DE68914345T2

DE68914345T2 - Gamma-atriales, natriuretisches Polypeptid erkennende monoklonale Antikörper, solche Antikörper produzierende Hybridome und deren Herstellung und Verwendung.

Info

Publication number: DE68914345T2
Application number: DE68914345T
Authority: DE
Inventors: Hiroo Imura; Kazuwa Nakao
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1988-07-04
Filing date: 1989-06-30
Publication date: 1994-08-11
Anticipated expiration: 2009-07-01
Also published as: CA1334176C; JP2561513B2; DK329789D0; DK329789A; KR0145406B1; EP0350218B1; JPH0216997A; AU625398B2; EP0350218A3; ES2055066T3; KR900002074A; AU3717889A; ATE103973T1; EP0350218A2; DK175750B1; DE68914345D1; US5124248A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft monoclonale Antikörper, die den N-Terminus des gamma-atrialen, natriuretischen Polypeptids (nachstehend bezeichnet als γ-ANP) erkennen; Hybridome, die die monoclonalen Antikörper produzieren, und ein Verfahren für einen Immuntest von γ-ANP unter Verwendung eines solchen monoclonalen Antikörpers.
ANF ist ein Folypeptid, das in Granula enthalten ist, die von atrialen Myocyten produziert werden. Es übt sowohl eine natriuretische Wirkung als auch eine starke diuretische Wirkung aus. Seit de Bold, A. J. et al. starke natriuretische Aktivität, diuretische Aktivität und blutdrucksenkende Aktivität in atrialen Extrakten entdeckte (Life Sci. 28 (1981), 89-94), wurden aus atrialen Geweben von Mensch und Ratte eine Reihe von Polypeptiden, in ihrer Gesamtheit als atriale, natriuretische Polypeptide (ANP) bezeichnet, isoliert und es wurde vermutet, daß die Polypeptide im Zusammenhang mit der Homöostase von Körperflüssigkeiten und der Kontrolle des Blutdrucks (Kangawa, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 11Q (1984), 131-139) stehen.
Solche Polypeptide werden nicht nur bei Menschen gefunden sondern auch bei Ratten und als hANP bzw. rANP bezeichnet. hANP und rANP werden jeweils in drei Gruppen unterteilt und zwar in α, β und γ. Nachstehend wird menschliches ANP vom γ-Typ und Ratten-ANP vom γ-Typ als γ-hANP bzw. γ-rANP abgekürzt Wenn es nicht notwendig ist die Quelle oder die Untergruppe von ANP zu spezifizieren, wird es einfach als "ANP" bezeichnet.
α-ANP besteht aus 28 Aminosäureresten. Cys[7], d.h. Cys an der 7. Position vom N-Terminus, bildet mit Cys[23], d.h. Cys an der 23. Position, eine Disulfidbrücke und deshalb bildet die Peptidsequenz zwischen Cys[7] und Cys[23] eine Ringstruktur (Biochem. Biophys. Res. Commun. 118 (1984), 131- 139). α-hANP unterscheidet sich von α-rANP durch den Aminosäurerest an der 12 Position vom N-Terminus; bei ersterem ist es Met, während es beim letzteren Ile ist (Biochem. Biophys. Res. Commun. 117 (1983), 839-865). β-hANP ist ein antiparalleles Dimer von α-hANP (Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 184098/1985).
γ-hANP besteht aus 126 Aminosäureresten (vgl. Fig. 1 der beigefügten Zeichnungen) und deine 99-126-Aminosäuresequenz des C-Terminus entspricht genau α-hANP (Nature 313 (1985), 397)
Unter Verwendung von polyclonalem Kaninchenantiserum gegen α-ANP [17-28] wurde ein Radioimmuntest (RIA) zur Messung von ANP entwickelt, der α-hANP und α-rANP nachweist (Nakao, K. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 124 (1984), 815-821) und es wurde gezeigt, daß α-ANP nach der Sekretion aus dem Herz als Hormon durch den Körper zirkuliert (Sugawara, A. et al. , Hypertension 8 (Suppl. I) (1986), I-151-155).
Andererseits zeigen Untersuchungen mit RIA und chromatographische Analysen, daß ANP auch im Zentralnerven-system vorkommt (Morii, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 127 (1985), 413-419) und dar die meisten ANP-Moleküle im Gehirn und im Rückenmark von Ratten α-rANP [4-28] und α-rANP [5-28] sind (Shiono, S. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 135 (1986), 728-734; Morii, N. et al. , ebenda 145 (1987), 196- 203). Es wurde auch gezeigt daß ANP im Gehirn und im Rückenmark als Neuropeptid wirkt, während ANP im zirkulierenden Blut als Hormon wirkt (Nakao, N. et al. , Can. J. Physiol Pharmacol. 65 (1987), 1756-1761).
Das vorstehend erwähnte polyclonale Kaninchenantiserum gegen α-ANP kann ANP im zirkulierenden Blut nicht von ANP aus dem Gehirn und dem Rückenmark unterscheiden, aber es wurde in unterschiedlicher Weise verwendet. Beispielsweise wurde das Antiserum in immunhistochemischen Untersuchungen verwendet (Kawata, M et al., Neuroscience 16 (1985), 521-546). Ergänzend wurde das Antiserum in den Cerebralventrikel von Ratten injiziert, um die Wirkung von endogenem ANP im Gehirn zu neutralisieren, dadurch wurde die Aufnahme von Wasser erhöht (Katsuura, G. et al. , European J. Pharmacol. 121 (1986), 285-287).
Die im Antiserum enthaltenen polyclonalen Antikörper gegen ANP sind in mehrfacher Hinsicht nützlich. Trotzdem weist das Antiserum unvermeidbare Nachteile auf und zwar steht es nur in geringem Umfang zur Verfügung, es enthält verschiedene Antikörper, die eine Vielzahl von Epitopen erkennen und es enthält nicht benötigte Antikörper gegen andere Antigene als ANP.
Aus den vorstehenden Gründen ergab sich eine starke Nachfrage nach monoclonalen Antikörpern gegen ANP und unlängst wurde von mehreren monoclonalen Antikörpern, die unterschiedliche Spezifitäten aufweisen, berichtet (Joh, A. et al., Life Sci. 38 ( 1986), 1991-1997; Milne, R. et al., Mol. Immunol. 24 (1987), 127-132; Glembotski, C. C. et al., Endocrinology 121 (1987), 843-852; Naomi. S. et al. , Hybridoma 6 (1987), 433-440; Stasch, J. P. et al., European J. Pharmacol. 129 (1986), 165-168). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben auch die monoclonalen Antikörper KY-ANP-I und KY-ANP-II entwickelt, die beide α-ANP erkennen (Japanische Patentanmeldung Nummern: 218662/1987 und 47280/1983)
Andererseits wurden verschiedene Radioimmuntests für ANP entwickelt, die ein Antiserum verwenden (Science 228 (1985), 323-325; Nature 314 (1985), 264-266; Biochem. Biophys. Res. Commun. 124 (1984), 815-821 und 124 1984), 663-668 sowie 125 (1984), 315-323). In einer dieser Veröffentlichungen wird als Ergebnis eines solchen Immuntest berichtet, daß das Antiserum CR-3 das C-terminale Fragment [17-28] von ANP erkennt. Ergänzend hierzu wurde von einem Radioimmuntest von γ-ANP berichtet, der Antiserum verwendet (Hypertension Vol.11, Nr. 2 (1988), I-52-56). Auch immunhistochemische und neutralisierende Tests sind bekannt, die monoclonale Antikörper gegen ANP verwenden.
Wie vorstehend angemerkt fand unlängst eine außerordentliche Entwicklung auf dem Gebiet der ANP-Wissenschaft statt. Dennoch wurden monoclonale Antikörper, die dazu fähig sind, spezifisch γ-ANP zu erkennen, und ein wirksamer Immuntest für γ-ANP, der solche monoclonaien Antikörper verwendet, bis jetzt noch nicht etabliert.
Die vorliegende Erfindung stellt neue monoclonale Antikörper bereit, die die Eigenschaften eines Hybridoms aufweisen, das aus FERM BP-1887 erhältlich ist, die spezifisch die N-terminale Sequenz von γ-ANP erkennen und die eine hohe Affinität zu γ-ANP zeigen, zusammen mit Hybridomas, die solche Antikörper produzieren können. Ergänzend hierzu stellt die Erfindung ein hoch empfindliches Verfahren zur Messung von γ-ANP unter Verwendung solcher Antikörper bereit
Erfindungsgemäße monoclonale Antikörper erkennen hauptsächlich die 25 Aminosäurereste vom ersten Aminosäurerest bis zum 25. Aminosäurerest des N-Terminus von y-ANF. Das Segment, das aus diesen Aminosäureresten besteht, wird zur Vereinfachung nachstehend als γ-ANP[1-25] bezeichnet. Die erfindungsgemäßen rnonoclonalen Antikörper erkennen sowohl γ-hANP als auch γ-rANP. Die Antikörper erlauben durch RIA hoch empfindliche Messungen von γ-ANP. Wenn der Antikörper in Kombination mit einem beliebigen bekannten Antikörper, der α-ANP erkennt, wie CR-3, KY-ANP-I, KY-ANP-I oder KY-ANP-II, verwendet wird, ist es außerdem möglich, einen "Sandwich-Enzymimmuntest (EIA) mit sehr hoher Empfindlichkeit. durchzuführen, da γ-ANP [99-126] mit α-ANP[1-28] identisch ist, zumindest soweit es menschliches ANP betrifft.
Weitere Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung schließen ein:
(a) Verwendung eines erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpers in einem Immuntest für γ-ANP;
(b) Verwendung eines erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpers in einem in vitro-diagnostischen Verfahren und
ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Hybridoms oder monoclonalen Antikörpers, umfassend die Impfung eines Tieres mit γ-ANP und die Gewinnung Antikörper-produzierender Zellen davon, Fusion der Antikörper- produzierenden Zellen mit Myelomzellen und Auswahl der Fusionsprodukte, die zur Produktion eines monoclonalen Antikörpers fähig sind, der den N-Terminus erkennt, und gegebenenfalls Züchtung der ausgewählten Fusionsprodukte zur Produktion des gewünschten monoclonalen Antikörpers.
Dem Anmelder gelang es, monoclonale Antikörper zu gewinnen, die den N-Terminus von γ-hANP erkennen, und ein hoch empfindliches Verfahren zur Messung von γ-hANP unter Verwendung der Antikörper zu etablieren. Verfahren zur Herstellung dieser monoclonalen Antikörper und zur Messung von γ-hANP sind nachstehend ausführlich beschrieben.

(1) Herstellung eines Hybridoms, das einen monoclonalen Antikörper produziert

Wie vorstehend erwähnt, entspricht γ-hANP[99-126] genau α-hANP[1-28]. Daher wird ein Fragment,das aus dem gesamten oder einem Teil von γ-hANP[1-98] besteht, zur Herstellung eines Antikörpers, der spezifisch gegen γ-hANP ist, als Antigen verwendet. Das Fragment wird, wenn es als Immunogen verwendet wird, mit einem anderen Protein mit höherem Molekulargewicht, wie Rinderserumalbumin oder Rinderthyroglobulin, verknüpft. Das so gewonnene Konjugat wird in einem geeigneten Adjuvans, wie komplettes Freundsches Adjuvans, emulgiert und dann zur Immunisierung von Mäusen verwendet.
Die Immunisierung wird durch wiederholte intraperitoneale, subkutane oder intravenöse Impfung der Mäuse mit der vorstehenden Emulsion in Abständen von mehreren Wochen durchgeführt. Drei oder sieben Tage nach der letzten Immunisierung wird die Milz herausgenommen, die als Quelle für Antikörper-produzierende Zellen verwendet wird. Gleichzeitig werden Myelomzellen, die einen geeigneten Marker. wie Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase-Mangel (HGPRT-) oder Thymidin-Kinase-Mangel (TK&supmin;), aufweisen, präpariert. Die Antikörper-produzierenden Zellen und die Myelomzellen werden fusioniert, um ein Hybridom herzustellen.
Als Kulturmedium für das Hybridom-Wachstum können Medien, wie Eagle-MEM, modifiziertes Dulbecco-Medium oder RPMI-1640, mit Zusatz von etwa 15% fötalem Kälberserum (FCS), verwendet werden; die Wahl des Mediums ist nicht darauf begrenzt.
Zuerst werden die Myelomzellen und die Milzzellen im Verhältnis 1:10, in Anwesenheit eines Fusionsmittels, gemischt. Als Fusionsmittel wird im allgemeinen 50%iges Polyethylenglykol (PEG) wegen seiner hohen Fusionswirkung verwendet. Fusionierte Zellen werden mit dem HAT-Selektionsverfahren selektiert. Hybridome, die im Kulturüberstand enthalten sind, werden mit üblichen Verfahren, wie Membran-Fluoreszenz-Antikörper-Technik, Enzym- Immunsorptions-Test (ELISA-Verfahren), immunologisches Gewebefärbeverfahren und RIA, abgesucht, um Hybridome zu selektieren, die das gewünschte Immunglobulin sezernieren. Um die Homogenität der selektierten Hybridome zu sichern, wird eine Reclonierung wie folgt durchgeführt: Normale Milzzellen werden als Nährschicht in eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen eingebracht und die selektierten Hybridome werden in einer Menge, die eine Zelle pro Vertiefung nicht überschreitet, aufgegeben und das Absuchen nach gezüchteten Clonen wird nochmals durchgeführt. Homogene Hybridome werden durch Wiederholung des Subclonierungs-Verfahrens gewonnen.

2) Herstellung eines monoclonalen Antikörpers

Die vorstehend gewonnenen Hybridome werden in vitro oder in vivo gezüchtet, um einen erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper herzustellen, Wird die Kultur in vitro durchgeführt, können herkömmliche Medien, wie vorstehend erwähnt, mit Zusatz von FCS, verwendet werden. Nach Züchtung von 3 bis 5 Tagen in dem Medium wird der monoclonale Antikörper aus dem Kulturüberstand gewonnen. Wird die Kultur in vivo durchgetührt, wird das Hybridom in die Bauchhöhle eines Säugetiere gespritzt. Ein bis zwei Wochen danach wird Ascitesflüssigkeit gesammelt, aus der der monoclonale Antikörper gewonnen wird. Verglichen mit der in vitro-Kultur produziert die in vivo-Kultur eine weit größere Menge von Antikörper und wird deshalb bevorzugt.
Der aus dem Kulturüberstand oder aus der Ascitesflüssigkeit gewonnene monoclonale Antikörper wird mit bekannten Verfahren, wie Ammoniumsulfat-Fraktionierung, Adsorption an eine Protein A-Säule und DEAE-Sepharose - Säulenchromatographie oder einer Kombination davon, gereinigt.
Die Erfinder erhielten nach dem vorstehend erwähnten Verfahren einen monoclonalen Antikörper gegen γ-ANP, der als KY-ANP-III bezeichnet wurde, und untersuchten seine Eigenschaften. Der monoclonale Antikörper zeigt hohe Affinität zu γ-ANP (Ka= 5,3 x 10&sup9;M&supmin;¹).
Der Antikörper zeigt starke Kreuzreaktivität mit γ- hANP[1-25] und γ-hANP[1-72]. Eine nur schwache Kreuzreaktivität wurde mit γ-hANP[1-10] und γ-hANP[17-25] beobachtet. Dies zeigt, daß die ersten 25 Aminosäurereste des N-Terminus von γ-hANP für die Erkennung durch den Antikörper am wichtigsten sind. Der Antikörper zeigt auch Kreuzreaktivität mit γ-rANP.
Das Hybridom KY-ANP-III, das den erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper KY-ANP-III produziert, wurde am 18. Mai 1988 beim Fermentation Research Institute, Agency of the Industrial Science & Technology, Higashi 1-1-3, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan. gemäß dem Budapester Vertrag unter dem Namen Maus-Hybridom KY-ANP-III, Bikoken Joki Nr. 1887 (FERM BP-1887) hinterlegt.
Als ein Immuntest von γ-ANP, der den erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper KY-ANP-III verwendet, sei RIA, der einen einzigen Antikörper verwendet oder "Sandwich"-EIA erwähnt. Beim RIA, einem kompetitiven Verfahren, wie im nachstehenden Beispiel beschrieben, läßt man eine zu testende Probe oder Standard-γ-ANP und eine vorherbestimmte Menge isotop-markiertes γ-ANP um die Bindung an den Antikörper konkurrieren und die an den Antikörper gebundene Radioaktivität wird gemessen.
Ein Sandwich-EIA wird mit dem Antikörper KY-ANP-III in Kombination mit einem anderen Antikörper durchgeführt, zum Beispiel dem vorstehend erwähnten Antiserum CR-3, KY-ANF-I und KY-ANP-II, die alle mit γ-ANP[99-126] in der vorstehend erwähnten Weise reagieren.
Als teste Phase zur Immobilisierung des Antikörpers können Träger, wie Glas- oder Plastikperlen oder Kugeln, Röhrchen oder Platten verwendet werden, die im Handel erhältlich sind und die im allgemeinen als Träger für eine Antigen-Antikörper-Reaktion in einem Immuntest verwendet werden. Ein Antikörper, der α-ANP oder γ-ANP erkennt, wird an einen dieser Träger adsorbiert. Die Adsorption wird meistens durchgeführt, indem man den Antikörper mit dem Träger über Nacht in einem Phosphatpuifer mit pH-Wert 6-10, vorzugsweise bei neutralem pH-Wert, bei Raumtemperatur reagieren läßt. Der Träger, an den der Antikörper adsorbiert wurde, wird an einem kühlen Ort in Gegenwart eines antiseptischen Mittels, wie Natriumazid, aufbewahrt.
Monoclonale und polyclonale Antikörper können bei dem vorstehenden Verfahren verwendet werden. Trennung und Reinigung des verwendeten Antikörpers in dem vorstehenden Verfahren kann in folgender Weise durchgeführt werden.
Ascites oder Antiserum, das den Antikörper enthält, wird mit Natriumsuifat fraktioniert und dann über eine DEAE-Cellulose-Säule geschickt, wodurch IgG gewonnen wird. Das so gewonnene IgG wird mit Pepsin gespaltet, um ein F(ab')&sub2;-Fragment herzustellen, das dann mit 2-Mercaptoethylamin reduziert wird, wobei anti-α-ANP-Fab' oder anti-γ-ANP-Fab' erhalten wird. Die Herstellung von Fab' aus IgG wird ausführlich in J. Immunoassay 4 (1983), 209-327, beschrieben und das gleiche Verfahren kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Als Enzym für die Markierung des Antikörpers kann alkalische Phosphatase, β-D-Galactosidase, Peroxidase, Glucoseoxidase und andere verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt Meerrettich-Peroxidase verwendet. Als Verknüpfungsmittel, das dazu verwendet wird das Enzym mit dem Antikörper zu verbinden, kann N,N'-o-Phenylendimaleimid, N-Succinimid-4-(N-maleimidomethyl)- cyclohexanoat, N-Succinimid-6-maleimidohexanoat, N-Succinimid- 3-(2-pyridylthio)-propionat, 4,4'-Dithiopyridin und andere bekannte Wirkstoffe verwendet werden. Die Reaktion des Verknüpfungsmittels mit dem Enzym und dem Antikörper wird nach üblichen Verfahren, mit notwendigen Abänderungen in Abhängigkeit von der Art des einzelnen Verknüpfungsmittels, durchgeführt.
Aus dem Vorstehenden wird deutlich, daß das Fragment des Antikörpers, wie Fab', Fab und F(ab')&sub2;, anstatt Antikörper per se verwendet werden kann. Außerdem kann der enzymmarkierte Antikörper polyclonal oder monoclonal sein. Die Reinigung des enzymmarkierten Antikörpers, der unter der Verwendung des vorstehend erwähnten Verknüpfungsmittels gewonnen wurde, durch Affinitätschromatographie schafft ein noch empfindlicheres Immuntest-System.
Der gereinigte, enzymmarkierte Antikörper wird kühl und dunkel mit Zusatz eines Stabilisators, wie Thimerosal oder Glycerin, aufbewahrt oder er kann gefriergetrocknet werden.
Bei der Herstellung der vorstehend erwähnten Reagenzien des Immuntests, kann entweder ein Antikörper, der den N-Terminus von γ-ANP erkennt, immobilisiert werden, wobei ein Antikörper, der α-ANP erkennt, enzymmarkiert ist. oder ein Antikörper, der α-ANP erkennt, wird immobilisiert, wobei ein Antikörper. der γ-ANP erkennt, enzymmarkiert ist. Da die Immobilisierung eines Antikörpers eine große Menge ass Antikörpers benötigt wird die Immobilisierung eines monoclonalen Antikörpers, der konstant in großen Mengen gewonnen werden kann, bevorzugt. Dennoch kann ein polyclonaler Antikörper, der aus Antiserum hergestellt ist, ohne Schwierigkeiten verwendet werden.
Ein enzymmarkierter Antikörper kann entweder ein monoclonaler oder ein polyclonaler Antikörper sein, mit der Maßgabe, daß der Antikörper eine andere Stelle als der immobilisierte Antikörper erkennt. Zum Beispiel kann der erfindungsgemäße KY-ANP-III als immobilisierter Antikörper verwendet werden, während das vorstehend erwähnte Antiserum CR-3, KY-ANP-I oder KY-ANP-II als enzyrnznarkierter Antikörper verwendet werden kann und umgekehrt.
Beigefügte Zeichnungen:
Fig. 1 zeigt eine Aminosäuresequenz von γ-ANP.
Fig. 2 zeigt ein Scatchard-Diagramm der Bindung zwischen [¹²&sup5;I]-γ-ANP[1-25] und dem monoclonalen Antikörper KY-ANP-III. Ascites, der KY-ANP-III enthält, wurde mit [¹²&sup5;I]- γ-ANP[1-25] (12-800 pM, 500 ul/Röhrchen) 48 Stunden bei 4ºC inkubiert und die spezifische Bindung wurde nach der Trennung mit Dextran-beschichteter Holzkohle gemessen.
Fig. 3 zeigt eine typische Standardkurve von γ-ANP in einem RIA, in dem KY-ANP-III verwendet wird- und kreuzreaktionskurven verwandter Peptide. [¹²&sup5;I]γ-hANP[1-25] und Standard-γ-ANP oder verwandte Peptide wurden in unterschiedlichen Konzentrationen mit KY-ANP-III 24 Stunden bei 4ºC inkubiert. Die verwendeten Symbole in Fig. 3 haben folgende Bedeutungen: . . . .γ-hANP[1-25] , . . . .γ-hANP[1-72] , . . . .γ-hANP[1-67] Δ. . . .γ-hANP[1-16], . . . .γ-hANP[1-10], . . . .γ-hANP[17-25], κ. . . .γ-hANP und . . . .γ-ANP.
Das folgende Beispiel veranschaulicht und beschreibt die hier offenbarte Erfindung weiter. Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel nicht in ihrem Schutzumfang begrenzt.

Beispiel

Herstellung des Hybridoms

Synthetisches γ-hANP[1-25] (5,0 mg) und Rinderthyroglobulin (10 mg) wurden in 1,6 ml destilliertem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung von 20 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-Carbodiimid in 0 2 ml destilliertem Wasser innerhalb von 10 Minuten, bei einer Temperatur von 4ºC zugetropft; danach wurde das Gemisch bei 0ºC unter Stickstoffatmosphäre 4 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde dann viermal gegen 1,0 l destilliertes Wasser über einen Zeitraum von 3 Tagen dialysiert. Das Dialysat wurde in 5 Teile aufgeteilt, die bei -20ºC gelagert wurden < Biochem. Biophys. Resp Commun. 124 (1984), 815-821).
Jede der gelagerten Lösungen (jede enthält 300 ug γ-hANP [1-25]) wurde mit destilliertem Wasser bis zu einem Volumen von 1,2 ml aufgefüllt, das dann in 1,2 ml komplettem Freundschem Adjuvans suspendiert wurde. Etwa 2 ml wurden intraperitoneal und subkutan in 10 weibliche BALB/c-Mäuse injiziert (200 ul pro Tier). Die Tiere wurden siebenmal mit 7,5-30 ug pro Tier γ-hANP[1-25], suspendiert in komplettem Adjuvans, mit einem Intervall von etwa 4 Wochen injiziert. Sechs Tage nach der letzten Immunisierung durch eine intravenöse Injektion von 30 ug γ-hANP[1-25] wurden die Milzen der Mäuse entnommen, die für die Zellfusion verwendet wurden.
Die vorstehend gewonnenen Milzzellen und Myelomzellen X63-Ag.653 wurden mit Dulbecco-Medium (DMEM) vermischt (1:10) und das Gemisch wurde 5 Minuten bei 1500 Upm bei 4ºC zentrifugiert. Die gewonnenen Pellets wurden durch Erwärmen auf 37ºC abgelöst, dann wurde 1 ml 50%iges PEG4000 (1 g PEG / 1 ml DMEM) innerhalb von 1 Minute bei 37ºC zugetropft. Man ließ das Gemisch 2 Minuten bei 37ºC stehen, danach wurde es durch tropfenweise Zugabe von 10 ml DMEM bei 37ºC innerhalb von 5 Minuten verdünnt. Das Gemisch wurde dann durch Zentrifugation bei 4ºC mit 15% FCS enthaltendem DMEM gewaschen.
Nach der vorstehend erwähnten Zeilfusion wurden die Hybridome in HAT-Medium, das 15% fötales Kälberserum enthält, selektiert. Während der Züchtung der Hybridome wurde die Antikörperproduktion im Kulturmedium periodisch mit RIA unter Verwendung von [¹²&sup5;I]γ-hANP[1-25] untersucht, In fast allen Vertiefungen wurde ein Wachstum der Hybridome beobachtet, 0,8% (3 Vertiefungen) davon produzierten Antikörper. Antikörper produzierende Zellen wurden zweimal durch das Grenzverdünnungsverfahren unter Verwendung von Thymuszellen der Maus als Nährschicht cloniert. Ein Clon, der einen Antikörper mit der stärksten Reaktivität, d.h. KY-ANP-III, produzierte, wurde etabliert. Um die Eigenschaften von KY-ANP-III zu untersuchen wurde der Clon weitergezüchtet.

Herstellung des monoclonalen Antikörpers

BALB/c-Mäuse wurden zweimal durch eine intraperitoneale Infektion von 0,5 ml Pristan/Tier in Intervallen von 1 bis 2 Wochen vorbehandelt. Jeder Maus wurden 5 x 10&sup6; Zellen des Hybridoms KY-ANP-III, suspendiert in 200 ul DMEM intraperitoneal injiziert. Der den Mäusen entnommene Ascites wurde mit einer Protein A Sepharose CL-4B-Säule gereinigt wobei der monoclonale Antikörper KY-ANP-III erhalten wurde.

Eigenschaften des monoclonalen Antikörpers

Der Isotyp des vorstehend gewonnenen monoclonalen Antikörpers wurde mit dem Ouchterlony-Verfahren (Mouse Monoclonal Typing Kit, Miles) bestimmt. Die Affinitätskonstante wurde mit dem Scatchard-Verfahren mit Hilfe des später erläuterten RIAs, bestimmt, Die Spezifität des Antikörpers wurde durch Feststellung der Kreuzreaktivität mit verschiedenen ANP-verwandten Peptiden an Hand eines RIA analysiert.
Mit dem Ouchterlony-Verfahren wurde festgestellt, daß der gewonnene monoclonale Antikörper zur IgG&sub1;-Unterklasse gehört. Die mit dem Scatchard-Verfahren gemessene Affinitätskonstante, mit einem Ka-Wert von 5,3 x 10&sup9;M&supmin;¹ (vgl. Fig. 2), zeigt eine hohe Affinität für γ-hANP[1-25].

RIA

Der RIA unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers wurde nach dem in Hypertension, Vol. 11, Nr. 2 (1988), I-52-56, beschriebenen Verfahren, das die Verwendung von polyclonalem Antiserum beinhaltet, durchgeführt.
Die verwendeten Reagenzien wurden immer in 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) gelöst. die 0,1% Gelatine (Merck), 1 mM Na&sub2;EDTA 0,2 mM Cystin, 0,1% Triton X-100 und 0,01% Merthiolat enthält.
Ein Gemisch aus 100 ul verdünnter Asciteslösung (1:10&sup5;), die KY-ANP-III enthält, 100 ul einer Probe oder einer verdünnten Lösung von Standard-γ-ANP, 200 ul des vorstehend erwähnten Puffers und 100 ul von [¹²&sup5;I]γ-hANP[1-25) (etwa 10.000 cpm) ließ man bei 4ºC 48 Stunden reagieren. Dem Reaktionsgemisch wurden dann 1 ml Dextran-beschichtete Holzkohle hinzugefügt es wurde damit vermischt und man ließ es 15 Minuten bei 4ºC reagieren. Das Reaktionsgemisch wurde dann 30 Minuten bei 4ºC bei 3000 Upm zentrifugiert und die Radioaktivität des Überstandes wurde mit einem γ-Zähler gemessen, wodurch der Antikörpertiter der verdünnten Lösung der Probe erhalten wurde. Die spezifische Aktivität von [¹²&sup5;I] γ-hANP[1-25] betrug 570 uCi/ug. Wurde Ascites der Maus verwendet, nachdem dieser 1:5 x 10&sup5; verdünnt wurde, betrug die Bindungsrate mit einem Tracer etwa 25%.
Das vorstehend erwähnte [¹²&sup5;I]γ-hANP[1-25] wurde mit dem Chloramin T-Verfahren hergestellt. Dabei wurde γ-hANP[1-25] (1ug) mit Na¹²&sup5;I (1 mCi) zu dem 10 ul Chloramin T (5,25 mg/ml) hinzugefügt waren, gemischt. 10 Sekunden danach wurden 20 ul Natriumpyrosulfit (4.5 mg/ml) hinzugefügt. Dem Gemisch wurden weiter 1 ml 2%ige Gelatine hinzugefügt und das erhaltene [¹²&sup5;I]γ-hANP wurde dann mit Sep-Pak C18 (Waters Co., Ltd.) gereinigt
Die mit RIA unter Verwendung des erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpers bestimmte Standardkurve von γ-hANP und die Kreuzreaktivität mit verwandten Peptiden sind in Fig. 3 dargestellt.
Da der erfindungsgemäße KY-ANP-III γ-rANP ebenso wie γ- hANP erkennt, ist der Antikörper nicht nur für die Messung von menschlichem ANP geeignet, sondern auch von ANP verschiedener Versuchstiere, wie Ratten und Mäuse. KY-ANP-III kann zusammen mit anderen bekannten Antikörpern gegen ANP verwendet werden, um γ-ANP mit hoher Empfindlichkeit zu bestimmen. Die Etablierung des Verfahrens, γ-ANP unter Verwendung des erfindunggemäßen monoclonalen Antikörpers zu messen, ermöglicht es uns verschiedene Erkrankungen, die von einer Normabweichung des Körperflüssigkeitsgleichgewichts begleitet sind, wie Herzerkrankungen, Nierenerkrankungen, Hypertonie (essentielle und sekundäre), ödematöse Erkrankungen (Cirrhose, Nephrose, kataplektisches Ödem, etc.) und Dehydration, einfach und genau zu diagnosizieren und die Ergebnisse der Behandlungen zu verfolgen.

Claims

1. Hybridom mit den Eigenschaften eines Hybridoms, das aus FERM BP-1887 erhältlich ist.

2. Monoclonaler Antikörper, der hauptsächlich die ersten 25 Aminosäuren des N-Terminus von γ-ANP erkennt und von einem Hybridom gemäß Anspruch 1 produziert wird.

3. Verwendung eines monoclonalen Antikörpers nach Anspruch 2 in einem Immuntest für γ-ANP.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei der Immuntest ein Radioimmuntest oder ein Enzymimmuntest ist.

5. Verwendung eines monoclonalen Antikörpers nach Anspruch 2 in einem in vitro diagnostischen Verfahren.

6. Verfahren zur Herstellung eines Hybridoms nach Anspruch 1 oder eines monocionalen Antikörpern nach Anspruch 2, umfassend die Sensibilisierung eines Tieres mit γ-ANP und die Gewinnung Antikörper-produzierender Zellen davon, Fusion der Antikörper-produzierenden Zellen mit Myelomzellen und Auswahl eines Produktes aus den Fusionsprodukten, das zur Produktion eines monoclonaler Antikörpers fähig ist, der den N-Terminus von γ-ANP erkennt, und gegebenenfalls Züchtung des ausgewählten Fusionsprodukts zum Produktion des gewünschten monoclonalen Antikörpers.