DE60029953T2 - Spezifische Antikörper gegen humanes Choriongonadotropin und deren Verwendung in Therapie und Diagnose - Google Patents

Spezifische Antikörper gegen humanes Choriongonadotropin und deren Verwendung in Therapie und Diagnose Download PDF

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Description

  • Die Erfindung betrifft monoclonale anti-β-hCG-Antikörper des Menschen zur in vivo-Immuntherapie von Krebserkrankungen, die mit der Produktion von menschlichem Choriongonadotropin (hCG) in Verbindung stehen. Die Erfindung betrifft darüber hinaus Verfahren und Vorrichtungen zur Überwachung und Anpassung der Behandlungsstrategie von Patienten, basierend auf den Ergebnissen einer Auswertung der Immunantwort auf das 37-Mer-C-terminale Fragment von β-hCG (β-hCG-CTP37) und immunogene Fragmente davon.
    • Abbas, AK, et al., Hrsg., Cellular and Molecular Immunology, 3. Auflage, WB Saunders Co., 394–405 (1997)
    • Acevedo, et al., Cancer 69: 1829–1842 (1992)
    • Acevedo, et al., Cancer Detect. Prev. 1 (Erg.): 447–287 (1987)
    • Braunstein, GD, In: IMMUNODIAGNOSIS OF CANCER, Herberman, RB und Mercer, DW, Hrsg., Marcel Dekker, Inc., New York, Seiten 673–701 (1990)
    • Dirnhofer, et al., Hum Pathol Apr; 29(4): 377–82 (1998)
    • Fiddes, J. C. und Goodman, H. M. Nature, 281: 351–356 (1979)
    • Fiddes, J. C. und Goodman, H. M., Nature, 286: 684–687 (1980)
    • Fife, K und Bower, M, Br. J. Cancer 73: 1317–1322 (1996)
    • Hudson, D., J. Org. Chem. 53: 617–624, (1988)
    • Lee, A. C. J., et al., Mol. Immunol., 17: 749 (1980)
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    • Triozzi PL und Stevens VC, Oncol Rep 6(1): 7–17, 1999.
    • Triozzi PL, et al., Clin Cancer Res 3 (12 Pt 1): 2355–62, 1997.
  • Impfung ist ein Mittel zur Vorbereitung des Immunsystems auf die Reduzierung von Krankheitssymptomen, verhindert horizontale Übertragung infektiöser Agenzien und senkt die Sterblichkeitsrate der Krankheit. Es ist gut bekannt, dass das Immunsystem eines Individuums eine Immunantwort auf fremde Antigene erzeugen wird. Es ist ebenfalls bekannt, Immunität auf ein Tier zu übertragen, indem ein an anderer Stelle gebildeter Antikörper verabreicht wird (d.h. passive Immunisierung).
  • Standardimpfstoffe umschließen die Verabreichung von Kohlenhydraten, Peptiden, Polypeptiden und glycosylierten Polypeptiden, gegen die eine Immunantwort erwünscht ist (aktive Immunisierung). Alternativen zur Verabreichung eines Impfstoffes umschließen die Verabreichung von zuvor gebildeten Antikörpern gegen ein oder mehrere Peptide oder Polypeptide (passive Immunisierung). Obwohl polyclonale und monoclonale Antikörper bereits durch Routinetechniken produziert werden, war die Produktion und Reinigung von sicheren Antikörper-Zusammenstellungen bis vor Kurzem relativ teuer und zeitaufwendig.
  • Geschichtlich betrachtet haben starke Einschränkungen bei der Verwendung von passiven Immunisierungsverfahren für die Therapie beim Menschen bestanden. Diese Einschränkungen treten bei der Behandlung von chronischen Krankheiten wie Krebserkrankung aufgrund der Kosten der Antikörperproduktion und der Notwendigkeit einer ausgedehnten Verabreichung dieser Antikörper am deutlichsten in Erscheinung. Zusätzlichen Schwierigkeiten steht man gegenüber, wenn das Immunogen ein lösliches Protein oder ein endogenes Protein ist, das normalerweise nicht vom Immunsystem des Individuums erkannt wird.
  • Bestimmte Krebserkrankungen sind in hohem Maße gegen einen Angriff des Immunsystems des Wirtes resistent, selbst wenn der Wirt theoretisch eine Immunantwort gegen den Krebs auslösen sollte. Man nimmt an, dass diese Resistenz auf der Fähigkeit des Krebses beruht, die normale Immunantwort auf Krebszellen zu stören, wodurch es ihnen ermöglicht wird, zu wachsen und sich zu teilen.
  • Normalerweise wird Choriongonadotropin (CG), z.B. menschliches Choriongonadotropin (hCG), von Zellen der menschlichen Plazenta und von Blastocysten sekretiert. Viele menschliche Krebsarten jedoch produzieren und halten zurück und/oder sekretieren hCG in einer Phase während der Karzinogenese. hCG ist in den Membranen einer Reihe von menschlichen Krebszelllinen (Acevedo et al., 1992) und im Serum von Krebspatienten (Braunstein, 1990) nachgewiesen worden. Tatsächlich wird das C-terminale Peptid (CTP) der beta-Untereinheit des hCG bei einer Reihe von Krebsarten in hohe Maße exprimiert, und Immunisierung mit dieser Konstruktion hat in vorklinischen Studien Antitumoraktivität gezeigt (Acevedo et al., 1992; Acevedo et al., 1987).
  • Zum Beispiel ist gezeigt worden, dass hCG und/oder Untereinheiten von menschlichen Lungenkrebszellen hergestellt werden und dass das hCG-Polypeptid oder Abschnitte davon als autokrine Wachstumspromotoren für die Tumorzellen wirken (vgl. z.B. Rivera et al., 1989). Zusätzliche Referenzen beschreiben ebenso, dass die aktive Produktion von anti-hCG-Antikörpern in Tieren, die einen Tumor haben, auf die Verabreichung eines hCG-Impfstoffes zurückgehen kann (vgl. z.B. US-Patent Nr. 5,762,931 und US-Patent Nr. 4,780,312).
  • Zahlreiche biologische Aktivitäten, die mit der Fähigkeit von Krebszellen zur Proliferation verbunden sind, sind hCG zugeschrieben worden, einschließlich (1) einer Verbindung zu Tumor-Anergie (dem Fehlen einer Immunantwort auf Tumoren), (2) der Verstärkung der Blutversorgung des Tumors und (3) der Beobachtung, dass hCG als ein Wachstums-Stimulationsfaktor für viele Krebszellen wirkt.
  • Epidemiologische Untersuchungen weisen darauf hin, dass menschliche Lungenkrebsarten oft mit der Synthese von Hormonen verbunden sind, in erster Linie dem menschlichen Choriongonadotropin (hCG). Erhöhte Spiegel an im Blut zirkulierendem hCG und seinen Untereinheiten werden oft als biochemische Kennzeichen für die Bösartigkeit, und gesenkte Spiegel an hCG als Kennzeichen für erfolgreiche Operation bei menschlichen Lungenkrebsarten verwendet. Freies und/oder mit Tumoren verbundenes β-hCG ist bei Blasen-, Bauchspeicheldrüsen-, Gebärmutterhals-, Kolorektal-, Lungen-, Bauchspeicheldrüsen-, Speiseröhren-, Brust-, Magen-, Prostata-, Eierstock-, Gebärmutter-, Gebärmutterhals- und Endometrialkrebsarten nachgewiesen worden, zusätzlich bei einer Mehrheit von Patienten mit Keimzelltumoren (vgl. z.B. Dirnhofer et al., 1998; Triozzi, PL. und Stevens, VC., 1999). hCG und andere gonadotrope Hormone sind auch mit dem Kaposi-Sarkom (KS, Fife, K. und Bower, M., 1996) in Verbindung gebracht worden.
  • Kolorektalkrebs ist eine Krankheit, die nahezu die Hälfte von jenen, die betroffen sind, innerhalb von 5 Jahren nach der ersten Diagnose tötet, und etwa einer von 17 Amerikanern entwickelt Kolorektalkrebs während seines Lebens. Für die meisten Patienten mit fortgeschrittenem, metastasierendem Kolorektalkrebs bietet der chirurgische Eingriff keine Option. Anfängliche Chemotherapie mit Fluoruracil (5-FU) und Leukovorin ist Standard für Patienten mit Kolonkrebs der Stufe III geworden (NIH Consensus Conference. Adjuvant therapy for patients with colon and rectal cancer. JAMA 264<. 1444–1450, 1990; Goldberg RM. und Erlichman C. Oncology 12: 59–63. 1998). Die Therapie für Patienten mit fortgeschrittenem, 5-FU refraktionärem Kolorektal-Krebs ist zur Zeit Irinotecan (Van Cutsem E. und Blijham GH. Semin. Oncol. 26: 13–20. 1999 und Cunningham D. et al., Lancet 352: 1413–1418, 1998). Zahlreiche neue Ansätze zur Behandlung von fortgeschrittenem Kolorektalkrebs umschließen: (a) neue Arzneistoffe wie etwa Oxaplatin, Capecitabine, Uracil/Tegafur (UFT), (Punt CJ., Cancer 1998; 15: 679–689, 1998); (b) passive Immuntherapie unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, 17-1A (Punt CJ., 1998); und (c) mehrere Ansätze der aktiven spezifischen Immuntherapie (ASI) mit einem oder mehreren mit dem Krebs verbundenen Antigenen (Goydos, JS. et al., J. Sur. Res. 1996; 63: 298–304 und Vermorken, JB. et al., Lancet 1999; 353: 345–350).
  • Mehrere Patente des Staates Ohio von Stevens, z.B. US-Patente Nr. 4,767,842, 4.855,285, 5,817,753 und 5,698,201, die hiermit ausdrücklich durch Bezugnahme eingeschlossen sind, offenbaren die Verwendung eines modifizierten beta-hCG/Tetanus-Toxoids als eine anti-Krebsstrategie, die auf Antikörperproduktion gegen hCG durch den Wirtsorganismus beruht.
  • Obwohl zahlreiche Forschungsanstrengungen auf verbesserte Verfahren zur Behandlung von hCG exprimierenden Krebsarten gerichtet sind, bleibt der Bedarf für ein wirksames und sicheres Verfahren zum Senken oder zum Entfernen des Spiegels an im Blut zirkulierendem CG und des an Zellen gebundenen CG bei Krebspatienten mit CG exprimierenden Tumoren.
  • Es ist daher eine allgemeine Aufgabe der Erfindung, Agenzien zur Immuntherapie von Krebsarten bereitzustellen, die menschliches Choriongonadotropin (hCG) oder ein immunogenes Epitop hiervon exprimieren.
  • Die Erfindung betrifft eine monoclonale Antikörper-Zusammensetzung vom Menschen, die spezifisch mit einem 21-Mer-N-terminalen Fragment von hCG-CTP37 immunreaktiv ist, welches als β-hCG-CTP21 bezeichnet und in SEQ ID NO: 4 dargestellt ist, entweder allein oder in Kombination mit einem menschlichen monoclonalen Antikörper, der spezifisch mit einem 16-Mer-C-terminalen Fragment von hCG-CTP37 immunreaktiv ist, welches als β-hCG-CTP16 bezeichnet und in SEQ ID NO: 6 dargestellt ist.
  • Solche monoclonalen Antikörper-Zusammensetzungen vom Menschen können in einer Lösung hergestellt werden, die zur Injektion bei einem menschlichen Patienten und zur Anwendung in der passiven Immuntherapie geeignet ist, besonders in der Immuntherapie gegen Krebs.
  • In einer anderen Ausführungsform liefert die Erfindung ein Verfahren zur Klassifizierung der Immunantwort auf β-hCG in einem Patienten, indem in vitro die Spiegel des Patienten an anti-hCG-Antikörpern bestimmt werden, die für β-hCG-CTP16, dargestellt in SEQ ID NO: 6, β-hCG-CTP21, dargestellt in SEQ ID NO: 4 beziehungsweise β-hCG-CTP37, dargestellt in SEQ ID NO: 2, spezifisch sind, und der Patient wie folgt, abhängig von den relativen Antikörperspiegeln, einer der nachstehenden vier Gruppen zugeordnet wird: (1) Patienten, bei denen weder anti-CTP16- noch anti-CTP21-Antikörper noch Gesamt-anti-β-hCG-CTP37-Antikörper nachweisbar sind, diese Patienten werden als Nicht-Antikörper-Ansprechende bezeichnet; (2) Patienten, bei denen Gesamt-anti-β-hCG-CTP37-Antikörper nachweisbar sind, während weder die ersten noch die zweiten Antikörper nachweisbar sind, diese Patienten werden als schwache Antikörper-Ansprechende bezeichnet; (3) Patienten mit einem nachweisbaren Spiegel an ersten Antikörpern, aber nicht nachweisbaren Spiegeln an zweiten Antikörpern, diese Patienten werden als Nur-CTP16-Antikörper-Ansprechende bezeichnet; und (4) Patienten mit nachweisbaren Spiegeln sowohl für den ersten als auch für den zweiten Antikörper, diese Patienten werden als CTP16- und CTP21-Antikörper-Ansprechende bezeichnet.
  • Darüber hinaus liefert die Erfindung eine Vorrichtung zur Diagnose und ein Verfahren zur Überwachung der Immunantwort auf β-hCG, welches ein β-hCG-CTP16-Peptid, ein β-hCG-CTP21-Peptid und ein β-hCG-CTP37-Peptid zusammen mit einem Reagenz zur Markierung menschlicher Antikörper, welche immunreaktiv mit den Peptiden sind, sowie einen nachweisbaren Reporter einschließt.
  • Diese und andere Aufgaben und Eigenschaften der Erfindung werden deutlicher erkannt werden, wenn die nachstehende genaue Beschreibung der Erfindung zusammen mit den begleitenden Abbildungen gelesen wird.
  • 1 stellt die Aminosäuresequenz der beta-Untereinheit von menschlichem Choriongonadotropin (hCG) dar, wie unter GenBank-Zugangsnummer 180437 bereitgestellt, bezeichnet als SEQ ID NO: 1.
  • 2A stellt die Reste 129–165 der beta-Untereinheit von hCG dar (C-terminales Peptid, CTP, SEQ ID NO: 2).
  • 2B stellt das C-terminale Peptid (CTP, SEQ ID NO: 3) von β-hCG mit einem addierten N-terminalen Methionin dar.
  • 2C stellt die Reste 130–150 der Aminosäuresequenz der beta-Untereinheit von hCG dar (C-terminales Epitop, CTP21, SEQ ID NO: 4).
  • 2D stellt die Reste 131–138 der Aminosäuresequenz der beta-Untereinheit von hCG dar (Epitop innerhalb von CTP21, SEQ ID NO: 5).
  • 2E stellt die Reste 150–165 der Aminosäuresequenz der beta-Untereinheit von hCG dar (N-terminales Epitop, CTP16, SEQ ID NO: 6).
  • 2F stellt die Reste 150–165 der Aminosäuresequenz der beta-Untereinheit von hCG dar (N-terminales Epitop mit angefügtem N-terminalen C, CTP17, SEQ ID NO: 7).
  • 2G stellt die Reste 153–165 der Aminosäuresequenz der beta-Untereinheit von hCG dar (Epitop innerhalb von CTP16, SEQ ID NO: 8).
  • 2H stellt die Aminosäuren 58–77 der beta-Untereinheit von hCG, das „Schleifen"-Peptid, dar (SEQ ID NO: 9).
  • 3 zeigt den durchschnittlichen Spiegel an anti-β-hCG-Antikörpern, die im Serum von Patienten mit Kolorektalkrebs in einem klinischen Versuch der Phase II über 0 bis 24 Wochen nach Beginn der Impfung mit dem C-terminalen Peptid von β-hCG nachgewiesen wurden. Die Patienten erhielten entweder ein „hohe" oder eine „niedrige" Dosis an hCG. Die Gruppe mit hoher Dosis (offene Kreise) erhielt eine anfängliche Injektion von 2,0 mg CTP37-DT mit einer Auffrischungsinjektion von 1,0 mg CTP37-DT nach entweder 3 oder 4 Wochen, gefolgt von einer Auffrischung von 1,0 mg CTP37-DT alle 3 Monate danach, und die Gruppe mit geringer Dosis (gefüllte Kreise) erhielt eine anfängliche Injektion von 0,5 mg CTP37-DT mit einer Auffrischungsinjektion von 0,5 mg CTP-DT nach entweder 3 oder 4 Wochen, gefolgt von einer Auffrischung von CTP-DT alle 3 Monate danach.
  • 4 zeigt die größte Tumorregion (cm2) über 0 bis 24 Wochen nach Beginn der Impfung mit CTP37 bei Patienten mit Kolorektalkrebs aus der Gruppe mit geringer Dosierung (gefüllte Kreise) und der Gruppe mit hoher Dosierung (offene Kreise) in einem klinischen Versuch der Phase II, wie vorstehend für 3 beschrieben.
  • 5 zeigt die Beziehung zwischen dem Spiegel für anti-CTP37-Antikörper im Serum und der Tumorregion (cm2) bei Patienten mit Kolorektalkrebs in einem klinischen Versuch der Phase II über 0 bis 24 Wochen nach Beginn der Impfung mit CTP37, wie vorstehend für 3 beschrieben.
  • 6 zeigt die zellvermittelte Immunantwort bei zwei Patienten mit Kolorektalkrebs, die mit CTP37 immunisiert worden waren (in einem erweiterten Protokoll des klinischen Versuchs der Phase II, wie vorstehend für 3 beschrieben), im Verhältnis zu der einer normalen, nicht immunisierten Person. Die PBMC-Proliferationsantwort auf verschiedene Antigene (PHA, CTP-37-KI, DT und β-hCG) wird dargestellt.
  • 7 zeigt das Verhältnis von überlebenden Patienten zu Überlebenszeit für Patienten mit Kolorektalkrebs, die mit CTP37 immunisiert wurden (in einem erweiterten Protokoll des klinischen Versuchs der Phase II, vorstehend für 3 beschrieben) und ist wie nachstehend gekennzeichnet: (1) Patienten mit keinem nachweisbaren anti-CTP37-Antikörper in ihrem Plasma (gefüllte Rauten); (2) Patienten mit einem niedrigen Spiegel an nachweisbarem anti-CTP37-Antikörper in ihrem Plasma, in der Weise, dass der relative Spiegel an Antikörpern gegen CTP16 zu CTP21 nicht bestimmt werden konnte (offene Dreiecke); (3) Patienten mit nachweisbaren anti-CTP37-Antikörpern und anti-CTP16-Antikörpern, aber keinen nachweisbaren anti-CTP21-Antikörpern in ihrem Plasma (gefüllte Quadrate); und (4) Patienten mit nachweisbaren anti-CTP37, anti-CTP16- und anti-CTP21-Antikörpern in ihrem Plasma (offene Kreise).
  • I. Definitionen
  • Der Ausdruck „hCG-Peptid", „immunogenes hCG-Peptid" oder „hCG-Epitop" betrifft ein hCG-Peptid, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die mit einem Teil, aber nicht mit der gesamten Aminosäuresequenz des vollständigen hCG-Proteins übereinstimmt und die mindestens eine biologische Funktion oder Aktivität des vollständigen hCG-Proteins behalten hat, zum Beispiel ein Fragment, welches eine immunologische Aktivität des vollständigen hCG-Proteins behalten hat.
  • Die hierin verwendeten Ausdrücke „immunogenes hCG-Peptid" oder „immunogenes hCG-beta-Untereinheit-Peptid" oder Fragmente hiervon betreffen Aminosäuresequenzen, die von hCG beziehungsweise der beta-Untereinheit von hCG abstammen und in der Lage sind, eine zelluläre und/oder humorale Immunantwort auszulösen, wenn sie einer Person verabreicht werden.
  • Die hierin in Bezug auf immunogene hCG-Peptide verwendeten Ausdrücke „antigener Vorläufer" oder „Vorläufer", betreffen hCG-Peptide, die in der Lage sind, von dem Individuum in immunogene hCG-Peptide prozessiert zu werden.
  • Der hierin verwendete Ausdruck „hCG-C-terminales Peptid" oder „hCG-CTP37" betrifft die 37 C-terminalen Aminosäuren der beta-Untereinheit von hCG („CTP-37-Mer", 2A, SEQ ID NO: 2), die als die ursprüngliche Sequenz dargestellt wird, oder eine Variante oder ein Analog davon, welche(s) äquivalente biologische Aktivität aufweist.
  • In einigen Fällen besitzt das hCG-CTP ein angefügtes Methionin am N-Terminus (als das „CTP-38-Mer" bezeichnet, 2B, SEQ ID NO: 3).
  • Der hierin in Bezug auf hCG verwendete Ausdruck „Schleifen"-Peptid betrifft die Aminosäuren 58–77 der beta-Untereinheit von hCG (2H, SEQ ID NO: 9), worin die Aminosäuren 58 und 77 in der Form der ursprünglichen Sequenz oder einer Variante oder eines Analogs hiervon, welche(s) äquivalente biologische Aktivität aufweist, durch eine Disulfidbrücke verbunden sind.
  • Der hierin in Bezug auf hCG verwendete Ausdruck „16-Mer" oder „C-terminales Epitop" betrifft die Aminosäuren 150 bis 165 der beta-Untereinheit von hCG (2E, SEQ ID NO: 6), dargestellt als die ursprüngliche Sequenz oder eine Variante oder ein Analog hiervon, welche(s) äquivalente biologische Aktivität aufweist.
  • Der hierin in Bezug auf hCG verwendete Ausdruck „17-Mer" betrifft die Aminosäuren 150–165 der beta-Untereinheit von hCG (2F, SEQ ID NO: 7) mit einem angefügten Cystein am C-Terminus mit dem Zweck der Derivatisierung an ein Trägerprotein.
  • Der hierin in Bezug auf hCG verwendete Ausdruck „21-Mer" oder „N-terminales Epitop" betrifft die Aminosäuren 130 bis 150 der beta-Untereinheit von hCG (2C, SEQ ID NO: 4), dargestellt als die ursprüngliche Sequenz oder eine Variante oder ein Analog hiervon, welche(s) äquivalente biologische Aktivität aufweist.
  • Der hierin in Bezug auf ein immunogenes hCG-Peptid oder Epitop verwendete Ausdruck „nicht ursprünglich" besagt, dass sich die Aminosäuresequenz des Epitops in einer oder mehreren Aminosäuren von der Aminosäuresequenz des gleichen immunogenen hCG-Epitops, das in der Natur gefunden wird, unterscheidet.
  • Die „nicht ursprüngliche" Aminosäuresequenz kann ein immunogenes hCG-Epitop umfassen, welches eine abweichende Aminosäuresequenz besitzt, die eine oder mehrere „konservative" oder „nicht konservative" Aminosäure-Substitutionen, Aminosäure-Insertionen oder -Deletionen enthält oder in einigen Fällen zusätzliche Aminosäuren am N- oder C-terminalen Ende des Peptides besitzen kann. Ein solches „nicht ursprüngliches" immunogenes hCG-Peptid behält die biologische Aktivität (Immunogenität) des ursprünglichen Peptides bei, von dem es abstammt.
  • Der Ausdruck „Peptid-Trägerprotein-Konjugat" wird austauschbar mit dem Ausdruck „Peptid derivatisiert an ein Trägerprotein" verwendet und betrifft ein immunogenes hCG-Peptid, das an ein Trägerprotein gebunden wurde, um seine Immunogenität zu verstärken.
  • Der hierin verwendete Ausdruck „immunogener hCG-Peptid-Impfstoff" oder „hCG-Peptid-Impfstoff" betrifft ein immunogenes hCG-Peptid, das an ein geeignetes Trägermolekül derivatisiert ist, wie hierin beispielhaft durch β-hCG-CTP16 (SEQ ID NO: 6) und β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4) dargestellt wird.
  • Der hierin verwendete Ausdruck „hCG-Impfstoff" oder „Impfstoff" betrifft ein immunogenes hCG-Peptid, das an ein geeignetes Trägermolekül derivatisiert ist, hCG-CTP37 (SEQ ID NO: 2) und/oder ein oder mehrere passiv verabreichte monoclonale anti-β-hCG-Antikörper vom Menschen.
  • Der hierin verwendete Ausdruck „Immunantwort" betrifft eine humorale Immunantwort wie etwa die Produktion von Antikörpern gegen das immunogene hCG-Epitop oder eine zelluläre Immunantwort wie eine cytotoxische T-Zell-Antwort.
  • Der hierin verwendete Ausdruck „immunkompetentes Individuum" betrifft ein Individuum, das Zellen der Immunantwort besitzt, welche bei Exposition gegen ein immunogenes Epitop in der Lage sind, eine zelluläre und/oder humorale Immunantwort gegen das immunogene Epitop aufzubauen.
  • Der hierin in Bezug auf ein hCG-Peptid verwendete Ausdruck immunogenes „Epitop" oder „antigene Determinante" betrifft einen Abschnitt der hCG-Aminosäuresequenz, der eine B- und/oder T-Zell-vermittelte Immunantwort gegen hCG erzeugen wird. Es wird bevorzugt, dass das Epitop einzigartig ist; das heißt, eine Immunantwort, die gegen ein spezifisches hCG-Epitop erzeugt worden ist, zeigt geringe oder keine Kreuzreaktivität mit anderen Antigenen.
  • Ein „funktionales Äquivalent" betrifft eine Aminosäuresequenz für ein immunogenes hCG-Peptid, die äquivalente biologische Aktivität zu der ursprünglichen Sequenz immunogener hCG-Peptide, die hierin beschrieben und als SEQ ID NO: 2, 4, 6 und 9 dargestellt werden, aufweist. Die relevante biologische Aktivität ist eine immunologische Aktivität, d.h. die Fähigkeit, eine Immunantwort in einem Individuum zu erzeugen, dem der immunogene hCG-Peptid-Impfstoff verabreicht wird.
  • Aminosäurereste werden hierin mit ihrer standardisierten Einzelbuchstaben-Bezeichnung verwendet: A, Alanin; C, Cystein; D, Asparaginsäure; E, Glutaminsäure; F, Phenylalanin; G, Glycin; H, Histidin; I, Isoleucin; K, Lysin; L, Leucin; M, Mehtionin; N, Asparagin; P, Prolin; Q, Glutamin; R, Arginin; S, Serin; T, Threonin; V, Valin; W, Tryptophan; Y, Tyrosin.
  • Der hierin verwendete Ausdruck „aktive Immunisierung" betrifft die Verwendung von hCG-Peptid-Impfstoffen, um eine Immunantwort durch die Zellen der Immunantwort des Individuums auszulösen.
  • Der hierin verwendete Ausdruck „Verabreichen" betrifft das Inkontaktbringen der Immunantwortzellen des Individuums mit einem immunogenen hCG-Peptid-Impfstoff. In den meisten Fällen findet solches „Verabreichen" entweder durch subkutane oder intramuskuläre Injektion der immunogenen hCG-Peptid-Impfstoff-Zusammensetzung an das betreffende Individuum statt.
  • Der hierin verwendete Ausdruck „passive Immunisierung" betrifft die direkte Verabreichung von Antikörpern an ein Individuum als ein Immunisierungsansatz.
  • Der hierin verwendete Ausdruck „Adjuvans" betrifft eine Substanz, die die Gesamt-Immunantwort des Individuums, dem ein Impfstoff verabreicht worden ist, erhöhen kann, d.h. durch Wirken als ein nicht spezifischer Immunstimulator. Ein Adjuvans kann auch verwendet werden, um eine Immunantwort schneller auszulösen.
  • Der hierin verwendete Ausdruck „in Abständen aufeinanderfolgende Verabreichungen" betrifft Behandlungsstrategien mit den immunogenen hCG-Peptid-Impfstoffen, welche eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von einer oder mehreren „Auffrischungs"-Verabreichungen in verschiedenen Zeitabständen nach der anfänglichen Verabreichung umfassen. Die „Auffrischungs"-Verabreichungen können, müssen aber nicht in regelmäßigen Zeitabständen erfolgen.
  • Die hierin verwendeten Ausdrücke „Lösung, die für die Injektion bei einem menschlichen Individuum geeignet ist", „in einer Form, die für die Injektion bei einem menschlichen Individuum geeignet ist" und „pharmazeutisch verträglich" können untereinander austauschbar verwendet werden und betreffen die Zusammensetzung, die Trägerstoffe, Verdünnungsmittel und Reagenzien umfasst, die zur Verabreichung an einen Menschen ohne die Erzeugung von negativen physiologischen Wirkungen geeignet ist.
  • Die hierin verwendeten Ausdrücke „behandeln", „Behandlung" und „Therapie" betreffen heilende Therapie, prophylaktische Therapie und präventive Therapie.
  • Der hierin verwendete Ausdruck „Dosis" betrifft die Menge an menschlichem monoclonalen anti-hCG-Antikörper oder an immunogenem hCG-Peptid-Impfstoff, welche dem Individuum verabreicht wird. Die Menge variiert in Abhängigkeit von Individuum, dem Immunogen und der Anwesenheit eines Adjuvans, wie nachstehend beschrieben.
  • Der hierin in Bezug auf die Behandlung einer Krebserkrankung verwendete Ausdruck „Wirksamkeitspotential der Behandlung" betrifft die potentielle Wirksamkeit einer gegebenen Behandlungsstrategie, die durch Auswertung verschiedener klinischer Eckpunkte, einschließlich der Immunantwort auf immunogene hCG-Peptide, Tumorgröße und Überlebenszeit des Patienten bestimmt wird.
  • Der hierin verwendete Ausdruck „antwortet nicht auf den Impfstoff" bedeutet allgemein, dass der Patient keine nachgewiesene Immunantwort auf β-hCG-CTP37 oder immunogene Epitope davon aufweist.
  • Der hierin verwendete Ausdruck „Körperflüssigkeit" betrifft eine Reihe von Probentypen, die von einem Individuum gewonnen wurden, einschließlich Urin, Speichel, Plasma, Blut, Rückenmarksflüssigkeit und anderer Proben biologischen Ursprungs.
  • Der hierin in Bezug auf den Immuntest der Immunantwort auf immunogene hCG-Peptide verwendete Ausdruck „Analyse" kann eine Auswertung sein, die entweder qualitativ (positiv/negativ) oder quantitativ ist.
  • II. Krebserkrankung und hCG
  • Obgleich bösartige Tumoren Protein-Antigene, die von einem Individuum als fremd erkannt werden, exprimieren können, und die Immunüberwachung das Wachstum und die Ausbreitung von einigen Tumorarten begrenzen kann, schützt das Immunsystem das Individuum nicht wirksam gegen tödliche menschliche Krebsarten.
  • Solche Tumoren können das Immunsystem durch schnelles Wachstum und schnelle Ausbreitung überwältigen, und/oder die Tumorzellen können die Zerstörung durch das Immunsystem unterlaufen. Vermutete Mechanismen für ein solches Unterlaufen umschließen, sind aber nicht darauf begrenzt, (1) Herabregelung von MHC-Antigenen der Klasse I auf der Oberfläche von Tumorzellen, was geringe oder keine Komplexbildung der prozessierten Tumorpeptid-Antigene mit MHC der Klasse I zur Folge hat, wie es für die Erkennung durch cytotoxische T-Lymphocyten (CTL) erforderlich ist, (2) einen Mangel an Aktivierung von CTL durch geringe oder keine Expression von MHC-Molekülen der Klasse II durch die Tumorzellen, so dass sie die für den Tumor spezifischen CD4+-T-Helferzellen (die Signale produzieren, die gleichfalls für CTL-Aktivität notwendig sind) nicht direkt aktivieren können, (3) einen Mangel an Markierungen zur Co-Stimulierung an der Zelloberfläche, welche sekundäre Signale zur Aktivierung von CD4+-T-Helferzellen liefern, und (4) von Tumorzellen produzierte Faktoren, die anti-Tumor-Antworten unterdrücken, wie etwa der fas-Ligand (Abbas, AK. et al., 1997).
  • Forscher haben ebenso festgestellt, dass bestimmte Polypeptide sowohl beim Menschen als auch bei anderen Säugern unterstützende Faktoren für neoplastische Zellen sind und/oder von ihnen sekretiert werden. Solche unterstützenden Faktoren weisen biochemische, biologische und immunologische Ähnlichkeit mit Hormonen auf, besonders mit Choriongonadotropin (CG). Bestimmte Karzinome scheiden CG oder einen immunologisch ähnlichen Stoff auf ihren Oberflächen aus, wodurch sie dem Immunsystem des Individuums eine Oberfläche darbieten, die, oberflächlich, aus endogenem Material des Individuums gebildet zu sein scheint und die auf diese Weise relativ nicht immunogen ist.
  • Freies β-hCG (mehr als 100 μg/ml) ist bei Patienten mit Blasen- (47%), Bauchspeicheldrüsen- (32%) und Gebärmutterhalskrebs (30%) nachgewiesen worden, zusätzlich bei einer Mehrheit der Patienten mit Tumoren der Keimzellen. Mit einem Tumor verbundenes β-hCG ist bei Kolorektal- (52%), Lungen- (34%), Bauchspeicheldrüsen- (31%), Speiseröhren- (28%), Brust- (24%) und Blasenkrebs (21%) (Braunstein, 1990) nachgewiesen worden. Zusätzlich ist immunohistochemischer Nachweis bei etwa 8 bis 19% bei Magen-, Prostata-, Eierstock-, Gebärmutter-, Gebärmutterhals- und Gebärmutterschleimhaut-Krebserkrankungen berichtet worden (Braunstein, 1990).
  • Eine wirksame Behandlung von bösartigen Krebserkrankungen muss weitere Ausbreitung von neoplastischen Zellen verhindern und die Sterblichkeit senken, d.h. die Überlebenszeit von Patienten, die diese Erkrankung haben, verlängern. Gegenwärtige Behandlungsverfahren umschließen nicht spezifische Stimulation des Immunsystems, passive Immuntherapie und Impfung mit abgetöteten Tumorzellen oder Tumorzell-Antigenen, Polypeptiden oder Fragmenten davon, allein oder in Kombination mit Chemotherapie und/oder Bestrahlungstherapie.
  • Studien zur aktiven Immunisierung haben darauf hingewiesen, dass ein modifiziertes beta-hCG/Tetanustoxoid-Polypeptid bei Ratten Schutz gegen eine Injektion von Tumorzellen des virulenten Brust-Adenokarzinoms R 3230 AC der Ratte verleiht, welches mit CG-ähnlichem Material verbunden ist. Passive Immunisierung hat ebenfalls zu Schutz gegen Lewis-Lungenkarzinom-Tumoren, Virus-induzierte Leukämie und Sarkom-Tumoren bei Mäusen geführt (vgl. z.B. US-Patent Nr. 5,698,201).
  • Das C-terminale Peptid von hCG ist, allein oder in Kombination mit dem hCG-„Schleifen"-Peptid, intramuskulär zusammen mit CRL 1005 (Optivax; Vaxcel Inc., Norcross, GA) als einem Adjuvans injiziert, in klinischen Frühphasen-Untersuchungen bei Patienten mit metastatischer Krebserkrankung bewertet worden. Messbare Produktion von anti-hCG-Antikörpern führten zu den Studien, die Messung von anti-Krebs-Aktivität war jedoch keine Komponente der Studie [vgl. Triozzi PL. und Stevens VC., Oncol Rep. 6(I): 7–17, 1999; Triozzi PL. et al., Clin. Cancer Res. 3(12 Ptl): 2355–62, 1997].
  • III. Monoclonale Antikörper des Menschen zur passiven Immuntherapie
  • A. Herstellung von monoclonalen Antikörpern des Menschen
  • Der Wert und das Potential von Antikörpern für die Therapie in vivo ist seit langem auf dem Fachgebiet bekannt. Ein Ansatz ist gewesen, menschliche oder „humanisierte" monoclonale Antikörper zu entwickeln, die vom Patienten nicht sofort als fremd „erkannt" werden, um eine anti-Antikörper-Immunantwort zu vermeiden. In einigen Fällen hat die Verwendung von durch menschliche B-Zell-Hybridome produzierten monoclonalen Antikörpern Potential für die Behandlung von verschiedenen Krankheitszuständen. Jedoch sind viele ursprüngliche Tumor-Antigene des Menschen für Menschen nicht immunogen, und es kann daher schwierig sein, menschliche B-Zellen zu isolieren, die Antikörper gegen menschliche Antigene produzieren.
  • Chimäre oder „humanisierte" Antikörper werden allgemein gentechnisch aus Abschnitten von mausstämmigen und menschlichen Antikörper-Genfragmenten erzeugt und zusammengesetzt. Solche chimäre und humanisierte Antikörper enthalten immer noch einen variierenden Anteil an mausstämmiger Antikörper-Profeinsequenz und können dementsprechend eine menschliche anti-Maus-Immunantwort hervorrufen, wenn sie einem Patienten verabreicht werden.
  • Ein Ansatz mit rekombinanter DNA hat sich auf die Herstellung von chimären Antikörpern konzentriert, die eine menschliche C[H]-Region und nicht menschliche (z.B. mausstämmiges), Antigen kombinierende (variable) Regionen aufweisen. Diese chimären Antikörper werden allgemein hergestellt, indem die gewünschte variable Antikörperregion und/oder die konstante Region cloniert werden, die clonierten Sequenzen in einer einzigen Konstruktion kombiniert werden, die den gesamten oder einen Teil eines funktionalen chimären Antikörpers, welcher die gewünschten variablen und konstanten Regionen aufweist, codiert, die Konstruktion in eine Zelle, die zur Expression von Antikörpern in der Lage ist, eingeführt wird, und die Zellen, die den chimären Antikörper stabil exprimieren, selektiert werden.
  • Humanisierte Formen von nicht menschlichen (z.B. murinen) Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulin-Ketten oder Fragmente davon (wie etwa Fv, Fab, Fab', F(ab')2 oder andere Regionen mit Antigen bindenden Sequenzen). Humanisierte Antikörper umschließen menschliche Antikörper, in denen Reste einer Komplementaritäts-bestimmenden Region (CDR) des menschlichen Antikörpers durch Reste einer CDR einer nicht menschlichen Art wie etwa Maus, Ratte oder Kaninchen ersetzt werden. In den meisten Fällen umfasst der humanisierte Antikörper Domänen variabler Regionen, in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen nicht menschlichen Ursprunges sind. In einigen Fällen werden die Reste der Fv-Gerüstregion (FR) des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht menschliche Reste ersetzt. Verfahren zur Humanisierung von nicht menschlichen Antikörpern sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (vgl. z.B. Jones, et al., 1986; Riechmann et al., 1988; Verhoyen et al., 1988). Um in den Verfahren der Erfindung von Nutzen zu sein, müssen humanisierte Antikörper hohe Affinität für das Peptid-Antigen und andere vorteilhafte biologische Eigenschaften behalten.
  • Antikörper des Menschen können auch hergestellt werden, indem Phagen-Display-Bibliotheken verwendet werden (Hoogenboom und Winter, 1991; Marks et al., 1991).
  • Es ist wiederholt gezeigt worden, dass Display-Vektoren filamentöser Phagen oder „Phagemids" die wirksame Herstellung von umfangreichen Bibliotheken von monoclonalen Antikörpern gestatten, welche verschiedene und neuartige immunologische Spezifitäten aufweisen. Die Membranankerdomäne des Hüllproteins von filamentösen Phagen dient dazu, ein Genprodukt und das Gen während der Zusammensetzungsphase der Phagenreplikation zu verbinden und ist zur Clonierung und Expression von Antikörpern aus Kombinationsbibliotheken verwendet worden (vgl. z.B. Kang et al., 1991). Diese Technik liefert vollständig menschliche Antikörper, welche keine von Nagetieren stammendes Gerüst oder CDR-Reste aufweisen, wie sie etwa in „humanisierten" Antikörpern angetroffen werden.
  • Das Verfahren zur Herstellung eines menschlichen monoclonalen Antikörpers umfasst allgemein (1) das Clonieren von Genen der V-Domäne des Antikörpers im Rahmen in entweder ein Haupt- oder Neben-Hüllprotein-Gen eines filamentösen Bakteriophagen, (2) das Exprimieren des zusammengesetzten heterodimeren Antikörpermoleküls in der Weise, dass funktionale Antikörperfragmente an der Oberfläche des Phagenpartikels gezeigt werden, (3) das Isolieren des an der Oberfläche exprimierten Phagenpartikels unter Verwendung von Immunaffinitätstechniken, was zur Selektion des Gens führt, welches den Antikörper, der diese Eigenschaften zeigt, codiert (vgl. z.B. Hoogenboom, HR. et al., 1998; US-Patent Nr. 5,804,440).
  • Ein Repertoire von V-Genen aus nicht immunisierten menschlichen Spendern kann aufgebaut werden, und Antikörper gegen ein breites Spektrum an Antigenen (einschließlich Eigen-Antigenen) können unter Verwendung von Phagen-Display-Technik isoliert werden (Marks et al., 1991; Griffiths et al., 1993).
  • Die Affinität von menschlichen Antikörpern, die durch Phagen-Display-Technik erhalten worden sind, kann verbessert werden, indem sequentiell die Gene für die V-Region der schweren und der leichten Ketten durch ein Repertoire aus natürlich vorkommenden Varianten der Gene für die V-Domäne ersetzt werden, die von nicht immunisierten Spendern mit dem Ziel erhalten wurden, Antikörper mit höherer Affinität zu selektieren (vgl. z.B. Griffiths und Duncan, 1998; Aujame et al., 1997). Die Vielfältigkeit der durch Phagen-Display-Technik erhaltenen menschlichen Antikörper kann auch vergrößert werden, indem die Gene für die schwere und die leichte Kette durcheinander gemischt werden (Kang et al., 1991), indem die CDR3-Regionen der clonierten Gene für die schwere Kette verändert werden (Barbas et al., 1992) und indem Zufallsmutationen durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in die Bibliothek eingeführt werden (Gram et al., 1992).
  • Alternativ ist es nun möglich, transgene Tiere (z.B. Xenomäuse) zu erzeugen, die in der Lage sind, nach Immunisierung ein vollständiges Repertoire an menschlichen Antikörpern bei Fehlen der Produktion von endogenem Immunglobulin zu produzieren. In diesem Ansatz sind große Fragmente der menschlichen Ig-Gene, sowohl der leichten als auch der schweren Kette in die Keimlinie der Maus inseriert worden, um einen Mausstamm zu erzeugen, der in der Lage ist, ein breites Repertoire an Antigen-spezifischen, vollständig menschlichen Antikörpern zu produzieren.
  • Die Xenomaus produziert B-Zellen, die die menschliche schwere Kette (h mu) und die menschliche leichte Kette K (h K) oder h mu und die leichte Kette lambda der Maus (m lambda) exprimieren. Diese Mäuse produzieren signifikante Spiegel an vollständig menschlichen Antikörpern mit einem breiten Repertoire wie bei Erwachsenen und erzeugen bei Immunisierung mit Antigenen für das Antigen spezifische, vollständig menschliche monoclonale Antikörper (vgl. z.B. Jakobovits et al., 1995; Jakobovits, 1995).
  • Solchen von xenogenen Mäusen stammenden menschlichen monoclonalen Antikörpern kann die korrekte schwere Ig-Kette zur Komplementfixierung im Menschen fehlen, z.B. IgG1. In solchen Fällen kann die Antikörper codierende mRNA des Hybridoms der xenogenen Maus verwendet werden, um cDNA zu erhalten, in welche die cDNA für die schwere IgG1-Kette inseriert wird. Diese Kassette kann dann unter Verwendung von Vorgehensweisen, die allgemein von Fachleuten auf diesem Gebiet verwendet werden, in einen Expressionsvektor inseriert werden und anschließend zur Produktion von transgenen Ziegen verwendet werden. Es sind transgene Ziegen entwickelt worden, bei denen induzierbare Promotoren die Expression des Proteins, welches hierin codiert ist, auslösen können, sodass es in die Milch der Ziegen sekretiert wird. Diese Vorgehensweise erlaubt die Produktion von großen Mengen an menschlichen monoclonalen Antikörpern bei relativ geringen Kosten.
  • In einem bevorzugten Ansatz umfassen die Antikörper gegen immunogenes hCG-Peptid der Erfindung menschliche Antikörper, die unter Verwendung der Technik mit xenogenen Mäusen, gefolgt vom Ersatz der schweren IgG-Kette, hergestellt, cloniert und in transgenen Ziegen, wie vorstehend beschrieben, exprimiert worden sind.
  • B. Therapeutische Zusammensetzungen, die menschliche monoclonale Antikörper enthalten
  • Die vorliegende Erfindung zieht daher therapeutische Zusammensetzungen in Betracht, die für die Durchführung der Immuntherapie gegen Krebserkrankungen von Nutzen sind.
  • Therapeutische Zusammensetzungen, die einen oder mehrere unterschiedliche menschliche monoclonale Antikörper enthalten, die spezifisch mit einem Epitop von β-hCG-CTP37 immunreaktiv sind, und ihre Verwendung zur Immuntherapie werden hierin beschrieben. Bevorzugte menschliche monoclonale Antikörper umschließen anti-β-hCG-CTP16 (SEQ ID NO: 6) und anti-β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4).
  • Eine therapeutisch wirksame Menge an menschlichen monoclonalen Antikörpern ist eine Menge, die in der Weise bemessen ist, dass sie die gewünschte Wirkung erzielt, d.h. das β-hCG neutralisiert, welches im Serum oder auf den Tumorzellen des Patienten anwesend ist, und dadurch die Menge an nachweisbarem hCG oder freiem hCG im Serum oder auf den Tumorzellen des Patienten senkt. Eine solche Senkung ist mit der Erhöhung der Überlebenszeit für den Patienten verbunden.
  • Die therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten einen/ein physiologisch verträglichen/s Trägerstoff, Excipienten oder Verdünnungsmittel zusammen mit mindestens einer Art eines menschlichen monoclonalen Antikörpers, der spezifisch mit einem Epitop von β-hCG-CTP37 immunreaktiv ist, welcher, formuliert entsprechend der herkömmlichen Praxis, darin als ein aktiver Bestandteil gelöst oder dispergiert ist.
  • Therapeutische Zusammensetzungen zur Injektion oder Infusion können solche Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen des Antikörpers in öligen oder wässrigen Trägerstoffen einnehmen und können Bestandteile wie suspendierende, stabilisierende und/oder dispergierende Stoffe enthalten. Alternativ kann die Zusammensetzung in einer trockenen Form vorliegen, um vor der Verwendung mit einer geeigneten sterilen Flüssigkeit rekonstruiert zu werden.
  • Die menschlichen monoclonalen Antikörper der Erfindung können parenteral durch Injektion oder durch graduelle Infusion über einen Zeitraum verabreicht werden. In den meisten Fällen werden therapeutische Zusammensetzungen, die die menschlichen monoclonalen Antikörper der Erfindung umfassen, intravenös verabreicht, andere Verabreichungsarten sind jedoch eingeschlossen. Zum Beispiel können menschliche monoclonale Antikörper der Erfindung intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intratumoral injiziert werden; oder sie werden transdermal oder über peristaltische Mittel verabreicht.
  • Geeignete Strategien zur Verabreichung von Antikörpern sind variabel, aber durch eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von wiederholten Dosen in einem oder mehreren Intervallen durch nachfolgende Verabreichung gekennzeichnet. Die anti-β-hCG-Antikörper können zusammen mit oder im Anschluss an immunogene hCG-Peptid-Impfstoffe verabreicht werden.
  • Eine therapeutisch wirksame Menge an Antikörpern für die Verwendung in dieser Erfindung ist typischerweise eine Menge an Antikörpern in einer pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung, die ausreicht, um die Menge an nachweisbarem β-hCG im Patienten zu verringern.
  • Die Dosierung kann zwischen etwa 25 mg und etwa 500 mg pro Patient pro Verabreichung variieren, wobei ein durchschnittlicher Patient 70 kg wiegt. Allgemein werden die anti-hCG-Antikörper 1 bis 2 Mal pro Woche über einen Zeitraum von 4 bis 6 Wochen verabreicht. In einigen Fällen kann eine solche Verabreichung von Antikörpern jedoch über einen unbestimmten Zeitraum fortgesetzt werden. Die Dauer der Antikörper-Behandlung wird in Zusammenhang mit der Verabreichung des immunogenen hCG-Peptid-Impfstoffes, basierend auf der Immunantwort des Patienten auf hCG-CTP16, hCG-CTP21 und hCG-CTP37, abgeschätzt, wie nachstehend genauer beschrieben wird.
  • Es wird deutlich sein, dass, wenn die Immuntherapie die Verabreichung eines menschlichen monoclonalen Antikörpers, der spezifisch mit hCG immunreaktiv ist, zusammen mit einem immunogenen hCG-Peptidimpfstoff umfasst, die Dosis an menschlichem monoclonalen Antikörper, basierend auf den Ergebnissen eines Immuntests auf immunogene hCG-Peptide, der etwa 9 bis 15 Wochen nach der anfänglichen Verabreichung des hCG-Impfstoffes durchgeführt wird, angepasst werden kann.
  • Genauer werden die Antikörperspiegel eines Patienten gegen ein 16-Mer-C-terminales Fragment von β-hCG-CTP37 (β-hCG-CTP16, SEQ ID NO: 6), ein 21-Mer-N-terminales Fragment von β-hCG-CTP37 (β-hCG-CTP21, SEQ ID NO: 4) und das vollständige β-hCG-CTP37-Peptid (SEQ ID NO: 2) zu verschiedenen Zeitpunkten überwacht. Die Dosierungsstrategie für die passive Verabreichung des menschlichen monoclonalen β-hCG-CTP37-Antikörpers wird in Kombination mit der Dosierungsstrategie für den hCG-Peptid-Impfstoff nach Bedarf angepasst, um nachweisbare Antikörper sowohl gegen β-hCG-CTP16 (SEQ ID NO: 6) als auch gegen β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4) in einer Körperflüssigkeit des Patienten zum Ergebnis zu haben.
  • Bevorzugt führt die Verabreichung eines hCG-Impfstoffes zu einem Spiegel an nachgewiesenen Antikörpern gegen β-hCG-CTP37 (SEQ ID NO: 2), β-hCG-CTP16 (SEQ ID NO: 6) und β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4). Sogar noch mehr bevorzugt führt die Verabreichung eines hCG-Peptid-Impfstoffes zu einem Spiegel an nachgewiesenen Antikörpern sowohl gegen β-hCG-CTP16 (SEQ ID NO: 6) als auch gegen β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4), wobei die Immunantwort auf beide Peptide in ihrer Stärke ähnlich ist.
  • IV. Immunogene hCG-Peptide als Impfstoffe
  • A. Immunogene hCG-Epitope
  • Ein „immunogenes hCG-Epitop" oder „antigenes hCG-Epitop" ist eine Aminosäuresequenz oder eine Kombination von Aminosäuresequenzen, die eine Immunantwort gegen hCG hervorruft.
  • Ein hCG-Impfstoff umfasst das C-terminale Peptid CTP37 (SEQ ID NO: 2) der β-Untereinheit von hCG, welcher einem Individuum allein oder in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen immunogenen hCG-Peptiden und/oder zusammen mit der passiven Verabreichung eines oder mehrerer anti-hCG-Antikörper verabreicht wird.
  • Bevorzugte immunogene Epitope sind die 37 C-terminalen Aminosäuren der beta-Untereinheit von hCG (CTP37) und Peptide, die davon abstammen, allein oder in Kombination mit den Aminosäuren 38 bis 57 der beta-Untereinheit von hCG (das „Schleifen"-Peptid).
  • Das „Schleifen"-Peptid der beta-Untereinheit von hCG ähnelt im Wesentlichen der entsprechenden Region des menschlichen Hormons Lutropin (LH), des Follikel stimulierenden Hormons (FSH) und des thyreotropen Hormons (TSH). Demzufolge wird das „Schleifen"-Peptid oder ein Analog davon in Verbindung mit dem CTP37-Peptid, einem Analog davon oder Peptiden, die davon abstammen, verabreicht.
  • Die kombinierte Verabreichung von „Schleifen-" und CTP37-Peptiden kann wie folgt durchgeführt werden: (1) die beiden Peptide können vor der Derivatisierung an ein geeignetes Trägerprotein chemisch verbunden oder in Tandemanordnung synthetisiert werden; (2) beide Peptide können chemisch an den selben Träger derivatisiert werden, ohne dass sie zuerst chemisch aneinander gebunden werden; (3) die beiden Peptide können an getrennte Träger derivatisiert werden, und ein Gemisch der beiden entstandenen Konjugate wird dem zu behandelnden Individuum verabreicht; oder (4) die beiden Peptide können an getrennte Träger derivatisiert werden, und die beiden entstandenen Konjugate werden dem zu behandelnden Individuum getrennt verabreicht.
  • Die hierin beschriebenen hCG-Impfstoffe sind repräsentativ für die hCG-Impfstofftypen, die verwendet werden können, um eine Immunantwort gegen zwei oder mehr Epitope von β-hCG-CTP37 zu erzeugen. Allgemein muss die Größe des Antigen-Peptides mindestens groß genug sein, um ein oder mehrere immunogene Epitope von hCG zu umfassen. Das kleinste nützliche immunogene Epitop oder Fragment, das von der vorliegenden Offenbarung vorweggenommen wird, würde allgemein im Bereich einer Länge von 8 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten liegen, wobei Sequenzen im Bereich von etwa 8 bis etwa 40 oder mehr Aminosäuren bevorzugt sind.
  • Es gibt zwei Haupt-Epitope innerhalb der terminalen 37 Aminosäuren des Carboxylendes von hCG, ein N-terminales Epitop aus 21 Aminosäuren (CTP21) und ein C-terminales Epitop aus 16 Aminosäuren (CTP16; Berger, P. et al., Mol. and Cell. Endocrinol. 125: 33–43, 1996). 2A, 2C und 2E stellen die Aminosäuresequenzen von CTP37, CTP21 beziehungsweise CTP16 dar. Eine hCG-Impfstrategie kann die Verabreichung eines oder mehrerer der Peptide CTP37, CTP21 und CTP16 umfassen. Studien haben jedoch gezeigt, dass die Immunantwort auf das CTP16-Epitop immundominant ist, und dass demzufolge die Verabreichung von CTP37 allein oder in Kombination mit CTP21 bevorzugt ist.
  • Allgemein besteht die anfängliche Verabreichung eines immunogenen hCG-Peptid-Impfstoffes aus mindestens 1 mg β-hCG-CTP37. Nachfolgende oder „Auffrischungs"-Verabreichungen von immunogenen hCG-Peptid-Impfstoffen oder passiv verabreichten anti-β-hCG-Antikörpern werden einem Krebspatienten gewöhnlich in aufeinanderfolgenden Verabreichungen mit zeitlichen Abständen in einer oder mehreren der nachstehenden Arten gegeben: (i) eine Dosis des CTP37-Impfstoffes (SEQ ID NO: 2), die größer als jene ist, die bei der anfänglichen Verabreichung gegeben wurde; (ii) eine Dosis des Impfstoffes, die weniger als 1,0 mg CTP37-Peptid pro Patient pro Verabreichung entspricht; (iii) ein Promotor-Impfstoff, bestehend aus dem hCG-Schleifenpeptid (SEQ ID NO: 9), derivatisiert an einen geeigneten Trägerstoff, in Kombination mit dem β-hCG-CTP37-Impfstoff; (iv) ein Promotor-Impfstoff, bestehend aus dem hCG-Schleifenpeptid (SEQ ID NO: 9), derivatisiert an einen geeigneten Trägerstoff, gefolgt von aufeinanderfolgenden Verabreichungen des β-hCG-CTP37-Impfstoffes mit zeitlichen Abständen, wobei die Dosis von letzterem Impfstoff weniger als 1,0 mg CTP37-Peptid pro Patient pro Verabreichung beträgt; (v) ein Peptid-Impfstoff, bestehend aus β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4), derivatisiert an ein geeignetes Trägerprotein; (vi) passive Verabreichung von mindestens einer Dosis eines menschlichen monoclonalen Antikörpers, der spezifisch mit einem 21-Mer-N-terminalen Fragment von β-hCG-CTP37 (hCG-CTP21, SEQ ID NO: 4) immunreaktiv ist, alle 1 bis 2 Wochen; (vii) passive Verabreichung von mindestens einer Dosis eines menschlichen monoclonalen Antikörpers, der spezifisch mit β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4) immunreaktiv ist, in Kombination mit einem menschlichen monoclonalen Antikörper, der spezifisch mit β-hCG-CTP16 (SEQ ID NO: 6) immunreaktiv ist, alle 1 bis 2 Wochen; und (viii) aufeinanderfolgende Verabreichungen eines β-hCG-CTP37-Impfstoffes (SEQ ID NO: 2) mit zeitlichen Abständen in Kombination mit einem menschlichen monoclonalen Antikörper, der spezifisch mit β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4) immunreaktiv ist.
  • In einem Ansatz beträgt die Menge des CTP37-Bestandteiles des hCG-Impfstoffes weniger als 1,0 mg, bevorzugt 0,5 mg. In einer verwandten Ausführungsform, in der der CTP37-Impfstoff einem Patienten zusammen mit dem „Schleifen"-Impfstoff verabreicht wird, beträgt die Menge des CTP-37-Bestandteiles des hCG-Impfstoffes weniger als 1,0 mg, bevorzugt 0,5 mg, und die Menge des „Schleifen"-Impfstoffes ist gleich oder größer als die des CTP37-Peptides.
  • In allen Fällen ist das immunogene hCG-Peptid an ein Trägermolekül, z.B. ein Protein, gebunden. Allgemein ist jedes immunogene hCG-Peptid getrennt an ein Trägerprotein gebunden. Wenn mehr als ein gebundenes immunogenes hCG-Peptid in die Behandlungsstrategie für einen gegebenen Patienten eingeschlossen ist, können die hCG-Peptid-Impfstoffe dem Patienten gleichzeitig oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten verabreicht werden. In den meisten Fällen werden die gebundenen immunogenen hCG-Peptide zusammen in aufeinanderfolgenden Verabreichungen mit zeitlichen Abständen verabreicht.
  • B. Herstellung eines hCG-Peptid-Impfstoffes
  • Zahlreiche hCG-Polypeptidketten sind mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technik in Wirtszellen wie etwa Bakterien, Hefe und kultivierten Säugerzellen exprimiert worden (vgl. z.B. Fiddes, J. C. und Goodman, H. M., 1979) und (Fiddes, J. C. und Goodman, H. M., 1980), welche die Clonierung der alpha- beziehungsweise beta-Untereinheiten des menschlichen Choriongonadotropin (hCG) beschreiben.
  • Die Aminosäuresequenz der beta-Untereinheit von hCG, verfügbar unter der GenBank-Zugangsnummer 180437 und hierin als SEQ ID NO: 1 dargestellt, wurde verwendet, um Peptide zur Verwendung in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
  • Immunogene hCG-Peptide wurden chemisch synthetisiert, indem entweder Fmoc-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-Chemie, im Wesentlichen wie von D. Hudson, 1988, beschrieben, oder Boc-(tert-Butyloxycarbonoyl)-Chemie verwendet wurde. Techniken zur Aminosäuresynthese werden von Fachleuten regelmäßig unter Verwendung der gerade zur Verfügung stehenden Laborausrüstung (z.B. Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) angewendet. Nach der Synthese werden Peptide im Allgemeinen mittels HPLC gereinigt, und die Vollständigkeit und Authentizität der Peptide werden durch Edman-Degradation, gefolgt von herkömmlicher Sequenz- oder massenspektroskopischer Analyse, z.B. NMR-Analyse des intakten Peptides, bestimmt. Die Immunogenität jedes dieser synthetischen Peptide wird individuell ermittelt, indem durch verschiedene in vitro-Immuntests die Immunreaktivität mit Antikörpern in den Körperflüssigkeiten, z.B. Serum oder Plasma, bestimmt wird, die von einer Person gewonnen wurden, von der bekannt ist, dass sie anti-hCG-CTP37-Antikörper besitzt.
  • C. hCG-Peptidvarianten oder modifizierte immunogene hCG-Peptide
  • In den meisten Fällen haben immunogene hCG-Peptide die gleiche Sequenz wie ursprüngliche immunogene hCG-Peptide. In einigen Fällen jedoch sind immunogene hCG-Peptide hCG-Peptidvarianten.
  • Einige Substitutionen von Aminosäuren sind möglich, ohne den immunogenen Charakter des Fragmentes zu verändern.
  • Standard-Substitutionsklassen sind die sechs Klassen, die auf allgemeinen Eigenschaften der Seitenketten und der höchsten Substitutionsfrequenz in homologen Proteinen in der Natur beruhen, wie zum Beispiel durch eine Standard-Frequenz-Austauschmatrix von Dayhoff (Dayhoff) bestimmt wird. Diese Klassen sind Klasse I: Cys; Klasse II: Ser, Thr, Pro, Hyp, Ala und Gly, die die kleinen aliphatischen Seitenketten und OH-Gruppen-Seitenketten repräsentieren; Klasse III: Asn, Asp, Glu und Gln, die die neutralen und negativ geladenen Seitenketten, die zur Bildung von Wasserstoffbrücken-Bindungen in der Lage sind, repräsentieren; Klasse IV: His, Arg und Lys, basische polare Seitenketten repräsentierend; Klasse V: Ile, Val und Leu, verzweigte aliphatische Seitenketten repräsentierend, und Met; und Klasse VI: Phe, Tyr und Trp, aromatische Seitenketten repräsentierend. Zusätzlich kann jede Gruppe verwandte Aminosäure-Analoga einschließen, wie etwa Ornithin, Homoarginin, N-Methyllysin, Dimethyllysin oder Timethyllysin in Klasse IV und ein halogeniertes Tyrosin in Gruppe VI. Darüber hinaus können die Klassen sowohl L- als auch D-Stereoisomere einschließen, obwohl L-Aminosäuren für Substitutionen bevorzugt werden.
  • Sobald eine Aminosäure-Substitution oder -Modifikation vorgenommen worden ist, wird die imunogene hCG-Peptidvariante in einem in vitro-Immuntest auf Immunogenität untersucht.
  • Die hierin beschriebenen Aminosäuresequenzen von immunogenen hCG-Peptiden können zusätzliche Reste einschließen, wie etwa zusätzliche N- oder C-terminale Aminosäuren, und sind doch immer noch im Wesentlichen die selben wie eine jener Sequenzen, die hierin offenbart werden, so lange das Peptid oder Polypeptid die entsprechende biologische Aktivität, z.B. Immunogenität, behält.
  • Die Aminosäuren eines imunogenen hCG-Peptides können in der Weise verändert werden, dass ein äquivalentes oder sogar verbessertes Molekül erzeugt wird. Es ist die Immunogenität des hCG-Peptides, die seine biologische Aktivität definiert. Bestimmte Aminosäuresequenz-Substitutionen können in der Aminosäuresequenz und der Nucleinsäure, die sie codiert, vorgenommen werden, was zur Expression eines hCG-Peptides mit größerem biologischen Nutzen oder größerer Aktivität (Immunogenität) führt. In einigen Fällen können solche Veränderungen andere Vorteile bringen, z.B. Stabilität oder wünschenswertere pharmakologische Eigenschaften bei Beibehaltung eines äquivalenten biologischen Nutzens und einer äquivalenten Aktivität.
  • Mit dem Vornehmen solcher Veränderungen kann der hydropathische Index der Aminosäuren berücksichtigt werden. Bestimmte Aminosäuren können durch andere Aminosäuren ersetzt werden, welche einen ähnlichen hydropathischen Index oder Kern haben und noch ein biologisch funktionelles äquivalentes Protein ergeben (Kyte und Doolittle, 1982). Bei dem Vornehmen solcher Veränderungen ist die Substitution von Aminosäuren, deren hydropathische Indizes innerhalb von +/–2 liegen, bevorzugt, jene, die innerhalb von +/–1 liegen, sind besonders bevorzugt, und jene, die innerhalb von +/–0,5 liegen, sind sogar noch mehr bevorzugt. Es ist in dem Fachgebiet auch selbstverständlich, dass die Substitution von ähnlichen Aminosäuren auf der Basis von Hydrophilie wirksam durchgeführt werden kann, US-Patent Nr. 4,554,101. Bei solchen Veränderungen ist die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophilie-Werte innerhalb von +/–2 liegen, bevorzugt, von jenen, die innerhalb von +/–1 liegen, besonders bevorzugt, und von jenen, die innerhalb von +/–0,5 liegen, sogar noch mehr bevorzugt.
  • Immunogene hCG-Peptidvarianten können verbesserte Eigenschaften für die Verabreichung an Patienten aufweisen, solche Peptide behalten jedoch die Immunogenität der ursprünglichen Sequenz der hierin beschriebenen immunogenen hCG-Peptide bei.
  • V. Behandlungsstrategien zur Erzeugung einer anti-hCG-Immunantwort
  • A. Verabreichung in vivo
  • Verabreichung der hCG-Impfstoffe in vivo kann durch Impfung in Anwesenheit von Adjuvantien oder anderen Substanzen erreicht werden, welche die Fähigkeit haben, Zellen des Immunsystems an die Impfstelle zu rekrutierten. Ein immunogener hCG- Peptid-Impfstoff kann allein oder in Kombination mit passiv verabreichten menschlichen monoclonalen Antikörpern, die spezifisch mit einem 16-Mer-C-terminalen Fragment von β-hCG-CTP37 immunreaktiv sind, verabreicht werden, z.B. β-hCG-CTP16, SEQ ID NO: 6; und/oder β-hCG-CTP21, SEQ ID NO: 4.
  • Die Zellen der Immunantwort eines Individuums, bei der schützende Immunisierung gewünscht wird, werden einem immunogenen hCG-Peptid-Impfstoff allein oder in Kombination mit einem oder mehreren monoclonalen menschlichen Antikörpern, die spezifisch mit einem Epitop von β-hCG-CTP37 immunreaktiv sind, ausgesetzt. Schützende Immunisierung kann nach einer solchen Exposition durch Erreichen einer Reduzierung der Menge an im Blut zirkulierendem hCG oder Tumor-verbundenem hCG in dem Individuum bewirkt werden. Sowohl durch Antikörper als auch durch Zellen vermittelte Immunantworten können zur anti-Krebs-Aktivität von hCG-Impfstoffen beitragen.
  • Ein immunogener hCG-Peptid-Impfstoff und/oder ein menschlicher monoclonaler Antikörper der Erfindung wird in einer Weise, die mit der Dosierungsformulierung verträglich ist, und in einer Menge verabreicht, die immunogene und therapeutische Wirksamkeit besitzt. Die zu verabreichende Menge ist von dem zu behandelnden Individuum abhängig, einschließlich, z.B. der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums, auf einen Peptid-Impfstoff zu antworten.
  • Allgemein sind die immuntherapeutischen Verfahren, die in der vorliegenden Erfindung offenbart werden, bei einem Individuum anwendbar, die schon eine Krebserkrankung aufweist. Dies bedeutet, dass bei dem Individuum auf Grund eines oder mehrerer Kriterien, die von Fachleuten auf diesem Gebiet zur Bestimmung der entsprechende Krebsart angewendet wurden, eine Krebserkrankung diagnostiziert worden ist. Eines dieser Kriterien ist, dass der Krebs durch Expression von hCG auf der Oberfläche der Krebszellen gekennzeichnet ist und in einigen Fällen darüber hinaus durch die Anwesenheit von im Plasma und/oder in anderen Körperflüssigkeiten des Patienten zirkulierendem hCG gekennzeichnet ist. Beispielhafte Krebsarten umschließen Kolorektalkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs und Hodenkrebs, der auf Behandlung mit Cisplatin refraktil ist.
  • In einigen Fällen sind die immuntherapeutischen Verfahren, die in der vorliegenden Erfindung offenbart werden, bei einem Individuum anwendbar, bei dem das Risiko besteht, eine Krebserkrankung zu entwickeln, oder für das ein oder mehrere diagnostische Kriterien darauf hinweisen, dass sich eine Krebserkrankung entwickeln kann.
  • Operation, Bestrahlungstherapie und Chemotherapie sind zur Zeit die vorrangigen Verfahren zur Behandlung von Krebserkrankungen. Es wird erwogen, dass passive Immunisierung mit menschlichen monoclonalen anti-β-hCG-CTP37-Antikörpern und/oder auf hCG-Peptid-Impfstoff beruhende Behandlung mit solchen anderen Krebstherapien kombiniert werden können. Man wird schätzen, dass die hierin beschriebenen Verfahren auf synergistische oder additive Weise mit Operation, Bestrahlungstherapie oder Chemotherapie in Wechselwirkung treten können, was zu einer größeren therapeutischen Wirkung führt. In einigen Fällen werden verbesserte Verfahren zur Behandlung von Krebserkrankungen herkömmliche Krebsbehandlungen, z.B. Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie, zusammen mit passiver Immunisierung durch Verabreichung von menschlichen monoclonalen anti-β-hCG-CTP37-Antikörpern und/oder Verabreichung von hCG-Peptid-Impfstoffen kombinieren.
  • B. hCG-Peptid-Impfstoff-Zusammensetzungen
  • Die Erfindung offenbart ein Verfahren zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen das C-terminale Peptid der beta-Untereinheit von hCG, ein Peptid, welches selbst im Wesentlichen nicht immunogen ist. Dies wird erreicht, indem das Peptid vor der Verabreichung an ein Individuum mit einem Trägermolekül verbunden wird.
  • In den Verfahren, die in der Erfindung offenbart werden, wird eine immunologisch wirksame Menge eines oder mehrerer immunogener Peptide, die an ein geeignetes Trägermolekül derivatisiert sind, verabreicht, z.B. wird ein Protein an einen Krebspatienten durch aufeinanderfolgende Verabreichungen eines Impfstoffes, der aus einem immunogenen hCG-Peptid oder Peptiden, die mit einem Trägermolekül verbunden sind, zusammengesetzt ist, mit zeitlichen Abständen in einer Weise verabreicht, die eine Verbesserung des Zustandes des Patienten bewirkt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind immunogene hCG-Peptide an einen aus einer Reihe von Trägermolekülen, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, gekoppelt. Ein Trägerprotein muss von ausreichender Größe für das Immunsystem der Person sein, der es verabreicht wird, damit dieses seine Fremdartigkeit erkennen und Antikörper dagegen entwickeln kann.
  • In einigen Fällen wird das Trägermolekül direkt an das immunogene hCG-Peptid gekoppelt. In anderen Fällen wird ein Linkermolekül zwischen das Trägermolekül und das immunogene hCG-Peptid eingefügt.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform erfordert die Kopplungsreaktion eine freie Sulfhydryl-Gruppe am Peptid. In solchen Fällen wird ein N-terminaler Cystein-Rest an das Peptid angefügt, wenn das Peptid synthetisiert wird. Zum Beispiel hat CTP17 (SEQ ID NO: 7) die gleiche Sequenz wie die beta-Untereinheit des hCG-Peptides, CTP16 (SEQ ID NO: 6), plus einen angefügten N-terminalen Cystein-Rest, der das Koppeln von CTP16 an ein Trägermolekül erleichtert.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform wird die herkömmliche Succinimid-Chemie verwendet, um das Peptid an ein Trägermolekül zu binden. Verfahren zur Herstellung solcher Peptid:Trägerprotein-Konjugate sind Fachleuten auf dem Gebiet allgemein bekannt und Reagenzien für solche Verfahren sind käuflich zu erwerben (z.B. von Sigma Chemical Co.). Allgemein werden etwa 5–30 Peptidmoleküle pro Trägermolekül konjugiert.
  • Beispielhafte Trägermoleküle umschließen Proteine wie etwa KLH („Keyhole limpet hemocyanin", Rinderserumalbumin (BSA), Flagellin, Influenza-Untereinheit-Proteine, Tetanus-Toxoid (TT), Diphterie-Toxoid (DT), Cholera-Toxoid (CT), eine Reihe von bakteriellen Hitzeschock-Proteinen, Glutathion-Reduktase (GST) oder natürliche Proteine wie Thyroglobulin und dergleichen. Fachleute auf dem Gebiet können leicht ein geeignetes Trägermolekül auswählen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein immunogenes hCG-Peptid an ein Diphtherie-Toxin (DT) konjugiert.
  • In einigen Fällen ist das Trägermolekül ein Nicht-Protein, wie etwa Ficoll 70 oder Ficoll 400 (ein synthetisches Copolymer von Saccharose und Epichlorhydrin), eine Polyglucose wie etwa Dextran T 70.
  • Der Grad der Konjugation muss angemessen sein, um durch einen Krebspatienten eine Immunantwort auf einer Ebene hervorzurufen, die ausreicht, dass einige oder alle der Auswirkungen von hCG, die mit dem Zustand des Patienten in Verbindung stehen, neutralisiert werden. Es wird deutlich sein, dass dies in Abhängigkeit von dem Peptid, dem Trägermolekül und dem Patienten variieren wird.
  • Die Erfindung offenbart hCG-Impfstoff-Zusammensetzungen, wie vorstehend beschrieben, in denen jedes immunogene hCG-Peptid an den selben oder an unterschiedliche Trägerproteine gekoppelt ist.
  • Eine hCG-Impfstoff-Zusammensetzung kann eine einzige oder vielfache Kopien des selben oder von unterschiedlichen immunogenen hCG-Peptiden, gekoppelt an ein ausgewähltes Trägermolekül, umfassen. In einem Aspekt dieser Ausführungsform kann die hCG-Impfstoff-Zusammensetzung unterschiedliche immunogene hCG-Peptide mit oder ohne flankierende Sequenzen, aufeinanderfolgend in einem Polypeptid kombiniert und an den selben Träger gekoppelt, enthalten. Alternativ können die immunogenen hCG-Peptide individuell als Peptide an den selben oder an verschiedene Träger gekoppelt werden, und die entstandenen immunogenen hCG-Peptid-Träger-Konjugate werden zusammengemischt, um eine einzige Zusammensetzung zu bilden, oder sie werden einzeln gleichzeitig oder zu verschiedenen Zeiten verabreicht.
  • Zum Beispiel können immunogene hCG-Peptide kovalent an das Diphtherie-Toxoid (DT)-Trägerprotein über die Cysteinyl-Seitenkette durch das Verfahren von Lee, A. C. J. et al., 1980, gekoppelt werden, wobei etwa 15–20 Peptidmoleküle pro Molekül Diphtherie-Toxoid (DT) verwendet werden.
  • Allgemein werden derivatisierte hCG-Peptid-Impfstoff-Zusammensetzungen zusammen mit einem Trägerstoff verabreicht. Der Zweck des Trägerstoffes besteht darin, das Impfstoffpräparat zu emulgieren. Fachleuten auf diesem Gebiet sind zahlreiche Trägerstoffe bekannt, und jeder Trägerstoff, der als ein wirksames emulgierendes Mittel wirkt, findet Anwendung in den Verfahren der Erfindung. Ein bevorzugter Trägerstoff für die Verabreichung umfasst ein Gemisch aus Mannid-Monooleat mit Squalan und/oder Squalen. Für die Verwendung in den Impfstoffen der Erfindung ist Squalen dem Squalan vorzuziehen, und bevorzugt liegt das Verhältnis von Squalen und/oder Squalan pro Teil zu Volumen Mannid-Monoolat zwischen etwa 4:1 und etwa 20:1.
  • Um die Stärke der Immunantwort, die auf die Verabreichung von hCG-Impfstoff zurückgeht, darüberhinaus zu steigern, wird ein immunologisches Adjuvans in die Impfstofftormulierung eingeschlossen. Beispielhafte Adjuvantien, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, umschließen Wasser/Öl-Emulsionen, nicht ionische Kopolymer-Hilfsstoffe, z.B. CRL 1005 (Optivax; Vaxcel Inc., Norcross, GA), Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid, wässrige Suspensionen aus Aluminium- und Magnesiumhydroxiden, bakterielle Endotoxine, Polynukleotide, Polyelektrolyte, lipophile Adjuvantien und synthetische Muramyl-Dipeptid (norMDP)-Analoga. Bevorzugte Adjuvantien zum Einschluss in eine hCG-Impfstoff-Zusammensetzung zur Verabreichung an einen Patienten sind norMDP-Analoga wie etwa N-Acetyl-normuranyl-L-alanyl-D-isoglutamin, N-Acetyl-muranyl-(6-0-stearoyl)-L-alanyl-D-isoglutamin und N-Glycol-muranyl-L.alphaAbu-D-isoglutamin (Ciba-Geigy Ltd.). In den meisten Fällen liegt das Massenverhältnis des Adjuvans in Bezug auf das Peptidkonjugat etwa zwischen 1:2 und 1:20. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das Massenverhältnis des Adjuvans in Bezug auf das Peptidkonjugat etwa 1:10. Man wird sich bewusst sein, dass die Adjuvans-Komponente im hCG-Impfstoff variiert werden kann, um die Immunantwort auf die immunogenen hCG-Epitope darin zu optimieren.
  • Direkt vor der Verabreichung werden das Konjugat aus immunogenem hCG-Peptid und Trägerprotein und das Adjuvans in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst, und ein emulgierendes Mittel oder ein Trägerstoff wird zugegeben. Zum Beispiel kann eine Zusammensetzung mit dem Konjugat aus immunogenem hCG-Peptid und Trägerprotein das CTP37-Peptid, an DT konjugiert, in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst, zusammen mit norMDP umfassen und darüber hinaus ein emulgierendes Squalen/Mannid-Monooleat-Agenz enthalten.
  • Geeignete pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe zur Verwendung in einer immunogenen Proteinzusammensetzung der Erfindung sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Solche Trägerstoffe umschließen zum Beispiel Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung oder jedes physiologisch verträgliche Medium, das geeignet ist, den hCG-Impfstoff in ein Individuum einzuführen.
  • Zahlreiche Abgabemechanismen für Arzneistoffe, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, können verwendet werden, um die immunogenen hCG-Peptide, die in der Erfindung offenbart werden, zu verabreichen. Präparate mit kontrollierter Freisetzung können durch die Verwendung von Polymeren erhalten werden, um mit den Peptiden oder Antikörpern in den Verfahren der vorliegenden Erfindung Komplexe zu bilden oder sie zu absorbieren. Kontrollierte Abgabe kann erreicht werden, indem Makromoleküle wie Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Protaminsulfat verwendet werden, deren Konzentration die Freisetzungsrate des Peptid-Impfstoffes verändern kann.
  • In einigen Fällen können die hCG-Peptide in polymere Partikel eingelagert werden, die z.B. aus Polyestern, Polyaminosäuren, Hydrogelen, Polymilchsäure oder Ethylenvinylacetat-Copolymeren zusammengesetzt sind. Alternativ wird der hCG-Peptid-Impfstoff in Mikrokapseln, Liposomen, Albumin-Mikrokugeln, Mikroemulsionen, Nanopartikel, Nanokapseln oder Makroemulsionen eingeschlossen, wobei Verfahren verwendet werden, die Fachleuten auf dem Gebiet allgemein bekannt sind.
  • C. Behandlungsstrategien
  • Die in der Erfindung offenbarten hCG-Impfstoffe können auf Wegen verabreicht werden, die intradermale (ID) Injektion, intramuskuläre (IM) Injektion, subkutane (SC) Injektion, intravenöse (IV) Injektion, intraperitoneale (IP) Injektion und peritumorale Injektion einschließen, aber nicht hierauf beschränkt sind. Der bevorzugte Verabreichungsweg ist die subkutane (SC) Injektion.
  • In den Behandlungsverfahren von Krebserkrankungen, die in der Erfindung offenbart werden, wird einem Patienten eine anfängliche Verabreichung von weniger als 2,0 mg hCG-CTP37 (SEQ ID NO: 2), und bevorzugt weniger als 1,0 mg hCG-CTP37, derivatisiert an ein geeignetes Trägermolekül, in einer pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung gegeben. In einigen Fällen umfasst der anfängliche Impfstoff die Kombination von weniger als 2,0 mg hCG-CTP37 (SEQ ID NO: 2) zusammen mit weniger als 2,0 mg hCG-„Schleifen"-Peptid (SEQ ID NO: 9), worin jedes immunogene hCG-Peptid getrennt an ein geeignetes Trägermolekül derivatisiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird einem Patienten ein anfänglicher Impfstoff gegeben, welcher aus der Kombination von 0,5 mg hCG-CTP37 (SEQ ID NO: 2) mit 0,5 mg hCG-„Schleifen"-Peptid (SEQ ID NO: 9) zusammengesetzt ist.
  • Nach einem Zeitraum von 9 bis 15 Wochen nach der anfänglichen Impfung werden die Spiegel der Antikörper des Patienten gegen ein 16-Mer-C-terminales Fragment von hCG-CTP37, ein 21-Mer-N-terminales Fragment von hCG-CTP37 und hCG-CTP37 in einem Immuntest ausgewertet. Der Immuntest kann in regelmäßigen Abständen vor, während und nach der Anti-Krebsbehandlung wiederholt werden.
  • In Abhängigkeit von dem Ergebnis des Immuntests kann die Behandlungsstrategie mit hCG-Impfstoff angepasst werden, um die Immunantwort auf hCG zu optimieren. Eine bevorzugte Dosierungsstrategie wird zu einer Immunantwort im Körper des Patienten sowohl auf das 16-Mer-C-terminale Peptidfragment als auch auf das 21-Mer-N-terminale Peptidfragment von hCG-CTP37 führen, wobei die Immunantwort auf beide Peptide mit vergleichbarer Stärke erfolgt und 9 bis 15 Wochen nach einer anfänglichen Verabreichung des Impfstoffes beginnend nachweisbar ist.
  • Es ist bevorzugt, dass die Immunantwort auf CTP21 (SEQ ID NO: 4) nachweisbar ist, und mehr bevorzugt, dass die nachgewiesene Immunantwort auf CTP21 von vergleichbarer Stärke wie die Immunantwort auf CTP16 (SEQ ID NO: 6) ist. Mit „vergleichbarer Stärke" ist gemeint, dass die nachgewiesene Immunantwort auf CTP21 und CTP16 sich nicht mehr als 50% unterscheidet, bevorzugt nicht mehr als 20%. In anderen Worten, die Immunantwort auf CTP21 (SEQ ID NO: 4) ist nicht wesentlich niedriger als die Immunantwort auf CTP16 (SEQ ID NO: 6).
  • Die Immunantwort eines Patienten auf hCG kann wie nachstehend gruppiert werden: (1) Patienten mit keinem nachweisbaren anti-CTP37-Antikörper in ihrem Plasma (Nicht-Antikörper-Ansprechende); (2) Patienten, bei denen die gesamten anti-β-hCG-CTP37-Antikörper nachweisbar sind, während weder anti-CTP16- noch anti-CTP21-Antikörper nachweisbar sind (schwache Antikörper-Ansprechende); (3) Patienten mit nachweisbarem anti-CTP37-Antikörper und anti-CTP16-Antikörper, aber keinem nachweisbaren CTP-21-Antikörper in ihrem Plasma (Nur-CTP16-Antikörper-Ansprechende); und (4) Patienten mit nachweisbaren anti-CTP37-, anti-CTP16- und anti-CTP21-Antikörpern in ihrem Plasma (CTP16- und CTP21-Antikörper-Ansprechende).
  • Nach dem Immuntest können Patienten aus den Gruppen (1), (2), (3) und Patienten aus Gruppe (4), bei denen der Spiegel an Antikörper, der spezifisch für das N-terminale CTP21-Fragment ist, wesentlich niedriger ist als der Spiegel an Antikörper, der spezifisch für das C-terminale CTP16-Fragment von hCG-CTP37 ist, mit einer Impfstrategie behandelt werden, die unter einer oder mehreren der nachstehenden Strategien wählbar ist: (i) in zeitlichen Abständen aufeinanderfolgende Verabreichungen des hCG-CTP37 (SEQ ID NO: 2)-Impfstoffes in einer Dosis, die höher als die in der anfänglichen Verabreichung gegebene ist; (ii) in zeitlichen Abständen aufeinanderfolgende Verabreichungen des hCG-CTP37 (SEQ ID NO: 2)-Impfstoffes in einer Dosis, die weniger als 1 mg CTP37-Peptid/Patient/Verabreichung entspricht; (iii) in zeitlichen Abständen aufeinanderfolgende Verabreichungen eines Promotor-Impfstoffes, bestehend aus dem hCG-Schleifenpeptid (SEQ ID NO: 9), an einen geeigneten Träger derivatisiert, in Kombination mit dem hCG-CTP37 (SEQ ID NO: 2)-Impfstoff; (iv) in zeitlichen Abständen aufeinanderfolgende Verabreichungen eines Promotor-Impfstoffes, bestehend aus dem hCG-Schleifenpeptid (SEQ ID NO: 9), an einen geeigneten Träger derivatisiert, gefolgt von in zeitlichen Abständen aufeinanderfolgende Verabreichungen des hCG-CTP37 (SEQ ID NO: 2)-Impfstoffes wobei die Dosis des letzteren Impfstoffes weniger als 1 mg CTP37-Peptid/Patient/Verabreichung beträgt; (v) in zeitlichen Abständen aufeinanderfolgende Verabreichung eines N-terminalen CTP37-Peptid-Impfstoffes, bestehend aus β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4), an ein geeignetes Trägerprotein derivatisiert; (vi) in zeitlichen Abständen aufeinander folgende Verabreichungen eines menschlichen monoclonalen Antikörpers, der spezifisch mit β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4) immunreaktiv ist, mindestens einmal alle ein bis zwei Wochen; (vii) in zeitlichen Abständen aufeinanderfolgende Verabreichungen eines menschlichen monoclonalen Antikörpers, der spezifisch mit β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4) immunreaktiv ist, zusammen mit einem menschlichen monoclonalen Antikörper, der spezifisch mit β-hCG-CTP16 (SEQ ID NO: 6) immunreaktiv ist, mindestens einmal alle ein bis zwei Wochen; und (viii) in zeitlichen Abständen aufeinanderfolgende Verabreichungen eines β-hCG-CTP37-Impfstoffes in Kombination mit einem menschlichen monoclonalen Antikörper, der spezifisch mit β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4) immunreaktiv ist.
  • Nach dem Immuntest können Patienten aus Gruppe (4), bei denen der Spiegel an Antikörper, der spezifisch für das N-terminale CTP21-Fragment ist, von vergleichbarer Stärke wie der Spiegel an Antikörper ist, der spezifisch für das C-terminale CTP16-Fragment von β-hCG-CTP37 ist, ebenfalls mit einer Impfstrategie behandelt werden, die unter einer oder mehreren der vorstehend angeführten Strategien (i) bis (viii) wählbar ist.
  • Bevorzugt führt die Verabreichung eines hCG-Impfstoffes zu einem Spiegel an nachgewiesenen Antikörpern gegen β-hCG-CTP37 (SEQ ID NO: 2), β-hCG-CTP16 (SEQ ID NO: 6) und β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4). Noch mehr bevorzugt führt die Verabreichung des hCG-Impfstoffes zu einem Spiegel an nachgewiesenen Antikörpern sowohl gegen β-hCG-CTP16 (SEQ ID NO: 6) als auch gegen β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4), wobei die Immunantwort auf beide Peptide von vergleichbarer Stärke ist.
  • Es wird deutlich sein, dass die vorstehend beschriebenen Behandlungsstrategien als Beispiele dargestellt worden sind, und dass die Behandlungsstrategie in Abhängigkeit von der Immunantwort des Patienten auf hCG den Erfordernissen angepasst werden kann, wie vorstehend beschrieben. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf die periodische Überwachung der Immunantwort auf β-hCG-CTP37, β-hCG-CTP21 und β-hCG-CTP16 und eine entsprechende Anpassung der Behandlungsstrategie, beruhend auf den Ergebnissen einer solchen Überwachung, gerichtet.
  • D. Dosierungsbereiche
  • In der Zeit vor der vorliegenden Erfindung enthielten anfängliche Verabreichungen von immunogenen hCG-Peptid-Konjugaten zur Behandlung von Krebserkrankungen allgemein mindestens 1,0 mg immunogenes hCG-Peptid, derivatisiert an ein geeignetes Trägerprotein. Die in Beispiel 1 dargestellten Untersuchungsergebnisse legen nahe, dass diese Dosen bei der Mehrheit der Patienten während der Behandlung weder zu einer Immunantwort auf das C-terminale Epitop (CTP16, SEQ ID NO: 6) noch auf das N-terminale Epitop (CTP21, SEQ ID NO: 4) von hCG-CTP37 führen und daher keine wirksame Behandlungsstrategie für Kolorektalkrebs sein können.
  • Wie darüber hinaus in Beispiel 1 gezeigt wird, hatten Patienten in der klinischen Untersuchung der Phase II, die eine Immunantwort sowohl auf das C-terminale Epitop (CTP16, SEQ ID NO: 6) als auch auf das N-terminale Epitop (CTP21, SEQ ID NO: 4) von hCG-CTP37 zeigten, signifikant verlängerte Überlebenszeiten.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart Verfahren zur Behandlung von Krebserkrankungen, die zu einer Immunantwort sowohl auf das C-terminale Epitop (CTP16, SEQ ID NO: 6) als auch auf das N-terminale Epitop (CTP21, SEQ ID NO: 4) von CTP37 führen. Dies kann erreicht werden durch die Verabreichung von einem oder mehreren: (1) weniger als 1,0 mg β-hCG-CTP37 (SEQ ID NO: 2)-Peptid/Patient/Verabreichung, allein oder in Kombination mit einer Menge an „Schleifen"-Peptid (SEQ ID NO: 9), jedes an ein geeignetes Trägermolekül derivatisiert; (2) einem hCG-Schleifenpeptid (SEQ ID NO: 9), an einen geeigneten Träger derivatisiert, gefolgt von der Verabreichung von weniger als 1,0 mg β-hCG-CTP37 (SEQ ID NO: 2)-Peptid/Patient/Verabreichung; (3) einem β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4)-Peptid-Impfstoff, an ein geeignetes Trägerprotein derivatisiert; (4) einem menschlichen monoclonalen Antikörper, der spezifisch mit β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4) immunreaktiv ist, mindestens einmal alle ein bis zwei Wochen verabreicht; (5) einem menschlichen monoclonalen Antikörpers, der spezifisch mit β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4) immunreaktiv ist, zusammen mit einem menschlichen monoclonalen Antikörper, der spezifisch mit β-hCG-CTP16 (SEQ ID NO: 6) immunreaktiv ist, mindestens einmal alle ein bis zwei Wochen verabreicht; und (6) einem β-hCG-CTP37-Impfstoff (SEQ ID NO: 2) in Kombination mit einem menschlichen monoclonalen Antikörper, der spezifisch mit β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4) immunreaktiv ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden 0,5 mg CTP37 (SEQ ID NO: 2), an ein geeignetes Trägermolekül derivatisiert, allein oder in Kombination mit einer Menge des „Schleifen"-Peptides (SEQ ID NO: 9) verabreicht. Typischerweise ist die Menge des „Schleifen"-Peptides (SEQ ID NO: 9), die einem gegebenen Patienten verabreicht wird, gleich der oder größer als die Menge an CTP37 (SEQ ID NO: 2). Wenn zum Beispiel der CTP37-Impfstoff zusammen mit dem „Schleifen"-Impfstoff verabreicht wird, beträgt die Menge des CTP37-Bestandteiles des Impfstoffes im Allgemeinen weniger als 1,0 mg, bevorzugt 0,5 mg, und die Menge an „Schleifen"- Impfstoff pro Patient ist gleich oder größer als die Menge an CTP37 (SEQ ID NO: 2). In einem weiteren Aspekt dieser Ausführungsform werden dem Patienten auch 25 bis 500 mg eines menschlichen monoclonalen anti-β-hCG-CTP21- und/oder anti-β-hCG-CTP16-Antikörpers verabreicht, bevorzugt etwa 1 bis 2 Mal pro Woche.
  • Die Mengen an CTP37 (SEQ ID NO: 2), mit oder ohne „Schleifen"-Peptid (SEQ ID NO: 9), in der Behandlungsstrategie und/oder die Mengen an menschlichen monoclonalen anti-β-hCG-CTP21- und/oder anti-β-hCG-CTP16-Antikörpern können vor den nachfolgenden Verabreichungen modifiziert werden, beruhend auf den Ergebnissen eines Immuntests auf anti-CTP37-, anti-CTP16- und anti-CTP21-Antikörper in einer Körperflüssigkeit des Patienten unter Behandlung.
  • Bevorzugte Behandlungsstrategien führen zu einer nachweisbaren Immunantwort auf CTP37, CTP16 und CTP21, welche für Patienten mit Kolorektalkrebs mit verlängerter Überlebenszeit verbunden ist, wie in Beispiel 1 genauer ausgeführt wird.
  • VI. Bewertung der Immunantwort auf hCG
  • Klinische Eckpunkte, die für die Bestimmung der Wirksamkeit der Verabreichung von hCG-Impfstoff von Nutzen sind, umschließen eine Bewertung der Immunantwort auf β-hCG-CTP37 (SEQ ID NO: 2), β-hCG-CTP16 (SEQ ID NO: 6), β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4), eine Bestimmung der Tumorgröße und der Überlebenszeit des Patienten (z.B. in Wochen).
  • In einem Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Klassifizierung der Immunantwort auf hCG bei einem Krebspatienten, z.B. 9 bis 15 Wochen nach Verabreichung eines hCG-Impfstoffes durch Messen des Antikörperspiegels gegen das C-terminale Fragment von CTP37, β-hCG-CTP16 (SEQ ID NO: 6), das N-terminale Fragment von CTP37, β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4), und CTP37, gefolgt von der Klassifizierung des Patienten in eine der nachstehenden vier Gruppen, basierend auf ihrer Immunantwort gegen β-hCG-CTP16, β-hCG-CTP21 und β-hCG-CTP37: (1) Patienten ohne nachweisbaren anti-CTP37-Antikörper in ihrem Plasma (Nicht-Antikörper-Ansprechende); (2) Patienten, bei denen die gesamten anti-β-hCG-CTP37-Antikörper nachweisbar sind, während weder anti-CTP16- noch anti-CTP21-Antikörper nachweisbar sind (schwache Antikörper-Ansprechende); (3) Patienten mit nachweisbarem anti-CTP37-Antikörper und anti-CTP16-Antikörper, aber keinem nachweisbaren CTP-21-Antikörper in ihrem Plasma (Nur-CTP16-Antikörper-Ansprechende); und (4) Patienten mit nachweisbaren anti-CTP37-, anti-CTP16- und anti-CTP21-Antikörpern in ihrem Plasma (CTP16- und CTP21-Antikörper-Ansprechende).
  • Die vorliegende Erfindung schließt ein diagnostische Vorrichtung zur Überwachung der Immunantwort auf β-hCG ein. Die Vorrichtung umschließt ein Peptid, das die Aminosäuresequenz des C-terminalen Fragments von β-hCG-CTP37 (β-hCG-CTP16, SEQ ID NO: 6) aufweist, ein Peptid, das die Aminosäuresequenz des N-terminalen Fragmentes von β-hCG-CTP37 (β-hCG-CTP21, SEQ ID NO: 4) aufweist, und ein Reagenz, das geeignet ist, menschliche Antikörper zu markieren, wie etwa ein Reporter-markierter anti-menschlicher Immunglobulin-Antikörper, um menschliche Antikörper nachzuweisen, die mit dem Peptid immunreaktiv sind.
  • Solche diagnostischen Vorrichtungen sind Fachleuten auf dem Gebiet der Immunologie allgemein bekannt und werden routinemäßig verwendet, um Antikörper in den Flüssigkeiten verschiedener Individuen zu analysieren.
  • In einigen Fällen umschließt die Vorrichtung ein Festphasensubstrat, an welches die β-hCG-Peptide gebunden sind.
  • Die Erfindung umschließt darüber hinaus ein Verfahren zur Überwachung der Immunantwort auf β-hCG mit Hilfe der Durchführung der Schritte der Umsetzung einer Körperflüssigkeitsprobe mit einem Peptid mit der Aminosäuresequenz (1) des C-terminalen Fragmentes von β-hCG-CTP37 (β-hCG-CTP16, SEQ ID NO: 6), (2) des N-terminalen Fragmentes von β-hCG-CTP37 (β-hCG-CTP21, SEQ ID NO: 4) und (3) β-hCG-CTP37 (SEQ ID NO: 2); und des Nachweises der Antikörper in der Probe, die mit dem jeweiligen Peptid immunreaktiv sind. Es ist bevorzugt, dass der Test quantitativ ist und demzufolge verwendet wird, um die Spiegel an jedem Antikörper zu vergleichen, um die relative Stärke der Immunantwort auf jedes Peptid zu bestimmen.
  • Die Verfahren der Erfindung sind allgemein in Immuntest, wie etwa dem enzymverbundenen Immunadsorptionstest (ELISA), Radioimmuntest (RIA), Immunniederschlag, Western-Blot, Dot-Blotting-Verfahren, FACS-Analysen und anderen auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren anwendbar.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umschließt der Immuntest ein hCG-Peptid-Antigen, das auf einem festen Substrat immobilisiert wurde, z.B. einen ELISA-Test.
  • Man wird zu schätzen wissen, dass der Immuntest leicht an ein Kit-Format angepasst werden kann, beispielhaft durch einen Kit dargestellt, welcher umfasst: (A) ein oder mehrere Peptide, die die Aminosäuresequenz (1) des C-terminalen Fragmentes von β-hCG-CTP37 (β-hCG-CTP16, SEQ ID NO: 6); (2) des N-terminalen Fragmentes von β-hCG-CTP37 (β-hCG-CTP21, SEQ ID NO: 4) und (3) β-hCG-CTP37 (SEQ ID NO: 2) besitzen, an ein festes Substrat gebunden; (B) eine Vorrichtung zum Sammeln von Proben von einem Individuum und (C) ein Reaktionsgefäß, in dem der Test durchgeführt wird. Der Kit kann auch Mittel zur Markierung, Enzyme und Substrate für eine Indikatorreaktion und alle Lösungen, Pufferlösungen oder anderen Inhaltstoffe umfassen, die für den Immuntest notwendig sind.
  • Beispiel 1
  • In einer klinischen Untersuchung der Phase II wurden 77 Patienten nach dem Zufallsverfahren entweder Strategien mit hohen oder mit niedrigen Impfstoffdosen zugeordnet. Geeignete Patienten hatten sich einer operativen Entfernung des Primärtumors unterzogen, gehörten keiner bestimmten Volksgruppe und keinem bestimmten Geschlecht an, hatten ein Alter von über 18 Jahren und hatten eine histologische Diagnose eines Adenokarzinoms von Kolon oder Rektum, welches metastatisch war. Der Versuchsentwurf schloss gleichzeitige Chemotherapie aus. Das Protokoll erforderte einen positiven Test auf Hypersensitivität des verzögerten Typs auf ein oder mehrere gewöhnliche Recall-Antigene (Tetanus-Toxoid, Diphtherie-Toxoid, Streptokinase, Tuberkulin, Candida, Trichophyton), gemessen durch intradermale Hauttests. Alle Patienten reagierten negativ auf Hypersensitivität des unmittelbaren Typs auf das Recall-Antigen des Diphtherie-Toxoids in einem intradermalen Hauttest vor der Impfung. Alle Patienten hatten einen SWOG (Southwest Oncology Group)-Performance-Score von 0, 1 oder 2.
  • Der Impfstoff wurde als eine handgefertigte Emulsion aus Squalen:Mannidoleat-Träger in einem Verhältnis von 4:1 (Vol.:Vol.) hergestellt, formuliert mit einem CTP37-Diphtherie-Toxoid-Konjugat (25 Moleküle synthetisches CTP37-Peptid/105 Da DT) auf nor-Muramyl-Dipeptid-Adjuvans im Verhältnis von 20:1 (Gew.:Gew.), gelöst in steriler Kochsalzlösung. Das Volumen des Impfstoffes betrug 0,4 ml für die Dosis von 0,5 mg, 0,8 ml für die Dosis von 1,0 mg und 1,6 ml für eine Dosis von 2,0 mg (basierend auf dem Gewicht des Konjugates). 36 Patienten wurden der Strategie mit niedriger Dosierung zugeordnet, welche aus 0,5 mg Impfstoff an Tag 0, Tag 28, Tag 70 und Woche 16 bestand. 41 Patienten mit der Strategie hoher Dosierung erhielten 2,0 mg Impfstoff an Tag 0, gefolgt von 1,0 mg an Tag 28, Tag 70 und Woche 16. Der Impfstoff wurde intramuskulär verabreicht.
  • Es ist bekannt, dass β-hCG-CTP37 (SEQ ID NO: 2, 2A) mindestens zwei Epitope enthält, eine N-terminale Region (CTP21, SEQ ID NO: 4, 2C), die ein Epitop enthält (SEQ ID NO: 5, 2D), und eine C-terminale Region (CTP16, SEQ ID NO: 6, 2E), die ein Epitop enthält (SEQ ID NO: 8, 2G).
  • Klinische Eckpunkte, die bewertet wurden, umschlossen die Immunantwort auf das N-terminale Fragment von β-hCG-CTP37, β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4); das C-terminale Fragment von β-hCG-CTP37, β-hCG-CTP16 (SEQ ID NO: 6); und das vollständige CTP37-Peptid (SEQ ID NO: 2), eine Bestimmung der Tumorgröße und der Überlebenszeit des Patienten.
  • Der Spiegel an anti-hCG-Antikörpern wurde gemessen, indem die Bindung von mit 125I markiertem hCG an unterschiedliche Verdünnungen von Seren, die in Abständen nach der Immunisierung gewonnen wurden, wie vorstehend beschrieben (Jones W. et al., Lancet 1: 1295–1298, 1998), bestimmt wurde. Ergebnisse werden als die Menge an β-hCG, gebunden in nMol pro Liter unverdünntem Serum, dargestellt.
  • Eine standardisierte Festphase, indirekter enzymverbundener Immunadsorptionstest (ELISA), wurde zur Analyse von Patienten-Antiseren auf DT-Antikörper verwendet. In Kürze, Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit gereinigtem DT (Pasteur Merieux Connaught, Toronto, Ontario, Kanada) in einer Konzentration von 1 μg/ml in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) überzogen. Serielle Zweifachverdünnungen der Patienten-Antiseren wurden in PBS/1 Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Tween-20 in die Vertiefungen gegeben und über 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit PBS/0,1% Tween-20 gewaschen, anschließend wurde ein Ziegen-anti-Mensch-IgA, IgG, IgM-Meerrettichperoxid-Konjugat (HRP-Konjugat, Kierkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) für 45 Minuten zugegeben. Nach der Waschung der Vertiefungen mit PBS/0,1% Tween-20 (zweimal) und destilliertem Wasser (zweimal) wurden die Platten durch die Zugabe von Chromogen (ABTS, Kierkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) über 15 Minuten entwickelt und nachfolgend auf Absorption bei 405 nm analysiert. Die Ergebnisse werden für alle Patientenproben als optische Dichte bei einer bestimmten Verdünnung (1/32.000), die sich in einem linearen Titrationsbereich befand, dargestellt.
  • β-hCG-CTP16 (SEQ ID NO: 6) und β-hCG-CTP21 (SEQ ID NO: 4) wurden synthetisiert und mit Hilfe von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie auf > 95% Reinheit gereinigt (Peptide Express, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA). β-hCG-CTP37 wurde durch GMP-Herstellung gewonnen (Peninsula Laboratories, Inc., Belmont, CA, USA). Patienten-Antiseren mit ausreichendem Titer für anti-hCG-Antikörper wurden auf die Bindung an CTP37, CTP21 und CTP16 unter Verwendung eines Konkurrenz-ELISA-Tests untersucht. Vor dem Konkurrenz-ELISA-Test wurden eine optimale Konzentration des Antigens für den Überzug und eine optimale Verdünnung des Antiserums für den Konkurrenz-ELISA-Test durch indirekten ELISA-Test für jedes einzelne Antiserum bestimmt. Eine ELISA-Platte, die mit CTP37 mit 1,0, 0,50, 0,25 und 0,10 μg/ml überzogen war, wurde mit 1% BSA in PBS blockiert. Mehrere Antiserum-Verdünnungen, die von 1/1000 bis 1/60.000 reichten, wurden der Platte zugegeben. Gebundene Antikörper wurden mit einem anti-Mensch-HRP-Konjugat nachgewiesen. Die Antigen-Konzentrationen des Überzugs, die lineare Antworten in Form von optischen Dichten auf Antiserum-Konzentrationen erzeugten, wurden in dem Konkurrenz-ELISA-Test verwendet. Der Konkurrenz-ELISA-Test wurde mit Änderungen nach dem Verfahren durchgeführt, welches an anderer Stelle beschrieben worden ist (Chang S. P. et al., J. Immunol. 128: 702–705, 1982). In Kürze, die Platten wurden über Nacht mit CTP37 in PBS in einer vorbestimmten Konzentration für jedes Antiserum inkubiert und dann mit 1%BSA/PBS blockiert. Als nächstes wurde das Antiserum mit der zuvor bestimmten Verdünnung mit verschiedenen Konzentrationen von CTP37, CTP21 oder CTP16 vorinkubiert, und dann wurden 60 μl eines jeden Antiserum-Peptid-Gemisches in jede Vertiefung der mit CTP37 überzogenen Platte zugegeben. HRP-konjugiertes menschliches Immunglobulin wurde verwendet, um die Menge an freien (nicht verdrängten) Antikörpern, die an die Platte gebunden sind, zu bestimmen. Prozentsätze für die Bindungen wurden durch Vergleichen der optischen Dichten der Proben bei 405 nm mit den Standardreihen der Antiseren (ohne verdrängende Peptide) auf der selben Platte errechnet. Aus zwei Wiederholungs-Werten für jede Peptidkonzentration wurde der Mittelwert gebildet und als % der Bindung gegen Log10 [Peptid-Konkurrent] aufgetragen, dann mit der einseitigen Kompetitions-Gleichung unter Verwendung von GraphPad PRISMTM-Software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) angeglichen. Die Software Excel von Microsoft und die Software GraphPad PRISMTM wurden für statistische Analysen einschließlich von Kaplan-Meier-Kurven verwendet, um Überlebenszeit und Log-Rank-Tests darzustellen, um die Überlebenszeiten zu vergleichen. P-Werte von 0,05 oder weniger wurden als signifikant angesehen.
  • Die Immunantwort auf hCG wurde im Serum von Patienten zwischen 0 und 24 Wochen nach Beginn der Impfung gemessen. Signifikante Produktion von hCG-Antikörpern wurde in Woche 12 des Impfprotokolls beobachtet (3).
  • Der Titer für anti-β-hCG-CTP37-Antikörper war von der Dosis abhängig, da die anfängliche Dosis von 2,0 mg Impfstoff zu einem höheren Antikörpertiter als die Strategie mit der Dosierung von 0,5 mg führte (3). Obwohl sich die größte Tumorregion bei Patienten, die die geringe Dosis erhielten, nicht wesentlich vergrößerte, wurde Tumorwachstum bei der Strategie mit hoher Dosis beobachtet, und die mittlere größte Tumorregion war zwischen den beiden Dosierungsstrategien signifikant unterschiedlich (p < 0,05, 4). Daher korrelierte die Immunantwort auf CTP-37 nicht mit der mittleren größten Tumorregion. Zusätzlich betrug die mittlere Überlebenszeit der Patienten 39,9 Wochen in der Gruppe mit niedriger Dosierung und 32,4 Wochen in der Gruppe mit der hohen Dosierung. Das Verhältnis Antikörper/größte Tumorregion stieg exponentiell mit der Zeit an (5).
  • Es zeigte sich auch, dass der Impfstoff eine Zell-vermittelte Immunantwort erzeugte, wie durch die PBMC-Proliferationsantwort auf verschiedene Antigene (PHA, CTP-37, CTP-37-KI, DT und β-hCG) bestimmt wurde. Das Mitogen wurde mit 1, 0,1 oder 0,01 μg/Vertiefung zugegeben (Daten, die in 6 dargestellt werden, stammen von der Konzentration 1 μg/ml). Der PHA-Stimulationsindex war größer als 4, daher ist 6 für diese Datenpunkte nicht korrekt. Die korrekten Werte für PHA betragen normal 79; 147 für Patient 1; und 2819 für Patient 2. Das Verfahren wird von Triozzi et al., 1997 genauer beschrieben.
  • Die Antikörperantwort auf CTP37 war mit der Überlebenszeit der Patienten korreliert, der DT-Antikörpertiter war jedoch weder in der Gruppe mit hoher noch in der Gruppe mit geringer Dosierung mit der Überlebenszeit der Patienten korreliert.
  • Obgleich der Mechanismus, der der Erfindung zugrunde liegt, nicht Teil der beanspruchten Erfindung ist, legen die Ergebnisse nahe, dass die Antikörperantwort auf bestimmte Epitope der beta-Untereinheit von hCG über pharmakokinetische (verstärkte Clearance von hCG) und/oder pharmakodynamische (Wechselwirkung mit hCG-Bindung an Rezeptoren) Mechanismen abläuft. Auswertungen von Serumproben, die von Patienten gewonnen wurden, die mit CTP37 in einer Konkurrenzuntersuchung mit entweder den CTP16- oder CTP21-Peptiden von CTP37 immunisiert worden waren, wiesen relativ zu der Immunantwort auf CTP21 auf eine stärkere Immunantwort auf CTP16 hin, was nahe legt, dass CTP16 bei Menschen immundominant ist.
  • Die Immunantwort von Patienten, die eine intramuskuläre Injektion von CTP37-DT erhielten, teilte sich wie folgt in 4 Gruppen: (1) Patienten, bei denen weder der erste noch der zweite Antikörper noch vollständige anti-β-hCG-CTP37-Antikörper nachweisbar sind (Nicht-Antikörper-Ansprechende); (2) Patienten, bei denen vollständige anti-β-hCG-CTP37-Antikörper nachweisbar sind, während weder erste noch zweite Antikörper nachweisbar sind (schwache Antikörper-Ansprechende); (3) Patienten mit einem nachweisbaren Spiegel von ersten Antikörpern, aber nicht nachweisbaren Spiegeln von zweiten Antikörpern (Nur-CTP16-Antikörper-Ansprechende); und (4) Patienten mit nachweisbaren Spiegeln sowohl von ersten als auch von zweiten Antikörpern (CTP16- und CTP21-Antikörper-Ansprechende) (Tabelle 1).
  • Tabelle 1 Patientenkennzeichen für vier Subpopulationen von Antikörperantworten
    Figure 00470001
  • Die Kurven der Überlebenszeiten für Patienten aus jeder der vier Gruppen von Antikörperantworten werden in 7 dargestellt. Es stellte sich heraus, dass sich diese Überlebenskurven signifikant voneinander unterschieden (p = 0,0019). Die mittleren Überlebenszeiten betrugen 16,4 Wochen für die 21 Patienten ohne anti-hCG-Antikörper, 29,6 Wochen für die 20 Patienten, die die Antwortgruppe mit schwachem Antikörper-Titer ausmachten, 34,8 Wochen für die 20 Patienten mit nur Erkennung des CTP16-Epitops und 64,6 Wochen bei den 15 Patienten, die eine Antwort sowohl auf CTP16 als auch auf CTP21 aufgebaut hatten, wie in Tabelle 2, nachstehend, zusammengefasst ist.
  • Tabelle 2. Immunantwort auf CTP37 in der klinischen Untersuchung der Phase II
    Figure 00480001
  • Zusätzlich ließ sich anhand der gestiegenen Überlebenszeit für Patienten mit einer nachgewiesenen Immunantwort gegen sowohl CTP16 als auch CTP21 eine gestiegene Überlebenszeit für die Behandlungsgruppen mit hoher als auch mit niedriger Dosis voraussagen.
  • Die verbesserte Überlebenszeit für Patienten mit Antikörpererkennung sowohl des CTP16- als auch des CTP21-Epitops in dem CTP37-Impfstoff („duale Epitop-Antwort") war nicht an ein allgemeines Maß des gesamten Immunstatus des Patienten gekoppelt. Wie in Tabelle 1 dargestellt, gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen den vier Gruppen für die mittleren Serum-IgG-Spiegel. Zusätzlich gab es in einem Hauttest vor der Verabreichung des CTP37-Peptid-Impfstoffes keinen Unterschied in der Anzahl der Recall-Antigene, auf die eine Antwort erfolgte, oder in der Stärke der Antwort auf die Recall-Antigene. Darüber hinaus wurde beim Vergleich der Gruppen, die nur auf CTP16 beziehungsweise auf CTP16 und CTP21 antworteten, kein signifikanter Unterschied im mittleren anti-hCG-Antikörper-Titer beobachtet.
  • Die hierin dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Überlebenszeit anstieg, sobald die Patienten eine duale Epitop-Antwort entwickelten. Die mittlere Überlebenszeit in der Gruppe mit dualer Epitop-Antwort betrug 65 Wochen, was im Vergleich mit Patienten, die mit Irinotecan behandelt worden waren, eine längere Überlebensdauer darstellt. Der gesamte mittlere anti-hCG-Titer war bei Patienten, die in der Lage waren, Antikörper gegen beide CTP37-Epitope zu entwickeln, nicht signifikant von denen jener Patienten verschieden, welche nur in der Lage waren, eine Antwort gegen das CTP16-Epitop zu entwickeln (Tabelle 1). Die mittlere Überlebenszeit war jedoch im Vergleich zu der Gruppe mit Antwort auf ein einzelnes Epitop in der Gruppe mit dualer Epitop-Antwort nahezu doppelt so lang. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die qualitative Natur der Immunantwort gegen β-hCG eine Rolle bei der Bestimmung der Wirksamkeit des Impfstoffes eine Rolle spielen kann, und zusätzlich unterstützen die Ergebnisse die Hypothese, dass die Antikörperantwort gegen β-hCG direkt mit der Überlebenszeit des Patienten verbunden ist.
  • Beispiel 2
  • Kaninchen wurden mit CTP37 immunisiert, und die Immunantwort auf CTP16 und CTP21 wurde gemessen. In einem Konkurrenz-Immuntest wurde relativ zu der Immunantwort auf CTP21 eine stärkere Immunantwort auf CTP16 nachgewiesen, was anzeigt, dass ähnlich wie beim Menschen CTP16 bei Kaninchen immundominant ist (Tabelle 3).
  • Wenn Kaninchen mit dem hCG-„Schleifen"-Peptid allein immunisiert wurden, wurde in einem Konkurrenz-Immuntest eine Immunantwort auf CTP16 nachgewiesen, während keine Antwort auf CTP21 nachgewiesen wurde, und wenn Kaninchen mit CTP37 und dem Schleifen-Peptid immunisiert wurden, wurde eine Immunantwort sowohl auf CTP16 als auch CTP21 in dem Konkurrenztest nachgewiesen. Nach der kombinierten Verabreichung der CTP37- und hCG-„Schleifen"-Peptid-Impfstoffe schien die Immunantwort auf CTP16 nicht immundominant zu sein. Tabelle 3. Epitopkartierung und Bioneutralisation1
    Figure 00500001
    • 1 + = ED 50 > 1000 ng; ++ = ED 50 < 250 ng; +++ = ED 50 < 10 ng
    • 2 Pro-Effekt = größere hCG-Antwort als die Kontrolle ohne Antiserum
    • 3 N. D. = nicht durchgeführt
  • Die Ergebnisse aus diesen Immunisierungsstudien über die kombinierte Verabreichung des CTP37-Peptid-Impfstoffes und des hCG-„Schleifen"-Impfstoffes weisen darauf hin, dass die gemeinsame Verabreichung der CTP37- und „Schleifen"-Peptide zu einer verstärkten Immunantwort auf CTP21 und einer Immunantwort von vergleichbarer Stärke sowohl auf CTP16 als auch CTP21 führt, was nahe legt, dass das „Schleifen"-Peptid als ein Verstärkungsimpfstoff wirken kann, der zu einer ausgeglicheneren Immunantwort auf β-hCG-CTP16 und β-hCG-CTP21 führt, als die Verabreichung von CTP37 allein.
  • Tabelle 4. Tabelle der Sequenzen
    Figure 00510001
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001

Claims (8)

  1. Menschlicher monoclonaler Antikörper, der spezifisch immunreaktiv ist mit einem 21-Mer-N-terminalen Fragment von β-hCG-CTP37, wobei das Fragment als β-hCG-CTP21 bezeichnet wird und in SEQ ID NO: 4 dargestellt ist.
  2. Antikörper gemäß Anspruch 1, enthalten in einer Lösung in einer Form, die geeignet ist zur Injektion in einen menschlichen Patienten.
  3. Antikörper gemäß Anspruch 1, in Kombination mit einem menschlichen monoclonalen Antikörper, der spezifisch immunreaktiv ist mit einem 16-Mer-C-terminalen Fragment von β-hCG-CTP37, wobei das Fragment als β-hCG-CTP16 bezeichnet wird und in SEQ ID NO: 6 dargestellt ist, und enthalten in einer Lösung, die geeignet ist zur Injektion in einen menschlichen Patienten.
  4. Antikörper gemäß Anspruch 1, gefangen in Liposomen, die ummantelt sind mit einer Polyethylenglycolhülle, wirksam um die Blutzirkulationszeit von Liposomen ausreichend zu verlängern, um die Sequestration von Liposomen am Ort eines soliden Tumors zu ermöglichen, wenn intravenös verabreicht wird.
  5. Verfahren zum Klassifizieren der Immunantwort auf β-hCG, umfassend (a) das Messen, in vitro, der Spiegel an ersten, zweiten und gesamten Patienten-β-hCG-Antikörpern gegen β-hCG-CTP16, dargestellt in SEQ ID NO: 6; β-hCG-CTP21, dargestellt in SEQ ID NO: 4; bzw. β-hCG-CTP37, dargestellt in SEQ ID NO: 2; und (b) das Klassifizieren des Patienten in eine der folgenden vier Gruppen, abhängig von den gemessenen Spiegeln der ersten und zweiten Antikörper: (i) Patienten, in denen weder erste noch zweite Antikörper noch die gesamten Anti-β-hCG-CTP37-Antikörper nachweisbar sind, wobei die Patienten als Nicht-Antikörper-Ansprechende bezeichnet werden; (ii) Patienten, in denen die gesamten Anti-β-hCG-CTP37-Antikörper nachweisbar sind, während weder erste noch zweite Antikörper nachweisbar sind, wobei die Patienten als schwache Antikörper-Ansprechende bezeichnet werden; (iii) Patienten mit einem nachweisbaren Spiegel von ersten Antikörpern, aber nicht-nachweisbaren Spiegeln von zweiten Antikörpern, wobei die Patienten als Nur-CTP16-Antikörper-Ansprechende bezeichnet werden; (iv) Patienten mit nachweisbaren Spiegeln von sowohl ersten als auch zweiten Antikörpern, wobei die Patienten als CTP16- und CTP21-Ansprechende bezeichnet werden.
  6. Diagnostische Vorrichtung zum Überwachen der Immunantwort auf β-hCG, umfassend: (a) ein 16-Mer-C-terminales Fragment von β-hCG-CTP37, wobei das Fragment als β-hCG-CTP16 bezeichnet wird und in SEQ ID NO: 6 dargestellt ist; (b) ein 21-Mer-N-terminales Fragment von β-hCG-CTP37, wobei das Fragment als β-hCG-CTP21 bezeichnet wird und in SEQ ID NO: 4 dargestellt ist; (c) das β-hCG-CTP37-Peptid, dargestellt in SEQ ID NO: 2; und (d) Reagenzmittel zur Markierung menschlicher Antikörper, die immunreaktiv mit den Fragmenten (a), (b) und (c) sind, mit einem nachweisbaren Reporter.
  7. Vorrichtung gemäß Anspruch 6, welche ferner ein Festphasen-Substrat, an das die Fragmente (a), (b) und (c) gebunden sind, beinhaltet, und wobei die Reagenzmittel Reporter-markierte anti-menschliche Immunoglobulin-Antikörper beinhalten.
  8. Verfahren zum Überwachen der Immunantwort auf β-hCG, umfassend: (a) das Reagieren einer Körperflüssigkeitsprobe mit einem Festphasen-Reagenz, das daran gebunden hat ein 16-Mer-C-terminales Fragment von β-hCG-CTP37, bezeichnet als β-hCG-CTP16 und dargestellt in SEQ ID NO: 6, ein 21-Mer-N-terminales Fragment von β-hCG-CTP37, bezeichnet als β-hCG-CTP21 und dargestellt in SEQ ID NO: 4, und β-hCG-CTP37, dargestellt in SEQ ID NO: 2, in der Anwesenheit von Reporter-markierten Antikörpern, die spezifisch immunreaktiv sind mit den drei Peptiden; und (b) das Ermitteln der Spiegel der drei Körperflüssigkeit-Antikörper aus der Menge der an den festen Träger gebundenen Reporter-markierten Antikörper.
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