DE4025725A1 - Monoklonale antikoerper, die mit human- und ratteninsulin bindefaehig sind - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, die so­ wohl mit Human- als auch mit Ratten-Insulin kreuzreagie­ ren, ein Verfahren zur Bestimmung von Human- bzw. Rat­ teninsulin, ein Testreagenz sowie Hybridom-Zellklone, welche solche Antikörper produzieren.

Aus der EP-A 03 31 126.A2 sind bereits monoklonale Anti­ körper bekannt, die mit Human-Insulin reagieren. Solche Antikörper werden z. B. zur Bestimmung von Human-Insulin in verschiedenen zur automatischen Analyse geeigneten standardisierten Enzymtests verwendet. In der Erfor­ schung der Ursachen und Behandlung von Diabetes werden nun im wesentlichen als experimentelles Tiermodell Rat­ ten verwendet. Zur Bestimmung des Insulins bei solchen Ratten-Experimenten wurden dabei bislang üblicherweise meist selbstentwickelte Testsysteme ohne internationalen Standard verwendet. Daher war es bislang nicht möglich, die in verschiedenen Labors aufgefundenen Versuchswerte miteinander zu vergleichen.

Die Erfindung hat daher zum Ziel, ein Testverfahren und im besonderen Antikörper bereitzustellen, die sowohl mit Human- als auch mit Ratten-Insulin kreuzreagieren und somit alle zwei Insulin-Spezies mit einem einzigen Stan­ dard meßbar machen.

Es wurden nun überraschenderweise Hybridom-Zellklone aufgefunden, die monoklonale Antikörper ausbilden, wel­ che sowohl mit Human- als auch mit Schweine- und Ratten- Insulin kreuzreagieren. Die Hybridom-Zellklone wurden bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down (UK) hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummern ECACC 90052212, ECACC 90052213 und ECACC 90052214.

Das Auffinden solcher Antikörper, die mit Human- und Ratteninsulin kreuzreagieren, ist umso überraschender, da aus theoretischen Gründen die Existenz solcher kreuz­ reagierender Antikörper nicht zu erwarten war. Aus Klaus Keck in Nature, Vol. 254 (1975), 78-79 ist es nämlich bekannt, daß die Insulin-Moleküle von Mensch, Maus, Ratte und Schwein dieselbe Sequenz im sogenannten A-Kettenloop aufweisen. Aus Diabetologia (Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-New York), Vol. 13 (1977), 407, Ab­ stract 164 ist es außerdem bekannt, daß dieser A-Ketten­ loop nicht als immunogene Determinante wirkt. Aus diesem Grunde entwickeln Mäuse lediglich Antikörper gegen Schaf- jedoch nicht gegen Schweine-Insulin, da dies nur immunogene Determinanten wie das eigene Maus-Insulin aufweist.

Die Ausbildung solcher Maus-Antikörper ist im übrigen auch deswegen überraschend, da es sich bei dem vom Anti­ körper erkannten A-Kettenloop um ein Epitop handelt, welches an der Bindungsstelle zum Insulin-Rezeptor sitzt. Ein gegen eine solche Bindungsstelle gerichteter Antikörper beseitigt nun die Bindefähigkeit des eigenen Insulins.

Schließlich ist es auch noch von J. Kapp (The Journal of Immunology, Vol. 123, July 1989, 109-114) bekannt, daß Mäuse nur eine ganz begrenzte Fähigkeit haben, Insulin­ spezifische Antikörper auszubilden, weshalb mit Mäusen nur Antikörper von sehr begrenzter Heterogenität, also von nur geringer Unterschiedlichkeit zu erhalten sind.

Die erfindungsgemäßen Anti-Insulin-Antikörper lassen sich mittels dem Fachmann bekannten Verfahren aus den zuvor genannten Hybridom-Zellklonen erhalten.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung von Human- und/oder Rattininsulin unter Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper mittels an sich bekannter Verfahren. Schließlich betrifft die Erfindung auch einen Testkit zur Bestimmung von Insulin, der die erfindungs­ gemäßen Antikörper enthält.

Die Erfindung soll durch die folgenden Beispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1 Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen Human-/Rat­ teninsulin

Balb/c-Mäuse, 8 bis 12 Wochen alt, werden mit 100 µg Human-Insulin (an Aluminiumhydroxid und Bordetella per­ tussis adsorbiert), intraperitoneal immunisiert. Nach 6 Wochen werden drei weitere Immunisierungen in vierwöchi­ gem Abstand durchgeführt. Dabei werden jeweils 50 µg Insulin (an Aluminiumhydroxid und Bordetella pertussis adsorbiert), intraperitoneal verabreicht.

Ungefähr 4 Monate nach der letzten Immunisierung wird fusioniert. Vier Tage und drei Tage vor der Fusionierung wird jeweils noch einmal mit 100 µg Insulin/PBS (= phos­ phate buffered saline), intraperitoneal bzw. intravenös immunisiert.

Zur Fusion werden in Anlehnung an Galfre, Methods in Enzymology, 73 (1981), Seite 3, 10⁸ Milzzellen einer immunisierten Maus mit 2×10⁷ Myelomzellen P3×63-Ag 8653, ATCC-CRL 8375) gemischt und anschließend 10 Minu­ ten zentrifugiert (300 g, 4°C). Die Zellen werden noch einmal mit BSS (= balanced salt solution) gewaschen und bei 400 g zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt. Das Zellsediment wird mit 1 ml 60%iger PEG-Lösung (MG 4000, Merck) versetzt. Danach wird bei Raumtemperatur 5 ml RPMI 1640-Medium (RPMI = Rosewell Parker Memory Institut) ohne fötales Kälberserum (FKS), anschließend noch einmal 5 ml RPMI 1640-Medium, mit 10% FKS langsam zugetropft, mit Medium auf 50 ml aufgefüllt und 10 Minu­ ten bei 400 g zentrifugiert. Die sedimentierten Zellen werden in RPMI 1640-Medium mit 10% FKS aufgenommen. Je 2×10⁵ Milzzellen werden auf 24-well-Zellkulturplatten (Firma Nunc) eingesät. Zu jeder Kultur werden 1×10⁵ Milzzellen oder 5×10⁴ Peritoneal-Exsudat-Zellen als Futterzellen zugefügt. Am folgenden Tag wird Hypo­ xanthin-Azaserin-Selektionsmedium (100 mM Hypoxanthin, 1 µg/ml Azaserin) zugegeben.

Nach ca. 7 bis 10 Tagen werden bereits viele Klone sichtbar. Der Überstand der Primärkulturen wird nach einem in Beispiel 2 beschriebenen ELISA-Verfahren ge­ testet. Primärkulturen, die Antigen-spezifische Anti­ körper enthalten, werden mit Hilfe eines fluoreszenzak­ tivierenden Zellsorters auf 96-well-Zellkulturplatten (Firma Nunc) weiter kloniert. Als Futterzellen dienen 1×10⁴ Peritoneal-Exsudat-Zellen oder 2×10⁴ Milzzellen pro 96er-well der Kultur.

Auf diese Weise konnten beispielsweise die Hybridom- Zellklone ECACC 90052212, 90052213 und 90052214 isoliert werden.

Zur Erzeugung von Ascites werden 5×10⁶ Hybrid-Zellen intraperitoneal Mäusen gespritzt, die zuvor ein bis zweimal mit 0,5 ml Pristan vorbehandelt worden sind. Ein bis drei Wochen danach kann aus den Mäusen Ascites-Flüs­ sigkeit gewonnen werden. Hieraus können in üblicher Weise die Antikörper isoliert werden.

Beispiel 2 Screening-Test auf Antikörper gegen Insulin

Um die Anwesenheit und Spezifität von Antikörpern gegen Insulin im Serum immunisierter Mäuse oder in dem Kul­ turüberstand der Hybridzellen oder in Ascites zu erken­ nen, wird ein ELISA-Verfahren als Testprinzip verwendet: Mikrotiterplatten werden mit 1 µg Schweineinsulin/ml Beschichtungspuffer (0,2 M Natriumcarbonat/-Bicarbonat, pH 9,3 bis 9,5) bei 37°C über Nacht beschichtet. Es wird 10 Minuten mit 0,9% Natriumchloridlösung und 1% Albu­ minlösung nachbehandelt. Danach wird mit 0,9% Natrium­ chloridlösung gewaschen. Anschließend wird bei 37°C eine Stunde mit 100µl Probe inkubiert und erneut mit 0,9% Natriumchloridlösung gewaschen. Es folgt eine weitere Inkubation (eine Stunde bei 37°C) mit 100 bis 150 mU/ml eines Schaf-anti-Maus-IgG-Peroxidase-Konjugats. Nach einem erneuten Waschschritt mit 0,9% Natriumchlorid wird die Peroxidaseaktivität in üblicher Weise bestimmt (bei­ spielsweise mit ABTS, 30 Minuten bei Raumtemperatur, ab­ gelesen wird die Extinktionsdifferenz, ΔmE bei 405 nm).

Der ELISA-Test kann auch wie folgt durchgeführt werden: Die Mikrotiterplatten werden zunächst mit einem Schaf- anti-Maus-IgG beschichtet (20 bis 30 µg/ml Beschich­ tungspuffer, eine Stunde bis über Nacht, 37°C). Danach wird wie oben beschrieben, weiter behandelt, die Probe­ lösung zugesetzt und erneut gewaschen. Schließlich wird mit 250 mU/ml eines Schweineinsulin-Peroxidase-Konjugat inkubiert (1 Stunde, 37°C). Es wird erneut gewaschen und die Peroxidase-Aktivität beispielsweise mit ABTS be­ stimmt.

Beispiel 3 RIA-Test auf Human-/Ratteninsulin

Die im Beispiel 2 gefundenen, positiven Antikörper wur­ den mittels RIA auf die Erkennung von Human-/Ratteninsu­ lin überprüft.

Das Ria-System war folgendermaßen aufgebaut:

RIA-Puffer:
0,05 mol/l Phosphatpuffer, 0,150 mol/l NaCl, 0,5% Rinderserumalbumin, pH 7,4,

Tracer:
I¹²⁵ markiertes Schweine-Insulin (Corning)

Kohle:
100 ml RIA-Puffer mit 2,5 g Kohle (Norit A) und 0,25 g Dextran F″ (Sigma).

Zunächst wurde die Bindung des Tracers an die unter­ schiedlichen Antikörper in einer Antikörperverdünnungs­ reihe bestimmt und die Antikörperverdünnung gewählt, die ca. 50% des Tracers band.

Von dieser Antikörper-Verdünnung wurden dann 100 µl mit 100 µl Tracer und 100 µl Insulinstandard (entweder Human-Insulin oder Ratten-Insulin) für 24 Stunden bei 4° inkubiert.

Die Trennung von gebundenem von freiem Tracer erfolgte durch Zugabe 400 µl "dextran coated charcoal", vortexen, zentrifugieren bei 6° für 1/2 Stunde, und Dekantieren des Überstandes.

Anschließend wurde die kohlegebundene (freie) Tracerak­ tivität in einem Gammacounter bestimmt.

Die Berechnung des gebundenen Anteils erfolgte folgen­ dermaßen:
% bound = (total count-counts bound)/(total counts) .

Die nicht spezifische Bindung wurde im gleichen System durch Ersatz von Antikörper durch RIA-Puffer bestimmt und lag in allen Versuchen unter 1%.

Claims (6)

1. Monoklonale Anti-Insulin-Antikörper, erhältlich aus einem der Hybridom-Zellklone ECACC 90052212, ECACC 90052213 oder ECACC 90052214 oder Antikörper, die mit denselben Epitopen bindefähig sind.

2. Verfahren zur Bestimmung von Human- und/oder Rat­ ten-Insulin, dadurch gekennzeichnet, daß man monoklonale Antikörper nach Anspruch 1 verwendet.

3. Testkit zur Bestimmung von Human- und/oder Ratten- Insulin, enthaltend zumindest einen der monoklona­ len Antikörper nach Anspruch 1.

4. Hybridom-Zellklon mit der Hinterlegungsnummer ECACC 90052212.

5. Hybridom-Zellklon mit der Hinterlegungsnummer ECACC 90052213.

6. Hybridom-Zellklon mit der Hinterlegungsnummer ECACC 90052214.