DE69531679T2

DE69531679T2 - Für e-selectin und p-selectin spezifische kreuzreaktive monoklonale antikörper

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Publication number: DE69531679T2
Application number: DE69531679T
Authority: DE
Inventors: Ellen L. Berg
Original assignee: Protein Design Labs Inc
Current assignee: PDL Biopharma Inc
Priority date: 1994-06-14
Filing date: 1995-06-07
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2015-06-08
Also published as: HK1016018A1; US6210670B1; AU2821195A; JPH10502168A; ATE248605T1; US5622701A; WO1995034324A1; DE69531679D1; EP0765172B1; CA2191870A1; EP0765172A4; EP0765172A1

Description

Die Fähigkeit von Zellen, aneinander zu haften, spielt eine kritische Rolle in der Entwicklung, der normalen Physiologie, und in Erkrankungsvorgängen, wie etwa Entzündung. Diese Fähigkeit wird durch Adhäsionsmoleküle, im Allgemeinen Glycoproteine, die auf Zellmembranen exprimiert werden, vermittelt. Oftmals wird ein Adhäsionsmolekül auf einem Zelltyp an ein anderes, auf einem unterschiedlichen Zelltyp exprimiertes Adhäsionsmolekül binden, wobei ein Rezeptor-Gegenrezeptor-Paar ausgebildet wird. Drei wichtige Klassen von Adhäsionsmolekülen sind die Integrine, die Selectine, und die Mitglieder der Superfamilie der Immunglobuline (Ig) (siehe Springer, Nature 346: 425 (1990); Osborn, Cell 62: 3 (1990); Hynes, Cell 69: 11 (1992)). Diese Moleküle sind lebenswichtig für die Wechselwirkung von Leukozyten und Plättchen untereinander und mit der extrazellulären Matrix und dem vaskulären Endothel.
Die Selectin-Rezeptorfamilie wird aufgrund ihrer Lectin-ähnlichen Domäne und der selektiven Natur ihrer adhäsiven Funktionen so bezeichnet. Es gibt drei bekannte Selectine, L-Selectin (auch bekannt als LECAM-1, Mel-14 oder LAM-1 oder CD62L), E-Selectin (auch als ELAM-1 oder CD62E bezeichnet), und P-Selectin (auch bekannt als CD62, CD62P, GMP140 oder PADGEM). Die Selectine sind in hohem Maße homolog, enthaltend eine N-terminale Lectindomäne von 120 Aminosäuren (aa), eine EGF-ähnliche Domäne, eine variable Anzahl von mehreren kurzen Consensuswiederholungsdomänen (SCR, short consensus repeat), die zu den in Komplementregulationsproteinen homolog sind, gefolgt von einer Transmembrandomäne und einem kurzen cytoplasmatischen Schwanz. Siehe Siegelmann et al., Science 243: 1165–1172 (1989); Lasky et al., Cell 56: 1045–1055 (1989); Tedder et al., J. Exp. Med. 170: 123–133 (1989); Johnson et al., Cell 56: 1033– 1044 (1989); Bevilacqua et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 9238–9242 (1987); Bevilacqua et al., Science 243: 1160–1165 (1989); Bevilacqua et al., J. Clin. Invest. 91: 379–387 (1993); Camerini et al., Nature 280: 496–498 (1989). Die Selectine haben überlappende, aber unterscheidbare Spezifitäten für Gegenrezeptoren. Siehe Bevilacqua et al., J. Clin. Invest. 91: 379–387 (1993); Feize, Current Opinion in Struct. Biol. 3: 701–710 (1993); Berg et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 184: 1048–1055 (1992); Foxall et al., J. Cell Biol. 117: 895–902 (1992); Larsen et al., J. Biol. Chem. 267: 11104–11110 (1992); Polley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6224–6228 (1991).
P-Selectin wird sowohl von Plättchen als auch von Endothelzellen konstitutiv exprimiert, wo es in α-Granulen oder Weibel-Palade-Körpern gelagert wird, für eine rasche (Sekunden bis Minuten) Translokation an die Zelloberfläche nach Aktivierung durch beispielsweise Thrombin oder Histamin (McEver et al., J. Biol. Chem. 250: 9799–9804 (1984); Hsu-Lin et al., J. Biol. Chem. 264: 8121–9126 (1984)). E-Selectin wird durch aktivierte Endothelzellen exprimiert (z. B. nach TNF-α oder IL-1 Stimulation während 6–8 h). Seine Expression wird auf dem Niveau der Transkription kontrolliert (Bevilacqua et al., 1987, oben, Bevilacqua et al., 1989, oben). P-Selectin und E-Selectin binden beide an Neutrophile und Monozyten (Larsen et al., Cell 59: 305–312 (1989); Johnston et al., Cell 56: 1033–1044 (1989), Bevilacqua et al., 1987, oben, Bevilacqua et al., 1989, oben) sowie an Subgruppen von Lymphozyten (Picker et al., Nature 349: 796–799 (1991), Shimizu et al., Nature 349: 799–802 (1991); Moore et al., BBRC 186; 173–181 (1992)). L-Selectin wird konstitutiv von Leukozyten exprimiert, und vermittelt eine Adhäsion von Lymphozyten an hohe endotheliale Venulae (HEV, high endothelial venules) von peripheren Lymphknoten (Gallatin et al., Nature 304: 30–34 (1983); Berg et al., Immunol. Rev. 108: 5–18 (1989); Berg et al., J. Cell Biol. 114: 343–349 (1991)) und Adhäsion von Neutrophilen an Cytokinaktivierte Endothelzellen (Hallmann et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 174: 236– 243 (1991); Smith et al., J. Clin. Invest. 87: 609–618 (1991); Spertini et al., J. Immunol. 147: 2565–2573 (1991). L-Selectin ist ein Gegenrezeptor auf Neutrophilen für sowohl E-Selectin als auch P-Selectin (Kishimoto et al., Blood 78: 805–811 (1990); Picker et al., Cell 66: 921 (1991)), obwohl alle drei Selectine vermutlich auch andere Gegenrezeptoren haben.
E-Selectin, P-Selectin und L-Selectin vermitteln adhäsive Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und Endothelzellen und zwischen Plättchen und Leukozyten (Bevilacqua et al., 1993, oben). Von allen drei Selectinen ist gezeigt worden, dass sie an der anfänglichen "rollenden" Wechselwirkung von Leukozyten mit aktiviertem Endothel beteiligt sind (von Andrian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7538–7542 (1991); Ley et al., Blood 77: 2553–2555 (1991); Abassi et al., J. Clin. Invest. 92: 2719– 2730 (1993); Dore et al., Blood 82: 1308–1316 (1993); Jones et al., Biophys. J. 65: 1560–1569 (1993); Mayadas et al., Cell 74: 541–554 (1993)). Diese anfängliche Wechselwirkung geht CD18-Integrin-vermittelter Adhäsion und nachfolgender Migration von Neutrophilen durch das Endothel und in entzündete Gewebestellen voran (Lawrence et al., Cell 65: 859–873 (1991); von Andrian et al., Am. J. Physiol. 263: H1034–H1044 (1992)). In Abhängigkeit von der Natur der entzündlichen Stimuli und dem Zeitpunkt nach der Initiation der Entzündungsreaktion kann entweder E-Selectin oder P-Selectin bei der Förderung der Neutrophilen-vermittelten Gewebeschädigung funktionell dominant sein.
Im Prinzip könnten Antikörper oder andere Selectinantagonisten ein Verkümmern des Adhäsionsvorgangs hervorrufen, wodurch Bindung von Neutrophilen an das Endothel und Extravasation in Gewebe verhindert würden. Es ist eine erhebliche Anzahl von Antikörpern, die für eines der Selectine spezifisch sind, veröffentlicht worden. Von manchen dieser Antikörper wurde berichtet, dass sie in vitro die Bindung von Selectinen an Gegenrezeptoren blockieren. Von manchen dieser Antikörper wurde auch berichtet, dass sie in vivo in Tiermodellen Selectin-vermittelte Wechselwirkungen blockieren. Beispielsweise wurde berichtet, dass Antikörper gegen E-Selectin in einem IgG-Komplexmodell von Lungenverletzung in der Ratte gegen die von Neutrophilen vermittelte Schädigung schützen (Mulligan et al., J. Clin. Invest. 88: 1396 (1991)). Von Antikörpern gegen P-Selectin wurde berichtet, dass sie gegen akute Lungenverletzung, induziert durch intravenöse Injektion von Kobragiftfaktor (Mulligan et al., J. Clin. Invest. 90: 1600–1607 (1992)) sowie in einem Rattemodell von systemischer Endotoxämie (Coughlan et al., J. Exp. Med. 179: 329– 334 (1994)) schützen. Von Antikörpern gegen P-Selectin wurde auch berichtet, dass sie in einem Katzemodell von Myocardischämie und Reperfusionsverletzung schützend sind (Weyrich et al., FASEB J. 7: A785 (1993)).
Obwohl manche Antikörper gegen E-Selectin und P-Selectin eine blockierende Aktivität gezeigt haben, sind viele, wenn nicht die meisten für E-Selectin oder P-Selectin spezifischen Antikörper nicht-blockierend (siehe z. B. Bevilacqua et al., 1989, oben; Erbe et al., J. Cell Biol. 119: 215–227 (1992)). Das heißt, diese Antikörper binden an Epitope in den extrazellulären Domänen von E-Selectin oder P-Selectin, die nicht direkt an der Bindung von Gegenrezeptor oder dem nachfolgenden zellulären Adhäsionsvorgang teilnehmen. Das Vorherrschen von nicht-blockierenden Antikörpern legt nahe, dass nur kleine Regionen der extrazellulären Domäne direkt an der Bindung teilnehmen oder die Bindung beeinflussen. Somit würde erwartet werden, dass ein erneutes Screening von Antikörpern, die gegen E-Selectin oder P-Selectin erzeugt wurden, vorwiegend nicht-blockierende Antikörper erzeugen würde.
Trotz der großen Anzahl von Antikörpern, die bisher gegen die drei Selectine isoliert wurden, gab es wenige Berichte über kreuzreagierende Antikörper, die an mehr als ein Selectin binden. Kreuzreagierende Antikörper könnten fähig sein, den Entzündungsprozess an mehr als einer Ebene zum Verkümmern zu bringen, und dadurch therapeutische Mittel für von Neutrophilen vermittelte Entzündungszustände mit einem größeren Anwendungsspektrum bereitstellen als Antikörper, die für ein einziges Selectin spezifisch sind. Von einem Antikörper ist berichtet worden, dass er mit humanem E-Selectin und L-Selectin aus Hund kreuzreagiert, aber nicht mit den zwei Selectinen aus der gleichen Spezies (Abassi et al., J. Immunol. 147: 2107–2115 (1991)). Von einem zweiten Antikörper ist berichtet worden, dass er mit humanem E-Selectin und L-Selectinen kreuzreagiert (Jutila et al., J. Exp. Med. 175: 1565–1573 (1992; WO/9324614). Es wurde jedoch kein Antikörper isoliert, der sowohl an P-Selectin als auch an E-Selectin bindet, umso weniger einer, der die Funktionen beider dieser Moleküle blockiert.
Dementsprechend besteht ein Bedarf für Antikörper, die sowohl an E-Selectin als auch P-Selectin binden, bevorzugt derart, so dass die Kapazität beider dieser Moleküle, an Adhäsionsreaktionen mit Gegenrezeptoren teilzunehmen, blockiert wird. Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses und andere Bedürfnisse.
Die Erfindung stellt monoklonale Antikörper mit einer Bindungsstelle, welche spezifisch an P-Selectin und E-Selectin binden, bereit. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung einen monoklonaler Antikörper mit einer Bindungsstelle bereit, welcher spezifisch an P-Selectin und E-Selectin bindet, wobei der Antikörper eine Affinität für sowohl P-Selectin als auch E-Selectin von mindestens 10⁸ M^–1 hat.
Der Antikörper kann aus Maus oder Mensch sein. Bevorzugt inhibiert die spezifische Bindung des Antikörpers an das P-Selectin eine Bindung des P-Selectins an einen Gegenrezeptor von P-Selectin und inhibiert die spezifische Bindung des Antikörpers an das E-Selectin eine Bindung des E-Selectins an einen Gegenrezeptor von E-Selectin, wobei die Gegenrezeptoren gegebenenfalls auf einer HL-60 Zelle oder einem Neutrophilen exprimiert sind. Stärker bevorzugt kompetiert der Antikörper mit dem Antikörper 5C7.29, ATCC Zugangsnummer CRL 11640, um eine spezifische Bindung an P-Selectin und E-Selectin. Am meisten bevorzugt ist der Antikörper 5C7.29.
Der Antikörper kann spezifisch an L-Selectin binden oder nicht.
Der Antikörper kann ein Epitop von E-Selectin, umfassend die Aminosäuren Q₂₁, R₂₂, Y₂₃, T₁₁₉ und A₁₂₀ erkennen, und/oder kann ein Fab, Fab', F(ab')₂, Fv-Fragment oder ein Einzelkettenantikörper sein.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen humanisierten Antikörper bereit, welcher spezifisch an P-Selectin bindet und die Bindung des P-Selectins an einen Gegenrezeptor von P-Selectin inhibiert, und spezifisch an E-Selectin bindet und die Bindung des E-Selectins an einen Gegenrezeptor von E-Selectin inhibiert, wobei der Antikörper eine humanisierte variable Region der leichten Kette und eine humanisierte variable Region der schweren Kette umfasst, wobei die humanisierte variable Region der leichten Kette Komplementarität-bestimmende Regionen mit Aminosäuresequenzen einer leichten Kette eines nicht-humanen Antikörpers umfasst und eine Gerüstsequenz der variablen Region umfasst, die im Wesentlichen mit einer Gerüstsequenz der variablen Region einer humanen leichten Kette identisch ist, und die humanisierte variable Region der schweren Kette Komplementarität-bestimmende Regionen mit Aminosäuresequenzen einer schweren Kette eines nicht-humanen Antikörpers umfasst und eine Gerüstsequenz der variablen Region umfasst, die im Wesentlichen mit einer Gerüstsequenz der variablen Region einer humanen schweren Kette identisch ist, wobei der humanisierte Antikörper gegebenenfalls weiterhin konstante Regionen der leichten Kette und/oder schweren Kette umfasst, die im Wesentlichen mit konstanten Regionen der humanen leichten Kette und/oder schweren Kette identisch sind.
Bevorzugt hat der humanisierte Antikörper eine humanisierte variable Region der leichten Kette mit einer Sequenz, die im Wesentlichen identisch ist mit der Sequenz:
und hat die humanisierte variable Region der schweren Kette eine Sequenz, die im Wesentlichen identisch ist mit der Sequenz:
Stärker bevorzugt hat der humanisierte Antikörper eine humanisierte variable Region der leichten Kette mit der Sequenz:
worin X₁ = D oder Q; X₂ = Q oder V; X₃ = M oder L; X₄ = S oder A; X₅ = S oder D; X₆ = Y oder F; X₇ = F oder I; X₈ = L oder F; X₉ = F, I oder A; X₁₀ = Q, G oder S; X₁₁ = V, I oder L; X₁₂ = M oder L; X₁₃ = eine beliebige Aminosäure, X₁₄ = eine beliebige Aminosäure, X₁₅ = S oder T; X₁₆ = Q, N oder H; und X₁₇ = Q, N oder N; und (b) hat die humanisierte variable Region der schweren Kette die Sequenz:
worin X₂ = A oder S; X₂ = N oder T; X₃ = E, Q oder D; X₄ = S, A oder P; X₅ = T oder S; X₆ = A oder S; X₇ = M, I, V oder L; X₈ = eine beliebige Aminosäure; X₉ = eine beliebige Aminosäure; X₁₀ = eine beliebige Aminosäure; X₁₁ = V, A, I, L, M oder F; X₁₂ = R, K oder Q; und X₁₃ = G, A, D, T oder S.
In einer Ausführungsform sind in der humanisierten variablen Region der leichten Kette X₁₁ = V; X₁₂ = M; X₁₃ = L; X₁₄ = A; X₁₅ = S; X₁₆ = Q; und X₁₇ = Q; und sind in der humanisierten variablen Region der schweren Kette X₇ = M; X₈ = A; X₉ = D; X₁₀ = T; X₁₁ = V; X₁₂ = R; und X₁₃ = G.
Genauso bevorzugt hat der humanisierte Antikörper eine humanisierte variable Region der leichten Kette mit der Sequenz:
und hat die humanisierte variable Region der schweren Kette die Sequenz:
Ebenfalls bereitgestellt werden gereinigte Nukleinsäuresegmente, die für variable Regionen der leichten oder schweren Kette der Antikörper kodieren, sowie stabile Zelllinien, umfassend ein Nukleinsäuresegment, das für die schwere Kette der Antikörper kodiert, wobei das Segment operativ mit einem ersten Promoter verbunden ist, um Expression der schweren Kette zu ermöglichen, und ein zweites Nukleinsäuresegment, das für die leichte Kette der Antikörper kodiert, wobei das zweite Segment operativ mit einem zweiten Promoter verbunden ist, um Expression der leichten Kette zu ermöglichen, wobei die stabilen Zelllinien die Antikörper produzieren können.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper werden ebenfalls bereitgestellt, sowie die Verwendung der monoklonalen Antikörper bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer entzündlichen Erkrankung oder eines entzündlichen Zustands, z. B. Ischämie-Repertusionsverletzung, Atemnotsyndrom bei Erwachsenen, Trauma, Schlaganfall, Sepsis, Psoriasis, oder Autoimmunerkrankung, bevorzugt wobei die Erkrankung oder der Zustand Ischämie-Reperfusionsverletzung nach Myokardinfarkt oder Schlaganfall ist.
Bevorzugt ermöglicht das Arzneimittel weiter die Verabreichung eines thrombolytischen Mittels.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der E-Selectin- und P-Selectin-vermittelte Funktionen blockieren kann, bereit, wobei das Verfahren das Immunisieren eines Säugers mit P-Selectin, das Immunisieren des Säugers mit E-Selectin, das Immortalisieren von B-Zellen aus dem Säuger, um immortalisierte, Antikörper-produzierende B-Zellen zu erhalten, und das Auswählen einer immortalisierten Zelle, welche einen Antikörper produziert, der spezifisch an E-Selectin und P-Selectin bindet, umfasst.
Ebenfalls offenbart hierin ist ein Verfahren zum Beseitigen von Zellen, die E-Selectin und P-Selectin auf ihrer Oberfläche haben, in einer biologischen Probe, von der vermutet wird, dass sie die Zellen enthält, wobei das Verfahren das in Kontakt Bringen der Probe mit einem erfindungsgemäßen Antikörper, um einen Immunkomplex mit den Zellen, die E-Selectin und P-Selectin auf ihrer Oberfläche haben, zu bilden, und das Nachweisen der Gegenwart des Immunkomplexes, um die Gegenwart der Zellen aufzuzeigen, umfasst.
Die monoklonalen Antikörper der Erfindung, die spezifisch an E-Selectin und P-Selectin binden, können an das gleiche Epitop von E-Selectin wie der Antikörper 5C7.29 binden, wobei sie gegebenenfalls weiter an das gleiche Epitop von P-Selectin wie der Antikörper 5C7.29 binden.
Für viele derartiger Antikörper inhibiert eine spezifische Bindung des Antikörpers an das P-Selectin die Bindung des P-Selectins an einen Gegenrezeptor von P-Selectin, und inhibiert eine spezifische Bindung des Antikörpers an das E-Selectin die Bindung des E-Selectins an einen Gegenrezeptor von E-Selectin.
Gegenrezeptoren von E-Selectin und P-Selectin werden auf der Oberfläche von Zellen wie etwa HL-60 Zellen und Neutrophilen exprimiert. Beispiele von Antikörpern werden als 57C.29, X9.11 und 1 D8.10 bezeichnet. Viele der erfindungsgemäßen Antikörper kompetieren mit einem Beispielsantikörper um eine spezifische Bindung an P-Selectin und E-Selectin. Manche der erfindungsgemäßen Antikörper binden auch spezifisch an L-Selectin, während andere dies nicht tun. In einer Ausführungsform erkennt der Antikörper ein Epitop von E-Selectin, umfassend die Aminosäuren Q₂₁, R₂₂, Y₂₃, T₁₁₉ und A₁₂₀. In einer anderen Ausführungsform binden die Antikörper an das gleiche Epitop von E-Selectin und/oder P-Selectin wie der Antikörper 57C.29. Zusätzlich zu intakten Antikörpern stellt die Erfindung auch Bindefragmente bereit, wie etwa Fab, Fab', F(ab')₂, Fv oder Einzelkettenantikörper.
Manche der erfindungsgemäßen Antikörper sind nicht-human, z. B. aus Maus, während andere humanisiert sind oder eine Kette einer humanen variablen Region und eine humanisierte variable Region der leichten Kette haben. Die humanisierte variable Region der leichten Kette kann Komplementarität-bestimmende Regionen (z. B. CDR1, CDR2, CDR3) mit Aminosäuresequenzen von der leichten Kette einer Maus, von einem Antikörper, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 57C.29, X9.11 und 1 D8.10, umfassen, und eine Gerüstsequenz der variablen Region, die im Wesentlichen mit einer Gerüstsequenz der variablen Region einer humanen leichten Kette identisch ist, aufweisen. Die humanisierte variable Region der schweren Kette kann Komplementarität-bestimmende Regionen (z. B. CDR1, CDR2 und CDR3) mit Aminosäuresequenzen von der korrespondierenden schweren Kette des Mausantikörpers umfassen, und eine Gerüstsequenz der variablen Region, die im Wesentlichen mit einer Gerüstsequenz der variablen Region einer humanen schweren Kette identisch ist, aufweisen. Die Antikörper enthalten gegebenenfalls konstante Regionen, die im Wesentlichen mit humanen konstanten Regionen identisch sind.
In besonderen Ausführungsformen der humanisierten Antikörper dieser Erfindung hat die humanisierte variable Region der leichten Kette eine Sequenz, die mit der in 8A [SEQ. ID NR: 5] abgebildeten reifen Sequenz im Wesentlichen identisch ist, und hat die humanisierte variable Region der schweren Kette eine Sequenz, die mit der in 8B [SEQ. ID NR: 8] abgebildeten reifen Sequenz im Wesentlichen identisch ist. Noch genauer stellt diese Erfindung humanisierte Antikörper bereit, bei denen (a) die humanisierte variable Region der leichten Kette die Sequenz hat:
worin X₁ = D oder Q; X₂ = Q oder V; X₃ = M oder L; X₄ = S oder A; X₅ = S oder D; X₆ = Y oder F; X₇ = F oder I; X₈ = L oder F; X₉ = F, I oder A; X₁₀ = Q, G oder S; X₁₁ = V, I oder L; X₁₂ = M oder L; X₁₃ = eine beliebige Aminosäure, X₁₄ = eine beliebige Aminosäure, X₁₅ = S oder T; X₁₆ = Q, N oder H; und X₁₇ = Q, N oder H; und (b) die humanisierte variable Region der schweren Kette die Sequenz hat:
worin X₁ = A oder S; X₂ = N oder T; X₃ = E, Q oder D; X₄ = S, A oder P; X₅ = T oder S; X₆ = A oder S; X₇ = M, I, V oder L; X₈ = eine beliebige Aminosäure; X₉ = eine beliebige Aminosäure; X₁₀ = eine beliebige Aminosäure; X₁₁ = V, A, I, L, M oder F; X₁₂ = R, K oder Q; und X₁₃ = G, A, D, T oder S. In bestimmten Ausführungsformen der vorstehend genannten Antikörper haben die CDR-Regionen der variablen Regionen der leichten und der schweren Kette die gleiche Aminosäuresequenz wie die CDR-Sequenzen der 8A und 8B. Das heißt, in der humanen variablen Region der leichten Kette sind X₁₁ = V; X₁₂ = M; X₁₃ = L; X₁₄ = A; X₁₅ = S; X₁₆ = Q; und X₁₇ = Q; und in der variablen Region der schweren Kette sind X₇ = M; X₈ = A; X₉ = D; X₁₀ = T; X₁₁ = V; X₁₂ = R; und X₁₃ = G. In einer anderen Ausführungsform haben die variablen Regionen der leichten und der schweren Kette die in den 8A und 8B abgebildete Aminosäuresequenz.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung gereinigte Nukleinsäuresegmente bereit, die für eine variable Region der leichten oder schweren Kette eines der vorstehend diskutierten monoklonalen Antikörpers kodieren.
Die Erfindung stellt auch stabile Zelllinien bereit, welche die vorstehend diskutierten Antikörper produzieren können. Die stabilen Zelllinien umfassen Nukleinsäuresegmente, welche für die schwere Kette bzw. die leichte Kette eines vorstehend beschriebenen Antikörpers kodieren. Die Segmente sind operativ mit einem ersten und einem zweiten Promoter verbunden, um Expression der schweren und der leichten Kette zu ermöglichen.
Die Erfindung stellt weiter pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend die vorstehend beschriebenen Antikörper, und Behandlungsverfahren unter deren Verwendung bereit. Die Behandlungsverfahren sind insbesondere effektiv für entzündliche Erkrankungen, umfassend Zustände wie etwa Ischämie-Repertusionsverletzung, Atemnotsyndrom bei Erwachsenen, Sepsis, Psoriasis und Autoimmunerkrankung.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung eines Antikörpers, der E-Selectin- und/oder P-Selectin-vermittelte Funktionen blockieren kann, bereit. Das Verfahren umfasst das Immunisieren eines Säugers mit P-Selectin und E-Selectin, gleichzeitig oder nacheinander. B-Zellen aus dem Säuger werden immortalisiert, um immortalisierte, Antikörper-produzierende Zellen zu erzeugen. Eine immortalisierte Zelle, welche einen Antikörper produziert, der spezifisch an E-Selectin und P-Selectin bindet, wird ausgewählt.
Die Erfindung stellt weiter Verfahren zum Nachweisen von Zellen bereit, die E-Selectin und P-Selectin auf ihrer Oberfläche haben, in einer biologischen Probe, von der vermutet wird, dass sie die Zellen enthält. Das Verfahren umfasst das in Kontakt Bringen der Probe mit einem Antikörper wie vorstehend beschrieben, wobei ein Immunkomplex mit den Zellen, die E-Selectin und/oder P-Selectin auf ihrer Oberfläche haben, gebildet wird. Danach wird die Gegenwart des Immunkomplexes nachgewiesen, um die Gegenwart der Zellen aufzuzeigen.
1A und 1B: Der kreuzreagierende Antikörper 5C7.29 bindet an natürlich vorkommendes humanes E-Selectin. (a) Bindung des bekannten anti-E-Selectin Antikörpers H18/7 an aktivierte (schwarze Histogramme) und ruhende (graue Histogramme) HUVEC Zellen. (b) Bindung des kreuzreagierenden Antikörpers 5C7.29 an aktivierte und ruhende HUVEC Zellen. Die Intensität der FACS Fluoreszenz ist durch die X-Achse angegeben.
2A und 2B: Der kreuzreagierende Antikörper 5C7.29 bindet an natürlich vorkommendes P-Selectin. (a) Bindung des bekannten anti-P-Selectin Antikörpers WAPS 12.2 an Plättchen, nachgewiesen durch Anfärbung mit sekundärem Antikörper (schwarzes Histogramm), verglichen mit Anfärbung durch sekundären Antikörper alleine (Kontrolle, graues Histogramm). (b) Bindung von 5C7.29 an Plättchen, ähnlich gezeigt.
3: Die Kreuzreaktivität von 5C7.29 beruht auf einem einzigen monoklonalen Antikörper. Der Antikörper 5C7.29 wurde mit einem Überschuss von elterlichen L1-2 Zellen (a, c) oder L1-2^P-Selectin-Transfektanten (b, d) inkubiert, und resultierende Überstände wurden mittels FACS-Analyse mit frischen Proben von L1-2^P-Selectin-(a, b) oder L1-2^P-Selectin-Zellen (c, d) auf Reaktivität getestet. Diese Figur zeigt, dass L1-2^P-Selectin die Reaktivität für E-Selectin erschöpft.
4: Der monoklonale Antikörper 5C7.29 blockiert die Bindung von (Neutrophilen ähnlichen) HL-60 Zellen an (E-Selectin exprimierende) TNF-α-aktivierte HUVEC Zellen. Mittelwert aus vier Experimenten.
5. Der monoklonale Antikörper 5C7.29 blockiert die Bindung von HL-60 Zellen an E-Selectin-Transfektantenzellen. Mittelwert aus vier Experimenten.
6. Die monoklonalen Antikörper 5C7.29, X9.11 und 1 D8.10 blockieren die Bindung von Plättchen an HL-60 Zellen, wie mittels Plättchen-Rosettenbildung gezeigt. Das Diagramm zeigt den Prozentanteil der HL-60 Zellen mit > 2 gebundenen (rosettierten) Plättchen. Mittelwert aus drei Experimenten.
7A–7B. Sequenzen der cDNA (leichte Kette – SEQ. ID NR: 1; schwere Kette - SEQ. ID NR: 3) und translatierte Aminosäuresequenzen (leichte Kette – SEQ. ID NR: 2; schwere Kette – SEQ. ID NR: 4) der variablen Regionen der leichten Kette (A) und der schweren Kette (B) des Antikörpers 5C7.29 aus Maus. Die erste Aminosäure jeder reifen Kette ist durch doppelte Unterstreichung angezeigt. Die drei CDR in jeder Kette sind unterstrichen.
8A–8B. Sequenzen der synthetischen DNA (leichte Kette – SEQ. ID NR: 5; schwere Kette – SEQ. ID NR: 7) und translatierte Aminosäuresequenzen (leichte Kette – SEQ. ID NR: 6; schwere Kette – SEQ. ID NR: 8) der variablen Regionen der leichten Kette (A) und der schweren Kette (B) des humanisierten Antikörpers 5C7.29. Die erste Aminosäure jeder reifen Kette ist durch doppelte Unterstreichung angezeigt. Die drei CDR in jeder Kette sind unterstrichen.
9. Schematisches Diagramm für die Konstruktion der Gene für die variable Region des humanisierten Antikörpers 5C7.29.
10. Reaktivität des humanisierten Antikörpers 5C7.29 mit E-Selectin-, P-Selectin- und L-Selectin-Transfektanten. L1-2-Transfektanten-Zelllinien, die das angegebene Selectin exprimieren, wurden mittels Durchflusszytometrie auf Reaktivität mit humanisiertem 5C7.29 analysiert.
11A und 11B. Kompetitive Bindung des Antikörpers 5C7.29 aus Maus und des humanisierten Antikörpers 5C7.29 an Zellen, die E-Selectin (A) oder P-Selectin (B) exprimieren. Steigende Konzentrationen an kaltem Kompetitorantikörper wurden mit den Zellen in der Gegenwart von radioaktiv markiertem Indikatorantikörper 5C7.29 aus Maus inkubiert, und das Verhältnis von gebundener/freier Radioaktivität wurde bestimmt.
12. Inhibition der Adhäsion von HL-60 Zellen an CHO^E-Selectin-Zellen durch den Antikörper 5C7.29 aus Maus und den humanisierten Antikörper 5C7.29. Fluoreszenz-markierte HL-60 Zellen wurden mit CHO^E-Selectin-Zellen in der Gegenwart der Antikörper in den angegebenen Konzentrationen inkubiert. Nach dem Waschen wurden adhärente Zellen mikroskopisch ausgezählt. Die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments, das mit jeder Sonde vierfach (+/– Standardabweichung) durchgeführt wurde, sind gezeigt.
13. Inhibition der Rosettenbildung von Plättchen an HL-60 Zellen durch den Antikörper 5C7.29 aus Maus und den humanisierten Antikörper 5C7.29. Normale humane Plättchen wurden in der Gegenwart der Antikörper in den angegebenen Konzentrationen mit HL-60 Zellen inkubiert. Nach der Fixierung wurde der Prozentanteil von HL-60 Zellen mit mehr als 2 gebundenen (rosettierten) Plättchen bestimmt. Die gezeigten Ergebnisse stammen aus einem repräsentativen Experiment, das mit jeder Sonde dreifach (+/– Standardabweichung) durchgeführt wurde.
Der Begriff "im Wesentlichen identisch" oder "im Wesentlichen homolog" bedeutet, dass zwei Peptidsequenzen bei optimaler Ausrichtung wie etwa mittels der Programme GAP oder BESTFIT unter Verwendung von Standardwerten für die Gewichtung von Lücken, mindestens 80 Prozent Sequenzidentität aufweisen, bevorzugt mindestens 90 Prozent Sequenzidentität, stärker bevorzugt mindestens 95 Prozent Sequenzidentität oder darüber (z. B. 99 Prozent Sequenzidentität).
Bevorzugt unterscheiden sich Positionen von Resten, die nicht identisch sind, durch konservative Aminosäureaustausche.
Der Begriff "im Wesentlichen rein" oder "isoliert" bedeutet, dass eine Zielspezies die vorwiegend vorhandene Spezies ist (d. h. sie ist auf einer molaren Basis zahlreicher vertreten als jede andere individuelle Spezies in der Zusammensetzung), und bevorzugt ist eine im Wesentlichen gereinigte Fraktion eine Zusammensetzung, bei der die Zielspezies mindestens etwa 50 Prozent (auf einer molaren Basis) aller vorhandenen makromolekularen Spezies ausmacht. Im Allgemeinen umfasst eine im Wesentlichen reine Zusammensetzung mehr als etwa 80 bis 90 Gewichtsprozent, bezogen auf alle in der Zusammensetzung vorhandenen makromolekularen Spezies. Am meisten bevorzugt ist die Zielspezies auf im Wesentlichen Homogenität gereinigt (kontaminierende Spezies können durch herkömmliche Nachweisverfahren nicht in der Zusammensetzung nachgewiesen werden), wobei die Zusammensetzung im Wesentlichen aus einer einzigen makromolekularen Spezies besteht.
"Immunglobulin", "Antikörper" oder "Antikörperpeptid(e)" bezeichnen einen intakten Antikörper oder ein Bindefragment davon, das mit dem Antikörper um eine spezifische Bindung kompetiert. Bindefragmente werden durch rekombinante DNA-Techniken, oder durch enzymatische oder chemische Spaltung von intakten Immunglobulinen produziert. Bindefragmente umfassen Fab, Fab', F(ab')₂, Fv und Einzelkettenantikörper. Es wird verstanden, dass bei einem Antikörper dessen Bindungsstellen identisch sind, außer bei einem "bispezifischen" oder "bifunktionellen" Antikörper.
Ein Antikörper inhibiert im Wesentlichen die Adhäsion eines Rezeptors an einen Gegenrezeptor, wenn ein Überschuss an Antikörper die Quantität eines an einen Gegenrezeptor gebundenen Rezeptors um mindestens etwa 20%, 40%, 60% oder 80%, und üblicherweise um mehr als etwa 85% verringert (gemessen in einem kompetitiven in vitro Bindungsassay).
Der Begriff Epitop umfasst jede Proteindeterminante, die spezifisch an einen Immunglobulin- oder T-Zell-Rezeptor binden kann. Epitopdeterminanten bestehen üblicherweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen wie etwa Aminosäuren oder Zuckerseitenketten und haben üblicherweise dreidimensionale Strukturcharakteristika sowie spezifische Ladungscharakteristika.
Von einem Antikörper wird ausgesagt, dass er spezifisch an ein Antigen bindet, wenn die Dissoziationskonstante ≤ 1 μM, bevorzugt ≤ 100 nM und am meisten bevorzugt ≤ 10 nM beträgt.
Der Begriff Patient umfasst Menschen und Tiere.
Der Begriff P-Selectin-Gegenrezeptor bezeichnet ein von einem Antikörper verschiedenes Protein, das zumindest teilweise durch nicht-kovalente Bindungen spezifisch an P-Selectin bindet. Eine spezifische Bindung hält Zellen, die Rezeptor bzw. Gegenrezeptor auf ihrer Oberfläche haben, in physischer Nähe und kann auch eine Veränderung des physischen oder funktionellen Phänotyps in einer der Zellen oder in beiden transduzieren. Andere Selectin-Gegenrezeptoren sind analog definiert.
1. Antikörper der Erfindung
Die Erfindung stellt Antikörper bereit, die mit E-Selectin und P-Selectin kreuzreagieren, d. h. spezifisch an sie binden. Bevorzugte Antikörper blockieren die Funktion beider dieser Moleküle.
A. Allgemeine Charakteristika von Antikörpern
Die grundlegende Antikörper-Struktureinheit umfasst bekanntermaßen ein Tetramer. Jedes Tetramer ist aus zwei identischen Paaren von Polypeptidketten zusammengesetzt, wobei jedes Paar eine "leichte" (etwa 25 kDa) und eine "schwere" (etwa 50–70 kDa) Kette hat. Der Amino-terminale Abschnitt jeder Kette umfasst eine variable Region mit etwa 100 bis 110 Aminosäuren, welche für die Antigenerkennung primär verantwortlich ist. Der Carboxy-terminale Abschnitt jeder Kette definiert eine konstante Region, welche für Effektorfunktion primär verantwortlich ist.
Leichte Ketten werden als entweder Kappa oder Lambda klassifiziert. Schwere Ketten werden klassifiziert als Gamma, Mu, Alpha, Delta oder Epsilon, und definieren den Isotyp des Antikörpers als IgG, IgM, IgA, IgD bzw. IgE. In leichten und schweren Ketten sind die variable und die konstante Region durch eine "J"-Region von etwa 12 oder mehr Aminosäuren miteinander verbunden, wobei die schwere Kette auch eine "D"-Region von etwa weiteren 10 Aminosäuren umfasst (siehe im Allgemeinen Fundamental Immunology (Paul, W., Hrsg., 2. Auflage, Raven Press, N.Y., 1989), Kapitel 7).
Die variablen Regionen jedes Paars von leichter/schwerer Kette bilden die Antikörperbindungsstelle. Somit hat ein intakter Antikörper zwei Bindungsstellen. Außer bei bifunktionellen oder bispezifischen Antikörpern sind die zwei Bindungsstellen gleich. Die Ketten weisen alle die gleiche allgemeine Struktur auf, von relativ konservierten Gerüstregionen (FR, framework region), die durch drei hypervariable Regionen, auch Komplementarität-bestimmende Regionen oder CDR genannt, miteinander verbunden sind. Die CDR aus den zwei Ketten jedes Paars sind mittels der Gerüstregionen ausgerichtet, wodurch sie die Bindung an ein spezifisches Epitop ermöglichen. Vom N-Terminus zum C-Terminus umfassen sowohl leichte als auch schwere Ketten die Domänen FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 und FR4. Die Zuordnung von Aminosäuren zu jeder Domäne erfolgt in Übereinstimmung mit den Definitionen von Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, MD, 1987 und 1991) oder Chotia & Lesk, J. Mol. Biol- 196: 901–917 (1987); Chotia et al., Nature 342: 878– 883 (1989).
Ein bispezifischen oder bifunktionellen Antikörper ist ein künstlicher Hybridantikörper mit zwei unterschiedlichen Paaren von schwerer/leichter Kette und zwei unterschiedlichen Bindungsstellen. Bispezifische Antikörper können durch eine Reihe von Verfahren hergestellt werden, umfassend die Fusion von Hybridomen oder die Verknüpfung von Fab'-Fragmenten. Siehe z. B. Songsivilal & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315–321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547–1553 (1992). Die Herstellung von bispezifischen Antikörpern kann im Vergleich zu der Herstellung von herkömmlichen Antikörpern ein relativ arbeitsaufwendiges Verfahren sein, und die Ausbeuten und der Reinheitsgrad sind für bispezifische Antikörper im Allgemeinen geringer. Es gibt keine bispezifischen Antikörper in der Form von Fragmenten mit einer einzigen Bindungsstelle (z. B. Fab, Fab' und Fv).
B. Bindungsspezifität und Affinität
Die Immunglobuline (oder Antikörper) der Erfindung zeigen eine spezifische Bindung an sowohl P-Selectin als auch E-Selectin. Das bedeutet, eine einzige Bindungsstelle auf einem Antikörper hat eine Affinität für sowohl P-Selectin als auch E-Selectin. Somit binden die Antikörper an Epitope, die beiden Molekülen gemeinsam sind. Die Antikörper binden an die natürliche und/oder die rekombinante Form von humanem P-Selectin und E-Selectin (siehe Johnston et al., 1989, oben; Bevilacqua et al., 1989, oben). Manche Antikörper können auch an P-Selectin und/oder E-Selectin von nichthumanen Spezies binden. Manche der Antikörper binden auch spezifisch an L-Selectin (bevorzugt humanes L-Selectin (siehe Tedder, EPA 386,906 (1990)), während andere Antikörper der Erfindung dies nicht tun. Überraschenderweise sind die von den erfindungsgemäßen kreuzreagierenden Antikörpern gebundenen gemeinsamen Epitope ebenfalls Epitope, die sowohl für E-Selectin als auch P-Selectin wichtig sind, um mit ihren Gegenrezeptoren auf aktivierten Leukozyten, wie etwa Neutrophilen, wechselzuwirken. Somit blockieren die meisten kreuzreagierenden Antikörper der Erfindung die funktionellen Wechselwirkungen von E-Selectin oder P-Selectin, und üblicherweise diejenigen von beiden diesen Molekülen. Manche kreuzreagierende Antikörper blockieren auch die funktionellen Wechselwirkungen von L-Selectin, während andere dies nicht tun.
Eine Blockierung der P-Selectin-vermittelten Funktionen kann in vitro gezeigt werden. In vitro Assays messen die Kapazität eines Antikörpers, die Bindung von P-Selectin an einen Gegenrezeptor zu inhibieren. Geeignete Quellen für P-Selectin für derartige Assays sind gereinigtes P-Selectin (oder eine extrazelluläre Domäne davon), mit P-Selectin transfizierte Zellen, aktivierte Endothelzellen oder Plättchen. Geeignete Quellen für Gegenrezeptoren sind Leukozyten, Neutrophile, Monozyten oder HL-60 Zellen (ATCC CCL 240) und geeignete, mit L-Selectin transfizierte Zelllinien. Neutrophile können aus Gesamtblut (bevorzugt Humanblut) durch Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation isoliert werden. Neutrophile werden vor Zugabe zu einem Bindeassay üblicherweise mit Kaninchenserum vorbehandelt, um Fc-Rezeptoren zu blockieren. Wenn beide Komponenten im Bindeassay zellulär sind, kann die Bindung mikroskopisch oder mittels Durchflusszytometrie untersucht werden. Siehe Kishimoto et al., oben. Wenn eine der oder beide Komponenten ein gereinigtes Protein ist bzw. sind, wird üblicherweise eine Komponente an einer Festphase immobilisiert und die andere markiert. Die Bindung wird dann anhand der an die Festphase gebundenen Markierung bewertet. Üblicherweise wird der Antikörper mit der Quelle für P-Selectin präinkubiert, bevor die Quelle für den Gegenrezeptor zu dem Inkubationsgemisch zugegeben wird. Eine blockierende Aktivität zeigt sich, wenn ein Überschuss an Antikörper, d. h. 5-fach, 10-fach oder bis zu 100-fach, die Bindung von P-Selectin an seinen Gegenrezeptor im Wesentlichen inhibiert. Der genaue Inhibitionsgrad wird von dem verwendeten Assay abhängen. In einem Assay, der die Inhibition der Bindung von Plättchen an HL-60 Zellen misst, zeigt ein Überschuss an P-Selectin-blockierenden Antikörpern typischerweise mindestens 50, 60, 70, 80 oder 90%, und üblicherweise etwa 80–90% Inhibition.
Die Bindespezifität von vielen blockierenden Antikörpern der Erfindung ist weiter definiert durch deren Kapazität, P-Selectin in der vollständigen oder im Wesentlichen Abwesenheit von Ca⁺⁺ (z. B. in der Gegenwart von 2 mM EDTA (einem Calciumchelator) und in der Abwesenheit von Ca⁺⁺ in einem in vitro Assay) zu binden. Im Gegensatz dazu benötigen die meisten bisher isolierten blockierenden Antikörper gegen P-Selectin Ca++ für eine Aktivität. Siehe Geng et al., J. Biol. Chem. 266: 22313–22318 (1991). Antikörper, die einen Ca⁺⁺-Cofaktor für eine blockierende Aktivität benötigen, können unter in vivo Bedingungen, unter denen die Ca⁺⁺-Gehalte erwartungsgemäß variieren würden, weniger effektiv sein.
Die Kapazität der erfindungsgemäßen Antikörper, E-Selectin-vermittelte Funktionen zu blockieren, kann durch in vitro Assays gezeigt werden, welche analog zu denjenigen sind, die verwendet werden, um eine Blockierung von P-Selectinvermittelten Funktionen zu zeigen. Geeignete Quellen für E-Selectin sind mit E-Selectin transfizierte Säugerzelllinien, aktivierte Endothelzellen sowie gereinigtes E-Selectin (oder extrazelluläre Domänen davon). Wenn der Assay unter Verwendung von gereinigtem E-Selectin durchgeführt wird, kann das E-Selectin an einem festen Träger immobilisiert sein. Geeignete Quellen für Gegenrezeptoren von E-Selectin sind Leukozyten, Neutrophile, Monozyten und HL-60 Zellen und geeignete, mit L-Selectin transfizierte Zelllinien. Der Grad der Bindungsinhibition hängt wiederum von den Komponenten in dem Assay ab. In einem Assay, der die Bindung zwischen aktivierten Endothelzellen und HL-60 Zellen misst, zeigen die erfindungsgemäßen Antikörper, wenn im Überschuss vorhanden, typischerweise mindestens etwa 20, 40, 60, 80% Inhibition, oder noch typischer etwa 25–75% oder 50% Inhibition.
Die Kapazität von Antikörpern, L-Selectin-vermittelte Funktionen zu blockieren, kann in einer Vielzahl von in vitro Assays gezeigt werden. Ein einfacher visueller Assay zur Bestimmung einer derartigen Wechselwirkung ist von Kishimoto et al., oben, beschrieben worden. In kurzen Worten werden Monoschichten von humanen Nabelvene-Zellen mit IL-1 stimuliert. Neutrophile, mit oder ohne Vorbehandlung mit dem zu testenden Antikörper werden unter definierten Bedingungen zu der Monoschicht zugegeben, und die Anzahl an adhärenten Neutrophilen wird mikroskopisch bestimmt. In einem Verfahren werden die Neutrophilen aus Humanpatienten erhalten, welche für Neutrophilenadhäsion defizient sind. Siehe Anderson et al., Ann. Rev. Med. 38: 175 (1987). Den Neutrophilen aus derartigen Patienten fehlen Integrinrezeptoren, deren Bindung an Neutrophile die Wirkungen einer Blockierung der L-Selectin-Bindung verbergen könnte.
Bevorzugte Antikörper binden selektiv ein funktionelles Epitop auf P-Selectin- und E-Selectin-Molekülen, welches mit einer Reaktion auf die Verletzung von Gewebe und Entzündung assoziiert ist. Die Bindung der Antikörper an ein funktionelles Epitop von P-Selectin und E-Selectin inhibiert in vivo wirksam eine Adhäsion von Leukozyten an das aktivierte vaskuläre Endothel und/oder an aktivierte Plättchen. Bevorzugte Antikörper beeinträchtigen die Adhäsion von Leukozyten an das aktivierte vaskuläre Endothel, um einen entzündlichen und/oder thrombotischen Zustand zu verhindern oder zu inhibieren.
Die in vivo Blockierwirksamkeit kann in den gleichen Tiermodellen gezeigt werden, die verwendet wurden um eine Wirksamkeit von Antikörpern, die für ein einzelnes Adhäsionsmolekül spezifisch sind, zu zeigen. Beispielsweise beschreiben Mulligan et al., 1991, 1992, oben, Rattemodelle, um die Schutzwirksamkeit von Antikörpern gegen Lungenverletzung zu testen; Coughlan et al., 1994, beschreiben ein Rattemodell um die Wirksamkeit von Antikörpern bei der Behandlung von systemischer Endotoxämie zu testen; und Weyrich et al., oben, beschreiben ein Katzemodell um die Schutzwirkung von Antikörpern bei Myocardischämie und Reperfusionsverletzung zu testen. Andere Tiermodelle für verschiedene Entzündungserkrankungen und Störungen sind beschrieben von Arfors et al., Blood 69: 338 (1987) (Hautläsionen); Tuomanen et al., J. Exp. Med. 170: 959 (1989) (Hirnödem und Tod, hervorgerufen durch Bakterienmeningitis); Lindbom et al., Clin. Immunol. Immunopath. 57: 105 (1990) (Gewebeödem, assoziiert mit Hypersensitivitätsreaktionen vom verzögerten Typ); Wegner et al., Science 247: 456 (1990) (Hyperreaktionsfähigkeit von Luftwegen bei allergischem Asthma); Goldman et al., FASEB J. 5: A509 (1991) (mittelbare Lungenverletzung nach Aspiration); Gundel et al., J. Clin. Invest. 88: 1407 (1991) (Spätphase-Bronchienverengerung nach Antigenexposition); Hutchings et al., Nature 346: 639 (1990) (Diabetes); Flavin et al., Transplant, Proc. 23: 533 (1991) (Überleben von Herzallotransplantat); Wegner et al., Am. Rev. Respir. Dis. 143: A544 (1991) (Lungenschaden und -dysfunktion, sekundär zu Sauerstofftoxizität); Cosimi et al., J. Immunol. 144: 4604 (1990) (Nierenallotransplantatabstoßung); Jasin et al., Arthritis Rheum. 33: S34 (1990) (Antigen-induzierte Arthritis); Thomas et al., FASEB J. 5: A509 (1991) (vaskuläre Verletzung und Tod bei endotoxischem Schock); Bucky et al., Proc. Am. Burn Assoc. 23: 133 (1991) (Verbrennungen); Hernandez et al., Am. J. Physiol. 253: H699 (1987) (Permeabilitätsödem nach Ischämiereperfusion (IR) von Darm); Winquist et al., Circulation 82: III (1990); Ma et al., Cir. Res. 82: III (1990) (Myokardschaden nach Myokardinfarkt); Mileski et al., Surgery 108: 206 (1990) (Gefäß- und Gewebeschaden nach hämorrhagischem Schock und Reanimation); Clark et al., Stroke 22: 877 (1991) (Schädigung des zentralen Nervensystems nach I/R des Rückenmarks); Mileski et al., Proc. Am. Burn Assoc. 22: 164 (1990) (Ödem und Gewebeschaden nach Erfrierung und Wiedererwärmung); Simpson et al., Circulation 81: 226 (1990) (Infarktgröße nach I/R des Myokards). Bevorzugte Antikörper zeigen eine Wirksamkeit in mindestens einer und üblicherweise in mehreren dieser entzündlichen und thrombotischen Erkrankungen und Zustände.
Viele der blockierenden Antikörper der Erfindung zeigen die gleiche oder eine ähnliche Bindespezifität wie einer der beispielhaften, als 5C7.29, X9.11 und 1 D8.10 bezeichneten Antikörper. Das bedeutet, die Antikörper kompetieren mit mindestens einem der beispielhaften Antikörper um eine spezifische Bindung an E-Selectin und/oder P-Selectin. Das in dem Test verwendete E-Selectin und P-Selectin ist bevorzugt human, und kann natürlich oder rekombinant sein. Kompetition zwischen Antikörpern wird bestimmt durch einen Assay, bei dem das zu testende Immunglobulin die spezifische Bindung eines Referenzantikörpers (z. B. 5C7.29) an eine antigene Determinante auf einem P-Selectin- und/oder E-Selectin-Molekül inhibiert. Es sind zahlreiche Typen von kompetitiven Bindeassays bekannt, beispielsweise: direkter oder indirekter Radioimmunassay (RIA) in der Festphase, direkter oder indirekter Enzymimmunassay (EIA) in der Festphase, Sandwichkompetitionsassay (siehe Stahli et al., Methods in Enzymology 9: 242–253 (1983)), direkter Botin-Avidin-EIA in der Festphase (siehe Kirkland et al., J. Immunol. 137: 3614–3619 (1986)), direkter markierter Assay in der Festphase, direkter markierter Sandwichassay in der Festphase (siehe Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press (1988)), Direktmarkierung-RIA in der Festphase unter Verwendung von I–125 Markierung (siehe Morel et al., Molec. Immunol. 25(1): 7–15 (1988)), direkter Biotin-Avidin-EIA in der Festphase (Cheung et al., Virology 176: 546–552 (1990)), und direkt markierter RIA (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32: 77–82 (1990)). Typischerweise beinhaltet ein derartiger Assay die Verwendung von gereinigtem P-Selectin oder E-Selectin, gebunden an eine feste Oberfläche, oder von Zellen, die eines von diesen auf ihrer Oberfläche haben, ein nicht-markiertes Testimmunglobulin und ein markiertes Referenzimmunglobulin. Kompetitive Inhibition wird gemessen durch Bestimmen der Menge an Markierung, welche an die feste Oberfläche oder die Zellen gebunden ist, in der Gegenwart des Testimmunglobulins. Üblicherweise ist das Testimmunglobulin im Überschuss vorhanden. Durch Kompetitionsassay identifizierte Antikörper (kompetierende Antikörper) umfassen Antikörper, die an das gleiche Epitop wie der Referenzantikörper binden, und Antikörper, die an ein angrenzendes Epitop binden, das ausreichend nahe an dem durch den Referenzantikörper gebundenen Epitop ist, so dass sterische Hinderung stattfindet. Wenn ein kompetierender Antikörper im Überschuss vorhanden ist, inhibiert er üblicherweise die spezifische Bindung eines Referenzantikörpers an P-Selectin und/oder E-Selectin um mindestens 50 oder 75%.
Die erfindungsgemäßen Antikörper weisen üblicherweise eine spezifische Bindeaffinität für P-Selectin und E-Selectin von größer oder gleich etwa 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ oder 10¹⁰ M^–1 auf. Antikörper zeigen jedoch nicht notwendigerweise die gleiche spezifische Bindeaffinität für jeden dieser Liganden. Üblicherweise ist die obere Grenze der Bindeaffinität der Antikörper innerhalb eines Faktors von etwa drei, fünf oder zehn der Bindeaffinität eines der beispielhaften Antikörper. Oftmals ist auch die untere Grenze der Bindeaffinität innerhalb eines Faktors von etwa drei, fünf oder zehn der Bindeaffinität der beispielhaften Antikörper. Der Begriff "etwa" umfasst den experimentellen Fehlergrad, der typischerweise bei der Messung der Bindeaffinitäten auftreten kann.
Ein den Antikörper 5C7.29 produzierendes Hybridom wurde am 25. Mal 1994 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland, unter dem Budapester Vertrag hinterlegt, und ihm wurde die Zugangsnummer Nr. ATCC CRL 11640 zugeteilt. Die Herstellung dieses Antikörpers ist in Beispiel 1 beschrieben.
C. Herstellung von Antikörpern
(1) Nicht-humane Antikörper
Antikörper aus Maus und andere nicht-humane Antikörper, die mit P-Selectin und E-Selectin kreuzreagieren, können unter Verwendung eine Reihe von Immunisierungsstrategien erhalten werden. In manchen Strategien werden von Mensch verschiedene Tiere (üblicherweise von Mensch verschiedene Säuger) wie etwa Mäuse mit E-Selectin- und P-Selectin-Antigenen immunisiert, entweder gleichzeitig oder nacheinander. In anderen Strategien werden von Mensch verschiedene Tiere mit nur einem von diesen Antigenen immunisiert. Bevorzugte Immunogene sind Zellen, die stabil mit P-Selectin oder E-Selectin transfiziert sind, und diese Moleküle auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. Andere bevorzugte Immunogene umfassen P-Selectin- und E-Selectin-Proteine oder epitopische Fragmente von P-Selectin und E-Selectin, enthaltend Segmente dieser Moleküle, welche an die beispielhaften Antikörper binden.
Antikörper aus Maus oder nicht-humane Antikörper, die mit allen drei Selectinen. d. h. P-Selectin, E-Selectin und L-Selectin kreuzreagieren, können durch ähnliche Strategien erzeugt werden. In kurzen Worten werden Mäuse entweder gleichzeitig oder nacheinander mit Zellen, die stabil mit entweder P-Selectin, E-Selectin oder L-Selectin transfiziert sind, oder mit gereinigten Selectinproteinen oder epitopischen Fragmenten davon immunisiert.
Aus den immunisierten Tieren erhaltene Antikörper-produzierende Zellen werden immortalisiert und für die Produktion eines Antikörpers, der spezifisch an mehrere Selectine bindet, ausgewählt. Siehe im Allgemeinen, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (C. S. H. P., NY, 1988). Die Bindeassays für die verschiedenen Selectine können separat oder gleichzeitig durchgeführt werden. Gleichzeitige Analyse wird bequem durchgeführt mittels Zweifarben-FACS-Screening nach Inkubation von Hybridomüberständen mit Zellen, die mit Selectinen transfiziert sind. Beispielsweise werden zwei Zellpopulationen, die E-Selectin bzw. P-Selectin exprimieren, differentiell mit einer ersten Markierung markiert, und auf ihre Kapazität, Hybridomüberstände zu binden, getestet. Eine Bindung wird nachgewiesen unter Verwendung eines geeigneten sekundären Antikörpers, der eine zweite Markierung hat. Dieses Schema ist leicht ausbaubar, um einen gleichzeitigen Nachweis einer Bindung an alle drei Selectine zu ermöglichen, durch differentielle Markierung von drei Zellpopulationen, die E-Selectin, P-Selectin bzw. L-Selectin exprimieren, mit unterschiedlichen Intensitäten der ersten Markierung. Alternativ kann ein separates Screening auf die Bindung von E-Selectin, P-Selectin und gegebenenfalls L-Selectin erreicht werden durch Einfarben-FACS-Analyse eines an transfektante Zellen bindenden Überstands oder durch Bindeassays an immobilisiertes E-Selectin, P-Selectin oder L-Selectin. Kreuzreagierende Antikörper werden danach weiter auf ihre Kapazität, funktionelle Eigenschaften von E-Selectin, P-Selectin und L-Selectin zu blockieren, gescreent, unter Verwendung der oben beschriebenen in vitro und in vivo Assays. Die meisten Antikörper, die mit P-Selectin oder E-Selectin kreuzreagieren, blockieren auch die funktionale Kapazität von beiden diesen Molekülen, mit einem Gegenrezeptor wechselzuwirken.
(2) Humanisierte Antikörper
Die Erfindung stellt humanisierte Antikörper mit ähnlicher Bindespezifität und Affinität wie ausgewählte Antikörper aus Maus oder andere nicht-humane Antikörper bereit. Humanisierte Antikörper werden gebildet durch Verknüpfung von CDR-Regionen (bevorzugt CDR1, CDR2 und CDR3) aus nicht-humanen Antikörpern mit humanen Gerüstregionen und konstanten Regionen mittels rekombinanter DNA-Techniken. Siehe Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029–10033 (1989) und WO 90/07861. Die humanisierten Immunglobuline haben Gerüstreste der variablen Region, im Wesentlichen von einem humanen Immunglobulin (bezeichnet als Akzeptorimmunglobulin) und Komplementarität-bestimmende Regionen im Wesentlichen von einem vorstehend beschriebenen Mausimmunglobulin, z. B. dem Antikörper 5C7.29 (bezeichnet als das Donorimmunglobulin). Die konstante Region bzw. die konstanten Regionen, falls vorhanden, stammen ebenfalls im Wesentlichen von einem humanen Immunglobulin.
Im Prinzip kann eine Gerüstsequenz aus einem beliebigen humanen Antikörper als das Templat für das CDR-Pfropfen dienen. Es wurde jedoch gezeigt, dass ein einfacher CDR-Austausch auf ein derartiges Gerüst oftmals zu einem signifikanten Verlust der Bindeaffinität an das Antigen führt (Glaser et al., J. Immunol. 149: 2606 (1992); Tempest et al., Biotechnology 9: 266 (1992); Shalaby et al., J. Exp. Med. 17: 217 (1992)). Je homologer der humane Antikörper zu dem ursprünglichen Mausantikörper ist, umso unwahrscheinlicher ist es, dass eine Kombination der CDR aus Maus mit dem humanen Gerüst eine Verzerrung, welche die Affinität verringern könnte, in die CDR einbringt. Daher ist eine Homologie (d. h. prozentuale Sequenzidentität) von mindestens 65% zwischen dem Gerüst der variablen Region des humanisierten Antikörpers und dem Gerüst der variablen Region des Donorantikörpers bevorzugt.
Die Gerüstreste der variablen Region der schweren und der leichten Kette können von der gleichen oder von verschiedenen humanen Antikörpersequenzen abgeleitet sein. Gerüstsequenzen der schweren und der leichten Kette, die von dem gleichen humanen Antikörper ausgewählt werden, verringern jedoch die Möglichkeit einer Inkompatibilität beim Zusammenbau der zwei Ketten. Die humanen Antikörpersequenzen können die Sequenzen von natürlich vorkommenden humanen Antikörpern sein, oder Konsensussequenzen von mehreren humanen Antikörpern. Siehe Carter et al., WO 92/22653. Bestimmte Aminosäurereste aus den Gerüstresten der humanen variablen Region können zur Substitution ausgewählt werden, basierend auf ihrem potentiellen Einfluss auf die Konformation der CDR und/oder die Bindung an Antigen. Die Untersuchung derartiger potentieller Einflüsse geschieht durch Modellierung, Untersuchung der Charakteristika der Aminosäuren an bestimmten Positionen, oder empirische Beobachtung der Wirkungen von Substitution oder Mutagenese von bestimmten Aminosäuren.
Wenn beispielsweise ein Aminosäureunterschied zwischen einem Gerüstrest der variablen Region von 5C7.29 aus Maus und einem ausgewählten Gerüstrest einer humanen variablen Region vorliegt, sollte die Aminosäure des humanen Gerüsts üblicherweise durch die entsprechende Gerüst-Aminosäure aus dem Maus-Antikörper substituiert werden, wenn vernünftigerweise erwartet wird, dass die Aminosäure:

(1) das Antigen direkt kontaktiert,
(2) in der Sequenz an eine CDR-Region angrenzt, oder
(3) anderweitig mit einer CDR-Region wechselwirkt (z. B. innerhalb von 4–6 A zu einer CDR-Region liegt).

Andere Kandidaten für eine Substitution sind Aminosäuren eines humanen Akzeptorgerüsts, die für ein humanes Immunglobulin an dieser Position ungewöhnlich sind. Diese Aminosäuren können durch Aminosäuren aus der äquivalenten Position des Donorantikörpers oder aus äquivalenten Positionen typischerer humaner Immunglobuline substituiert werden. Die Gerüste der variablen Region von humanisierten Immunglobulinen zeigen üblicherweise mindestens 85% Sequenzidentität zu einer humanen Gerüstsequenz der variablen Region oder einem Konsensus derartiger Sequenzen.
(3) Humane Antikörper
In einem anderen Aspekt der Erfindung werden humane Antikörper bereitgestellt, die mit E-Selectin und P-Selectin kreuzreagieren. Diese Antikörper werden durch eine Reihe von nachstehend beschriebenen Techniken produziert. Manche humane Antikörper werden durch kompetitive Bindeexperimente ausgewählt, oder ansonsten aufgrund der gleichen Epitopspezifität wie ein beispielhafter Antikörper aus Maus, wie etwa 5C7.29. Die Wahrscheinlichkeit, dass derartige Antikörper ähnliche therapeutische Eigenschaften teilen, ist insbesondere hoch.
a. Triom-Methodik
Der grundlegende Ansatz und ein beispielhafter Zellfusionspartner, SPAZ-4, zur Verwendung in diesem Ansatz wurden von Oestberg et al., Hybridoma 2: 361–367 (1983); Oestberg, US Patent Nr. 4,634,664; und Engleman et al., US Patent Nr. 4,634,666 beschrieben. Die durch diese Verfahren erhaltenen Antikörperproduzierenden Zelllinien werden Triome genannt, da sie auf drei Zellen – zwei humane und eine Mauszelle – zurückgehen. Zunächst wird eine Mausmyelomlinie mit einem humanen B-Lymphozyten fusioniert, wobei eine xenogene Hybridzelle, die keine Antikörper produziert, erhalten wird, wie etwa die von Oestberg, oben, beschriebene Zelllinie SPAZ-4. Die xenogene Zelle wird danach mit einem immunisierten humanen B-Lymphozyten fusioniert, wobei eine Antikörperproduzierende Triomzelllinie erhalten wird. Es hat sich herausgestellt, dass Triome Antikörper stabiler produzieren als gewöhnliche, aus humanen Zellen hergestellte Hybridome.
Die B-Lymphozyten werden aus Blut, Milz, Lymphknoten oder Knochenmark eines humanen Donors erhalten. Eine in vivo Immunisierung eines lebenden Menschen mit E-Selectin und/oder P-Selectin ist üblicherweise nicht erwünscht, aufgrund des Risikos, eine schädliche Reaktion zu initiieren. Somit werden B-Lymphozyten üblicherweise in vitro mit einem E-Selectin und/oder P-Selectin, oder einem antigenen Fragment von einem von diesen, oder einer Zelle, die eines von diesen auf ihrer Oberfläche hat, immunisiert. Spezifische epitopische Fragmente, bestehend im Wesentlichen aus den Aminosäuresegmenten, welche an einen der beispielhaften Mausantikörper binden, sind für die in vitro Immunisierung bevorzugt.
B-Lymphozyten werden dem Antigen typischerweise während eines Zeitraums von 7–14 Tagen in einem Medium wie etwa RPMI-1640 (siehe Engleman, oben), ergänzt mit 10% Humanserum, ausgesetzt.
Die immunisierten B-Lymphozyten werden mittels gut bekannter Methoden mit einer xenogenen Hybridzelle wie etwa SPAZ-4 fusioniert. Die Zellen werden beispielsweise mit 40–50% Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1000– 4000 während etwa 5–10 Minuten bei etwa 37°C behandelt. Zellen werden von dem Fusionierungsgemisch abgetrennt und in einem für die gewünschten Hybride selektiven Medium (z. B. HAT oder AH) propagiert. Klone. welche Antikörper mit der erforderlichen Bindespezifität sezernieren, werden identifiziert durch Testen des Triom-Kulturmediums auf die Fähigkeit, an E-Selectin und P-Selectin zu binden, unter Verwendung der gleichen Methoden wir vorstehend für nicht-humane Antikörper diskutiert. Triome, die humane Antikörper mit der gewünschten Spezifität produzieren, werden subkloniert, mittels z. B. der limitierenden Verdünnungstechnik, und in vitro in Kulturmedium gezüchtet.
Obwohl Triome im Allgemeinen genetisch stabil sind, kann es sein, dass sie Antikörper in nicht sehr hohen Niveaus produzieren. Expressionsniveaus können erhöht werden durch Klonieren von Antikörpergenen aus dem Triom in einen oder mehrere Expressionsvektoren, und Transformation des Vektors in eine Zelllinie, wie etwa die unten für die Expression von rekombinanten oder humanisierten Immunglobulinen diskutierten Zelllinien.
b. Transgene von Mensch verschiedene Säuger
Humane, mit P-Selectin und E-Selectin kreuzreaktive Antikörper können auch produziert werden aus von Mensch verschiedenen, transgenen Säugern, die Transgene haben, welche für mindestens ein Segment des humanen Immunglobulin-Locus kodieren. Üblicherweise ist der endogene Immunglobulin-Locus derartiger transgener Säuger funktionell inaktiviert. Bevorzugt umfasst das Segment des humanen Immunglobulin-Locus nicht-umgelagerte Sequenzen von Komponenten der schweren und der leichten Kette. Sowohl die Inaktivierung der endogenen Immunglobulingene als auch die Einbringung von exogenen Immunglobulingenen können erreicht werden durch zielgerichtete homologe Rekombination, oder durch das Einbringen von YAC Chromosomen. Die aus diesem Verfahren resultierenden transgenen Säuger sind fähig, die Sequenzen von Immunglobulinkomponenten funktionell umzulagern und ein Antikörperrepertoire von verschiedenen, durch humane Immunglobulingene kodierten Isotypen zu exprimieren, ohne endogene Immunglobulingene zu exprimieren. Die Herstellung und Eigenschaften von Säugern mit diesen Eigenschaften sind in Detall z. B. von Lonberg et al., WO 93/12227 (1993); Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) beschrieben. Transgene Mäuse sind besonders geeignet. Humane, mit P-Selectin/E-Selectin kreuzreagierende Antikörper werden erhalten durch Immunisieren eines transgenen, von Mensch verschiedenen Säugers, wie etwa von Lonberg oder Kucherlapati, oben, beschrieben, gemäß der gleichen Strategie wie für ein nichttransgenes von Mensch verschiedenes Tier diskutiert (Abschnitt I. C.(1)). Monoklonale Antikörper werden hergestellt mittels z. B. Fusionierung von B-Zellen aus derartigen Säugern mit geeigneten Myelomzelllinien unter Verwendung herkömmlicher Kohler-Milstein-Technologie.
c. Phage-Display-Methoden
Ein weiterer Ansatz, um humane, mit E-Selectin und P-Selectin kreuzreagierende Antikörper zu erhalten, besteht darin, eine DNA-Bibliothek aus humanen B-Zellen zu screenen, wie von Dower et al., WO 91/17271, und McCafferty et al., WO 92/01047 beschrieben. Bei diesen Methoden werden Phagenbibliotheken hergestellt, bei denen individuelle Phagen unterschiedliche Antikörper auf ihren äußeren Oberflächen präsentieren. Antikörper werden üblicherweise als Fv oder Fab Fragmente präsentiert. Von Phagen präsentierte Antikörper werden mittels einer Affinitätsanreicherung auf eine Bindung an entweder P-Selectin oder E-Selectin ausgewählt. Phagen, die durch das anfängliche Screening identifiziert wurden, werden danach weiter auf eine Kreuzreaktion mit dem anderen Liganden gescreent.
Bei einer Variation der Phage-Display-Methode können humane Antikörper mit der Bindespezifität eines ausgewählten Mausantikörpers produziert werden. Siehe Winter, WO 92/20791. Bei dieser Methode wird die variable Region entweder der schweren oder der leichten Kette des ausgewählten Mausantikörpers (z. B. 5C7.29) als ein Ausgangsmaterial verwendet. Wenn beispielsweise eine variable Region der leichten Kette als das Ausgangsmaterial verwendet wird, wird eine Phagenbibliothek konstruiert, bei der individuelle Phagen die gleiche variable Region der leichten Kette (d. h. das Ausgangsmaterial aus Maus) und unterschiedliche variable Regionen der schweren Kette aufweisen. Die variablen Regionen der schweren Kette werden aus einer Bibliothek von umgelagerten humanen variablen Regionen der schweren Kette erhalten. Ein Phage, der starke spezifische Bindung für P-Selectin und E-Selectin (z. B. mindestens 10⁸ und bevorzugt mindestens 10⁹ M^–1) zeigt, wird ausgewählt. Die humane variable Region der schweren Kette aus diesem Phagen dient danach als ein Ausgangsmaterial für die Konstruktion einer weiteren Phagenbibliothek. In dieser Bibliothek weist jeder Phage die gleiche variable Region der schweren Kette (d. h. die aus der ersten Display-Bibliothek identifizierte Region) und eine unterschiedliche variable Region der leichten Kette auf. Die variablen Regionen der leichten Kette werden aus einer Bibliothek von umgelagerten humanen variablen Regionen der leichten Kette erhalten. Wiederum werden Phagen mit starker spezifischer Bindung für P-Selectin und E-Selectin ausgewählt. Diese Phagen weisen die variablen Regionen von vollständig humanen Antikörpern, die mit E-Selectin und P-Selectin kreuzreagieren, auf. Diese Antikörper haben üblicherweise die gleiche oder eine ähnliche Epitopspezifität wie das Ausgangsmaterial aus Maus (z. B. 5C7.29).
D. Bispezifische Antikörper
Die Erfindung stellt auch bispezifische oder bifunktionelle Antikörper bereit, die eine Bindungsstelle haben, welche spezifisch an P-Selectin und E-Selectin bindet, und eine zweite Bindungsstelle, welche spezifisch an eine zweite Gruppierung bindet. Bei bispezifischen Antikörpern ist ein Paar von schwerer und leichter Kette üblicherweise aus einem kreuzreagierenden Antikörper, und das andere Paar aus einem gegen ein anderes Epitop erzeugten Antikörper. Dies resultiert in der Eigenschaft einer multifunktionellen Valenz, d. h. der Fähigkeit gleichzeitig an mindestens zwei unterschiedliche Epitope zu binden, von denen eines das Epitop ist, an das der anti-P-Selectin/E-Selectin kreuzreagierende Antikörper bindet. Das andere Epitop könnte z. B. ein Epitop auf L-Selectin sein.
E. Andere therapeutische Mittel
Nachdem ein Antikörper mit gewünschten Eigenschaften, wie etwa 5C7.29 und die anderen beispielhaften Antikörper, produziert worden sind, können durch eine Reihe von Verfahren andere, von Antikörpern verschiedene Mittel mit ähnlicher Bindespezifität und/oder Affinität produziert werden. Beispielsweise diskutieren Fodor et al., US 5,143,854 , eine als VLSIPS^TM bezeichnete Technik, bei der eine breit gefächerte Sammlung von kurzen Peptiden an ausgewählten Positionen auf einem festen Substrat gebildet wird. Derartige Peptide könnten danach auf Bindung an ein durch 5C7.29 erkanntes epitopisches Fragment gescreent werden, gegebenenfalls in Kompetition mit dem 5C7.29. Bibliotheken von kurzen Peptiden können auch unter Verwendung der Phage-Display-Technologie produziert werden, siehe z. B. Devlin, WO 91/18980. Die Bibliotheken können auf Bindung an ein z. B. durch 5C7.29 erkanntes epitopisches Fragment gescreent werden, gegebenenfalls in Kompetition mit 5C7.29.
II. Nukleinsäuren
Die Gene, kodierend für die schweren und leichten Ketten von Immunglobulinen, welche von Hybridom- oder Triomzelllinien, die kreuzreagierende Antikörper sezernieren, produziert werden, werden gemäß den in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (Cold Spring Harbor, NY, 1989); Bergen & Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1987); Co et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992) beschriebenen Methoden kloniert. Beispielsweise werden Gene, die für schwere und leichte Ketten kodieren, aus der genomischen DNA oder cDNA, erzeugt durch reverse Transkription von RNA, eines Hybridoms kloniert. Das Klonieren wird durch herkömmliche Techniken bewerkstelligt, umfassend die Verwendung von PCR-Primern, die an die Sequenzen hybridisieren, welche die zu klonierenden Gene flankieren oder mit ihnen überlappen, oder an Sequenzen der zu klonierenden Gene.
Typischerweise umfassen rekombinante Konstrukte DNA-Segmente, die für eine vollständige schwere Immunglobulinkette und/oder eine vollständige leichte Immunglobulinkette eines von einer Hybridom- oder Triomzelllinie exprimierten Immunglobulins kodieren. Alternativ werden DNA-Segmente produziert, welche lediglich für einen Abschnitt der primären Antikörpergene kodieren, wobei die Abschnitte Binde- und/oder Effektoraktivitäten aufweisen. Andere rekombinante Konstrukte enthalten Segmente von Immunglobulingenen, die an Segmente von anderen Immunglobulingenen fusioniert sind, insbesondere an Segmente von anderen Sequenzen der humanen konstanten Region (schwere und/oder leichte Kette). Sequenzen der humanen konstanten Region können aus verschiedenen Referenzquellen, umfassend die oben in Kabat et al. aufgelisteten, ausgewählt werden.
DNA-Segmente, die für Antikörper kodieren, welche mit P-Selectin/E-Selectin kreuzreagieren, können durch rekombinante DNA-Techniken wie etwa Stellengerichtete (site directed) Mutagenese modifiziert werden (siehe Gillman & Smith, Gene 8: 81–97 (1979); Roberts et al., Nature 328: 731–734 (1987)). Derartige modifizierte Segmente werden üblicherweise die Antigenbindekapazität und/oder Effektorfunktion aufrecht halten. Darüber hinaus sind die modifizierten Segmente üblicherweise nicht so stark von den ursprünglichen Sequenzen abgeändert, um eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen an diese Sequenzen zu verhindern. Die modifizierten Sequenzen kodieren üblicherweise für ein Immunglobulin, das substantielle Sequenzidentität zu einem Referenzimmunglobulin, von dem es abgeleitet ist, aufweist. Da Immunglobulingene, wie viele Gene, separate funktionale Regionen umfassen, von denen jede eine oder mehrere gesonderte biologische Aktivitäten hat, können die Gene an funktionale Regionen von anderen Genen fusioniert werden, wobei Fusionsproteine (z. B. Immuntoxine) mit neuen Eigenschaften oder neuen Kombinationen von Eigenschaften produziert werden.
Die rekombinanten Polynukleotidkonstrukte umfassen typischerweise eine Expressionskontrollsequenz, die operativ mit den kodierenden Sequenzen verknüpft ist, umfassend natürlich assoziierte oder heterologe Promoterregionen. Bevorzugt sind die Expressionskontrollsequenzen eukaryontische Promotersysteme in Vektoren, welche eukaryontische Wirtszellen transformieren oder transfizieren können. Sobald der Vektor in den entsprechenden Wirt eingebracht worden ist, wird der Wirt unter Bedingungen gehalten, die für die Expression der Nukleotidsequenzen in hohem Niveau, und die Sammlung und Reinigung der kreuzreagierenden Antikörper geeignet sind.
Diese Expressionsvektoren können typischerweise in Wirtsorganismen replizieren, entweder als Episomen oder als ein Bestandteil der chromosomalen Wirts-DNA. Expressionsvektoren enthalten normalerweise Selektionsmarker, z. B. Ampicillin-Resistenz oder Hygromycin-Resistenz, um die Bestimmung der mit den gewünschten DNA-Sequenzen transformierten Zellen zu ermöglichen.
E. coli ist ein prokaryontischer Wirt, der zur Klonierung der DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung insbesondere geeignet ist. Mikroben, wie etwa Hefe, sind ebenfalls für eine Expression geeignet. Saccharomyces ist ein bevorzugter Hefewirt, wobei geeignete Vektoren Expressionskontrollsequenzen, einen Replikationsursprung, Terminationssequenzen und dergleichen, je nach Wunsch, aufweisen. Typische Promotoren umfassen 3-Phosphoglyceratkinase und andere glycolytische Enzyme. Induzierbare Hefepromotoren umfassen, neben anderen, Promotoren von Alkoholdehydrogenase, Isocytochrom C, und von Enzymen, die für die Verwertung von Maltose und Galaktose verantwortlich sind.
Säugerzellen sind ein bevorzugter Wirt für die Expression von Nukleotidsegmenten, die für Immunglobuline oder Fragmente davon kodieren. Siehe Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publishers, NY, 1987). In der Technik wurde eine Reihe von geeigneten Wirtszelllinien entwickelt, die zur Sezernierung von intakten heterologen Proteinen geeignet sind, und sie umfasst CHO Zelllinien, verschiedene COS Zelllinien, HeLa Zellen, L-Zellen, und Myelomzelllinien. Bevorzugt stammen die Zellen nicht von Mensch. Expressionsvektoren für diese Zellen können Expressionskontrollsequenzen, wie etwa einen Replikationsursprung, einen Promoter, einen Enhancer (Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49 (1986)), und notwendige Prozessierungsinformationsstellen, wie etwa Ribosomenbindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen und Transkriptionsterminationssequemzen umfassen. Bevorzugte Expressionskontrollsequenzen sind Promotoren, die von endogenen Genen, Cytomegalovirus, SV40, Adenovirus, Rinderpapillomvirus und dergleichen abgeleitet sind. Siehe Co et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992).
Die Vektoren, welche die interessierenden DNA-Segmente enthalten, können in Abhängigkeit vom Typ des zellulären Wirts mittels gut bekannter Methoden in die Wirtszelle transferiert werden. Beispielsweise wird Calciumchlorid-Transfektion üblicherweise für prokaryontische Zellen verwendet, während Calciumphosphat-Behandlung, Elektroporation, Lipofektion, Biolistik und Transfektion auf Basis von Viren für andere zelluläre Wirte verwendet werden können. Andere Methoden, die zur Transformation von Säugerzellen verwendet werden, umfassen die Verwendung von Polybren, Protoplastenfusion, Liposomen, Elektroporation und Mikroinjektion (siehe im Allgemeinen Sambrook et al., oben).
Nach Expression können kreuzreagierende Immunglobuline der Erfindung gemäß Standardvorgehensweisen der Technik gereinigt werden, umfassend HPLC-Reinigung, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und dergleichen (siehe im Allgemeinen Scopes, Protein Purification (Springer Verlag, NY, 1982)).
III. Epitop-Kartierung
Das P-Selectin-Epitop, bzw. die P-Selectin-Epitope, die von 5C7.29 oder einem anderen kreuzreagierenden Antikörper gebunden werden, können bestimmt werden, indem eine Familie von Fragmenten bereitgestellt wird, die unterschiedliche Aminosäuresegmente von P-Selectin enthalten. Jedes Fragment umfasst typischerweise mindestens 4, 6, 8, 10, 20, 50 oder 100 aufeinander folgende Aminosäuren. Die Familie an Polypeptidfragmenten deckt einen Großteil der oder die gesamte Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne eines P-Selectin-Polypeptids ab. Mitglieder der Familie werden individuell auf eine Bindung an z. B. den Antikörper 5C7.29 getestet. Das kleinste Fragment, das spezifisch an den Testantikörper binden kann, enthält die Aminosäuresequenz des von dem Antikörper erkannten Epitops. Das von dem Antikörper gebundene E-Selectin-Epitop wird durch eine analoge Strategie unter Verwendung einer Familie von E-Selectin-Peptiden kartiert. Es wird erwartet, dass die entsprechenden Epitope auf P-Selectin und E-Selectin auf Segmente dieser Moleküle, die einen hohen Grad an Sequenzidentität aufweisen, kartieren. Die epitopischen Fragmente sind nützlich als Immunogene zur Erzeugung weiterer kreuzreagierender Antikörper. Die epitopischen Fragmente sind auch nützlich als therapeutische Mittel, die agonistisch oder antagonistisch bezüglich der Funktionen von P-Selectin oder E-Selectin wirken.
Ein anderes Verfahren zur Kartierung von Epitopen umfasst das Testen der Fähigkeit eines Antikörpers an E-Selectin oder P-Selectin zu binden, in welche Zufallsmutationen eingeführt worden sind. Dieses Verfahren ist ausführlicher in Beispiel 9 beschrieben.
IV. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verwendung in den unten diskutierten therapeutischen Verfahren umfassen typischerweise einen Wirkstoff, wie etwa einen kreuzreagierenden E-Selectin/P-Selectin-Antikörper, aufgelöst in einem akzeptablen Träger, bevorzugt einem wässrigen Träger. Manche Zusammensetzungen enthalten einen Cocktall von mehreren Wirkstoffen, beispielsweise einen kreuzreagierenden Antikörper und ein thrombolytisches Mittel. Eine Vielzahl von wässrigen Trägern kann verwendet werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), 0,4% Salzlösung, 0,3% Glycin, Humanalbuminlösung und dergleichen. Diese Lösungen sind steril und im Allgemeinen frei von teilchenförmigem Material. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen nach Bedarf enthalten, um sich physiologischen Bedingungen anzunähern, wie etwa pH-Einstellmittel und Puffersubstanzen, Mittel zur Einstellung der Toxizität und dergleichen, beispielsweise Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid und Natriumlactat. Die Konzentration an Antikörper in diesen Formulierungen kann über einen breiten Bereich variieren, d. h. von kleiner als etwa 0,005 Gew.-%, üblicherweise mindestens etwa 1 Gew.-%, bis zu 15 oder 20 Gew.-%, und wird primär auf Basis von Fluidvolumina, Viskositäten und so weiter ausgewählt, gemäß dem ausgewählten, besonderen Anwendungsmodus.
Somit könnte eine typische pharmazeutische Zusammensetzung zur Injektion derart formuliert sein, so dass sie 1 ml steriles gepuffertes Wasser und 1–10 mg Immunglobulin enthält. Eine typische Zusammensetzung zur intravenösen Infusion könnte derart formuliert sein, so dass sie 250 ml sterile Ringer-Lösung und 150 mg Antikörper enthält. Methoden zur Herstellung von Zusammensetzungen, die parenteral verabreicht werden können, sind in Remington's Pharmaceutical Science (15. Auflage, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980) beschrieben.
Therapeutische Mittel der Erfindung können zur Lagerung eingefroren oder lyophilisiert, und vor Verwendung in einem geeigneten Träger rekonstituiert werden. Lyophilisation und Rekonstitution können zu variierenden Graden eines Aktivitätsverlusts der Antikörper führen (z. B. neigen bei herkömmlichen Immunglobulinen IgM-Antikörper zu einem höheren Aktivitätsverlust als IgG-Antikörper). Gegebenenfalls müssen Dosierungen zur Kompensierung angepasst werden.
V. Therapeutische Verfahren
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung sind nützlich zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen und Zuständen, insbesondere den von Neutrophilen vermittelten. Die duale Spezifität der Antikörper führt zu der Inhibierung von entzündlichen Ereignissen, welcher entweder durch P-Selectin oder E-Selectin vermittelt werden.
Beispielsweise sind die Antikörper geeignet für die therapeutische und prophylaktische Behandlung von Ischämie-Reperfusionsverletzung, verursacht durch Myokardinfarkt, zerebralem ischämischem Ereignis (z. B. Schlaganfall), Niereninfarkt, Leberinfarkt oder Milzinfarkt, Hirnchirurgie, Lungenverletzung, Schock, Herzchirurgie (z. B. Herzarterien-Bypass), elektiver Angioplastie und dergleichen. Andere bevorzugte Anwendungen sind die Behandlung von Sepsis, Atemnotsyndrom bei Erwachsenen und multiplem Organversagen. Die Antikörper sind auch nützlich zur Behandlung von Verletzungen aufgrund von Trauma, Verbrennungen, Erfrierungen oder Schädigung des Rückenmarks. Die Antikörper werden weiter Verwendung finden bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, umfassend rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematodes, multiple Sklerose, Diabetes Typ 1 und Uveitis, bei der Behandlung von entzündlichen Hauterkrankungen wie etwa Psoriasis, und bei der Behandlung von Meningitis und Enzephalitis. Die Antikörper sind auch nützlich für die Behandlung von allergischem Schnupfen, Asthma und Anaphylaxie. Andere typische Anwendungen sind die Prävention und Behandlung von Organtransplantatabstoßung und Transplantat-Wirt-Reaktion.
Die die Antikörper enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen sind insbesondere geeignet zur parenteralen Verabreichung, d. h. subkutan, intramuskulär oder intravenös. Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch verabreicht werden, typisch für lokale Anwendung, durch künstliche Sondenernährung oder Spülung, intraperitoneale Injektion, ophthalmische Salben. topische Salben, intrakraniale Injektion (typischerweise in einen Hirnventrikel), Injektion in den Herzbeutel oder Injektion in Schleimbeutel.
Die Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemäßen Antikörper oder einen Cocktall davon enthalten, können für prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen verabreicht werden. Bei therapeutischen Anwendungen werden die Zusammensetzungen einem Patienten, der bereits an einer entzündlichen Erkrankung leidet, verabreicht, in einer ausreichenden Menge, um die Erkrankung und deren Komplikationen zu heilen oder zumindest partiell zu stoppen. Eine adäquate Menge, um dies zu bewirken, ist als eine "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Wirksame Mengen für diese Verwendung werden von der Schwere der Erkrankung und dem allgemeinen Zustand des dem Patienten eigenen Immunsystems abhängen, aber im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis etwa 200 mg Antikörper pro Dosis liegen, wobei die Verwendung von Dosierungen von 5 bis 80 mg pro Patient gebräuchlicher sein wird. Dosierungsschemata werden in Abhängigkeit vom Erkrankungsstatus und dem Status des Patienten variieren, und werden typischerweise von einer einzigen Bolusdosis oder einer kontinuierlichen Infusion bis zu mehreren Verabreichungen pro Tag (z. B. alle 4–6 Stunden) reichen, oder wie vom behandelnden Arzt und dem Zustand des Patienten indiziert. Bei lebensbedrohlichen oder potentiell lebensbedrohlichen Situationen ist es möglich, und kann vom behandelnden Arzt als erwünscht erachtet werden, substantielle Überschüsse dieser Antikörper zu verabreichen.
Bei prophylaktischen Anwendungen werden Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemäßen Antikörper oder einen Cocktall davon enthalten, einem Patienten verabreicht, der nicht bereits an einer bestimmten Erkrankung leidet, um die Widerstandsfähigkeit des Patienten zu verstärken. Eine derartige Menge ist als eine "prophylaktisch wirksame Dosis" definiert. Bei dieser Verwendung hängen die genauen Mengen wiederum vom Gesundheitszustand und dem allgemeinen Immunitätsniveau des Patienten ab, liegen aber im Allgemeinen im Bereich von 1 bis 80 mg pro Dosis. Bevorzugte prophylaktische Anwendungen sind zur Verhinderung von Atemnotsyndrom bei Erwachsenen in Patienten, die bereits an Sepsis oder Trauma leiden; zur Verhinderung einer Organtransplantatabstoßung; und zur Verhinderung von Reperfusionsverletzung bei Patienten, die an Ischämie leiden. Bei schwerkranken Patienten werden häufig Dosierungen von 50 bis 150 mg humanisiertes oder humanes Immunglobulin pro Verabreichung verwendet, und höhere Dosierungen können indiziert sein.
Einfache oder mehrfache Verabreichungen der Zusammensetzungen können mit Dosismengen und Schemata ausgeführt werden, die vom behandelnden Arzt ausgewählt werden. In jedem Falle sollten die pharmazeutischen Formulierungen eine ausreichende Menge des bzw. der erfindungsgemäßen Antikörper bereitstellen, um den Patienten wirksam zu behandeln.
Die Antikörper können auch in Kombination mit anderen Antikörpern verwendet werden, insbesondere mit Antikörpern, die mit unterschiedlichen Adhäsionsmolekülen reaktiv sind. Geeignete Antikörper umfassen beispielsweise diejenigen, welche für CD11a, CD11b, CD18, L-Selectin und ICAM-1 spezifisch sind. Andere geeignete Antikörper sind die für Lymphokine, wie etwa IL-1, IL-2 und TNF-γ, sowie deren Rezeptoren spezifischen. Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch zusammen mit chemotherapeutischen Mitteln verabreicht werden. Geeignete Mittel umfassen nicht-steroide entzündungshemmende Arzneimittel und Corticosteroide, aber es können auch zahlreiche zusätzliche Mittel (z. B. Cyclosporin) verwendet werden.
In manchen therapeutischen Methoden der Ischämie-Reperfusionstherapie werden kreuzreagierende Antikörper in Kombination mit thrombolytischen Mitteln verwendet. In früheren Methoden werden Patienten mit Myokardinfarkt oder instabiler Angina oftmals durch Öffnen der verstopften Herzarterie behandelt. Ein Wiederöffnen der verstopften Herzarterie kann durch Verabreichen von thrombolytischen Mitteln erreicht werden, welche das die Verstopfung verursachende Gerinnsel lysieren und dadurch den Blutfluss im Herz wieder herstellen. Reperfusion des Gefäßes kann auch durch perkutane transluminale Herzangioplastie (PTCA, percutaneous transluminal coronary angioplasty) mittels Balloonerweiterung des verstopften und eingeengten Segments der Herzarterie erreicht werden. Wiederherstellung des Blutflusses im Herz führt in früheren Verfahren jedoch zu Ischämie-Reperfusionsverletzung.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren wird durch die Kombination eines thrombolytischen Mittels oder von PCTA mit kreuzreagierenden E-Selectin/P-Selectin-Antikörpern eine Ischämie-Reperfusionsverletzung verringert oder verhindert. Antikörper werden üblicherweise prophylaktisch vor oder gleichzeitig mit der Verabreichung von thrombolytischen Mitteln oder der Einleitung von PCTA verabreicht. Weitere Dosierungen an Antikörper werden danach häufig während und nach der thrombolytischen oder angioplastischen Behandlung verabreicht. Der Zeitabstand zwischen prophylaktischer Verabreichung der Antikörper und der Einleitung einer thrombolytischen oder angioplastischen Behandlung beträgt üblicherweise 5–60 min, bevorzugt 5–30 min und am meisten bevorzugt 5–10 min. Die Antikörper werden parenteral verabreicht, bevorzugt durch intravenöse Injektion, in Dosierungen von 0,01–10 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt von 0,14–5 mg/kg, und am meisten bevorzugt von 0,3–3 mg/kg. Die Antikörper können als eine intravenöse Bolusinjektion, z. B. über 1–5 min, als wiederholte Injektionen kleinerer Dosierung, oder als eine intravenöse Infusion verabreicht werden. Die Bolusinjektion ist insbesondere geeignet für die prophylaktische Dosis oder in einem Notfall. Weitere Dosierungen an Antikörpern können während und nach thrombolytischer oder angioplastischen Behandlung von akutem Myokardinfarkt wiederholt werden (z. B. alle 4–24 Stunden), in den gleichen Proportionen wie oben beschrieben, um optimale Plasmakonzentrationen des Antikörpers zu erreichen.
Thrombolytische Mittel sind Arzneimittel mit der Fähigkeit, direkt oder indirekt eine Auflösung von Thromben in vivo zu stimulieren. Thrombolytische Mittel umfassen Gewebeplasminogenaktivator (siehe EP-B 0 093 619), Activase, Alteplase, Duteplase, Silteplase, Streptokinase, Anistreplase, Urokinase, Heparin, Warfarin, und Cumarin. Zusätzliche thrombolytische Mittel umfassen Saruplase und Vampir-Plasminogenaktivator. Siehe Harris, Protein Engineering 6: 449–458 (1987); PCT/EP 90/00194; US Patent Nr. 4,970,159. Thrombolytische Mittel werden einem Patienten in ausreichender Menge verabreicht um Thromben partiell aufzulösen, oder um die Bildung von Thromben und deren Komplikationen zu verhindern. Eine adäquate Menge, um dies zu bewirken, ist als eine "therapeutisch wirksame Dosis" oder "wirksame Dosis" definiert. Wirksame Mengen für diese Verwendung werden von der Schwere des Zustands, dem Allgemeinzustand des Patienten, dem Verabreichungsweg und einer Kombination mit anderen Arzneimitteln abhängen. Oftmals sind die therapeutisch wirksamen Dosierungen von thrombolytischen Mitteln und Verabreichungspläne für derartige Mittel mit Antikörpern, die mit E-Selectin und P-Selectin kreuzreagieren, die gleichen, die von der FDA für die unabhängigen Verwendungen von thrombolytischen Mitteln zugelassen sind, z. B. 100 mg Alteplase oder 1,5 Millionen IU Streptokinase.
VI. Diagnoseverfahren
Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sind nützlich für die Diagnose der vorstehend diskutierten entzündlichen Zustände und die Überwachung deren Behandlung. Die Antikörper weisen P-Selectin und E-Selectin in einer Gewebeprobe wie etwa Serum oder Endothelzellen nach, z. B. mittels ELISA oder RIA. Die Gegenwart von jedem Selectin ist für eine Entzündung diagnostisch. Selectingehalte können als ein Differenzierungsmarker zur Identifikation und Typisierung von Zellen bestimmter Abstammung und Entwicklungsursprünge verwendet werden.
In derartigen Verfahren kann der Antikörper direkt markiert (z. B. durch radioaktive oder Fluoreszenzmarkierung), und Immunkomplexe über die Markierung bestimmt werden. Üblicherweise ist jedoch der Antikörper unmarkiert, und der gewünschte Komplex aus Antigen-monoklonalem Antikörper wird mit einem Enzym-konjugierten Antikörper gegen den monoklonalen Antikörper bestimmt. Eine Diagnose kann auch erreicht werden durch in vivo Verabreichung eines markierten, mit P-Selectin/E-Selectin kreuzreagierenden Antikörpers und eine Bestimmung durch in vivo Bilddarstellung. Die Konzentration des verabreichten Antikörpers sollte ausreichend sein, so dass die Bindung an Zellen mit dem Zielantigen, verglichen mit dem Hintergrundsignal, bestimmt werden kann. Das diagnostische Reagenz kann für eine Kamerabilddarstellung mit einem Radioisotop markiert sein, oder mit einem paramagnetischen Isotop für eine Bilddarstellung mittels Magnetresonanz oder Elektronenspinresonanz.
VII. Andere Verwendungen
Die Antikörper sind auch für die Affinitätsreinigung von Selectinen und von Zellen, welche diese auf ihren äußeren Oberflächen exprimieren, nützlich. Die Antikörper können auch verwendet werden, um antiidiotypische Antikörper, die eine für eine Antikörperbindung verantwortliche Selectindomäne nachbilden, zu erzeugen. Antiidiotypische Antikörper sind als kompetitive Inhibitoren der Selectinbindung geeignet. Beispielsweise kann ein antiidiotypischer Antikörper gegen einen monoklonalen, mit P-Selectin, E-Selectin kreuzreagierenden Antikörper ausgewählt werden, um mit P-Selectin und/oder E-Selectin um die Bindung an deren Gegenrezeptoren zu kompetieren. Die Antikörper sind auch nützlich in Screenings auf ein therapeutisches Mittel mit der gleichen Bindespezifität wie ein kreuzreagierender Antikörper (siehe Abschnitt I. E).
Die nachfolgenden Beispiele werden bereitgestellt um die Erfindung zu erläutern, ohne sie einzuschränken:
Beispiel 1: Herstellung von mit Selectinen transfizierten Zellen
Maus-L1-2 prä-B Zell-Selectintransfektanten werden erhalten durch Insertion der entsprechenden humanen Selectingene stromabwärts des LCMV-Promoters in pMRB101 oder einem ähnlichen Plasmid (pMRB101 ist ein Derivat von EEb, welches das E. coli gpt Gen enthält. Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072–2076 (1981); Stephans et al., Nucleic Acids Research 17: 7110 (1989)). Plasmid-DNA wird mittels Standardverfahren wie etwa Elektroporation in L1-2 Zellen eingebracht, und die Zellen werden auf Resistenz gegen Mycophenolsäure selektiert. Zellen, die hohe Gehalte des entsprechenden Selectins exprimieren, werden mittels "Panning" oder Fluoreszenz-aktivierte Zellsortiertechniken weiter selektiert. Siehe Lymphocytes, A Practical Approach (G. C. B. Klaus, IRL Press, Oxford, England, 1987).
Beispiel 2: Produktion von kreuzreagierenden monoklonalen Antikörpern
Kreuzreagierende Antikörper wurden unter Verwendung zweier unterschiedlicher Immunisierungsprozeduren produziert. In allen diesen Prozeduren war das Impfmaterial 10⁷ L1-2 Selectintransfektantenzellen (Berg et al., 1991, 1992, oben) in PBS pro Injektion in Mäuse. In einer Prozedur wurden Balb/c Mäuse mit einem Alter von 4–6 Wochen (Simonson Labs, Gilroy, CA) an Tag 0 und Tag 14 IP L1-2^E-Selectin-Transfektanten und an Tag 46 L1-2^P-Selectin-Transfektanten injiziert, gefolgt von Milzzellenfusion an Tag 50. In einer zweiten Prozedur wurden C57/Ld Mäuse mit einem Alter von 4-6 Wochen (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) an Tag 0 mit hypotonisch lysierten L1-2^E-Selectin-Zellen in den Fußballen, danach an den Tagen 3 und 6 mit intakten L1-2^E-Selectin-Zellen und an Tag 9 mit L1-2^P-Selectin-Zellen immunisiert. Die drainierenden Lymphknotenlymphozyten wurden an Tag 12 fusioniert. Bei jeder Prozedur wurden Maus-B-Zellen unter Verwendung von Polyethylenglycol mit P3X-Mausmyelomzellen fusioniert.
Überstände von Hybridomen wurden mittels Zweifarben-FACS-Analyse auf spezifische Bindung sowohl an E- als auch an P-Selectin getestet. L1-2^P-Selectin-Transfektanten und L1-2^kontrolle-Transfektanten wurden durch Inkubation mit Aminohexanoylbiotin-N-hydroxysuccinimid (Zymed Labs, South San Francisco, CA) in einer Konzentration von 10 μg/ml in PBS, pH 8,0, bei Raumtemperatur während 25 min biotinyliert. Nach dem Waschen wurden 2 × 10⁷ Zellen/ml mit FITC-Z-Avidin (Zymed Labs, So. San Francisco, CA), 1 : 150 verdünnt für L1-2^P-Selectin-Zellen und 1 : 1000 für L1-2^kontrolle-Zellen, in FACS-Puffer (2% BSA/PBS/10 mM NaN₃) 30 min bei 4°C inkubiert. Nach dem Waschen wurden Zellen mit unmarkierten L1-2^E-Selectin-Zellen in einem Verhältnis von 1 : 1 : 1 in FACS-Puffer gemischt. 50 μl Hybridomüberstände wurden zu 200.000 gemischten Zellen in 50 μl in Platten mit 96 Vertiefungen zugegeben und 1 h auf Eis inkubiert. Nach dem Waschen wurden 50 μl Sekundärmittel, 50 μl von 1 : 500 F(ab')2 anti-Maus IgG aus Ziege, konjugiert an PE (TAGO, Burlingame, CA), zugegeben, 30 min vor Waschen und Fixieren. FACS-Analyse wurde gemäß Standardprozeduren auf einem Becton Dickinson FACScan^TM (San Jose, CA) durchgeführt.
Überstände, die Antikörper enthielten, welche sowohl mit P-Selectin als auch mit E-Selectin reagieren, wurden durch eine Verschiebung in der roten Fluoreszenz der L1-2^E-Selectin-Transfektanten (nicht mit FITC markiert) und der hellsten FITC-markierten Zellen (L1-2^P-Selectin-Transfektanten) identifiziert. Die L1-2 Kontrollzellen (moderat mit FITC markiert) zeigten keine Verschiebung in der roten Fluoreszenz, was darauf hindeutet, dass die Bindung für P-Selectin und E-Selectin spezifisch war.
Die Ausbeute an kreuzreagierenden Antikörpern als ein Verhältnis von gescreenten Überständen betrug 1/844 und 2/57 für die zwei Immunisierungsschemata.
Überstände, die Bindung an P-Selectin- und E-Selectin-Transfektanten zeigten, wurden durch limitierende Verdünnung subkloniert und in Serum-freiem Medium, enthaltend Restmengen an PBS, angezogen. Drei mit E-/P-Selectin kreuzreagierende Antikörper, bezeichnet als 5C7.29, 1D8.10 und X9.11, wurden aus diesen Überständen über Protein-A-Sepharose (Pierce) gemäß dem empfohlenen Protokoll gereinigt. Zwei nur mit E-Selectin reagierende Antikörper, 1E4 und 2D4, und ein nur mit P-Selectin reagierender Antikörper, 5F4, wurden durch das gleiche Verfahren identifiziert. Die Isotypen von 5C7.29, 1 D8.10, X9.11, 1 E4 und 5F4 wurden als IgG1 bestimmt, und der von 2D4 wurde als IgG2a bestimmt, unter Verwendung eines Innogenetics Inno-Lia Kits zur Isotypisierung von monoklonalen Antikörpern aus Maus (Biosource International, Camarillo, CA).
Die drei mit E-/P-Selectin kreuzreagierenden Antikörper wurden durch Einfarben-FACS-Analyse auch auf ihre Fähigkeit getestet an die natürlichen Liganden zu binden, anstelle der in den ursprünglichen Screening-Assays verwendeten rekombinanten Formen. Die Quelle des in diesen Tests verwendeten natürlichen E-Selectins waren TNF-α-aktivierte humane Nabelvene-Endothelzellen (HUVEC). In aktivierter Form exprimieren HUVEC Zellen E-Selectin, exprimieren aber keine nennenswerten Mengen an P-Selectin. 1b zeigt, dass der mit E-/P-Selectin kreuzreaktive Antikörper 5C7.29 mit TNF-α-aktivierten HUVEC (gezeigt durch schwarze Histogramme), aber nicht mit nicht-aktivierten HUVEC (graue Histogramme) reagiert. Ähnliche Ergebnisse wurden für die zwei anderen kreuzreagierenden Antikörper X9.11 und 1 D8.10 erhalten. Die aktivierten Zellen reagierten auch mit dem anti-E-Selectin blockierenden Antikörper H18/7 (1a (Becton Dickinson (San Jose, CA)), aber nicht mit den P-Selectin-spezifischen Antikörpern WAPS 12.2 und 5F4 (WAPS 12.2, ein P-Selectin blockierender Antikörper, wurde von R. Aaron Warnock und Eugene C. Butcher (Stanford, CA) bereitgestellt).
Die Quelle des in diesen Tests verwendeten natürlichen P-Selectins waren Thrombin-aktivierte Plättchen. 2b zeigt, dass 5C7.29 an diese Zellen bindet, wie der bekannte P-Selectin Antikörper WAPS 12.2 (2a). Ähnliche Ergebnisse wurden mit X9.11 und 1 D8.10 erhalten. Plättchen reagierten nicht signifikant mit den anti-E-Selectin Antikörpern H18/7 oder 1E4.
Die mit E-/P-Selectin kreuzreagierenden Antikörper wurden weiter auf eine Bindung an L1-2^L-Selectin-Transfektanten und mit normalen Humanlymphozyten analysiert. Eine spezifische Bindung wurde nicht beobachtet, was zeigt, dass die Antikörper für E- und P-Selectin spezifisch sind und nicht an L-Selectin binden.
Um zu bestätigen, dass die kreuzreagierenden Antikörper tatsächlich monoklonal waren, wurden Pärklärexperimente durchgeführt. 10 ng Antikörper (eine limitierende Menge) wurden 1 h mit einer großen Anzahl (10⁷) von L1-2^E-Selectin-Zellen oder L1-2^P-Selectin-Zellen inkubiert. Der Überstand wurden danach in ein zweites Aliquot von L1-2^E-Selectin-Zellen oder L1-2^P-Selectin-Zellen (der gleiche Zelltyp wie zuvor) transferiert und 1 h inkubiert. Überstand wurde in ein drittes Aliquot von Zellen des gleichen Typs wie zuvor transferiert, für eine weitere einstündige Inkubation. Danach wurde Überstand entfernt und mittels Einfarben-FACS-Analyse auf Reaktivität mit L1-2^E- ^Selectin L1-2^P-Selectin oder nicht-transfizierten L1-2 Zellen untersucht.
3 zeigt, dass die Präinkubation einer Lösung des Antikörpers 5C7.29 mit L1-2^P- ^Selectin-Transfektanten eine spätere Reaktivität für sowohl P-Selectin als auch E-Selectin eliminierte. Ähnliche Ergebnisse wurden nach Präinkubation mit L1-2E-^Selectin-Transfektanten festgestellt. Diese Ergebnisse würden nur erhalten werden, wenn der Antikörper an beide Selectine bindet, und nicht, wenn der Antikörper ein Gemisch aus zwei verschiedenen Antikörpern wäre, von denen einer mit E-Selectin reaktiv ist und einer mit P-Selectin reaktiv ist. Die dualen Spezifitäten von 5C7.29 stammen daher von dem gleichen Antikörper. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Antikörper X9.11 und 1 D8.10 erhalten.
Beispiel 3: Inhibition von E-Selectin-vermittelten Funktionen
Der Antikörper 5C7.29 wurde auf die Fähigkeit, E-Selectin-vermittelte Funktionen zu blockieren, getestet. In einem Assay wurde der Antikörper auf die Inhibition einer Bindung von HL-60 an durch Tumornekrosefaktor α (TNF-α) aktivierte humane Nabelvene-Endothelzellen (HUVEC) getestet. Dieser Bindeassay simuliert die Bindung von Neutrophilen an Endothelzellen während einer entzündlichen Reaktion. Die HL-60 Zellen sind eine promyelozytische Zelllinie, die aus einem Patienten mit akuter promyelozytischer Leukämie stammt. Collins et al., Nature 270, 347–349 (1977). Die HUVEC Zellen sind Endothelzellen, die nach Aktivierung mit TNF-α während 4–6 Stunden E-Selectin, aber kein P-Selectin exprimieren.
HUVEC wurden von Clonetics (San Diego, CA) erhalten und wie empfohlen kultiviert. Konfluente Kuluren, bis zu Passage 6, angezogen in Lab Tek Kunststoffschalen mit 8 Vertiefungen (Nunc, Naperville, IL) wurden 4 Stunden mit 1 ng/ml TNF-α (R&D Systems, Minneapolis, MN) aktiviert. HUVEC Kulturen wurden gewaschen und 20 min in 0,15 ml Assaypuffer (10% normales Rinderserum/10% normales Kaninchenserum/10 mM HEPES, pH 7,2/RPMI), enthaltend Antikörper in einer Konzentration von 17 μg/ml (d. h. im Überschuss), inkubiert.
HL-60 Zellen wurden mit 6-Carboxyfluoresceindiacetatacetoxymethylester (CFDA-AM, Molecular Probes, Eugene, OR) (von Andrian et al., 1991, oben) durch eine 30-minütige Inkubation in 10 mg/ml RPMI/10 mM HEPES, pH 7,2, fluoreszenzmarkiert, gewaschen und in Assaypuffer resuspendiert und 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die resuspendierten Zellen (6 × 10⁵ Zellen in 0,15 ml) wurden danach zu den HUVEC Kulturen zugegeben.
Objektträger wurden 15 min bei Raumtemperatur auf einer Rotationsvorrichtung (Innova 200, New Brunswick Inc.) mit 50 UpM rotiert. Die Deckgläser wurden entfernt und nicht-adhärente HL-60 Zellen wurden durch kurzes Eintauchen der Objektträger in DMEM entfernt. Adhärente Zellen wurden durch Eintauchen in 1 Paraformaldehyd-PBS fixiert. Die Objektträger wurden mikroskopisch untersucht und die Anzahl von gebundenen Zellen pro Feld wurde bestimmt. Zwei Behandlungen pro Objektträger (vierfach) wurden analysiert.
4 zeigt, dass die Anzahl der an die aktivierten HUVEC Zellen bindenden HL-60 Zellen durch Präinkubation mit 5C7.29 47% verringert wurde. Dies ist im Vergleich zu der Blockierung durch den anti-E-Selectin-spezifischen Antikörper N18/7 (38%) ein guter Wert. Die Bindung wurde durch einen Kontrollantikörper nicht signifikant vermindert.
Da HUVEC Zellen auch P-Selectin exprimieren können (obwohl bei den vorliegenden Aktivierungsbedingungen nur in geringen Gehalten), wurde 5C7.29 auch hinsichtlich der Bindung von HL-60 an mit E-Selectin transfizierte CHO Zellen getestet. CHO Zellen, die permanent mit einer verkürzten Form von E-Selectin, enthaltend die ersten vier N-terminalen Domänen von E-Selectin an die Transmembrandomäne und die zytoplasmatische Domäne eines anderen Proteins fusioniert, transfiziert sind, wurden gemäß Standardverfahren erhalten. Die Expression wurde durch Reaktivität mit einem anti-E-Selectin Kontrollantikörper (N18/7) bestätigt. Eine Inhibition der Bindung zwischen fluoreszenzmarkierten HL-60 und den transfizierten CHO Zellen wurde unter Verwendung des gleichen Assays wie für die TNF-α-aktivierten HUVEC durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass 5C7.29 die Adhäsion um 82% inhibiert (5). Ähnliche Ergebnisse wurden für 1 D8.10, X9.11 und den E-Selectin blockierenden Antikörper 1 E4 beobachtet. Der nicht-blockierende, für P-Selectin spezifische Kontrollantikörper 5F4 hatte in diesem Assay keine signifikante Wirkung.
Die kreuzreagierenden Antikörper blockierten auch eine Bindung von humanen Neutrophilen aus peripherem Blut an TNF-α-aktivierte HUVEC. In einer Endkonzentration von 10 μg/ml blockierte 5C7.29 71 +/– 13%, X9.11 blockierte 62 +/– 8% und 1D8 blockierte 52 +/– 10% der Bindung von Neutrophilen an aktivierte HUVEC, während die anti-E-Selectin Antikörper 1E4 und H18/7 (Bevilacqua et al., 1987, oben) 68 +/– 4% und 68 +/– 15% blockierten und ein IgG1 Kontrollantikörper aus Maus nicht blockierte (–21% +/–11%), n = 4. Für diese Experimente wurden Neutrophile aus normalem Humanblut mittels Dichtegradientenzentrifugation und Dextransedimentation durch Standardprozeduren Isoliert (Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Hrsg., John Wiley and Sons, New York, 1992). Assays wurden durchgeführt wie für die HL-60 Zellen, außer dass 7,5 × 10⁴ Neutrophile in 0,15 ml zu den HUVEC zugegeben wurden.
Beispiel 4: Inhibition von P-Selectin-vermittelten Funktionen
Die Antikörper 5C7.29, X9.11 und 1 D8.10 wurden auf ihre Fähigkeit getestet, P-Selectin-vermittelte Funktionen zu blockieren. Die Blockierung wurde in einem Plättchen-HL-60 Rosettenassay getestet (Corral et al., 1990, oben). Die Plättchen liefern eine Quelle von P-Selectin exprimierenden Zellen und die HL-60 Zellen simulieren Neutrophile. Normales Humanblut wurde mit Natriumcitrat als Gerinnungshemmer gesammelt und das Plättchen-reiche Plasma (PRP) wurde mittels 10-minütiger Zentrifugation bei 250 G hergestellt. Plättchen wurden aus PRP isoliert durch 20-minütige Zentrifugation bei 1000 G und in einer Konzentration von 3 × 10⁸ in PBS, pH 7,2, resuspendiert. Monoklonale Antikörper (1 μg in 20 μl, d. h. ein Überschuss) wurden zu 20 μl Plättchen zugegeben. In manchen Experimenten wurde normales Humanthrombin (0,3 U/μl) zugegeben um die Plättchen zu aktivieren, wie von Corral et al., 1990, oben, beschrieben. Nach 45 min wurden 20 μl HL-60 Zellen (10⁶/ml in PBS) zugegeben und es wurde weitere 45 min inkubiert. Gebundene Plättchen wurden durch Zugabe von Glutaraldehyd auf 1,25% an HL-60 Zellen fixiert. Mindestens 100 HL-60 Zellen für jede Probe wurden mikrokopisch ausgewertet, und die Anzahl von Zellen mit gebundenen Plättchen (> 2 Plättchen pro HL-60 Zelle) wurde bestimmt.
6 zeigt, dass alle drei kreuzreagierenden Antikörper die Rosettenbildung um etwa das gleiche Ausmaß blockieren wie der P-Selectin-spezifische blockierende Antikörper WAPS 12.2. Ähnliche Blockierexperimente können unter Verwendung von humanen Neutrophilen aus peripherem Blut anstelle von HL-60 Zellen durchgeführt werden. Neutrophile können durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt und in der gleichen Konzentration verwendet werden.
Beispiel 5: Klonierung und Sequenzierung der cDNA der variablen Region der schweren Kette und der leichten Kette des Mausantikörpers 5C7.29
cDNA für die _Gene der variablen Region der schweren Kette und der leichten Kette des Mausantikörpers 5C7.29 wurden kloniert unter Verwendung von verankerten Polymerasekettenreaktionen wie beschrieben (siehe Co et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992)), unter Verwendung von 3'-Primern, die an die konstanten Regionen hybridisierten und HindIII-Stellen enthielten, und von 5'-Primern, die an die dG-Schwänze hybridisierten und EcoRI-Stellen enthielten. Die PCR-amplifizierten Fragmente wurden mit EcoRI und HindIII verdaut und zur Sequenzierung in pUC18 oder pUC19 Vektoren kloniert. Mindestens zwei Gamma-1-spezifische und zwei Kappa-spezifische Klone wurden sequenziert. Die Gamma-1-Klone und die Kappa-Klone haben jeweils eine identische Sequenz. Die cDNA-Sequenzen der variablen Region und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen für die Gamma-1- und die Kappa-Ketten sind in den 7A–7B [SEQ. ID. Nr: 1–4] gezeigt.
Beispiel 6: Planung der variablen Domäne eines humanisierten 5C7.29 Antikörpers
Auf Basis einer Sequenzhomologiesuche gegen die NBRF Proteinsequenz-Datenbank zeigen die variablen Regionen der leichte Kette-Subklasse I und der schwere Kette-Subklasse III eine gute Homologie zum Mausantikörper 5C7.29. Insbesondere liefert der Antikörper III-3R die beste Gerüsthomologie mit 5C7.29 und wurde ausgewählt um die Gerüstsequenzen für die Humanisierung von 5C7.29 bereitzustellen. Andere Mitglieder der leichte Kette-Subklasse I und der schwere Kette-Subklasse III wären jedoch besonders zur Verwendung geeignet, um die Gerüstsequenzen der entsprechenden humanisierten 5C7.29-Ketten bereitzustellen.
Das Computerprogramm ENCAD (M. Levitt et al., J. Mol. Biol. 168: 595 (1983)) wurde verwendet um ein Molekülmodell der variablen Domäne von 5C7.29 zu konstruieren. Das Programm ABMOD (B. T. Zilber et al., Biochem. 29: 10032–41) ist ebenfalls geeignet. Das Modell wurde verwendet um die Aminosäuren im Gerüst von 5C7.29 zu bestimmen, die nahe genug an den CDR sind, um potentiell mit ihnen wechselzuwirken. Um die humanisierten variablen Regionen der leichten und der schweren Kette von 5C7.29 zu konstruieren wurden die CDR aus dem Mausantikörper 5C7.29 in die Gerüstsequenzen des Antikörpers III-3R insertiert. An Gerüstpositionen, bei denen das Modell einen Kontakt mit den CDR nahelegte, wurden die Aminosäuren aus dem Mausantikörper 5C7.29 ausgewählt, um die Reste in der III-3R-Sequenz zu ersetzen. Für den humanisierten 5C7.29 wurde dies an den Resten 69 und 70 in der leichten Kette und an keinen Resten in der schweren Kette getan. Darüber hinaus wurde an manchen Positionen, bei denen die Aminosäure an dieser Position für humane Antikörper ungewöhnlich war, für den III-3R-Gerüstrest eine Aminosäure substituiert, die einen Konsensus in der relevanten Subklasse darstellt. Für den humanisierten 5C7.29 wurde dies an den Positionen 61, 72, 82 und 99 in der leichten Kette und den Resten 1, 75 und 78 in der schweren Kette getan.
Die endgültige Sequenz der variablen Region der schweren und der leichten Kette des humanisierten 5C7.29 ist in den 8A–8B [SEQ. ID NR: 5–8] gezeigt. Viele der potentiellen CDR-Kontaktreste sind jedoch für Substitutionen durch andere Aminosäuren zugänglich und können immer noch ermöglichen, dass der Antikörper eine wesentliche Affinität für die Antigene aufrechterhält. Die nachfolgende Tabelle listet eine Reihe von Positionen im Gerüst auf, an denen alternative Aminosäuren geeignet sein können (Anmerkung: LC = leichte Kette, HC = schwere Kette):
In ähnlicher Weise sind viele der Gerüstreste, die die CDR in den humanisierten schweren und leichten 5C7.29-Ketten nicht kontaktieren, auch für Substitutionen durch andere Aminosäuren zugänglich, entweder aus dem humanen Antikörper III-3R, oder aus den entsprechenden Positionen anderer humaner Antikörper, oder aus dem Mausantikörper 5C7.29 oder anderen Mausantikörpern, während eine wesentliche Affinität und nicht-Immunogenität des humanisierten Antikörpers bewahrt wird. Die nachfolgende Tabelle listet eine Reihe von Positionen im Gerüst auf, an denen alternative Aminosäuren geeignet sein können:
Schließlich können sogar bestimmte Reste in den CDR durch andere Reste substituiert werden, während der Antikörper im Wesentlichen die gleiche Affinität und Spezifität beibehalten kann. Struktur-Funktion-Studien der Antikörperbindung zeigen, dass nicht alle der CDR-Aminosäuren gleichermaßen an der Definition der Affinität gegen ein gegebenes Antigen (oder einen Satz verwandter Antigene) teilhaben. Diese Studien ermöglichen eine Vorhersage mit einer gewissen Zuverlässigkeit von bestimmten CDR-Positionen, bei denen die Wahrscheinlichkeit am geringsten ist, dass sie die Bindecharakteristika eines Antikörpers wesentlich verändern. Beispielsweise definieren Chotia und Mitarbeiter strukturell akzeptable Aminosäuren in CDR-Positionen (Chotia et al., J. Mol. Biol. 196: 902 (1987); Chotia et al., Nature 342: 877 (1989); und Tramontano et al., Proteins: Struct. Funct. Genet. 6: 382 (1989)), und im Modell von 5C7.29 sind viele von diesen nicht Lösungsmittel-zugänglich (d. h. verfügbar um an der Bindung teilzunehmen). Andere Arbeiter haben gezeigt, dass es sein kann, dass die Reste 61–66 von CDR H2 nicht an der Antigenbindung teilnehmen (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992); Hsiao et al., Protein Eng. 7: 815 (1994)). Begutachtungen von Antikörper-Antigen-Komplex-Strukturen unterstützen diese Auffassung (Glaser et al., J. Immunol 149: 2606 (1992); Padlan, Mol. Immunol. 31: 169 (1994)). Manche dieser CDR-Reste, die in humanisiertem 5C7.29 ausgetauscht werden können sowie ihre potentiellen Substitutionen sind in der nachfolgenden Tabelle aufgelistet:
Eine Auswahl von verschiedenen Kombinationen von alternativen Aminosäuren kann verwendet werden um Versionen von humanisiertem 5C7.29 mit variierenden Kombinationen von Affinität, Spezifität, nicht-Immunogenität, Einfachheit der Herstellung und anderen wünschenswerten Eigenschaften zu produzieren. Die obigen Beispiele sind als Erläuterung, nicht als Einschränkung angegeben.
Beispiel 7: Konstruktion von humanisiertem 5C7.29
Für die Konstruktion der Gene der variablen Regionen für den humanisierten Antikörper 5C7.29 wurden Nukleotidsequenzen ausgewählt, welche für die Proteinsequenzen der humanisierten schweren und leichten Kette kodieren, einschließlich des Signalpeptids, im Allgemeinen unter Verwendung von Codons aus der Maussequenz. Mehrere degenerierte Codons wurden verändert um Restriktionsstellen zu erzeugen oder unerwünschte zu entfernen. Die Nukleotidsequenzen der Gene umfassten auch Spleißdonorstellen und eine XbaI-Stelle an jedem Ende. Die Nukleotidsequenzen und die davon kodierten variablen Regionen der leichten und der schweren Kette des humanisierten Antikörpers 5C7.29 sind in den 8A–8B [SEQ. ID NR: 5–8] gezeigt.
Jedes Gen wurde aus acht überlappenden synthetischen Oligonukleotiden konstruiert. Der Zusammenbau und die Amplifizierung der Gene wurde in vier Schritten durchgeführt, wie in 9 gezeigt: (1) die vier Paare von komplementären Oligonukleotiden wurden in separaten Reaktionen annealt und mit Klenow-Polymerase extendiert; (2) die resultierenden vier doppelsträngigen DNA-Fragmente wurden in Paaren gemischt, denaturiert, erneut annealt und in zwei separaten Reaktionen unter Verwendung von Klenow-Fragment extendiert; (3) die resultierenden zwei doppelsträngigen Halbgenfragmente wurden gemischt, denaturiert, erneut annealt und extendiert, wobei die doppelsträngigen Volllängengene der variable Region erzeugt werden; (4) die Genfragmente wurden zum Schluss amplifiziert, unter Verwendung von Taq-Polymerase und von zwei Primern, die an das 5'-Ende und das 3'-Ende der Gene der variablen Region hybridisieren und XbaI-Stellen zur Klonierung in die entsprechenden Expressionsvektoren pVk und pVg4 enthalten. Die Reaktionen wurden unter Bedingungen ausgeführt, die in der Technik gut bekannt sind.
Der Vektor pVk für die Expression der leichten Kette und der Vektor pVg1 für die Expression der schweren Kette wurden früher beschrieben (siehe Co et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992)). Um einen humanisierten Antikörper 5C7.29 des IgG4-Isotyps zu produzieren wurde der schwere Kette-Expressionsvektor pVg4 konstruiert. Dazu wurde das XbaI-BamHI-Fragment von pVg1, das die konstante Region γ1 enthält, durch ein Fragment von annähernd 2000 bp des humanen Gens für die konstante Region γ4 ersetzt (Ellison and Hood, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1984 (1982)), das sich von der HindIII-Stelle vor dem CH1-Exon des γ4-Gens bis 270 bp nach der NsiI-Stelle hinter dem CH4-Exons des Gens erstreckt, unter Verwendung von dem Fachmann gut bekannter Methoden, umfassend Polymerasekettenreaktion.
Die Plasmide der schweren Kette und der leichten Kette wurden in eine Mausmyelomzelllinie, Sp2/0-Ag-14 (ATCC CRL 1581), transfiziert. Die Transfektion erfolgte mittels Elektroporation unter Verwendung einer Gene Pulsen Vorrichtung (Bio-Rad), bei 360 V und 25 uFD Kapazitanz, gemäß den Herstellerangaben. Vor der Transfektion wurden die die leichte Kette- und die schwere Kette-enthaltenden Plasmide unter Verwendung von PvuII linearisiert, mit Phenol-Chloroform extrahiert, und mit Ethanol gefällt. Alle Transfektionen wurden unter Verwendung von 30–50 μg Plasmid-DNA und etwa 10⁷ Zellen in PBS durchgeführt. Die Zellen aus jeder Transfektion wurden in 2 bis 4 Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen plattiert. Nach 48 Stunden wurde Selektivmedium angewandt.
Die Zellen wurden in DMEM + 10% FBS + HT-Mediumergänzung (Sigma) + 1 μg/ml Mycophenolsäure auf gpt-Expression selektiert. Antikörper-produzierende Klone wurden durch Testen der Produktion von Humanantikörpern im Kulturüberstand mittels ELISA gescreent. Antikörper aus den am besten produzierenden Klonen wurde gereinigt durch Führen des Gewebekulturüberstands über eine Säule von Protein A-Sepharose CL-4B (Pharmacia). Die gebundenen Antikörper wurden mit 0,2 M Glycin-HCl, pH 3,0, eluiert und mit 1 M Tris-HCl, pH 8,0, neutralisiert. Der Puffer wurde durch Führen über eine PD10-Säule (Pharmacia) oder durch Dialyse gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) getauscht. Um Zellen zu gewinnen, die höhere Antikörpergehalte produzieren, können die transfizierten Klone in steigenden Methotrexat-Konzentrationen kultiviert werden.
Beispiel 8: Eigenschaften von humanisiertem 5C7.29
Um zu zeigen, dass humanisierter 5C7.29 spezifisch an E-Selectin und P-Selectin bindet, wurden L1-2^E-Selectin- und L1-2^P-Selectin,-Transfektanten 1 Stunde mit humanisiertem 5C7.29 oder Kontrollantikörpern inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen in einer 1 : 400 Verdünnung von Phycoerythrin-konjugiertem antihuman Ig (Biosource, Camarillo, CA) inkubiert, gewaschen, danach mittels Durchflusszytometrie (FACS) auf Fluoreszenz analysiert, wie früher beschrieben (Berg et al., Blood 85: 31 (1995)). Humanisierter 5C7.29 reagiert mit sowohl L1-2^E-^Selectin- als auch L1-2^PE-Selectin-Transfektanten, aber nicht mit L1-2^L-selectin-Transfektanten (10), was zeigt, dass das Humanisierungsverfahren nicht zu einem Verlust der Bindung an entweder E-Selectin oder P-Selectin oder zu einem Zugewinn hinsichtlich der Fähigkeit an L-Selectin zu binden, geführt hatte.
Die Affinität des humanisierten Antikörpers 5C7.29 für E-Selectin und P-Selectin wurde separat durch Kompetition mit dem radiojodierten Mausantikörper 5C7.29 bestimmt (11). Gereinigter Mausantikörper 5C7.29 wurde unter Verwendung des Lactoperoxidaseverfahrens mit Na¹²⁵I (Amersham, Arlington Heights, IL) auf 4 mCi/mg Protein markiert.
CHO^E-Selectin-Zellen und L1-2^P-Selectin-Zellen, die durch Transfektion der E-Selectin- und P-Selectin-Gene in die entsprechenden Wirtszellen CHO und L1-2 (Gallatin et al., Nature 304: 30 (1983)) mittels in der Technik gut bekannter Methoden (siehe z. B. Larsen et al., J. Biol. Chem. 267: 11104 (1992)) erhalten worden waren, wurden als Quellen für E-Selectin und P-Selectin verwendet. Steigende Mengen an Kompetitorantikörper (Maus 5C7.29 oder humanisierter 5C7.29) wurden zu 2 ng radiojodiertem Indikatorantikörper 5C7.29 aus Maus zugegeben und mit 4 × 10⁵ CHO^E-Selectin-Zellen oder L1-2^P-Selectin-Zellen 2 Stunden bei 4°C unter konstantem Schütteln in 0,2 ml Bindepuffer (PBS mit 2% fötalem Kälberserum, 0,1% Natriumazid) inkubiert. Die Zellen wurden danach gewaschen und zentrifugiert, und ihre Radioaktivitäten gemessen. Das Verhältnis von gebundenem und freiem Indikatorantikörper wurde berechnet (11A und 11B).
Die Bindeaffinitäten wurden nach den Methoden von Berzofsky und Berkower (J. A. Berzofsky and I. J. Berkower, in Fundamental Immunology (Hrsg. W. E. Braun), Raven Press (New York), Seite 595 (1984)) berechnet. Der humanisierte 5C7.29 hatte eine Affinität von annähernd 3 × 10⁸ M^–1 für E-Selectin, ohne einen signifikanten Unterschied zu der von Maus 5C7.29, und eine Affinität von annähernd 1,3 × 10⁸ M^–1 für P-Selectin, innerhalb des etwa drei- bis vierfachen des Mausantikörpers 5C7.29. Dieses Experiment zeigt auch direkt, dass humanisierter 5C7.29 die Fähigkeit hat, mit dem Antikörper 5C7.29 aus Maus um eine Bindung an sowohl E-Selectin als auch P-Selectin zu kompetieren. In einem anderen Experiment wurden die Affinitäten von Maus 5C7.29 und humanisiertem 5C7.29 für P-Selectin nach der Methode von Scatchard (Berzofsky und Berkower, oben) mit annähernd 1,9 × 10⁸ M^–1 bzw. 6 × 10⁸ M^–1 bestimmt, in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen des kompetitiven Bindungsexperiments.
Um zu zeigen, dass der humanisierte Antikörper 5C7.29 die Bindung von E-Selectin an einen Gegenrezeptor von E-Selectin inhibiert, wurde dessen Fähigkeit, die Bindung von HL-60 Zellen an E-Selectin-Transfektantenzellen zu inhibieren, bestimmt. Adhäsionsassays von HL-60 Zellen mit CHO^E-Selectin-Zellen wurden durchgeführt wie früher beschrieben (Berg et al., Blood 85: 31 (1995), und oben), in der Gegenwart von monoklonalen Antikörpern in den angegebenen Konzentrationen. 12 zeigt, dass humanisierter 5C7.29 sowie Maus 5C7.29 die Bindung von HL-60 Zellen an CHO^E-Selectin-Transfektanten blockiert. Für das repräsentative gezeigte Experiment wurden zwei Behandlungen pro Objektträger (jede Behandlung vierfach) analysiert und die mittlere sowie die Standardabweichung wurden berechnet. Ein Kontrollantikörper mit passendem Isotyp beeinflusste die Bindung nicht.
Um zu zeigen, dass der humanisierte Antikörper 5C7.29 die Bindung von P-Selectin an einen Gegenrezeptor von P-Selectin inhibiert, wurde dessen Fähigkeit, die Bindung von HL-60 Zellen an aktivierte Plättchen zu inhibieren, bestimmt. Assays der Rosettenbildung von aktivierten Plättchen an die HL-60 Zellen wurden durchgeführt wie früher beschrieben (Berg et al., Blood 85: 31 (1995), und oben), in der Gegenwart von monoklonalen Antikörpern in den angegebenen Konzentrationen. 13 zeigt, dass humanisierter 5C7.29 sowie Maus 5C7.29 die Bindung von Plättchen an HL-60 Zellen blockiert. Ein Kontrollantikörper mit passendem Isotyp hatte in diesem Assay keinen Einfluss auf die Bindung. Das repräsentative gezeigte Experiment wurde dreifach durchgeführt und die mittlere sowie die Standardabweichung wurden berechnet.
Beispiel 9: Epitopkartierunq von 5C7.29
Um die an der Bindung von 5C7.29 beteiligten Aminosäuren von E-Selectin (das Epitop) zu bestimmen, wurde die nachfolgende Vorgehensweise verwendet. DNA, kodierend für die Lectin- und EGF-ähnliche Domäne von humanem E-Selectin, wurde an ein für die humane konstante Region Immunglobulin-Lambda (Cλ) kodierendes Gen, das als ein Identifizierungskennzeichen diente, fusioniert. Die chimäre DNA wurde in einen Plasmidvektor insertiert, der einen lac Promoter und eine pelB Signalsequenz für die Expression und Sezernierung des chimären Proteins (Fusionsprotein) in E. coli bereitstellte. Die E-Selectin-Domänen wurden mittels fehleranfälliger Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung des Enzyms AmpliTaq (Perkin Elmer) und Mn⁺⁺ durch das Zufallsprinzip mutagenisiert, und die Aminosäuresubstitutionen wurden durch DNA-Sequenzierung bestimmt. Der E. coli Stamm TG1ΔrecA wurde mit dem Wildtypplasmid und dem mutierten Plasmid transformiert, und chimäre Proteine wurden durch Anzüchten von transformierten E. coli in 2YT Nährmedium überexprimiert. Nach 8-stündiger Induktion mit 1 mM IPTG wurden Kulturüberstände, welche die chimären Proteine enthielten, gesammelt. Alle Arbeitsschritte wurden gemäß Methoden, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie gut bekannt sind, durchgeführt.
Danach wurden Platten mit 96 Vertiefungen mit dem Antikörper 5C7.29 (oder Kontrollantikörpern) beschichtet. Nach der Blockierung wurden die Platten mit den E. coli Überständen und danach mit HRP-konjugierten anti-human-Cλ Antikörpern (Biosource, Camarillo, CA) inkubiert. Nach dem Waschen wurde gebundenes Enzym mit TMB-Substrat bestimmt. Überstände, enthaltend mutiertes chimäres E-Selectin-Cλ-Protein, an das 5C7.29 immer noch binden konnte, ergaben ein positives Signal, während Überstände, enthaltend mutiertes E-Selectin, an das 5C7.29 nicht binden konnte, ein negatives Signal ergaben. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle gezeigt, worin das Symbol AXB eine Mutante bezeichnet, bei der die X-te Aminosäure vom reifen N-Terminus von E-Selectin von der normalen Aminosäure A zu der mutierten Aminosäure B verändert ist.
Da die Mutation der Aminosäuren Q₂₁, R₂₂, Y₂₃, T₁₁₉ und A₁₂₀ in E-Selectin eine Bindung des Antikörpers 5C7.29 verhinderte, müssen diese Aminosäuren im Eptiop von 5C7.29 liegen. Die vollständige Aminosäuresequenz von E-Selectin ist in Bevilacqua, oben, und in US Patent Nr. 5,272,263 (ELAM-1) angegeben (ein anderer anti-E-Selectin Antikörper konnte an diese Mutanten binden, was zeigt, dass in diesen die Gesamtstruktur von E-Selectin nicht zerstört ist). Andere mit E/P-kreuzreagierende Antikörper, die ein unterschiedliches Reaktivitätsmuster mit diesen E-Selectin-Mutanten zeigen, müssen ein unterschiedliches Epitop auf E-Selectin erkennen. Das Epitop von 5C7.29 auf P-Selectin kann durch ein ähnliches Verfahren unter Verwendung von P-Selectin-Mutanten bestimmt werden, und kann in ähnlicher Weise mit dem Epitop von anderen mit E/P-kreuzreagierenden Antikörpern verglichen werden. Die Epitope von 5C7.29 auf E-Selectin und P-Selectin sind bevorzugte Epitope, da Antikörper wie etwa 5C7.29, die an sie binden, ein hohe Affinität und blockierende Aktivität haben können.
Obwohl die vorliegende Erfindung aus Gründen der Klarheit und des Verständnisses in gewisser Ausführlichkeit beschrieben wurde, wird es für den Fachmann aus dem Lesen dieser Offenbarung klar sein, dass verschiedene Veränderungen in der Form und im Detall gemacht werden können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Monoklonaler Antikörper mit einer Bindungsstelle, welcher spezifisch an P-Selectin und E-Selectin bindet, wobei der Antikörper eine Affinität für sowohl P-Selectin als auch E-Selectin von mindestens 10⁸ M^–1 hat.
Antikörper nach Anspruch 1, z. B. ein Antikörper aus Maus oder Mensch, wobei die spezifische Bindung des Antikörpers an das P-Selectin eine Bindung des P-Selectins an einen Gegenrezeptor von P-Selectin inhibiert und die spezifische Bindung des Antikörpers an das E-Selectin eine Bindung des E-Selectins an einen Gegenrezeptor von E-Selectin inhibiert, wobei die Gegenrezeptoren gegebenenfalls auf einer HL-60-Zelle oder einem Neutrophilen exprimiert sind.
Antikörper nach Anspruch 2, welcher mit dem Antikörper 5C7.29, ATCC Zugangsnummer CRL 11640, um eine spezifische Bindung an P-Selectin und E-Selectin kompetiert.
Antikörper nach Anspruch 2, welcher der monoklonale Antikörper 5C7.29, ATCC Zugangsnummer CRL 11640, ist.
Antikörper nach Anspruch 1, welcher nicht spezifisch an L-Selectin bindet.
Antikörper nach Anspruch 1, welcher spezifisch an L-Selectin bindet.
Antikörper nach Anspruch 1, welcher ein Epitop von E-Selectin, umfassend die Aminosäuren Q₂₁, R₂₂, Y₂₃, T₁₁₉ und A₁₂₀ erkennt.
Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 7, welcher ein Fab, Fab', F(ab')₂, Fv-Fragment oder ein Einzelkettenantikörper ist.
Humanisierter Antikörper, welcher spezifisch an P-Selectin bindet und die Bindung des P-Selectins an einen Gegenrezeptor von P-Selectin inhibiert, und spezifisch an E-Selectin bindet und die Bindung des E-Selectins an einen Gegenrezeptor von E-Selectin inhibiert, wobei der Antikörper eine humanisierte variable Region der leichten Kette umfasst und eine humanisierte variable Region der schweren Kette umfasst, wobei (1) die humanisierte variable Region der leichten Kette Komplementaritätbestimmende Regionen mit Aminosäuresequenzen einer leichten Kette eines nicht-humanen Antikörpers umfasst und eine Gerüstsequenz der variablen Region umfasst, die im Wesentlichen mit einer Gerüstsequenz der variablen Region einer humanen leichten Kette identisch ist, und (2) die humanisierte variable Region der schweren Kette Komplementaritätbestimmende Regionen mit Aminosäuresequenzen einer schweren Kette eines nicht-humanen Antikörpers umfasst und eine Gerüstsequenz der variablen Region umfasst, die im Wesentlichen mit einer Gerüstsequenz der variablen Region einer humanen schweren Kette identisch ist, wobei der humanisierte Antikörper gegebenenfalls weiterhin konstante Regionen der leichten Kette und/oder schweren Kette umfasst, die im Wesentlichen mit konstanten Regionen der humanen leichten Kette und/oder schweren Kette identisch sind.
Humanisierter Antikörper nach Anspruch 9, wobei die humanisierte variable Region der leichten Kette eine Sequenz hat, die im Wesentlichen identisch ist mit der Sequenz:
und die humanisierte variable Region der schweren Kette eine Sequenz hat, die im Wesentlichen identisch ist mit der Sequenz:
Humanisierte Antikörper nach Anspruch 10, wobei entweder: (i) die humanisierte variable Region der leichten Kette die Sequenz hat:
worin X₁ = D oder Q; X₂ = Q oder V; X₃ = M oder L; X₄ = S oder A; X₅ = S oder D; X₆= Y oder F; X₇ = F oder I; X₈= L oder F; X₉= F, I oder A; X₁₀= Q, G oder S; X₁₁ = V, I oder L; X₁₂ = M oder L; X₁₃ = eine beiliebige Aminosäure, X₁₄ = eine beliebige Aminosäure, X₁₅ = S oder T; X₁₆ = Q, N oder H; und X₁₇ = Q, N oder N; und (b) die humanisierte variable Region der schweren Kette die Sequenz hat:
worin X₁ = A oder S; X₂ = N oder T; X₃ = E, Q oder D; X₄ = S, A oder P; X₅ = T oder S; X₆ = A oder S; X₇ = M, I, V oder L; X₈ = eine beliebige Aminosäure; X₉ = eine beliebige Aminosäure; X₁₀ = eine beliebige Aminosäure; X₁₁ = V, A, I, L, M oder F; X₁₂ = R, K oder Q; und X₁₃ = G, A, D, T oder S; oder (ii) in der humanisierten variablen Region der leichten Kette X₁₁ = V; X₁₂ = M; X₁₃ = L; X₁₄ = A; X₁₅ = S; X₁₆ = Q; und X₁₇ = Q ist; und in der humanisierten variablen Region der schweren Kette X₇ = M; X₈ = A; X₉ = D; X₁₀ = T; X₁₁ = V; X₁₂ = R; und X₁₃ = G ist.
Humanisierter Antikörper nach Anspruch 10, wobei die humanisierte variable Region der leichten Kette die Sequenz hat:
und die humanisierte variable Region der schweren Kette die Sequenz hat:
Gereinigtes Nukleinsäuresegment, das für eine variable Region der leichten oder schweren Kette eines Antikörpers nach Anspruch 2 oder Anspruch 9 kodiert.
Stabile Zelllinie, umfassend: ein Nukleinsäuresegment, das für die schwere Kette eines Antikörpers nach Anspruch 2 oder Anspruch 9 kodiert, wobei das Segment operativ mit einem ersten Promoter verbunden ist, um Expression der schweren Kette zu ermöglichen; ein zweites Nukleinsäuresegment, das für die leichte Kette eines Antikörpers nach Anspruch 2 oder Anspruch 9 kodiert, wobei das zweite Segment operativ mit einem zweiten Promoter verbunden ist, um Expression der leichten Kette zu ermöglichen; wobei die stabile Zelllinie den Antikörper nach Anspruch 2 oder Anspruch 9 exprimieren kann.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 2 oder Anspruch 9.
Verwendung eines monoklonalen Antikörpers wie in Anspruch 2 oder Anspruch 9 definiert bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer entzündlichen Erkrankung oder eines entzündlichen Zustands, z. B. Ischämie- Reperfusionsverletzung, Atemnotsyndrom bei Erwachsenen, Trauma, Schlaganfall, Sepsis, Psoriasis, oder Autoimmunerkrankung, bevorzugt wobei die Erkrankung oder der Zustand Ischämie-Reperfusionsverletzung nach Herzinfarkt oder Schlaganfall ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Arzneimittel weiter die Verabreichung eines thrombolytischen Mittels ermöglicht.
Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der E-Selectin- und P-Selectin-vermittelte Funktionen blockieren kann, wobei das Verfahren umfasst: Immunisieren eines Säugers mit P-Selectin, Immunisieren des Säugers mit E-Selectin, Immortalisieren von B-Zellen aus dem Säuger, um immortalisierte, Antikörperproduzierende B-Zellen zu erhalten, und Auswählen einer immortalisierten Zelle, welche einen Antikörper produziert, der spezifisch an E-Selectin und P-Selectin bindet.
Verfahren zum Nachweisen von Zellen, die E-Selectin und P-Selectin auf ihrer Oberfläche haben, in einer biologischen Probe, von der vermutet wird, dass sie die Zellen enthält, wobei das Verfahren umfasst: In Kontakt Bringen der Probe mit einem Antikörper nach Anspruch 2 oder Anspruch 9, um einen Immunkomplex mit den Zellen, die E-Selectin und P-Selectin auf ihrer Oberfläche haben, zu bilden, und Nachweisen der Gegenwart des Immunkomplexes, um die Gegenwart der Zellen aufzuzeigen.
Monoklonaler Antikörper, der spezifisch an E-Selectin und P-Selectin bindet, wobei der Antikörper an das gleiche Epitop von E-Selectin wie der Antikörper 5C7.29, ATCC Zugangsnummer CRL 11640, bindet, wobei der Antikörper gegebenenfalls weiter an das gleiche Epitop von P-Selectin wie der Antikörper 5C7.29, ATCC Zugangsnummer CRL 11640, bindet.