DE69334036T2

DE69334036T2 - Hybridom und humanisierter momoklonaler Anti-KC-4-Antikörper, dafür kodierende DNA und RNA, Kit und diagnostische Verfahren

Info

Publication number: DE69334036T2
Application number: DE69334036T
Authority: DE
Inventors: J.J.R. Pleasanton DOCOUTO; Roberto L. Lafayette CERIANI; Jerry A. Lafayette PETERSON
Original assignee: I B C PHARMACEUTICALS LLC; IBC Pharmaceuticals Inc
Current assignee: IBC Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-10-08
Filing date: 1993-11-16
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2013-11-17
Also published as: EP0723663A4; WO1995010776A1; USRE40535E1; AU5869294A; EP0723663B1; US6281335B1; JPH09503663A; DE69334036D1; CA2173324A1; CA2173324C; EP0723663A1; JP3831408B2

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die in vitro Diagnose von Karzinomen durch einen spezifisch gerichteten humanisierten Maus monoklonalen Antikörper, der selektiv das humane KC-4 Antigen bindet. Der humanisierte Anti-KC-4 Maus Antikörper umfasst die komplementären bestimmenden Regionen (engl.: complementary determining regions (CDRs)) der variablen Regionen des Maus Antikörpers derselben Spezifität, und seine Gerüstregionen weisen spezifische Aminosäuren, die in einer vorbestimmten Weise ausgetauscht wurden, und die konstanten Regionen eines humanen Antikörpers auf. Von dem erfindungsgemäßen humanisierten Anti-KC-4 Maus Antikörper wird erwartet, dass er eine geringere immunologische Antwort in Menschen als der gesamte Maus Antikörper hervorruft, und er wird deshalb als geeignet für die in vivo Verabreichung an Menschen erachtet. Polynukleotidsegmente, die den humanisierten Antikörper kodieren, ein Hybridvektor und eine transfizierte Wirtszelle, welche die DNA Segmente trägt, die den Antikörper kodieren, können zur Herstellung der hier offenbarten Peptide verwendet werden.
Beschreibung des Hintergrunds
Karzinome entstehen durch die karzinogene Transformation von Zellen verschiedener Epithelien. Zwei der am meisten schädigenden Eigenschaften von Karzinomen sind ihr unkontrolliertes Wachstum und ihre Fähigkeit, Metastasen an entfernten Stellen des Wirts, insbesondere eines humanen Wirts, zu bilden. Es sind für gewöhnlich diese entfernten Metastasen, die ernste Konsequenzen für den Wirt bewirken, weil häufig das primäre Karzinom in den meisten Fällen chirurgisch entfernt werden kann. Die Behandlung von metastasierenden Karzinomen, die selten entfernt werden können, hängt von Bestrahlungstherapie und systemischen Therapien unterschiedlicher Arten ab. Die systemischen Therapien schließen gegen wärtig ein, aber sie umfassen nicht vollständig, Chemotherapie, Bestrahlung, Hormontherapie, verschiedene immunitätssteigernde Medikamente und Verfahren, hyperthermische und systemische monoklonale Antikörper Behandlung.
Der zuletzt genannte kann mit radioaktiven Elementen, Immuntoxinen und chemotherapeutischen Arzneimitteln markiert sein. Radioaktiv markierte monoklonale Antikörper werden in Lymphomen, Leukämien und in einigen Karzinomen verwendet. Das Konzept, das der Verwendung von markierten Antikörpern zugrunde liegt, ist, dass der markierte Antikörper das Karzinom spezifisch suchen und daran binden wird, und das radioaktive Element durch seinen Zerfall den Tumor in situ bestrahlen wird. Weil radioaktive Strahlen einen gewissen Weg in Tumoren wandern, ist es nicht notwendig, dass jede Karzinomzelle den markierten Antikörper bindet. Die Spezifität der monoklonalen Antikörper erlaubt eine selektive Behandlung des Tumors, während die Bestrahlung von nicht betroffenen normalen Nachbargeweben, die Dosis limitierend sein könnten, vermieden wird. Die Chemotherapie von Karzinomen bewirkt ernste toxische Wirkungen auf normale Gewebe, was sie weniger wünschenswert und die Verwendung von radioaktiv markierten monoklonalen Antikörpern zu einer wertvollen Alternative macht.
Nicht humane Antikörper, die gegen humane Epitope gerichtet sind, wurden für die Diagnose und Therapie von Karzinomen, wie im Stand der Technik bekannt ist, verwendet. Ebenfalls bekannt sind die Verfahren zur Herstellung von sowohl polyklonalen als auch monoklonalen Antikörpern. Beispiele für die zuletzt genannten sind BrE-2, BrE-3 und KC-4 (z.B. US Patente Nr. 5,007,220; 5,075,219 und 4,708,930). Der KC-4 murine monoklonale Antikörper ist spezifisch für eine einzige antigene Determinante, das „Antigen" und bindet selektiv stark an neoplastische Karzinomzellen, aber nicht an normales humanes Gewebe (US Patent Nr. 4,708,930 an Coulter). Das Antigen kommt in zwei Formen in Karzinomzellen vor, wobei nur die kleinere dieser Formen in der Zellmembran exprimiert wird. Die größere Form kommt nur im Cytoplasma vor und weist ein ungefähres 490 Kdalton Molekulargewicht (Bereich von 480.000 – 510.000) auf. Die zweite Form tritt in einer höheren Expressionsdichte auf, wird sowohl im Cytoplasma als auch in der Membran von Karzinomzellen gefunden und weist ein ungefähres 480 Kdalton Molekulargewicht (Bereich von 390.000 – 450.000) auf, wie durch Gelelektrophorese mit Markerproteinen mit bekannten Molekulargewichten bestimmt wurde. Markierter KC-4 wurde in der Diagnose und medikamentösen Behandlung von verschiedenen Karzinomen angewendet, insbesondere Adenokarzinom und Plattenepithel Karzinom, unabhängig von der Organstelle der Abstammung im Menschen.
Von dem BrE-3 Antikörper (Peterson et al., Hybridoma 9:221 (1990); US Patent Nr. 5,075,219) wurde gezeigt, dass er an die Tandemwiederholung des Polypeptidkerns von humanem Brust epithelialen Mucin bindet. Wenn das Mucin deglykosyliert ist, ist die Anwesenheit von mehr Epitopen mit Tandemwiederholungen exponiert und die Bindung des Antikörpers steigt. Somit binden Antikörper wie BrE-3 vorzugsweise an neoplastische Karziomtumore, weil diese eine nicht glykosylierte Form des Brust epithelialen Mucins exprimieren, das nicht in normalem epithelialen Gewebe exprimiert wird. Diese präferenzielle Bindung, kombiniert mit einer beobachteten niedrigen Epitopkonzentration dieser Antikörper im Kreislauf von Karzinompatienten, wie Brustkrebspatienten, macht Antikörper mit einer Spezifität für ein Mucinepitop hochwirksam für Karzinom Radioimmuntherapie. Ein ⁹⁰Y-BrE-3 Radioimmunkonjugat zeigte sich als hochwirksam gegen humane Brustkarzinome, die in Nacktmäuse transplantiert wurden. Klinische Studien am Menschen zeigten, dass das ⁹⁰Y-BrE-3 Radioimmunkonjugat beträchtlich die Größe von Brusttumor Metastasen ohne irgendwelche sofortigen toxischen Nebenwirkungen reduzierte. Darüber hinaus wurde ein ¹¹¹In-BrE-3 Radioimmunkonjugat erfolgreich für die Darstellung von 15 Brustkrebspatienten verwendet, was ein exzellentes Abzielen auf den Tumor in 13 von 15 der Patienten lieferte. Von allen der Brusttumor Metastasen, die in einer anderen Studie auftraten, wurden 86 % durch ¹¹¹In-BrE-3 nachgewiesen. Leider entwickelten die Patienten 2 bis 3 Wochen nach der Behandlung eine starke humane anti-murine Antikörper (HAMA) Antwort, welche die weitere Verabreichung des Radioimmunkonjugats verhinderte. Diese Antwort, die für zahlreiche murine monoklonale Antikörper beobachtet wurde, schloss ihre Langzeitverabreichung an humane Patienten aus. Andere heterologe Antikörper, wenn sie an Menschen verabreicht wurden, zeigten ähnliche Antikörper Antworten, was anzeigt, dass die anti-heterologe humane Antwort ein wesentlicher limitierender Faktor ist, der die erfolgreiche Verwendung von heterologen Antikörpern als therapeutische Mittel behindert.
Chimäre Antikörper sind direkte Fusionen zwischen variablen Domänen von einer Spezies und konstanten Domänen einer anderen. Von murinen/humanen chimären Antikörpern, die aus anderen Arten von B Zellen hergestellt werden, die an andere Arten von antigenen Determinanten binden, wurde gezeigt, dass sie weniger immunogen in Menschen als gesamte murine Antikörper sind. Diese bewiesen sich als weniger immunogen, aber in einigen Fällen ist immer noch eine Immunantwort gegen die Nager variable Region Gerüstregion (GR) (engl.: framework region (FR)) gerichtet. Eine weitere Verringerung der "Fremd" Natur der chimären Antikörper wurde durch Übertragen (grafting) nur der CDRs von dem Nager monoklonalen Antikörper auf das humane tragende Gerüst vor seiner anschließenden Fusion mit einer geeigneten konstanten Domäne erreicht (europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungsnr. 239,400 an Winter; Riechmann, et al., Nature 332:323-327 (1988)). Jedoch führen die Verfahren, die eingesetzt werden, um CDR-Übertragung (CDR-grafting) zu erreichen oft zu unvollständigen "humanisierten" Antikörpern. Dies bedeutet, dass der resultierende Antikörper Affinität verliert (für gewöhnlich 2- bis 3-fach im besten Fall).
Die Liganden Bindungseigenschaften einer Antikörper kombinierenden Stelle sind primär durch die Struktur und die relative Lage der CDRs bestimmt, obwohl auch gefunden wurde, dass einige Nachbarreste in die Antigenbindung involviert sind (Davies, et al., Ann. Rev. Biochem. 59:439-473 (1990)).
Die Technologien der Molekularbiologie haben die Verwendung von vielen Antikörpern weiter erweitert, indem sie die Bildung von Molekülen mit ausgetauschten Klassen (engl.: class switched molecules) erlauben, deren Funktionalität durch die Aufnahme oder den Verlust von Komplementfixierung verbessert wurden. Die Größe des bioaktiven Moleküls kann auch verringert werden, so dass die Gewebe Ziel Verfügbarkeit des Antikörpers ansteigt, durch entweder Änderung der Klasse von einem IgM zu einem IgG, oder durch Entfernen des größten Teils der Schwere- und Leichte-Kette konstante Regionen, um einen F_v Antikörper zu bilden. Diesen möglichen therapeutischen Formen des Antikörpers sind die benötigten komplementären bestimmenden Regionen (CDRs) gemeinsam, welche das Molekül zu seinem Liganden führen, und die Gerüstreste (GRs), welche die CDRs tragen und ihre Disposition relativ zueinander vorgeben. Die kristallographische Analyse von zahlreichen Antikörper Strukturen zeigte, dass die Antigen Kombinierungsstelle nahezu vollständig aus den CDR Resten zusammengesetzt ist, die in einer begrenzten Anzahl von Schleifenmotiven angeordnet sind. Die Notwendigkeit der CDrs, diese Strukturen zu bilden, kombiniert mit der gewünschten Hypervariabilität ihrer Primärsequenz führt zu einer großen Diversität in der Antigen Kombinierungsstelle, aber zu einer, die eine begrenzte bzw. endliche Anzahl von Möglichkeiten aufweist. Somit würde ihre Hypermutabilität und das begrenzte Primärsequenz Repertoire für jeden CDR vorschlagen, dass die CDRs, die von einem gegebenen Antigen von einer Spezies eines Tieres abgeleitet sind, dieselben wären für jene, die von einer anderen Spezies abgeleitet sind. Somit sollten sie schlecht immunogen sein, wenn überhaupt, wenn sie einem Empfängerorganismus präsentiert werden.
Demzufolge besteht noch ein Bedarf für ein Produkt mit hoher Affinität und/oder Spezifität für Karzinom Antigene, das für den Nachweis und die Therapie von Karzinomen geeignet ist, das eine bessere Antikörper Antwort hervorruft als gesamte nicht humane Antikörper oder chimäre Antikörper, die zum Beispiel die gesamte nicht humane variable Region enthalten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft einen modifizierten chimären Antikörper, der selektiv an das humane KC-4 Antigen bindet, der Antikörper wird in Anspruch 1 definiert.
Ebenfalls bereitgestellt werden die korrespondierenden DNA und RNA Segmente, die den monoklonalen Antikörper kodieren, ein Hybridvektor, der die DNA trägt, und ein damit transfizierter Wirt.
Ebenfalls Teil dieser Erfindung sind in vitro Verfahren zum Diagnostizieren von Krebs und zum Durchführen immunhistochemischer Assays von Gewebeschnitten, ein ex vivo Verfahren zum Abführen neoplastischer Zellen, und in vivo Verfahren zum Darstellen und der Therapie von Krebspatienten.
Andere Ziele, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann aus der folgenden Diskussion deutlich.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Diese Erfindung entstand aus einem Wunsch der Erfinder, eine Antikörper Technologie zu verbessern, die zur Verwendung in diagnostischen und therapeutischen Anwendungen geeignet ist, insbesondere für die in vivo Verabreichung. Die verwendbaren monoklonalen Antikörper, die bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt erhalten wurden, wurden durch Fusionieren von immortalisierten Zelllinien mit B Zellen von Maus oder anderen tierischen Ursprungs hergestellt. Jedoch können im Allgemeinen heterologe Antikörper nur einmal an einen Menschen aufgrund der nachteiligen immunologischen Wirkungen, die sie auslösen, verabreicht werden. Dies stimmt für die meisten verabreichten heterologen Antikörper. Zum Beispiel löst die wiederholte Verabreichung von murinen Antikörpern an ein Subjekt eine starke humane anti-murine Antikörper (HAMA) Antwort aus, was ihre weitere Verwendung als therapeutische Agenzien in Menschen ausschließt. Diese heterologen Antikörper initiieren eine sofortige gegenläufige Reaktion in vielen humanen Patienten und werden dadurch für die weitere Verabreichung als therapeutische Agenzien unwirksam. Andererseits sind humane monoklonale Hybridom Zelllinien nicht sehr stabil und waren deshalb für die wiederholte Herstellung von monoklonalen Antikörpern im großen Maßstab nicht geeignet.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben deshalb die Herstellung von Anti-KC-4 humanisierten monoklonalen Antikörpern unternommen, welche die gesamten CDRs der Maus Antikörper derselben Spezifität und humane konstante Regionen aufrechterhalten, und 7 Aminosäuren in der schweren Kette und 12 Aminosäuren in der leichten Kette wurden substituiert, wobei die substituierten Aminosäuren in den Gerüstregionen (GRs) angeordnet sind und aus jenen ausgewählt sind, die an äquivalenten Positionen in anderen humanen Antikörpern vorhanden sind, und die konstanten Regionen eines humanen Antikörpers. Die erfindungsgemäßen Hybridoma können große Mengen an monoklonalen Antikörpern mit einer gewünschten hohen Affinität, Spezifität und Selektivität für das humane KC-4 Antigen bilden.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben überraschenderweise gefunden, dass diese monoklonalen Antikörper im Wesentlichen die Bindung, Spezifität und Selektivität des gesamten korrespondierenden Maus Antikörpers bewahren, während von ihnen erwartet wird, dass sie eine weniger nachteilige immunologische Antwort auslösen. Jedoch stellt die einfache Konservierung der Bindungsregion eines Antikörpers nicht selbst sicher, dass die Bindungseigenschaften des Antikörpers aufrechterhalten werden. Antikörper sind Glykopolypeptide, die in spezifische Konformationen gefaltet werden. Wenn der Glykosidabschnitt des Moleküls oder Abschnitte der Aminosäuresequenz gestört sind oder entfernt werden, kann das Faltungsmuster des Moleküls gestört sein. So muss jede Deletion oder Modifikation der Sequenz eines Antikörpers unter der Berücksichtigung gemacht werden, dass seine faltungsabhängigen Eigenschaften sich verringern oder sogar verschwinden können, wenn die Faltung wesentlich beeinflusst ist, selbst wenn die Aminosäuresequenzen, die in die Bindung des Antigens involviert sind, erhalten bleiben.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung wählten die folgende Strategie für die Präparation und Herstellung der erfindungsgemäßen Antikörper. Die cDNAs, welche die variablen Ketten eines Antikörpers kodieren, können durch Isolierung von mRNAs aus Hybridom Zellen und dadurch dass ihre mRNAs revers transkribiert werden, erhalten werden. Die so erhaltenen cDNAs können durch Polymerase Kettenreaktion (PCR) amplifiziert und die erhaltenen DNAs in einen Vektor eingeführt und wahlweise sequenziert und durch ein Restriktionsenzym herausgeschnitten werden. Auf diese Weise können die cDNAs, die für die variable Kette (F_v) Region der leichten (V_L) und der schweren (V_H) Ketten eines Antikörpers mit Affinität und Spezifität für das humane KC-4 Antigen kodieren, aus den isolierten mRNAs revers transkribiert werden. Die cDNAs der variablen Region können anschließend modifiziert werden, mit vorbestimmten Primern, die verwendet werden, um sie mittels PCR zu amplifizieren oder de novo zu synthetisieren, in einen Vektor kloniert werden, der wahlweise DNA Sequenzen trägt, welche die humane(n) konstante(n) Region(en) kodierten, wahlweise sequenziert und anschließend in Wirtszellen für die Expression der humanisierten Anti-KC-4 Antikörper transfiziert werden. Die Bindungsspezifitäten und Bindungskonstanten der humanisierten Antikörper können anschließend bestimmt und mit jenen für die gesamten Maus Antikörper verglichen werden.
Röntgenstrahlen kristallographische Studien zeigen, dass die Gerüststrukturen der F_v von verschiedenen Antikörpern eine kanonische Struktur annehmen, unabhängig von der Spezies des Ursprungs, Aminosäuresequenz oder Ligandenspezifität. Dies wird allgemein als Beweis erachtet, dass die Liganden Bindungseigenschaften einer Antikörper Kombinierungsstelle primär durch die Struktur und relative Disposition der CDRs bestimmt werden, obwohl auch einige benachbarte Gerüstreste ebenfalls in die Antigenbindung involviert sein können. Wenn somit die genaue Spezifität eines Antikörpers konserviert werden soll, müssen seine CDR Strukturen und Teile der benachbarten Reste, ihre Wechselwirkung miteinander und mit dem Rest der variablen Domänen ebenfalls aufrechterhalten werden. Diese kristallographischen Studien weisen auf den möglichen Bedarf zur Aufrechterhaltung der meisten, wenn nicht aller, der vielen inneren und Inter-Domänen Kontaktreste, weil die strukturellen Wirkungen des Austausches von nur wenigen von ihnen nicht vorhergesagt werden kann.
Während zunächst die Notwendigkeit, diese Aminosäuren zu erhalten, aussieht, als ob das Ziel der Verringerung der Immunogenität durch "Humanisierung" zunichte gemacht wird, haben die Erfinder die aktuelle Zahl von Aminosäuren, die erhalten werden muss, als klein bestimmt aufgrund der starken Ähnlichkeit zwischen humanen und murinen variablen Regionen. Darüber hinaus besitzen viele, wenn nicht die meisten, der erhaltenen Aminosäuren Seitenketten, die nicht auf der Oberfläche des Moleküls exponiert sind und deshalb nicht zu seiner Antigenität beitragen. Es sind eindeutig die am meisten exponierten Aminosäuren, die gute Kandidaten für Substitution sind, weil es diese Aminosäuren sind, die gegenüber der immunologischen Umgebung eines Säugetiers exponiert sind und die Epitope mit gesteigerter Immunogenität bilden können.
Die Herausforderung der Humanisierung der variablen Regionen des Anti-KC-4 Maus Antikörpers beginnt deshalb mit der Identifizierung der "wichtigen" heterologen Aminosäuren. "Wichtige" Aminosäuren sind hier definiert als jene, die zum Beispiel in die Antigenbindung involviert sind, die CDRs und die gegenüberliegenden Ketten kontaktieren und die verdeckte Seitenketten aufweisen. Im Idealfall können diese Reste aus einer gut charakterisierten dreidimensionalen Struktur identifiziert werden. Wenn jedoch, wie im vorliegenden Fall, direkte strukturelle Daten nicht zur Verfügung stehen, haben es die Erfinder glücklicherweise möglich gemacht, die Lage dieser wichtigen Aminosäuren durch Analysieren von anderen verwandten Antikörper Strukturen, insbesondere jener, deren leichte und schwere Regionen zu derselben Klasse gehören, vorherzusagen. Diese Klassen von variablen Regionen können aus ihrer Aminosäuresequenz bestimmt werden.
Ein Verfahren, durch welches diese wichtigen Aminosäuren identifiziert werden können, wurde für den Fall der Aminosäuren mit verdeckten Seitenketten durch Padlan, E.A. beschrieben (Padlan, E.A. "A Possible Procedure for Reducing the Immunogenicity of Antibody Variable Domains While Preserving Their Ligand-Binding Properties", Molecular Immunology, 28:489-494 (1991)). Im vorliegenden Fall wurden verschiedene Antikörper variable Region Strukturen unter Verwendung eines Computerprogramms verglichen, das die Lösungsmittel Erreichbarkeit der Gerüstreste ebenso wie ihre Kontakte mit der gegenüberliegenden Domäne bestimmt, wie von Padlan, E.A. (1991), supra, beschrieben. Überraschenderweise zeigt eine genaue Untersuchung der Gerüst Lösungsmittelerreichbarkeit eine sehr starke Ähnlichkeit in den Exponierungsmustern der V_H und der V_L Domänen. In einfachen Worten ausgedrückt haben die Erfinder unabhängig von dem bestimmten fraglichen Antikörper und seiner Aminosäuresequenz gefunden, dass verdeckte Reste ähnliche relative Positionen in den meisten Antikörpern besetzen.
Eine ähnliche Analyse kann durch Computer Modeling durchgeführt werden, um zu bestimmen, welche Aminosäuren die CDRs kontaktieren und welche die gegenüberliegende Domäne kontaktieren. Zu diesem Zeitpunkt können die Fab Strukturen, die gegenwärtig in der Protein Datenbank vorliegen (Bernstein, F.C., et al., J. Mol. Biol. 112:535-542 (1977)), untersucht werden, um zu bestimmen, welche GRs in der Aufrechterhaltung der Struktur der Kombinierungsstelle wichtig sein können. Somit kann nach einer genauen Inspektion von vielen hochauflösenden dreidimensionalen Strukturen von variablen Regionen die Position von allen wichtigen Gerüst Aminosäuren, dies bedeutet jene, welche die CDRs kontaktieren, die gegenüberliegende Domäne und jene, deren Seitenketten nach innen gerichtet sind, tabellarisch angeordnet werden. Diese Aminosäuren, ebenso wie jene der CDRs und schließlich jene GR Aminosäuren, die in die Ligandenbindung involviert sein können, zu erhalten, sollte zu einem großen Ausmaß den Erhalt der Affinität sicherstellen. Die genaue Identifizierung von GR Aminosäuren, welche in die Ligandenbindung involviert sind, kann nicht verallgemeinert werden, weil sie für verschiedene Antikörper variiert. Nichts desto trotz können konservative Entscheidungen getroffen werden, um die Aminosäuren zu erhalten, die in GRs angeordnet sind, die eine hohe Wahrscheinlichkeit aufweisen, das Antigen zu kontaktieren. Diese Regionen sind allgemein unmittelbar angrenzend an die CDRs und den N Terminus von beiden Ketten angeordnet, weil die Oberfläche von diesen Regionen benachbart zu den CDR Oberflächen liegt.
Überraschenderweise ist es möglich, alle diese wichtigen Aminosäuren in einem heterologen humanisierten Antikörper zu erhalten und immer noch die Ähnlichkeit mit einer humanen Konsensussequenz dramatisch zu steigern. Dies bedeutet, dass die finale Zahl von Aminosäuren mit murinen Identitäten, die von humanen Identitäten verschieden sind, die erhalten bleiben, typischerweise klein ist. Dies ist möglich, weil humane Gerüste, die zu den murinen Gerüsten ähnlich sind, insbesondere an den Positionen der wichtigen Aminosäuren, gefunden werden können. Dies liegt daran, dass viele der wichtigen Aminosäuren dieselben Identitäten in sowohl murinen als auch humanen Antikörpern aufweisen.
All die Aminosäuren, die als nicht wichtig durch das oben beschriebene Verfahren bestimmt werden, können durch ihre korrespondierenden humanen Gegenstücke ausgetauscht werden. Die Oberfläche des endgültig humanisierten Antikörpers sollte sehr stark wie jene eines humanen Antikörpers aussehen, mit Ausnahme der Antigen bindenden Oberflächen. Die ursprüngliche Form dieser Bindungsoberflächen wird jedoch erhalten indem die innere Zusammensetzung des Antikörpers intakt bleibt, was Inter-Domänen Kontakte erhält und indem sehr wenige Schlüsselaminosäuren, welche die CDRs kontaktieren, erhalten bleiben.
a) Auswahl des besten humanen Gerüsts zur Verwendung in der "Humanisierung" eines Antikörpers, wenn seine Struktur bekannt ist
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt gibt es 11 Fab Strukturen, für welche die atomaren Koordinaten bekannt sind, und die in die Protein Datenbank, wie in Tabelle 1 unten gezeigt, eingegeben wurden, 2 von humanen und 9 von murinen Antikörpern.
Tabelle 1: Fab Strukturen, für welche sich die Koordinaten in der Protein Datenbank befinden
Die Kontakte zwischen Seitenketten in den variablen Domänen der 11 Fabs wurden gesammelt und sind in den Tabellen 2 bis 4 unten dargestellt. Die Gerüst (GR) Aminosäuren in den V_L Domänen, welche die CDRs kontaktieren, sind in Tabelle 2 unten aufgelistet.
Tabelle 2: V_L Gerüstreste, die CDR Reste in Fabs mit bekannter dreidimensionaler Struktur kontaktieren
Jene GR in den V_H Domänen, die CDRs kontaktieren, sind in Tabelle 3 unten aufgelistet.
Tabelle 3: V_H Gerüstreste, die CDR Reste in Fabs mit bekannter dreidimensionaler Struktur kontaktieren
Die GR Aminosäuren, welche die gegenüberliegende Domäne kontaktieren, und die wahrscheinlich diejenigen sind, die hauptsächlich für die quartäre Struktur der F_v Domänen verantwortlich sind, sind in Tabelle unten aufgelistet.
Tabelle 4: Gerüstreste, die Gerüstreste in der gegenüberliegenden Domäne in Fabs mit bekannter dreidimensionaler Struktur kontaktieren
Die verdeckten nach innen gerichteten GR Aminosäuren in den V_L Domänen, d.h. jene, die in dem Domäneninneren angeordnet sind, sind in Tabelle 5 unten aufgelistet.
Tabelle 5: Nach innen gerichtete, verdeckte Gerüstreste in der V_L von Fabs mit bekannter dreidimensionaler Struktur
Jene in der V_H Domäne sind in der Tabelle 6 unten aufgelistet.
Tabelle 6: Nach innen gerichtete, verdeckte Gerüstreste in der V_H von Fabs mit bekannter dreidimensionaler Struktur
Aus dem oben Gesagten kann geschlossen werden, dass

(1) es viele GR Aminosäuren gibt, die entweder die CDRs oder die gegenüberliegende Domäne kontaktieren, oder die in dem Domäneninneren gefunden werden;
(2) diese GR Aminosäuren, welche die Struktur der Kombinierungsstelle und damit die Antigen Bindungseigenschaften eines Antikörpers beeinflussen könnten, von Antikörper zu Antikörper verschieden sind.

Es ist aus diesen Ergebnissen offensichtlich, dass nicht eine einzige Struktur als die perfekte und einzige Basis für alle Humanisierungsprotokolle dienen kann. Um tatsächlich die 9 murinen Antikörper, die in Tabelle 1 oben gezeigt sind, durch CDR Grafting zu "humanisieren" mit dem Ziel ihre Liganden Bindungseigenschaf ten zu erhalten, müssten die GR Aminosäuren, die in Tabelle 2 bis 6 oben aufgelistet sind, erhalten bleiben.
Eine Suche durch die Tabellen von Immunglobulinsequenzen (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5. Aufl., US Dept. of Health and Human Service, NIH Veröffentlichung Nr. 91-3242 (1991)) zeigt, dass die humanen variable Domänesequenzen bekannt sind, die bereits die meisten der GR Aminosäuren aufweisen, die erhalten werden müssen, wie in Tabelle 7 unten gezeigt.
Tabelle 7: Humane Antikörper die in der Sequenz mit murinen Antikörpern mit bekannter dreidimensionaler Struktur sehr ähnlich sind
Diese humanen Sequenzen sind nicht notwendigerweise jene, die am ähnlichsten zu den murinen Antikörpern sind, insgesamt oder nur in den Gerüstregionen, sondern vielmehr jene, welche die größte Zahl von wichtigen Aminosäuren gemeinsam haben, wobei die zuletzt genannten Sequenzen in Tabelle 7 oben eingeschlossen sind.
Die Zahl von murinen Aminosäuren, die immer noch erhalten werden muss, um alle die wichtigen GR Aminosäuren in der "humanisierten" Version der murinen Antikörper aufzuweisen, wie in Tabelle 7 oben gezeigt, reicht von 21 (für HyHEL-5:12 in V_H und 9 in V_L) bis 5 (für B1312:2 in V_H und 3 in V_L). Diese sind keine sehr ähnlichen Aminosäuren, berücksichtigt man, dass die resultierenden humanisierten Moleküle wahrscheinlich die meisten oder alle ihrer Liganden Bindungseigenschaften erhalten bleiben. Es ist möglich, dass andere humane Sequenzen existieren, die noch ähnlicher zu diesen murinen Domänen sind, die nicht in die Erfassung von Kabat, et al. (1991), supra, eingeschlossen sind. Wenn mehr Sequenzen zur Verfügung stehen, können diese ebenfalls eingeschlossen werden, um den Pool von zugrundeliegenden Daten, der für die Verwendung in der Humanisierung von Antikörpern zur Verfügung steht, zu verbessern.
b) Auswahl des besten humanen Gerüsts zur Verwendung in der "Humanisierung" eines Antikörpers, wenn seine Struktur nicht bekannt ist
In der Abwesenheit einer dreidimensionalen Struktur ist die Identifizierung der GR Aminosäuren, die kritisch sind, um die Kombinierungsstellen Struktur aufrecht zu erhalten, nicht einfach durchzuführen. Nichts desto trotz können einige Vorschläge aus den Daten, die in den Tabellen 2 bis 6 oben gezeigt sind, gemacht werden, die in den Tabellen 8 und 9 unten für die V_L und V_H Domänen gesammelt wurden.
Tabelle 8: Gerüstreste in V_L, die wahrscheinlich erhalten werden müssen, um die Liganden Eigenschaften des original Antikörpers zu reproduzieren
Tabelle 9: Gerüstreste in V_H, die wahrscheinlich erhalten werden müssen, um die Liganden Eigenschaften des original Antikörpers zu reproduzieren
Aus den Tabellen 8 und 9 oben kann erkannt werden, dass viele der wichtigen GR Aminosäuren die CDRs flankieren. Unter diesen flankierenden Positionen sind die meisten der GR Aminosäuren, die in dem Kontakt mit der gegenüberliegende Domäne involviert sind, wie in Tabelle 4 oben gezeigt ist, und viele von jenen, die in Kontakt mit den CDRs stehen, wie in Tabellen 2 und 3 oben gezeigt ist. Darüber hinaus liegen nahezu alle der GR Aminosäuren, von denen beobachtet wurde, dass sie in der Bindung an das Antigen teilnehmen (Amit, A.G., et al., Science 233:747-753 (1986); Sheriff, et al., P.N.A.S. (USA) 82:1104-1107 (1987); Padlan, E.A., et al., P.N.A.S. (USA) 86:5938-5942 (1989); Tulip, et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 54:257-263 (1989); Bentley, et al., Nature (London) 348:254-257 (1990)) in diesen flankierenden Regionen. Somit werden während der Humanisierung nicht nur die CDRs erhalten, sondern auch einige der Reste unmittelbar benachbart zu den CDRs. Dies liefert eine bessere Chance zum Erhalten von mehr der Liganden Bindungseigenschaften des ursprünglichen Antikörpers. Die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens der Antigen Bindungseigenschaften des Maus Antikörpers ist noch größer wenn die ersten wenigen Aminosäuren an den NH₂-Termini von beiden Ketten ebenfalls erhalten bleiben, weil gefunden wurde, dass einige von ihnen mit CDRs in Kontakt stehen, wie in den Tabellen 2 und 3 oben gezeigt ist. Darüber hinaus zeigen die Tabellen 8 und 9 oben auch viele andere Gerüstpositionen, von denen angenommen wird, dass sie strukturell in allen hier untersuchten Fällen wichtig sind. Die murinen Reste an diesen Positionen sollten wahrscheinlich ebenfalls erhalten werden.
Alternativ dazu kann es möglich sein, die Immunogenität zu verringern während die Antigen Bindungseigenschaften bewahrt bleiben, durch einfaches Austauschen jener exponierter Reste in den Gerüstregionen, die sich von jenen unterscheiden, die für gewöhnlich in humanen Antikörpern gefunden werden (Padlan, E.A. (1991), supra). Dies würde die Oberfläche des Anti-KC-4 murinen Antikörpers humanisieren während das Innere und die Kontaktreste, die seine Antigen Bindungseigenschaften beeinflussen, erhalten bleiben. Der vernünftige Austausch von äußeren Resten sollte eine geringe oder keine Wirkung auf das Innere der Domänen oder auf die Inter-Domänen Kontakte aufweisen. Zum Beispiel wurde gefunden, dass die Lösungsmittel Zugänglichkeitsmuster der F_vs von J539, einem murinen IgA (κ) und von KOL, einen humanen IgG1 (λ) sehr ähnlich sind (Padlan, E.A. (1991), supra).
Zur Zeit wurden mehr als 35 verschiedene Fab Strukturen durch Röntgenstrahlen Diffraktionsanalyse aufgeklärt, obwohl sich atomare Koordinaten für nur 11 gegenwärtig in der Protein Datenbank, wie in Tabelle 1 oben gezeigt, befinden. Die meisten der zur Verfügung stehenden Strukturen wurden nur bis zu einer mittleren Auflösung analysiert, einige wurden nur zu einem begrenzten Ausmaß verfeinert. Schließlich werden atomare Koordinaten für mehr und besser verfeinerte Strukturen zur Verfügung stehen, so dass die "wichtigen" GRs einfacher zugänglich sind. Dies wird die theoretisch vorhersagbare Aufzeichnung des vorliegenden Verfahrens zur Bestimmung der Sequenz der humanisierten Antikörper verbessern.
Die Gestaltung des humanisierten Anti-KC-4 murinen Antikörpers wird in Schritten wie folgt erreicht.

1. Wahl eines murinen Modells bekannter Struktur.
2. Wahl des humanen GR.
3. Identifizierung von murinen/hunanen Antikörper Unterschieden.
4. Identifizierung von wichtigen murinen Aminosäuren.

(1) Wahl eines xenogenen Modells bekannter Struktur
Die V_H und V_L Domänen eines Antikörpers mit gewünschter Spezifität werden gemäß Kabat et al. (1991), supra klassifiziert. Anschließend kann ein anderer humaner Antikörper gewählt werden, dessen Struktur bestimmt wurde, und dessen variable Regionen zu denselben Klassen und Subklassen gehören. Die Modellierung des fraglichen murinen Antikörpers zu einer solchen Struktur stellt die maximale Erfolgschance sicher. Dies ist jedoch nicht absolut notwendig, weil die relativen Positionen der wichtigen Aminosäuren nicht beachtlich selbst in variablen Regionen von verschiedenen Klassen variieren. Somit wurde mit weniger als einer per fekten Übereinstimmung dieses Verfahren angewendet, um die erfindungsgemäßen humanisierten Anti-KC-4 Antikörper zu gestalten. Sobald das murine Modell ausgewählt ist, kann es angewendet werden, um die Lagen der wichtigen Reste in dem zu humanisierenden murinen Antikörper zu identifizieren. Die Tabellen 2, 3, 4, 5, 6, 8 und 9 zeigen die Positionen der wichtigen Aminosäuren in verschiedenen Antikörpern, deren Strukturen zu einer hohen Auflösungsebene bestimmt wurden.
(2) Wahl der Zielspezies GR
Das Zielspezies Gerüst sollte idealerweise ein Konsensusgerüst sein. Dies ist eines, das eine maximale Anzahl von gemeinsamen Aminosäuren mit allen humanen Gerüsten derselben Klasse aufweist. Dies ist wichtig, weil es das Ziel der Humanisierung ist, eine immunologische Antwort gegen den veränderten humanisierten Anti-KC-4-Antikörper zu vermeiden.
Das Zielspezies Gerüst, das ausgewählt wurde, ist jenes, das die größte Zahl von wichtigen Aminosäuren mit dem original murinen Antikörper teilt. Somit ist bei der Wahl der humanen GRs die Ähnlichkeit zwischen den wichtigen Aminosäuren wichtiger als die gesamte Ähnlichkeit.
In der Praxis wurden die Sequenzen der murinen variablen Ketten mit den Konsensussequenzen von allen variablen Region Klassen des Anti-KC-4 murinen Antikörpers ausgerichtet, und die Zahl der Unterschiede in den Aminosäuren, die von dem murinen Antikörper erhalten bleiben müssen, wurde bewertet. Die humane(n) Konsensussequenz(en), welche die niedrigste Zahl an Unterschied erreichte(n) wird/werden anschließend ausgewählt. Dies sind die besten Antikörper Kandidaten. Andere mit geringeren Zahlen, die höher als die obigen sind, können auch geeignet sein, und werden in einen Reservepool gegeben, und so weiter. Wenn es zu viele Unterschiede in dem gewählten Gerüst (z.B. mehr als 16) gibt, dann kann dasselbe Anordnungsverfahren unter Verwendung aller tabellarisierten humanen Sequenzen wiederholt werden, um ein spezifisches humanes Gerüst zu finden, dessen Ähnlichkeit mit der murinen Sequenz an den Positionen der wichtigen Aminosäuren maximiert ist. Somit sollte am meisten bevorzugt die Zielspezies GR eine Konsensussequenz sein. Als nächstes bevorzugt wäre ein Gerüst eines häufigen humanen Antikörpers, und schließlich das Gerüst irgendeines humanen Antikörpers.
(3) Identifizierung von murinen/humanen Antikörper Unterschieden
Die murinen Sequenzen werden anschließend gegenüber den humanen Sequenzen ausgerichtet, und die Positionen aller Aminosäuren, die in den murinen und in den humanen Gerüsten verschieden sind, werden tabellarisiert. Eine solche Tabelle enthält die maximale Zahl von Aminosäuren, die gegenüber der Humanisierung des Anti-KC-4 murinen Antikörpers ausgetauscht werden können (siehe Tabelle 19 unten). Wenn alle diese Änderungen gemacht würden, würde ein sogenannter CDR grafted Antikörper erhalten werden. Dies bedeutet, dass nur die original CDRs aus dem Anti-KC-4 murinen Antikörper erhalten blieben. Die Affinität eines CDR grafted Antikörpers gegenüber sich selbst wäre beachtlich geringer als jene des original Anti-KC-4 murinen Antikörpers. Um die Chancen zum Erhalten der original Affinität zu maximieren, müssen die Identitäten von allen wichtigen Aminosäuren erhalten bleiben.
(4) Identifizierung von wichtigen murinen Aminosäuren
In dem ersten Schritt in Richtung Humanisierung eines Antikörpers bleiben die Aminosäuren, die entsprechend wichtig in dem Anti-KC-4 murinen Antikörper sind, der in Schritt 1 ausgewählt wurde, erhalten. In einem anschließenden Schritt können jedoch auch die Aminosäuren, von denen gezeigt wurde, dass sie wichtige Positionen in anderen murinen Antikörpern oder in humanen Antikörpern besitzen, ebenfalls erhalten bleiben und werden deshalb aus der Gruppe der zu mutierenden Kandidaten herausgenommen. Der zweite Schritt ist besonders angebracht, wenn alle Chancen, dass die fraglichen Aminosäuren in Kontakt mit den CDRs oder mit den gegenüberliegenden Ketten treten können, ausgeschlossen werden sollen. Sobald die wichtigen murinen Aminosäuren identifiziert sind, kann die DNA Sequenz mutagenisiert werden, um alle anderen Aminosäuren zu verändern, die zum größten Teil exprimierte Positionen besetzen.
Das vorliegende Verfahren wurde in der exemplarischen Offenbarung angewendet, die im Folgenden bereitgestellt wird, für die Humanisierung des Anti-KC-4 murinen Antikörpers ausgehend von einem chimären Antikörper, der aus Anti-KC-4 Maus variablen Regionen und humanen konstanten Regionen besteht. Murine und humane Antikörper deren dreidimensionale Strukturen zu einem hohen Grad der Auflösung abgeleitet wurden, wurden als Richtlinie in der Wahl der zu substituierenden Aminosäuren verwendet, um diesen murinen Antikörper zu humanisieren. Informationen über andere murine Antikörper aus einer Datenbank wurden in der exemplarischen Offenbarung, die unten bereitgestellt wird, verwendet, um die Anti-KC-4 murinen-humanen chimären Antikörper mit humanen Aminosäuren zu modifizieren.
Die cDNAs, welche die Anti-KC-4 humanisierten variablen Regionen kodieren, wurden anschließend in einen Vektor kloniert, der Sequenzen enthält, die konstante Regionen eines humanen Antiköpers unter demselben Promotor kodieren. Obwohl dies die Klonierungsstrategie ist, die in der exemplarischen Offenbarung dieser Erfindung verwendet wurde, können andere Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, wie Koexpression und ähnliches, ebenfalls verwendet werden. In der hier bereitgestellten exemplarischen Offenbarung wurden die Anti-KC-4 murinen-humanen chimären Antikörper durch das Verbinden der cDNAs der Anti-KC-4 murinen variablen Domäne mit einer humanen konstanten Domäne (ein Effektoragens) konstruiert, in einen Hybridvektor kloniert und dieses Produkt durch Transfizieren des Vektors in Myelomzellen exprimiert. Die variablen Regionen der chimären Antikörper wurden anschließend auf der DNA Ebene modifiziert, um die humanisierten chimären Antikörper zu erhalten. Die Modifikationen an den variablen Regionen der Peptide können entweder durch PCR Amplifikation mit Primern durchgeführt werden, die maßgeschneidert sind, um die gewünschten Mutationen zu bilden, oder durch DNA Synthese.
Die unten exemplarisch dargestellten Anti-KC-4 humanisierten Antikörper umfassen die humanisierten variablen Regionen des Anti-KC-4 murinen/humanen chimären Antikörpers (US Patent Nr. 4,708,930 an Coulter offenbart die Anti-KC-4 Maus Antikörper Technologie) und die Kappa und Gamma 1 konstante Region eines humanen Antikörpers. Diese humanisierten Antikörper wurden durch ihre Molekulargewichte und Bindungsspezifitäten charakterisiert, und es wurde gezeigt, dass sie gut oder besser mit den korrespondierenden murinen und chimären Antikörpern für das KC-4 Antigen konkurrieren. Es wurde gezeigt, dass die humanisierten Antikörper schwach an normale Brust-, Lungen-, Kolon- und Endometrium- und stark an Karzinomgewebeschnitte in dem ABC Immunperoxidase Verfahren binden. Von den Abschnitten der CDR und GR Regionen der nicht modifizierten Peptide (murine F_v Regionen) und Effektoragenzien (humane F_C Regionen) wurde in beiden Fällen gezeigt, dass sie im Wesentlichen identisch mit jenen der murinen und humanen Antikörper sind, von denen sie erhalten wurden. Die erfindungsgemäßen Anti-KC-4 humanisierten Antikörper, denen alle nicht humanen konstanten Regionsequenzen fehlen, besitzen weniger fremde antigene Epitope als die gesamten murinen oder chimären Antikörper, von denen sie abgeleitet wurden. Folglich wird von ihnen erwartet, dass sie eine weniger komplexe immunogene Antwort im Menschen als die korrespondierenden gesamten murinen Antikörper und selbst als die murinen/humanen chimären Antikörper auslösen. Zu welchem Ausmaß jedoch ein Abschnitt der murinen GR Aminosäuren ohne Veränderung der Bindungseigenschaften der CDRs ausgetauscht werden kann, konnte vor dieser Erfindung nicht vorhergesagt werden aufgrund der substanziellen konformationellen Veränderungen in den inneren Regionen, welche die Bindung der CDRs an das Antigen beeinflussen, die bei Modifikation der Aminosäuresequenzen auftreten können.
Somit bindet der erfindungsgemäße, im Wesentlichen reine, isolierte Anti-KC-4 humanisierte Antikörper spezifisch und selektiv an das humane KC-4 Antigen, das in dem US Patent Nr. 4,708,930 beschrieben ist. Der Antikörper besteht aus einer leichten und einer schweren Kette, die im Wesentlichen aus der variablen Region der leichten und schweren Ketten des Anti-KC-4 murinen Antikörpers besteht, in denen die GRs mit sieben Aminosäuren in der leichten Kette und zwölf Aminosäuren in der schweren Kette substituiert sind, die an äquivalenten Positionen in Antikörpern von anderen Spezies vorkommen, und den konstanten Regionen eines humanen Antikörpers.
Das hier beschriebene Humanisierungsverfahren ist ausgelegt, um die potenziellen Verluste in der Antigen Bindungsaffinität zu minimieren, die von den eingeführten Aminosäuren herrühren kann. Im Falle des hier beschriebenen Anti-KC-4 humanisierten Antikörpers wurden sieben Aminosäure Änderungen in die variable Region der leichten Kette eingeführt, und zwölf Aminosäure Änderungen wurden in der variablen Region der schweren Kette durchgeführt. Um darüber hinaus die immunologische Antwort auf den humanisierten Antikörper zu minimieren, wurden humane Ziel Aminosäuresequenzen verwendet, welche die Konsensussequenzen aller geeigneter humaner variabler Regionen umfassen. Der Anti-KC-4 humanisierte Antikörper besteht im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz ID Nr. 50 aus Tabelle 24 und/oder der Sequenz ID Nr. 51 aus Tabelle 25.
Die vorliegenden Anti-KC-4 humanisierten monoklonalen Antikörper werden entweder als ein nacktes Peptid oder in glykosylierter Form bereitgestellt. Wenn sie in glykosylierter Form bereitgestellt werden, sind die Antikörper an (einen) Glykosylrest(e) angeheftet, der/die durch die eukaryonte Zelle bereitgestellt wird/werden, wenn es/sie exprimiert wird/werden. Wenn es kloniert und in einer prokaryonten Zelle exprimiert wird, wird es als das nackte Polypeptid bereitgestellt, und der/die Glykosylrest(e) kann/können später dazugefügt werden, zum Beispiel mittels Glykosyltransferasen, die im Stand der Technik bekannt sind.
Der erfindungsgemäße Anti-KC-4 humanisierte Antikörper kann auch als ein Radioisotop durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, hinzugefügt werden.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform umfasst der Anti-KC-4 humanisierte Antikörper den humanisierten Antikörper, der von der Hybridom Zelllinie exprimiert wird, welche die ATCC Zugangs Nr. HB 11,455 (HuKC-4V2) aufweist, hinterlegt unter dem Budapester Vertrag am 23. September 1993. Dieses Hybridom wurde als die beste Weise der Erfindung hinterlegt, die den Erfindern bekannt ist.
Die erfindungsgemäßen Anti-KC-4 humanisierten Antikörper werden auch als eine Zusammensetzung zusammen mit einem Träger oder Verdünnungsmittel zur Verwendung in vitro bereitgestellt, vorzugsweise einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel zur Verwendung in vivo und ex vivo. Der hier bereitgestellte Anti-KC-4 humanisierte Antikörper kann in der Zusammensetzung in einer Menge von ungefähr 0,001 bis 99,99 Gew.-%, weiter bevorzugt ungefähr 0,01 bis 20 Gew.-% und noch weiter bevorzugt ungefähr 1 bis 5 Gew.-% anwesend sein. Jedoch sind auch andere Mengen geeignet. Träger im Allgemeinen und pharmazeutisch verträgliche Träger im Besonderen sind im Stand der Technik bekannt und brauchen hier nicht näher beschrieben zu werden. Der Träger kann in einem getrennten sterilen Behälter oder in einem Gemisch mit dem Antikörper bereitgestellt werden. Typischerweise sind Salzlösung, wässrige alkoholische Lösungen, Albumin-Salzlösungen und Propylengykollösungen geeignet. Jedoch können auch andere verwendet werden. Wenn die Verwendung für therapeutische Zwecke erfolgt, muss das proteinöse Material in einer Reinheit vorliegen, die für die humane Verabreichung geeignet ist, und die Zusammensetzung kann andere Bestandteile enthalten, die im Stand der Technik bekannt sind. Beispiele dafür sind andere anti-neoplastische Arzneimittel, wie Adriamycin und Mitomycin, Cytoxan, PALA und/oder Methotrexat, und anderem. Jedoch können auch andere therapeutische Arzneimittel, Träger oder Verdünnungsmittel, immunologische Adjuvanzien und ähnliches hinzugefügt werden. Wenn die oben beschriebene Zusammensetzung für die in vivo Darstellung verwendet wird, kann sie ungefähr 0,001 bis 99,9 Gew.-% humanisierten Antikörper, und weiter bevorzugt ungefähr 0,01 bis 25 Gew.-% humanisierten Antikörper enthalten. Wenn die Zusammensetzung typischerweise für therapeutische Zwecke verwendet wird, kann sie ungefähr 0,001 bis 99,9 Gew.-% humanisierten Antikörper und weiter bevorzugt ungefähr 0,01 bis 30 Gew.-% humanisierten Antikörper enthalten. Wenn sie für die ex vivo Abführung von neoplastischen Zellen aus Körperflüssigkeiten, wie Spinalflüssigkeit, verwendet wird, kann die Zusammensetzung ungefähr 0,0001 bis 50 Gew.-% und vorzugsweise ungefähr 0,01 bis 20 Gew.-% humanisierten Antikörper aufweisen. Wenn sie in der in vitro Diagnose von Karzinomen eingesetzt wird, kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung ungefähr 0,001 bis 35 Gew.-% humanisierten Antikörper und weiter bevorzugt ungefähr 0,01 bis 10 Gew.-% humanisierten Antikörper aufweisen. Andere Mengen sind jedoch ebenfalls geeignet.
Solche Produkte finden eine Anwendung in der Behandlung von Krebs, wie unter anderem Brust-, Lungen-, Ovar-, Endometrium-, Pankreas-, Prostata- und Kolonkrebs, unter anderem. Die Anti-KC-4 humanisierten Antikörper können für die in vivo Behandlung oder Diagnose von Menschen verwendet werden. Die vorliegenden analogen Peptide sind insbesondere geeignet für die wiederholte Verabreichung an Menschen und für die Langzeittherapie, wie im Fall von Metastasen und/oder dem Wiederauftreten von Tumoren.
Ein hier bereitgestellter Kit für die Diagnose von Krebszellen umfasst den erfindungsgemäßen Anti-KC-4 humanisierten Antikörper und Anweisungen für seine Verwendung und wahlweise eine Positivkontrolle und heterologe Immunglobuline, die selektiv an die konstanten Regionen des Antikörpers binden, wie Protein G oder Protein A. Der diagnostische Kit kann auch mit einer Radioisotop oder einer fluoreszenten Markierung bereitgestellt werden.
Ein Krebspatient kann in vivo dargestellt und/oder durch die Verabreichung des erfindungsgemäßen Anti-KC-4 humanisierten Antikörpers in radioaktiv markierter Form diagnostiziert werden, in einer Menge die wirksam ist, den Ort des Krebses zu erreichen und die Krebszellen zu binden, und weiterhin der nicht invasive Nachweis irgendeiner lokalisierten Bindung des markierten Anti-KC-4 humanisierten Antikörpers an die Tumorzellen. Typischerweise kann der Anti-KC-4 humanisierte Antikörper in einer Menge von ungefähr 0,001 bis 5000 mg/kg Gewicht pro Behandlung, weiter bevorzugt ungefähr 0,01 bis 5000 μg/kg Gewicht pro Behandlung und weiter bevorzugt ungefähr 0,1 bis 500 μg/kg Gewicht pro Behandlung verabreicht werden. Jedoch können auch andere Mengen verwendet werden. Radioaktive Markierungen, die verwendet werden können, sind unter anderem ¹¹¹In, ¹²⁵I, ^99mTc und ¹³¹I. Diese Radioisotope können mit einem PET Scanner und mit einem NMR Darstellungs- und/oder Radioaktivität zählenden Apparat, in Abhängigkeit von der verwendeten radioaktiven Markierung nachgewiesen werden, die in der medizinischen Gemeinschaft weitreichend verwendet werden.
Ein Krebs kann in vitro durch Inkontaktbringen einer biologischen Probe mit dem hier beschriebenen Anti-KC-4 humanisierten Antikörper in Form eines Anti-KC-4 humanisierten Antikörper-Krebszellantigen Komplexes mit irgendeinem Krebs oder Krebs assoziierten Zellantigen, das in der Probe anwesend ist, und Nachweisen irgendeines gebildeten Komplexes diagnostiziert werden. Die biologische Probe wird typischerweise aus einem Menschen erhalten, der unter dem Verdacht steht, von Krebs betroffen zu sein. Geeignete biologische Proben sind unter anderem Serum, Blut, Sputum, Stuhl, Lymphflüssigkeit, Spinalflüssigkeit, Lungensekretionen und Urin. Eindeutig kann irgendeine Quelle von Fluid, Gewebe und ähnlichem hergestellt werden, um in diesem Verfahren verwendet zu werden, wie im Stand der Technik bekannt ist.
Von dem erfindungsgemäßen Anti-KC-4 humanisierten Antikörper wurde gezeigt, dass er Gewebespezifitäten ähnlich zu jenen des Anti-KC-4 murinen Antikörpers aufweist. Es wurde gezeigt, dass der Anti-KC-4 humanisierte monoklonale Antikörper spezifisch und stark an feste Tumorgewebe in der Lunge, dem Kolon, den Nieren, der Brust, dem Magen, der Prostata, dem Pankreas, dem Lymphknotendurchgang und Lymphomen bindet und nicht spezifisch und schwach an normales Brust-, Nieren- und Magengewebe bindet. Der Anti-KC-4 murine Antikörper zeigte auch eine geringe schwache Bindung an normales Gewebe, einschließlich Nabelschnur, Uterus, Schilddrüse, Zunge, Prostata, Milz, Nebenniere, Lunge, Gallenblase, Herz, Lymphknoten, Kolon, Leber, Gehirn, Hoden, Thymus und Plazenta (US Patent Nr. 4,708,930).
Die vorliegenden Anti-KC-4 humanisierten Antikörper sind auch für das Abführen von Krebszellen aus biologischen Proben verwendbar, egal ob Fluid- oder Gewebeproben. Das Ableiten von neoplastischen Zellen aus einer Fluidprobe ist Teil der Erfindung und kann durchgeführt werden, durch das Inkontaktbringen eines biologischen Fluids, das unter dem Verdacht steht, neoplastische Zellen zu enthalten, mit dem erfindungsgemäßen Anti-KC-4 humanisierten Antikörper und Bindenlassen des Antikörpers an irgendein KC-4 verwandtes Antigen, das in den Zellen anwesend ist, und Trennen des Anti-KC-4 humanisierten Antikörper-Zellkomplexes von dem verbleibenden Rest des Fluids.
Dieses Verfahren kann zum Ableiten von ungewünschten Zellen ex vivo verwendet werden durch Extrahieren einer biologischen Probe aus einem Patienten, Eliminieren der neoplastischen Zellen daraus durch Trennen des Anti-KC-4 humanisierten Antikörper-Zellkomplexes oder durch weiteres Hinzufügen eines Effektors, wie Komplement oder einem Toxin oder einer radioaktiven Markierung, der/die auf die Zellen einwirken kann, und anschließend Zuführen der abgeleiteten Probe an den Patienten. Dies ist typischerweise geeignet für die Verwendung mit spinaler Entnahme, wenn die Spinalflüssigkeit frei von Karzinomzellen vor ihrer Reinjektion ist. Andere Fluide können auch auf diese Weise behandelt werden.
Die vorliegenden humanisierten Antikörper können auch in der histochemischen Bewertung der Anwesenheit von Krebszellen in dem Gewebe verwendet werden, das von einem Patienten erhalten wurde, der unter dem Verdacht steht, von Krebs betroffen zu sein, wofür Verfahren verwendet werden, die im Stand der Technik Standard sind, wie die Herstellung von Gewebeschnitten und ihre Fixierung auf einem festen Substrat, um die Anwendung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers zu erlauben, und die anschließende Bewertung irgendeiner Bindung an neoplastische Zellen in der Probe, wie durch die Bildung von Komplexen zwischen dem Anti-KC-4 humanisierten Antikörper und Antigenen, an die er selektiv auf den Zellen bindet, angezeigt wird.
Das Wachstum oder die Größe eines primären oder metastasierenden Krebses kann inhibiert oder reduziert werden durch das Verabreichen einer wirksamen Menge des erfindungsgemäßen Anti-KC-4 humanisierten Antikörpers in radioaktiv markierter Form an einen Patienten, der eine Notwendigkeit für die Behandlung aufweist. Typischerweise kann der hier bereitgestellte monoklonale Antikörper in einer Menge von ungefähr 0,001 bis 2000 mg/kg Körpergewicht pro Dosis und weiter bevorzugt von ungefähr 0,01 bis 500 mg/kg Körpergewicht pro Dosis verabreicht werden. Wiederholte Dosen können nach der Verschreibung durch den behandelnden Arzt verabreicht werden. Jedoch sind auch andere Mengen geeignet. Im Allgemeinen wird die Verabreichung des erfindungsgemäßen Antikörpers durch Infusion durchgeführt, so dass die Menge der anwesenden radioaktiven Markierung, die eine schädigende Wirkung bilden kann, durch Variieren der Geschwindigkeit der Verabreichung unter Kontrolle gehalten werden kann. Typischerweise kann die Infusion einer Dosis einige Stunden dauern. Jedoch ist hier auch die konstante Infusion einer Dosis für therapeutische Zwecke umfasst, welche die Aufrechterhaltung einer konstanten Menge des erfindungsgemäßen Antikörpers im Serum erlaubt. Die Infusion des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers kann wie folgt durchgeführt werden. Ein intravenöser (I.V.) Schlauch kann vorbehandelt werden, z.B. mit 0,9 % NaCl und 5 % humanem Serumalbumin und für die intravenöse Verabreichung angeordnet werden. Die verschriebene Dosis des analogen Peptids kann wie folgt infundiert werden. Nicht markierte analoge Peptide können zuerst infundiert werden. 30 Minuten nach dem Abschluss der Infusion des nicht markierten Antikörpers können ¹¹¹In markierter und ⁹⁰Y markierter Antikörper gleichzeitig infundiert werden. Die I.V. Infusion kann ein Gesamtvolumen von 250 ml aus 0,9 NaCl und 5 % humanem Serumalbumin umfassen und über einen Zeitraum von ungefähr 2 Stunden in Abhängigkeit von irgendwelchen beobachteten geschwindigkeitsabhängigen Nebenwirkungen infundiert werden. Vitalitätszeichen sollten ermittelt werden, z.B. alle 15 Minuten, während der Infusion und jede Stunde nach der Infektion bis der Zustand stabil ist. Eine gründliche Herz-Lungen Untersuchung kann vor und bei Abschluss der Infusion durchgeführt werden. Arzneimittel einschließlich Acetaminophen, Diphenhydramin, Epinephrin und Kortikosteroide können zur Behandlung von allergischen Reaktionen bereit gehalten werden, sollten sie auftreten. Die Verabreichung des erfindungsgemäßen hybrid analogen Peptids kann wiederholt werden, wenn es der Arzt für wünschenswert hält. Typischerweise wird zunächst eine erste Dosis verabreicht, und die Darstellung zeigt an, dass es eine Verringerung in der Größe des Tumors geben könnte, egal ob primär oder metastasierend, dann werden wiederholte Behandlungen jeweils nach ungefähr 1 bis 100 Tagen und weiter bevorzugt ungefähr alle 2 bis 60 Tage verabreicht. Die wiederholten Behandlungen können für einen Zeitraum von bis zu 2 Jahren fortgesetzt werden, und unter einigen Umständen sogar für längere Zeiträume bis der/die Tumor(e) vollständig verschwunden ist/sind. Die Verabreichung des erfindungsgemäßen radioaktiv markierten Antikörpers ist typischerweise für die therapeutischen Zwecke nützlich, wenn zum Beispiel ein Primärtumor entfernt wurde. So ist er primär für die Anschlusstherapie ("mopping-up" Therapie) nach chirurgischem Eingriff oder für die Anwendung in Fällen von krebsartigen Metastasen vorgesehen. In diesen Fällen ist das vorliegende Verfahren von größter Nützlichkeit.
Ein reines, isoliertes Polydesoxyribonukleotid, das den erfindungsgemäßen Anti-KC-4 humanisierten Antikörper kodiert, kann in der Herstellung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers eingesetzt werden. In einer Ausführungsform der Erfindung besteht das erfindungsgemäße Polydesoxyribonukleotid im Wesentlichen aus einer DNA Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den DNA Sequenzen ID Nr. 48 und/oder 49 aus den Tabellen 21 und 22. Diese DNA Sequenzen können für die Expression unter denselben Promotor kloniert werden.
Ebenfalls bereitgestellt wird hier ein Hybridvektor, der einen Vektor umfasst, der das erfindungsgemäße Polydesoxyribonukleotid funktionell damit verbunden trägt. Typischerweise sind Vektoren geeignet, die in der Lage sind, sowohl in eukaryonten als auch prokaryonten Zellen zu replizieren. Wenn die Herstellung eines glykosylierten analogen Peptids gewünscht ist, sollte der Vektor für die Transfektion von eukaryonten Wirtszellen geeignet sein.
Diese Erfindung umfasst auch eine Wirtszelle, die mit dem oben beschriebenen Hybridvektor transfiziert wurde. Geeignete Wirte sind prokaryonte und eukaryonte Wirte, wie unter anderem Bakterien, Hefe und Säugerzellen, wie Insektenzellen und nicht produzierende Hybridomzellen. Geeignete Vektoren und/oder Plasmide für die Transfektion jedes dieser Typen von Wirten sind im Stand der Technik bekannt und brauchen hier nicht näher beschrieben zu werden. Ebenfalls im Stand der Technik bekannt sind Verfahren zur Klonierung von DNA Sequenzen in jeden dieser Typen von Vektoren und zum Transfizieren der verschiedenen Typen von Wirtszellen. Besonders bevorzugt ist die Zelllinie mit der ATCC Zugangs Nr. HB 11,455 (HuKC4V2).
Die Polyribonukleotide können durch Transkription der oben beschriebenen Polydesoxyribonukleotide, wie im Stand der Technik bekannt ist, erhalten werden. Bereitgestellt werden hier Polyribonukleotide, die im Wesentlichen aus Oligoribonukleotiden bestehen, welche variablen Regionen des Anti-KC-4 humanisierten Antikörpers und die konstanten Regionen eines humanen Antikörpers kodieren. Die Polyribonukleotide können hergestellt werden durch Klonieren der gewünschten DNA Segmente und dem anschließenden Transkribieren der so erhaltenen Hybridpolydesoxyribonukleotide in die korrespondierenden RNA Sequenzen.
Der erfindungsgemäße Anti-KC-4 humanisierte Antikörper kann durch Klonieren des Polydesoxyribonukleotids, das den erfindungsgemäßen Antikörper kodiert, in einen Vektor, um einen Hybridvektor zu bilden, Transfizieren einer Wirtszelle mit dem Hybridvektor und Zulassen der Expression des Anti-KC-4 humanisierten Antikörpers und Isolieren des Antikörpers aus dem Zellkulturgemisch hergestellt werden. Das DNA Segment, das den Anti-KC-4 humanisierten Antikörper kodiert, kann durch chemische Synthese oder durch seitenspezifische Modifikation der DNA Sequenz, welche die variable Region des Anti-KC-4 murinen oder murinen/humanen chimären Antikörpers kodiert, durch PCR Amplifikation mit spezifisch gestalteten Primern, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden. Vorzugsweise werden die Klonierungs- und Transfektionsschritte durchgeführt durch das Klonieren der Polydesoxyribonukleotide, welche die variable Region der schweren oder leichten Ketten des Anti-KC-4 murinen Antikörpers kodiert, in ein DNA Segment, das die Gene für die humanen konstanten Regionen trägt, und das Zulassen, dass die Antikörper Ketten exprimiert werden. Die exprimierten Antikörper Ketten können anschließend miteinander interagieren, um den doppelkettigen Antikörper, der wie oben beschrieben modifiziert ist, zu bilden.
Nachdem diese Erfindung jetzt allgemein beschrieben wurde, wird sie besser unter Bezugnahme auf bestimmte spezifische Beispiele verstanden, die hier nur zum Zweck der Darstellung eingeschlossen sind, und die nicht beabsichtigen, die Erfindung auf irgendeine Ausführungsform davon zu beschränken, außer es ist derart angegeben.
BEISPIELE
Beispiel 1: Verwendete Verfahren
Die hier verwendeten Verfahren für die reverse Transkription (RT) von RNAs, welche die variablen Regionen kodieren und die anschließende Amplifikation der cDNAs durch die Polymerase Kettenreaktion (PCR), wurden beschrieben (Orlandi, R., et al., "Cloning Immunoglobulin Variable Domains for Expression by the Polymerase Chain Reaction", PNAS (USA) 86:3833-3837 (1989); Coloma, M.J., et al., "Primer Design for the Cloning of Immunoglobulin Heavy-Chain Leaders-Fvs from Murine Hybridoma Cells Using the PCR", Bio. Techniques 11:152-156 (1991); Gavilondo-Cowley, J.V., et al., "Specific Amplification for Rearranged Immunoglobulin Fv Genes for Murine Hybridoma Cells", Hybridoma 9:407-417 (1990)).
Gesamt RNA ist ein adäquates Substrat für RT-PCR. Polyadenylierte RNA wurde jedoch hier verwendet, weil sie nur geringe Mengen von kontaminierender ribosomaler RNA und praktisch keine DNA enthält. Die polyadenylierte RNA wurde mit einem Fast Track mRNA Isolierungskit (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) isoliert.
Die Oligonukleotide wurden auf einem PCR-Mate EP DNA Synthetisiergerät Modell 391 (Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisiert. Ein PCR muriner Ig Primersatz wurde von Novagen (Madison, WI) bezogen, und komplementäre DNA (cDNA) wurde mit einem RNA PCR Kit (Perkin Elmer-Cetus, Norwalk, CT) hergestellt.
PCR DNA Fragmente wurden direkt in pCR1000 unter Verwendung eines TA Klonierungskits (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) kloniert. Plasmid DNA wurde mit einem Kit, der von Quiagen (Tchapsworth, CA) bezogen wurde, isoliert, und DNA Sequenzierung wurde mit einem Sequenase 2.0 DNA Sequenzierungskit (United States Biochemical, Cleveland, Ohio) unter Verwendung von wässrigem 5'α-³⁵SdATP bei 600 mCi/mmol (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL) durchgeführt.
Die Sequenzanalysen wurden auf einem Macintosh Computer unter Verwendung des Programms GeneWorks (IntelliGenetics, Inc., Mountain View, CA) durchgeführt.
Beispiel 2: PCR Primer, die in der ersten Isolierung von Anti-KC-4 cDNAs verwendet wurden
Die PCR Primer wurden von Novagen (Madison, WI) bezogen. Ihre Sequenzen, die aus einer Broschüre, die von Novagen bereitgestellt wurde, reproduziert wurden, sind in Tabelle 10 unten gezeigt.
Tabelle 10: PCR Primersequenzen
Beispiel 3: Amplifikation von cDNAs, die Anti-KC-4 Antikörper F_v Regionen kodieren
Die cDNAs, die das Anti-KC-4 murine Immunglobulin V_H und V_L kodieren, wurden durch PCR aus polyadenylierter RNA hergestellt, die aus 100 Millionen KC-4 Hybridomzellen isoliert wurde. Alle Klone wurden von unabhängigen PCRs erhalten. Diese Sequenzen der Primer sind in Beispiel 2 oben angegeben. Die Primer sind spezifisch für entweder die Leader Peptidregion oder für die konstanten Regionen. Die Primerkombinationen, die verwendet wurden, sind in Tabelle 11 unten gezeigt.
Tabelle 11: Primerkombination für PCR Amplifikationen
Beispiel 4: Isolierung von amplifizierten Anti-KC-4 V_L und V_H cDNA und Sequenzen
Die PCR Produkte wurden ohne vorherige Reinigung in pCR1000 (Invitrogen) kloniert und in beide Richtungen sequenziert. Die V_H und V_L DNA Sequenzen und ihre abgeleiteten Proteinsequenzen sind in den Tabellen 12, 13, 14 und 15 unten gezeigt.
Tabelle 12: V_L Nukleotidsequenzen Anti-KC-4 V_L (kII-Jk2)
Tabelle 13: V_H Nukleotidsequenzen Anti-KC-4 V_H (IIID-D9-JH3)
Diese cDNA Sequenzen sind korrekt, weil sie in beiden Fällen identisch für Klone waren, die durch unabhängige reverse Transkriptionsreaktionen hergestellt wurden. Die abgeleiteten Proteinsequenzen sind in den Tabellen 14 und 15 unten gezeigt.
Tabelle 14: V_L Anti-KC-4 Aminosäuresequenzen (kII-Jk2)
Tabelle 15: Anti-KC-4 V_H Aminosäuresequenzen (IIID-D9-JH3)
Die Sequenzen wurden interpretiert, wie bei Kabat et al. (1991), supra, beschrieben. Die unterstrichenen Reste in den Proteinsequenzen entsprechen den PCR Primern. Die reifen V_L und V_H Ketten beginnen jeweils bei den Aminosäuren D und E von Gerüst 1 (GR1).
Die Gerüst – und CDR Proteinsegmente wurden gemäß Kabat et al. (1991), supra, identifiziert. V_L ist eine Gruppe II κ Kette. Ein Teil der CDR 3 und das gesamte Gerüst 4 (GR4) werden von Jk2 kodiert. V_H gehört zu der Gruppe IIId. CDR3 und GR4 stammen von einer genomischen Rekombination, welche die Minigene D9 und JH3 betraf. Es gibt eine Asparaginglykosylierungsstelle in der leichten Kette in GR3. Die Stelle liest sich NIS (Asn Ile Ser).
Beispiel 5: Vergleich der cDNA abgeleiteten Aminosäuresequenz mit der direkt bestimmten N-terminalen Fragmentsequenz
Ein Vergleich zwischen der cDNA abgeleiteten Polypeptidsequenz und der Aminosäuresequenz, die direkt aus dem gereinigten Anti-KC-4 monoklonalen Antikörper bestimmt wurde, wurde angestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 unten gezeigt.
Tabelle 16: Vergleich von cDNA abgeleiteten mit direkt bestimmten N-terminalen Aminosäuresequenzen
Eine Probe aus Anti-KC-4 chimärem Antikörper (ungefähr 190 μg) wurde mit 5 beta-Mercaptoethanol (65°C für 15 Min.) reduziert, auf drei Spuren eines 10 % SDS Polyacrylamidgels getrennt und auf eine ProBlott Membran (Applied Biosystems, Foster City, CA) in 90 % 30 mM CAPS pH 11, 10 % Methanol für 1 Stunde bei 25 V und bei 4°C elektrogeblottet. Die transferierten Proteinspezies wurden mit Commassie Brilliant Blue gefärbt. 3 Banden wurden in jeder Spur beobachtet, von denen 2 wie erwartet für eine schwere und leichte Kette wanderten. Die dritte Bande wanderte oberhalb der leichten Kette. Es wurde ein direktes Aminosäure Sequenzieren mit den immobilisierten Banden durch die Technology Instrumentation Facility, Universität von Kalifornien, Riverside, durchgeführt. Die Aminosäure sequenz, die hier angegeben ist, ist die beste Vermutung der die Sequenzierung durchführenden Person.
Die starke Übereinstimmung zwischen der abgeleiteten Aminosäuresequenz und der direkt bestimmten aminoterminalen Sequenz zeigt, dass die klonierten cDNAs die authentische Anti-KC-4KC-4 F_v Region kodieren.
Beispiel 6: Konstruktion von Vektoren, die einen murinen-humanen chimären Anti-KC-4 Antikörper exprimieren
Die zwei Expressionsvektoren pAG4622 und pAH4604 sind in Coloma et al. (Coloma, M.J., et al., "Novel Vectors for the Expression of Anitbody Molecules Using Variable Regions Generated by PCR", J. Immunol. Methods 152:89-104 (1992)) beschrieben. Sie wurden freundlicherweise von S.L. Morrison (Dept. of Microbiology and Molecular Genetics, UCLA), US Anmeldungs Serial No. 07/798,696; PCT/US91/10207, bereitgestellt. Die Konstruktion und Expression von chimären Genen wurde durchgeführt, wie von Coloma et al., supra, beschrieben.
Die in einer PCR synthetisierten und verwendeten Oligonukleotide, um V_H und V_L Fragmente mit den korrekten Enden für die Insertion in die pAG4622 und pAH4604 Expressionsvektoren bereitzustellen, sind in Tabelle 17 unten gezeigt.
Tabelle 17: PCR Primersequenzen
Die original pCR1000 Klone waren die Ausgangsmatrizen für die PCR. Die neuen PCR Produkte wurden in pCR1000 zurück kloniert und ihre Sequenz bestätigt.
Korrekt modifizierte und amplifizierte Fragmente wurden mit entweder EcoR V und Sal I (für V_L) oder mit EcoR V und Nhe I (für V_H) ausgeschnitten. Diese Fragmente wurden anschließend in die jeweiligen Vektoren ligiert, die mit den geeigneten Restriktionsenzymen aufgeschnitten wurden. Beide Vektoren und die Inserts wurden aus einem Agarosegel vor der Ligation gereinigt, wofür der Bio101 GeneClean Kit (Glaskügelchen) (La Jolla, CA) verwendet wurde.
Beispiel 7: Expression des Anti-KC-4 chimären Antikörper Gens
Sobald sie in pAG4622 und pAG4604 eingebaut waren, wurden die V_H und V_L kodierenden Regionen in den Anti-KC-4 murinen-humanen chimären Antikörper Konstrukten nochmals sequenziert, um ihre Korrektheit sicherzustellen. Die Transfektion der nicht produzierenden Myelom Zelllinie SP2/0-Ag14 (ATCC Nr. CRL 1581) und die Isolierung des Polypeptids wurde durchgeführt, wie in Coloma et al., (1992), supra, beschrieben.
Beispiel 8: Herstellung von chimärem Antikörper in transfizierten Wirten
Nach zehn Tagen wurden stabil transfizierte Kolonien eindeutig mit einer Frequenz von ungefähr 1/10.000 etabliert. Die transfizierten Zellen wurden entweder in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DME): fötales Rinderserum (FBS), 90:10 (v/v) oder in einem Gemisch aus DME:RPMI:FBS, 45:45:10 (v/v/v) oder RPMI:FBS, 90:10 (v/v) kultiviert. Penicillin und Streptomycin wurden hinzugefügt, um bakterielles Wachstum zu verhindern. Histidinol wurde zu dem Medium in 5 mM hinzugefügt, um hinsichtlich Transfektionen zu selektieren. Die Kolonien wurden in normales Medium (ohne Histidinol) überführt, und die Überstände von stabilen Transfektanten wurden hinsichtlich der Anwesenheit des murinen-humanen chimären Anti-KC-4 Antikörpers untersucht. Dies wurde durchgeführt, indem der sekretierte murine-humane chimäre Anti-KC-4 Antikörper mit einem Platten gebundenen Ziege Anti-Human-κ Antikörper gefangen und mit Ziege Anti-Human-γ Antikörper, wie bei Coloma et al. beschrieben, mit den folgenden Modifikationen, entwickelt. Der hier verwendete sekundäre Antikörper wurde radioaktiv mit ¹²⁵I markiert.
Beispiel 9: Bestätigung der Anti-KC-4 murinen-humanen chimären Antikörper Expression
Die Überstände wurden hinsichtlich der Bindung an humanes Milchfettglobulin (HMFG), wie von Ceriani et al. (Ceriani, R.L., et al., Diagnostic Ability of Different Human Milk Fat Globule Antigens in Breast Cancer", Breast Cancer Res. Treat. 15:161-174 (1990)) beschrieben, untersucht. HMFG wurde an die Mikrotiter Platten wie zuvor beschrieben gebunden (Ceriani R.L., "Solid Phase Identification and Molecular Weight Determination of Cell Membrane Antigens with Monoclonal Antibodies", in: Monoclonal antibodies and functional cell lines. Progress and application, Bechtol, K.B., McKern, T.J., and Kennett, R., Hrsg., Plenum Press, New York, S. 398-402 (1984)). Der gebundene Anti-KC-4 chimäre Antikörper (an die Kappa Kette des polyklonalen Antikörpers HMFG) wurde mit entweder Ziege Anti-Human Gamma Kette oder Ziege Anti-Human Kappa Kette polyklonalen Antikörpern, die an ¹³⁵I konjugiert waren, nachgewiesen. Die meisten Kolonieüberstände waren in beiden Assays positiv. Die Kolonien, welche die größten Mengen an chimärem Antikörper in die Überstände sekretierten, wie durch diese Assays bestimmt wurde, wurden subkloniert.
Beispiel 10: Western Blot
75 μl des Kulturüberstandes wurde zu 20 μl 4 × Laemmli Puffer und 5 μl β-Mercaptoethanol hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei 65°C für 15 Min. erhitzt, um die Antikörper Disulfidbrücken zu reduzieren und somit die schweren von den leichten Ketten zu trennen. 20 μl der behandelten Probe wurde in doppelten Spuren auf einem 10 % SDS Polyacrylamidgel zusammen mit anderen Antikörpern, die ähnlich behandelt wurden, und die zum Vergleich aufgetragen wurden, chromatographiert. Vorgefärbte Größenmarker (BioRad, Richmond, CA) wurden ebenfalls aufgetragen.
Die chromatographierten Proteine wurden auf eine ProBlott Membran (Applied Biosystems, Foster City, CA) in 90 % 30 mM CAPs pH 11, 10 % Methanol für 1 Stunde bei 25 V und bei 4°C elektrogeblottet. Die Membran wurde in 2 Teilen, die identische Antikörper Proben enthielt, ausgeschnitten. Die 2 Membrane wurden in 20 % bovines Kälberserum in PBS eingetaucht und langsam bei Raumtemperatur für 1 Stunde 35 Min. geschüttelt. ¹²⁵I markierter Ziege Anti-Human κ Kette Antikörper wurde zu einer Membran hinzugefügt, und ¹²⁵I markierter Ziege Anti-Human γ Kette Antikörper wurde zu der anderen Membran hinzugefügt. Die Antikörper waren bei einer spezifischen Aktivität von ungefähr 10 mCi/mg unter Verwendung des Chloramin T Verfahrens, das von Ceriani, R.L. und Blank, E.W. (1988) beschrieben ist, markiert, die markierten Antikörper wurden auf 4.000 cpm/μl in RIA Puffer verdünnt.
Nach Inkubation für 3 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Blots zweimal in TBS für 10 Min. jedes Mal gewaschen, einmal in TBST (50 mM TRIS pH 7,5, 3 mM EDTA 25 mM NaCl), 10 Min. und einmal mehr in TBS (TBS mit 0,05 % Tween 20) für 10 Min. Die Membrane wurden getrocknet und gegenüber Kodax XAR Film exponiert.
Die Western Blot Analyse von Kulturüberständen zeigte, dass drei Antikörper Ketten exprimiert wurden, die den drei Antikörper Ketten entsprachen, die in dem original Anti-KC-4 murinen Antikörper beobachtet wurden. Es gab eine schwere Kette, die mit Ziege Anti-Human γ Kette ¹²⁵I markiertem Antikörper gefärbt wurde, und zwei leichte Ketten, die mit Ziege Anti-Human κ Kette ¹²⁵I markiertem Antikörper gefärbt wurden (Figur nicht gezeigt).
Die Behandlung des original Anti-KC-4 murinen Antikörpers mit N-Glykosidase F (Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) nach den Empfehlungen des Herstellers, führte zu einem merklichen Abfall in der Intensität der "oberen" leichten Kette und einem gleichzeitigen Anstieg in der Intensität der unteren leichten Kette (Figur nicht gezeigt).
Die Erklärung für die Existenz einer zusätzlichen leichten Kette ist die, dass die Kette glykosyliert ist. Drei Beweislinien substantiieren dies. Zunächst der Nachweis einer Asparagin verknüpften Glykosylierungsstelle in der Aminosäuresequenz der leichten Kette. Dies ist die Dreiergruppe NIS (Asn-Ile-Ser) in Gerüst 3. Zweites der Abfall in der Intensität in der putativen glykosylierten Bande nach der Behandlung mit N-Glykosidase F während gleichzeitig die Intensität der nicht glykosylierten Bande anstieg. Schließlich werden 2 korrespondierende leichte Ketten Banden in der chimären Antikörper Version beobachtet.
Die zusätzliche leichte Kette in der chimären Version kann keine Kontaminante sein, weil sie spezifisch durch Ziege Anti-Human κ Kette Antikörper gefärbt wurde. Sie kann nur ein Produkt sein, das von pAG4622 exprimiert wurde. Somit müssen die beiden leichten Ketten dieselbe V_L Aminosäuresequenz und dieselbe humane konstante Region aufweisen. Diese Beobachtungen zeigen, dass ungefähr die Hälfte der leichten Ketten von beiden Anti-KC-4 murinen und chimären Antikörpern an der Asparagin ähnlichen Glykosylierungsstelle glykosyliert sind.
Beispiel 11: Gewebebindungsstudien
Die Überstände von stabilen Transfektanten wurden hinsichtlich der Anwesenheit des Anti-KC-4 murinen-humanen chimären Antikörpers, wie beschrieben, unter Verwendung des Vectastain ABC Verfahrens (Vector Labs, Burlingame, CA) untersucht.
Der chimäre Antikörper, der in den Überstand sekretiert wurde, band sowohl HMFG als auch BEM sehr stark. Zusätzlich wurden die Überstände, die Anti-KC-4 murinen-humanen chimären Antikörper enthalten, verwendet, um humane Brustkarzinom Gewebeschnitte unter Verwendung der Immunperoxidase immunhistochemischen Färbetechnik zu färben. Die Intensität der Färbung war vergleichbar mit jener, die mit dem original murinen monoklonalen Antikörper erhalten wurde. Der Anti-KC-4 monoklonale Antikörper ist bekannt, dass er das humane Milch fettglobulin und das Brust epitheliale Mucin bindet. Die Bindungsspezifität des Anti-KC-4 murinen monoklonalen Antikörpers wurde selbst nach dem rekombinanten Verfahren aufrechterhalten. Der Anti-KC-4 chimäre Antikörper band sehr stark an HMFG und BEM, wie durch einen Radioassay bestimmt wurde (Ceriani, et al., Breast Cancer Res. Trent. 15:161 (1990)). Zusätzlich band der Anti-KC-4 chimäre Antikörper verschiedene humane Brusttumore in histopathologischen Schnitten in einer Weise, die mit dem Anti-KC-4 murinen monoklonalen Antikörper vergleichbar ist, wie durch Immunfärbung unter Verwendung des Vectastain ABC Verfahrens (supra) nachgewiesen wurde. Diese Bindungsspezifität zeigte die zurückgehaltene Bindungsreaktivität der variablen Regionen des Anti-KC-4 murinen Antikörpers durch das erfindungsgemäße Polypeptid, wenn es an das humane F_C Fragment angeheftet war.
Beispiel 12: Ansatz für Humanisierung von Antikörpern
Der vorliegende Humanisierungsansatz beruht auf Padlan, E.A., "Choosing the Best Framework of Use in the Humanization of an Antibody by CDR-Grafting: Suggestions from 3-D Structural Data", Antibody Engineering 2. jährliche Konf. San Diego, CA (16. – 17. Dez. 1991).
Die reine Spezifität kann in "humanisiertem" Antikörper nur erhalten werden, wenn die CDR Strukturen, ihre Interaktion miteinander und ihre Interaktion mit dem Rest der variablen Domänen erhalten werden kann (Padlan, E.A. (1991), supra). Dies benötigt den Erhalt von Resten der GR Aminosäuren, welche die CDRs kontaktieren, jene, die in den V_L-V_H Kontakt involviert sind, und jene, die verdeckt sind und die Gesamtdomänen Struktur und die Struktur der Kombinierungsstelle beeinflussen könnten.
Durch Untersuchung der murinen Fab Strukturen, für die atomare Koordinaten zur Verfügung stehen, können die GR Aminosäuren, die wahrscheinlich "wichtig" für die Aufrechterhaltung der Struktur in der Kombinierungsstelle sind, bestimmt wer den (Padlan, E.A., 8. Internationaler Kongress für Immunol., Budapest, Ungarn, Zusammenfassungen S. 19 (2. – 28. August 1992)).
Die Spezifität eines Antikörpers hängt von den CDR Strukturen und manchmal auch von ihren benachbarten Resten ab. Diese CDR Strukturen hängen wiederum von Kontakten mit Gerüst Aminosäuren und von der Interaktion der V_L und V_H Domänen ab. Um somit die Beibehaltung der Bindungsaffinität sicherzustellen müssen nicht nur die CDR Reste bewahrt werden, sondern auch jene GR Reste, die entweder die CDRs oder ihre gegenüberliegenden Domänen kontaktieren, ebenso wie alle verdeckten Reste, die den variablen Domänen Form geben. Die verdeckten Reste sind exakt an denselben Positionen in den humanen und in den murinen Gerüsten angeordnet (Padlan, E.A., "A Possible Procedure For Reducing the Immunogenicity of Antibody Variable Domains While Preserving Their Ligand-Binding Properties", Molecular Immunology 28:489-498 (1991)).
Dieser Ansatz wurde verwendet, um humanisierte Analoga der variablen Regionen der erfindungsgemäßen murinen Antikörper zu gestalten. Die Humanisierung oder die Gestaltung der exemplarischen analog Peptide, die hier bereitgestellt werden, wurde wie folgt unternommen. Die Identifizierung der Reste, die am wahrscheinlichsten "wichtig" beim Erhalt der Kombinierungsstellen Struktur sind, erlaubt die Selektion der besten humanen GR Sequenzen, um sie in der "Humanisierung" jedes erfindungsgemäßen chimären Antikörpers bekannter Struktur oder analogen Peptids zu verwenden. Die Ergebnisse der Analyse können auch verwendet werden, um vorherzusagen, welche GR Aminosäuren wahrscheinlich in jenen Fällen erhalten bleiben sollten, wo keine dreidimensionalen Strukturdaten zur Verfügung stehen.
Das vorliegende Verfahren wurde gestaltet, um die Immunogenität von xenogenen Antikörpern durch Herstellung ihrer chimären Derivate oder Fragmente davon zu verringern, während ihre Antigen bindenden Eigenschaften erhalten bleiben. Im Allgemeinen sind die Antigen Bindungseigenschaften eines Antikörpers primär durch seine CDRs bestimmt. Die CDRs des murinen Antikörpers wurden deshalb vollständig erhalten. Zusätzlich wurden auch die GR Aminosäuren in dem murinen Antikörper, die als wahrscheinlich wichtig bei der Aufrechterhaltung der Kombinierungsstellen Struktur bewertet wurden, in dem humanisierten Molekül erhalten. Die verbleibenden GR Aminosäuren wurden ausgetauscht, um mit jenen der gewählten humanen GR zusammenzupassen.
Beispiel 13: Wahl des murinen Modells von bekannter Struktur zur Humanisierung von Anti-KC-4 Antikörper
Die Klassifizierung der V_H und V_L Domänen eines Antikörpers, wie dem Anti-KC-4 Antikörper, wurde gemäß Kabat et al. (Kabat E.A., et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH (1991)) durchgeführt. Die KC-4G3 Kappa Kette V_L Domäne gehört zur Gruppe II, und die V_H Domäne gehört zur Gruppe IIId. Ein muriner Antikörper wurde anschließend gefunden, dessen Struktur bestimmt wurde und dessen variable Regionen zu denselben Klassen gehören. Der Anti-Myohämerythrin Peptid Antikörper B13I2 erfüllt diese Voraussetzungen, weil er, wie der Anti-KC-4 murine Antikörper, V_L und V_H Domänen aufweist, die zu den Gruppen II und IIId gehören (Stanfield, R.L., et al., "Crystal Structures of an Antibody to a Peptide and its complex with Peptide Antigen at 2.8 Å"; Science 248:712-719 (1990)). Somit sollten die dreidimensionalen Strukturen von Antikörpern aus Anti-KC-4 und B13I2 Antikörper ähnlich sein, und die Humanisierung des Anti-KC-4 Antikörpers kann nach B13I2 modelliert werden.
Beispiel 14: Wahl von humanem Zielgerüst für die Humanisierung von chimärem Anti-KC-4 Antikörper
Die Wahl des humanen Zielgerüsts beruhte strikt auf der Ähnlichkeit der Reste, die als strukturell wichtig gemäß dem B13I2 Modell bewertet wurden. Dies sind nur Aminosäuren, die in Kontakte mit CDRs auf der gegenüberliegenden Kette involviert sein können oder Aminosäuren, von deren Seitenketten vorhergesagt wurde, dass sie nach innen gerichtet sind. Diese Positionen dieser Aminosäuren sind in Tabelle 18 unten gezeigt.
Tabelle 18: Wichtige Aminosäure Positionen für Anti-KC-4 Antikörper
Das Nummerierungssystem ist herkömmlich akzeptiert (Kabat, et al. (1991), supra) und ist in den Tabellen 10 und 11 oben gezeigt. In diesem Fall wurden die Konsensussequenzen für alle humanen F_v Regionen als das humane Ziel Gerüst ausgewählt, um die Immunogenität des Produkts zu minimieren.
Zunächst wurden die Sequenzen der murinen variablen Ketten mit den Konsensussequenzen für alle bekannten humanen variablen Regionklassen ausgerichtet (Herron, J.N., (1989), supra), und die Zahl der Unterschiede in den Aminosäuren, die von dem murinen erhalten bleiben müssen, wurden bewertet. Die Positionen dieser Aminosäuren wurden von jenen des B13I2 murinen monoklonalen Antikörpers erhalten, der gewählt wurde, um die Humanisierung des Anti-KC-4 Antiköpers zu modellieren.
Basierend auf diese Bewertungen wurden die Konsensussequenzen humaner Gerüste, die zu den Gruppen V_KII und V_HIII gehören, ausgewählt, um die Anti-KC-4 murinen Antikörper CDRs plus andere wichtige Aminosäuren zu erhalten.
Beispiel 15: Identifizierung von murinen-humanen Anti-KC-4 Antikörper Unterschieden
Die original murinen Sequenzen (Anti-KC-4 V_K oder V_H) wurden mit ihren nähesten humanen (human KII oder HIII) verwandten (siehe Beispiel 14 oben) ausgerichtet, und die Unterschiede in den GR Aminosäuren wurden notiert. Im vorliegenden Beispiel war es beabsichtigt, so viele Aminosäuren wie möglich zu substituieren, um von der murinen zu den humanisierten variablen Konsensussequenzen zu gelangen, wobei die wichtigen Aminosäuren intakt blieben, wie in den Beispielen 14 und 16 beschrieben ist. Die Aminosäuren, die für die Erhaltung ausgewählt wurden, waren ein Untersatz jener, die oben aufgelistet sind. Diese wurden durch Analogie zu der B13I2 Sequenz ausgewählt. Die einzige Ausnahme war der Glycin (100) Rest des original Gerüsts der variablen Region der murinen Kappa Kette, der erhalten blieb obwohl er nicht von Tabelle 18 oben umfasst war, weil angenommen wurde, dass er die variable Domäne der schweren Kette kontaktieren könnte. Solche Kontakte wurden in mindestens Fab beobachtet, die kein Gly an dieser Position aufwiesen.
Beispiel 16: Identifizierung von wichtigen murinen Anti-KC-4 Antikörper Aminosäuren
Die "wichtigen" murinen Aminosäuren wurden für die Erhaltung basierend auf den Kontakten einer bestimmten Aminosäure mit den CDRs, und mit den gegenüberliegenden Ketten und/oder ob ihre Seitenketten nach innen oder nach außen gerichtet waren, ausgewählt. Die Positionen dieser "wichtigen" Aminosäuren wurden basierend auf der Untersuchung der bekannten Strukturen von anderen Antikörpern bestimmt.
Die meisten der "wichtigen" Aminosäuren wurden auf der Basis der Struktur des Antikörpers B13I2 und gemäß den Tabellen 2, 3, 4, 5, 6, 8 und 9 oben ausgewählt.
Die Endauswahl der Aminosäurepositionen für die tatsächliche Mutation wurde durch Vergleichen der Position von allen Aminosäuren, die Kandidaten für Mutation sind, mit jenen, die "wichtig" sind und erhalten bleiben sollten, erreicht. Irgendeine "wichtige" Aminosäureposition wurde aus der Liste der Kandidaten eliminiert. Tabelle 19 unten zeigt die Aminosäuren, die für die Veränderung in der murinen Sequenz ausgewählt wurden, um die humanisierte Sequenz in dem vorliegenden beispielhaften Analogon zu erhalten.
Tabelle 19: Anti-KC-4 murine Antikörper Variable Region Aminosäuren, die für Mutation ausgewählt wurden
Der Austausch N ----> K an Position 74 in der variablen leichten Kette eliminiert bekanntermaßen eine N-verknüpfte Glykosylierungsstelle, die in dem original murinen monoklonalen Antikörper anwesend war.
Beispiel 17: Einführung von Veränderungen in die Aminosäuresequenz zur Humanisierung von Anti-KC-4 Antikörper
Die Einführung der Änderungen in die Aminosäuresequenz wurde wie folgt durchgeführt. Die DNA, die jede humanisierte variable Region kodiert, wurde in einer einzelnen Polymerase Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von überlappenden Oligonukleotiden in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das von Ye et al. (Ye, Q-Z, Jonhson, L.L., und Baragi, V., "Gene Synthesis and Expression in E. coli for PUMP, a Human Metalloproteinase" BBRC 186(1):143-149 (1992)) beschrieben ist, synthetisiert. Die Sequenzen der Oligonukleotide sind in Tabelle 20 unten gezeigt.
Tabelle 20: Primer für die Humanisierung von Anti-KC-4 murinen Antikörper Variablen Regionen
Beispiel 18: Synthese von Primern für die Humanisierung von Anti-KC-4 Antikörper
Alle Primer wurden auf einem PCR-Mate EP DNA Synthetisiergerät Modell 391 (Applied Biosystems, Foster City, CA) unter Verwendung von 40 nmol Säulen, Zyklus 1:63, mit Trityl aus, synthetisiert. Keines wurde vor der Verwendung gereinigt. Ihre Sequenzen sind in Tabelle 20 oben gezeigt.
Beispiel 19: Synthese von Anti-KC-4 humanisierten schwere Kette Variablen Regionen
Ein Gemisch aus PCR Primern wurde hergestellt, wobei jeder Primer in einer Konzentration von 10 pmol/μl in Wasser anwesend war.
Vier 101'mer Oligonukleotide (JO61, JO62, JO63 und JO64), ein 50'mer (JO59) und ein 49'mer (JO60) wurden für die Synthese der humanisierten variablen schweren Kette verwendet. Die Oligonukleotid Konzentrationen wurden unter Verwendung der Formel c = [(A260)/30]μg/μlbestimmt.
Die PCR Amplifikationsbedingungen waren wie folgt. Alle Reagenzien ebenso wie das GeneAmp PCR System 9600 wurden von Perkin Elmer Cetus bezogen. OPtimale PCR Bedingungen wurden empirisch für jedes Paar der mutagenisierten Primer bestimmt. Eine Matrix von Bedingungen, die in der Konzentration von MgCl₂, den mutagenisierten Primern und der Matrizen Plasmid DNA variierten, wurden wie folgt aufgestellt. Jedoch können die Annealing- und Extensionstemperaturen während der PCR variiert werden.
2 μM Primer JO59
2 μM Primer JO60
150 nM jedes der Primer JO61, 62, 63 und 64
200 μM jeweils von dGTP, dATP, dTTP und dCTP
10 mM KCl
20 mM Tris-HCl pH 8,8
10 mM (NH₄)₂SO₄
2 Einheiten pro 100 μl Reaktion Vent DNA Polymerase (New England Biolabs)
0,1 % Triton X-100
6 mM MgSO₄
Beispiel 20: Heiß gestartete PCR für die Humanisierung von Anti-KC-4 Antikörper
Alle die Bestandteile des PCR Gemisches, mit der Ausnahme der Vent DNA Polymerase, wurden gemischt. Das Gemisch wurde anschließend in 19 μl Aliquots in 5 PCR Gefäße aufgeteilt. Der Grund für die Durchführung von fünf unabhängigen Reaktionen war es, die Risiken zu verringern, dass ungewünschte Mutationen als ein Ergebnis von Nukleotid Fehleinbau während der PCR isoliert werden. Die Gefäße wurden auf 95°C für 5 Minuten erhitzt und anschließend auf 72°C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wurde 1 μl einer geeigneten Vent DNA Polymerase Verdünnung in 1 x Puffer zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt (Heißstart). Der Temperaturzyklus wurde anschließend wie folgt fortgesetzt.
[(96°C, 6 Sek.) (55°C, 10 Sek.) (72°C, 30 Sek.)] 3 Zyklen [(96°C, 5 Sek.) (60°C, 10 Sek.) (72°C, 30 Sek.)] 29 Zyklen 72°C, 10 Min.
Beispiel 21: Zusätzliche finale Extension für humanisierte Anti-KC-4 Antikörper V_H DNA
Nach dem Zyklus wurde eine zusätzliche finale Extensionsreaktion durchgeführt. Zusätzliche Desoxyribonukleotidtriphosphate (auf 150 μM) und 1 Einheit Vent DNA Polymerase wurden hinzugefügt, und das Gemisch wurde auf 72°C für 10 Minuten erhitzt.
Das resultierende synthetische DNA Fragment wurde mit DraI und NheI gespalten und in dieselben Restriktionsstellen eines Zwischenplasmid Konstrukts eingebaut, das die korrespondierende murine schwere Kette variable Region kodiert, wie in den Beispielen 23 bis 25 beschrieben ist.
Beispiel 22: Synthese von Anti-KC-4 humanisierten leichte Kette Variablen Regionen
Die Gene für die leichte Kette variable Region (V_L) wurden in einer ähnlichen Weise wie in den Beispielen 22 bis 24 oben für die schwere Kette Signalpeptid variablen Regionen beschrieben ist, synthetisiert. In diesem Fall waren jedoch das vollständige Signalpeptid und die V_L kodierende DNA zwischen EcoRV und SalI enthalten. Diese DNA wurde in pBluescriptIIKS⁺ (Stratagene) eingebaut (ligiert), wie in den Beispielen 23 bis 25 beschrieben ist.
Beispiel 23: Reinigung von humanisierten Anti-KC-4 PCR Produkten
Die PCR Produkte wurden anschließend auf einem 0,8 % Agarosegel in 1 × TAE Puffer und 0,5 μg/ml Ethidiumbromid getrennt. Die korrekten DNA Banden wurden mit UV Licht (366 nm) sichtbar gemacht, aus den Gelen ausgeschnitten und mit dem GeneClean Kit (Bio 101, La Jolla, CA) extrahiert.
Beispiel 24: Ligation von humanisierter Anti-KC-4 DNA in Plasmide (Rückschluss des Plasmids)
Die Ligationsgemische bestanden aus 5 μl extrahierter DNA, 2 μl 10 × Ligationspuffer (NEB), 1 μl T4 DNA Polymerase (NEB), 12 μl Wasser. Die Menge an Plasmid DNA kann in Abhängigkeit von der Intensität der aus dem Gel extrahierten Bande variiert werden. Die Ligationen wurden bei Raumtemperatur für 2 Stunden oder alternativ bei 14°C über Nacht durchgeführt.
Beispiel 25: Transformation und Sequenzierung von humanisierter Anti-KC-4 DNA
Die rückgeschlossenen Plasmide wurden anschließend in E. coli unter Verwendung von Inv alpha F' kompetenten Zellen, die von Invitrogen Corporation, San Diego, CA, bezogen wurden, transformiert. Anschließend wurde Plasmid DNA von einigen Transformanten hergestellt und sequenziert, um zu bestätigen, dass die Mutagenese erfolgreich war.
Beispiel 26: Hybrid Plasmid Herstellung und Sequenzierung
Anschließend wurde Plasmid DNA hergestellt und sequenziert, um zu bestätigen, dass die Gensynthese erfolgreich war. Die Anti-KC-4 humanisierten DNA Sequenzen für die V_H und V_L Segmente sind in den Tabellen 21 und 22 unten gezeigt.
Tabelle 21: Humanisierte Anti-KC-4 Antikörper V_L DNA Sequenzen
Tabelle 22: Humanisierte Anti-KC-4 Antikörper V_H DNA Sequenzen
Beispiel 27: Expression von Anti-KC-4 humanisiertem Antikörper
Zwei Expressionsvektoren pAG4622 und pAH4604 (Coloma, M.J., et al. (1992), supra) wurden verwendet, die von S.L. Morrison (Dept. of Microbiology and Molecular Genetics, UCLA) entwickelt und bereitgestellt wurden. Irgendeine cDNA, die ein Signalpeptid und entweder die variable schwere Kette oder die variable leichte Kette kodiert, kann prinzipiell in diese Vektoren eingeführt werden, was zu einer Konstruktion führt, die einen IgG1, K, Antikörper mit humanen konstanten Regionen kodiert. Synthetische DNA Fragmente wurden aus ihren Zwischenplasmiden (siehe Beispiele 21 und 22) mit entweder EcoRV und Sal ausgeschnitten, um in pAG4622 (leichte Kette Vektor) eingebaut zu werden, oder mit EcoRV und NheI, um in pAH4604 (schwere Kette Vektor) eingebaut zu werden. Die Restriktions- und Ligationsreaktionen, die notwendig sind, um diese Operationen zu erreichen, wurden unter den Bedingungen durchgeführt, die von dem Enzymhersteller (New England Biolabs, Beverly, MA) angegeben sind. Sowohl die Vektoren als auch die Inserts wurden aus einem Agarosegel vor der Ligation unter Verwendung des Bio 101 (La Jolla, CA) GeneClean Kit (Glaskügelchen) gereinigt. Die V_H und V_L Regionen in den Endkonstruktionen wurden nochmals sequenziert, um zu bestätigen, dass sie korrekt waren. Die nicht produzierende Myelom Zelllinie SP2/0-Ag14, ATCC: CRL 1581 (Shulman, M., et al. (1978), supra) wurde mit beiden Plasmidkonstruktionen transfiziert, und Antikörper Produzenten wurden nach den Empfehlungen, die in Coloma et al. (Coloma, M.J. et all (1992), supra) angegeben sind, isoliert, mit der Ausnahme, dass die Selektion nur für die Aufnahme von hisD (durch Hinzufügen von 5 mM Histidinol zu dem Medium und erneutem Einstellen des pH auf 7,4 mit NaOH) durchgeführt wurde. Für gewöhnlich wurden nach zehn Tagen stabile Transfektantenkolonien mit einer Frequenz von ungefähr 10^–5 bis 10^–4 etabliert. Die Kolonien wurden anschließend in normales Medium (ohne Histidinol) transferiert. Das Kulturmedium war entweder Dulbecco's modified Eagle's medium (DME): fötales Rinderserum (FBS), 90:10, v/v, oder ein Gemisch aus DME:RPMI:FBS, 45:45:10, v/v/v. Penicillin und Streptomycin wurden hinzugefügt, um bakterielles Wachstum zu verhindern.
Die Überstände von stabilen Transfektanten wurden hinsichtlich der Anwesenheit von Antikörpern untersucht. Dies wurde durchgeführt, indem der sekretierte chimäre Antikörper mit einem Platten gebundenen Ziege Anti-Human-Kappa Ketten Antikörper gefangen und mit Ziege Anti-Human-Gamma Antikörper entwickelt wurde, im Wesentlichen wie zuvor beschrieben (Coloma, M.J. (1992), supra), mit der Ausnahme, dass der zweite Antikörper mit ¹²⁵I radioaktiv markiert war. Die Überstände wurden auch hinsichtlich der Bindung an humanes Milchfettglobulin (HMFG) untersucht, wie zuvor beschrieben (Ceriani, R.L., et al., "Diagnostic Ability of Different Human Milk Fat Globule Antigens in Breast Cancer", Breast Cancer Res. Treat., 15.161-174 (1990)). HMFG wurde an die Mikrotiter Platten wie zuvor beschrieben, gebunden (Ceriani, R.I. (1984), supra). Für gewöhnlich waren die meisten Kolonieüberstände in beiden Assays positiv.
Kolonien, welche die höchsten Mengen an Antikörper in die Überstände sekretierten, wie durch diese Assays bestimmt wurde, wurden subkloniert und anschließend an serumfreies Medium für die Reinigung von Antikörper angepasst. Serumfreies Medium enthält HL-1 Ergänzung, wie vom Hersteller angegeben (Ventrex Labs., Portland, ME).
Beispiel 28: Halb humanisierter halb chimärer Anti-KC-4 Antikörper
Eine Anti-KC-4 humanisierte leichte Kette wurde mit einer Anti-KC-4 nicht humanisierten chimären schweren Kette durch Kotransfektion von SP2/0-Ag14 Myelom zellen mit Hybridplasmiden, welche die jeweiligen DNA Sequenzen tragen und jenen eines humanen F_C, gepaart. Der resultierende Antikörper wurde als "HuKC4V1" (ATCC Nr. HB 11454) bezeichnet.
Zusätzlich wurde eine Anti-KC-4 humanisierte schwere Kette mit einer Anti-KC-4 nicht humanisierten chimären leichten Kette gepaart, wie in Beispiel 27 oben beschrieben ist. Der resultierende Antikörper wurde als "HuKC4V3" (ATCC Nr. HB 11456) bezeichnet.
Beispiel 29: Vollständig humanisierter Anti-KC-4 Antikörper
Ein Anti-KC-4 vollständig humanisierter Antikörper wurde hergestellt durch das Paaren von vollständig humanisierten Anti-KC-4 leichten und schweren Ketten durch Kotransfektion, wie in Beispiel 27 oben beschrieben ist. Die vollständig humanisierte Version wurde als "HuKC4V2" (ATTC Nr. HB 11455) bezeichnet.
Beispiel 30: Bestimmung von Affinitätskonstanten für den vollständig humanisierten Anti-KC-4 Antikörper
Der sekretierte vollständig humanisierte Antikörper (NuKC4V2) wurde aus Kulturüberständen unter Verwendung einer Sepharose 4B Protein A Säule (Bio-Rad, Richmond, CA) gereinigt, wie von Ey et al. beschrieben (Ey, P.L., et al. (1978), supra). Miktrotiter Platten (Dynatech, Chantilly, VA) wurden hergestellt, wie von Ceriani et al. (Ceriani, R.L., et al. (1992), supra) beschrieben unter Verwendung von aufeinanderfolgenden Schichten von methyliertem BSA, Glutaraldehyd, Anti-β-Galactosidase und dem bakteriellen Fusionsprotein 11-2 (ein Hybrid aus β-Galactosidase und humanem Mammamycin). Jede Vertiefung enthielt 388 ng des 11-2 Fusionsproteins. Zu jeder Vertiefung wurden 25 μl ¹²⁵I-KC-4 in RIA Puffer (10 % bovines Kälberserum, 0,3 % Triton X-100, 0,05 % Natriumazid pH 7,4 in Phosphat gepufferter Salzlösung) hinzugefügt und konkurrierte mit 25 μl von entweder nicht markiertem murinem oder chimärem Antikörper in RIA Puffer bei Endkonzentrationen von 130 pM, 850 pM, 1,3 nM, 4 nM und 13 nM. Die Iodierungen wur den mit ¹²⁵I (17 Ci/mg, Nordion International) durchgeführt. 50 μg Anti-KC-4 monoklonaler Antikörper (Coulter, Hialeah, FL) wurden bei einer spezifischen Aktivität von 9,56 mCi/mg unter Verwendung des Chloramin T Verfahrens, wie zuvor von Ceriani et al. beschrieben (Ceriani, R.L., et al. (1988), supra) markiert.
Die Antikörper-Antigen Affinitätskonstanten wurden bestimmt, indem das Reziprok der Konzentration von konkurrierendem nicht markierten monoklonalen Antikörper, der 50 % Bindung hervorrief, wie von Sheldon et al. (Sheldon, K., et al. (1987), supra), verwendet wurde. Das Protokoll, das verwendet wurde, um die Affinitätskonstanten zu bestimmen, war wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass in jedem Fall ein nicht markierter Antikörper hinsichtlich der Bindung an das Antigen mit demselben radioaktiv markierten Antikörper konkurrierte. Von dem vollständig humanisierten Antikörper wurde ebenso wie von dem Anti-KC-4 murinen Antikörper gezeigt, dass er mit radioaktiv markiertem Anti-KC-4 murinen Antikörper hinsichtlich der Bindung an das KC-4G3 Antigen konkurrierte.
Eine Polyacrylamid Gelelektrophorese wurde durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Antikörper Ketten wie erwartet wanderten. Die Affinitätsbindungskonstanten der murinen, chimären, halb humanisierten und humanisierten Antikörper wurden in unabhängigen Kompetitionsassays bestimmt. Die Bindungsaffinitäten der murinen Anti-KC-4 und HuKC4V2 Antikörper für das KC-4G3 Antigen wurden als gleich bestimmt.
Beispiel 31: Histochemische Spezifität von vollständig humanisiertem Antikörper
Die immunhistochemische Färbung unter Verwendung der Immunperoxidase Technik von aufeinanderfolgenden humanen Brustkarzinom Gewebeschnitten wurde als ein Test verwendet, um zu bestätigen, dass die analogen Antikörper, die Affinität für das KC-4G3 Karzinom Antigen des murinen Antikörpers behielten. Die Brustkarzinom Gewebeschnitte wurden mit dem Überstand der KC-4 murinen und vollständig humanisierten transfizierten Zellen unter Verwendung des Vectastain ABC Verfahrens (Vector Labs, Burlingame, CA) gefärbt. Beide Antikörper zeigten starke Färbemuster.
Die folgende Tabelle 23 zeigt die Ergebnisse der Immunperoxidase Färbung von fünf humanen Brustkarzinomen mit entweder dem Standard Anti-KC-4G3 murinen oder den vollständig humanisierten Antikörpern. Beide färbten dasselbe Gewebe in einer vergleichbaren Menge.
Tabelle 23: Immunperoxidase Färbung von humanen Brustkarzinom Gewebeschnitten mit murinen und vollständig humanisierten Anti-KC-4 Antikörpern
Beispiel 32: Bindung an HMFG von halb humanisierten und vollständig humanisierten Anti-KC-4 Antikörpern
Von Gewebekultur Überständen von Transfektanten von allen drei Anti-KC-4 Varianten des humanisierten Antikörpers wurde gezeigt, dass sie humanes Milchfettglobulin (HMFG) binden, wie durch Radioimmunnachweise bestimmt wurde.
Beispiel 33: Halb humanisierte und vollständig humanisierte Anti-KC-4 Antikörper binden an Ziege Anti-Human κ oder γ Antikörper
Von Gewebekultur Überständen von Transfektanten von allen drei Varianten des Anti-KC-4 humanisierten Antikörpers wurde gezeigt, dass sie in Sandwich Radioimmunnachweisen sowohl an Ziege Anti-Human Kappa Kette Antikörper, gebun den an Mikrotiter Plattenvertiefungen (750 ng/Vertiefung) ebenso wie an radioiodierte ¹²⁵I markierte Ziege Anti-Human Gamma Kette Antikörper binden.
Die Ergebnisse dieser Sandwich Assays zeigen, dass beide Ketten der humanisierten Antikörper tatsächlich humane Kappa und Gamma konstante Regionen aufweisen.
Beispiel 34: Abgeleitete Aminosäuresequenzen von humanisierten Anti-KC-4 variablen leichten und schweren Ketten
Die Aminosäuresequenzen der leichten und schweren Ketten der analog humanisierten Antikörper sind in Tabellen 24 und 25 unten gezeigt. Die tatsächlichen Aminosäuresequenzen können variiert werden, entweder um die Affinität für das Antigen zu steigern oder die Immunogenität in Menschen zu verringern. Zahlreiche Varianten dieser Sequenz können in Übereinstimmung mit dieser Erfindung bearbeitet werden.
Tabelle 24: Humanisierte Anti-KC-4 Antikörper V_L analoge Sequenz
Tabelle 25: Humanisierte Anti-KC-4 Antikörper V_H analoge Sequenz
Beispiel 35: Hybridomzellen Hinterlegung
Die folgenden Zelllinien wurden als gegenwärtige Beispiele für die beste Art und Weise für die Erfindung hinterlegt. Die Hybridom Zelllinie, die den Anti-KC-4 murinen-humanen chimären Antikörper exprimiert, wurde mit der ATCC am 13. November 1992 unter dem Budapester Vertrag hinterlegt, und ihr wurde die Zugangs Nr. HB 11201 (chimäres Anti-KC-4 1E8) zugewiesen. Die Hybridom Zelllinie, die den vollständig humanisierten Anti-KC-4 Antikörper (huKC4V2) und die halb humanisierten Anti-KC-4 Antikörper (huKC4V1 und huKC4V3) exprimieren, wurden bei der ATCC am 23. September 1993 hinterlegt, und ihnen wurden die Zugangs Nr. HB 11455 (humanisierter HuKC-4 V2), HB 11454 (halb humanisierter HuKC4V1) und HB 11456 (halb humanisierter HuKC4V3) zugewiesen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Modifizierter chimärer Antikörper, welcher selektiv an das humane KC-4 Antigen bindet, umfassend (1) die variablen Regionen der leichten und schweren Ketten eines Anti-KC-4 murinen Antikörpers und (2) Leichte- und Schwere-Kette konstante Regionen eines humanen Antikörpers, wobei die Aminosäuresequenz der variablen Regionen SEQ ID Nr.: 50 und SEQ ID Nr.: 51 umfaßt.
Antikörper nach Anspruch 1, wobei 12 Aminosäuren in den Leichte-Kette Gerüstregionen (GRs) substituiert sind und 7 Aminosäuren in den Schwere-Kette GRs substituiert sind.
Antikörper nach Anspruch 2, wobei die Aminosäuren in den Gerüstregionen Aminosäuren sind, die in äquivalenten Positionen in humanen Antikörpern vorhanden sind.
Antikörper nach Anspruch 1, weiter umfassend mindestens einen daran gebundenen Glykosylrest.
Stoffzusammensetzung, umfassend den Antikörper nach Anspruch 1 und einen Träger.
Krebsdiagnose-Kit, umfassend die Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei der Träger ein pharmazeutisch verträglicher Träger für eine in vivo Verabreichung ist, und wobei der Antikörper in einer radiomarkierten Form vorliegt.
Krebstherapie-Kit, umfassend die Zusammensetzung nach Anspruch 4, in einer pharmazeutisch verträglichen Form, wobei der Antikörper in einer radiomarkierten Form vorliegt.
In vitro Krebsdiagnose-Kit, umfassend den Antikörper nach Anspruch 1 und einen Feststoff-Träger.
In vitro Kit nach Anspruch 8, weiter umfassend einen oder mehrere heterologe Immunglobuline, die selektiv an die konstante Region auf dem Anti-KC-4 Antikörper binden.
In vitro Kit nach Anspruch 9, weiter umfassend einen Marker, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Radioisotop, einem Enzym, einem phosphoreszierendem Molekül und einem fluoreszierendem Molekül, wobei der Marker an den Antikörper des Immunglobulins gebunden ist.
Hybridoma-Zelle, welche den Antikörper nach Anspruch 1 exprimiert.
Hybridoma-Zelle nach Anspruch 11 mit der ATCC Zugangs-Nr. HB 11455 (HuKC4V2).
Zusammensetzung, umfassend die Hybridoma-Zelle nach Anspruch 11 und ein Verdünnungsmittel oder einen Träger.
Reines, isoliertes Polydesoxyribonukleotid, im wesentlichen bestehend aus einem Oligodesoxyribonukleotid, welches den Anti-KC-4 monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 kodiert.
Polydesoxyribonukleotid nach Anspruch 14, wobei das Oligodesoxyribonukleotid aus einer DNA-Sequenz besteht, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus DNA-Sequenz ID Nr. 48 und DNA-Sequenz ID Nr. 49.
Hybridvektor, umfassend einen Vektor, der das Polydesoxyribonukleotid nach Anspruch 14 trägt.
Transfizierte Wirtszelle, die den Hybridvektor nach Anspruch 16 trägt.
Reines isoliertes Polyribonukleotid, bestehend im wesentlichen aus einem Oligoribonukleotid, welches den Antikörper nach Anspruch 1 kodiert.
Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der chimäre Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.