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In Nucleic Acids Res. if, 4739-4749 (1985) werden neue Typ I-Interferone beschrieben, die sich in ihrer Struktur und ihren antigenen Eigenschaften wesentlich von den bisher bei kannten Alpha- und Beta-Interferonen unterscheiden. Diese neue Interferon-Klasse wurde daher mit IFN-omega bezeichnet.
Desweiteren konnte mit Hilfe der in der EP-A-0. 236. 920, welche am 16. September 1987 veröffentlicht wurde, beschriebenen neuen monoklonalen Antikörpern, z. B. des neuen monoklonalen Antikörpers OMG-2, die Reinigung der IFN-omega wesentlich verbessert werden. Diese Antikörper zeigen jedoch Spezifität sowohl für IFN-Alpha als auch für IFN-omega. Mit Hilfe der in dieser Anmeldung beschriebenen Antikörper konnte jedoch kein Immunoassay zum Nachweis von IFN-omega etabliert werden, da der Anteil der IFN-omega-spezifischen Antikörper im polyklonalen Immunoglobulin, das zur Beschichtung eingesetzt wurde, viel zu gering war. Darüber hinaus würde ein derartiger Test nicht spezifisch für IFN-omega sein, da, wie bereits oben erwähnt, sowohl die polyklonalen als auch die monoklonalen Antikörper auch IFN-Alpha erkennen würden.
Der Nachweis und die Quantifizierung von IFN-Omega musste daher bisher ausschliesslich mit Hilfe von biologischen Tests durchgeführt werden, wie zum Beispiel der Messung der antiviralen Aktivität. Diese Nachweismethoden sind im allgemeinen sehr empfindlich, jedoch zeit- und arbeitsaufwendig sowie von geringer Präzision. Die Etablierung eines Immunoassays, zum Beispiel eines Tests vom Typ eines ELISA oder IRMA, mit dessen Hilfe eine einfache, rasche und genaue Bestimmung von IFN-omega möglich ist, wäre daher wünschenswert. Da IFN-omega in Lösung als Monomeres vorliegt, sind zur Etablierung eines derartigen Tests aber mindestens zwei Antikörper notwendig, die verschiedene Epitope des IFN-Moleküls erkennen können, wobei monoklonale Antikörper zwar nicht notwendig sind, jedoch zahlreiche Vorteile gegenüber Antiseren haben.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass die erwähnten Probleme mit Hilfe neuer monoklonaler Antikörper behoben werden können. Die erfindungsgemäss hergestellten Antikörper sind spezifisch für IFNomega ; mit ihrer Hilfe hergestellte Immunoassays erlauben den Nachweis und die Quantifizierung von IFNomega, sprechen jedoch auf andere humane Interferone, wie IFN-Alpha, IFN-Beta oder IFN-Gamma, nicht an.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit in vitro und in vivo zu kultivierende Hybridzellinien, welche neue monoklonale Antikörper produzieren, die spezifisch mit Humaninterferon vom Typ IFN-omega, nicht jedoch mit anderen Humaninterferonen reagieren, und Verfahren zu deren Herstellung, die Verwendung der neuen monoklonalen Antikörper zur Reinigung von IFN-omega und zum Nachweis von IFN-omega, z. B. mittels Immunoassays, in denen diese Antikörper zum spezifischen Nachweis von Humaninterferon vom Typ IFN-omega eingesetzt werden können, wobei zusätzlich auch polyklonale Antikörper eingesetzt werden können.
Erfindungsgemäss wird zur Herstellung der genannten Antikörper wie folgt verfahren :
Die hierfür erforderlichen Antikörper-produzierenden Hybridomzellinien erhält man durch Zellfusion von Milzzellen (siehe Köhler und Milstein in Nature 256,495-497 (1975)) von entsprechend immunisierten Versuchstieren, z. B. von Mäusemilzzellen, mit Myelomzellen, die bevorzugt selbst keine Antikörper produzieren, z. B. mit Myelomzellen der Linie P3X63Ag8. 653 (siehe Keamey et al. in J. Immunol. 123,1548 (1979)). Dieses Verfahren besteht grundsätzlich darin, dass man eine Maus oder ein anderes geeignetes Tier mit einem Immunogen injiziert. Anschliessend werden die von den immunisierten Mäusen, deren Seren Antikörper gegen das injizierte Immunogen enthalten, entnommenen Milzzellen mit Myelomzellen fusioniert.
Man erhält Hybridzellen, die als Hybridoma bezeichnet werden, die sich in vitro reproduzieren. Die Population der Hybridoma wird analysiert und manipuliert, so dass man einzelne Klone isoliert, von denen jeder eine einzige, antigen-spezifische Antikörperspezies abscheidet. Jede auf diese Weise erhaltene individuelle Antikörperspezies ist das Produkt einer einzigen B-Zelle aus dem immunisierten Tier, die erzeugt wurde als Reaktion auf eine spezifische immunogene Struktur der immunogenen Substanz. Wird also eine immunogene Substanz in einen lebenden Wirt eingeführt, dann reagiert das Immunsystem des Wirts unter Bildung von Antikörpern gegenüber allen erkennbaren Stellen auf der immunogenen Substanz.
Dieser Effekt, nämlich die Bildung von Antikörpern im Abwehrkampf gegen den Eindringling, besteht somit in der Bildung von Antikörpern verschiedener Affinitäten und Spezifitäten für die immunogene Substanz.
Da der Zwei-Stellen-immunometrische Assay auf der Bildung eines Antikörper : Antigen : Antikörper-Sandwich beruht, werden im allgemeinen zwei unterschiedliche monoklonale Antikörper, die sich nicht gegenseitig beim Binden an das Antigen behindern, ausgewählt.
Im vorliegenden Falle werden die Versuchstiere hierzu mit einem IFN-omega oder einem Hybridinterferon, bestehend aus einem Teil IFN-omegal und einem Teil IFN-Alpha, vorzugsweise mit IFN-omegal oder mit IFNomegal/Alpha2, vorimmunisiert und anschliessend nochmals mit einem IFN-omega, vorzugsweise mit IFNomegal, immunisiert.
Bei der nachfolgenden Zellfusion werden Hybridomkulturen erhalten, welche anschliessend einem Screening unterworfen werden, um diejenigen Klone zu identifizieren, die gegen IFN-omega gerichtete Antikörper produzieren. Hierzu werden bevorzugt biologische Tests herangezogen, z. B. Tests, die die Neutralisation der biologischen Aktivitäten eines IFN-omega, beispielsweise die der antiviralen Aktivität, durch die hergestellten Antikörper belegen können.
Von den so fünf erhaltenen Kulturen, die als OMG-4, OMG-S, OMG-6, OMG-7 und OMG-8 bezeichnet wurden, und konsistent eine Reduktion der antiviralen Aktivität des IFN-omegal zeigen, wurden die Klone OMG- 4, OMG-5 und OMG-7 zur Antikörperproduktion ausgewählt.
Hierzu können die ausgewählten Hybridomzellinien in vitro oder in vivo kultiviert werden, wobei jedoch die
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in vivo Kultur bevorzugt ist :
Zellen der ausgewählten Klone werden in mit Pristan oder inkomplettem Freund's Adjuvans vorbehandelte Balb/c Mäuse inokuliert (siehe z. B. Müller et al. in J. Immunol. Methods 81, 193-196 (1986)). Nach 7-18
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Selbstverständlich kann aus einem Zellkulturüberstand einer entsprechenden in vitro-Kultur der gewünschte
Antikörper analog isoliert bzw. angereichert werden.
Wie bereits eingangs erwähnt, kann ein so erfindungsgemäss hergestellter neuer Antikörper zur Reinigung und zum Nachweis von IFN-omega, vorzugsweise von IFN-omegal, verwendet werden.
Soll der erfindungsgemäss erhaltene Antikörper zur Hochreinigung eines IFN-omega verwendet werden, so wird dieser vorzugsweise kovalent an einen biologisch inaktiven Träger gebunden. Die kovalente Bindung des
Antikörpers erfolgt hierbei an einen entsprechend aktivierten Träger, vorzugsweise auf Dextran-Basis, z. B. an
CNBr-aktivierte Sepharose oder CH-aktivierte Sepharose der Firma Pharmacia, Uppsala. Zur Hochreinigung wird eine Lösung des zu reinigenden omegal-Interferons, welches zweckmässigerweise entweder gemäss den in der EP-
A-0. 170. 204 beschriebenen Verfahren oder erfindungsgemäss mit Hilfe der der in der EP-A-0. 236. 920 beschriebenen neuen Plasmide erhalten wird, bei schwach basischen pH, z.
B. bei einem pH 7-8, vorzugsweise jedoch bei einem pH 7, 5, über einen so hergestellten Antikörper-Affinitätsträger gepumpt, solange bei pH 7, 5 gewaschen bis das Eluat proteinfrei ist, und anschliessend das gebundene Interferon im sauren Bereich, z. B. mit
Hilfe von 0, 1 molarer Zitronensäure in 25% igem Äthylenglykol, eluiert. Die so erhaltenen proteinhältigen Fraktionen werden anschliessend über einen stark sauren Kationenaustauscher, z. B. den Kationenaustauscher
Mono-S der Firma Pharmacia, chromatographiert. Hierbei wird das Humaninterferon des obigen Eluats sofort von der Kationenaustauscher-Säule absorbiert und anschliessend mit Hilfe eines NaCI-Gradienten eluiert.
Soll mit Hilfe der neuen Antikörper als Antigen ein omega-Interferon, z. B. IFN-omegal, nachgewiesen bzw. quantitativ bestimmt werden, so stehen hierfür die gebräuchlichen Immunoassaytechniken zur Verfügung.
Die Techniken basieren auf der Bildung eines Komplexes zwischen der zu bestimmenden "antigenen" Substanz und einem oder mehreren Antikörpern, in denen ein Teil oder mehrere Teile des Komplexes markiert sein können, wodurch dann der Nachweis und/oder die quantitative Bestimmung des "Antigens" nach der Abtrennung des komplexen markierten "Antigens" oder Antikörpers ermöglicht wird.
Im Falle einer kompetitiven Immunoassaytechnik liegt die "antigene" Substanz in einer zur untersuchenden Flüssigkeitsprobe im Wettbewerb mit einer bekannten Menge eines markierten "Antigens" für eine limitierte Menge an Antikörperbindungsstellen. Daher ist die Menge des markierten, an den Antikörper gebundenen "Antigens" umgekehrt proportional zu der Menge des"Antigens"in der Probe.
Immunometrische Methoden verwenden demgegenüber markierte Antikörper. Bei einem solchen Assay ist die Menge des mit dem Komplex gebundenen markierten Antikörpers proportional zu der Menge der "antigenen" Substanz, die in der Flüssigkeitsprobe enthalten ist.
Immunometrische Assays sind besonders zum Nachweis von polyvalenten "Antigenen", d. h."antigenen" Substanzen, die in der Lage sind, mit zwei oder mehr Antikörpern gleichzeitig einen Komplex zu bilden, geeignet. Bei solchen Assays werden typischerweise eine Menge eines unmarkierten Antikörpers, gebunden an einen festen Träger, der in der zu untersuchenden Flüssigkeit unlöslich ist, und eine Menge eines löslichen Antikörpers, der eine Markierung trägt, verwendet, so dass der Nachweis und/oder eine quantitative Bestimmung der Menge des ternären Komplexes, der sich zwischen dem Festphasen-Antikörper, dem "Antigen" und dem markierten Antikörper ausbildet, möglich wird.
Hierzu wird normalerweise der an die feste Phase gebundene Antikörper zunächst mit der zu untersuchenden Probe in Berührung gebracht, um das "Antigen" aus der Probe durch Bildung eines binären FestphasenAntikörper : Antigen-Komplexes zu extrahieren. Nach einer geeigneten Inkubationsperiode wird der feste Träger gewaschen, um den Rest der Flüssigkeitsprobe, einschliesslich nichtumgesetztes "Antigen", falls vorhanden, zu entfernen, und wird dann mit einer Lösung, die eine bekannte Menge des markierten Antikörpers enthält, in Berührung gebracht.
Nach einer zweiten Inkubierungsperiode, bei welcher man den markierten Antikörper einen Komplex mit dem "Antigen" bilden lässt, das an den festen Träger durch den unmarkierten Antikörper gebunden ist, wird der feste Träger ein zweites Mal gewaschen, um nichtumgesetzten markierten Antikörper zu entfernen. In einer einfachen "Ja-Nein"-Assay zur Bestimmung, ob Antigen in der zu untersuchenden Probe vorhanden ist, wird der gewaschene feste Träger untersucht. Die Menge des nachgewiesenen markierten Antikörpers wird mit der einer negativen Kontrollprobe, die frei von dem "Antigen" ist, verglichen. Der Nachweis von markiertem Antikörper in Mengen, die erheblich oberhalb der Hintergrundniveaus sind, wie sie durch eine Negativkontrolle angezeigt werden, gibt dann die Gegenwart des verdächtigen Antigens an.
Quantitative Nachweise sind möglich, indem an die Messungen von markierten Antikörpern, die man mit kalibrierten Proben, enthaltend bekannte Mengen des "Antigens", erhält, vergleicht. - Diese Art des Assays wird häufig als ein "zwei-Stellen"- oder "Sandwich"-Assay bezeichnet, weil das Antigen zwei Antikörper an verschiedenen Stellen seiner Oberfläche gebunden hat.
Bei den vorstehend beschriebenen Assays kommen beispielsweise als Träger übliche Träger wie Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylase, natürliche oder chemisch veränderte
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Cellulose, Polyacrylamide, Agarose oder Magnetit und als Marker Enzyme, Radioisotope, Metallchelate oder fluoreszierende, chemilumineszierende undbiolumineszierende Verbindungen in Betracht.
Als Enzyme seien beispielsweise Malatdehydrogenase, Staphylococcalnuclease, Delta-5-steroidisomerase, Alpha-Glycerin-phosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glukoseoxidase, Beta-Galactosidase, Ribonuclease, Urease, Katalase, Glukose-6phosphatdehydrogenase, Glucoamylase oder Acetylcholinesterase, als Radioisotope 3H, I," 1, 2p, 35S und 14C, als fluoreszierende Verbindungen Fluoreszein-isothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd oder Fluorescamin, als chemilumeszierende Verbindungen Luminol, Isoluminol, ein aromatischer Acridiniumester, Imidazol, ein Acridiniumsalz oder ein Oxalsäureester und als biolumineszierende Verbindungen Luciferin, Luciferase oder Äquorin genannt.
Desweiteren kann ein erfindungsgemässer Antikörper mit einem niedermolekularen Hapten wie Biotin, Dinitrophenyl, Pyridoxal oder Fluorescamin verknüpft werden. Diese Haptene können dann durch eine weitere spezifische Reaktion erkannt werden, z. B. Biotin mit Hilfe von Avidin oder Fluorescamin mit Hilfe eines spezifischen Antihapten-Antikörpers.
Desweiteren kann die Aktivität eines als Marker benutzten Enzyms zur Verstärkung des zu messenden Signals verwendet werden.
Besonders bevorzugt ist jedoch die Verwendung von Meerrettich-Peroxidase als Marker, da dieses Enzym mit zahlreichen Substraten reagieren kann. Ausserdem ist dieses relativ klein und kann sehr leicht mit einem Antikörper verknüpft werden, beispielsweise mittels der Perjodat-Methode.
Zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von einem omega-Interferon, vorzugsweise von IFNomegal, kommt jedoch vorzugsweise, falls das IFN-omega radioaktiv markiert ist, der kompetitive Radioimmunoassay (RIA), bei welchem insbesondere polyklonale Antikörper bzw. Antikörperseren eingesetzt werden, der immunoradiometrische Assay (IRMA), falls der Antikörper radioaktiv markiert ist, und der "enzymlinked immunosorbent assay" (ELISA), falls der Antikörper mit einem Enzym markiert ist, in Betracht.
Erfindungsgemäss wird IFN-omega, vorzugsweise jedoch IFN-omegal, in einer zu untersuchenden Flüssigkeit nachgewiesen bzw. wie folgt quantitativ bestimmt : a) Durch Kontaktieren einer zu untersuchenden Probe mit einem Träger, an den ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper gegen das zu bestimmende IFN-Omega gebunden ist, und b) Messung der Bildung des gemäss a) gebildeten binären Komplexes unter Ausbildung eines ternären Komplexes zwischen einem markierten monoklonalen Antikörper und dem gemäss a) gebildeten binären Komplex.
Die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung erforderlichen omega-Interferone sind Gegenstand der EP-A- 0. 170. 204 bzw. die nicht in der vorliegenden Erfindung beschriebenen monoklonalen Antikörper, z. B. des Antikörpers OMG-2, sind Gegenstand der EP-A-0. 236. 920, das Gleiche gilt für die zur Immunisierung verwendeten Hybridinterferone. Die verwendeten polyklonalen Antikörper erhält man nach literaturbekannten Verfahren.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne diese jedoch einzuschränken : Beispiel l Herstellung monoklonaler. für If-omega spezifischer Antikörper a) Immunisierung
Eine weibliche, etwa acht Wochen alte Balb/c-Maus wurde mit hochgereinigtem (Reinheit > 95 %) Hybridinterferon lFN-omegal/Alpha2 wie folgt immunisiert : 1. Immunisierung-200 lig in komplettem Freund's Adjuvans, intraperitoneal 2. Immunisierung : 200 p. g in komplettem Freund's Adjuvans, intraperitoneal, 5 Wochen nach der 1.
Immunisierung
Acht Monate nach der zweiten Immunisierung wurde die Maus mit 70 lig gereinigtem IFN-omegal (Reinheit > 90 9to) weiter immunisiert (inkomplettes Adjuvans, intraperitoneal). Zwölf Tage später wurde eine Serumprobe gewonnen. Neutralisationstests zeigten, dass das Serum der Maus nunmehr relativ hohe Titer von neutralisierenden Antikörpern gegen IFN-omegal aufwies (vollständige Neutralisation bei bis zu 1000-facher Verdünnung des Serums, partielle Neutralisation bei 10 000-facher Verdünnung).
Der Neutralisationstest wurde folgendermassen durchgeführt : 100 ll einer Verdünnung der Serumprobe in Zellkulturmedium werden mit 100 J. Ù einer Lösung von IFN-omegal (100 antivirale Einheiten/ml) gemischt und 90 Minuten bei 37 C inkubiert.
Anschliessend wurde die antivirale Aktivität der Proben im biologischen Test (A549 Lungenkarzinom-Zellen, Encephalomyocardids-Virus) geprüft.
Fünf Wochen nach der dritten Immunisierung wurden der Maus nochmals 70 gag gereinigtes IFN-omegal (Reinheit 90 %) ohne Adjuvans injiziert.
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b) Herstellung und Screening von Hybridomen
Die Herstellung von Hybridomen erfolgte nach der ursprünglich von Köhler und Milstein (Nature , 495 (1975)) entwickelten Methode unter Verwendung der nicht-sezemierenden Zellinie P3X63Ag8. 653 (Kearneyet al., J. Immunol. l23., 1548 (1979)).
Dazu wurde wie folgt vorgegangen :
Vier Tage nach der letzten Immunisierung (siehe oben) wurde die Milz der Maus entnommen ; die Milzzellen wurden mechanisch aus dem Gewebeverband gelöst, in Zellkulturmedium (RPMI 1640 Medium mit Zusatz von Natrium-Penicillin 0 (100 Einheiten/ml) und Streptomycinsulfat (50 Einheiten/ml)) suspendiert und durch Zentrifugation (Beckmann TJ-6 Zentrifuge, 10 Minuten bei 1000 UpM) gesammelt. 2x108 Myelomzellen (kultiviert in Zellkulturmedium wie oben mit Zusatz von 10 % fötalem Kälberserum) wurden ebenfalls durch Zentrifugation gesammelt und einmal mit serumfreiem Zellkulturmedium gewaschen. Milzzellen und Myelomzellen wurden schliesslich in serumfreiem Zellkulturmedium resuspendiert, die Suspensionen vereinigt und erneut zentrifugiert.
Der Überstand wurde entfernt, die Zellen wurden in 3 ml Fusionsmedium (45 % RPMI
1640 Medium, 50 % Polyethylenglykol 4000,5 % Dimethylsulfoxid) suspendiert und 90 Sekunden vorsichtig geschüttelt, anschliessend weitere 60 Sekunden stehengelassen. 3 ml serumfreies Kulturmedium wurden nun tropfenweise über 90 Sekunden zugegeben, die Suspension 60 Sekunden stehengelassen, anschliessend weitere 6 ml serumfreies Kulturmedium tropfenweise über 90 Sekunden zugegeben. Schliesslich wurden 12 ml Kulturmedium mit 10 % fötalem Kälberserum unter ständigem Rühren langsam zugegeben, 10 Minuten stehengelassen und anschliessend auf 50 ml mit Zellkulturmedium mit 10 % fötalem Kälberserum aufgefüllt.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, in 400 ml Zellkulturmedium mit Zusatz von 20 % fötalem Kälberserum sowie von Hypoxanthin (10 M), Aminopterin (4x10-7 M) und Thymidin (1, 6x10-5 M), in der Folge HAT-Medium genannt, suspendiert. Zu dieser Suspension wurden weiters peritoneale Macrophagen aus Balb/c Mäusen zugegeben (etwa 50 000/ml) ; die Suspension wurde schliesslich in Zellkulturplatten pipettiert (48 Vertiefungen pro Platte ; 0, 5 ml pro Vertiefung). Die Platten wurden bei 37 C bebrütet (95 % Luft, 5 % C02' Wasserdampfsättigung). Nach 3 Tagen wurden zu jeder Kultur 0, 5 ml HAT-Medium zugegeben. Von den insgesamt 800 angesetzten Kulturen zeigten nach zwei bis drei Wochen etwa 300 Kulturen Wachstum von Hybridomzellen.
Das anschliessende Screening wurde folgendermassen durchgeführt :
Kulturüberstände von mindestens 10-20 % konfluenten Hybridom-Kulturen wurden mit gleichen Volumina einer Lösung von HulFN-omegal (20 antivirale Einheiten/ml) gemischt, 90 Minuten bei 37 C inkubiert und anschliessend auf ihre antivirale Aktivität getestet. Alle Kulturen wurden in Abständen von jeweils einer Woche mindestens zweifach getestet. Fünf der Kulturen, in der Folge OMG-4, OMG-5, OMG-6, OMG-7 und OMG-8 bezeichnet, zeigten in allen Tests konsistent eine Reduktion der antiviralen Aktivität. Alle Kulturen wurden durch limitierende Verdünnung kloniert, die Klone erneut im beschriebenen Verfahren auf neutralisierende Aktivität getestet.
Von jeder Kultur wurden 3 bis 5 positive Klone gepoolL Zur Antikörperproduktion in vivo wurden von jeder der Hybridomkulturen 3-10x10-6 Zellen in Balb/c Mäusen intraperitoneal inokuliert, in die zwei bis drei Tage zuvor 0, 5 ml inkomplettes Freund's Adjuvans oder aber sieben bis zehn Tage zuvor 0, 5 ml Pristan intraperitoneal injiziert worden waren. Nach sieben bis 21 Tagen wurde die gebildete Ascites-Flüssigkeit gewonnen ; die enthaltenen Antikörper wurden durch Präzipitation mit 50 % Ammoniumsulfat und Affinitätschromatographie über trägergebundenes Protein A nach bekannten Methoden zu über 90 % Reinheit angereichert. Pro ml Ascites-Flüssigkeit wurden bei allen Hybridomen etwa 2-5 mg reiner Antikörper erhalten. c) Charakterisierung der Antikörper OMG-4. OMG-5 und OMG-7
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Alpha2c, IFN-Beta oder IFN-Gamma.
Diese 3 Klone wurden gemäss Budapester Vertrag bei der European Collection of Animal Cell Cultures, PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom, am 14. August 1987 unter den ECACC-Nummern 87081401 (OMG-4), 87081402 (OMG-5) und 87081403 (OMG-7) hinterlegt.
Beispiel 2 Enzymimmunoassavs (ELISA) für IFN-omegal
Die Antikörper OMG-5 und OMG-7 wurden nach bekannten Methoden (siehe zum Beispiel Wilson M. B. und Nakane P. K., in Immunofluorescence and Related Staining Techniques, Herausgeber W. Knapp et al., S. 215- 224 ; Elsevier 1978) kovalent an Meerrettich-Peroxidase gebunden. Dazu wurde wie folgt verfahren :
2 mg Meerrettich-Peroxidase in Wasser wurden mit 0, 2 ml 100 mM Natriumperjodat versetzt und 40
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geschüttelt. 100 pl einer Lösung von NaBH4 (4 mg/ml in Wasser) wurden zugegeben und die Lösung weitere zwei Stunden im Eisbad inkubiert ; anschliessend wurden 3 ml kalte gesättigte Ammonsulfatlösung zugetropft und eine Stunde im Eisbad inkubiert.
Das entstandene Präzipitat von Peroxidase-Immunglobulin-Konjugat wurde durch Zentrifugation gesammelt, in 1 ml phosphat-gepufferter isotoner Kochsalzlösung pH 7, 4 gelöst und durch Zugabe von 1 ml einer Lösung von Rinderserumalbumin (10 mg/ml in phosphat-gepufferter Kochsalzlösung) stabilisiert. Die Lösung wurde bei-70 C eingefroren.
Festphasen-Sandwich-Enzymimmunoassays für IFN-omegal wurden nach im allgemeinen bekannten Verfahren durchgeführt (siehe zum Beispiel Berthold, W., Merk, W. und Adolf, G. R. Arzneim.-Forschung./Drug Res. M, 364-369 (1985)). Dabei wurden zur Beschichtung der Mikrotiter-ELISA-Testplatten die monoklonalen Antikörper OMG-2, OMG-5 oder OMG-7 in einer Konzentration von 10 lig (ml in 0. 1 M Natriumkarbonat pH 9. 5 eingesetzt (100 pl pro Vertiefung) und die Platten entweder eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4-8 C inkubiert.
Die Antikörperlösung wurde entfernt, die Vertiefungen mit jeweils 200 pu Wasser gewaschen und mit 100 pJ einer Lösung von Rinderserumalbumin (5 mg/ml) in phosphatgepufferter, isotoner Kochsalzlösung pH 7, 4 (in der Folge PBS/BSA genannt) befüllt. Anschliessend wurden jeweils 100) il einer Lösung von IFN-omegal in einer Konzentration von 20 ng/ml zugegeben, durchmischt und durch seriellen
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J. I. lKaliumzitrat pH 5) gefüllt. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurden zu jeder Vertiefung 100 pl 4 N Schwefelsäure pipettiert ; anschliessend wurde die optische Dichte bei 492 nm in einem MehrkanalPhotometer (ELISA-Lesegerät) gemessen.
Mit allen heterologen Kombinationen von Beschichtungs-Antikörper und Antikörper-Peroxidase-Konjugat wurden dosisabhängige Absorptionsänderungen erzielt. Die Fig. 1, 2 und 3 zeigen die erhaltenen Kurven.
Zur Beschichtung konnte auch ein Kaninchen-anti-IFN-omegal Immunoglobulin, gewonnen durch zweimalige Immunisierung eines Kaninchens mit IFN-omegal und partielle Reinigung aus dem Serum durch Präzipitation mit 50 % Ammoniumsulfat, in einer Konzentration von 10 tig/ml eingesetzt werden (siehe Fig. 4).
Die Spezifität des aus dem Antikörper OMG-2 (siehe EP-A-0. 236. 920) und Peroxidase-gebundenem Antikörper OMG-7 aufgebauten ELISA (siehe Fig. 2) für IFN-omega wurde geprüft, indem Präparate anderer humaner Interferone in einem sehr weiten Konzentrationsbereich aufgetragen wurden. Folgende Interferone wurden dabei eingesetzt :
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<tb>
<tb> Interferon <SEP> Quelle <SEP> Konzentrationsbereich <SEP>
<tb> IFN-Alpha-1 <SEP> rekombinant <SEP> (E.coli) <SEP> 2 <SEP> ng <SEP> - <SEP> 50 <SEP> g/ml
<tb> IFN-Alpha-2c <SEP> rekombinant <SEP> (E. <SEP> coli) <SEP> 2 <SEP> ng <SEP> - <SEP> 50 <SEP> J. <SEP> 1g/ml <SEP>
<tb> IFN-Alpha-B <SEP> rekombinant <SEP> (E. <SEP> coli) <SEP> 3x10 <SEP> -1, <SEP> 25x106 <SEP> E/ml <SEP>
<tb> IFN-Alpha-F <SEP> rekombinant <SEP> (E. <SEP> coli) <SEP> 1, <SEP> 4x101. <SEP> 3, <SEP> 5xI05 <SEP> E/ml
<tb> IFN-Beta <SEP> Fibraoblasten, <SEP> mit <SEP> 8x10-2x106 <SEP> E/ml <SEP>
<tb> Poly <SEP> (I <SEP> :
<SEP> C) <SEP> induziert
<tb> IFN-Gabba <SEP> rekombinant <SEP> (E. <SEP> coli) <SEP> 2 <SEP> ng-50 <SEP> HK/ml <SEP>
<tb>
Dabei wurde bei einer Sensitivität von 100 pg/ml für IFN-omegal mit keinem der Präparate bei keiner Konzentration ein signifikantes Signal beobachtet. Der ELISA kann daher nicht nur zur Quantifizierung von rekombinantem IFN-omegal, sondern auch beispielsweise zur Bestimmung des Anteils an IFN-omegal in Leukocyteninterferon oder anderen aus Zellkulturen gewonnenen Interferon-Präparaten verwendet werden.
Beispiel 3 Immunradiometrischer Assay (IRMA) für IFN-omegal Der Antikörper OMG-7 wurde nach an sich bekannter Methode mit Hilfe von N-Succinimidyl [2, 3- 3H]propionat (3H-NSP, Firma Amersham International, England ; 110 Ci/mMol) radioaktiv markiert. Dazu
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wurde in einem silikonisierten Probengefäss 1 mCi der Lösung von H-NSP im Vakuum zur Trockene gebracht. Anschliessend wurden 50 Jlg einer Lösung des monoklonalen Antikörpers OMG-7 (4, 7 mg/ml) in gepufferter Kochsalzlösung pH 7, 4 zupipettiert und 3 til l M Boratpuffer pH 8, 5 zugegeben.
Nach 24 Stunden bei 4 C wurde das überschüssige H-NSP mit 20 pl 1 M Glycin in Boratpuffer abgefangen, mit-250 d 50 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 7, 4, mit 150 mM NaCI und 5 mg/ml Rinderserumalbumin verdünnt und über eine Sephadex G 50 M-Säule (0, 5 x 20 cm) vom markierten Antikörper abgetrennt. Der Antikörper zeigte eine spezifische Aktivität von etwa 10 Ci/g Protein.
Zur Durchführung des Tests wurden geätzte Polystyrol-Kügelchen (Durchmesser 6, 5 mm ; Firma Northumbria Biologicals, England) mit dem Antikörper OMG-2 beschichtet (10 g/ml in 0, 1 M Natriumkarbonat pH 9, 5 ; 1 Stunde bei Raumtemperatur). Die Kügelchen wurden in PBS/BSA (siehe Beispiel 2) eine Stunde inkubiert und danach zweimal mit je 250 Jll Wasser gewaschen. Die Kügelchen wurde in geeigneten Eprouvetten mit jeweils 200 pl einer Lösung von IFN-omegal in steigenden Konzentrationen in PBS/BSA 3 Stunden bei 40C inkubiert und dreimal mit 250 pl Wasser gewaschen. Anschliessend wurden je 200 pl einer Lösung des markierten Antikörpers (100 ng/ml in PBS/BSA ; pro Röhrchen ca. 27000 Impulse/Minute) zugegeben und 20 Stunden bei 4 C inkubiert.
Danach wurden die Kügelchen dreimal mit 20 pJ Wasser gewaschen, in Polypropylen-Röhrchen transferiert und die gebundene Radioaktivität nach Zugabe von 4 ml Szintillator-Cocktail im Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen. Fig. 5 zeigt die gebundene Radioaktivität in Abhängigkeit von der Interferonkonzentradon.
PATENTANSPRÜCHE 1. In vitro und in vivo zu kultivierende Hybridomzellinien, die Antikörper gegen ein IFN-omega produzieren, wobei die gebildeten Antikörper keine neutralisierenden Eigenschaften gegen IFN-Alpha, IFN-Beta und IFN- Gamma aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass diese durch Zellfusion von Milzzellen eines durch ein IFNomega oder durch ein Hybridinterferon, bestehend aus einem Teil IFN-omega und einem Teil IFN-Alpha, immunisierten Versuchstieres, welches nach der ersten Immunisierung nochmals mit einem IFN-omega immunisiert wurde, mit Myelomzellen erhalten werden.