通常の免疫測
定法で採用されている条件、例えば、一般には４５℃以
下、通常約４〜４０℃にて約０．５から数時間程度の条
件下に実施することができる。また、反応に使用される
溶媒およびそのｐＨも当該反応に悪影響を与えないもの
であれば、特に制限されない。その例としては、例えば
クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩緩衝液、酢酸
緩衝液などを挙げることができる。
定法で採用されている条件、例えば、一般には４５℃以
下、通常約４〜４０℃にて約０．５から数時間程度の条
件下に実施することができる。また、反応に使用される
溶媒およびそのｐＨも当該反応に悪影響を与えないもの
であれば、特に制限されない。その例としては、例えば
クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩緩衝液、酢酸
緩衝液などを挙げることができる。
【００３８】本発明測定法は、好適には、本発明標識体
を用いる競合法に従い実施することができる。例えば、
抗ダイオキシン抗体を固相化してなる固相化抗体に、標
識体としての本発明誘導体の存在下に、測定対象のダイ
オキシン類を含み得る検体を加えて、抗原抗体反応（競
合）を行わせる。次いで、固相化抗体に結合した標識体
を通常のアビジンからなる検出試薬を用いて測定する。
を用いる競合法に従い実施することができる。例えば、
抗ダイオキシン抗体を固相化してなる固相化抗体に、標
識体としての本発明誘導体の存在下に、測定対象のダイ
オキシン類を含み得る検体を加えて、抗原抗体反応（競
合）を行わせる。次いで、固相化抗体に結合した標識体
を通常のアビジンからなる検出試薬を用いて測定する。
【００３９】ここでアビジンからなる検出試薬として
は、特に制限されることなく一般に当業界で採用されて
いる各種の標識剤で修飾されたアビジン或いはストレプ
トアビジンを広く用いることができる。アビジンの標識
剤としては、特に制限されず、従来公知のものまたは将
来使用され得るいずれのものをも用いることができる。
具体的には、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）やペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素類を好ましいもの
として例示することができる。これら標識剤によるアビ
ジンの修飾は、自体公知の方法に従って実施できる。ま
た、これらの修飾体は、市販品としても入手できる。
は、特に制限されることなく一般に当業界で採用されて
いる各種の標識剤で修飾されたアビジン或いはストレプ
トアビジンを広く用いることができる。アビジンの標識
剤としては、特に制限されず、従来公知のものまたは将
来使用され得るいずれのものをも用いることができる。
具体的には、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）やペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素類を好ましいもの
として例示することができる。これら標識剤によるアビ
ジンの修飾は、自体公知の方法に従って実施できる。ま
た、これらの修飾体は、市販品としても入手できる。
【００４０】尚、標準抗原（スタンダード）としては、
前記一般式（２）で表される化合物が利用でき、特に該
式中、Ｘが水素原子およびｎが４である化合物が好まし
いものとして例示できる。
前記一般式（２）で表される化合物が利用でき、特に該
式中、Ｘが水素原子およびｎが４である化合物が好まし
いものとして例示できる。
【００４１】本発明に係わるダイオキシン類の特異的測
定・検出法の特に好ましい１例としては、後述する実施
例に記載の高感度ＥＬＩＳＡを例示することができる。
定・検出法の特に好ましい１例としては、後述する実施
例に記載の高感度ＥＬＩＳＡを例示することができる。
【００４２】尚、本発明に係わるダイオキシン類の測定
・検出に際しては、本発明ビオチン化ダイオキシン誘導
体を有効成分として含有する測定キットを利用するのが
簡便である。かかるキットには、当該誘導体に加えて、
前記したアビジンからなる検出試薬、抗ダイオキシン抗
体、標準抗原およびアッセイ緩衝液などの、当該測定・
検出を実施するのに際して必要な、任意の他の試薬をさ
らに包含させることができる。
・検出に際しては、本発明ビオチン化ダイオキシン誘導
体を有効成分として含有する測定キットを利用するのが
簡便である。かかるキットには、当該誘導体に加えて、
前記したアビジンからなる検出試薬、抗ダイオキシン抗
体、標準抗原およびアッセイ緩衝液などの、当該測定・
検出を実施するのに際して必要な、任意の他の試薬をさ
らに包含させることができる。
【００４３】本発明に係わるダイオキシン類の測定法
は、被検物質としてのヒトおよび動物中の、即ちヒトお
よび動物の組織、血液、尿、骨髄液、唾液および魚類の
組織および血液中の、ダイオキシン類の測定乃至検出に
有効な手段を与えるものであり、外因性物質の生体刺激
−分泌機構或いは臓器組織への影響の解明・研究に役立
つものである。
は、被検物質としてのヒトおよび動物中の、即ちヒトお
よび動物の組織、血液、尿、骨髄液、唾液および魚類の
組織および血液中の、ダイオキシン類の測定乃至検出に
有効な手段を与えるものであり、外因性物質の生体刺激
−分泌機構或いは臓器組織への影響の解明・研究に役立
つものである。
【００４４】また、本発明方法は、河川、海水、排水、
大気、土壌などを被検物質として、これら環境中のダイ
オキシン類の測定・検出にも有用である。
大気、土壌などを被検物質として、これら環境中のダイ
オキシン類の測定・検出にも有用である。
【００４５】尚、本発明測定法に利用される抗ダイオキ
シン抗体は、測定対象であるダイオキシン類に特異反応
性を有するものであれば、特に制限はなく、これらは前
記した各種公知の抗体或いはそれらに準じて製造した抗
体であることができる。該抗体には、温血動物の抗血清
や鶏卵抗体などのポリクローナル抗体およびモノクロー
ナル抗体が含有される。
シン抗体は、測定対象であるダイオキシン類に特異反応
性を有するものであれば、特に制限はなく、これらは前
記した各種公知の抗体或いはそれらに準じて製造した抗
体であることができる。該抗体には、温血動物の抗血清
や鶏卵抗体などのポリクローナル抗体およびモノクロー
ナル抗体が含有される。
【００４６】当該抗体は、測定対象とするダイオキシン
類に応じて適宜選択することができる。好ましくは、
２，３，７，８−ＴＣＤＤと反応性を有する抗体である
ことができる。
類に応じて適宜選択することができる。好ましくは、
２，３，７，８−ＴＣＤＤと反応性を有する抗体である
ことができる。
【００４７】また、ダイオキシン類のような低分子有機
化合物を抗原として産生する抗体の力価においては、一
般に、ポリクローナル抗体が優れていることが本発明者
により確認されており、本発明でもかかるポリクローナ
ル抗体の利用をより好ましいものとして例示することが
できる。
化合物を抗原として産生する抗体の力価においては、一
般に、ポリクローナル抗体が優れていることが本発明者
により確認されており、本発明でもかかるポリクローナ
ル抗体の利用をより好ましいものとして例示することが
できる。
【００４８】かかる抗体は、免疫抗原を温血動物（ヒト
を除く）に免疫することにより収得できる。その方法な
いし手法は、基本的には常法に従うことができる。
を除く）に免疫することにより収得できる。その方法な
いし手法は、基本的には常法に従うことができる。
【００４９】上記において免疫抗原としては、好ましく
は前記一般式（２）で表される化合物のキャリア蛋白結
合体であることができる。
は前記一般式（２）で表される化合物のキャリア蛋白結
合体であることができる。
【００５０】上記キャリア蛋白としては、抗原またはハ
プテンの免疫原性を高めるものとして当該分野で慣用の
各種キャリア蛋白、例えばアルブミン、グロブリン、チ
オグロブリン、ヘモシアニンなどの各種動物蛋白質やポ
リリジンなどを制限なく採用できる。これらキャリア蛋
白質は、前記した縮合反応と同様にして、慣用の試薬を
用いた縮合反応により、一般式（２）の化合物との結合
体とすることができる。
プテンの免疫原性を高めるものとして当該分野で慣用の
各種キャリア蛋白、例えばアルブミン、グロブリン、チ
オグロブリン、ヘモシアニンなどの各種動物蛋白質やポ
リリジンなどを制限なく採用できる。これらキャリア蛋
白質は、前記した縮合反応と同様にして、慣用の試薬を
用いた縮合反応により、一般式（２）の化合物との結合
体とすることができる。
【００５１】かくして得られるキャリア蛋白結合体は、
それ自体所望の免疫原性を有し、本発明測定法に良好に
採用し得る特異抗体製造用の免疫抗原として使用でき
る。
それ自体所望の免疫原性を有し、本発明測定法に良好に
採用し得る特異抗体製造用の免疫抗原として使用でき
る。
【００５２】尚、かかる免疫抗原は、所望により、上記
キャリア蛋白結合体を高分子吸着体に吸着させて得られ
る吸着体として使用することもできる。
キャリア蛋白結合体を高分子吸着体に吸着させて得られ
る吸着体として使用することもできる。
【００５３】ここで、高分子吸着体としては、免疫原性
を高めるものとして、当該分野で慣用される各種高分子
物質を採用することができ、例えば、ポリビニルピロリ
ドン、ラテックス、ブタチオグロブリンなどの血清蛋白
質および炭素末などを例示できる。該高分子吸着体と上
記キャリア蛋白結合体とを常法に従い混和することによ
り所望の吸着体が得られる。
を高めるものとして、当該分野で慣用される各種高分子
物質を採用することができ、例えば、ポリビニルピロリ
ドン、ラテックス、ブタチオグロブリンなどの血清蛋白
質および炭素末などを例示できる。該高分子吸着体と上
記キャリア蛋白結合体とを常法に従い混和することによ
り所望の吸着体が得られる。
【００５４】上記免疫抗原を用いた免疫化および所望の
抗体の取得操作も、常法に従うことができる。例えば、
ポリクロ−ナル抗体の製造は、ウサギ、ヒツジ、モルモ
ット、ニワトリのような温血動物に、上記免疫抗原を、
通常、フロイントの完全アジュバントと混和して調製し
た乳化物を、複数回注射免疫し、得られる抗血清を常法
に従い取得することにより実施できる。また、ニワトリ
の場合には、上記免疫抗原を複数回免疫して、該ニワト
リが産卵する鶏卵にイムノグロブリン（ＩｇＹ）を産生
させ、そして該鶏卵の卵黄より、常法に従いＩｇＹを取
得することによっても、所望のポリクローナル抗体を得
ることができる。
抗体の取得操作も、常法に従うことができる。例えば、
ポリクロ−ナル抗体の製造は、ウサギ、ヒツジ、モルモ
ット、ニワトリのような温血動物に、上記免疫抗原を、
通常、フロイントの完全アジュバントと混和して調製し
た乳化物を、複数回注射免疫し、得られる抗血清を常法
に従い取得することにより実施できる。また、ニワトリ
の場合には、上記免疫抗原を複数回免疫して、該ニワト
リが産卵する鶏卵にイムノグロブリン（ＩｇＹ）を産生
させ、そして該鶏卵の卵黄より、常法に従いＩｇＹを取
得することによっても、所望のポリクローナル抗体を得
ることができる。
【００５５】またかかる抗体は、勿論モノクローナル抗
体として取得することもできる。該モノクローナル抗体
は、例えば上記免疫抗原をフロイントの完全アジュバン
トとともにマウスに複数回投与して免疫化し、抗体を産
生させるとともに、例えば細胞融合法などの常法に従
い、得られる抗体産生細胞と骨髄脾細胞とを融合し、ク
ローニングし、目的とする抗体を産生する単一クローン
細胞を分離し、該細胞の培養により取得することができ
る。
体として取得することもできる。該モノクローナル抗体
は、例えば上記免疫抗原をフロイントの完全アジュバン
トとともにマウスに複数回投与して免疫化し、抗体を産
生させるとともに、例えば細胞融合法などの常法に従
い、得られる抗体産生細胞と骨髄脾細胞とを融合し、ク
ローニングし、目的とする抗体を産生する単一クローン
細胞を分離し、該細胞の培養により取得することができ
る。
【００５６】かくして得られる抗体は、所望により、硫
安塩析、イオン交換クロマトグラフイー、アフィニティ
ークロマトグラフイーなどの常法に従いさらに精製する
ことができる。
安塩析、イオン交換クロマトグラフイー、アフィニティ
ークロマトグラフイーなどの常法に従いさらに精製する
ことができる。
【００５７】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。しかし、これらの実施例は非制限的なものであ
り、本発明の範囲はそれらの例によって限定解釈される
べきものではない。 実施例１ 後記参考例で得た一般式（２）の化合物（Ｘ＝水素原
子、ｎ＝４）を出発原料として用いて、本発明のビオチ
ン化ダイオキシン誘導体を製造した。
明する。しかし、これらの実施例は非制限的なものであ
り、本発明の範囲はそれらの例によって限定解釈される
べきものではない。 実施例１ 後記参考例で得た一般式（２）の化合物（Ｘ＝水素原
子、ｎ＝４）を出発原料として用いて、本発明のビオチ
ン化ダイオキシン誘導体を製造した。
【００５８】即ち、水溶性カルボジイミド（３．８μ
Ｌ；ペプチド研）を、上記化合物（２．３ｍｇ、５．４
μmol）およびＢｏｃ−Ｎ2Ｈ3（１．４ｍｇ、１０．７
μmol）のジメチルホルムアミド溶液（１．０ｍＬ）に
−１０℃にて添加し、室温にて１８時間撹拌した。反応
混合物に氷冷下に蒸留水を加え固化した固化物を集め減
圧乾燥して、１位側鎖が Boc-NHNHCO(CH2)4CONH- の
３，７，８−トリクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン
２．５ｍｇを得た。
Ｌ；ペプチド研）を、上記化合物（２．３ｍｇ、５．４
μmol）およびＢｏｃ−Ｎ2Ｈ3（１．４ｍｇ、１０．７
μmol）のジメチルホルムアミド溶液（１．０ｍＬ）に
−１０℃にて添加し、室温にて１８時間撹拌した。反応
混合物に氷冷下に蒸留水を加え固化した固化物を集め減
圧乾燥して、１位側鎖が Boc-NHNHCO(CH2)4CONH- の
３，７，８−トリクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン
２．５ｍｇを得た。
【００５９】これをトリクロロ酢酸（ＴＦＡ）（０．５
ｍＬ）に溶解し、室温で４０分間撹拌して脱Ｂｏｃ化
後、後記参考例で得たビオチニル−Ｌ−Ａｒｇ（ｐｂ
ｆ）−Ｌ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ（７．３ｍｇ、６．
８μmol）と、ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中、上記と同様に
水溶性カルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアズ
ール（ＷＳＣＬ／ＨＯＢｔ）法で室温２日間縮合した。
ｍＬ）に溶解し、室温で４０分間撹拌して脱Ｂｏｃ化
後、後記参考例で得たビオチニル−Ｌ−Ａｒｇ（ｐｂ
ｆ）−Ｌ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ（７．３ｍｇ、６．
８μmol）と、ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中、上記と同様に
水溶性カルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアズ
ール（ＷＳＣＬ／ＨＯＢｔ）法で室温２日間縮合した。
【００６０】反応混合物に、氷冷化、蒸留水を加えて固
化し、固化物を集めて減圧下に乾燥した。この５．０ｍ
ｇを、蒸留水（６５μＬ）およびトリイソプロピルシラ
ン（６５μＬ）を含むＴＦＡ（２．４ｍＬ）に溶解し、
室温で２時間撹拌後、ジエチルエーテルを加えて固化、
乾燥して、目的の粗生成物４．５ｍｇを得た。
化し、固化物を集めて減圧下に乾燥した。この５．０ｍ
ｇを、蒸留水（６５μＬ）およびトリイソプロピルシラ
ン（６５μＬ）を含むＴＦＡ（２．４ｍＬ）に溶解し、
室温で２時間撹拌後、ジエチルエーテルを加えて固化、
乾燥して、目的の粗生成物４．５ｍｇを得た。
【００６１】この粗生成物（４．５ｍｇ）を１０％酢酸
（１ｍＬ）に溶解後、０．１％ＴＦＡ/アセトニトリル
混合溶媒の直線濃度勾配（８５/１５→２０/８０，３０
分）による分取用逆相ＨＰＬＣにて精製して、目的の化
合物（一般式（１）の化合物：Ｘ＝水素原子、ｍ＝２、
ｎ＝４、Ｒ2＝Ｌ−Ａｒｇ）０．２ｍｇを得た。
（１ｍＬ）に溶解後、０．１％ＴＦＡ/アセトニトリル
混合溶媒の直線濃度勾配（８５/１５→２０/８０，３０
分）による分取用逆相ＨＰＬＣにて精製して、目的の化
合物（一般式（１）の化合物：Ｘ＝水素原子、ｍ＝２、
ｎ＝４、Ｒ2＝Ｌ−Ａｒｇ）０．２ｍｇを得た。
【００６２】マススペクトルにて、理論値（分子量：９
８３．３７８）に一致するピークを確認した。 実施例２ 抗体固定化プレートの作成 ９６ウエルのマイクロプレート（Maxi Sorp Nunc）の各
ウエルに、０．１Ｍクエン酸緩衝液で２００倍に希釈し
たヤギ抗ウサギＩｇＧ血清（Jackson immuno Researc
h）をそれぞれ１００μＬづつ分注した。２５℃で２時
間静置後、上清を捨て、ブロックエース（大日本製薬）
を各ウエルに３４０μＬ分注して２５℃２時間静置し
た。洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１５Ｍ
ＮａＣｌ）で５回洗浄後、０．０１ＭＰＢＳ緩衝液
（０．０５％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，１０
ｍＭ ＥＤＴＡ含有）で１０００倍に希釈した抗ダイオ
キシン抗体（後記参考例で得た抗体調製物）を各ウエル
に１００μＬづつ分注した。４℃で２４時間静置し、抗
ダイオキシン抗体が固相化された抗体固相化プレートを
得た。 標準液の調整 参考例で得た一般式（２）の化合物（Ｘ＝水素原子、ｎ
＝４）の１ｍｇをヘキサメチレンスルフォラミド（Hexa
methylphospharamide）またはＤＭＳＯに溶解後、ＰＢ
Ｓ緩衝液にて１０００倍に希釈し、濃度１μg／ｍＬの
標準液とした。さらにこの溶液について５倍希釈の操作
を行い、２００；４０；８；１．６；０．３２；０．０
６４μg／ｍＬの標準希釈液をそれぞれ調製した。 標識体の調製 実施例１で得た本発明化合物（一般式（１）の化合物：
Ｘ＝水素原子、ｍ＝２、ｎ＝４、Ｒ2＝Ｌ−Ａｒｇ）の
２００μｇを０．１Ｎ酢酸に溶解し、使用時にＰＢＳ緩
衝液で１０００倍に希釈して使用した。 発色液の調整 ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）
の２００μｇをＰＢＳ緩衝液で２０００倍に希釈して使
用した。
８３．３７８）に一致するピークを確認した。 実施例２ 抗体固定化プレートの作成 ９６ウエルのマイクロプレート（Maxi Sorp Nunc）の各
ウエルに、０．１Ｍクエン酸緩衝液で２００倍に希釈し
たヤギ抗ウサギＩｇＧ血清（Jackson immuno Researc
h）をそれぞれ１００μＬづつ分注した。２５℃で２時
間静置後、上清を捨て、ブロックエース（大日本製薬）
を各ウエルに３４０μＬ分注して２５℃２時間静置し
た。洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１５Ｍ
ＮａＣｌ）で５回洗浄後、０．０１ＭＰＢＳ緩衝液
（０．０５％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，１０
ｍＭ ＥＤＴＡ含有）で１０００倍に希釈した抗ダイオ
キシン抗体（後記参考例で得た抗体調製物）を各ウエル
に１００μＬづつ分注した。４℃で２４時間静置し、抗
ダイオキシン抗体が固相化された抗体固相化プレートを
得た。 標準液の調整 参考例で得た一般式（２）の化合物（Ｘ＝水素原子、ｎ
＝４）の１ｍｇをヘキサメチレンスルフォラミド（Hexa
methylphospharamide）またはＤＭＳＯに溶解後、ＰＢ
Ｓ緩衝液にて１０００倍に希釈し、濃度１μg／ｍＬの
標準液とした。さらにこの溶液について５倍希釈の操作
を行い、２００；４０；８；１．６；０．３２；０．０
６４μg／ｍＬの標準希釈液をそれぞれ調製した。 標識体の調製 実施例１で得た本発明化合物（一般式（１）の化合物：
Ｘ＝水素原子、ｍ＝２、ｎ＝４、Ｒ2＝Ｌ−Ａｒｇ）の
２００μｇを０．１Ｎ酢酸に溶解し、使用時にＰＢＳ緩
衝液で１０００倍に希釈して使用した。 発色液の調整 ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）
の２００μｇをＰＢＳ緩衝液で２０００倍に希釈して使
用した。
【００６３】また、発色剤には、０．０１５％過酸化水
素を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム−クエン酸緩衝液
（ｐＨ５．０）１０ｍＬにＯＰＤ錠（１０ｍｇ：Ｓｉｇ
ｍａ）を溶解し、最終濃度１ｍｇ／ｍｌになるように使
用時に調製した。 免疫測定 抗ダイオキシン抗体を固定化したプレートの各ウエルを
洗浄後、各段階希釈の標準品５０μＬまたは測定すべき
検体５０μＬを加えた。さらに上記の標識体５０μＬを
添加し、マイクロタイタープレートを密封して室温にて
２時間反応させた。その各ウエルの液を流し除いて５回
洗浄操作を繰り返した。
素を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム−クエン酸緩衝液
（ｐＨ５．０）１０ｍＬにＯＰＤ錠（１０ｍｇ：Ｓｉｇ
ｍａ）を溶解し、最終濃度１ｍｇ／ｍｌになるように使
用時に調製した。 免疫測定 抗ダイオキシン抗体を固定化したプレートの各ウエルを
洗浄後、各段階希釈の標準品５０μＬまたは測定すべき
検体５０μＬを加えた。さらに上記の標識体５０μＬを
添加し、マイクロタイタープレートを密封して室温にて
２時間反応させた。その各ウエルの液を流し除いて５回
洗浄操作を繰り返した。
【００６４】各ウエルに上記で調製した発色液を１００
μＬずつ注入し、室温で１５分間反応させた。その後、
各ウエルに酵素反応停止液として２Ｎ硫酸１００μＬを
加え、マイクロタイタープレート用吸光度計を用いて、
波長４９０nmにて各ウエル内の液の吸光度をそれぞれ測
定した。
μＬずつ注入し、室温で１５分間反応させた。その後、
各ウエルに酵素反応停止液として２Ｎ硫酸１００μＬを
加え、マイクロタイタープレート用吸光度計を用いて、
波長４９０nmにて各ウエル内の液の吸光度をそれぞれ測
定した。
【００６５】かくして得られた標準曲線を図１に示す。 参考例１ １−アミノ−３，７，８−トリクロロジベンゾ−ｐ−ダ
イオキシン（３０．０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を４−ジ
メチルアミノピリジン（６．１ｍｇ、０．０５ｍｍｏ
ｌ）を含む無水ピリジン溶液（２．０ｍＬ）に溶解し
た。
イオキシン（３０．０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を４−ジ
メチルアミノピリジン（６．１ｍｇ、０．０５ｍｍｏ
ｌ）を含む無水ピリジン溶液（２．０ｍＬ）に溶解し
た。
【００６６】アジピン酸モノメチルエステル（７４．１
μＬ、０．５ｍｍｏｌ）を無水ピリジン溶液（２．０ｍ
Ｌ）に溶解し、塩化チオニル（３６０μＬ、５ｍｍｏ
ｌ）を滴下して窒素雰囲気下に５時間還流後、溶媒を留
去し乾燥した。
μＬ、０．５ｍｍｏｌ）を無水ピリジン溶液（２．０ｍ
Ｌ）に溶解し、塩化チオニル（３６０μＬ、５ｍｍｏ
ｌ）を滴下して窒素雰囲気下に５時間還流後、溶媒を留
去し乾燥した。
【００６７】この酸クロリドを無水ピリジン（１．０ｍ
Ｌ）に溶解し、上記１−アミノ−３，７，８−トリクロ
ロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンのピリジン溶液に加え、
室温で３日間撹拌した。溶媒を留去後、エーテルを加え
固化し、沈殿を集めて目的のメチルアジポイル誘導体を
得た（１４．０ｍｇ／３１．５％）。
Ｌ）に溶解し、上記１−アミノ−３，７，８−トリクロ
ロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンのピリジン溶液に加え、
室温で３日間撹拌した。溶媒を留去後、エーテルを加え
固化し、沈殿を集めて目的のメチルアジポイル誘導体を
得た（１４．０ｍｇ／３１．５％）。
【００６８】この１４．０ｍｇ（３１．５μｍｏｌ）を
９５％エタノール（５．０ｍＬ）に懸濁し、０．１Ｎ
ＮａＯＨ（３７８μＬ、３７８μｍｏｌ）を加え７０℃
にて４時間撹拌した。０〜４℃に冷却後、１Ｎ ＨＣｌ
を加え、酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を１
Ｎ ＨＣｌ、ついで飽和食塩水でそれぞれ３回洗浄後、
無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、溶媒を留去
した。残査をジオキサン存在下凍結乾燥して１０．０ｍ
ｇ（７３．５％）の目的物（一般式（２）の化合物：Ｘ
＝水素原子、ｎ＝４）を得た。純度はＨＰＬＣにて９８
％以上であることを確認した。 参考例２ ビオチニル−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｏ
Ｈは、常法の固相合成法に従い合成した即ち、Ｈ−Ａｒ
ｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｒｔ（２−ＣＬ）−樹脂１．０ｇ
（０．４９ｍｍｏｌ）をＤＭＦで洗浄後、ＨＡＴＵ試薬
（０．７５ｇ、１．９６ｍｍｏｌ）を用いて、Ｆｍｏｃ
−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（１．２７ｇ、１．９６ｍｍ
ｏｌ）を縮合した。ペプチド樹脂を５０％ピペリジンの
ＤＭＦ溶液（１０ｍｌ）で室温２０分間処理して脱Ｆｍ
ｏｃ後，同様にしてビオチン（０．４８ｇ、１．９６ｍ
ｍｏｌ）を縮合した。ペプチド樹脂を、酢酸：トリフロ
ロエタノール：ジクロロメタン＝１：２：７（２５ｍ
ｌ）で室温１時間処理してペプチドを樹脂から脱離し
た。樹脂をろ過にて除去し、ろ液を留去して残渣にエー
テルを加えて固化し沈澱物として目的化合物５４０ｍｇ
を得た。 ＨＡＴＵ：0-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetra
methylunonium hexafluorophosphate 参考例３ 参考例１で得た化合物をハプテンとして、常法に従い、
キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ；Ｐｉ
ｅｒｃｅ）と縮合させ免疫用コンジュゲートを作成し
た。
９５％エタノール（５．０ｍＬ）に懸濁し、０．１Ｎ
ＮａＯＨ（３７８μＬ、３７８μｍｏｌ）を加え７０℃
にて４時間撹拌した。０〜４℃に冷却後、１Ｎ ＨＣｌ
を加え、酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を１
Ｎ ＨＣｌ、ついで飽和食塩水でそれぞれ３回洗浄後、
無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、溶媒を留去
した。残査をジオキサン存在下凍結乾燥して１０．０ｍ
ｇ（７３．５％）の目的物（一般式（２）の化合物：Ｘ
＝水素原子、ｎ＝４）を得た。純度はＨＰＬＣにて９８
％以上であることを確認した。 参考例２ ビオチニル−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｏ
Ｈは、常法の固相合成法に従い合成した即ち、Ｈ−Ａｒ
ｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｒｔ（２−ＣＬ）−樹脂１．０ｇ
（０．４９ｍｍｏｌ）をＤＭＦで洗浄後、ＨＡＴＵ試薬
（０．７５ｇ、１．９６ｍｍｏｌ）を用いて、Ｆｍｏｃ
−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（１．２７ｇ、１．９６ｍｍ
ｏｌ）を縮合した。ペプチド樹脂を５０％ピペリジンの
ＤＭＦ溶液（１０ｍｌ）で室温２０分間処理して脱Ｆｍ
ｏｃ後，同様にしてビオチン（０．４８ｇ、１．９６ｍ
ｍｏｌ）を縮合した。ペプチド樹脂を、酢酸：トリフロ
ロエタノール：ジクロロメタン＝１：２：７（２５ｍ
ｌ）で室温１時間処理してペプチドを樹脂から脱離し
た。樹脂をろ過にて除去し、ろ液を留去して残渣にエー
テルを加えて固化し沈澱物として目的化合物５４０ｍｇ
を得た。 ＨＡＴＵ：0-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetra
methylunonium hexafluorophosphate 参考例３ 参考例１で得た化合物をハプテンとして、常法に従い、
キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ；Ｐｉ
ｅｒｃｅ）と縮合させ免疫用コンジュゲートを作成し
た。
【００６９】即ち、上記化合物の５．２ｍｇを２０％イ
ソプロパノール含有リン酸緩衝液１ｍＬに溶解し、０．
１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）２ｍＬに溶解したＫＬＨ
（２０ｍｇ）と混合し、水溶性カルボジイミド（１００
ｍｇ：ペプチド研）を添加して、室温で３０分間反応さ
せた。
ソプロパノール含有リン酸緩衝液１ｍＬに溶解し、０．
１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）２ｍＬに溶解したＫＬＨ
（２０ｍｇ）と混合し、水溶性カルボジイミド（１００
ｍｇ：ペプチド研）を添加して、室温で３０分間反応さ
せた。
【００７０】上記反応液（３ｍＬ）を５０％ポリビニル
ピロリドン（３ｍＬ：Ｍｅｒｃｋ）と混和し、これを３
等分し、さらにそれぞれ等量のフロイントの完全アジュ
バント（１ｍＬ：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を加えて乳化
した。この乳化物を、家兎３匹（日本ホワイト、オス、
体重２．０〜２．５ｋｇ）に免疫抗原が０．３ｍｇ/家
兎になるように調整して皮内注射した。追加免疫を初回
の注射量の１/２の投与量にて２週間毎に６回注射免疫
を繰り返すことにより行った。最終免疫１週間後、家兎
の血液を全採血し、これを３７℃にて１時間、その後４
℃にて一夜放置し、３，０００ｒｐｍで遠心分離するこ
とにより充分な力価の抗血清を収得した。これは凍結乾
燥して保存した。
ピロリドン（３ｍＬ：Ｍｅｒｃｋ）と混和し、これを３
等分し、さらにそれぞれ等量のフロイントの完全アジュ
バント（１ｍＬ：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を加えて乳化
した。この乳化物を、家兎３匹（日本ホワイト、オス、
体重２．０〜２．５ｋｇ）に免疫抗原が０．３ｍｇ/家
兎になるように調整して皮内注射した。追加免疫を初回
の注射量の１/２の投与量にて２週間毎に６回注射免疫
を繰り返すことにより行った。最終免疫１週間後、家兎
の血液を全採血し、これを３７℃にて１時間、その後４
℃にて一夜放置し、３，０００ｒｐｍで遠心分離するこ
とにより充分な力価の抗血清を収得した。これは凍結乾
燥して保存した。
【００７１】上記で得た抗血清の力価および各種ダイオ
キシン類との交差反応性を検討した結果、免疫した３匹
の家兎のいずれから得られた抗血清もダイオキシン類と
特異的な反応性を示した。
キシン類との交差反応性を検討した結果、免疫した３匹
の家兎のいずれから得られた抗血清もダイオキシン類と
特異的な反応性を示した。
【００７２】また、１−アミノ−３，７，８−トリクロ
ロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンまたは１−アミノ−２，
３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン
をカラム（ＦＭＰ活性化セルロファイン：生化学工業）
に結合し、このカラムを用いて上記で得た抗血清のアフ
ィニティークロマトグラフィーを行った。
ロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンまたは１−アミノ−２，
３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン
をカラム（ＦＭＰ活性化セルロファイン：生化学工業）
に結合し、このカラムを用いて上記で得た抗血清のアフ
ィニティークロマトグラフィーを行った。
【００７３】上記アフィニティークロマトグラフィー
（１Ｍ酢酸で溶出）により、３，７，８−トリクロロジ
ベンゾ−ｐ−ダイオキシンおよび／または２，３，７，
８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンに特異的
な反応性をもち、ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンおよび含
クロロフェノールとは実質的に交差反応しないことで特
徴付けられる抗体調製物を収得した。
（１Ｍ酢酸で溶出）により、３，７，８−トリクロロジ
ベンゾ−ｐ−ダイオキシンおよび／または２，３，７，
８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンに特異的
な反応性をもち、ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンおよび含
クロロフェノールとは実質的に交差反応しないことで特
徴付けられる抗体調製物を収得した。
【図１】実施例２のに従い作成された本発明免疫測定
法における標準曲線である。
法における標準曲線である。
Claims (3)
- 【請求項１】一般式（１）： 【化１】 （式中、Ｘは水素原子または塩素原子を、Ｒ1はビオチ
ン残基を、Ｒ2は同一または相異なってアルギニン残基
またはリジン残基を、ｎは１〜５の整数を、またｍは１
〜３の整数を、それぞれ示す）で表わされるビオチン化
ダイオキシン誘導体。 - 【請求項２】Ｘが水素原子、ｎが４およびｍが２である
請求項１に記載の一般式（１）で表わされる誘導体。 - 【請求項３】請求項１に記載のビオチン化ダイオキシン
誘導体を標識体として利用することを特徴とする、ダイ
オキシン類の免疫測定法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000039914A JP2001226371A (ja) | 2000-02-17 | 2000-02-17 | ダイオキシン誘導体およびこれを使用した測定法 |
| US10/203,628 US20030108955A1 (en) | 2000-02-17 | 2001-02-16 | Dioxin derivatives and method of measurement therewith |
| EP01904503A EP1256579A4 (en) | 2000-02-17 | 2001-02-16 | DIOXIN DERIVATIVES AND MEASUREMENT METHOD BASED ON SAID DERIVATIVES |
| AU2001232321A AU2001232321B2 (en) | 2000-02-17 | 2001-02-16 | Dioxin derivatives and method of measurement therewith |
| CA002400840A CA2400840A1 (en) | 2000-02-17 | 2001-02-16 | Dioxin derivatives and method of measurement therewith |
| AU3232101A AU3232101A (en) | 2000-02-17 | 2001-02-16 | Dioxin derivatives and method of measurement therewith |
| PCT/JP2001/001118 WO2001060812A1 (fr) | 2000-02-17 | 2001-02-16 | Derives de dioxine et procede de mesure fonde sur lesdits derives |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000039914A JP2001226371A (ja) | 2000-02-17 | 2000-02-17 | ダイオキシン誘導体およびこれを使用した測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001226371A true JP2001226371A (ja) | 2001-08-21 |
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ID=18563403
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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| EP (1) | EP1256579A4 (ja) |
| JP (1) | JP2001226371A (ja) |
| AU (2) | AU3232101A (ja) |
| CA (1) | CA2400840A1 (ja) |
| WO (1) | WO2001060812A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003075011A1 (fr) * | 2002-03-07 | 2003-09-12 | Enbiotec Laboratories Co., Ltd. | Instruments de detection de substances de faible poids moleculaire |
| JP2004292367A (ja) * | 2003-03-27 | 2004-10-21 | Takuma Co Ltd | ２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルカルボン酸およびそれを用いたダイオキシン類の測定方法 |
| WO2006132027A1 (ja) | 2005-06-07 | 2006-12-14 | Miura Co., Ltd. | ダイオキシン類の分析用試料調製方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111718321A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-09-29 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种二噁英抗体及其制备方法与应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3629194A1 (de) * | 1985-08-28 | 1987-03-26 | Yeda Res & Dev | Biotinylierungsreagentien |
| JPH1175841A (ja) * | 1997-08-29 | 1999-03-23 | Toshiba Corp | 検出方法、検出装置および検出試薬 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4238472A (en) * | 1978-11-27 | 1980-12-09 | United States Of America | Radioimmunoassay for chlorinated dibenzo-p-dioxins |
| US4865972A (en) * | 1986-08-22 | 1989-09-12 | Westinghouse Electric Corp. | Antibody-based bioassay for enzyme-inducing chemicals |
| US5128244A (en) * | 1987-05-14 | 1992-07-07 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Assay for dioxins |
| US5429925A (en) * | 1988-01-26 | 1995-07-04 | The Regents Of The University Of California | Method for immunodiagnostic detection of dioxins at low concentrations |
| US5464746A (en) * | 1991-12-17 | 1995-11-07 | Abbott Laboratories | Haptens, tracers, immunogens and antibodies for carbazole and dibenzofuran derivatives |
| AU7043594A (en) * | 1993-05-28 | 1994-12-20 | Ensys Environmental Products, Inc. | A polychlorinated biphenyls (pcb) immunoassay method, its components and a kit for use in performing the same |
| US5674697A (en) * | 1995-03-16 | 1997-10-07 | Ecochem Research, Inc. | High sensitivity immunoassay for polychlorinated dibenzo-p-dioxins and polychlorinated dibenzofurans |
| US6127136A (en) * | 1995-10-23 | 2000-10-03 | Paracelsian, Inc. | Detection of dioxin-like compounds by detection of transformed Ah receptor/ARNT complex |
| US6509462B2 (en) * | 2000-07-18 | 2003-01-21 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Estradiol derivative and immunoassy using the same |
| JP2002311030A (ja) * | 2000-11-10 | 2002-10-23 | Yanaihara Kenkyusho:Kk | フタル酸エステル類の測定法 |
-
2000
- 2000-02-17 JP JP2000039914A patent/JP2001226371A/ja not_active Ceased
-
2001
- 2001-02-16 AU AU3232101A patent/AU3232101A/xx not_active Withdrawn
- 2001-02-16 CA CA002400840A patent/CA2400840A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-16 EP EP01904503A patent/EP1256579A4/en not_active Withdrawn
- 2001-02-16 AU AU2001232321A patent/AU2001232321B2/en not_active Ceased
- 2001-02-16 US US10/203,628 patent/US20030108955A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-16 WO PCT/JP2001/001118 patent/WO2001060812A1/ja not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3629194A1 (de) * | 1985-08-28 | 1987-03-26 | Yeda Res & Dev | Biotinylierungsreagentien |
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| EP1489420A1 (en) * | 2002-03-07 | 2004-12-22 | Enbiotec Laboratories Co., Ltd. | Instruments for detecting low-molecular weight substance |
| EP1489420A4 (en) * | 2002-03-07 | 2006-05-03 | Enbiotec Lab Co Ltd | INSTRUMENTS FOR DETECTING LOW MOLECULAR WEIGHT SUBSTANCES |
| JP2004292367A (ja) * | 2003-03-27 | 2004-10-21 | Takuma Co Ltd | ２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルカルボン酸およびそれを用いたダイオキシン類の測定方法 |
| WO2006132027A1 (ja) | 2005-06-07 | 2006-12-14 | Miura Co., Ltd. | ダイオキシン類の分析用試料調製方法 |
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| EP1256579A1 (en) | 2002-11-13 |
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| AU3232101A (en) | 2001-08-27 |
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