MX2008000974A

MX2008000974A - Composiciones de heparina e inhibicion de selectina.

Info

Publication number: MX2008000974A
Application number: MX2008000974A
Authority: MX
Inventors: Ajit Varki; Jennifer L Stevenson
Original assignee: Univ California
Priority date: 2005-07-22
Filing date: 2006-07-21
Publication date: 2008-03-27
Also published as: EP1906974A4; AU2006272780A1; IL188936A0; JP2009507209A; CN101583273A; ZA200801696B; EP1906974A2; US20070021378A1; WO2007014049A2; US20100081630A1; CA2616166A1; WO2007014049A3

Abstract

La descripcion proporciona metodos in vitro e in vivo para identificar heparinas y heparinoides que modulan la actividad de selectinas. La descripcion proporciona tambien heparinas y heparinoides que modulan la actividad de selectinas. La identificacion y aislamiento de estas formulaciones de heparina tiene el potencial de mediar una amplia variedad de patologias mediadas por P- y/o L- selectinas, incluyendo metastasis hematogena, enfermedades asociadas con inflamacion (por ejemplo, asma, artritis, dermatitis alergica), lesion de isquemia-reperfusion u otras patologias tales como anemia falciforme. La inhibicion de selectina puede lograrse a concentraciones en plasma mas bajas que aquellas que causan excesiva anticoagulacion o sangrado indeseable en un sujeto humano.

Description

COMPOSICIONES DE HEPARINA E INHIBICIÓN DE SELECTINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La descripción se refiere generalmente a biología molecular y, más específicamente, a métodos para identificar y/o aislar variantes de heparina que bloquean la actividad de unión de L-selectina y/o P-selectina y atenúan metástasis mediada por selectina u otras enfermedades o trastornos mediados por selectina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN P- y L- selectina son lectinas tipo C que reconocen ligandos sialilados, fucosilados y sulfatados. La P-selectina se almacena dentro de las plaquetas y células endoteliales en reposo, y se traslada a la superficie celular luego de su activación. La L-selectina es expresada constitutivamente en la mayoría de los tipos de leucocitos y media sus interacciones con ligandos endoteliales. Ambas selectinas promueven el amarre inicial de los leucocitos durante la extravasación en sitios de inflamación. La P-selectina juega también un papel en hemostasis. Los ligandos endógenos para P- y L-selectina (tales como PSGL-1) son expresados en leucocitos y células endoteliales (para revisiones generales sobre selectinas y sus ligandos (véase, por ejemplo, Varki A., Proc Nati Acad Sci USA (1994) 91:7390-7; Ley et al. J Immunol REF.: 189744 (1995) 155:525-8; Kansas GS, Blood (1996) 88:3259-87; McEver et al., J Clin Invest (1997) 100:485-92; Lowe JB. Kidney Int (1997) 51:1418-26; Rosen SD. Annu Rev Immunol (2004) 22:129-56) . P- y L-selectina también, tienen papeles patológicos en muchas enfermedades que incluyen inflamación y reperfusión (Bevilacqua et al., Annu Rev Med (1994) 45:361-78; Lowe et al., J Clin Invest (1997) 99:822-6; Ley K. , Trends Mol Med (2003) 9:263-8), así como en metástasis de carcinomas. Muchas células tumorales expresan ligandos de selectina, y se ha reportado una relación inversa entre la expresión y supervivencia de ligandos de selectina en tumores (Varki NM, Varki A. Semin Thromb Hemost (2002) 28:53-66). Modelos de ratón singénicos y alogénicos han demostrado que la metástasis de adenocarcinomas positivos a ligandos de selectina a los pulmones es dependiente de P- y L-selectina (Kim et al., Proc Nati Acad Sci USA (1998) 95:9325-30; Friederichs et al., Cáncer Res (2000) 60:6714-22; Borsig et al., Proc Nati Acad Sci USA (2001) 98:3352-7; Borsig et al., Proc Nati Acad Sci USA (2002) 99:2193-8; Ludwig et al., Cáncer Res 2004; 64:2743-50) . Muchos estudios clásicos documentaron un efecto inhibidor de heparina no fraccionada (UFH) en modelos animales de metástasis de cáncer (Zacharski et al . , Thromb Haemost (1998) 80:10-23; Engelberg H. Cáncer (1999) 85:257-72; Hejna et al . , J Nat Cáncer Inst (1999) 91:22-36; Smorenburg et al . , Pharmacol Rev (2001) 53:93-105), y análisis retrospectivos indicaron que la heparina podría tener efectos similares en cáncer humano (Kakkar et al . , Int J Oncol (1995) 6:885-8; Hettiarachchi et al . , Thromb Haemost (1999) 82:947-52; Ornstein et al . , Haemostasis (1999) 29 Suppl. 1:48-60; Smorenburg et al . , Thromb Haemost (1999) 82:1600-4; y Zacharski et al . , Semin Thromb Hemost (2000) 26 Suppl. 1:69-77). Un gran cuerpo de literatura también describe las bien documentadas relaciones de cáncer y trombosis venosa, y la inhibición de metástasis al bloquear la coagulación en fase fluida, ya sea con heparina o hirudina. Sin embargo, pruebas en humanos usando antagonistas de vitamina K como un modo alternativo de anticoagulación no mostraron efecto alguno en la supervivencia de la mayoría de carcinomas. Así, no se debe asumir que la eficacia de la heparina en metástasis se base principalmente en su actividad anticoagulante. La heparina no fraccionada ha estado en uso clínico con base en su capacidad para inhibir la coagulación en fase fluida al incrementar la inactivación por antitrombina de los factores lía y Xa. Sin embargo, UFH es un producto natural que contiene una compleja mezcla polidispersa de cadenas de glucosaminoglucana altamente sulfatadas que varían de 5,000 a 30,000 daltons, sólo algunas de las cuales en realidad se unen a antitrombina. Estudios anteriores demostraron que la P-selectina podría unirse a heparina inmovilizada (Skinner et al . , Biochem Biophys Res Commun (1989) 164:1373-9). Se ha demostrado que varias heparinas y heparinoides podrían inhibir la unión tanto de P- como L-selectina a sus ligandos naturales (Nelson et al . , Blood (1993) 82:3253-8; Norgard-Sumnicht et al . , Science (1993) 261:480-3; Koenig et al . , J Clin Invest (1998) 101:877-89; Ma et al . , J Immunol (2000) 165:558-65; Xie et al . , J Biol. Chem (2000) 275:30718-1). Es deseable la identificación de preparaciones de heparina y heparinoide grado farmacéutico útiles para inhibir la unión de L-selectina y P-selectina a ligandos presentes en células en humanos. Estas preparaciones pueden refinarse más para identificar aquellas que no sólo medien la actividad L-selectina y P-selectina, sino que también lo hagan sin producir efectos secundarios indeseables en un sujeto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan en la presente métodos para identificar varias heparinas/heparinoides (en adelante llamados colectivamente heparinas) para verificar su capacidad en la inhibición de la actividad de P/L-selectina . Se proporciona también un subconjunto de heparinas que inhibe metástasis en dos modelos de tumor diferentes a dosis clínicamente relevantes. Además, la invención identifica diferencias estructurales entre las heparinas de bajo peso molecular (LMWHs) en vista de su actividad inhibidora de selectina diferencial y resuelve los papeles relativos de anticoagulación e inhibición de selectina para atenuar metástasis . En una modalidad, se proporciona un método para tamizar una composición para verificar su inhibición de la actividad selectina. El método puede incluir proporcionar una preparación de heparina que incluye una pluralidad de moléculas de heparina. Generalmente la preparación se obtiene a partir de un lote de heparina aprobado por la FDA. Se incluye también en el método una o más selectinas seleccionadas del grupo que consiste en L-selectina y P-selectina; un ligando para una o más de las selectinas y heparina. El método incluye además poner en contacto los elementos identificados arriba, simultánea o consecutivamente, bajo condiciones adecuadas para la unión de selectina a un ligando de selectina y detectar un nivel reducido de unión de la una o más selectinas a un ligando en presencia de la preparación de heparina en comparación con la ausencia de la preparación de heparina. Un nivel reducido de unión entre una selectina y un ligando de selectina puede detectarse en una concentración de la preparación de heparina que sea más baja que la concentración de heparina que produce una o más actividades seleccionadas del grupo que consiste en actividad anticoagulante in vivo y sangrado indeseable in vivo . Además, la concentración de la preparación de heparina podría no reducir el nivel de unión de L-selectina a un ligando de E-selectina. Más aún, la concentración de heparina que produce el nivel reducido de unión de la una o más selectinas al ligando puede ser de 2 veces a 50 veces más bajo que la concentración de heparina que produce actividad anticoagulante excesiva in vivo . En algunas modalidades, es posible identificar heparinas que se unan selectivamente a selectinas. Estas heparinas típicamente carecerán de otras actividades de heparina (por ejemplo, inhibición de angiogénesis, inhibición de heparanasa, unión a citocinas y similares). Además, es posible identificar fracciones de heparina que sólo tengan actividad anticoagulante pero que carezcan de otras actividades. Las preparaciones de heparina identificadas por los métodos provistos en la presente pueden usarse como un terapéutico para patologías relacionadas con L-selectina o P-selectina. La invención proporciona también un método para tamizar una composición para verificar su inhibición de la actividad selectina. El método puede incluir proporcionar una preparación de heparina que incluya una pluralidad de moléculas de heparina. Generalmente, la preparación se obtiene a partir de un lote de heparina aprobado por la FDA.

También se incluyen en el método una o más selectinas seleccionadas del grupo que consiste en L-selectina y P-selectina; un ligando para una o más selectinas seleccionadas del grupo que consiste en L-selectina y P-selectina, y heparina. El método puede incluir además fraccionar la preparación de heparina y aislar una pluralidad de fracciones que comprendan moléculas de heparina, en donde las fracciones se aislan con base en el tamaño de las moléculas de heparina en la fracción. El método incluye además poner en contacto cada fracción con el ligando y selectina, simultáneamente o consecutivamente, bajo condiciones adecuadas para la unión de selectina a un ligando de selectina y detectar un nivel reducido de unión de la una o más selectinas a un ligando en presencia de las fracciones e identificar las fracciones que reduzcan el nivel de unión de la una o más selectinas al ligando en presencia de la fracción en comparación con la ausencia de la fracción. La invención proporciona también un método para identificar una fracción de heparina como un terapéutico para una patología relacionada con L-selectina y/o P-selectina. La invención proporciona también una fracción de heparina identificada por un método descrito en la presente. La invención proporciona un artículo de manufactura que incluye material de empaque. Dentro del material de empaque puede estar contenida una preparación de heparina identificada por un método provisto en la presente. El material de empaque puede incluir una etiqueta o inserto de empaque que indique que la preparación de heparina inhibe la actividad de una selectina y puede usarse para inhibir metástasis hematógenas en un sujeto. La preparación de heparina puede incluir una preparación de heparina de bajo peso molecular (LMWH) . Las preparaciones ejemplares incluyen Tinzaparina (TINZ) . En otra modalidad, se proporciona un artículo de manufactura que incluye material de empaque. Dentro del material de empaque puede estar contenida una fracción de heparina identificada por un método provisto en la presente. El material de empaque puede incluir una etiqueta o inserto de empaque que indique que la fracción de heparina inhibe la actividad de una selectina y puede usarse para inhibir metástasis hematógenas en un sujeto. En una modalidad, el artículo de manufactura comprende una fracción de heparina útil para una actividad heparina específica con base en el uso de los métodos de la invención. Por ejemplo, el artículo de manufactura que comprende una fracción de heparina puede comprender una etiqueta o inserto de empaque que indique que la fracción de heparina es útil para inhibir la actividad de una selectina y puede usarse para inhibir enfermedades mediadas por P- y/o L-selectina en un sujeto. La invención proporciona también un método para prevenir o tratar un trastorno de proliferación celular en un sujeto. El método puede incluir administrar al sujeto una cantidad efectiva de un inhibidor específico de actividad selectina, en un portador farmacéuticamente aceptable. Generalmente el inhibidor será una preparación de heparina o una fracción de heparina. La invención proporciona un método para prevenir o inhibir metástasis en un sujeto. El método incluye administrar al sujeto una cantidad efectiva de un inhibidor específico de actividad selectina, en un portador farmacéuticamente aceptable. Generalmente, el inhibidor es una preparación de heparina o una fracción de heparina. Los detalles de una o más modalidades de la descripción se establecen en las figuras anexas y en la siguiente descripción. Otras características como objetos y ventajas se harán aparentes a partir de la descripción y figuras, y de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra que preparaciones de heparina clínicamente utilizadas muestran marcadas diferencias en su capacidad para inhibir la unión de P- y L-selectina a ligandos de carcinoma. La unión de células de carcinoma de colon humanos a quimeras de selectina inmovilizadas se probó en presencia de una gama de concentraciones de diferentes heparinas. La unión de control se basó en mediciones en presencia de un regulador de pH únicamente y los valores de fondo se midieron en 2 . 5 mM de EDTA . Cada concentración de heparina se probó por triplicado , y los datos presentados son representativos de resultados de varios experimentos . Las figuras 2A-2B muestran que escalas terapéuticas de unidades anti-Xa pueden lograrse con una sola dosis de heparina . Los niveles de anti-Xa se midieron en plasma de varios ratones , 30 minutos después de que cada ratón recibiera una sola ( fig . 2A) " lx" o ( fig . 2B) "3x" dosis subcutánea de varias heparinas . Cada círculo no relleno representa un ratón y las barras horizontales representan valores medios . Las figuras 3A-3B ilustran que la inhibición de metástasis de células de carcinoma de colon se logra a niveles clínicamente tolerables de UFH y TINZ , con FOND ( un pentasacárido sintético ) que no tiene efecto . Ratones fueron inyectados subcutáneamente con " lx" heparina ( fig . 3A) o " 3x" heparina ( fig . 3B ) ( o PBS como un control ) , y 30 minutos más tarde se inyectaron intravenosamente con células MC38GFP. Luego de 27 días, los ratones fueron sometidos a eutanasia y la metástasis se evaluó al cuantificar la fluorescencia de homogenado de pulmón. Los círculos no rellenos representan cada ratón y las barras horizontales representan los valores medios. Los valores P se determinaron por una prueba T del Estudiante, suponiendo una distribución desigual de dos extremos . Las figuras 4A y 4B ilustran heparinas con actividad inhibidora de selectina que inhiben metástasis de células de melanoma. Los ratones fueron inyectados subcutáneamente con "lx" de heparina (Fig. 4A) o "3x" de heparina (fig. 4B) (o PBS como un control), y 30 minutos más tarde fueron inyectados intravenosamente con células B16F1. Después de 17 días, los ratones fueron sometidos a eutanasia, los pulmones perfundidos con formalina a través de la tráquea y luego se les dejó fijar en formalina durante un mínimo de 24 horas. Se cuantificó la metástasis al medir el peso del pulmón, lo cual se correlacionó bien con la apariencia física de los pulmones, documentado por fotografía (las imágenes representativas se muestran debajo de la cuantificación). Los círculos no rellenos representan cada uno un ratón y las barras horizontales representan pesos de pulmón medios. Los valores P fueron determinados por una prueba T del estudiante, suponiendo una distribución desigual y de dos extremos. Las figuras 5A y 5B ilustran que la inhibición de selectina por TINZ es mediada principalmente por fragmentos de alto peso molecular con actividad anti-Xa relativamente más baja. (fig. 5A) . Alícuotas de las cinco heparinas (UFH, las tres LMWHs y FOND) se corrieron en un sistema de exclusión de tamaño HPLC y sus perfiles de tamaño se evaluaron al rastrear la absorbancia a 206 nm (la parte relevante del cromatograma mostrado es de t=17.5 a 33.3 minutos). La flecha abierta marca la elución del polisacárido sintético FOND. (fig. 5B) Una alícuota de TINZ se corrió en el mismo sistema HPLC que en la figura 5A, y fracciones de 0 . 5 minuto se recogieron después del detector UV . La cantidad total ( ug ) de ácido urónico en cada fracción se cuantificó usando ensayo de carbazol . Se determinó la capacidad de cada fracción para inhibir la unión de P-selectina a sLex, con diluciones adecuadas de tal forma que todas las lecturas estuvieron en una escala lineal ( ~30-70% de inhibición ) . Una unidad inhibitoria es definida arbitrariamente como 1% de inhibición de unión de P-selectina . El número total de unidades anti-Xa en cada fracción también se determinó en la escala lineal de ese ensayo ( si no se detectó actividad, el límite de detección mínimo del ensayo fue usado ) . Las unidades inhibitorias totales y las unidades anti-Xa totales se normalizaron a contenido de ácido urónico total . Si no se detectó ácido urónico en la muestra, el límite de detección mínimo del ensayo se usó para el cálculo. El cuadro con rayas diagonales en la parte superior de la gráfica designa fracciones 28-32, que contienen alta actividad inhibidora de P-selectina, y mínima actividad anti-Xa, cuando se normalizaron a contenido de ácido urónico. La figura 6 proporciona una breve descripción de posibles mecanismos de actividad inhibidora de selectina y fracciones dé heparina de peso molecular más alto . Esta descripción es ej emplar y de ninguna manera limita los métodos y composiciones descritos a los mecanismos descritos . Se sabe que la P-selectina (presentada ya sea por plaquetas activadas o células endoteliales) tiene dos cavidades de unión: una para la porción de sialilo Lewis X, y otra para la región rica en sulfato de tirosina de su ligando nativo PSGL-1, la cual se presenta sobre leucocitos. (Somers et al . , Cell (2000) 103:467-79). Esta última región de PSGL-1 también es rica en aminoácidos con cadenas laterales carboxilato. Otros ligandos de P- o L-selectina pueden ser mucinas sialiladas y sulfatadas presentadas en células endoteliales o en células de carcinoma. Notablemente éstas también son moléculas que presentan altas densidades de sulfatos y carboxilatos cargados negativamente. Las heparinas pueden imitar estos ligandos naturales y patológicos en virtud de su alta densidad de sulfatos y carboxilatos, es decir, presentando un "parche de sacáridos en racimo" similar. Si la cadena de heparina es muy corta (como en FOND) sólo puede bloquear un sitio a la vez, haciéndola un inhibidor muy deficiente (panel superior) . Una cadena de heparina un poco más larga podría interactuar con ambos sitios de unión en P-selectina, y tener cierta actividad inhibidora (panel medio) . Una cadena todavía más larga podría bloquear varias moléculas de P-selectina y afectar más dramáticamente la avidez de interacciones célula-célula que incluyen ligandos de P-selectina (panel inferior) . En contraste, el complejo Antitrombina-Factor Xa es uno soluble, y un solo pentasacárido (con la secuencia idéntica a la encontrada en FOND) es tanto necesario como suficiente para unirse a antitrombina y catalizar la inactivación de Xa. Incrementando la longitud de una molécula de heparina no se cambia el resultado, a menos que hubiera más de un pentasacárido de unión a antitrombina en la secuencia. Sin embargo, a diferencia del caso con la unión multivalente y de varios sitios de P-selectina con sus ligandos en interacciones célula: célula, el efecto de interacciones antitrombina-Xa sólo sería aditivo. La especificidad de la estructura de heparina para el reconocimiento por P-selectina tampoco se detalla en este modelo. Sin embargo, trabajo previo por los presentes inventores y otros (véase texto) indica una continuidad de afinidades de unión, con 6-O-sulfatación siendo necesaria. La figura 7 muestra interacciones de ligandos de P-y L-selectina en la fisiología normal y metástasis hematógena. La terapia con heparina puede minimizar la metástasis al inhibir las interacciones entre leucocitos, plaquetas y células endoteliales con células tumorales y ligandos endógenos . La figura 8 muestra que la deficiencia de P- y L-selectina mejora la supervivencia a largo plazo en un modelo experimental de metástasis hematógena. Ratones WT y PL-/-fueron inyectados intravenosamente con células de carcinoma de colon MC38GFP. Los ratones fueron monitoreados diariamente para apariencia, y se les sometió a eutanasia cuando estaban moribundos para verificar la presencia de focos metastásicos pulmonares. El número de ratones supervivientes se gráfica contra el tiempo después de la inyección de células tumorales. Aunque todos los ratones PL-/- parecieron normales en el momento de la conclusión, 5 de 7 mostraron focos metastásicos pulmonares visibles. La figura 9 muestra que una alta dosis de heparina mejora más la supervivencia en ratones deficientes en P- y L-selectina. Ratones PL-/- fueron inyectados intravenosamente con células tumorales a t = 0, y subcutáneamente con PBS o 100 U de heparina no fraccionada en PBS a t = 0.5h, +6h y +12h. Los ratones fueron sometidos a eutanasia 50 días después de la inyección, y la formación de metástasis pulmonares se determinó al cuantificar la fluorescencia del homogenado de pulmón. Los valores P se determinaron al llevar a cabo una prueba T del estudiante, suponiendo una distribución desigual y de dos extremos. Las figuras 10A y 10B demuestran que la administración de niveles clínicamente relevantes de heparina no tuvo efecto significativo en la formación de focos metastásicos en ratones deficientes tanto en P- como en L-selectina. Ratones PL-/- fueron inyectados intravenosamente con células tumorales a t = 0, y subcutáneamente con PBS o 19.68U de heparina no fraccionada (UFH) en PBS a t = 0.5h, +6h y +12h. Los ratones fueron sometidos a eutanasia 55 días después de la inyección, y se determinó la formación de metástasis pulmonares al contar el número de focos visibles (fig. 10A) y al cuantificar la fluorescencia del homogenado pulmonar (fig. 10B) , nótese la división eje y). Los valores P se determinaron como en la figura 9.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La patente de E.U.A. No. 6,787,365 y la patente de E.U.A. No. 6,596,705 se incorporan en la presente a manera de referencia, en su totalidad, para todos los propósitos. Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la descripción son indicadores de los niveles de capacidad de aguellos expertos en la técnica a la cual pertenece la invención. Todas las referencias citadas en esta descripción se incorporan por referencia al mismo grado que si cada referencia se hubiera incorporado por referencia en su totalidad individualmente. L-selectina, E-selectina y P-selectina median los eventos adhesivos iniciales que dirigen el regreso de linfocitos al interior de órganos linfoides, así como las interacciones de leucocitos u otras células inflamatorias con endotelio en sitios de inflamación. L-selectina es expresada en leucocitos, E-selectina es expresada en endotelio y P-selectina es expresada en plaquetas y endotelio. Las tres selectinas se unen a estructuras de carbohidrato específicas sobre células opuestas, por ejemplo, L-selectina se une a plaquetas y endotelio, en tanto que P-selectina y E-selectina se unen a leucocitos . La adhesión de selectina está implicada en trastornos tales como lesión de reperfusión patológica, trastornos inflamatorios y enfermedades autoinmunes. Las interacciones de selectina también pueden mediar mecanismos adhesivos primarios implicados en la metástasis de ciertos cánceres epiteliales. Así, las selectinas son objetivos terapéuticos potenciales para el tratamiento de patologías caracterizadas por interacciones indeseables y anormales mediadas por selectinas. Se proporcionan métodos in vi tro e in vivo para identificar tipos y lotes de heparina que inhiben la actividad de P- y/o L-selectina. Estos métodos proporcionan varios medios para identificar formas de heparina que se unen a P-y/o L-selectina. Subsecuentemente, las formas identificadas de heparina pueden usarse para inhibir metástasis de células cancerosas. Además, se proporcionan métodos para identificar fragmentos de heparina que posean actividad inhibitoria en relación con actividad anticoagulante. Las heparinas pueden tener otros efectos biológicos potencialmente relevantes para la dispersión de tumores sólidos, incluyendo inhibición de heparanasas implicadas en degradar membranas de basamento, efectos moduladores en varios factores de crecimiento de unión a heparina o proteasas extracelulares, alteración de las funciones de integrina en la adhesión celular, inhibición de angiogénesis, etc. De todos estos mecanismos no anticoagulantes potenciales, la inhibición de P/L-selectina es la primera que probablemente sea relevante cuando las células tumorales inicialmente entran en el torrente sanguíneo. Este efecto también permanece como el inicio de una cascada de eventos implicados en la supervivencia de células tumorales, antes de su eventual extravasación y establecimiento como focos metastásicos. Como con cualquier cascada, el bloqueo de la primera etapa puede hacer que todos los mecanismos subsecuentes sean prácticamente relevantes. De hecho, se ha demostrado que los efectos de una sola dosis de UFH dada antes de una introducción de células tumorales intravenosa puede explicarse por la inhibición de P/L-selectina, toda vez que la heparina no tuvo efectos adicionales en metástasis en ratones con una deficiencia combinada de ambas selectinas. Un resultado similar se observó con respecto a los efectos de heparina para atenuar inflamación, con la actividad relevante limitada nuevamente a la inhibición de P- y L-selectina. Sobre todo, modelos que explican la acción de heparina en metástasis de tumores sólidos han sido la inhibición de P/L-selectinas, combinada con un grado desconocido de bloqueo de formación de fibrina intravascular por la vía de coagulación en fase fluida. Sin embargo, las dosis relativamente altas administradas en la mayoría de los estudios previos podrían ser imprácticas de usar clínicamente, debido a una excesiva anticoagulación. UFH es también generalmente deficiente en biodisponibilidad, requiere de varias dosis diarias, y tiene efectos laterales tales como trombocitopenia inducida por heparina (Rosenberg RD. Semin Hematol (1997) 34 Suppl. 4:2-8; Hirsh et al . , Chest (2004) 126: 188S-203S) . Para evitar esto, muchas heparinas de bajo peso molecular (LMWHs) se han creado al degradar UFH usando una variedad de métodos, incluyendo despolimerización química y digestión enzimática (Rosenerg, citado anteriormente; Linhardt et al . , Semin Thromb Hemost (1999) 25 Suppl. 3:5-16). Mientras que las LMWHs también son una mezcla de tamaños de fragmentos, con perfiles de peso molecular que varían de 3,000 a 9,000 daltons, tienen mejores cinéticas y biodisponibilidad, requerida típicamente sólo de dosis diarias individuales. Tomada junto con una eficacia similar en la anticoagulación clínica (por medio de actividad ati-Xa) , y una incidencia más baja de efectos secundarios tales como trombocitopenia inducida por heparina, se han favorecido de la práctica clínica (Hirsh et al . , citado arriba, Valentine et al . , Semin Thromb Hemost (1997) 23:173-8). Beneficios adicionales se reclaman para Fondaparinux (FOND), un pentasacárido heparinoide sintético de estructura definida que se une específicamente a antitrombina. Se ha propuesto que la heparina impide la metástasis durante el periodo entre el diagnóstico inicial de carcinomas en etapa temprana y justo después de su remoción quirúrgica, una idea soportada por el reciente descubrimiento de que pacientes con tumores primarios (pero sin metástasis) quienes fueron tratados con una LMWH tuvieron supervivencia incrementada (Lee et al . , J Clin Oncol (2005) 23:2123-9). Traducir todas estas promisorias ideas en práctica clínica, sin embargo, requiere de una evaluación experimental del potencial de niveles clínicamente aceptables de los diferentes tipos de heparinas para bloquear P/L-selectina y atenuar metástasis. Sin embargo, la heparina no se ha usado con el propósito de inhibir la unión de L-selectina y P-selectina en humanos debido a preocupaciones acerca de potenciales efectos secundarios desagradables asociados con su actividad anticoagulante. Las preparaciones de heparina que ya fueron aprobadas por la FDA para usarse como anticoagulantes pueden usarse a dosis clínicamente tolerables (desde la perspectiva de anticoagulación) para inhibir patologías mediadas por P- y L-selectina, incluyendo isquemia, lesiones de reperfusión, inflamación aguda, inflamación crónica y metástasis por cáncer. El presente estudio proporciona métodos para identificar tipos y lotes de preparaciones de heparina que media la actividad de P- y L-selectina. En la presente se proporcionan métodos in vivo e in vi tro para tamizar composiciones de heparina para actividad óptima en inhibir P-y L-selectina. Las heparinas identificadas pueden, por ejemplo, marcarse para usarse en las condiciones anteriores. La terapia con heparina es ya ampliamente usada para indicaciones anticoagulantes con efectos secundarios manejables. También, se proporciona aquí preparaciones de heparina y heparinoides útiles para tratamientos no anticoagulantes. Se proporcionan también fragmentos de heparina que tienen potente actividad inhibidora de selectina en comparación con su actividad anticoagulante. Preparaciones grado clínico de UFH, tres tipos de LMWH (Tinzaparina (TINZ) , Dalteparina (DALT) y Enoxaparina (ENOX)), y el pentasacáridos sintético (FOND) están disponibles comercialmente y representan la mayoría de las heparinas actualmente comercializadas para uso clínico en los Estados Unidos (fuente: Physician's Desk Reference). Las formulaciones de heparina clínicamente aprobadas tienen capacidades ampliamente variables para inhibir P- y L-selectina in vi tro . Notablemente, las LMWHs se preparan mediante diferentes métodos de degradación de UFH: TINZ, mediante el corte eliminador beta con heparinasa; DALT, mediante corte desaminador con ácido nitroso y ENOX, mediante corte beta eliminador con álcali. La invención proporciona métodos para identificar fracciones de heparina que carecen de cantidades sustanciales de actividad anticoagulante pero que no obstante conservan actividad inhibidora de L-selectina y/o P-selectina. La invención proporciona además métodos para inhibir metástasis en un sujeto, que comprenden administrar una heparina o fracción de heparina. La invención proporciona métodos para inhibir metástasis mediada por L-selectina y/o P-selectina en un sujeto al administrar al sujeto una cantidad de una heparina fraccionada que no produzca actividad anticoagulante sustancial o sangrado indeseable en el sujeto. En un aspecto, la concentración de heparina comprende un nivel anti-Xa de 1 IU/ml o menos. En forma importante, la inhibición de selectina puede lograrse a concentraciones en plasma más bajas que aquellas que causan una excesiva coagulación o sangrado no deseado en un sujeto mamífero. Para los métodos de la invención, una cantidad de heparina que no produce actividad anticoagulante sustancial o sangrado indeseable se administra al sujeto. Según se usa en la presente, la referencia a "una cantidad de heparina que no produce actividad anticoagulante sustancial" significa una cantidad de heparina que no causa complicaciones de sangrado, aunque puede ocurrir un efecto anticoagulante leve. Los signos y señales clínicos de sangrado indeseable incluyen sangre en la orina o heces, menstruación más fuerte que la normal, sangrado nasal o sangrado excesivo de heridas menores o sitios quirúrgicos. Una fácil formación de moretones puede preceder estas manifestaciones clínicas. Cuando ocurre un sangrado indeseable, la actividad de heparina puede neutralizarse por la administración de sulfato de protamina; sin embargo esto no es cierto para FOND. Según se describe en la presente, la heparina, como se formula para uso clínico, puede inhibir la unión de P-selectina y L-selectina a sus ligandos. Estas cantidades y métodos también son útiles para inhibir metástasis. Así, la invención proporciona un medio para inhibir la unión mediada por L-selectina y P-selectina en un sujeto al administrarle heparina en una cantidad que no produce actividad anticoagulante sustancial o sangrado indeseable en el sujeto. La cantidad de heparina administrada a un sujeto para inhibir metástasis mediada por L-selectina o P-selectina se caracteriza además porque no produce sangrado indeseable como un efecto secundario, aunque puede producir actividad anticoagulante leve. Como resultado, los efectos secundarios tales como complicaciones hemorrágicas que están asociadas con el uso de heparina para terapia anticoagulante no son una preocupación. En un aspecto, la invención demuestra que P-selectina puede ser inhibida a concentraciones más bajas de heparina que L-selectina, proporcionando así un medio para inhibir selectivamente P-selectina. Aunque una cantidad de heparina administrada para inhibir metástasis mediada por L-selectina y P-selectina en un sujeto dependerá, en parte, del individuo, sujetos adultos normales a los que se les administró heparina en cantidades que resultan en menos de 0.2 unidades de heparina/ml de plasma generalmente no exhiben sangrado indeseable. Un sujeto tratado con heparina puede ser monitoreado para sangrado indeseable usando varios ensayos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, tiempo de coagulación de sangre, tiempo de tromboplastina parcial activa (APTT) o actividad anti-Xa puede usarse para determinar si el estado de coagulación se incrementa indeseablemente en un sujeto a quien se le administró heparina. Cuando ocurre un sangrado indeseable, se discontinua la administración de heparina. La cantidad de heparina administrada depende, en parte, de si la L-selectina o P-selectina median metástasis y, por lo tanto, ya sea que sólo P-selectina, o tanto L-selectina como P-selectina, vayan a ser inhibidas. Por ejemplo, una cantidad de heparina de menos que aquella usada para terapia anticoagulante puede administrarse a un sujeto con el propósito de inhibir sustancialmente P-selectina en comparación con L-selectina. La cantidad de heparina administrada a un sujeto también depende de la magnitud del efecto terapéutico deseado. La invención proporciona también métodos para tamizar e identificar inhibidores de metástasis que inhiban interacciones entre P- y/o L-selectina. El método incluye proporcionar i) una preparación de heparina o fracción de heparina que comprenda una pluralidad de moléculas de heparina, en donde la preparación se obtiene de un lote y tipo de heparina aprobado por la FDA. Una o más selectinas seleccionadas del grupo que consiste en L-selectina y P-selectina; iii) un ligando para una o más de las selectinas y b) poner en contacto a) i) con a)ii) y a) iii), simultáneamente o consecutivamente, bajo condiciones adecuadas para la unión de selectina a un ligando de selectina; y c) detectar un nivel reducido de unión de la una o más selectinas a un ligando en presencia de la preparación de heparina en comparación con la ausencia de preparación de heparina, en donde una reducción en unión es indicadora de una composición para la inhibición de metástasis. Los ligandos útiles en varios métodos provistos en la presente incluyen, pero no están limitados a, PSGL-1 o sialilo-Lewis* (SLe*). El ligando puede ser inmovilizado. El ligando puede estar presente sobre una célula, tal como, por ejemplo, una célula endotelial. Las células ejemplares incluyen células LS180. Por ejemplo, quimeras de P- o L-selectina se inmovilizan en placas recubiertas con proteína-A y células tumorales marcadas fluorescentemente se les deja unir en presencia de cantidades variables de heparina. Usando este método, la invención demuestra que cuando se normaliza a actividad de anti-Factor-Xa (un predictor de actividad anticoagulante in vivo) , UFH fue el mejor inhibidor de ambas selectinas (figura 1) . Gran variación se observó entre las tres LMWHs, con TINZ teniendo actividad inhibidora más alta que DALT y ENOX. De manera interesante, FOND, aunque diseñada sintéticamente específicamente por su potente actividad anticoagulante, no tuvo la capacidad de inhibir ni P- ni L-selectina. DALT y ENOX fueron capaces de inhibir la unión de P-selectina a concentraciones anti-Xa más altas (figura 1, panel superior) , pero sólo tuvo capacidad mínima para inhibir la unión de L-selectina (figura 1, panel inferior) . Aunque la inhibición de P-selectina se obtuvo a dosis relativas más bajas que L-selectina, el orden de inhibición clasificado (UFH>TINZ>DALT=ENOX»FOND) fue el mismo. Además, la cantidad de heparina administrada dependerá del sujeto individual debido a la biodisponibilidad de heparina dentro del sujeto se sabe que varía. Por ejemplo, las dosis de heparina son algunas veces administradas en unidades de heparina/kg de peso corporal. Sin embargo, las dosis de heparina requeridas (por ejemplo, unidades de heparina/kg de peso corporal) para lograr niveles específicos de heparina en el plasma de un sujeto pueden variar entre individuos debido a diferencias en la biodisponiblidad de heparina. Así, la concentración de heparina en la sangre de un sujeto en unidades/ml de plasma es la medida más confiable de concentración de heparina. La cantidad de heparina en plasma en un sujeto puede determinarse usando ensayos de titulación y neutralización con sulfato de protamina (esto no aplica para FOND) . Heparina, según se usa en la presente, se refiere a heparina, heparina de bajo peso molecular, heparina no fraccionada, sales de heparina formada con cationes metálicos (por ejemplo, sodio, calcio o magnesio) o bases orgánicas (por ejemplo, dietilamina, trietilamina, trietanolamina, etc.), esteres de heparina, heparina en conjugados con ácido graso, conjugados de ácido biliar y heparina y sulfato de heparina. Según se usa en la presente, el término "inhibir la unión" en relación conl efecto de una concentración dada de una heparina en la unión de una P- y/o L-selectina o L-selectina a su ligando, se refiere a una reducción en la cantidad de unión de la P- y/o L-selectina o L-selectina a su ligando en relación con la cantidad de unión en ausencia de heparina, e incluye tanto una reducción en la unión así como una inhibición de unión completa. Una "cantidad efectiva" o "cantidad farmacéuticamente efectiva" de heparina como la provista en la presente significa una cantidad no tóxica pero suficiente de heparina para proporcionar el efecto terapéutico deseado. La cantidad exacta variará de sujeto en sujeto, dependiendo de la edad, condición general del sujeto, la severidad de un trastorno proliferativo de células u otro trastorno mediado por P- y/o L-selectina, y la heparina particular, fracción de heparina, etc. administrada. Una cantidad "efectiva" adecuada en cualquier caso individual puede determinarse por alguien de capacidad ordinaria en la técnica al hacer referencia a los textos y literatura pertinentes y/o usando experimentación de rutina . Por "farmacéuticamente aceptable" se intenta decir un portador que comprende un material que no es biológicamente o de otra manera indeseable. El término "portador" se usa genéricamente para referirse a cualquier componente presente en las formulaciones farmacéuticas que no sea el agente o agentes activos, y de esta manera incluye diluyentes, aglutinantes, lubricantes, desintegrantes, rellenos, agentes colorantes, agentes humectantes o emulsionantes, agentes de regulación de pH, conservadores y similares. Las formulaciones de suministro por liberación retrasada o prolongada pueden formularse con base en la experiencia en la técnica. Los términos "tratar" y "tratamiento" según se usan en la presente se refieren a la reducción en la severidad y/o frecuencia de los síntomas, eliminación de los síntomas y/o causa subyacente, prevención de la ocurrencia de síntomas y/o su causa subyacente y mejora o remedio de daño. Así, por ejemplo, el presente método para "tratar" metástasis o trastorno proliferativo celular (por ejemplo, cáncer) abarca la inhibición o reducción de focos de tumor, capacidad proliferativa de células y similares. La invención incluye, en un aspecto, administrar una cantidad efectiva de heparina (por ejemplo, heparina de un peso molecular deseado) a un sujeto para inhibir la adhesión de células metastásicas al endotelio. La heparina usada en los métodos y composiciones de la invención puede ser ya sea una preparación de heparina comercial de calidad farmacéutica o una preparación de heparina cruda, tal como la que se obtiene luego de extraer heparina activa de tejidos u órganos de mamífero. El producto comercial (heparina USP) está disponible de varias fuentes (por ejemplo, SIGMA Chemical Co., St . Luis, Mo . ) , generalmente como una sal de metal alcalino o metal alcalino terreo (más comúnmente como heparina de sodio) . Como alternativa, la heparina puede extraerse de tejidos u órganos de mamíferos, particularmente de mucosa intestinal o pulmón de, por ejemplo, res, puerco y borrego, usando una variedad de métodos bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Coiné, Erwin, Chemistry and biology of Heparin, (Lundblad, R. L., et al . , (Eds.), pág. 9-17, Elsevier/North-Holland, N. Y. (1981) ) . La heparina y compuestos tipo heparina también se han encontrado en tejido vegetal en donde la heparina o compuesto tipo heparina está unido a las proteínas vegetales en forma de un complejo. La heparina y compuesto tipo heparina derivados de un tejido vegetal son de particular importancia toda vez que son considerablemente menos costosas que la heparina y compuestos tipo heparina cosechados de tejido animal. Las plantas que contienen heparina o compuestos tipo heparina tales como sales fisiológicamente aceptables de heparina, o análogos funcionales de la misma también pueden ser una fuente adecuada para la invención. Las fuentes vegetales de heparina o compuestos tipo heparina típicas incluyen artemisia princeps , nothogenia fastigia (algas rojas), copallina pililifera (algas rojas), cladophora sa crlis (algas verdes), chaetomorpha anteninna (algas verdes), aopallina officinalis (algas rojas), monostrom ni tidum , laminaria japónica , filipéndula ulmaria (ulmaria) , ecklonia kuroma (algas cafés), ascophyllum nodosum (algas cafés), ginkgo biloba , ulva rígida (algas verdes), stichopus japonicus (pepino de mar) , panax ginseng, spiralina máxima , spirulína pla tensis , la urencia gemmifera (algas rojas) y larix (larchwood) . La heparina puede ser heparina de bajo peso molecular (LMWH) o, alternativamente, heparina estándar o no fraccionada. LMWH, según se usa en la presente, incluye una referencia a una preparación de heparina que tenga un peso molecular promedio de aproximadamente 3,000 daltons a alrededor de 10,000 daltons, típicamente alrededor de 4,000 daltons a aproximadamente 8,000 daltons. La LMWH puede incluir sacáridos en porcentajes más pequeños que excedan el límite superior de la escala. Por ejemplo, la tinzaparina incluye una cantidad menor de sacáridos de heparina que son mayores que 8,000 daltons. Estas LMWHs están disponibles comercialmente de un número de fuentes diferentes. Los compuestos de heparina de la invención pueden prepararse usando un número de técnicas de separación o fraccionado diferentes conocidas y usadas por aquellos expertos en la técnica. Estas técnicas incluyen, por ejemplo, cromatografía de permeación de gel (GPC) , cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) , ultrafiltración, cromatografía de exclusión de tamaño y similares. Las LMWHs se producen actualmente en varias formas diferentes: (i) enriquecimiento de LMWH presente en heparina estándar por fraccionado; etanol y/o tamizado molecular, por ejemplo, filtración en gel o filtración en membrana; (ii) despolimerización química y controlada (por ácido notroso, beta-eliminación u oxidación con peryodato) ; y (iii) despolimerización enzimática por heparinasas. Las condiciones para la despolimerización pueden controlarse cuidadosamente para crear productos de pesos moleculares deseados. La despolimerización con ácido nitroso se usa comúnmente. También, se emplea la despolimerización del éster bencílico de heparina por beta-eliminación, lo cual produce el mismo tipo de fragmento que la despolimerización enzimática usando heparinasas . Las LMWh con baja actividad anticoagulante y que conservan estructura básica pueden prepararse por despolimerización usando oxidación con peryodato. Están disponibles comercialmente varias LMWHs: (i) Fragmin con peso molecular de 4,000-6,000 daltons se produce por la despolimerización con ácido nitroso controlada de heparina de sodio a partir de mucosa intestinal porcina por Kabi Pharmacia, Suecia (véase también patente de E.U.A. No. 5,686,431); (ii) Fraxiparin y Fraxiparine con un peso molecular promedio de 4,500 daltons se produce por fraccionado o despolimerización controlada con ácido nitroso, respectivamente, de heparina de calcio proveniente de mucosa intestinal porcina Sanofi (Chaoy laboratories) ; (iii) Lovenox (Enoxaparin y Enoxaparine) se produce mediante despolimerización de heparina de sodio a partir de mucosa intestinal porcina usando beta-eliminación por Farmuka SF, Francia y se distribuye por Aventis por los nombres comerciales Clexane y Lovenox; y (iv) Logiparina (LHN-1, Novo, Denmark) con un peso molecular de 600 a 20,000 Daltons y con más de 70% entre 1,500 y 10,000 Daltons se produce por despolimerización enzimática de heparina de mucosa intestinal, usando heparinasa. Los fragmentos de heparina de bajo peso molecular ejemplares incluyen, pero no están limitados a, enoxaparina, dalteparina, danaproid, gamaparina, nadroparina, ardeparina, tinzaparina, certoparina y reviparina. En otra modalidad, los compuestos de heparina de la invención pueden obtenerse a partir de heparina no fraccionada al despolimerizar primero la heparina no fraccionada para producir heparina de bajo peso molecular y luego aislando o separando la fracción de interés. La heparina no fraccionada es una mezcla de cadenas polisacáridas compuestas de disacáridos en repetición constituidos de un residuo de ácido urónico (ácido D-glucurónico o ácido L-idurónico) y un residuo de D-glucosamina . Muchos de estos disacáridos son sulfatados en los residuos de ácido urónico y/o residuos de glucosamina. Generalmente, la heparina no fraccionada tiene un peso molecular promedio que varía de alrededor de 6,000 Daltons a 40,000 Daltons, dependiendo de la fuente de la heparina y de los métodos usados para aislarla. En una modalidad, la heparina conserva una capacidad de unirse a P- y/o L-selectina, pero es una forma no anticoagulante. Por ejemplo, la heparina de acuerdo con esta modalidad incluye heparina formada al desulfatar heparina en la posición 2-0 de residuos de ácido urónico y/o la posición 3-0 de residuos glucosamina de heparina. Heparina y sulfato de heparano consisten en unidades disacáridas en repetición que contienen ácido D-glucurónico (GIcA) o ácido L-idurónico (IdoA) y un residuo de glucosamina que es ya sea N-sulfatado (GIcNS) , N-acetilado (GIcNAc) u, ocasionalmente, no sustituido (GIcNH2) (Esko, J. D., y Lindahl, U. 2001. Molecular diversity of heparan sulfate. J. Clin. Invest. 108:169-173). Los disacáridos pueden sulfatarse más en C6 o C3 de los residuos de glucosamina y C2 de los residuos de ácido urónico. La potente actividad anticoagulante de la heparina puede depender en una disposición específica de unidades de azúcar sulfatadas y epímeros de ácido urónico, las cuales forman un sitio de unión para antitrombina. Véase, por ejemplo, Wang, L. et al. (2002) J Clin Invest, julio 2002, volumen 110, número 1, 127- 136. La heparina 2-0, 3-O-desulfatada (2/3DS-heparina) puede prepararse de acuerdo con cualquier método estándar cocido en la técnica, por ejemplo, el método de Fryer, A. et al . , (1997) Selective O-desulfation produces nonanticoagulant heparin that retains pharmological activity in the lung. J. Pharmacol. Exp. Ther. 282:208-219. La actividad anticoagulante de heparina y heparinoides modificados puede analizarse, por ejemplo, por el ensayo de anti-factor Xa amidolítico como el descrito en Buchanan, M. R. , Boneu, B., Ofosu, F. , and Hirsh, J. (1985) The relative importance of thrombin inhibition and factor Xa inhibition to the antithrombotic effects of heparin. Blood 65:198-201. La heparina (por ejemplo, una fracción de heparina) sola o en combinación con otros inhibidores de P- y/o L-selectina puede inhibir la interacción entre P- y/o L-selectina y un ligando de P- y/o L-selectina. Por inhibir la interacción se intenta decir, por ejemplo, que la P- y/o L-selectina y su ligando son incapaces de unirse adecuadamente uno al otro. Esta inhibición puede ser el resultado de cualquiera de una variedad de eventos, incluyendo, por ejemplo, prevenir o reducir la interacción entre P- y/o L-selectina y el ligando, inactivar P- y/o L-selectina y/o el ligando, por ejemplo, mediante corte u otra modificación, alterar la afinidad de P- y/o L-selectina y el ligando unos por otros, diluir P- y/o L-selectina y/o el ligando, evitar la expresión en superficie y membrana de plasma de P- y/o L-selectina o reducir la síntesis de P- y/o L-selectina y/o el ligando, sintetizar una P- y/o L-selectina y/o ligando anormal, sintetizar una P- y/o L-selectina y/o ligando empalmado alternativamente, prevenir o reducir el doblez conformacional adecuado de P- y/o L-selectina y/o el ligando, modular las propiedades de unión de P- y/o L-selectina y/o el ligando, interferir con las señales que se requieren para activar o desactivar P- y/o L-selectina y/o el ligando, activar o desactivar P- y/o L-selectina y/o el ligando en el momento inadecuado o interferir por otros receptores, ligandos u otras moléculas que se requieran para la síntesis o funcionamiento normal de P- y/o L-selectina y/o su ligando. Ejemplos de otros inhibidores de P- y/o L-selectina que pueden usarse en combinación con la heparina de la invención incluyen formas solubles de P- y/o L-selectina o el ligando, proteínas inhibidoras, péptidos inhibidores, carbohidratos inhibidores, glucoproteínas inhibidoras, glucopéptidos inhibidores, sulfátidos inhibidores, análogos sintéticos de P- y/o L-selectina o el ligando, ciertas sustancias derivadas de productos naturales, inhibidores de liberación granulada e inhibidores de una molécula que se requiere para la síntesis o funcionamiento de P- y/o L-selectina o el ligando. Por ejemplo, la forma soluble ya sea de P- y/o L-selectina o el ligando, o una porción de la misma, puede competir con su molécula goznada por el sitio de unión en la molécula complementaria, y de esta manera reducir o eliminar la unión entre la P- y/o L-selectina unida a membrana y el ligando celular. La forma soluble puede obtenerse, por ejemplo, a partir de purificación o secreción de P- y/o L-selectina de ocurrencia natural o ligando, a partir de P- y/o L-selectina o ligando recombinante o a partir de P- y/o L-selectina o ligando sintetizado. Las formas solubles de P-y/o L-selectina o ligando también intentan incluir, por ejemplo, formas secretadas solubles truncadas, fragmentos proteolíticos, otros fragmentos y construcciones quiméricas al menos entre una porción de P- y/o L-selectina o ligando y otras moléculas. Las formas solubles de P- y/o L-selectina se describen en Mulligan et al . , J. Immunol., 151:6410-6417, 1993 y las formas solubles de P- y/o L-selectina y ligando se describen en Sako et al., Cell 75 ( 6) : 1179-1186, 1993. Las proteínas inhibidoras que pueden usarse en combinación con una heparina de la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-P- y/o L-selectina (Palabrica et al . , Nature 359:848-851, 1992; Mulligan et al . , J. Clin. Invest. 90: 1600-1607, 1992; Weyrich et al . , J. Clin. Invest. 91: 2620-2629, 1993; Winn et al . , J. Clin. Invest. 92:2042-2047, 1993); anticuerpos anti-ligando de P- y/o L-selectina (Sako et al . , Cell 75(6): 1179-1186, 1993); fragmentos Fab (2) del anticuerpo inhibidor generados a través de corte enzimático (Palabrica et al . , Nature 359: 848-851, 1992); quimeras de P- y/o L-selectina-IgG (Mulligan et al., Immunol., 151: 6410-6417, 1993); y proteínas portadoras que expresen una porción de carbohidrato reconocida por P- y/o L-selectina. Los anticuerpos pueden ser dirigidos contra P- y/o L-selectina o el ligando, o una subunidad o fragmento del mismo. Anticuerpos tanto policlonales como monoclonales pueden usarse en esta invención. Típicamente, se usan anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos tienen una región constante derivada de anticuerpo humano y una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal de ratón inhibidor. Los anticuerpos contra P- y/o L-selectina humana se describen en Palabrica et al . , Nautre 359: 848-851, 1992; Stone y Wagner, J. C. I., 92: 804-813, 1993; y contra P- y/o L-selectina de ratón se describen en Mayadas et al . , Cell, 74: 541-554, 1993. Anticuerpos contra ligando humano se describen en Sako et al . , Cell 75(6): 1179-1186, 1993. Anticuerpos que están disponibles comercialmente contra P- y/o L-selectina humana incluyen el clon ACl.2 monoclonal de Becton Dickinson, San José, California. Un péptido inhibidor para usarse en combinación con una heparina de la invención incluye, por ejemplo, unirse a un sitio de unión en el ligando de P- y/o L-selectina de tal forma que la interacción al igual que la unión de P- y/o L-selectina al ligando se reduzca o elimine. El péptido inhibidor puede ser, por ejemplo, el mismo, o una porción de, el sitio de unión primario de P- y/o L-selectina, (Geng et al . , J. Biol.. Chem., 266: 2313-22318, 1991, o puede ser de un sitio de unión diferente. Los péptidos inhibidores incluyen, por ejemplo, péptidos o fragmentos de los mismos que se unen normalmente a ligando P- y/o L-selectina, péptidos sintéticos y péptidos recombinantes. En otra modalidad, un péptido inhibidor puede ser una molécula que no sea P- y/o L-selectina o su ligando, y de esta manera interferir con la unión de P-y/o L-selectina o su ligando debido a que la molécula está ya sea directa o indirectamente implicada en efectuar la síntesis y/o funcionamiento de P- y/o L-selectina y/o su ligando. Los carbohidratos inhibidores incluyen oligosacáridos que contienen sialilo-Lewis o un sialilo-Lewis x o estructuras o análogos relacionados, carbohidratos que contienen ácido 2, 6 siálico, fracciones de heparina agotadas de actividad anticoagulante, oligosacáridos de heparina, por ejemplo, tetrasacáridos de heparina o heparina de bajo peso, y otros polisacáridos sulfatados. Los carbohidratos inhibidores se describen en Nelson et al . , Blood 82: 3253-3258, 1993; Mulligan et al . , Nature 364: 149-151, 1993; Ball et al . , J. Am. Chem. Soc. 114: 5449-5451, 1992; De Frees et al . , J. Am. Chem. Soc. 115: 7549-7550, 1993. Los carbohidratos inhibidores que están disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, 3' -sialilo-Lewis x, 3' -sialilo-Lewis a, lacto-N-fucopentosa III y 3' -sialil-3-fucosilactosa, de Oxford GlycoSystems, Roseadle, N.Y. Las glucoproteínas inhibidoras, por ejemplo, PSGL-1, ligando de P- y/o L-selectina monoespecífico de 160 kD, glucoproteína de membrana lisosómica, sialilo-Lewis x que contiene glucoproteína y sulfátidos inhibidores (Suzuki et al . , Biochem. Biophys. Res. Común. 190: 426-434, 1993; Todderud et al . , Leuk. Biol.. 52: 85-88, 1992) que inhiben la interacción de P- y/o L-selectina con su ligando también pueden usarse en esta invención en combinación- con una heparina de la invención. Los análogos sintéticos o miméticos de P- y/o L-selectina o el ligando pueden servir también como agentes inhibidores. Los análogos o miméticos de P- y/o L-selectina son sustancias que simulan en forma y/o distribución de carga P- y/o L-selectina. Un análogo de por lo menos una porción de P- y/o L-selectina puede competir con su P- y/o L-selectina unida a membrana cognada por sitios de unión en ligando, y de esta manera reducir o eliminar la unión entre la P- y/o L-selectina y el ligando unidos en membrana. Los análogos no miméticos de ligando incluyen sustancias que simulan en forma y/o distribución de carga de ligando de carbohidrato para P-y/o L-selectina. Un análogo de por lo menos una porción del ligando puede competir con su ligando celular cognado por el sitio de unión en la P- y/o L-selectina, y de esta manera reducir o eliminar la unión entre P- y/o L-selectina y el ligando celular. En ciertas modalidades que usan un análogo de ligando, el ácido siálico de un ligando de carbohidrato es reemplazado con un grupo que incrementa la estabilidad del compuesto pero que aún conserva o incrementa su afinidad para P- y/o L-selectina, por ejemplo, un grupo carboxilo con un separador adecuado. Una ventaja de incrementar la estabilidad es que permite al agente ser administrado oralmente. El análogo de sialilo-Lewis x con glucal en el extremo reductor y un sialilo-Lewis x bivalente anclado en un residuo de galactosa por medio de enlaces beta-1, 3- y beta-1, 6 inhiben también la unión de P- y/o L-selectina (DeFrees et al., J. Am. Chem. Soc., 115: 7549-7550, 1993).

Un inhibidor de la liberación granular también interfiere con la expresión de P- y/o L-selectina sobre la superficie de la célula, y por lo tanto interfiere con la función de P- y/o L-selectina. Por liberación granular se intenta decir la secreción de exocitosis de granulos de almacenamiento que contienen P- y/o L-selectina: Cuerpos de Weibel-Palade de células endoteliales o granulos [agr] de plaquetas. La función de la membrana granular con la membrana de plasma da como resultado la expresión de P- y/o L-selectina sobre la superficie de la célula. Ejemplos de estos agentes incluyen colchicina. [Sinha y Wagner, Europ. J. Cell. Biol. 43: 377-383, 1987) . Los agentes activos incluyen también inhibidores de una molécula que se requiere para la síntesis, modificación post-traduccional o funcionamiento de P- y/o L-selectina y/o el ligando, o activadores de una molécula que inhibe la síntesis o funcionamiento de P- y/o L-selectina y/o el ligando. Los agentes incluyen citocinas, factores de crecimiento, hormonas, componentes de señalización, asas, fosfatasas, proteínas homeobox, factores de transcripción, factores de traducción, factores post-traducción o enzimas. Los agentes también intentan incluir radiación ionizante, radiación no ionizante, agentes de ultrasonido y tóxicos que pueden, por ejemplo, al menos parcialmente inactivar o destruir P- y/o L-selectina y/o el ligando.

Como se indicó arriba, en ciertas modalidades de la invención, el agente activo puede ser anticuerpos monoclonales y/o policlonales dirigidos contra P- y/o L-selectina o su ligando (por ejemplo, PSGL-1) . Anticuerpos de ratón u otros anticuerpos no humanos reactivos con P- y/o L-selectina o su ligando pueden obtenerse usando una variedad de estrategias de inmunización, tales como aquellas descritas en las patentes de E.U.A. Nos. 6,210,670; 6,177,547 y 5,622,701; cada una de las cuales se incorpora a manera de referencia en la presente. En algunas estrategias, animales no humanos (normalmente mamíferos no humanos), tales como ratones, son inmunizados con antígenos de P- y/o L-selectina. Los inmunógenos típicos son células transfectadas establemente con P- y/o L-selectina que expresan estas moléculas sobre su superficie celular. Otros inmunógenos incluyen proteínas de P- y/o L-selectina o fragmentos epitópicos de P- y/o L-selectina que contienen los segmentos de estas moléculas que se unen a los anticuerpos de reacción ejemplificados. Las células productoras de anticuerpos obtenidas de los animales inmunizados son inmortalizadas y seleccionadas por la producción de un anticuerpo que se une específicamente a selectinas múltiples. Véase, Harlow & Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual (C.S.H. P. N. Y., 1988). Otros inhibidores de selectina que pueden usarse en combinación con una heparina de la invención contemplados para usarse en la invención incluyen heparinoides que bloquean la unión de P- y/o L-selectina; la molécula de carbohidrato fucoidina un derivado de azúcar sintético tal como OJ-R9188 que bloquea las interacciones selectina-ligando; el derivado fucosilado a carbono de ácido glicirretínico GM2296 y otros compuestos glicomimétidos de sialilo Lewis x; inhibidores de la expresión de P- y/o L-selectina tales como micofenolato mofetil, el inhibidor de proteasoma ALLN, y antioxidantes tales como PDTC; sulfátido y análogos de sulfátido tales como BMS-190394; el péptido terminal de 19 aminoácidos de PSGL1, otros péptidos de PSGL-1, proteínas de fusión a PSGL-1, análogos de PSGL-1 e inhibidores selectivos de la unión de PSGL-1 tales como beta-C-manósidos; compuestos de benzotiazol derivados de ZZZ21322 tales como compuesto 2 y/o estatinas, particularmente simvastatina la cual se comercializa por Merck como Zocor. En ciertas modalidades, la invención contempla el uso de potenciadores, por ejemplo, liposomas y/o nanocápsulas en el suministro de una heparina de la invención sola o en combinación con otros inhibidores, de tal manera que el agente sea complejado con el compuesto potenciador efectivo para potenciar la captación de heparina del tracto gastrointestinal (Gl) al torrente sanguíneo. Estas formulaciones pueden usarse para la introducción de formulaciones farmacéuticamente aceptables de las heparinas, anticuerpos y/u otros agentes activos descritos en la presente. La formación y uso de liposomas se conoce generalmente por aquellos expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Backer, M. V., et al . , (2002) Bioconjug Chem 13 (3): 462-7. En una modalidad, 1- (aciloxialquil) imidazoles (AAl) es de utilidad en la presente invención como liposomas sensibles a pH y no tóxicos. AAl se incorporan en los liposomas como se describe en Chen, F, et al . (2003) Cytosolic delivery of macromolecules : I. Synthesis and characterization of pH-sensitive aciloxyalkylimidazoles Biochimica et Biophysica Acta (BBA) —Biomembranes volumen 1611, Ediciones 1-2, pág. 140-150. Los 1- (aciloxialquil) imidazoles (AAl) ejemplares pueden sintetizarse mediante sustitución nucleofílica de esteres cloroalquílicos de ácidos grasos con imidazol. El primero puede prepararse a partir de cloruro de ácido graso y un aldehido. Cuando se incorporan en liposomas, estos lípidos muestran un valor pKa aparente que varía de 5.12 para 1- (palmitoiloximetil) imidazol (PMl) a 5.29 para l-[(alfa-miristoiloxi) etil] imidazol (alfa-MEI) según se determina por un ensayo de fluorescencia. Cuando la porción de imidazol es protonada, los lípidos son tensioactivos, como lo demuestra la actividad hemolítica hacia glóbulos rojos. AAl puede hidrolizarse en suero así como en homogenado de células. Son significativamente menos tóxicos que N-dodecilimidazol (NID) bioquímicamente estable hacia células de ovario de hámster chino (CHO) y RAW 264.7 (RAW) como lo determina el ensayo MTT. Un número de potenciadores de absorción se conocen en la técnica y pueden utilizarse en la invención. Por ejemplo, glicéridos de cadena media han demostrado la capacidad de potenciar la absorción de fármacos hidrofílicos a través de la mucosa intestinal (Pharm. Res. Vol 11:1148-54 (1994)). Se ha reportado que el caprato de sodio incrementa la absorción intestinal y colónica de fármacos por la ruta paracelular (Pharm. Res. 10:857-864 (1993); Pharm. Res. 5:341-346 (1988)). La patente de E.U.A. No. 4,545,161 describe un proceso para incrementar la capacidad de absorción enteral de heparina y heparinoides al añadir agentes tensioactivos no iónicos tales como aquellos que pueden prepararse al reaccionar óxido de etileno con un ácido graso, un alcohol graso, un alquilfenol o un éster de ácido graso de sorbitán o glicerol . Puede usarse un método para potenciar la absorción de heparina a través de membranas mucosas al co-administrar una sulfona y un alcohol graso junto con la heparina (patente de E.U.A. No. 3,510,561). La patente de E.U.A. No. 4,239,754 a Sache et al . describe formulaciones liposómicas para la administración oral de heparina, diseñadas para proporcionar una duración de acción prolongada. La heparina se retiene dentro o sobre los liposomas, los cuales se forman típicamente a partir de fosfolípidos que contienen cadenas acilo que se derivan de ácidos grasos no saturados. Otros métodos de suministro para heparina de la invención se describen en la patente de E.U.A. No. 4,654,327 a Teng (se refiere a la administración oral de heparina en forma de un complejo con un ion de amonio cuaternario) , patente de E.U.A. No. 4,656,161 a Herr (describe un método para incrementar la capacidad de absorción enteral de heparina o heparinoides al administrar oralmente el fármaco junto con un agente tensioactivo no iónico tal como éter polioxietilen-20 cetílico, estearato de polioxietileno-20, otros agentes tensioactivos a base de polioxietileno (polietilenglicol), éter estearílico de polioxipropileno-1, 5, estearato palmitato de sucrosa u octil-beta-D-glucopiranósido) , la patente de E.U.A. No. 4,695,450 a Bauer describe una emulsión anhidra de un líquido hidrofílico que contiene polietilenglicol, un alcohol dihídrico tal como propilenglicol, o alcohol trihídrico tal como glicerol, y un líquido hidrofóbico, particularmente un aceite animal, un aceite mineral o un aceite sintético), la patente de E.U.A. No. 4,703,042 a Bodor describe la administración oral de una sal de ácido heparínico polianiónico y una especie policatiónica) , la patente de E.U.A. No. 4,994,439 a Longenecker et al., describe un método para mejorar la capacidad de absorción en transmembrana de fármacos macromoleculares tales como péptidos y proteínas, al co-administrar el fármaco junto con una combinación de una sal biliar o fusidato o derivado de los mismos y un detergente no iónico (agente tensioactivo)), patente de E.U.A. No. 5,688,761 a Owen et al., (se enfoca principalmente en el suministro de fármaco péptidos usando una formulación de microemulsión de agua en aceite que convierte fácilmente en una emulsión de aceite en agua mediante la adición de un fluido acuoso, con lo cual el péptido u otro fármaco hidrosoluble es liberado para su absorción por el cuerpo), la patente de E.U.A. Nos. 5,444,041, 5,646,109 y 5,633,226 a Owen et al., (dirigidas a microemulsiones de aceite en agua para suministrar agentes biológicamente activos tales como proteínas o péptidos, en donde el agente activo se almacena inicialmente en la fase de agua interna de la emulsión, pero es liberado cuando la composición se convierte en una emulsión de aceite en agua luego de mezclarla con fluidos corporales), la patente de E.U.A. No. 5,714,477 a Einarsson (describe un método para mejorar la biodisponibilidad de heparina, fragmentos de heparina o sus derivados al administrar el agente activo en combinación con uno o varios esteres glicerólicos de ácidos grados), la patente de E.U.A. No. 5,853,749 a New (describe una formulación para regular el intestino a un pH en la escala de 7.5 a 9 al coadministrar un agente biológicamente activo con un ácido biliar o sal y un agente regulador de pH) . En una modalidad, las presentes formas de dosis son de liberación retrasada en naturaleza, de tal manera que la liberación de la composición a partir de la forma de dosis se retrasa después de la administración oral, y típicamente ocurra en el tracto Gl inferior. Después de alcanzar el sitio de liberación deseado, puede o no haber un mecanismo adicional que controle la liberación de la composición de la forma de dosis. Es decir, la liberación retrasada de la composición de la forma de dosis puede ser inmediata y sustancialmente completa en el sitio de liberación deseado, o, como alternativa, la liberación en el sitio deseado puede ocurrir en una forma prolongada durante un periodo de tiempo extendido, o de una forma en etapas o pulsátil. Por ejemplo, la heparina puede ser suministrada por bombas implantables internas y externas. Estas bombas pueden suministrar cantidades de heparina básales y/o de bolo. Como se describió arriba, una heparina de la invención sola o en combinación con inhibidores de selectina adicionales se administra en una cantidad efectiva para inhibir la unión de células cancerosas metastásicas a P- y/o L-selectina. Esta inhibición de unión puede ensayarse mediante un número de métodos conocidos en la técnica. La heparina de la invención sola o en combinación con otros inhibidores de selectina puede incorporarse en una variedad de formulaciones para administración terapéutica. Más particularmente, la heparina sola o en combinación con otros agentes puede formularse en composiciones farmacéuticas mediante combinación con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables y adecuados, y puede formularse en varias preparaciones, incluyendo en formas líquidas, tales como suspensiones y soluciones. La administración del agente activo puede lograrse por administración oral. Las formulaciones adecuadas para usarse en la invención pueden encontrarse en Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Filadelfia, Pa . , 19a ed. (1995)), cuyas enseñanzas se incorporan en la presente a manera de referencia. Además, para una breve revisión de métodos de suministro de fármaco, véase, Langer, et al (1990) Science 249:1527-1533, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente a manera de referencia. Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden fabricarse de una manera que se conozca por aquellos de capacidad en la técnica, es decir, por medio de técnicas convencionales de mezclado, disolución, levigado, emulsionado, atrape o liofilización. Los siguientes métodos y excipientes son simplemente ejemplares y de ninguna manera limitativos. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para usarse en la invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad terapéuticamente efectiva. La cantidad de composición , administrada por supuesto, dependerá del sujeto que esté siendo tratado, el peso del sujeto, de la severidad de la aflicción, la manera de administración y el juicio del médico tratante. La determinación de la cantidad efectiva está dentro de la capacidad de alguien capacitado en la técnica, especialmente, en vista de la descripción detallada proporcionada en la presente. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden fabricarse usando cualquier método convencional, por ejemplo, mezclado, disolución, granulado, levigado, emulsionado, encapsulado, atrape, centrifugación por fusión, secado por aspersión o procesos de dispersión. Sin embargo, la formulación farmacéutica óptica se determinará por alguien de capacidad en la técnica dependiendo de la ruta de administración y la dosis deseada. Estas formulaciones pueden influenciar el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de eliminación in vivo del agente administrado. Dependiendo de la condición que se esté tratando, estas composiciones farmacéuticas pueden formularse y administrarse sistémicamente o localmente. Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden administrarse mediante un número de rutas, incluyendo sin limitación, tópicamente, rectalmente, oralmente, vaginalmente, nasalmente, transdérmicamente . Las modalidades de administración enteral incluyen, por ejemplo, administración oral (incluyendo bucal y sublingual) y rectal. Las modalidades de administración transepitelial incluyen, por ejemplo, administración transmucosal y administración transdérmica. La administración transmucosal incluye, por ejemplo, administración enteral así como nasal, inhalación y administración profunda pulmonar; administración vaginal y administración rectal. Administración transdérmica incluye modalidades transdérmicas o transcutáneas pasivas o activas, incluyendo, por ejemplo, parches y dispositivos de iontoforesis, así como la aplicación tópica de pastas, pomadas o ungüentos . Las composiciones farmacéuticas se formulan para contener portadores farmacéuticamente aceptables adecuados, y pueden comprender opcionalmente excipientes y auxiliares que faciliten el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que puedan usarse farmacéuticamente. La modalidad de administración generalmente determinará la naturaleza del portador. Para administración tisular o celular, los penetrantes adecuados para la barrera particular que será permeada se usan en la formulación. Estos penetradores se conocen generalmente en la técnica. Para ciertas preparaciones la formulación puede incluir materiales de estabilización, tales como polioles (por ejemplo sucrosa) y/o agentes tensioactivos (por ejemplo, agentes tensioactivos no iónicos), y similares. Estas preparaciones pueden contener uno o más excipientes, los cuales incluyen, sin limitación: a) diluyentes tales como azúcares, incluyendo lactosa, dextrosa, sucrosa, manitol o sorbitol; b) aglutinantes tales como silicato de magnesio aluminio, almidón de maíz, trigo, arroz, papa, etc.; c) materiales de celulosa tales como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y carboximetilcelulosa de sodio, polivinilpirrolidona, gomas tales como goma arábiga y goma tragacanto y proteínas tales como gelatina y colágeno; d) agentes desintegrantes o solubilizadores tales como polivinilpirrolidona entrelazada, almidones, agar, ácido algínico o una sal de los mismos tales como alginato de sodio, o composiciones efervescentes; e) lubricantes tales como sílice, talco, ácido esteárico o su sal magnesio o calcio y polietilenglicol; f) saborizantes y edulcorantes; g) colorantes o pigmentos, por ejemplo, para identificar el producto o para caracterizar la cantidad (dosis) de agente activo; y h) otros ingredientes tales como conservadores, estabilizadores, agentes de hinchamiento, agentes emulsionantes, promotores de solución, sales para regular presión osmótica y reguladores de pH . La composición farmacéutica puede proveerse como una sal del agente activo, la cual puede formarse con muchos ácidos, incluyendo pero no limitados a clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en solventes protónicos acuosos o en otros solventes protónicos que son las formas de base libre correspondientes.

Como se indicó arriba, las características del propio agente y la formulación del agente pueden influenciar el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de eliminación in vivo del agente administrado. Esta información farmacocinética y farmacodinámica puede recabarse a través de estudios preclínicos in vi tro e in vivo, confirmados posteriormente en humanos durante el curso de pruebas clínicas. Así, para cualquier compuesto usado en el método de la invención, una dosis terapéuticamente efectiva en mamíferos, particularmente humanos, puede calcularse inicialmente a partir de ensayos bioquímicos y/o a base de células. Entonces, la dosis puede formularse en modelos animales para lograr una escala de dosis terapéutica deseable que module la unión de P- y/o L-selectina. La toxicidad y eficacia terapéutica de estos compuestos puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos de células tales como células endoteliales de vena umbilical humana in vi tro o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) . Para el método de la invención, cualquier régimen de administración efectivo que regule la sincronización y secuencia de dosis puede usarse. Las dosis del agente activo incluyen unidades de dosificación farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva del agente. Típicamente, el producto activo, por ejemplo, la heparina, estará presente en la composición farmacéutica a una concentración que varíe de alrededor de 1 mg por dosis a 3,000 mg por dosis y, más típicamente, a una concentración que varíe de alrededor de 40 mg (10,000 unidades) por dosis a alrededor de 2,700 mg (300,000 unidades) por dosis, o aproximadamente 50 mg por dosis a alrededor de 600 mg por dosis. Sin embargo, dependiendo de la formulación de heparina (por ejemplo, si era una fracción que tenía una concentración de inhibición de selectina, se puede dar menos heparina) . En una modalidad, el agente activo se administra en una tableta o cápsula diseñada para incrementar la absorción del tracto Gl. En otra modalidad, el agente activo está contenido en una forma sólida o de cápsula adecuada para su administración oral en dosis totales de entre alrededor de 50 mg a aproximadamente 500 mg, y típicamente dosis totales de 50 mg (6,250 unidades), 100 mg (12,500 unidades), 250 mg (31,250 unidades) o 500 mg (62,500 unidades) . Las dosis diarias pueden variar ampliamente, dependiendo de la actividad específica del agente activo particular. Dependiendo de la ruta de administración, una dosis adecuada puede calcularse de acuerdo con el peso corporal, área de superficie del cuerpo o tamaño de órganos. El régimen de dosificación final será determinado por el médico que atienda en vista de una adecuada práctica médica, considerando varios factores que modifiquen la acción de fármacos, por ejemplo, la actividad específica del agente, la severidad del estado de la enfermedad, la respuesta del paciente, la edad, condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, y similares. Factores adicionales que pueden tomarse en cuenta incluyen tiempo y frecuencia de administración, combinaciones de fármacos, sensibilidades a reacción y tolerancia/respuesta a terapia. Una refinación adicional de la dosis adecuada para tratamiento que incluye cualquiera de las formulaciones mencionadas en la presente se hace rutinariamente por el practicante capacitado sin experimentación indebida, especialmente en vista de la información de dosis y ensayos descritos, así como los datos farmacocinéticos observados en pruebas clínicas. Las dosis adecuadas pueden determinarse a través del uso de ensayos establecidos para determinar la concentración del agente en un fluido corporal u otra muestra junto con datos de respuesta a dosis. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos del agente y la ruta de administración. La dosis y administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del agente activo o para mantener el efecto deseado. En consecuencia, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en una sola dosis, varias dosis individuales, infusión continua, depósitos de liberación prolongada o combinaciones de los mismos, según se requiera para mantener un nivel mínimo deseado del agente. Las composiciones farmacéuticas de corta acción (es decir, corta vida media) pueden administrarse una vez al día o más de una vez al día, (por ejemplo, dos, tres o cuatro veces al día) . Las composiciones farmacéuticas de larga acción pueden administrarse cada 3 a 4 días, cada semana o una vez cada dos semanas. Las composiciones que comprenden un agente activo de la invención formulado en un portador farmacéutico aceptable pueden prepararse, ponerse en un recipiente adecuado y etiquetarse para el tratamiento de una condición indicada. Las condiciones indicadas en la etiqueta pueden incluir, pero no están limitadas a, tratamiento de trastornos proliferativos celulares y metástasis. Los equipos también se contemplan, en donde el equipo comprende una forma de dosis de una composición farmacéutica y un inserto de empaque que contiene instrucciones para usar la composición en el tratamiento de una condición médica. Generalmente, los agentes activos usados en la invención se administran a un sujeto en una cantidad efectiva. Generalmente, una cantidad efectiva es una cantidad efectiva para (1) reducir los síntomas de la enfermedad que se busque tratar, (2) inducir un cambio farmacológico relevante a tratar la enfermedad que se busque tratar y/o (3) prevenir los síntomas de la enfermedad que se busca tratar. Los resultados descritos en la presente, junto con el registro de heparina establecido como un agente terapéutico, indican que la heparina puede ser útil para inhibir interacciones a base de P- y/o L-selectina usando cantidades más bajas que aquellas requeridas para terapia anticoagulante. En particular, la invención proporciona una fracción de heparina que comprende la heparina de más alto peso molecular encontrada en tinzaparina (por ejemplo, más de 8,000 daltons). Idealmente, la fracción de heparina pesa más de 8,000 daltons, pero no es tan grande como para causar efectos secundarios indeseables o biodisponibilidad reducida. Así, la invención proporciona un método para inhibir la unión de P- y/o L-selectina en un sujeto, al administrar al sujeto una cantidad de heparina que no produzca actividad anticoagulante sustancial o sangrado indeseable en el sujeto, se proporcionan además métodos para tratar una patología relacionada con P- y/o L-selectina al administrar a un sujeto que tenga la patología una cantidad de heparina que no produzca actividad anticoagulante sustancial o sangrado indeseable en el sujeto. Las condiciones agudas y crónicas particulares, en las cuales P- y/o L-selectina tienen un papel patofisiológico pueden tratarse usando un método de la invención. Por ejemplo, respuestas inmunes indeseables en las cuales la adherencia o unión de leucocitos, neutrófilos, macrófagos, eosinófilos u otras células inmunes mediadas por la interacción de L-selectina con ligandos de células endoteliales, pueden ser inhibidas al administrar heparina al sujeto de acuerdo con un método de la invención. La inhibición de adherencia a neutrófilos, por ejemplo, puede interrumpir la cascada de daño iniciada por la secreción de radicales de oxígeno libre y actividades relacionadas que resultan en daño tisular y pérdida de la función contráctil miocardiaca presente en infarto de miocardio. Similarmente, la adhesión de células mediada por P- y/o L-selectina tales como neutrófilos y plaquetas puede ser inhibida en un sujeto si esta actividad es indeseable. Así, la severidad de trastornos inmunológicos crónicos o respuestas inflamatorias agudas puede reducirse usando un método de la invención. Cuando se administra a un sujeto, la heparina se administra como una composición farmacéutica. Estas composiciones farmacéuticas de heparina están disponibles comercialmente y los protocolos para la administración de heparina se conocen bien en la técnica. Estas composiciones y protocolos de administración pueden emplearse convenientemente en la práctica de la invención. Alguien capacitado en la técnica conocería que la elección de la composición farmacéutica de heparina particular depende, por ejemplo, de la ruta de administración y que una composición farmacéutica de heparina puede administrarse a un sujeto mediante varias rutas, incluyendo, por ejemplo, parenteralmente, particularmente intravenosamente. La composición de heparina puede administrarse mediante inyección intravenosa o subcutánea, y la administración puede ser como un bolo o mediante infusión continua. Además, las formas mucosalmente absorbibles de heparina pueden administrarse oralmente, rectalmente o mediante inhalación, siempre y cando la cantidad de heparina lograda en la sangre no exceda una concentración de aquella que produce actividad anticoagulante sustancial o sangrado indeseable en el sujeto. Aunque la invención ha sido descrita generalmente arriba, aspectos adicionales de la invención se harán aparentes a partir de la siguiente descripción específica que sigue, la cual es ejemplar y no limitativa.

Ejemplos Ejemplo 1 Materiales: Los siguientes materiales fueron de UCSD Medical Center Pharmacy: Heparina sódica no fraccionada (UFH) de American Pharmaceutical Partners (20,000 U/ml; números de lote 302523, 333246); Innohep (Tinzaparina, TINZ) de Pharmion, E.U.A. (Licenciada de LEO Pharmaceutical Products, Dinamarca, 20,000IU/ml; números de lote E9867A y G3371A) ; Fragmin (Dalteparina, DALT) de Pharmacia (5000IU/0.2 ml; números de lote 94250A51, 94683A02 y 94802401) ; Lovenox (Enoxaparina, ENOX) de Aventis (30 mg/0.3 ml; números de lote 30324, 9367 y 9369) y Arixtra (Fondaparinux, FOND) de Sanofi-Synthelabo (2.5 mg/0.5 ml; números de lote 010000003 y 0170000010). A menos que se indique lo contrario, todos los químicos restantes se compraron de Sigma Chemical Company, St. Luis. Líneas de Células: Células de adenocarcinoma colónico humano LS180 y células MC38GFP (una línea de células de carcinoma de colon de ratón transfectada establemente con EGFP) fueron cultivadas. Células B16F1 de melanoma de ratón se cultivaron en DMEM con 10% de FCS. Todos los medios y aditivos fueron de Gibco (Invitrogen), excepto para FCS de HyClone. Todas las células se incubaron a 37°C con 5% de C02. Antes de usar, las células se liberaron mediante incubación en PBS con 2 mM de EDTA a 37°C durante 5-10 minutos, y se lavaron en PBS con Ca2+, Mg2+ y glucosa antes de suspender en el mismo regulador de pH para inyección intravenosa. Ratones: Ratones C57BL/6J de Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine) fueron alimentados con alimento estándar y agua ad libi tum, y se les mantuvo sobre un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Algunos ratones se obtuvieron de la crianza en casa de estos ratones C57BL/6J. Todos los ratones comprados se les dejó aclimatarse en el vivario durante un mínimo de una semana después de su llegada antes de empezar los experimentos. Todos los experimentos se llevaron a cabo en vivarios acreditados por la AAALAC en un protocolo aprobado por la IACUC de la Universidad. Inhibición con heparina de la unión de LS180 a selectinas: Los niveles de heparina se normalizaron con base en su actividad anti-Xa. La unión de células a quimeras de selectina-Fc humana inmovilizadas fue estudiada, excepto que se usaron las células LS180 cargadas con calceína AM. Los resultados se expresan como porcentaje de unión de control, calculado usando la fórmula: 100* (valor de heparina-valor EDTA) / (valor de regulador de pH solo-valor de EDTA) . Cada anticoagulante fue probado en pocilios triplicados a cada concentración relativa. Titulación de la dosis de heparina por medio de los niveles de anti-Xa en plasma: Los ratones fueron inyectados subcutáneamente con 100 ul de UFH, TINZ o FOND diluidas en PBS, a varias concentraciones finales. Treinta minutos más tarde, se tomó sangre mediante punción cardiaca en una jeringa de 1 cc que contenía 30 ul de EDTA 10 mM. Las muestras se centrifugaron dos veces a 2,000 ref a 24°C para recoger el plasma, el cual se almacenó a -80°C hasta el análisis de la actividad anti-Xa. Antitrombina III humana (3.3 ug/pocillo) (Enzyme Research Laboratories), y factor Xa humano (0.02 ug/pocillo) (Enzyme Research Laboratories), en 155 uL de HEPES 25 mM/150 mM de NaCl/pH 7.5 fueron añadidos a muestras de plasma de 1.25 uL, las cuales después se incubaron con 25 ug/pocillo de un sustrato cromogénico de factor Xa sintético (Chromogenix) . La reacción se detuvo después de 15 minutos al añadir 50 ul/pocillo de ácido acético al 20%. El cromóforo resultante se midió a 405 nm. Los niveles de heparina en plasma se calcularon en unidades anti-Xa/ml al comparar contra una curva estándar de muestras de plasma de ratón picadas con heparina. Los estándares y muestras se analizaron por triplicado. Las cantidades finales usadas para dosificación "lx" fueron 6.56 U de UFH, 7.32 IU de TINZ y 0.0033 mg de FOND. La dosificación "3x" usó tres veces la cantidad. Ensayo de metástasis experimental de carcinoma: Los ratones fueron inyectados subcutáneamente con 100 ul de PBS o heparina en 100 uL de PBS. Treinta minutos más tarde, 500,000 células MC38GF fueron inyectadas intravenosamente en la vena de la cola lateral. Los ratones de cada grupo estudiado fueron inyectados en orden alternante, y las células fueron resuspendidas al golpetear suavemente el tubo antes de aspirar la muestra para cada inyección. Veintisiete días después de la inyección, los ratones fueron sometidos a eutanasia, se extirparon sus pulmones y la fluorescencia por EGFP en los lisados fue cuantificada. Ensayo de metástasis experimental de melanoma: Los ratones fueron inyectados con heparina y 500,000 células B16F1 usando el protocolo descrito para el ensayo de metástasis en carcinoma. Diecisiete días después de la inyección, los ratones fueron sometidos a eutanasia, la perfusión traqueal con 10% de formalina regulada en pH se llevó a cabo y los pulmones se extirparon y se pusieron en 10% de formalina regulada en pH. Los pulmones se dejaron fijar durante un mínimo de veinticuatro horas, se retiraron de la formalina individualmente y se fotografiaron usando una cámara digital. Los pesos de los pulmones se determinaron al retirar los pulmones de la formalina, poniéndolos brevemente en papel filtro para remover el exceso de líquido y luego pesándolos en una pesa analítica Sartorius. Análisis de disacárido de heparina: El análisis de disacárido se llevó a cabo por UCSD Glycotechnology Core Facility. Brevemente, 5 ug de cada heparina se secaron, resuspendieron en 100 mM de acetato de sodio, 0.1 mM de acetato de calcio, pH 7.0 y se incubaron con 5 mU cada uno de heparina liasas I, II y III durante 18 horas a 37°C. Las muestras se hirvieron durante 2 minutos y se corrieron a través de un filtro Microcon 10 prelavado. Las muestras se secaron después, se resuspendieron en agua MilliQ y se separaron por HPLC en una columna de intercambio aniónico dionex ProPac PAl usando agua MilliQ a pH 3.5 con un gradiente de cloruro de sodio de 50-1000 mM durante 60 minutos. La derivación post-columna con la detección de fluorescencia se logró al mezclar 2-cianoacetamida (1%) con 250 mM de NaOH en la corriente eluyente usando una bomba de canal Eldex dual. El eluyente se pasó después a través de una bobina de reacción Eppendorf TC-40 calentada a 130°C, seguida por un baño de enfriamiento y luego a un detector de fluorescencia Jasco puesto a una excitación de 346 nm y una emisión de 410 nm. La sensibilidad de este método es ~5 pmoles. Configuración de la heparina: Una columna TosoHaas TSKG2000SW HPLC se corrió a 0.4 ml/min en 10 mM de KH2P0 , 0.5 M de NaCl y 0.2% de Zwittergent (Calbiochem). El volumen vacío se determinó usando azul dextrano. Monofosfato de citidina (CMP, 0.5 ug) fue salpicado en todas las muestras para usarse como un control interno para marcar el volumen incluido. Dos lotes diferentes de cada heparina fueron evaluados. Cada muestra se llevó a un volumen total de 10 ul con agua MilliQ. La absorbancia UV se monitoreó a lo largo de las corridas de 45 minutos a una longitud de onda de 206 nm. En una corrida adicional, una alícuota más grade de TINZ (19.5 ul de TINZ y 2.5 ug de marcador CMP) fue corrida en la misma columna, y fracciones de 200 ul se recogieron y se evaluaron para su actividad inhibidora contra la unión de P-selectina a sLex (véanse detalles de ensayo aquí) . La cantidad de ácido urónico en cada fracción se cuantificó usando un ensayo de carbazol estándar. Ensayo para la Inhibición de la unión de P-selectina a sLex: Placas de ELISA de 96 pocilios y alta unión se recogieron durante la noche con 2 ug/ml de sLex-PAA (Gycotech, Maryland) en regulador de pH de carbonato 50 mM, pH 9.5. Las placas se enjuagaron dos veces con una dilución 1:5 de regulador de pH de corrida HPLC (concentración final de 2 mM de KH2P04, 0.1 M de NaCl y 0.04% de Zwittergent), y luego se bloquearon durante 1 hora en una dilución 1:5 de regulador de pH de corrida HPLC + 0.5% de BSA. La quimera de P-selectina humana se pre-acomplejó con IgG-AP (BioRad) (0.25 ug:0.25 ul) anti-humano de cabra en presencia de 1:5 diluciones de fracciones de HPLC recogidas (o diluciones de esas fracciones en regulador de pH de columna) o estándares de heparina durante una hora a temperatura ambiente con mezclado. Las muestras se añadieron a la placa bloqueada y se incubaron a temperatura ambiente durante 2-3 horas. La placa se enjuagó dos veces con una dilución 1:5 de regulador de pH HPLC + 0.5% de BSA, y luego dos veces con una dilución 1 : 5 de regulador de pH HPLC. La solución de substrato AP (150 ul; 10 mM de fosfato de p-nitrofenilo, 100 mM de Na2Co3, lmM de MgCl2, pH 9.5) fue añadida a la placa y se le dejó desarrollar a temperatura ambiente. La densidad óptica a 405 nm se leyó en un lector de placa SpectraMax 250. Una unidad de actividad inhibidora se definió arbitrariamente como 1% de inhibición de la unión de selectina, dentro de la escala lineal del ensayo. Los resultados se expresan como unidades inhibidoras totales, lo cual se calcula usando la siguiente fórmula: 100* [(unión máxima-unión desconocida) / (unión máxima-unión mínima) ]* (200/ul fracción probada en ensayo de inhibición) , en donde "unión máxima" es la cantidad de unión en presencia de una fracción que eluyó antes de la elusión de heparina y "unión mínima" es la cantidad de unión en presencia de 0.5UI/ml de TINZ. Estudios de farmacocinética en ratones para normalizar la dosificación de heparina. Estudios adicionales que comparaban UFH, TINZ y FOND fueron llevados a cabo, abarcando entonces el espectro de propiedades de inhibición de selectina. Una buena documentación acerca de la farmacocinética de estas heparinas en ratones no está disponible en la literatura. De hecho, la mayoría de los estudios en ratones anteriores han usado altas dosis de UFH que es probable que logren efectos anticoagulantes inaceptables en uso clínico humano. Antes de la prueba de estas heparinas en ensayos de metástasis, se llevaron a cabo estudios para normalizar la dosificación, de tal manera que cada heparina administrada diera niveles anti-Xa in vivo similares y clínicamente aceptables. El suministro subcutáneo es la ruta de administración típica de LMWHs. Así, dosis de heparina subcutáneas en ratones fueron optimizadas para lograr niveles ' anti-Xa relevantes clínicamente. Los niveles terapéuticos para pacientes tratados con heparina a partir de tromboembolia venosa son alrededor de -1 unidad/anti-factor Xa/ml para LMWHs, medida típicamente a 3-4 horas después de la inyección. Las dosis de heparina subcutánea fueron administradas sistemáticamente para lograr niveles anti-Xa en plasma aproximadamente similares en ratones. Se determinó que cantidades de una sola inyección de dosis de "lx" UFH, TINZ y FOND que produjeron niveles anti-Xa medios dentro de esta escala (figura 2A, como en humanos, existe una variación considerable entre individuos en los efectos de una sola dosis subcutánea) . Los niveles anti-Xa en plasma se analizaron 30 minutos después del suministro subcutáneo, que es cuando las células tumorales serían inyectadas en la vasculatura en los experimentos de metástasis planeados. Sin embargo, los estudios de farmacocinética mostraron que TINZ en realidad se eliminó mucho más rápido en ratones que en humanos, en quienes una dosis diaria es suficiente para mantener anticoagulación. Dosis de heparina individuales se incrementaron de dosificación "lx" a "3x", y se analizaron los niveles anti-Xa (figura 2B) . Aquí, el nivel pico inicial podría ser ligeramente más alto que lo aceptable clínicamente, pero niveles prácticamente relevantes serían sostenidos un poco más. Ambas dosis de heparina "lx" y "3x" se usaron para los experimentos de metástasis, que se aproximan a la escala de concentraciones que pudieran encontrarse en un paciente en estos fármacos. La metástasis de carcinoma puede ser atenuada sólo por ciertas heparinas. Todos los estudios in vivo subsecuentes utilizaron el modelo "experimental" de metástasis, en el cual células tumorales son inyectadas intravenosamente. Este método proporciona una oportunidad para estudiar las interacciones entre las células tumorales y células sanguíneas dentro de las primeras pocas horas de entrada de células tumorales en la vasculatura, de una manera controlada en un punto de tiempo conocido, (es decir, experimento de metástasis "espontánea" son inadecuados) . Nuestros experimentos utilizaron una inyección de un solo bolo de heparina antes de la inyección de células tumorales. Se ha demostrado que la metástasis experimental de células de carcinoma de colon humano y ratón podría ser atenuada por inyección intravenosa de 100U de UFH treinta minutos antes de la inyección de células tumorales. Estudios por otros usando 12.5 o 60UI de UFH antes de la inyección de células tumorales también demostraron una reducción en metástasis de células de melanoma. Aunque se demuestre el potencial de la heparina para reducir metástasis, estos y la mayoría de los estudios anteriores fueron llevados a cabo usando dosis de heparina que son clínicamente inaceptables. Para evaluar el tratamiento con heparina en un escenario más clínicamente relevante, se llevaron a cabo ensayos de metástasis que comparaban UFH, TINZ y FOND a dosis de "lx" y "3x". Los ratones fueron inyectados intravenosamente con células de carcinoma de colon MC38GFP singeneicas que se sabía portaban ligandos de selectina, 30 minutos después de la dosis subcutánea con las heparinas o con un control de PBS a dosis "lx" o dosis "3x". Los resultados con la dosis "lx" demostraron una tendencia en la reducción de metástasis que coincidió con la actividad de inhibición de selectina in vitro observada (es decir, UFH>TINZ»FOND) (figura 3A) . Sin embargo estos resultados no fueron estadísticamente significativos. La inyección de heparina "3x" dio una atenuación casi completa de metástasis con UFH y TINZ, pero ninguna diferencia significativa entre FOND y PBS (figura 3B) . Notablemente, esta dosis de FOND dio niveles anti-Xa en plasma en o por arriba de la escala aceptada para anticoagulación clínica (figura 2B) . La inhibición con heparina de metástasis de melanoma también depende de la actividad inhibidora de selectina. Los resultados obtenidos con células MC38GFP demuestran la relación entre la inhibición de metástasis de carcinoma de colon y la capacidad de la heparina para inhibir P- y L-selectina. Para determinar si este fenómeno fue aplicable a otros modelos de metástasis por cáncer ratones fueron inyectados intravenosamente con células de melanoma B16F1 treinta minutos después de una inyección subcutánea de dosis "lx" o dosis "3x" de UFH, TINZ o FOND (PBS como un control). Diecisiete días después de la inyección, se extirparon los pulmones y se evaluaron para la presencia de focos metastásicos. En lugar de contar los focos, los pesos de los pulmones se obtuvieron y se compararon con el peso de pulmones de ratones que no se les había inyectado células tumorales. Este método ha sido usado por otros, y se correlacionó muy bien con la apariencia física de los pulmones (véase figura 4). En ratones que recibieron la dosificación de heparina "lx", una reducción estadísticamente significativa en metástasis se observó en aquellos que recibieron UFH y TINZ (figuras 4A-4B) . De nuevo, FOND no tuvo algún efecto, con los pulmones pareciendo comparables a aquellos de ratones inyectados con PBS. Cuando la cantidad de heparina se incrementó a dosificación "3x", una reducción todavía mayor en metástasis fue observada con el tratamiento con UFH y TINZ, con los pesos de los pulmones similares a aquellos de ratones que no recibieron células tumorales (figura 4B) . De nuevo, FOND no tuvo efecto en metástasis, incluso la dosis más alta. Así, un solo bolo de UFH y TINZ de baja dosis, dado justo antes de la inyección de células de melanoma, tiene la capacidad de reducir metástasis. Esta tendencia coincide con aquella observada con células de carcinoma de colon, confirmando la importancia de la inhibición de selectina (y la falta de importancia de efecto anticoagulante) a través de varios tipos de células tumorales. La capacidad variable de LMWHS para inhibir selectina no se correlaciona con la composición disacárida. Las heparinas son polisacáridos complejos con una distribución polidispersa de patrones de sulfatación y epimerización. Se ha demostrado previamente que los patrones de sulfatación pueden afectar la capacidad de heparinas químicamente modificadas para inhibir selectinas. Dados diferentes métodos de preparación de las tres formulaciones de LMWH, diferentes patrones de sulfatación pudieran explicar su capacidad diferencial para inhibir P- y L-selectina. Se conoce bien la estructura de FOND. La composición disacárida de dos lotes cada uno de UFH y de cada una de las tres LMWHs fue evaluada como se describe en "Materiales y Métodos". Ninguna diferencia significativa en el porcentaje de cada disacárido fue notada. Es probable, por lo tanto, que las diferencias en inhibición observadas entre las diferentes LMWHs no se deban a las grandes diferencias en los patrones de sulfatación básicos. Más bien, tendría que ser debido a una estructura de orden más alto y/o longitud general. Para soportar la última posibilidad, nuestro trabajo previo demostró que una longitud cada vez más alta en la escala de 1-7 disacáridos se correlacionó con la capacidad cada vez más alta para inhibir P- y L-selectina. El fraccionado de tamaño Identifica heparinas con potentes propiedades inhibidoras de selectina en relación con actividad anticoagulante. Los insertos de empaque que acompañan las formulaciones de heparina indican que TINZ es probable que contenga más fragmentos de heparina de alto peso molecular (HMW) que ya sea DALT o ENOX. La cantidad de fragmentos de >8000 daltons es específica como 22-36% para TINZ, 14-26% para DALT y 0-18% para ENOX. Para determinar si esta diferencia potencial en el contenido de HMW estaba presente en estas muestras, se llevó a cabo un análisis HPLC por exclusión de tamaño en las cinco heparinas. El perfil de tamaño de cada heparina se determinó al monitorear la absorbancia UV a 206 nm (figura 5A) . Cada una de las tres LMWHs contenía una escala de tamaño notablemente más pequeña de fragmentos de heparina que UFH. ENOX tiene un perfil de peso molecular más bajo que tanto TINZ como DALT. Aunque el peso molecular promedio para ser similar para TINZ y DALT, el perfil de TINZ fue más amplio que el de DALT. Así, TINZ contiene una pequeña cantidad de moléculas de más alto peso molecular no presentes en DALT (figura 5A) . Para determinar si esta pequeña población de fragmentos más grandes está implicada desproporcionadamente en la inhibición de P-selectina, se recogieron fracciones después de la separación de tamaño HPLC de una alícuota más grande de TINZ . La cantidad total de heparina en cada fracción se determinó al medir el contenido de ácido urónico usando un ensayo de carbazol estándar. Las fracciones fueron evaluadas para su número total de unidades inhibidoras de P-selectina. Una gran cantidad de actividad inhibidora de P-selectina se notó en un número pequeño de las fracciones de peso molecular más alto (figura 5B) . De hecho, esta actividad se observó incluso antes de que el ácido urónico pudiera ser detectado en la muestra, indicando que una cantidad relativamente pequeña de material HMW tiene gran actividad inhibidora de P-selectina. Este resultado soporta fuertemente nuestra hipótesis de que la longitud es un factor importante para determinar la actividad inhibidora. Cuando se evaluó el número total de unidades anti-Xa en el perfil de fraccionado del tamaño de TINZ (figura 5B) , . se puede ver que existe un desplazamiento entre los picos de inhibición de P-selectina y anti-Xa. De hecho, cuando estas variables se normalizan a la cantidad de ácido urónico en cada fracción, puede verse que hay un pequeño subconjunto de fracciones (fracciones 28-32, indicadas por el cuadro con diagonales en la parte superior de la gráfica) que contienen una cantidad muy alta de actividad inhibidora de P-selectina y mínima actividad anti-Xa (figura 5B) . Así, una heparina disponible comercialmente contiene un subconjunto de fragmentos que, a una concentración dada, son capaces de inhibir la unión de P-selectina a su ligando, mientras que sólo afectan mínimamente el proceso de coagulación. Las cercanas relaciones de cáncer y trombosis sistémica excesiva están bien documentadas, y la necesidad de anticoagulación en estas situaciones es clara. Ya sea que la anticoagulación afecte la expansión del cáncer se resuelve en esta descripción. Numerosos estudios previos han demostrado la inhibición con UFH de metástasis de tumores sólidos en ratones, y datos limitados sugieren que es probable que el efecto sea relevante a humanos también. Una suposición básica ha por lo tanto sido que la anticoagulación es el mecanismo primario de su acción para atenuar el proceso metastásico. Como se describió anteriormente, las heparinas son mezclas complejas de moléculas bioactivas con muchos efectos potencialmente relevantes para la biología general de los tumores sólidos. Los datos indican que los efectos de la heparina relevantes a la supervivencia inicial de células tumorales en la circulación se deben principalmente a la inhibición de P/L-selectinas, posiblemente junto con el bloqueo de formación de fibrina intravascular por medio de la vía de coagulación en fase fluida. Si la heparina se administrase perioperatoriamente como se sugiere, sus otros efectos beneficiarían al paciente durante el tiempo en el que las células tumorales no estuvieran activamente en la vasculatura, toda vez que tiene el potencial de reducir el crecimiento e invasión de tumores primarios, así como el crecimiento de focos metastásicos establecidos, gracias a la inhibición de angiogénesis, heparanasas, etc. Casi todos los estudios en roedores han usado heparina a dosis relativamente altas, y el análisis de los diferentes tipos de heparinas actualmente comercializadas a dosis clínicamente relevantes no habia sido llevado a cabo. La presente descripción describe por primera vez que la capacidad de varias heparinas para inhibir P- y L-selectina in vi tro se correlaciona con su capacidad para inhibir metástasis de dos tipos diferentes de tumores de murino singeneicos. Esta reducción de metástasis también se muestra que es independiente de la actividad anticoagulante de las heparinas, toda vez que FOND, un excelente anticoagulante, no tuvo alguna capacidad para inhibir metástasis al mismo nivel que la actividad anti-Xa clínicamente tolerable, medido in vivo . A este respecto, recientes estudios de inhibición de metástasis con hirudina (un potente anti-trombina) en ratones usaron una dosis mucho más alta que la recomendada en humanos, y causaron niveles de anticoagulación algunas veces más allá de los limites superiores de detección de su ensayo. Así, aunque los efectos previamente reportados de heparina e hirudina a alta dosis en la formación de fibrina que soportan la metástasis tumoral probablemente sean ciertos, podrían no ser muy relevantes para la situación clínica en pacientes humanos. Se reportó recientemente que la coagulopatía de síndrome de Trousseau microangiopática dependiente P/L-selectina mediada por plaquetas y leucocitos puede ser inducida inyectando mucinas tumorales en ratones, incluso en presencia de hirudina . Los datos provistos en la presente indican que la inhibición de selectina es una acción importante de heparina que afecta la metástasis tumoral a dosis clínicamente relevantes. El orden de clasificación de cada capacidad de heparina para inhibir P- y L-selectina in vi tro coincidió con el efecto de la atenuación de metástasis in vivo . También, estos estudios usaron bolos individuales de heparina que producían niveles anti-Xa clínicamente tolerables que son eliminados del sistema a las pocas horas. Así, muchas de las otras acciones subsecuentes de heparina (por ejemplo, inhibición de angiogénesis, inhibición de heparanasa, etc.) son probablemente relevantes para los estudios de metástasis descritos, toda vez que la heparina en una sola dosis no está en el sistema lo suficiente como para influenciar estas interacciones. Más aún, estas otras acciones de heparina están hacia abajo del efecto de selectina en el modelo de metástasis descrito, ya que las células tumorales se introducen directamente en la vasculatura, en donde interactúan primero con células sanguíneas y endoteliales portadoras de P- y L-selectina. En el escenario clínico de una administración de heparina continua, podrían o no contribuir a grados variables, en diferentes situaciones. Debe notarse que, en el escenario clínico la heparina permanecería en la circulación durante más tiempo después de cada dosis (debido a su vida media incrementada en humanos) . También habría una duración de terapia más extendida. Así, los dramáticos efectos vistos en estos estudios de una sola inyección probablemente serían todavía más pronunciados en el escenario clínico. Las plaquetas y leucocitos pueden soportar la metástasis al interactuar con ligandos de selectina expresados sobre la superficie de células tumorales. Sin embargo, la línea de células de melanoma usada en estos estudios mostró previamente expresar bajos niveles de sLex, un componente principal de ligandos de selectina, y experimentos llevados a cabo en nuestro laboratorio indicaron que la P-selectina recombinante se une a estas células mínimamente. Esto indica que la inhibición con heparina de células de melanoma podría deberse también a la inhibición de interacciones selectina-ligando endógena (por ejemplo, entre PSGL-1 y P-selectina) . Esto es soportado por el reciente descubrimiento de que agregados plaquetarios alrededor de células tumorales pueden ocurrir incluso cuando uno porte ligandos de P-selectina. La interrupción de estos agregados plaquetarios por inhibición con heparina de P-selectina y/o el bloqueo de otros efectos de L-selectina podría ser suficiente para reducir la metástasis. Por lo tanto, la terapia con heparina no necesariamente está limitada a pacientes cuyas células tumorales porten ligandos de selectina. Este trabajo proporciona métodos para diseñar una prueba clínica prospectiva que evalúe la terapia con heparina pre-, peri- y post-operatoria en relación con cirugía para remover malignidades primarias, lo cual es un periodo de tiempo en el cual las células malignas pueden entrar en la vasculatura. Demuestran también la importancia de seleccionar una preparación de heparina que se sepa sea un potente inhibidor de la unión de P/L-selectina. Los datos in vi tro e in vivo indicados aquí indicarían que TINZ podría tener más de un incremento en la supervivencia libre de metástasis que DALT y ENOX, y que FOND no tendría ningún efecto en el resultado. Por lo tanto, recientes pruebas clínicas que demuestran una mejora en la supervivencia de pacientes con terapia de DALT podrían haber tenido un efecto todavía más grande si TINZ hubiera sido incluida en sus estudios. En la presente se identifica una LMWH, la cual tradicionalmente porta menos riesgos para efectos secundarios dañinos, que también es capaz de reducir metástasis por medio de inhibición de selectina. Además, los presentes estudios que evalúan varias fracciones de TINZ muestran que eventualmente sería posible aislar un subconjunto de fragmentos de heparina que permitieran la administración de dosis muy bajas que no afectaran un estado de coagulación de un paciente, pero que aún tuvieran una capacidad significativa para inhibir P-selectina. Finalmente, ya que la terapia anticoagulante se requiere frecuentemente en pacientes con cáncer para tratar trombosis en cualquier forma, los presentes datos indican que debe ponerse más atención en seleccionar el anticoagulante, toda vez que podría ser posible mejorar la supervivencia de una manera que fue independiente de la anticoagulación. Aunque no es necesaria para identificar la teoría de cómo funciona la invención, se proporciona una discusión de los posibles mecanismos de acción de las heparinas y heparinoides descritos. Así, se garantiza una breve descripción de las razones potenciales para las diferencias en efectos en la anticoagulación e inhibición de selectina (véase figura 6 para detalles) . Las razones más probables se deben a la naturaleza de doble sitio extendida del dominio de lectina de P-selectina, y a la avidez multivalente de la unión de selectina-ligando que implica superficies celulares. Esto permanece en contraste con la unión heparina-antitrombina, la cual incluye sólo un sitio de unión pentasacárid con un requerimiento especifico para la estructura precisa encontrada en FOND, la cual también se encuentra dispersa a lo largo de la longitud de las cadenas de heparina más largas. Estos conceptos son modelados en la figura 6 y explicados en la leyenda de la figura. Otra posible explicación (no mutuamente excluyente) está en el hecho de que ya que un polisacárido aniónico incrementa en longitud, muchos cambios ocurren potencialmente en medio de la cadena, incluyendo cambios en conformación y carga. Así, cadenas de heparina extendidas pueden tener características internas novedosas que se prefieran por P/L-selectina. Diseñar nuevos tipos de heparina para reducir a la actividad anticoagulante pero conservar otras actividades previamente ha sido descrito; sin embargo, estas nuevas heparinas modificadas requerirán de pruebas preclínicas y clínicas en fase I-III completas antes de que puedan ser eventualmente aprobadas para su uso en humanos. La presente descripción demuestra que no se requiere de alguna modificación especial, y que una preparación efectiva podría aislarse de un subconjunto de fragmentos en las formas de heparina actualmente aprobadas por la FDA. Aunque este trabajo se refiere a la importancia de la inhibición de P/L-selectina por heparina en la reducción de metástasis, los descubrimientos también son de significado para el tratamiento de muchas otras enfermedades humanas en las cuales ha mostrado ser importante la P/L-selectina. -Estas incluyen enfermedades inflamatorias tales como dermatitis alérgica, asma, aterosclerosis y enfermedad inflamatoria del intestino; enfermedades en las cuales la lesión de isquemia-reperfusión juega un papel crítico, tales como transplantes de órgano, disfunción de miocardio después de angioplastia de arterias coronarias bloqueadas, etc. (Bevilacqua et al . , Annu Rev Med (1994) 45:361-78; Lowe et al . , J Clin Invest (1997) 99:822-6; y Ley K. , Trends Mol Med (2003) 9:263-8); y otras, tales como enfermedad de células falciforme (Matsui et al . , Blood (2002) 100:3790-6).

Ejemplo 2 Líneas de células: Células MC38GFP, células de carcinoma de colon de ratón transfectadas establemente con proteína de fluorescencia verde mejorada (GFP) , fueron cultivadas y preparadas para inyección. Ratones: Los ratones C57BL/6J (WT) fueron de The Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine) o de crianza en casa de estos ratones. Todos los ratones comprados fueron aclimatados en el vivario durante un mínimo de una semana después de la llegada, antes de empezar los experimentos. Los ratones deficientes tanto en P- como en L-selectina (PL-/-) y singeneicos para el antecedente C57BL/6J se conocen en la técnica. A todos los ratones se les dio alimento estándar y agua ad libi tum, y se les mantuvo en un ciclo de luz/oscuridad de doce horas. Los experimentos se llevaron a cabo en vivarios acreditados por AAALAC. Para mantenerse con las recomendaciones de la IACUC, los estudios de "supervivencia" no usaron muerte como un punto final, sino que en lugar de ello usaron eutanasia cuando los ratones alcanzaron un estado obviamente moribundo (casi inmóviles, encorvados, respiración rápida y sin buscar agua o alimento) . Ensayo de metástasis experimental de carcinoma: Los ratones fueron inyectados subcutáneamente con 100 uL de PBS o heparina (ya sea 100U o 19.68U) en 100 uL de PBS. Las inyecciones de heparina o PBS se llevaron a cabo a t=-0.5h, +6h, y +12h en relación con la inyección de células tumorales. Las células MC38GFP fueron inyectadas intravenosamente en la vena de la cola lateral a t=0. El peso de los ratones y los ratones WT fueron sometidos a eutanasia cuando parecían moribundos. Todos los ratones que sobrevivieron fueron sometidos a eutanasia 50 ó 55 días después de la inyección. Para evaluar la metástasis, los focos visibles en pulmones extirpados fueron enumerados y/o la fluorescencia GFP de los homogenados pulmonares fue cuantificada. La deficiencia combinada de P- y L-selectina extiende marcadamente la supervivencia de ratones a los que se les inyectó intravenosamente células tumorales. Una formación reducida de focos metastásicos en ratones PL-/- ha sido demostrada en estudios de metástasis experimental. Sin embargo, estos estudios fueron concluidos en el punto de tiempo cuando el primer ratón de control WT pareció moribundo. Así, la capacidad de la deficiencia de P- y L-selectina para mejorar la supervivencia nunca ha sido evaluada. Los ratones WT y PL-/- a los que se les inyectó intravenosamente células de carcinoma de colon de ratón singeneicas fueron llevados a cabo y los ratones fueron monitoreados durante un periodo de tiempo más largo, sometiendo a eutanasia a animales individuales sólo cuando parecían moribundos, con la necropsia típica encontrando que estaban casi en completo desplazamiento de la parénquima pulmonar por masas confluentes de células tumorales. Los primeros ratones WT fueron sometidos a eutanasia el día 33 después de la inyección de células tumorales (figura 8). Aunque el número de ratones WT sobrevivientes continuó reduciéndose con el tiempo, ningún ratón PL-/- se observó que estuviera moribundo al concluir el estudio el día 55 después de la inyección de células tumorales (figura 8) . Sin embargo más de la mitad de los ratones PL-/-sí tuvo metástasis pulmonar visible en el día 55. Así, aunque la supervivencia incrementada con deficiencia en P- y L-selectina fue dramática, no hubiera sido absoluta, si el experimento se hubiera llevado a cabo durante más tiempo. El hecho de que los ratones PL-/- de larga vida desarrollaran aún ciertas lesiones metastásicas proporcionó la capacidad para determinar si la heparina pudiera tener cualquier efecto adicional en estos animales. La heparina a alta dosis reduce más la metástasis en ratones deficientes en P- y L-selectina. Estudios anteriores demostraron que P-selectina es probable que juegue un papel en metástasis en varios puntos de tiempo tempranos en la cascada metastásica hematógena, tal vez al facilitar la agregación plaquetaria alrededor de células tumorales. Con base en estudios con un anticuerpo de bloqueo de funciones, L-selectina también parece estar jugando un papel relativamente temprano, en puntos de tiempo un poco posteriores, a de ~6-18 horas después de la inyección de células tumorales. La inyección de 100U de heparina ya sea a 0.5 h antes de la inyección de células tumorales o 6h y 12h después de la inyección de células tumorales redujo marcadamente la formación de focos metastásicos en ratones WT. Se cree que el mecanismo de acción de heparina en estos estudios se debió principalmente a su capacidad para inhibir P- y L-selectina. Para cumplir esta hipótesis, los ratones PL-/- se inyectaron con PBS o 100U de heparina en los mismos puntos de tiempo -0.5h, +6h y +12h en relación con la inyección de células de carcinoma de colon de ratón transfectadas con GFP. Estos ratones se mantuvieron bajo prueba durante 50 días, permitiendo focos metastásicos significativos que se formara al menos en algunos animales. Cuando la fluorescencia GFP de los homogenados de pulmón se cuantificó como una medida de la formación de focos metastásicos, se observó una reducción significativa en los ratones PL-/- que recibieron las tres inyecciones de heparina, en comparación con aquellos que recibieron inyecciones de control de PBS (figura 9) . Así, estas inyecciones de heparina de alta dosis tienen ciertos efectos adicionales para disminuir metástasis, los cuales son independientes de la actividad inhibidora de selectina. Como se describió anteriormente, la heparina tiene muchos otros efectos anti-metastásicos potenciales, incluyendo anticoagulación. Algunos estudios experimentales han demostrado que la anticoagulación usando el agente antitrombina hirudina puede reducir metástasis. En uno de estos estudios, 20 mg/kg de hirudina se dieron a ratones inmediatamente antes, cuatro horas después, y después en días salteados después de la inyección intravenosa de células tumorales, durante 10 días. Se observó una reducción significativa en la reducción de focos metastásicos. Otro grupo inyectado a ratones con hirudina a 10 mg/kg 20 minutos antes de la inyección de células tumorales. De nuevo, una detención pulmonar reducida de células tumorales con el tratamiento con hirudina fue demostrada. Sin embargo, cuando la anticoagulación por hirudina se midió en el momento de la inyección de células tumorales, los resultados fueron casi todos por arriba de los límites de detección (tiempo de coagulación >300 segundos en una prueba de tiempo de tromboplastina parcial activada) . Ya que esta dosis fue casi la mitad de aquella dada en el primer estudio mencionado, ambos conjuntos de resultados es muy probable que no sean clínicamente relevantes, dada la excesiva anticoagulación lograda a las dosis dadas. La heparina no fraccionada se comparó con el pentasacárido sintético Fondaparinux, el cual no tiene actividad inhibidora de selectina. Cuando se dio a niveles clínicamente tolerables similares de anticoagulación, el pentasacárido no tuvo algún efecto en metástasis hematógena. La dosis de 100U de heparina que se usa convencionalmente en los estudios con ratón logran niveles de anticoagulación que también son inaceptables en uso clínico. Las dosis clínicamente tolerables de heparina no tienen efecto significativo en la metástasis independiente de la inhibición de P- y L-selectina. El estudio examinó heparina no fraccionada dada a niveles clínicamente tolerables y si la UFH tenía algún efecto aditivo en limitar metástasis, más allá de la inhibición de P- y L-selectina. Así, un experimento similar, en el cual se dio heparina en los mismos tres puntos de tiempo, para inhibir la P-selectina y L-selectina fue llevado a cabo. A diferencia de la heparina en alta dosis dada en el experimento previo (figura 9), una dosis clínicamente relevante de heparina fue usada. Como se observa al evaluar el número de focos metastásicos visibles (figura 10A) o al cuantificar la fluorescencia en el homogenado de pulmón (figura 10B) , no hay un efecto significativo de las inyecciones de heparina clínicamente relevantes en la metástasis en el escenario de deficiencia de P- y L-selectina (mientras que existe una tendencia hacia una leve mejora con heparina, esto no es estadísticamente significativo, por ninguna medida) . Esta dosis de heparina ha demostrado previamente tener un efecto dramático en la formación de focos metastásicos en ratones WT. Ya que no se observó algún efecto adicional en ratones deficientes tanto en P- como en L-selectina, se concluyó que las dosis clínicamente relevantes de heparina atenúan metástasis principalmente por medio de la inhibición de P- y L-selectina. Por supuesto siempre hay una posibilidad de que la heparina también inhiba uno o más mecanismos adicionales que estén dentro de la misma guía lineal que las contribuciones de selectina a metástasis. Sin embargo, en el modelo de metástasis experimental, en el cual células tumorales se administran directamente a la vasculatura e inmediatamente interactúan con células hemáticas, las selectinas es probable que estén implicadas en algunas de las etapas más tempranas de cascada metastásica. Así, inhibir estas etapas tempranas en una cascada harían a otros efectos descendentes de la heparina prácticamente relevantes. Además, ya que las dosis de heparina administradas en este experimento son eliminadas a las pocas horas, muchos de los efectos adicionales de heparina (por ejemplo, inhibición de heparanasa y angiogénesis) probablemente no sean relevantes durante el marco de tiempo estudiado. Permanece posible que la unión de heparina a quimiocinas también podría ser un factor relevante durante este periodo de tiempo. Se ha descrito un número de modalidades de la invención. No obstante, se entenderá que varias modificaciones pueden hacerse sin alejarse del espíritu y alcance de la invención. En consecuencia, otras modalidades están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para tamizar una composición inhibición de la actividad selectina, caracterizado porque comprende: a) proporcionar: i) una preparación de heparina que comprende una pluralidad de moléculas de heparina, en donde la preparación se obtiene a partir de un tipo y lote de heparina aprobados por la FDA; ii) una o más selectinas seleccionadas del grupo que consiste en L-selectina y P-selectina; iii) un ligando para una o más de las selectinas y heparinas seleccionado del grupo que consiste en L-selectina y P-selectina y b) poner en contacto a) i) con a)ii) y a) iii), simultánea o consecutivamente, bajo condiciones adecuadas para la unión de selectina a un ligando de selectina y c) detectar un nivel reducido de unión de la una o más selectinas a un ligando en presencia de la preparación de heparina en comparación con la ausencia de la preparación de heparina, en donde una reducción en unión es indicadora de una composición para la inhibición de la actividad selectina.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el nivel reducido de unión se detecta usando una concentración de la preparación de heparina que es más baja que la concentración de heparina que produce una o más actividades seleccionadas del grupo que consiste en actividad anticoagulante in vivo y sangrado indeseable in vivo.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la concentración de la preparación de heparina es más baja que la concentración de heparina que produce una actividad seleccionada del grupo que consiste en inhibición de angiogénesis, inhibición de heparanasa y unión a citocinas .
4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la concentración de la preparación de heparina no reduce el nivel de unión de E-selectina a un ligando de E-selectina.
5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la concentración de heparina que produce el nivel reducido de unión de la una o más selectinas al ligando es de dos a 50 veces más baja que la concentración de heparina que produce actividad anticoagulante ín vivo excesiva o peligrosa.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ligando es PSGL-1.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ligando es sialilo-Lewisx (SLex) .
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ligando es inmovilizado.
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ligando está presente en una célula.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la célula es una célula endotelial.
11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la célula es una célula HL-60.
12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además identificar la preparación de heparina como terapéutico para patologías relacionadas con L-selectina.
13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además identificar la preparación de heparina como terapéutico para patologías relacionadas con P-selectina.
14. Un método para tamizar una composición inhibición de la actividad selectina, caracterizado porque comprende : a) proporcionar: i) una preparación de heparina que comprende una pluralidad de moléculas de heparina, en donde la preparación se obtiene a partir de un lote de heparina aprobado por la FDA; ii) una o más selectinas seleccionadas del grupo que consiste en L-selectina y P-selectina; iii) un ligando para una o más selectinas seleccionadas del grupo que consiste en L-selectina y P-selectina, y iv) heparina; b) fraccionar la preparación de heparina de a) i) y aislar una pluralidad de fracciones que comprendan moléculas de heparina, en donde las fracciones se aislan con base en el tamaño de las moléculas de heparina en la fracción; c) poner en contacto cada fracción de b) con a)ii) y a) iii), simultáneamente o consecutivamente, bajo condiciones adecuadas para la unión de selectina a un ligando de selectina e d) identificar las fracciones que reduzcan el nivel de unión de la una o más selectinas al ligando en presencia de la fracción en comparación con la ausencia de la fracción.
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el ligando es PSGL-1.
16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el ligando es sialilo-Lewisx (SLex) .
17. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el ligando es inmovilizado.
18. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el ligando está presente en una célula.
19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la célula es una célula endotelial.
20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la célula es una célula HL-60.
21. Una fracción de heparina caracterizada porque es identificada por el método de conformidad con la reivindicación 14.
22. La fracción de heparina de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la heparina comprende polisacáridos de heparina de entre aproximadamente 8,000 y 40,000 Daltons.
23. La fracción de heparina de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la heparina comprende polisacáridos de heparina con corte beta-eliminador con heparinasa y un peso molecular de al menos 8,000 Daltons.
24. La fracción de heparina de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque es la fracción de tinzaparina de alto peso molecular.
25. Un artículo de manufactura caracterizado porque comprende material de empaque y, contenida dentro del material de empaque, una preparación de heparina identificada por el método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el material de empaque comprende una etiqueta o inserto de empaque que indica que la preparación de heparina inhibe la actividad de una selectina y puede usarse para inhibir metástasis hematógenas en un sujeto. La misma etiqueta proporciona también información acerca del nivel de actividad anticoagulante en relación con la actividad inhibidora de selectina. Esto permite al médico administrar una dosis que proporcione suficiente actividad de bloqueo de P- y L-selectina in vivo sin causar una excesiva anticoagulación que pudiera poner al paciente en riesgo de sangrado.
26. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la preparación de heparina es una preparación de heparina de peso molecular intermedio que comprende heparina que tiene un peso molecular de más de 8,000 daltons.
27. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la preparación de heparina es Tinzaparina.
28. Un artículo de manufactura caracterizado porque comprende material de empaque y, contenida dentro del material de empaque, una fracción de heparina identificada por el método de conformidad con la reivindicación 14, en donde el material de empaque comprende una etiqueta o inserto de empaque que indica que la fracción de heparina inhibe la actividad de una selectina y puede usarse para inhibir metástasis hematógenas o cualquier otra patología mediada por P- y L-selectina en un sujeto.
29. El artículo de manufactura de conformidad con las reivindicaciones 24 ó 28, caracterizado porque la selectina se selecciona del grupo que consiste en P-selectina y L-selectina.
30. Un método para prevenir o tratar un trastorno de proliferación celular en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un inhibidor específico de actividad selectina que comprende una heparina de peso intermedio, en un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el inhibidor es una preparación de heparina o una fracción de heparina.
31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la heparina de peso intermedio comprende polisacáridos de heparina de entre alrededor de 8,000 y 40,000 Daltons.
32. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la preparación de heparina de peso intermedio comprende polisacáridos de heparina con corte beta-eliminador con heparinasa y un peso molecular de al menos 8,000 Daltons.
33. Un método para prevenir o tratar un trastorno de proliferación celular en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de la preparación de heparina de conformidad con la reivindicación 21 en un portador farmacéuticamente aceptable.
34. Un método para prevenir o inhibir metástasis o cualquier otra patología mediada por P- y/o L-selectina en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un inhibidor específico de la actividad selectina, en un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el inhibidor es una preparación de heparina o una fracción de heparina que comprende heparina de peso intermedio.