JPH0210159A - 螢光偏光免疫検定法原理によるタンパク質の測定方法およびハイブリッドクローン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、螢光偏光免疫検定法原理によるタンパク質の
測定方法に関する。

従来の技術 特に臨床分野における診断法の領域では最近２０年間に
、放射線免疫検定法原理による方法から出発して同検出
法の変法が次第に開発された。これらの変法は特異的な
結合能力を有する物質の、次第に精密になった独特な測
定を許す。

極めて鋭敏な検出法として螢光偏光免疫検定法が開発さ
れた。この検定法は、螢光性物質と例えばハシテンのよ
うな小さい分子とから成る複合体が極めて迅速に溶液中
で揺動され、この溶液中に送られかつ螢光性物質を励起
する偏光が、入射と発光との間に起こる複合体の旋回に
よって発光時には偏光解消されることを基礎にしている
。この場合偏光解消度は複合体分子の旋回率に逆比例す
る。螢光性物質をより大きい分子に結合させる場合、例
えば螢光で標識したハプテンを相応の抗体に結合させる
場合、全複合体の運動は極めて限定されていて、偏光は
それが螢光物質に入射する時点からそれが発光される時
点までもは、や偏光解消されずに偏光されて再び溶液か
ら出る。

偏光解消は自体公知の装置で測定することができる。さ
て検出法に関しては前記挙動を利用する。そのために、
特異的に結合可能の被測定・卆−トナーの含有されてい
る溶液中に、螢光性物質を有する被測定・り一トナーか
ら成る複合体および被検出物質ならびに螢光標識分子の
両者に結合可能の抗体を加え、偏光解消の減少を測定す
る。この際抗体の周りで溶液中に存在する結合パートナ
−と螢光標識分子が競合する。次に偏光解消の減少を介
して、結合された螢光標識物質の量を測定することがで
き、この量は被測定物質の溶液中の量の尺度である。

上記方法にとっては、標識１−た結合・ぐ・−トナーお
よび標識結合ノ５−トノ一一と抗体とより成る複合体の
運動性の相違が重要である。このような相違は結合・ｅ
−）ナーが小さい場合のみ起こる。したがってハプテン
に関しては核方法を極めて良好に実施でき、精密な結果
が得られる。

しかしより大きい分子を測定しようとする場合には、標
識分子と、標識分子および抗体から成る複合体との間の
分子の大きさの相違はもは千十分ではなく、偏光解消の
減少を十分に正確に測定することができない。したがっ
てこの検出法は従来は大きな分子に関しては適用するこ
とができなかった。

発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、大きいタンパク質分子に関しても溶液
中で鋭敏に検出することのできる方法を提供することで
あった。

問題点を解決するための手段 前記課題は、冒頭記載の方法において、均質系において
試料溶液を、 ａ）螢光性化合物で標識されていて、ジスルフイｒ架橋
を形成する２個のシスティンを含むアミノ酸６〜１４個
から成るペゾチｒ連鎖（同連鎖は被測定タン・！り質の
エピドープ連鎖に相応する）および ｂ）前記タンＡり質および前記ベゾチｒ連鎖に特異的な
結合能力を有しかつタン・ｆり質の螢光性ペプチＰ連鎖
および天然タン・臂り質に関して高々６倍だけ相違する
分子相対親和性を有する抗体 と一緒に同時に恒温保持しかつ恒温保持された溶液中に
送られた偏光の偏光解消を測定することを特徴とする螢
光偏光免疫検定法原理によるタン・やり質の測定方法に
よって解決される。

本発明により使用される成分、すなわち螢光性化合物で
標識された（ゾチｒおよび抗体を用いて、大きい分子を
溶液中で検出することができた。この検出は極めて鋭敏
である。本発明により使用されるペプ連鎖連鑓は、担体
タン・９り質に結合されて、同時にまた免疫のため、つ
まり必要な抗体を製造するためにも使用することができ
る。

本発明による方法は、特に体液中のタンノ９り質を測定
するために用いられる。被測定タンノ母り質は免疫原性
であり、したがって抗原と称してもよい。核方法は例え
ばホルモン、酵素および他の生物学的活性高分子物質の
検出に好適である。これらの物質は、適当表生体に注射
されると免疫反応を惹起し、抗体の形成をもたらす。

この場合免疫原性なのは、分子全体ではなく、エピドー
プと称される特定範囲である。一般には１０個までのア
ミノ酸を包含しかつ分子の表面に存在する小さい範囲で
ある。タンパク質はその表面にそのようなエピドープを
多数有しているので、免疫の際、個々のエピドープに対
応する多数の種々の抗体が形成される。さらにまた個々
の抗体は、抗原に対する分子相対親和性に関しても相違
している。

分子量の高いタンパク質（螢光偏光免疫検定法において
偏光解消時に分析的に評価できる相違を生じない）の検
出の場合には、本発明によれば螢光性化合物とタンパク
質とから成る複合体の代りに、螢光性化合物と被測定タ
ン・やり質のエピドープ連鎖に相応するペプチド連鎖と
から成る複合体を使用する。この場合エピドープ連鎖と
しては、２個のシスティンを含む６〜１４個のアミノ酸
の連鎖を使用する。２個のシスティンはジスルフイｒ架
橋を形成している。被測定タン・９り質のエピドープ連
鎖が３個以上のシスティンを有する場合には、好ましく
は螢光標識ペプチｒにおいて、限定されたジスルフィＰ
化合物を得るためには、２個を除く全システィンを他の
アミノ酸、好ましくはアラニンと代える。エピドープ連
鎖が３個以上のシスティンを有する場合には、種々の位
置にジスルフイＰ架橋を有する分子から成る混合物が生
成される。

この混合物のために抗体による部門の際に種々の難点の
生じる可能性がある。

ペプチＰは自体公知の方法で製造する。ペプチドの合成
法は一般に公知であって、ここで詳述する必要はないで
あろう。

ペプチド連鎖は螢光性物質で標識される。螢光性化合物
としては、短い螢光半減期を有する化合物が適当である
、つまり螢光性物質は励起後にエネルギーを螢光の形で
極めて迅速に放出し、再び出発状態に復帰するのである
。螢光性物質としては、例えばフルオレジインおよびそ
の誘導体ならびにレゾルフィンである。極めて有利には
レゾルフィンを使用する。

螢光性物質は、自体公知の方法でペプチド連鎖（結合さ
れる。結合は両成分の間で直接性われるかまたはスペー
サを介して行われてもよい。

結合の仕方は使用された螢光性物質および使用されたペ
プチドに依存している。このための方法は当業者にとっ
て周知である。

ベプチＰへの螢光性物質の結合は、螢光性物質が同ペゾ
チドのエビトーゾ機能を妨害しないように行われなけれ
ばならない。したがって好ましくはペプチｒの両鎖端の
一方に結合する。

また本発明による方法の場合には、被測定タンパク質お
よび螢光標識した被ブチｒに特異的な結合能力を有する
抗体を使用する。正確な成績を得るためには、抗体は螢
光標識ペプチド連鎖および天然タン／４’り質に関して
、高々６倍だけ相違する分子相対親和性を有しなければ
ならない。分子相対親和性は自体公知の微量力価−ＥＬ
ＩＳＡによって測定する。この測定のために天然タンパ
ク質を塗布した微量力価板を、抗体および測定すべき物
質（天然タン・母り質、螢光標識ペプチド）と一緒に同
時に数種の希釈度グループにおいて恒温保持する。測定
すべき物質は、同物質に対する抗体の親和性に応じてお
よび測定すべき物質の濃度に応じて抗体の抗原結合を阻
止する。

抗体の結合は、例えば多クローン性抗−マウスＦＣ・ヒ
ツジ抗体−ペルオキシダーゼ複合体を用いる単クローン
性マウス抗体の特異性試験の場合には、抗抗体−酵素複
合体と一緒に恒温保持することによって検出される。核
結合は相応の酵素基質と一緒に恒温保持することによっ
て可視化される。

半最大結合に属する被測定分析体の濃度（Ｍｏｌ／ｌ）
を分子相対親和性と称する。抗体の測定すべき物質への
結合が不良であればある程それだけ分子相対親和性の値
は高くなる。

使用すべき抗体量は実験で確定する。天然タンＡ？り質
を施した微量力価板を、同様に種々の濃度の抗体のみと
一緒に恒温保持し、同様に結合を測定する。分子相対親
和性の上記測定の場合には、半最大結合の観察される抗
体濃度を使用する。

適当な抗体は、例えば、適当な生体を免疫原としての被
測定タン・卆り質で免疫し、次に螢光標識ペゾチＰに対
する抗体の結合強さに従って抗体を選択することによっ
て得ることができる。

同様に適当な生体を免疫原としてのペプチド連鎖で免疫
し、次に天然タンパク質に対する抗体の親和性に従って
同抗体を選択することによって同種の抗体が得られる。

前記の選択は、多クローン性抗体の場合には免疫収着に
よってまたは単クローン性抗体の場合にはスクリーニン
グによって行われる。

本発明方法にとっては両種の抗体が適当である。しかし
好ましくは単クローン性抗体を使用する。本発明方法の
場合には１種の抗体のみを使用するので、同抗体が所望
のエピドープに対して高特異性であり、実際には他の内
生物質との交差反応性を有しない。

タンノ９り質を本発明により測定するだめには、試料溶
液を、螢光標識ペプチド、および被測定タン・やり質に
らびに螢光標識ペプチＰに対して特異的な結合能力を有
する抗体と一緒に恒温保持する。溶液中に送られた偏光
の偏光解消の変化を測定する。この変化は結合された螢
光標識ペプチドの割合の程度である。次に標準曲線との
比較によって計算されうる螢光標識へプチドの量から溶
液中の被測定タンパク質の量が自体公知の方法で計算さ
れる。

本発明の他の対象はバイブｌ）　ｂ’−−マクローン２
Ｅ６および３Ｃ４である。これらのクローンはブダペス
ト条約により１９８８年２月２５１］Ｋ英国在ＥＵＲＯ
ＰＥＡＮ　　Ｃ０ＬＬＥＣＴＩＯＮ　　ＯＦＡＮＩＭＡ
Ｌ　　ＣＥＬＬ　　ＣＵＬＴＵＲＥＳ（ＥＣＡＣＣ）で
寄託され、次の寄託番号を有している：２Ｅ６ＥＣＡＣ
Ｃ８８０２２５０２，３Ｃ４＝ＥＣＡＣＣ８８０２２５
０１゜これらの細胞系統からヒトインシュリンのＡルー
プ−エピドープおよびこのエピドープの螢光標識連鎖と
極めて特異的に反応する単クローン性抗体が得られる。

このような抗体は、螢光偏光測定法でインシュリンの測
定用に使用するのに適している。

本発明により、タンパク質を極めて特異的にかつ極めて
鋭敏に検出することのできる方法が提供される。さらに
同方法に適当な単りＩ】−ン性抗体が提供される。

次に本発明を図面および実施例により詳述する。

例］。

ヒトインシュリンＡ鎖ループに相応するペプチｒ連鎖を
合成する。半自動式ペゾチＰ合成装置（スイス国ブーペ
ンｔルフ在Ｌａｂｏｒ　ｔｅｃｈ社製）で固相合成を実
施する。Ｎ−アミノ保護基としてＦＭＯＣ［＝（９−フ
ルオレニル）−メトキシカル？ニル〕基を使用した。

前記ペプチｙ合成法は、Ｊ０Ｍｅ１８ｎｈＯｆｅｒ等：
　Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅ
ｓ、　　１３　。

３５−４２　（１９７９）に記載されている。Ｃ末端Ｆ
ＭＯＣ−アミノ酸は、Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ　ｏ記載のよ
うに、ｐ−アルコキシペンシルアルコール樹脂（スイス
国ブーペンＰルフ在Ｂａｃｈｅｍ社）に結合した。

合成サイクルの記録： Ｘ３ｍ１ｎ ｘ７ｍｉｎ ４Ｘｌ／２ｍ１ｎ ２ｘ１／２ｍ；ｎ 停止 ２ｘ１ｒｎｉｎ ｍｉｎ ０　ｍ１ｎ ３×１ｍＩｎ Ｘ１ｍＩｎ 停止 ピペリジン／ＤＭＦ　ｌ　：　４ ピペリジン／ＤＭＦ１：４− ＭＦ イソゾロパノール ニンヒ１？リン試験 ＭＦ ル）を加える 振盪 える カップリング ＭＦ イソゾロパノール ニンヒドリン試験 洗浄−およびカップリング段階の容量としてはその都度
出発樹脂の重量の１５倍を用いる。

＝ンヒｒ＋）：ｙ試験は、Ｅ、Ｋａｉｓｅｒ等：Ａｎａ
ｌ。

Ｂｌｏｃｈｅｍ、３４．５９５〜９８（１９７０）に記
載されているように行う。１４段階におけるニンヒｒリ
ン試験がなお遊離アミノ基を示す場合には、記録を８段
階から反復する。８段階〜１１段階による結合に関して
は、出発樹脂の負荷に対して３倍のモル量のＦｍｏｃア
ミノ酸およびＤＣＣを使用する。ＨＯ８ｔは４．５倍の
モル量で使用する。

最後のＮ末端Ｆｍｏｃアミノ酸の結合後に、Ｆｍｏｃ保
護基を脱離するために、合成サイクルの１〜５段階を実
施する。次に樹脂を、１５倍容量のジクロルメタン（Ｄ
ＣＭ）／トリフルオル酢酸（ＴＦＡ）１　：　１中で室
温で２時間振盪する。

濾過を行い、樹脂をジクロルメタン／トリフルオル酢酸
４：１を用いてさらに２回洗浄し、全炉液を精製し、ド
ルオールを加えつつ２５℃で真空蒸発させる。残留物に
ジエチルエーテルを加える。固体を沖取し、乾燥する。

上記図式によると、Ａ鎖ルーゾ： ＨＧｌｕＧＩｎＣｙｓＡｌａＴｈｒＳｅｒＩ　ＩｅＣｙ
ｓＳｅｒＬｅｕＡｈｘＯ）−１し−８−８」 が合成される。出発樹脂としては５ｇのＦｍｏｃＡｈｘ
　＝ε−アミノヘキサン酸−ｐ−アルコキシペンノルア
ルコール樹脂（負荷０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を使用する
。合成サイクルにおいては次下のＦｍｏｃアミノ酸を順
々に使用する： １　　Ｆｍｏｃ　Ｌｅｕ ２　　Ｆｍｏｃ　５ｅｒ（ｔＢｕ） ３　　Ｆｍｏｃ　Ｃｙｓ（Ｔｒｔ） ４　　Ｆｍｏｃ　　ｌ１ｅ ５　　Ｆｍｏｃ　５ｅｒ（ｔＢｕ） ６　　Ｆｍｏｃ　Ｔｈｒ（ｔａｕ） ７　　Ｆｍｏｃ　Ａｌａ ３９ｇ ２．５９ｇ ３．９５．９ ２．３９．Ｆ ２．５９ｇ ２．６８ｇ １０ｇ Ｆ　ｍｏｃ　Ｇ　Ｉ　ｕ　（０ｔＢｕ　）　３．１３．
９反復する ｔａｕ　：　ｔ−ブチルエーテル Ｔｒｔ　　：　）リチル ｏｔｓｕ　：　ｔ−ブチルエーテル 樹脂からペプチｒを分離する前にシスティンの保護基を
脱離し、退化してジスルフィド架橋を形成させる：ヘキ
サフルオルイソプロノクノール１５１ＬｌとＤＣＭ４５
ｍ１／とから成る混合物に沃素を飽和するまで加える。

過剰な沃素は襞付きｒ紙により戸取する。上記のように
して得られたベプチＰ樹脂５００ｍ９を加え、２時間振
盪し、濾過を行い、ＤＣＭ、ＤＭＦおよびイソプロ／Ｉ
Ｐノールで各３回洗浄する。次に上記のようにして樹脂
からペプチＰを分離する；収量：粗生成物１２０〜。

粗生成物を、ボリザシル（Ｐｏｌｙｇｏｓｌｌ　）　Ｃ
１８５μ、２５０　Ｘ　２０ｆｉ（Ｂ１５ｃｈｏｆｆ社
製）によりクロマトグラフィーにかけた。溶離液Ａ：　
ＴＦＡｏ、１％を含む水、溶離液Ｂ：ＴＦＡ０，１％ヲ
含む水中のイソプロノ千ノール６５％；１２０分で２０
〜８０チ。移動速度：３．５Ｍｌ／ｍｉｎ。

２２６　ｎｍで検出。

純物質４７■が得られる。

ＤＣ：（珪酸グル、展開剤：ｎ−ブタノール／酢酸／水
４：１：１） Ｒｆ：０．４４ ＦＡＲ−ＭＳ　（ｆａｓｔ　−ａｔｏｍ　ｂｏｍｂａｒ
ｄｍｅｎｔ質量分析計）（正）ＭＨ＋：　１１６５　（
計算値：１１６５．５） 得られたベプチ）’５１３ｍｇを水１５−中に取り、こ
の溶液を５　％　Ｋ２Ｃｏ３溶液でｐＨ８，５に調節す
る。

ジオキサン１５ｄ中のＮ−（レゾルフィニルカル？ニル
）−サルコシン−Ｎ’−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル２１．５〜の溶液を加える。

この試薬の製造は西独国特許出願公開第３５２６５６５
号に記載されている。室温で２０時間攪拌し、次にジオ
キサンを真空蒸発し、声をトリフルオル酢酸を用いて２
．２に調節する。レゾルフィンとベゾチｒとから成る複
合体が沈殿する。この沈殿物を吸引し、０．１Ｍ　Ｎａ
ＨＣＯ，溶液中で溶解しかつ酸性化することによって再
沈殿させる。Ａ鎖ループ−レゾルフィン−サルコシン５
〜が得られる。さらに集めた炉液にポリゴシルＣ１８に
よりクロマトグラフィーな施すとＡ鎖ルーフ−１／　）
ルフィン−ザルコシン６．８■が得られる。

ＤＣ：（珪酸ケ゛ル、展開剤−上記のとおり）Ｒｆ：０
．５６ 例２ ヒトインシュリンに対する単クローン性抗体の製造 Ｂａ１ｂ／Ｃマウス（８〜１２週令）を、水酸化アルミ
ニウムおよび？ルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅ
ｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｌｓ　）　Ｋ吸着されたヒトイ
ンシュリン１００μｙで腹腔内的に免疫した。

６週後に３回の他の免疫を４週の間隔で行う。

この場合その都度水酸化アルミニウムおよびボルデテラ
・ペルツシスに吸着されたインシュリン５０ｔｔｆ！を
腹腔内投与する。

最後の免疫のほぼ４力月後融合を行う。この融合の４日
前および３日前にそれぞれもう一同インシュリン１００
μｊ！／ＰＢＳ　（−燐酸塩緩衝塩水）を腹腔内および
静脈内投与により免疫する。

融合のためには、Ｇａ１ｆｒｅ　：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ＩｎＥｎｚｙｍｏｉｏｇｙ　、　７３　（１９８〕、　
）　、　３頁に従ってまず、免疫されたマウスの肺臓細
胞１０８を骨髄腫細、胞（Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３
　、ＡＴＣＣ−ＣＲＬ８３７５）２ｘｌＯ７を混合し、
次Ｖｒ、１０分遠心分離する（３００．！ｉ’、牛℃）
。細胞をもう一回ＢＳＳ　（−平衡塩溶液）で洗浄し、
＋ｏｏｇで遠心分離する。上澄みを除去する。沈降細胞
に６０％ＰＥＧ溶液（ＭＧ　４０００、Ｍｅｒｋ社）１
１１７を加える。次に室温でＲＰＭＩ　１６４０培地（
ＲＰＭＩ＝Ｒｏｓｅｗｅｌｌ　Ｐａｒｋｅｒ　Ｍｅｍｏ
ｒｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ）５＋＊Ｊをウシ胎児の血清（
ＦＫＳ）ｆｒ、１．に加え、次にもう一回ＲＰＭ１１６
４０培地５　ｍｌを］、０チＦＫＳと共に徐々に加え、
培地を増量ｊ−て６０ｄにし、４００ｇで１０分間遠心
分離する。

沈降細胞を１０チＦＫＳを含むＰＲＭ１１６４０培地中
にとる。肺臓細胞各２　Ｘ　１０５を２４ｗｅｌｌ−細
胞培養板（Ｎｕｎｃ社）上に植える。各培養物に骨髄細
胞Ｉ　Ｘ　１０５または腹膜惨出物細胞５×ｌＯ４を飼
養細胞として加える。次の日にヒポキサンチン−アザセ
リン選択培地（ヒボキサンチｙｌＱＱｍＭ、アザセリン
１　ｔｔｆｌ／ｊ　）を加える。

約７〜１０日後にはすでに多数のクローンが見えてくる
。−次培養物の上澄みを例５で記載したＥＬＩＳＡ法に
より試験する。抗原特異性抗体を含む一次培養物を、螢
光活性細胞選別器を用イテ、９６ｗｅｌｌ−細胞培養板
（Ｎｕｎｃ社）でさらにクローン培養する。飼養細胞と
しては腹膜惨出物細胞Ｉ　Ｘ　１０’　ｔたは肺臓細胞
２×１０４を用いる。

このようにして例えばハイプリｒ−マクローン２Ｅ６　
（ＥＣＡＣＣ８８０２２５０２）および３Ｃ４（ＥＣＡ
ＣＣ８８０２２５０１）を単離することができた。

腹水症を発生させるために、プリスタン（Ｐｒｌｓｔａ
ｎ　）　ＯＪｄで１〜２回前処理しておいたマウスにハ
イゾリツｒ５ｘ１ｏを嗅腔内投Ｊｊする。この投与から
１〜３週間後には同マウスから腹水症液を取ることがで
きる。このものから常法で抗体を単離することができる
。この琳クローン性抗体はインシュリンに対して特異的
に適合しており、プロインシュリンに対するその交差反
応性は全くないかまたは少しｌ〜かない。

例３ インシュリンに対する抗体のスクリーニング試験 免疫されたマウスの血清中またはハイブリツｒの培地上
澄み中または腹水症液中でインシュリンに対する抗体の
存在および特異性を検出する丸めに、試験原理としてＥ
ＬＩＳＡ法を用いる：微量力価板に、インシュリンｌμ
Ｉ／Ｍｌ塗布用緩衝液（Ｑ、２Ｍ炭酸ナトリウム／重炭
酸ナトリウム、ｐＨ９，３〜９．５）を３７℃で一晩中
塗布する。０．９　％塩化ナトリウム溶液および１チア
ルプミン溶液で１０分間後処理する。次に０．９％塩化
ナトリウム溶液で洗浄する。次に３７℃で１時間試料１
００μｌと一緒に恒温保持し、再び０．９％塩化ナトリ
ウム溶液で洗浄する。次にもう一度、ヒツジの抗マウス
ＩｇＧ−ペルオキシダーゼ複合体１００〜１５０　ｍｕ
／ゴと一緒に恒温保持（３７℃で１時間）を行う。０．
９　％塩化ナトリウムで再び洗浄した後ペルオキシダー
ゼ活性を常法で測定する〔例えばＡＢＴＳを用いる、室
温で３０分、吸光度差（４０５ｎｍテΔｍＦ、　）を読
取る〕。

またＥＬＩＳＡ試験は次のように行うことができる： 先づ微量力価板に、ヒツジの抗マウスＩｇＧを塗布する
（２０〜３０μｆｌ／ｄ塗布用緩衝液、３７℃で１時間
乃至−晩中）。次に前記のように処理し、試料溶液を加
え、再び洗浄する。最後にインシュリン−ペルオキシダ
ーゼ複合体２５ｏｍｕ、、’ｙと一緒に恒温保持する（
３７℃、１時間）。再び洗浄し、ベルオキシダーぜ活性
を例えばＡＢＴＳで測定する。

さらに抗体を、例４で記載するようなインシユリンーペ
プチドの検出でスクリーニングする。

例４ 材料 微量力価板：　Ａ　：　ＮＵＮＣ４−４２４０４ｎＢ：
　　＃　　　２−６９６２０ １２管状ピペット：デイナテツヒ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）
、カタロｆＡ７７−８８７−００ 扁平振盪器：　Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
　ティｆルｆり（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　）、カタログＡ　
７７−４７カッ２−シ一ト：デイナテツヒゾレートシー
ラー、ｅ　（Ｐｌａｔｅ　５ｅａｌｅｒｓ　）、カタロ
グＡ　Ｍ　３０ＥＬＩＳＡ読取り器：デイナテツヒＭＲ
７００塗布用緩衝液：５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９
，６試料１１１衝液：　１０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐ）
Ｉ　７．４．０．９Ｌ％ＮａＣ１、０，１％トウイーｙ
　（Ｔｗｅｅｎ　）２０．１　ｑｂ　りｏ−ｙ−イｙ　
（Ｃｒｏｔｅｉｎ　）Ｃ洗浄緩衝液：　０．９　％　Ｎ
ａＣ１，０，１％　）ウィーン２抗体−酵素複合体：ペ
ルオキシダーゼおよびヒツジ産多りローン性抗体（マウ
スＩｇＧのＦｃ１部分に対応している）のＦａｂフラグ
メントから成る複合体、試料緩衝液中１１３　ｍｕ／ｍ
／基質：燐酸塩−クエン酸塩緩衝液（ｐＨ４，４）１０
０ｍｍｏｌ／ｌ、、過硼酸ナトリウム３．２ｍｍｏｌ／
１ＸＡＢＴＳ　（２，２’−アジノージ−／３エチルー
ベンゾチアゾリンースルホン酸（６）／ジアンモニウム
塩）　１．９　ｍｍｏ　Ｉ　／ｌ抗体：インシュリン２
Ｅ６および３Ｃ４に対するＭＡＫ ペプチド誘導体：Ａ鎖ループ（例１により製造）、Ａ鎖
ルーフ’−レゾルフィン−サルコシン（例１により製造
） 抗原：ヒトインシュリン 実際の特異性実験に供給すべき抗体の量は予備実験で測
定する。このために微量力価板にインシュリンを塗布す
る。１００μｌ容器当りインシュリン２．５μｇ／ｍｌ
塗布用緩衝液を室温で１時間恒温保持する。次に溶液を
吸引し、洗浄緩衝液で３回洗浄する。

次に固相結合インシュリンに抗体２Ｅ６ｔたは３Ｃ４（
腹水症）の希釈度グループを加える。

希釈は試料緩衝液を用いて１　：　１００から５段階で
行う。それぞれ室温で１時間恒温保持し、次いで洗浄す
る。

インシュリンに結合された抗体は、ペルオキシダーゼお
よびヒツジ産多クローン性抗体（マウスＩｇＧのＦｃ１
部分に対応している）のＦａｂフラグメントから成る複
合体を加えることによって、ペルオキシダーゼと加えた
基質との反応を介して測定する。検出反応はすべての容
量に基質を加えることによって開始される。測定は牛Ｑ
　５　ｎｍでＥＬＴＳＡ読取り器で行う（参照波長４Ｑ
　Ｏｎｍ　）。

半最大結合の起こる抗体希釈度を力価と定義する。この
抗体量を次の実験で使用する。

単クローン性抗体の特異性を検べる。このために個々の
抗体の反応性を、溶液中に存在する種々の成分と比較す
る。

１チクロチインＣを前塗布した微量力価板に、２倍の力
価濃度の単クローン性抗体溶液５０μｌおよび抗原溶液
またはペプチｒ誘導体の溶液（希釈度グループ、次下参
照）５０μｌをピペットで加え、混合し、室温で３０分
恒温保持する。

次に前記混合物のアリコート１００μｌを、インシュリ
ンを塗布した微量力価板に移す。

希釈度グループ： Ａ鎖“−プ　　　　　　　　　　　　　１０μ９／ｄか
らＡ鎖ループ−１／ゾルフィン−サルコシン　５段階で
希釈中最大結合に属する、被測定物質の濃度（ｍｏｌ／
ｌ）を、分子相対親和性と定義する。

例１からの非標識ペプチｒに対するＭＡＫｓ　　２Ｅ６
または３Ｃ４の分子相対親和性はヒトインシュリンに対
するよりも５倍大きく、例１からのレゾルフィン標識に
ブチｒに対する分子相対親和性はヒトインシュリンに対
するよりも１．８倍大きい。従ってペゾチＰ誘導体はヒ
トインシュリンよりも若干弱く検出されるという結果に
なる。

例さ 螢光偏光免疫検定法によるインシュリンの測定０、１　
Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐｉｆ７．８　’）　１９３５
μｌに、試料２０μ１１クローン２　Ｅ　６　（６，４
−・１０−６ｍｏｌ　／１１　ｇＧ　）　ノ腹水症溶液
２ｏ１１１および例］７からのレゾルフィン標Ｒベプチ
ｒの溶液２５μｌを加える。

３７℃で５分恒温保持した後、螢光偏光な測定する（励
起波長：５７５ｎｍ、発光波長：５９４−　ｎｍ　）。

螢光分光計Ｆ４．．０００（日立製）、偏光測定ヘラＰ
あり。

このようにして得られた校正曲線を第１図で示す。各測
定点は５回の個々の測定からの平均値である。

【図面の簡単な説明】

第１図はインシュリン測定時における螢光偏光の校正曲
線のグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、螢光偏光免疫検定法原理によりタンパク質を測定す
   るに当り、均質系において試料溶液を、 ａ）螢光性化合物で標識されていて、ジスルフィド架橋
   を形成する２個のシステインを含むアミノ酸６〜１４個
   から成るペプチド連鎖（同連鎖は被測定タンパク質のエ
   ピドープ連鎖に相応する）および ｂ）前記タンパク質および前記ペプチド連鎖に特異的な
   結合能力を有しかつタンパク質の螢光性ペプチド連鎖お
   よび天然タンパク質に関して高々６倍だけ相違する分子
   相対親和性を有する抗体 と一緒に同時に恒温保持しかつ恒温保持された溶液中に
   送られた偏光の偏光解消を測定することを特徴とする螢
   光偏光免疫検定法原理によるタンパク質の測定方法。 ２、ハイブリッドクローン３Ｃ４（ＥＣＡＣＣ８８０２
   ２５０１） ３、ハイブリッドクローン２Ｅ６（ＥＣＡＣＣ８８０２
   ２５０２）