DE69729857T2

DE69729857T2 - An menschliches wachstumshormon (hgh) bindende monoklonale antikörper

Info

Publication number: DE69729857T2
Application number: DE69729857T
Authority: DE
Inventors: Elof Yngve HANSSON; Leonor Kremer Baron; Carlos Martinez Alonso; Jose Mario Mellado Garcia; Jose Miguel Rodriguez Frade
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Pharmacia Spain SA
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Pharmacia Spain SA
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-03-27
Publication date: 2005-08-25
Anticipated expiration: 2017-03-28
Also published as: JP2000508889A; CA2250047C; DE69729857D1; SE9601231D0; EP0889907B1; AU716091B2; DK0889907T3; NO984522L; NZ331868A; EP0889907A1; ATE271067T1; NO323598B1; CA2250047A1; SI0889907T1; NO984522D0; PT889907E; AU2525597A; WO1997036929A1; ES2224231T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen monoklonalen Antikörper, der in der Lage ist, spezifisch an diejenige Variante des menschlichen Wachstumshormos zu binden, welche ein Molekulargewicht von 20 kDa aufweist und hier als hGH 20K bezeichnet ist.
Dieser monoklonale Antikörper besitzt keine spezifische Bindungsfähigkeit an hGH des Molekulargewichts 22 kDa.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung dieses monoklonalen Antikörpers zur Bestimmung von hGH 20K, besonders in Körperflüssigkeiten.
Die Antikörper können für die Auffindung und Quantifizierung von hGH 20K, besonders im Serum, eingesetzt werden.
Eine Hybridomzelllinie, welche den Antikörper bildet, ist unter der Nummer DSM ACC 2254 am 28. Februar 1996 hinterlegt worden.
EINLEITUNG
Menschliches Wachstumshormon (hGH) ist ein einkettiges Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 22 kDa (hGH 22K), das aus 191 Aminosäuren mit zwei Disulfidbrücken innerhalb der Kette zusammengesetzt ist und von der vorderen Hypophyse gebildet wird (1, 2).
Das zirkulierende hGH ist jedoch eine komplexe Mischung verschiedener molekularer Formen, von denen einige, wie z. B. hGH 22K und hGH 20K, ein menschliches Wachstumshormon in Form eines einkettigen Polypeptides mit einem Molekulargewicht von 20 KDa, von der Hypophyse stammen, während andere (hGH-V) während der Schwangerschaft von der Plazenta sekretiert werden. Weiterhin zeigen andere trope Hormone, Plazentalaktogen (hPL) und Prolaktin (PRL) eine auffallende Se quenzidentität mit hGH. Andere Varianten des hGH, die durch post-translationale Modifikationen, wie z. B. Deamidierung, Acylierung, Glycosylierung und Oligomerisierung (3), abgeleitet sind, wurden ebenfalls beschrieben.
Das menschliche Wachstumshormon wird durch zwei Gene, hGH-N und hGH-V, kodiert, die zusammen mit dem Gen des hoch homologen Plazentalactogens (hPL) (4, 5) am Chromosom 17 einen Cluster bilden. Das Hauptprodukt des in den Hypophysenzellen exprimierten hGH-N-Gens ist die 191-Aminosäure 22K hGH.
Ein sekundäres Produkt dieses Gens ist das 20K hGH, entstanden durch alternatives Splicing einer mRNA, bei der 15 Reste in der Aminosäurekette fehlen, nämlich von Aminosäure 32 bis 46 (6, 7). Dieses hGH 20K repräsentiert 5 bis 10% der hGH der Hypophyse (3) und seine biologischen Eigenschaften sind noch nicht definiert. Während es sicherlich einige Funktionen mit der 22K-Isoform teilt, sind auch spezifische Aktivitäten in Erscheinung getreten. So bindet hGH 20K nicht an die hGH-Rezeptoren der menschlichen Leber (8) oder zeigt wenigstens eine geschwächte Bindung (9) und hat weniger insulinähnlich stimulierende Aktivität (10). Die 20K-Isoform konkurriert mit dem hGH bei der Bindung an die Rezeptoren der Brustdrüsen des Kaninchens und zeigt damit an, dass seine Aktivität eher laktogen als somatogen ist, obwohl sie das Wachstum von hypophysektomierten Ratten fördert (11); vgl. auch EP 587 427 .
hGH 20K wird langsamer als hGH abgebaut und die hierdurch verlängerte Wirkdauer von hGH 20K trägt möglicherweise zu einer in-vivo Bioaktivität im Kreislauf bei, die höher als erwartet ist (Baumann et al., Endocrinology, Vol 117, No 4, 1309–13, 1985). In EP 587 427 ist ein Verfahren zur Herstellung von hGH 20K mittels einer rekombinanten Technik beschrieben.
Trotz der klinischen Relevanz dieser Familie von Peptidhormonen gibt es wenig Information über die Konzentrationen der Isoformen im Kreislauf oder über die relative Mitwirkung einer jeden molekularen Form der komplexen Mischung. Selektive Assays zur Definition der hGH 22K- und hGH 20K-Konzentration wären sowohl für die Diagnostik als auch für die Grundlagenforschung wertvoll (12, 13, 14). Mittel, wie z. B. monoklonale Antikörper (mAb), welche die Wirkung dieser Proteine spezifisch blockieren, könnten als Hilfen zum Verständnis ihrer spezifischen biologischen Aktivitäten von großem Interesse sein.
Es wird darauf hingewiesen, dass die Menge und das Verhältnis zwischen hGH 22K und hGH 20K im Kreislauf für bestimmte Krankheiten wie Diabetes, Akromegalie, chronische Leber- und/oder Nierenerkrankungen und deren jeweiliges Krankheitsstadium wichtig sein könnten, so dass eine spezifische und präzise Methode zur Bestimmung von 20 kDa dringend benötigt wird.
Bis heute existiert keine auf der Verwendung eines hGH 20K-spezifischen mAb beruhende Methode zur spezifischen Bestimmung und Quantifizierung. Es wurden erfolglose Versuche unternommen, den hGH 20K-spezifischen mAb zu züchten, um so Immunoassays für hGH 20K zu entwickeln. Hier wird auf F. Gomez et al., J of Immunoassay, 5 (364); 145–57 (1984) verwiesen. Auf Seite 155 ist vermerkt: „Da die präzise pathophysiologische Relevanz des 20K GH noch weitgehend unbekannt ist, hielten wir es für angebracht, einen geeigneten Immunoassay hierfür zu entwickeln und zunächst monoklonale Antikörper gegen hGH 20K mit hoher Spezifität zu erhalten. Dennoch konnten trotz selektiver Immunisierung der Tiere mit einer hochgereinigten Zubereitung der Variante keine stabilen Hybridome erhalten werden, die spezifische monoklonale Antikörper gegen 20K sekretieren".
Bo Dinesen diskutiert in Hormone Research, Vol 36, No 1, 1991, 11–16 die immunchemischen Aspekte von GH-Assays, aber in der grundsätzlichen Diskussion über den Vorteil eines selektiven Assays zur Bestimmung der individuellen Konzentration verschiedener GH-Splicing-Formen, wie 22K und 20K, werden keine 20K-spezifischen mAb beschrieben. Frankenne F et al. demonstrieren in J Clin Endocrinol Metab, 1988, June 66 (6): 1171–80, mAb, welche unterschiedliche Epitope erkennen, aber es werden keine 20K-spezifischen mAb offenbart. Aston et al. beschreiben in Mol Immunol. 1985, Mar 22 (3): 271–5, monoklonale Antikörper für das menschliche Wachstumshormon die zwischen hypophysären und genetisch hergestellten Formen unterscheiden können, es wurden also Antikörper erzeugt, um zwischen rekombinantem NH₂-terminalem Methionin-GH und von der Hypophyse abgeleitetem GH unterscheiden zu können, aber es ist kein mAb offenbart, der für hGH 20k spezifisch ist.
Es besteht schon lange ein Bedürfnis für hGH 20K-Antikörper mit einer hohen Spezifität, die in einem spezifischen und genauen Verfahren zur Messung von hGH 20K eingesetzt werden können. Ein solcher Antikörper könnte möglicherweise auch für therapeutische Anwendungen eingesetzt werden, wenn die biologischen Aktivität von hGH 20K blockiert wird.
Wir haben nun eine Lösung gefunden, den Bedarf an Ermittlung und Quantifizierung von hGH 20K zu decken, da wir einen mAb generiert haben, der für hGH 20K spezifisch ist.
Dieser mAb ist in verschiedenen Assays zur spezifischen Ermittlung und Quantifizierung dieses Hormons erfolgreich verwendet worden, und es wurde auch gefunden, dass er dessen spezifische biologische Aktivität blockiert. Aus diesem Grund ist es auch verwendbar, um die biologische Aktivität dieses Hormons zu untersuchen und dessen biologische Signifikanz zu analysieren.
In besonderen Beispielen beschreiben wir die Herstellung und Charakterisierung dieses mAb. Als Vergleichsantikörper beschreiben wir auch monoklonale Antikörper, die für hGH 22K spezifisch sind und einen, der beide, nämlich hGH 20K und hGH 22K, erkennt.
LEGENDE DER ABBILDUNGEN
1 (A–C)Hemmung der mAb-¹²⁵ 1-hGH-(20K oder 22K)Bindung mit nicht-markiertem rhGH-22K, hGH-20K, hGH-V, hPL und hPRL. Die Abbildungen beziehen sich auf mAb hGH-33 (1A), hGH-12 (1B) und hGH-25 (1C).
2 Sandwich-capture-Assays für die spezifische Bestimmung von hGH-Isoformen. hGH-22K (2A) und hGH-20K (2B).
3 Stimulierung des Wachstums chimärer hGHR/G-CSF-transfizierter Ba/F3-Zellen als Reaktion auf hGH-22K und 20K.
4 Blockade der hGH 22K- und 20K-Aktivität durch monoklonale Antikörper bei Ba/F3-transfizierten Zellen.
5 Dosisabhängige Reaktion von 20K- und 22K hGH bei Zugabe zu einem Pool normalen menschlichen Serums.
DIE ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf gegenüber dem menschlichem Wachstumshormon (hGH) mit einem Molekulargewicht von 20 kDa (hGH 20K) spezifische monoklonale Antikörper mit einer Affinität gegenüber hGH 20K von 1 × 10⁸ M^–1 oder höher, vorzugsweise mindestens 1 × 10⁹ M^–1 und höher, bevorzugt über 2 × 10⁹ M^–1, wie von uns ermittelt und im experimentellen Teil beschrieben.
Die beanspruchten Antikörper sind befähigt, an das menschliche Wachstumshormon (hGH) mit einem Molekulargewicht von 20 kDa (hGH 20K) zu binden, bei einer unter 5%, vorzugsweise unter 1% liegenden Kreuzreaktion mit hGH eines Molekulargewichts von 22 kDa. Die Kreuzreaktivität mit hGH-V, Plazentalaktogen und Prolaktin sollte klein sein und, wie im experimentellen Teil ermittelt, bevorzugt weniger als 5% und, noch bevorzugter, weniger als 1% betragen.
Es wurden auch folgende Hormone auf ihre Kreuzreaktivität untersucht und zeigten weniger als 5% und sogar weniger als 1% Kreuzreaktivität: Luteinisierendes Hormon (LH), humanes Choriongonadotropin (HCG), follikelstimulierendes Hormon (FSH) und schilddrüsenstimulierendes Hormon (TSH).
Dieser monoklonale Antikörper kann für die Messung von hGH 20K z. B. in Körperflüssigkeiten, wie Serum, Plasma, Blut, Speichel, Urin, Lymphflüssigkeit usw., verwendet werden. Der Antikörper der Erfindung kann für die Bestimmung des hGH 20K in Immunoassays bei Proben verwendet werden, die dieses Hormon enthalten. Die verschiedenen Formen des Immunoassays sind allgemein bekannter Stand der Technik und umfassen folgende Schritte:

1) Zusammenbringen einer Probe, welche hGH 20K enthält, mit dem Antikörper der Erfindung zur Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper und hGH 20K in einer Menge die zur Menge des hGH 20K in der Probe in Beziehung steht und
2) Bestimmung der Menge des gebildeten Komplexes in an sich bekannter Weise und in Beziehung-Setzen der gefundenen Menge zur Menge des hGH 20K in der Probe.

Immunoassays können heterogen oder homogen, kompetitiv oder nicht-kompetitiv sein (Sandwich). In vielen Fällen wird in den verschiedenen Formen von markierten Reagenzien, im vorliegenden Fall von hGH 20K, Antikörpern oder Anti-Antikörpern, die an hGH 20K binden, Gebrauch gemacht, die mit Enzymen, Isotopen, Biotin, Fluorophoren oder Chromophoren etc. (z. B. Anti-Maus Ig) markiert sind, um die Bestimmung der Menge des gebildeten Komplexes zu ermöglichen.
Der beanspruchte Antikörper kann unmittelbar oder indirekt über einen anderen Antikörper, der an den beanspruchten Antikörper gebunden ist, an eine feste Phase gebunden werden. Der beanspruchte Antikörper könnte auch in löslicher Form angewendet werden.
In einigen Formen kann Gebrauch von Fällungsmitteln, etwa von Anti-Antiseren und von in fester Phase gebundenen Anti-Antikörpern, gemacht werden.
Der beanspruchte Antikörper kann in multianalytischen Assays, z. B. zur Bestimmung verschiedener Isoformen des hGH angewandt werden.
Für die Ermittlung von hGH 20K im Gewebe verschiedener Spezies (z. B. Affen, Kaninchen, Hunde, Ratten) wird die Anwendung einer immunhistochemischen Färbung empfohlen.
Die Verwendung des beanspruchten monoklonalen Antikörpers kann auch bei der Reinigung von hGH 20K-haltigen Proben nützlich sein.
Da anzunehmen ist, dass hGH 20K eine eigene therapeutische Wirkung besitzt, wird auch eine therapeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge des monoklonalen Antikörpers in einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff aufweist, beansprucht. Desgleichen wird ein Verfahren beansprucht, bei dem ein Patient, bei dem die Menge von 20K erniedrigt werden muss, durch Verabreichung der beanspruchten Verbindung behandelt wird.
DEFINITIONEN
Unter Körperflüssigkeiten versteht man beispielsweise Serum, Plasma, Lymphflüssigkeit, Vollblut, Urin, Speichel, Spinalflüssigkeit, Medien aus Gewebskulturen, Zellextrakte.
hGH bedeutet menschliches Wachstumshormon, hGH 20K bedeutet eine Variante des hGH mit einem Molekulargewicht von 20 kDa und hGH 22K stellt eine Variante von hGH mit einem Molekulargewicht von 22 kDa dar.
mAb hGH-33 ist der von uns aufgefundene monoklonale Antikörper, der, bei geringer Neigung zu Kreuzreaktionen mit dem hGH vom Molekulargewicht 22 kDa, befähigt ist, an das menschliche Wachstumshormon mit einem Molekulargewicht von 20 kDa zu binden und der von den Ansprüchen umfasst wird.
mAb hGH-12 ist ein monoklonaler Antikörper, der fähig ist, an das menschliche Wachstumshormon (hGH) mit einem Molekulargewicht von 20 kDa ebenso gut zu binden, wie an hGH mit einem Molekulargewicht von 22 kDa.
mAb hGH-25 und mAb hGH-26 sind monoklonale Antikörper, die in der Lage sind, an das menschliche Wachstumshormon (hGH) mit einem Molekulargewicht von 22 kDa zu binden, ohne eine Kreuzreaktionen mit hGH des Molekulargewichts von 20 kDa zu zeigen.

Unter Antikörper (ab) versteht man Antigen-bindende Antikörperfragmente (Fv, Fab, Fab2, einkettiges Fv etc.), Chimären (wie Klasse-Klasse and Spezies-Spezies), miteinander verbundene Antikörper und rekombinante Antikörper.

BSA	Rinderserum Albumin
cpm	Zerfall pro Minute (count per minute)
EIA	Enzymgebundenes Immunoassay
FCS	Foetales Kalbsserum
hGHR	Rezeptor für menschliches Wachstumshormon
G-CSFR	Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor-Rezeptor
PBS	Phosphatgepufferte Salzlösung
PEG	Polyethylenglykol

EXPERIMENTELLES, MATERIALIEN UND METHODEN
MATERIAL
Rekombinantes, menschliches GH 22K (rhGH-22K, Genotropin) und die rekombinante, menschliche GH-Variante (rhGH-V) wurden von Pharmacia Peptide Hormones (Schweden) erhalten. Gereinigtes menschliches GH 20K wurde freundlicherweise von Professor Paul Roos (Uppsala, Schweden) zur Verfügung gestellt. Gereinigtes hPL, hPRL, und hGH-22K stammen von Dr. A. F. Parlow (Pituitary Hormones and Antisera Center, Maryland, USA)
IMMUNISIERUNG
BALB/c, C571BL10 und C3H/He-Mäuse wurden subkutan mit 10–40 μg Protein in 0.1 ml steriler, phosphatgepufferter und mit Freunds Complete Adjuvant (Difco Laboratories, USA) emulgierter Salzlösung (PBS) immunisiert. Die Mäuse wurden an den Tagen 30 und 60 subkutan mit 20 μg Protein in Freunds Incomplete Adjuvant und am Tag 90 intraperitoneal mit 20 μg Protein in PBS geboostert. Vor der Zellfusion wurden die Mäuse intravenös an den Tagen -3 und -2 mit 40 μg Hormon in sterilem PBS geboostert.
Serum der immunisierten Mäuse wurde 7 bis 10 Tage nach jedem Boost gesammelt und die Anwesenheit spezifischer Antikörper mittels Enzymimmunoassay (EIA) oder Radioimmunoassay (RIA) untersucht.
ZELLFUSIONEN UND HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTIKÖRPER
Milzzellen und/oder Zellen von Lymphknoten von Mäusen wurden unter Verwendung von Polyethylenglykol 4000 (Merck, Deutschland) mit der Myelom-Zelllinie P3X63Ag8.653 (CRL 1580,ATCC) fusioniert, wobei nach Standardprotokollen (15, 16) gearbeitet wurde.
Die Überstände wurden mittels EIA oder RIA auf Anwesenheit von Antikörpern getestet und positive Hybridome wurden durch wiederholte Verdünnung auf einer Thymozyten-Nährzellschicht bis zum Erreichen einer stabilen Antikörperproduktion stabilisiert. Die Hybridome wurden in Abwesenheit von Antibiotika bei 37°C und bei 5% CO₂ in RPMI-1640, 10% FCS, gezüchtet.
Monoklonale Antikörper wurden sowohl im Überstand von Gewebskulturen als auch in durch Injektion von Pristane (Sigma Chemical Co.) bei Mäusen induzierten Ascites-Flüssigkeiten (17) hergestellt; diese wurden durch Ammoniumsulfatfällung (16) und/oder an immobilisierter Protein A-Sepharose (Pharmacia, Schweden) durchgeführter Affinitätschromatographie gereinigt.
Der Isotyp eines jeden mAb wurde unter Verwendung von nach Klassen und Unterklassen spezifischen Antiseren (ICN) durch Doppeldiffusionen nach Ouchterlony bestimmt.
JODIERUNG UND BIOTINYLIERUNG VON PROTEINEN
Hormone (2,5 μg in 20 ml 50 μM Natriumphosphatpuffer, pH 7,6) wurden unter Verwendung von Iodogen-beschichteten Röhrchen (Pierce Chemical Co.) (19) oder mittels Chloramin-T (20) als Oxidationsmittel jodiert.
Die jodierten Hormone wurden von nichtmarkierten mittels Gelfiltration an einer PD-10 Sephadex G-25M Säule (Pharmacia) abgetrennt. Die spezifische Aktivität der markierten Hormone reichte von 10 bis 50 μCi/μg. Die Biotinylierung wurde wie beschrieben durchgeführt (21). Die Hormone und die mAb (0,5 mg in 0,5 ml eines 150 mM NaCl enthaltenden 0,1 molaren Carbonatpuffer, pH 9) wurden 120 Minuten in 50 μl 1 mg/ml N-Hydroxysuccinimid-Biotin in Dimethylsulfoxid (Sigma Chemical Co.) bei Raumtemperatur inkubiert. Nicht gebundenes Biotin wurde durch Dialyse gegen PBS entfernt. Biotin-markiertes Protein wurde 1 : 2 mit Glycerin verdünnt und bei –20°C aufbewahrt.
ENZYMGEBUNDENE IMMUNOASSAYS
Drei verschiedene enzymgebundene Immunoassays (EIA) wurden durchgeführt (Antikörper, Antigen und Sandwich-captures) die sich in ihrem Mechanismus der Antigenpräsentation gegenüber dem Antikörper unterschieden.
1. ENZYMGEBUNDENE IMMUNOASSAYS – ANTIKÖRPER CAPTURE
Die Hormone (0,5 μg/ml in PBS, 100 μl/well) wurden über Nacht bei 4°C an Mikrotiter-Platten (Maxisorb, Nunc) adsorbiert. Verbleibende Proteinbindungsstellen wurden mit 0,5% BSA in PBS blockiert. Nach dem Waschen der Platten mit destilliertem Wasser wurden die mAb 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Dann wurden Pe roxidase-markierter Anti-Maus Immunglobulin-Antikörper aus der Ziege (GAM-PO) (Tago Inc.) und o-Phenylendiamin-dihydrochlorid (OPD, 4 mg/ml in 0,15 molarem Natriumcitratpuffer, pH 5,0, Sigma Chemical Co.) zugegeben. Die Reaktion wurde mittels 3 N Schwefelsäure abgebrochen und die optische Dichte bei 492 nm bestimmt.
2. ENZYMGEBUNDENE IMMUNOASSAYS-ANTIGEN CAPTURE
Die monoklonalen Antikörper wurden entweder direkt (3 μg/ml in PBS) oder über einen affinitäts-gereinigten GAM-Antikörper an die feste Phase adsorbiert. Nach der Blockade wurden die Biotin-markierten Hormone in 0,5% BSA enthaltendem PBS 1 : 500 bis 1 : 1000 verdünnt und 60 Minuten bei 37°C inkubiert, anschließend erfolgte eine 30minütige Inkubation unter Zugabe von Peroxidase-markiertem Streptavidin (Sigma Chemical Co.) und OPD bei 37°C. Die Reaktion wurde wie oben abgebrochen.
3. ENZYMGEBUNDENE IMMUNOASSAYS-SANDWICH CAPTURE
Gereinigte mAb (3 μg/ml in PBS) wurden auf Mikrotiter-Platten adsorbiert. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C und Blockierung mit 0,5% BSA wurden Hormonverdünnungen in PBS-0,5% BSA zugegeben und 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschen wurde ein zweiter Biotin-markierter mAb (mAb hGH-12), der vorher auf optimale Bindung titriert wurde, zugegeben. Das mAb hGH-12 wurde als zweiter Antikörper verwendet, da er beide molekularen Formen erkannte. Danach wurden Peroxidase-markiertes Streptavidin und OPD zugegeben. Die Reaktion wurde wie zuvor abgebrochen.
RADIOIMMUNOASSAY-FESTE PHASE
Die Antikörper wurden über einen affinitäts-gereinigten GAM-Antikörper (2,5 μg/ml in PBS) auf RIA Well-Streifen (Costar) adsorbiert. Nach der Blockierung mit 0,5% BSA in PBS wurden Jod-markierte Hormone (20.000 cpm/well) zugegeben und 120 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Waschen mit destilliertem Wasser wurde die gebundene Radioaktivität gemessen.
RADIOIMMUNOASSAY-FLÜSSIGE PHASE
Die Antikörper (100 μl/Röhrchen) – die in 10 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, 10 mM EDTA, 0,25% BSA, pH 7,6 (RIA-Puffer) verdünnt waren, so dass eine halbmaximale Bindung erreicht wird – wurden mit 30.000 cpm Jodmarkierter Hormone in 100 μl RIA-Puffer in Gegenwart oder Abwesenheit unmarkierter Hormone als Kompetitoren inkubiert. Normales Mausserum wurde zum Erreichen von 0,25% im endgültigen Reaktionsvolumen zugegeben. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wurden 400 μl gebundener und ungebundener Hormone durch 60minütige Inkubation bei Raumtemperatur mit 200 μl 5%igen GAM Antiserum und 200 μl 15%igem PEG 6000 (Merck) und anschließendes 20minütiges Zentrifugieren bei 1520 × g voneinander abgetrennt. Die verbleibende Radioaktivität im Pellet wurde in einem Gammastrahlenzähler gezählt.
AFFINITÄTSKONSTANTE UND BESTIMMUNG DER KREUZREAKZIVITÄT
Die vorhandenen Affinitätskonstanten (K_a) des mAb wurden durch Plotanalyse der kompetitiven RIA-Daten (22) nach Scatchard bestimmt. Kreuzreaktivitäten wurden als die Menge der Kompetitoren definiert, die für eine entsprechende Verdrängung der Tracer, die an den mAb gebunden sind, erforderlich sind.
SDS-PAGE-ANALYSE UND WESTERN BLOTS
Hormone (je 15 μg) wurden nach der Methode von Laemmli (23) in 15% (Gew./Vol.) SDS-Polyacrylamidgelen elektrophoretisch aufgetrennt. Die Gele wurden mit Coomassieblau eingefärbt oder 60 Minuten bei 250 mA in einem Puffer mit 48 millimolarer Tris-Base, 39 mM Glycin, 20% Methanol und einem Gehalt an 0,037% SDS auf Nitrozellulose auf einem semi-dry Biotter (Bio Rad) überführt. Nach der Blockierung mit 10% fettfreier Trockenmilch in PBS wurden die mAb unter Schütteln 120 Minuten bei Raumtemperatur und unter anschließender Zugabe eines auf 1 : 2500 verdünnten GAM-PO Antikörpers (Tago Inc.) inkubiert. Der Blot wurde unter Verwendung eines 4-Chlor-1-naphtholsubstrats (Sigma Chemical Co.) entwickelt.
DAS ZELLPROLIFERATIONS-ASSAY
Mit dem chimären Konstrukt hGHR/G-CSFR transfizierte Ba/F3-Zellen wurden in einem RPMI-1640-Medium, das zusätzlich mit IL-3 (10 U/ml) und 10% FCS versetzt wurde, bei 37°C in 5% CO₂ gezüchtet. Die Zellen (20 × 10⁵ Zellen/ml) wurden im sel ben Medium ohne IL-3 gewaschen, und 25 μl der Zellsuspension wurden auf 96-Well-Platten gegeben. Die Zellen wurden mit verschiedenen Hormon-Konzentrationen (0,001 nM–10 Nm) in einem Endvolumen von 100 μl über 18 Stunden bei 37°C behandelt. In Competition-Assays wurden verschiedene Konzentrationen gereinigter mAb (1–450 nM) und Hormone (0,001–10 nM) vor der Behandlung der Zellen 18 Stunden bei 4°C vorinkubiert. Um die DNA-Synthese zu messen, wurde 1 μCi/Well (5 Ci/mmol) ³H-Thymidin zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 4 Stunden bei 37°C in 5% CO₂ wurden die Zellen gesammelt und auf Glasfiltern gewaschen. Mit einem β-Zähler wurde die Radioaktiviät bestimmt.
ERGEBNISSE
Beispiel 1. Analyse von Seren mit Antikörper-Capture EIA
Bei der Analyse von Seren hGH 20K- oder 22K-immunisierter Mäuse mittels Antikörper-Capture EIA wurde gefunden, dass alle Mäuse abhängig vom verwendeten Screening-Assay und dem eingesetzten Immunogen auf das entsprechende Immunogen mit Titern von 1 : 500 bis 1 : 100.000 reagierten (wobei die Verdünnung des Antiserums halbmaximale Bindungen ergab).
Seren von hGH 20K-immunisierten Mäusen wurden mittels Antikörper-Capture EIA analysiert, wobei an eine feste Phase gebundene hGH 20K und hGH 22K zur Anwendung kamen. Die Titer reichten von 1 : 500 bis 1 : 10.000 für beide Hormone und zeigten für hGH 22- oder 20K keine Spezifität.
Beispiel 2. Radioimmunoassay – Feste Phase
Nach der Fusion wurden die Hybridom-Klone mittels Festphasen-RIA unter Verwendung von ¹²⁵J-hGH 20K einem Screening unterworfen, wobei acht Hybriden eine Bindungsaktivität (achtfach oder mehr verglichen mit der Hintergrundaktivität) zeigten. Nur ein Antikörper erkannte ¹²⁵J-hGH 22K im Festphasen-RIA nicht und wurde ausgewählt für eine Stabilisation und die weitere Charakterisierung (hGH-33). Die anderen sieben Antikörper erkennen sowohl hGH 20K, als auch 22K.
Beispiel 3. Radioimmunoassay – Flüssige Phase
Seren von mit hGH 22K immunisierten Mäusen wurden mittels Flüssigphasen-RIA gegen das 22K-Protein analysiert. Alle Seren zeigten hohe Titer für das Immunogen (> 1/10.000) und die Mäuse wurden anschließend für Zellfusionen eingesetzt. Nach den Fusionen wurden Hybriden ausgesucht und stabilisiert, welche ¹²⁵J-hGH 22K bindende Antikörper erzeugen. Zwei davon waren hGH 22K-spezifisch (mAb hGH-25 und mAb hGH-26), während ein anderer (mAb hGH-12) die beiden molekularen Formen gleichermaßen gut erkannte.
Beispiel 4. Antigen-Capture EIA und kompetitive Flüssigphasen-RIA
Die ausgewählten Hybriden des Beispiels 2 wurden mittels Antigen-Capture EIA unter Verwendung biotinmarkierter sowie unmarkierter Hormone als Kompetitoren oder in einer kompetitiven Flüssigphasen RIA getestet. Die Bindungscharakteristika von mAb hGH-33 und jeweils als Kontrollsubstanzen der drei, hGH-25, hGH-26 und hGH-12, sind in Tabelle I zusammengestellt.
Für die Quantifizierung der Hormone wurde kompetitive RIA unter Verwendung jodmarkierter Hormone und spezifischer mAb eingesetzt. In 1 wird die Inhibition der mAb-¹²⁵J-hGH(20K oder 22K)-Bindung mit unmarkiertem rhGH-22K, hGH 20K, hGH-V, hPL und hPRL dargestellt.
Die 1A bis 1C entsprechen mAb hGH-33 (A), hGH-12 (B), und hGH-25 (C). Gebundenes GH ist die im Pellet vorhandene Radioaktivität und wird als Prozentanteil des gesamten eingesetzten ¹²⁵J-hGH ausgedrückt.
Der hGH-25 mAb wurde für hGH 22K eingesetzt, wobei die Ermittlungsgrenze für diese Isoform 0,25 nM betrug, während die verbleibenden getesteten Hormone (hGH 20K, hGH-V, hPL und hPRL selbst bei tausendfach erhöhter Konzentration nicht konkurrierten (1C). Der hGH-33 mAb wurde für hGH 20K eingesetzt, mit einer Ermittlungsgrenze von 0,5 nM, wobei für den Rest der gestesteten Hormone eine vernachlässigbare Konkurrenzreaktion (competition) beobachtet wurde (1A) Die Daten der kompetitiven RIA unter Verwendung von ¹²⁵J-hGH 20K zeigten, dass (mAb) hGH-33 offenbar einen K_a für hGH 20K von 2,2 × 10⁹ M^–1 und weniger als 1% Kreuzreaktivität mit hGH 22K, hGH-V, hPL und hPRL aufweist (1A).
Das mAb hGH-12 erkennt hGH-V, hGH 20K und hGH 22K gleich gut und hat 40% Kreuzreaktivität mit hPL sowie < 1% mit hPRL (1B). Die anderen beiden mAb (hGH-25 und hGH-26) sind hGH 22K-spezifisch und zeigen eine vernachlässigbare Kreuzreaktivität mit verwandten Hormonen und einen ersichtlichen K_a-Wert von 10⁸–10¹⁰ M^–1 (1C).
TABELLE 1. Wichtige Charakteristika der monoklonalen Antikörper
Beispiel 5. Antikörper-Capture EIA
In der Antikörper-Capture EIA variieren die Bindungscharakteristika der mAb. Der mAb hGH-33 erkennt an feste-Phase-gebundene Hormone nicht, während das bei den mAbs hGH-12, hGH-25 und hGH-26 nicht der Fall ist (Daten werden nicht gezeigt).
Beispiel 6. Sandwich-Assay
Um die Möglichkeit, diese mAb für die spezifische Erkennung der verschiedenen molekularen hGH-Formen einzusetzen, zu testen, wurden zwei unterschiedliche Sandwich-Assays entwickelt. In jedem wurde ein isoformspezifischer mAb als Capture- Antikörper verwendet, hGH-33 im Fall von hGH 20K und hGH-26 für hGH 22K. In beiden Assays wurde der Biotin-markierte mAb hGH-12 als zweiter Antikörper eingesetzt, da dieser beide Isoformen erkennt.
Die Empfindlichkeit eines jeden spezifischen Assays ist 0,2 nM für hGH 22K und 0,2 nM für hGH 20K und es wurde keine Kreuzreaktion mit anderen verwandten Hormonen beobachtet (2A und 2B).
Beispiel 7. Western Blot
Die Antikörper hGH-25 und hGH-26 erkannten die entsprechenden und gereinigten Hormone im Western Blot spezifisch sowohl unter reduzierenden als auch unter nicht-reduzierenden Bedingungen. Der hGH-33 mAb erkennt hGH 20K im Western Blot nicht, wie das von den Bindungscharakteristika in der Antikörper-Capture EIA zu erwarten war.
Beispiel B. Zellproliferation
Für die hGH-Isoformen spezifische Antikörper wurden durch die Untersuchung ihrer Fähigkeit, hGH-abhängiges Zellwachstum zu blockieren, funktionell charakterisiert. Stimulierung des Wachstums chimärer hGHR/G-CSF-transfizierter Ba/F3-Zellen als Reaktion auf hGH 22K- und hGH 20K. Die Zellen wurden 18 Stunden mit zunehmenden Hormonkonzentrationen behandelt. Die DNA-Synthese wurde mittels des ³H-Thymidin-Einbaus gemessen.
Ba/F3-Wildtyp-Zellen benötigen IL-3, um in in-vitro-Kulturen wachsen zu können. Ba/F3-Zellen wurden mit einem – die extrazytoplasmatische Domäne des hGH-Rezeptors und die transmembrane und intrazytoplasmatische Domäne des G-CSF (Granuiozytenkolonie-stimulierender Faktor)-Rezeptors enthaltenden – chimären Gen transfiziert. Während sowohl die Zellen des Wildentyps als auch die transfizierten Zellen in Gegenwart von exogenem IL-3 wachsen, proliferieren nur transfizierte Zellen in Gegenwart des menschlichen Wachstumshormons (GH). Wie in 3 gezeigt, unterstützen sowohl hGH 20K als auch 22K die Proliferation in den transfizierten Zellen gleichermaßen. In beiden Fällen lag bezüglich der Hormonkonzentration der Bereich maximalen Effekts bei 2–10 nM.
Blockierung der Aktivität von hGH 22K und 20K durch monoklonale Antikörper in Ba/F3 transfizierten Zellen: Hormone (1 nM) wurden mit 74 nM hGH-33 und 222 nM hGH-12, 25 und 26 für 18 Stunden bei 4°C vorinkubiert, bevor sie der Kultur zuge fügt wurden. Die Daten in 4 zeigen das Mittel dreifacher Bestimmungen unter Angabe der Standardabweichungen.
Die hGH 22K-induzierte Proliferation wurde spezifisch durch mAb hGH-25 und hGH-26, jedoch nicht durch hGH-33 gehemmt, wohingegen die hGH 20K-induzierte Proliferation nur durch hGH-33 gehemmt wurde (4). Der hGH-12 mAb, welcher beide Hormone in flüssiger Phase gleich gut erkennt, zeigt teilweise inhibitorischen Effekt bei hGH 22K und 20K, obwohl dieser mAb an den hGH (22 und 20K)-GHBP/GHR Komplex mit hoher Affinität bindet und immunpräzipitiert.
Beispiel 9 Auffindung und Quantifizierung von hGH 20K in Serum-Proben
Als Beispiel für eine Körperflüssigkeit wurde normales Humanserum zur Untersuchung des Sandwich-Assays bezüglich der Spezifizität und der Brauchbarkeit für die Quantifizierung des 20K verwendet.
Im Assay wurde der 20K-spezifische Antikörper hGH-33, als Capture-Antikörper eingesetzt, als Antikörper für die Auffindung wurde das Biotin-markierte hGH-12 verwendet. Zur Messung der Signale wurde zeitkontrollierte Fluorometrie (TRF) angewendet.
Ein Humanserum-Pool wurde für die dosisabhängige Testung von hGH 20K und hGH 22K verwendet. Zunehmende Konzentrationen von 0,5 bis 50 ng/ml des 20K hGH führten zu einer erhöhten Wirkung. Eine Zugabe von 50 ng/ml 22K hGH konnte im Assay nicht entdeckt werden. Eine Zunahme der 22K-hGH-Konzentration bis 500 ng/ml ergab ein schwaches Signal und als Kreuzreaktivität wurde weniger als 0,5% im 20K-Sandwich-Assay errechnet (5).
Der Empfindlichkeitsbereich liegt unterhalb 0,5 ng/ml.
In 5 wird die dosisabhängige Wirkung von 20K und 22K hGH bei Zugabe zum normalen Humanserum-Pool wiedergegeben.
Der Capture-Antikörper ist hGH-33 und der Nachweis-Antikörper ist (biotinyliertes) hGH-12.
Als Testsystem wurde ein zeitkontrolliertes Fluoreszenzimmunoassay, TR-FIA, benutzt.
Dies zeigt klar, dass der spezifische Antikörper in normalem Humanserum perfekt arbeitet und deshalb für die Ermittlung durch Immunoassay und für die Quantifizierung eingesetzt werden kann.
DISKUSSION
Das Wachstumshormon ist in biologischen Flüssigkeiten als ein Gemisch verschiedener hGH-Isoformen in unterschiedlichen Aggregatzuständen oder in Form von Komplexen vorhanden. Der eigentliche Effekt dieses außergewöhnlich wirksamem Gemischs bezüglich der Rezeptorbindung und ihrer biologischen Aktivität ist schwer präzise zu ermitteln. Es ist wahrscheinlich, dass viele der hGH-Formen bezüglich der Rezeptorbindung miteinander konkurrieren und teilweise als Agonisten und/oder Antagonisten die Bioaktivität der anderen Isoformen über Kreuz beeinflussen (25). Diese Heterogenität ist zusammen mit den bei den im Test verwendeten Antikörpern herrschenden poly- und monoklonalen Unterschieden wohl maßgeblich für die bei der hGH-Bestimmung beobachteten Diskrepanzen (26).
Immunoassays gründen sich auf die Existenz epitopspezifischer Antikörper. Die Verwendung monoklonaler Antikörper brachte eine Steigerung sowohl der Spezifität als auch der Empfindlichkeit ebenso wie der Handhabbarkeit dieser Assays mit sich. Wir haben mAb als wirksames Mittel zur präzisen Messung der hGH-Isoform-Konzentration und zum Verständnis der entsprechenden Biologie hergestellt und charakterisiert.
Sandwich-Typ EIA und kompetitive RIA sind für die Bestimmung einer jeden dieser Varianten speziell in Puffersystemen mit Empfindlichkeiten, die mit den früher beschriebenen vergleichbar sind (12), entwickelt worden.
Das hGH 20k-Hormon hat dieselbe Aminosäuresequenz wie hGH 22K, mit Ausnahme einer internen Deletion von 15 Aminosäureresten (E32-Q46). Im Vergleich mit hGH 22K sind für hGH 20K unterschiedliche Aktivitäten behauptet worden (25), wie etwa eine reduzierte insulinähnliche Aktivität (decreased Promotion of insulinlikeactivity), mehr laktogene als somatogene Potenz (11) und verminderte Affinität sowohl für hGH-Rezeptoren als auch für das rezeptorassoziierte bindende Protein (8, 25). Weiterhin wurde ein spezifisches, an hGH 20K bindendes Protein, das nicht rezeptorassoziiert ist, beschrieben (27, 28, 29). Die meisten dieser Daten sind jedoch in keiner Weise schlüssig.
Monoklonale Anti-hGH-Antikörper wurden von einigen Gruppen (30, 31, 32) hergestellt und es wurde auch ein mAb mit im Vergleich zu hGH 20K verstärkter Antwort (responses) gegenüber hGH 22K hergestellt. Wir haben hier zwei Hybridome hergestellt, die mAb sekretieren, die für hGH 22K spezifisch sind, einen für hGH 20K und einen, der beide Isoformen gleich gut erkennt. In allen Fällen haben die erzeugten mAb eine hohe Affinität (10⁸ bis 10¹⁰ M^–1) und eine vernachlässigbare Kreuz-Aktivität gegenüber anderen verwandten Hormonen, einschließlich hGH-V, hPRL und hPL. Der anti-hGH-spezifische Antikörper wurde unter Verwendung eines nativen Proteins als Immunogen generiert. Er erkennt wahrscheinlich ein Epitop (conformational epitope), welches nur in der kürzeren hGH-Form vorkommt, da dieser mAb keine Peptide erkennt, welche die neue E32-Q46-Peptidbindung enthalten (Daten sind nicht dargestellt) und er erkennt hGH 20K nicht unter Bedingungen, die dessen Struktur ändern könnten (Western Blot, Adsorption an fester Phase). Im Gegensatz dazu erkennen die zwei hGH 22K-spezifischen mAb das Protein unter denaturierenden Bedingungen. Da der einzige Unterschied zwischen 22K und 20K die Deletion der 15 Aminosäuren ist, müssen hGH-25 und hGH-26 eine Sequenz innerhalb dieses Stranges der 15 Aminosäuren erkennen.
Da die biologische Aktivität von hGH 20K und 22K noch nicht klar differenziert worden ist, haben wir die Wirkungen dieser mAb in einem Wachstumshormonaktivitätstest unter Verwendungen von Ba/F3 Zellen, die den hGHR/G-CSFR-chimären Rezeptor exprimieren und hinsichtlich des Wachstums mit hGH 22K selektiert wurden, getestet. Diese Zellen proliferieren gleich gut in Gegenwart jeweils von 22K und 20K. Der hGH-33 mAb blockiert spezifisch die Wirkung von hGH 20K, während hGH-25 und 26 die Wirkung von 22K spezifisch blockieren. Die Sequenzen, von denen beschrieben ist, dass sie an der hGH 22K-Rezeptorbindung beteiligt sind (34) sind auch in hGH 20K vorhanden. In der Annahme, dass ähnliche Regionen beider Hormone eine Rolle bei der Rezeptorbindung spielen, sollte eine isoform-spezifische Blockade der biologischen Aktivität bei Verwendung von mAb nicht möglich sein, es sei denn diese Regionen unterscheiden sich in ihrer Konformität. Dies würde die spezifische Erkennung durch mAb ermöglichen und könnte die Unterschiede der hGH-Rezeptoraffinität bei diesen beiden Hormonen erklären (8, 25). Weitere Studien über exakt diejenigen Epitope, welche von diesen mAb erkannt werden, wären von Inter esse für die Definition derjenigen Hormonstrukturen, die an der Rezeptorbindung beteiligt sind.
Zusammenfassend könnten diese mAb eingesetzt werden, um hGH 22K und 20K in biologischen Proben zu quantifizieren und sie könnten aufgrund ihres Verhaltens als spezifische Antagonisten bei der Bestimmung der physiologischen Rolle dieser Isoformen nützlich sein.
Wir haben folglich einer Reihe monoklonaler Antikörper (mAb) abgeleitet und charakterisiert, die für unterschiedliche Isoformen des menschlichen Wachstumshormons (hGH) spezifisch sind. Diese Antikörper werden als hGH-25, hGH-26, hGH-33, hGH-25 und hGH-12 bezeichnet. Die Bindungscharakteristika eines jeden Antikörpers gegenüber den hGH-Isoformen (22K und 20K) wurden sowohl in Sandwich- sowie direkten und kompetitiven Immunoassays als auch mittels Western Blot analysiert.
hGH-33 ist ein gegenüber hGH 20K spezifischer Antikörper.
Eine Hybridomzelllinie, welche den Antikörper gemäß den Patentansprüchen exprimiert, mAb hGH-33, wurde am 28. Februar 1996 unter der Nummer DSM ACC 2254 hinterlegt.
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Claims

Ein für das menschliche Wachstumshormon (hGH) mit einem Molekulargewicht von 20 kDa (hGH 20K) spezifischer monoklonaler Antikörper, wobei der monoklonale Antikörper gegenüber hGH 20K eine Affinität von 1 × 10⁸ M^–1 oder mehr und eine Kreuzreaktivität von weniger als 5% mit dem hGH eines Molgewichts von 22 kDa (hGH 22K) aufweist, wobei der monoklonale Antikörper das der Konformation entsprechende Epitop (conformational epitope) erkennt, welches von dem mittels der Hybridom-Zelllinie, die unter der Bezeichnung DSM ACC 2254 hinterlegt worden ist, erzeugten mAb-33 erkannt wird.
Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 1 mit einer Affinität gegenüber hGH 20K von mindestens 1 × 10⁹ M^–1 und bevorzugter mehr als 2 × 10⁹ M^–1.
Verwendung des monoklonalen Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2 für die in-vitro Messung des hGH 20K.
Verwendung gemäß Anspruch 3 für die in-vitro Messung in Körperflüssigkeiten.
Verwendung gemäß Anspruch 4 für Messung im Serum.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 5 in einem Assay für Mehrfachanalysen.
Verwendung des monoklonalen Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2 für die Reinigung von hGH 20K enthaltenden Zubereitungen.
Verfahren zur Immunoassay-Analyse und Quantifizierung von hGH 20K, umfassend folgende Verfahrensschritte: 1) Zusammenbringen einer hGH 20K enthaltenden Probe mit dem Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, um zwischen dem Antikörper und dem hGH 20K einen Komplex auszubilden, der nach seiner Menge zur Menge des hGH 20K in der Probe angepasst ist und 2) Bestimmung der Menge des gebildeten Komplexes in an sich bekannter Weise und in Korrelation Bringen dieser Menge mit der Menge des hGH 20K in der Probe.
Eine therapeutische Zubereitung enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge eines monoklonalen Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2 in einer pharmazeutisch annehmbaren Trägersubstanz.
Eine Hybridom-Zelllinie, welche einen monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 1 erzeugt.