RU2451515C2 - Композиции гепарина низкой молекулярной массы и их применение - Google Patents
Композиции гепарина низкой молекулярной массы и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2451515C2 RU2451515C2 RU2008151420/15A RU2008151420A RU2451515C2 RU 2451515 C2 RU2451515 C2 RU 2451515C2 RU 2008151420/15 A RU2008151420/15 A RU 2008151420/15A RU 2008151420 A RU2008151420 A RU 2008151420A RU 2451515 C2 RU2451515 C2 RU 2451515C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lmwh
- activity
- composition
- reh
- composition according
- Prior art date
Links
- 0 *[C@](C1O)OC(*#C)=CC1O Chemical compound *[C@](C1O)OC(*#C)=CC1O 0.000 description 3
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к композициям гепаринов низкой молекулярной массы (LMWH). Композиции гепаринов характеризуются средневесовой молекулярной массой от 5500 до 8500 Да, анти-Xa активностью от 170 до 330 МЕ/мг, анти-IIa активностью от 130 до 190 МЕ/мг, соотношением активностей анти-Xa/анти-IIa от 2:1 до 1:1 в течение 30-120 минут после введения пациенту. С помощью данных композиций достигаются лечение и профилактика тромботических заболеваний. Композиции гепаринов обладают улучшенными свойствами, в частности, обеспечивающими клиническое преимущество: обратимостью действия в ответ на протаминсульфат, улучшенной анти-IIa активностью, относительно постоянным соотношением активностей анти-Xa/анти-IIa на протяжении определенного промежутка времени, отслеживаемым уровнем активности, биологической доступностью при подкожном введении, уменьшенной вероятностью развития индуцированной гепарином тромбоцитопении (HIT). 5 н. и 23 з.п. ф-лы, 17 ил., 20 табл., 13 пр.
Description
Эта заявка претендует на приоритет предварительных патентных заявок США №№ 60/809136, поданной 25 мая 2006 г., 60/849578, поданной 4 октября 2006 г., и 60/849628, поданной 5 октября 2006 г., содержание которых включено сюда в виде ссылки.
Уровень техники
Коагуляция представляет собой физиологический путь метаболизма, связанный с поддержанием нормального гемостаза у млекопитающих. В тех ситуациях, когда происходит повреждение кровеносных сосудов, метаболический путь коагуляции стимулируется и приводит к формированию сгустка крови, что предотвращает кровопотерю. Немедленно после сосудистого повреждения тромбоциты начинают скапливаться на участке такого повреждения, образуя физическую пробку, приостанавливающую утечку крови. В дополнение к этому, поврежденный сосуд сужается, что ограничивает кровотечение в участке повреждения, а в это время фибрин начинает образовывать скопления, формируя нерастворимую сетчатую структуру, покрывающую разорванный участок сосудистой сети.
Когда в метаболическом пути коагуляции нарушается равновесие, то есть происходит сдвиг в сторону избыточной коагуляции, это приводит к развитию тромботических тенденций, типичными проявлениями которых можно считать сердечные приступы, апоплексические удары, тромбоз глубоких вен и острые коронарные синдромы, такие как инфаркт миокарда и нестабильная стенокардия. Кроме того, от тромба может оторваться его фрагмент (эмбол), который, попав в легкие или головной мозг, способен вызвать эмболию, включая инсульт или кратковременный приступ ишемии. Современные способы терапевтического лечения заболеваний, связанных с дисбалансом в метаболическом пути коагуляции, сопряжены со многими рисками, то есть нуждаются в тщательном контроле.
Гепарин и гепарины низкой молекулярной массы (LMWH), сложные, сульфатированные полисахариды, выделенные из эндогенных источников, являются мощными модуляторами гемостаза. Гепарин, а также высокосульфатированный гепариноподобный гликозаминогликан (HLGAG), вырабатываемый тучными клетками, представляет собой широко используемый в клинической практике антикоагулянт, одно из первых биополимерных лекарств и одно из немногих углеводных лекарств. Гепарин и полученные из него производные молекулы представляют собой мощные антикоагулянты, которые используются в разных клинических ситуациях, особенно при тромбоэмболических заболеваниях, включая профилактику и лечение тромбоза глубоких вен, эмболию сосудов легких, артериальные тромбозы и острые коронарные синдромы, в частности инфаркт миокарда и нестабильную стенокардию. Гепарин и LMWH взаимодействуют со многими компонентами каскада коагуляции, подавляя процесс свертывания крови. Эффект гепарина реализуется, прежде всего, через два механизма, причем оба этих механизма включают связывание антитромбина III (AT-III) со специфической пентасахаридной последовательностью, HNAс/S,6SGHNS,3S,6SI2SHNS,6S, содержащейся внутри полимера. Во-первых, связывание AT-III с пентасахаридом индуцирует конформационное изменение в белке, которое опосредует подавление этим белком фактора Xa. Во-вторых, тромбин (фактор IIa) также связывается с гепарином на участке, прилегающем к сайту связывания пентасахарида с AT-III. Образование тройного комплекса между AT-III, тромбином и гепарином приводит к инактивации тромбина. В отличие от анти-Xa активности гепарина, для реализации которой требуется только сайт связывания AT-III с пентасахаридом, его анти-IIa активность, в дополнение к блоку пентасахарида, ответственному за анти-Xa активность, зависит от размера, обеспечивающего эффективное образование тройного комплекса из AT-III, тромбина и гепарина. Гепарин также опосредует высвобождение ингибитора метаболического пути тканевого фактора (TFPI) из эндотелиальных клеток. TFPI, кофактор гепарина, представляет собой сериновую протеазу, непосредственно связывающуюся с фактором X и ингибирующую его. TFPI, особенно при совместном введении с гепарином, действует как мощный антитромботик.
Хотя гепарин высокоэффективен и имеет широкий потенциал применения в самых разных клинических ситуациях, следует отметить многочисленные и разнообразные побочные эффекты, связанные с гепаринотерапией. Основное клиническое применение нефракционированного гепарина (UFH) более 65 лет заключалось в антикоагуляции. Учитывая такие факторы, как нестабильность внутривенной фармакокинетики и утрата биологической доступности гепарина при подкожном введении, UFH предпочитали вводить посредством внутривенных инъекций. В дополнение к этому, применение UFH в качестве антикоагулянта затрудняли многочисленные побочные эффекты, обусловленные неспецифическим связыванием UFH с белками плазмы.
Это привело к взрыву активности в разработке и применении гепарина низкой молекулярной массы (LMWH) в качестве эффективной альтернативы UFH. LMWH обеспечивает более предсказуемое фармакологическое действие, дает меньше побочных эффектов и обладает лучшей биологической доступностью по сравнению с UFH. Поскольку имеющиеся в продаже препараты LMWH не полностью нейтрализуются протамином, непредсказуемая реакция может сопровождаться крайне тяжелыми побочными эффектами; например, анти-Xa активность эноксапарина и других LMWH нейтрализуется приблизительно лишь на 40% дозами ≤2 мг протамина на 100 МЕ анти-Xa LMWH. Анти-IIa активность нейтрализуется приблизительно лишь на 60% дозами ≤2 мг протамина на 100 МЕ анти-Xa LMWH. (С другой стороны, анти-Xa и анти-IIa активность UFH нейтрализуется почти полностью (>90%) дозами ≤2 мг протаминсульфата на 100 МЕ анти-Xa UFH).
Фармацевтические препараты этих полисахаридов, которые обычно выделяют из слизистой оболочки кишечника свиней, разнородны по длине и составу. По существу антикоагулянтной активностью обладает лишь часть типичного препарата. В лучшем случае бóльшая часть полисахаридных цепей в фармацевтическом препарате гепарина или LMWH неактивна, а в худшем случае эти цепи неспецифически взаимодействуют с белками плазмы, вызывая побочные эффекты, связанные с гепаринотерапией. Таким образом, важно разработать новые LMWH, которые сохраняют антикоагулянтную активность и другие желательные виды активности UFH, но обладают менее выраженными побочными эффектами. LMWH, главным образом, из-за ограниченного размера их цепей и дисперсности, обладают намного меньшей способностью неспецифически связываться с белками плазмы. Однако все LMWH, доступные в настоящее время для клинического применения, также обладают сниженной анти-IIa активностью по сравнению с UFH. В связи с меньшей активностью LMWH требуется увеличивать их дозы (по сравнению с UFH) для достижения сходной анти-Xa и анти-IIa активности, причем стандартные анализы на активность UFH, на активированное частичное тромбопластиновое время (aPTT) или на активированное время свертывания крови (ACT), оказываются бесполезными, поскольку они при считывании данных основаны, прежде всего, на анти-IIa активности. Наиболее широко применяемым тестом для мониторинга уровня LMWH является тест на анти-Xa активность, который зависит от того, имеет ли обследуемый субъект достаточный уровень антитромбина III (ATIII), что бывает далеко не всегда. Этот анализ довольно дорог (значительно дороже 100 USD), а также не относится к общепринятым и широкодоступным, поскольку образцы обычно приходится посылать для анализа в специальную лабораторию. Вследствие этого применение LMWH до сих пор было в значительной степени ограничено профилактикой тромбоза, но не его лечением, кроме того, категории пациентов, которым можно вводить такие препараты, также были ограничены, исключая, среди всего прочего, детей, пациентов с нарушенной функцией почек, определяемой по таким критериям, как RFI, мочевина, креатинин, фосфор, скорость клубочковой фильтрации (GFR) или BUN (азот мочевины в крови) при исследовании крови и мочи пациентов, и контингент пациентов инвазивной (катетеризационной) кардиологии.
Сущность изобретения
Изобретение отчасти основано на разработке препаратов LMWH, имеющих и/или сконструированных с тем расчетом, чтобы иметь улучшенные свойства, например, такие свойства, которые обеспечивают клинические преимущества. Такие функциональные свойства включают, в качестве примера, одно из следующих свойств: обратимость действия в ответ на протаминсульфат, предсказуемая или иным образом улучшенная фармакокинетика, улучшенная анти-IIa активность по сравнению, например, с эноксапарином, относительно постоянное соотношение активностей анти-Xa/анти-IIa на протяжении периода приблизительно от 30 до 180 минут, отслеживаемый уровень активности, биологическая доступность при подкожном введении, а также уменьшенная вероятность развития индуцированной гепарином тромбоцитопении (HIT). Раскрытые здесь LMWH также могут обладать структурными характеристиками, которые отличают их от других поступающих в продажу LMWH. Например, предлагаемый этим изобретением препарат LMWH может обладать одним и более из следующих свойств: по существу отсутствующая область связывания, повышенное количество 3-O сульфатов по сравнению с коммерчески доступными препаратами LMWH, подгруппа цепей с несульфатированной ΔU на нередуцирующем конце, подгруппа цепей, например большинство или почти все цепи, с N-ацетилированным гексозамином на редуцирующем конце, соотношение между ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S и ΔU2SHNS,6SIHNAс,6SGHNS,3S,6S приблизительно от 1:1 до 4:1 (например, приблизительно 1:1, 2:1, 3:1, 4:1), а также в основном не модифицированные структуры на редуцирующем конце. Изобретение включает препараты LMWH, обладающие одним или более из указанных свойств и характеристик, а также способы получения и применения таких препаратов. Изобретение также включает способы анализа исходных материалов, технологического процесса, промежуточных и конечных продуктов при получении таких препаратов LMWH.
В соответствии с этим, в первом аспекте изобретение относится к композиции LMWH, имеющей следующие свойства:
средневесовая молекулярная масса приблизительно от 5000 до 9000 Да, например, приблизительно от 5000 до 8300 Да, приблизительно от 5500 до 8000 Да, приблизительно от 5700 до 7900 Да, приблизительно от 5800 до 6800 Да, а также анти-IIa активность приблизительно от 50 до 300 МЕ/мг, например, приблизительно от 70 до 280 МЕ/мг, приблизительно от 90 до 250 МЕ/мг, приблизительно от 100 до 250 МЕ/мг, приблизительно от 100 до 140 МЕ/мг, приблизительно от 150 до 200 МЕ/мг, приблизительно от 130 до 190 МЕ/мг или приблизительно от 155 до 195 МЕ/мг.
Во втором аспекте изобретение относится к композиции LMWH, имеющей следующие свойства:
средневесовая молекулярная масса приблизительно от 5000 до 9000 Да, например, приблизительно от 5000 до 8300 Да, приблизительно от 5000 до 8000 Да, приблизительно от 5500 до 8000 Да, приблизительно от 5700 до 7900 Да, приблизительно от 5800 до 6800 Да, а также анти-IIa активность, которая нейтрализуется протамином по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% при измерении по активированному времени свертывания крови (ACT) или активированному частичному тромбопластиновому времени (aPTT). В предпочтительном варианте анти-IIa активность LMWH нейтрализуется по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% в течение 5, 10, 15, 30 минут после введения протамина.
В третьем аспекте изобретение относится к композиции LMWH, имеющей следующие свойства:
средневесовая молекулярная масса приблизительно от 5000 до 9000 Да, например, приблизительно от 5000 до 8300 Да, приблизительно от 5500 до 8000 Да, приблизительно от 5700 до 7900 Да, приблизительно от 5800 до 6800 Да, и
ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S от 5 до 15%, например, от 7 до 14%, от 9 до 12% композиции при измерении в мол.%. В предпочтительном варианте ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S на нередуцирующем конце молекулы составляет приблизительно от 5 до 15%, например, от 7 до 14%, от 9 до 12%, цепей в композиции при измерении в мол.%.
В четвертом аспекте изобретение относится к композиции LMWH, имеющей следующие свойства:
cредняя длина цепи приблизительно от 9 до 18 дисахаридов, или от 8 до 18 дисахаридов, например, приблизительно от 9 до 16 или от 8 до 16 дисахаридов, и
ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S от 5 до 15%, например, от 7 до 14%, от 9 до 12% композиции при измерении в мол.%. В предпочтительном варианте ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S на нередуцирующем конце молекулы составляет приблизительно от 5 до 15%, например, от 7 до 14%, от 9 до 12%, цепей в композиции при измерении в мол.%.
В пятом аспекте изобретение относится к композиции LMWH, имеющей следующие свойства:
cредневесовая молекулярная масса приблизительно от 5000 до 9000 Да, например, приблизительно от 5000 до 8300 Да, приблизительно от 5500 до 8000 Да, приблизительно от 5700 до 7900 Да, приблизительно от 5800 до 6800 Да, и
cоотношение анти-Xa и анти-IIa активностей 3:1 или менее, например, 2:1, 1,6:1, 1,5:1, 1,4:1, 1,3:1, 1,2:1, 1,1:1, 1:1 или 0,5:1.
В предпочтительном варианте соотношение анти-Xa и анти-IIa активностей остается относительно постоянным в течение всего курса введения препарата LMWH, например, отношение анти-Xa активности к анти-IIa активности варьируется в диапазоне не более чем приблизительно ±1,5, ± 1, ±0,5 или ±0,2, на протяжении отрезка времени приблизительно 30, 60, 120, 180, 240, 300 минут. Например, если начальное отношение анти-Xa активности к анти-IIa активности равно 2, то предпочтительно, чтобы при повторном измерении (например, через 30, 60, 120, 180, 240, 300 минут после начального введения препарата) оно составляло менее 3, предпочтительнее, приблизительно 2.
В седьмом аспекте изобретение относится к композиции LMWH, имеющей следующие свойства:
необязательно, средневесовая молекулярная масса приблизительно от 5000 до 9000 Да, например, приблизительно от 5000 до 8300 Да, приблизительно от 5500 до 8000 Да, приблизительно от 5700 до 7900 Да, приблизительно от 5800 до 6800 Да, и
при анализе, основанном на расщеплении гепариназой I, гепариназой II, гепариназой III с капиллярным электрофорезом, представлен каждый из пиков 1-14, указанных в таблице 10A.
В предпочтительном варианте реализации изобретения: при анализе с расщеплением гепариназой I, гепариназой II, гепариназой III с капиллярным электрофорезом количество каждого пика в композиции приблизительно соответствует данным, приведенным в таблице 10A, количество каждого пика не выходит за пределы диапазона, указанного в таблице 10A, количество пиков 10 и 11 не выходит за пределы диапазона, указанного в таблице 10A.
В восьмом аспекте изобретение относится к композиции LMWH, имеющей следующие свойства:
необязательно, средневесовая молекулярная масса приблизительно от 5000 до 9000 Да, например, приблизительно от 5000 до 8300 Да, приблизительно от 5500 до 8000 Да, приблизительно от 5700 до 7900 Да, приблизительно от 5800 до 6800 Да, а также
при анализе методом 2D ядерного магнитного резонанса (ЯМР) представлены протоны каждой из структур, указанных в таблице 11A.
В предпочтительном варианте реализации изобретения количество каждой из структур в композиции LMWH при анализе методом 2D ЯМР приблизительно соответствует указанному в таблице 11A.
В девятом аспекте изобретение относится к композиции LMWH, имеющей одно или более из следующих свойств:
композиция почти не имеет модифицированных структур на редуцирующем конце (например, свободна от таких цепей по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или более). По меньшей мере 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% цепей композиции имеют на редуцирующем конце HNAc. Менее чем 90%, 95%, 98%, 99% цепей композиции имеют на нередуцирующем конце сульфатированную ΔU (предпочтительно, чтобы ни одна из цепей не имела такого признака). В композиции, по существу, нет областей связывания (например, менее 0,1%). Композиция имеет больше цепей с 3-O сульфатами, чем поступающие в продажу LMWH, например, эноксапарин или далтепарин. Соотношение между ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S и ΔU2SHNS,6SIHNAc,6SGHNS,3S,6S в композиции составляет приблизительно от 1:1 до 4:1.
В одном из вариантов реализации изобретения композиция обладает двумя, тремя, четырьмя, пятью или всеми указанными свойствами.
В десятом аспекте изобретение относится к композиции LMWH, имеющей следующую структуру:
где R представляет собой H или SO3X,
R1 представляет собой SO3X или COCH3,
X представляет собой моновалентный или бивалентный катион,
n = 2-50, например, 2-40, и
предпочтительно, чтобы композиция имела среднее значение n 9-16, 8-16 или 8-15.
В одном из вариантов реализации изобретения композиция LMWH имеет следующую структуру:
где
R представляет собой H или SO3X,
R1 представляет собой SO3X or COCH3,
X представляет собой моновалентный или бивалентный катион,
n = 2-50, например, 2-40, и
предпочтительно, чтобы композиция имела среднее значение n 9-16, 8-16 или 8-15.
В одиннадцатом аспекте изобретение относится к композиции LMWH, имеющей следующую структуру:
где X представляет собой Na или Ca, R представляет собой H или SO3Na,
R1 представляет собой SO3Na или COCH3,
n = 2-45, например, 2-35, и
предпочтительно, чтобы композиция имела среднее значение n 7-11 или 8-12.
В одном из вариантов реализации изобретения композиция LMWH имеет следующую структуру:
где
X представляет собой Na или Ca, R представляет собой H или SO3Na,
R1 представляет собой SO3Na или COCH3,
n = 2-45, например, 2-35, и
предпочтительно, чтобы композиция имела среднее значение n 7-11 или 8-12.
Такая композиция может представлять собой промежуточный продукт для получения LMWH, например продукт ферментативного расщепления фракции с высокой подвижностью (как это обсуждается здесь).
В двенадцатом аспекте изобретение относится к композиции LMWH, имеющей следующую структуру:
где X представляет собой Na или Ca, R представляет собой H или SO3Na,
R1 представляет собой SO3Na или COCH3,
n = 2-50, например, 2-40, и
предпочтительно, чтобы композиция имела среднее значение n от 8 до 15, например, от 10 до 15, либо от 9 до 16, например, от 11 до 16.
В одном из вариантов реализации изобретения композиция LMWH имеет следующую структуру:
где X представляет собой Na или Ca, R представляет собой H или SO3Na,
R1 представляет собой SO3Na или COCH3,
n = 2-50, например, 2-40, и
предпочтительно, чтобы композиция имела среднее значение n от 8 до 15, например, от 10 до 15, либо от 9 до 16, например, от 11 до 16.
Такая композиция может представлять собой промежуточный продукт для получения LMWH, например продукт выпадения в осадок фракции с высокой подвижностью (как это обсуждается здесь).
Любые из описанных здесь LMWH, например, те, что были описаны выше, также могут обладать другими свойствами. Например, какая-либо из описанных выше композиций может дополнительно обладать одним и более функциональных или структурных свойств, которые будут изложены ниже.
Например, в одном из вариантов реализации изобретения композиция LMWH имеет анти-Xa активность приблизительно от 100 до 400 МЕ/мг, например, приблизительно от 120 до 380 МЕ/мг, от 150 до 350 МЕ/мг, от 170 до 330 МЕ/мг, от 180 до 300 МЕ/мг, от 150 до 200 МЕ/мг, от 200 до 300 МЕ/мг, от 130 до 220 МЕ/мг или от 225 до 274 МЕ/мг.
В одном из вариантов реализации изобретения композиция LMWH имеет анти-Xa активность, которая нейтрализуется по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, например, при измерении анти-Xa активности по ACT или aPTT. В предпочтительном варианте анти-Xa активность нейтрализуется по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% в течение 5, 10, 15 минут после введения протамина. Например, анти-Xa активность может быть нейтрализована по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% в течение 5, 10, 15, 30 минут после выведения протамина, если доза композиции LMWH составляла приблизительно 1, 2, 3 мг на 100 анти-Xa МЕ плазмы.
В другом варианте реализации изобретения композиция LMWH обладает одним или более из следующих свойств: активность композиции можно отслеживать по таким критериям, как aPTT и/или ACT. Полидисперсность композиции составляет менее 1,6, например, приблизительно от 1,6 до 1,1, от 1,5 до 1,1, от 1,4 до 1,1, от 1,3 до 1,1, от 1,2 до 1,1. Менее чем 70%, 60%, 50%, 45%, 40%, 35% или 30% цепей, представленных в композиции, имеют молекулярную массу более 7500 или 8000 Да. Менее чем 40%, 35%, 30%, 25% цепей, представленных в композиции, имеют молекулярную массу менее 5500 или 5000 Да. Композиция включает смесь структур ΔU и I/G на нередуцирующих концах цепей. Сайты связывания с PF4 имеют меньшее число цепей по сравнению с эноксапарином, далтепарином, UFH.
В одном из вариантов реализации изобретения приблизительно 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 45%, 50% цепей в композиции LMWH имеют ΔU на нередуцирующем конце. Предпочтительно, чтобы ΔU на нередуцирующем конце имели приблизительно от 15% до 50% цепей, например, от 15% до 35% или от 20% до 35% цепей.
В одном из вариантов реализации изобретения композиция LMWH имеет более высокую степень сульфатирования по сравнению с эноксапарином и далтепарином. В одном из вариантов реализации изобретения композиция LMWH имеет в своем составе больше трисульфатированных дисахаридов по сравнению с эноксапарином или далтепарином, например, композиция LMWH имеет приблизительно от 50 до 65%, от 55 до 60%, от 55 до 58%, от 57 до 60% трисульфатированных дисахаридов при определении по мол.%.
В одном из вариантов реализации изобретения композиция включает более высокий уровень ΔUHNAс,6SGHNS,3S,6S по сравнению с эноксапарином, далтепарином и/или UFH, например, включает приблизительно от 5 до 15 мол.%, от 7 до 14 мол.%, от 9 до 12 мол.%.
В одном из вариантов реализации изобретения композиция LMWH имеет содержание кальция менее 3%, 2,5%, 2%, 1,5%, 1,0% и/или содержание натрия менее 30%, 25%, 20%, 15%, 10%. В одном из вариантов реализации изобретения композиция LMWH включает менее 1000 нг/мг, 750 нг/мг, 500 нг/мг, 250 нг/мг фермента гепариназы, например, описанного здесь фермента гепариназы, менее 1,0%, 0,5%, 0,3% метанола (масс./масс.), менее 1,0%, 0,5%, 0,3%, 0,1% этанола (масс./масс.), менее 2,0%, 1,75%, 1,25%, 1,0%, 0,5%, 0,3%, 0,15% хлорида, менее 15%, 10%, 5%, 2,5% воды по массе, менее 2000, 1500, 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300 м.д. свободного сульфата.
В одном из вариантов реализации изобретения композиция LMWH обеспечивает усиленное высвобождение TFPI по сравнению с эноксапарином. В одном из вариантов реализации изобретения композиция LMWH обеспечивает высвобождение TFPI, увеличенное по меньшей мере в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 раз по сравнению с эноксапарином.
В одном из вариантов реализации изобретения композиция LMWH имеет период полувыведения после внутривенной инъекции приблизительно от 30 минут до 3 часов, например, приблизительно от 1 до 2 часов. В одном из вариантов реализации изобретения композиция LMWH имеет период полувыведения после подкожной инъекции приблизительно от 30 минут до 3,5 часов, например, приблизительно от 1,5 до 2,5 часов или приблизительно 2 часа.
В одном из вариантов реализации изобретения в его первом, втором, третьем, четвертом, пятом, шестом, седьмом, восьмом, девятом и/или десятом аспекте композиция LMWH обладает одним или более из следующих свойств:
композиция почти не имеет модифицированных структур на редуцирующем конце (например, свободна от таких цепей по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или более). По меньшей мере, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% цепей композиции имеют на редуцирующем конце HNAc. Менее чем 90%, 95%, 98%, 99% цепей композиции имеют на нередуцирующем конце сульфатирование ΔU (предпочтительно, чтобы ни одна из цепей не имела такого признака). В композиции, по существу, нет областей связывания (например, менее 0,1%). Композиция имеет больше цепей с 3-O сульфатами, чем поступающие в продажу LMWH, например эноксапарин или далтепарин. Соотношение между ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S и ΔU2SHNS,6SIHNAc,6SGHNS,3S,6S в композиции составляет приблизительно от 1:1 до 4:1 (например, 1:1, 2:1, 3:1 или 4:1). В одном из вариантов реализации изобретения композиция обладает двумя, тремя, четырьмя, пятью или всеми указанными свойствами.
Еще в одном аспекте изобретение относится к композиции LMWH, обладающей следующими свойствами:
средневесовая молекулярная масса приблизительно от 5000 до 9000 Да,
анти-IIa активность приблизительно от 50 до 300 МЕ/мг,
анти-IIa активность, которая по меньшей мере на 50% нейтрализуется протамином, например, при измерении по ACT или aPTT,
ΔUHNAс,6SGHNS,3S,6S составляет от 5 до 15% композиции, предпочтительно, если ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S не только составляет приблизительно от 5 до 15% композиции, но и находится на нередуцирующем конце молекулы,
средняя длина цепи составляет приблизительно от 9 до 16 дисахаридов,
соотношение активностей анти-Xa и анти-IIa составляет 3:1 или менее,
соотношение активностей анти-Xa и анти-IIa остается относительно постоянным в течение всего курса введения препарата LMWH, например, отношение анти-Xa активности к анти-IIa активности варьируется в диапазоне не более чем приблизительно ±1,5, ±1, ±0,5 или ±0,2, на протяжении отрезка времени приблизительно 30, 60, 120, 180, 240, 300 минут. Например, если начальное отношение анти-Xa активности к анти-IIa активности равно 2, то предпочтительно, чтобы при повторном измерении (например, через 30, 60, 120, 180, 240, 300 минут после начального введения препарата) оно составляло менее 3, предпочтительнее, приблизительно 2.
В предпочтительном варианте реализации изобретения композиция LMWH имеет следующую структуру:
где
R представляет собой H или SO3Na,
R1 представляет собой SO3Na или COCH3,
n = 2-50, например, 2-40, и
предпочтительно, чтобы композиция имела среднее значение n от 9 до 16 или от 8 до 15.
В предпочтительном варианте реализации изобретения композиция LMWH обладает следующими свойствами:
анти-Xa активность приблизительно от 100 до 400 МЕ/мг,
анти-Xa активность, которая нейтрализуется по меньшей мере на 50%, например, при измерении по ACT или aPTT,
полидисперсность составляет менее 1,6,
менее 70%, 60%, 50% цепей, представленных в композиции, имеют молекулярную массу более 7500 Да,
менее 40% цепей, представленных в композиции, имеют молекулярную массу менее 5000 Да,
композиция включает смесь структур ΔU и I/G на нередуцирующих концах цепей,
композиция, по существу, не имеет модифицированных структур на редуцирующих концах,
по сравнению с эноксапарином, далтепарином или UFH меньшее число цепей в композиции имеют сайты связывания с PF4,
по меньшей мере, 60%, 70%, 80%, 90% цепей в композиции имеют HNAc на редуцирующем конце,
приблизительно от 15% до 35% цепей в композиции имеют ΔU на нередуцирующем конце,
менее чем 90%, 95%, 98%, 99% цепей в композиции имеют на нередуцирующем конце сульфатированной ΔU (предпочтительно, чтобы ни одна из цепей не имела такого признака).
В предпочтительном варианте реализации изобретения композиция LMWH обладает следующими свойствами:
она имеет более высокую степень сульфатирования по сравнению с эноксапарином и далтепарином,
она имеет в своем составе больше трисульфатированных дисахаридов по сравнению с эноксапарином и далтепарином, например, композиция LMWH имеет приблизительно от 50 до 65% трисульфатированных дисахаридов при определении по мол.%,
она имеет более высокий уровень ΔUHNAс,6SGHNS,3S,6S по сравнению с эноксапарином, далтепарином и/или UFH, например, содержание ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S приблизительно составляет от 5 до 15 мол.%.
В предпочтительном варианте реализации изобретения композиция LMWH обладает следующими свойствами:
она имеет содержание кальция менее 3% и/или содержание натрия менее 20%,
она включает менее 1000 нг/мг фермента гепариназы,
она содержит менее 1,0% метанола (масс./масс.),
она содержит менее 1,0% этанола (масс./масс.),
она содержит менее 2,0% хлорида,
она содержит менее 15% воды по массе,
она содержит менее 2000 м.д. свободного сульфата.
В предпочтительном варианте реализации изобретения композиция LMWH обладает следующими свойствами:
она обеспечивает повышенное высвобождение ингибитора метаболического пути тканевого фактора (TFPI) по сравнению с эноксапарином.
В предпочтительном варианте реализации изобретения композиция LMWH имеет период полувыведения после внутривенной инъекции приблизительно от 30 минут до 3 часов.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу получения LMWH. Указанный способ включает
пропускание UFH через одну стадию или поэтапную серию осаждения водными спиртами, например этанолом (по меньшей мере одним с солью натрия (или другой солью, кроме солей кальция)) для того, чтобы экстрагировать из нефракционированного гепарина фракцию низкой молекулярной массы (например, фракцию с высокой подвижностью) и получить первый промежуточный продукт, причем указанный первый промежуточный продукт в предпочтительном варианте имеет среднюю длину цепи от 10 до 16 дисахаридов,
переваривание первого промежуточного продукта с применением агента, например, ферментативного или химического, который расщепляет гликозидные связи несульфатированных уроновых кислот, например, описанного здесь фермента, например, водного буфера, например, водного солевого буфера, например, буфера с ацетатом натрия, причем указанный агент имеет pH приблизительно 5-9, например, 7-8, температура поддерживается на уровне от 25°C до 52°C, например, 37°C, и в результате такой обработки получается второй промежуточный продукт, который в предпочтительном варианте имеет среднюю длину цепи от 8 до 14 дисахаридов, например 8-12 дисахаридов,
отделение компонентов высокой молекулярной массы (направленных против факторов Xa и IIa) от второго промежуточного продукта, т.е. от материалов с низкой активностью, посредством стадии обработки, основанной на размере молекул, например, гель-хроматографии (SEC), для получения третьего промежуточного продукта, причем третий промежуточный продукт в предпочтительном варианте имеет среднюю длину цепи от 9 до 16 дисахаридов, а также необязательно
растворение третьего промежуточного продукта в очищенной воде, фильтрация, например через фильтр калибра 0,2 пм, с последующей сублимационной сушкой для получения лекарственного вещества.
Еще в одном аспекте изобретение относится к композиции LMWH, полученной описанным здесь способом.
Еще в одном аспекте указанный способ включает промежуточную или реакционную смесь любых способов для получения или анализа описанной здесь композиции LMWH.
Еще в одном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит описанную здесь композицию LMWH.
В одном из вариантов реализации изобретения фармацевтическая композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель.
В одном из вариантов реализации изобретения фармацевтическая композиция имеет форму, пригодную для системного введения. В предпочтительном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция пригодна для подкожного, внутривенного, внутриартериального, внутрисуставного, внутримышечного, внутрибрюшинного, внутриглазного (в стекловидное тело), эпидурального, субдурального или интратекального (внутриоболочечного) введения. В одном из вариантов реализации изобретения фармацевтическая композиция для системного введения может представлять собой изотонический раствор, например изотонический раствор с консервантами или без консервантов. Примеры консервантов включают, но не ограничиваясь ими, бензиловый спирт, маннит и лейцин. Стандартное дозированное количество фармацевтической композиции, предлагаемой изобретением, может находиться в упаковке или в устройстве, предназначенном для введения лекарства. Например, композиция, пригодная для подкожной доставки, может находиться в шприце для подкожной инъекции, композиция, пригодная для внутривенной доставки, может находиться в шприце для внутривенной инъекции или в другом устройстве, предназначенном для той же цели, например, в мешочке или бутылочке для капельного вливания.
В одном из вариантов реализации изобретения фармацевтическая композиция имеет форму, пригодную для местного инвазивного введения, например, покрытие или внутреннее содержимое имплантируемого устройства. Примеры устройств, пригодных для имплантации, включают, но не ограничиваясь ими, стенты и экстракорпоральные замкнутые контуры. В одном из вариантов реализации изобретения фармацевтическая композиция имеет форму, пригодную для подкожной имплантации, для имплантации в ткань или орган (например, в коронарную артерию, сонную артерию, почечную артерию, другие периферические артерии, вены, почку, сердце, роговицу, стекловидное тело (глаза) и головной мозг), либо для имплантации в пространство, окружающее ткань или орган (например, в капсулу почки, перикард, торакальное или перитонеальное пространство).
В одном из вариантов реализации изобретения фармацевтическая композиция имеет форму, пригодную для неинвазивного введения, например, топического, трансдермального (чрескожного), пульмонарного (внутрилегочного), назального, орального, в наружный слуховой проход, ректального или вагинального введения. Стандартное дозированное количество фармацевтической композиции, предлагаемой изобретением, может находиться в упаковке или в устройстве, предназначенном для введения лекарства указанными способами.
В одном из вариантов реализации изобретения композиция LMWH лиофилизирована (высушена сублимационным способом). В другом варианте реализации изобретения композиция LMWH имеет жидкую форму.
В одном из вариантов реализации изобретение относится к контейнеру, например ампуле, шприцу или флакону, где находится фармацевтическая композиция. В одном из вариантов реализации изобретения композиция LMWH представлена в дозе приблизительно 1500 МЕ, 2000 МЕ, 2500 МЕ, 3000 МЕ, 3500 МЕ, 4000 МЕ, 4500 МЕ, 5000 МЕ, 5500 МЕ, 6000 МЕ анти-Xa активности на один миллилитр фармацевтически приемлемого носителя.
В одном из вариантов реализации изобретения фармацевтическая композиция имеет осмотическое давление приблизительно от 200 до 400 мОсм/л, например, приблизительно от 250 до 350 мОсм/л, приблизительно от 280 до 330 мОсм/л. В одном из вариантов реализации изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит хлорид натрия и воду.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу лечения субъекта, который связан с введением указанному субъекту раскрытого здесь лекарственного препарата LMWH. Лечение может быть терапевтическим, например, таким, которое уменьшает, облегчает или улучшает существующее патологическое состояние или его симптомы, а также профилактическим, например, таким, которое замедляет, например, предупреждает проявление патологического состояния или его симптомов. Описанную здесь композицию LMWH можно применять для лечения заболеваний, которые поддаются лечению UFH или имеющимися в продаже лекарственными препаратами LMWH, например эноксапарином, далтепарином или тинзапарином. Изобретение включает способы лечения субъекта, страдающего заболеванием (патологическим состоянием) или имеющего повышенный риск развития таких заболеваний/состояний, которые могут быть выбраны из группы, в состав которой входят заболевания, связанные с нарушением коагуляции, например, тромбоз глубоких вен (DVT) или эмболия ветвей легочной артерии, сердечно-сосудистый тромбоз или заболевание, например острый коронарный синдром (ACS), стабильная или нестабильная стенокардия, инфаркт миокарда, например инфаркт миокарда с повышением сегмента ST (STEMI) или инфаркт миокарда без повышения сегмента ST (NSTEMI), сосудистая патология или фибрилляция предсердий, мигрень, атеросклероз, воспалительные заболевания, такие как аутоиммунные или атопические болезни, псориаз, артрит, сепсис, диссеминированная внутрисосудистая коагулопатия (DIC), аллергия или респираторное заболевание, например, астма эмфизема, синдром острой дыхательной недостаточности взрослых (ARDS), муковисцидоз или реперфузионное повреждение легких, стеноз или рестеноз, раковое или метастатическое заболевание, ангиогенное заболевание, фиброзное заболевание, например фиброз крупного органа, фибропролиферативные заболевания и рубцовые изменения, связанные с травмой, остеопороз, болезнь Альцгеймера, костные переломы, например перелом бедра. Субъект может подвергаться или быть ранее подвергнутым хирургической процедуре, например пересадке органа, ортопедической операции, замене сустава, например тазобедренного или коленного, чрескожному коронарному вмешательству (PCI), установке стента, ангиопластике или операции по типу аортокоронарного шунтирования (CABG). Композиции, предлагаемые изобретением, вводят субъекту, имеющему повышенный риск развития одного или более заболеваний, применяя эффективное количество для лечения указанных заболеваний или патологических состояний.
В одном из вариантов реализации изобретения указанный способ дополнительно включает мониторинг активности композиции LMWH у субъекта с анализом показателей коагуляции, например, по таким критериям как ACT и/или aPTT.
В одном из вариантов реализации изобретения указанный способ дополнительно включает введение протаминсульфата после введения композиции LMWH для нейтрализации некоторых или всех видов активности, например анти-Xa и/или анти-IIa активности, проявляемых композицией LMWH. В одном из вариантов реализации изобретения нейтрализуется приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% активности или вся анти-IIa активность, проявляемая композицией LMWH, например, приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% активности или вся анти-IIa активность, проявляемая композицией LMWH, нейтрализуется в течение 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 минут после введения протамина. В одном из вариантов реализации изобретения нейтрализуется приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% активности или вся анти-IIa активность, проявляемая композицией LMWH, например, приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% активности или вся анти-IIa активность, проявляемая композицией LMWH, нейтрализуется в течение 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 минут после введения протамина. В одном из вариантов реализации изобретения протаминсульфат вводят в дозе приблизительно 1 мг, 2 мг, 3 мг, 5 мг композиции LMWH на 100 анти-Xa МЕ плазмы. Нейтрализацию анти-Xa и/или анти-IIa активности можно оценить количественно, например, по таким показателям, как ACT и/или aPTT.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу лечения (например, терапевтического или профилактического лечения) заболевания, например тромботического заболевания у субъекта. Указанный способ включает введение субъекту описанной здесь композиции LMWH для того, чтобы посредством этого лечить или, в предпочтительном варианте, предупредить заболевание. В одном из вариантов реализации изобретения заболевание представляет собой один или более синдромов типа ACS, инфаркт миокарда, например, NSTEMI или STEMI, стабильную стенокардию или нестабильную стенокардию. Предпочтительным тромботическим заболеванием является артериальный тромбоз, включая инфаркт миокарда типа STEMI. Заболевание может иметь связь с хирургическим вмешательством, например с PCI, установкой стента или ангиопластикой. Например, возможны такие варианты, когда субъект запланирован для проведения, уже перенес или выздоравливает после проведенного хирургического вмешательства, например кардиологического вмешательства (например, ангиопластики, PCI, установки стента). В одном из вариантов реализации изобретения субъект имеет повышенную вероятность (рассматривается как кандидат на проведение) хирургического вмешательства, например CABG.
В одном из вариантов реализации изобретения композицию LMWH вводят субъекту внутривенно, например, в дозе приблизительно от 0,03 мг/кг до 0, 45 мг/кг, например, 0,03 мг/кг, 0,05 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,15 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,22 мг/кг, 0,25 мг/кг, 0,27 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,35 мг/кг, 0,37 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,44 мг/кг. В предпочтительных вариантах реализации изобретения композицию LMWH вводят внутривенно в дозе приблизительно от 0,1 до 0,3 мг/кг, например, 0,1 мг/кг, 0,15 мг/кг, 0,20 мг/кг, 0,22 мг/кг, 0,25 мг/кг, 0,27 мг/кг или 0,30 мг/кг. Еще в одном варианте реализации изобретения композицию LMWH вводят субъекту подкожно, например, в дозе приблизительно 0,1 мг/кг, 0,15 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,25 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,35 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,44 мг/кг, 0,47 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,55 мг/кг, 0,60 мг/кг, 0,7 мг/кг, 0,8 мг/кг, 0,9 мг/кг, 1,0 мг/кг. В предпочтительных вариантах реализации изобретения композицию LMWH вводят подкожно в дозе приблизительно от 0,15 до 1,0 мг/кг, от 0,20 до 0,9 мг/кг, от 0,25 до 0,9 мг/кг, от 0,30 до 0,50 мг/кг, например, 0,30 мг/кг, 0,35 мг/кг, 0,40 мг/кг, 0,42 мг/кг, 0,44 мг/кг, 0,47 мг/кг или 0,50 мг/кг.
В одном из вариантов реализации изобретения указанный способ дополнительно включает мониторинг активности композиции LMWH у субъекта с анализом показателей коагуляции, например ACT и/или aPTT. В одном из вариантов реализации изобретения перед хирургическим вмешательством, во время хирургического вмешательства или после хирургического вмешательства, например ангиопластики, PCI, установки стента, отслеживается анти-Xa и/или анти-IIa активность, например, по таким показателям, как ACT и/или aPTT. В одном из вариантов реализации изобретения анти-Xa и/или анти-IIa активность отслеживается по таким показателям, как ACT и/или aPTT перед введением, во время введения или после введения композиции LMWH. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-Xa и/или анти-IIa активность отслеживается по показателям ACT, причем дозу препарата LMWH подбирают с таким расчетом, чтобы достичь величины ACT приблизительно от 200 до 350 секунд.
В одном из вариантов реализации изобретения указанный способ дополнительно включает введение протаминсульфата после введения композиции LMWH для нейтрализации некоторых или всех видов активности, например анти-Xa и/или анти-IIa активности, проявляемых композицией LMWH. В одном из вариантов реализации изобретения нейтрализуется по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% активности или вся анти-IIa активность, проявляемая композицией LMWH, например, по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% активности или вся анти-IIa активность, проявляемая композицией LMWH, нейтрализуется в течение 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 минут после введения протамина. В одном из вариантов реализации изобретения нейтрализуется по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% активности или вся анти-IIa активность, проявляемая композицией LMWH, например, по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% активности или вся анти-IIa активность, проявляемая композицией LMWH, нейтрализуется в течение 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 минут после введения протамина. В одном из вариантов реализации изобретения протаминсульфат вводят в дозе приблизительно от 1 до 5 мг, например, 1 мг, 2 мг, 3 мг, 5 мг композиции LMWH на 100 анти-Xa МЕ плазмы. Нейтрализацию анти-Xa и/или анти-IIa активности можно оценить количественно, например, по таким показателям, как ACT и/или aPTT. В одном из вариантов реализации изобретения анти-Xa активность и/или анти-IIa активность можно определять перед введением, во время введения или после введения протаминсульфата по таким показателям, как ACT и/или aPTT. В одном из вариантов реализации изобретения анти-Xa и/или анти-IIa активность нейтрализуют до, во время или после хирургического вмешательства. Например, в одном из вариантов реализации изобретения анти-Xa и/или анти-IIa активность можно нейтрализовать во время или после хирургического вмешательства, например, ангиопластики или PCI. В другом варианте реализации изобретения композицию LMWH нейтрализуют перед хирургическим вмешательством, например, таким как CABG.
В одном из вариантов реализации изобретения указанный способ дополнительно включает мониторинг пациента на неблагоприятные реакции, например эпидуральную или спинальную гематому, геморрагию или кровотечение.
В одном из вариантов реализации изобретения композицию LMWH вводят внутривенно или подкожно.
В одном из вариантов реализации изобретения композицию LMWH вводят в комбинации с другим лекарственным средством, например антикоагулянтом или антитромботиком, например бивалирудином (Angiomax), ASA, ингибитором GPIIbIIIa (например, эптифибатидом или абциксимабом), ингибитором ADP (например, Plavix), rPA, ТНК-азой, аспирином, ингибитором P2Y12, ингибитором тромбоцитов, варфарином и какой-либо комбинацией этих средств.
Раскрытые здесь композиции LMWH, имеющие обратимое действие (нейтрализуемые) и поддающиеся мониторингу, обеспечивают бóльшую гибкость в лечении пациентов, например, поступивших в больницу и проходящих обследование для оценки показаний к сердечно-сосудистым лечебным вмешательствам, например хирургическим. В соответствии с этим, еще в одном аспекте изобретение относится к способу лечения (например, терапевтического или профилактического лечения) заболевания, например, тромботического или сердечно-сосудистого заболевания у пациента. Указанный способ включает,
необязательно, введение пациенту описанной здесь отслеживаемой композиции LMWH с обратимым действием,
клиническую оценку пациента (которому вводили или будут вводить композицию LMWH), как не нуждающегося в хирургическом вмешательстве (например, перед выпиской из больницы) или его/ее отнесение к числу кандидатов на хирургическое вмешательство перед выпиской из больницы,
необязательно, если пациент расценен как кандидат на хирургическое вмешательство, проведение одной или обеих процедур: мониторинга поддающейся отслеживанию композиции LMWH обратимого действия (например, как это описано здесь, например, анализом коагуляции, например, по таким показателям, как ACT и/или aPTT) и/или нейтрализации поддающейся отслеживанию композиции LMWH обратимого действия (например, как это описано здесь, например, посредством введения протаминсульфата).
В одном из вариантов реализации изобретения композицию LMWH вводят субъекту внутривенно, например, в дозе приблизительно от 0,03 мг/кг до 0,45 мг/кг, например, 0,03 мг/кг, 0,05 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,15 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,22 мг/кг, 0,25 мг/кг, 0,27 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,35 мг/кг, 0,37 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,44 мг/кг. В предпочтительных вариантах реализации изобретения композицию LMWH вводят внутривенно в дозе приблизительно от 0,1 до 0,3 мг/кг, например, 0,1 мг/кг, 0,15 мг/кг, 0,20 мг/кг, 0,22 мг/кг, 0,25 мг/кг, 0,27 мг/кг или 0,30 мг/кг. Еще в одном варианте реализации изобретения композицию LMWH вводят субъекту подкожно, например, в дозе приблизительно 0,1 мг/кг, 0,15 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,25 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,35 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,44 мг/кг, 0,47 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,55 мг/кг, 0,60 мг/кг, 0,7 мг/кг, 0,8 мг/кг, 0,9 мг/кг, 1,0 мг/кг. В предпочтительных вариантах реализации изобретения композицию LMWH вводят подкожно в дозе приблизительно от 0,15 до 1,0 мг/кг, от 0,20 до 0,8 мг/кг, от 0,25 до 0,9 мг/кг, от 0,30 до 0,50 мг/кг, например, 0,30 мг/кг, 0,35 мг/кг, 0,40 мг/кг, 0,42 мг/кг, 0,44 мг/кг, 0,47 мг/кг или 0,50 мг/кг.
В предпочтительном варианте реализации изобретения пациента расценивают как кандидата на хирургическое вмешательство, например, PCI, установку стента или ангиопластику, и проводят мониторинг эффекта поддающейся отслеживанию композиции LMWH с обратимым действием. В предпочтительном варианте реализации изобретения пациенту проводят хирургическое вмешательство и мониторинг поддающейся отслеживанию композиции LMWH обратимого действия на одной и более или на всех стадиях: до, во время и после хирургического вмешательства. В одном из вариантов реализации изобретения у пациента наблюдают уровень ACT до и/или во время хирургического вмешательства, например, PCI, причем необходимый диапазон ACT должен составлять приблизительно от 200 до 350.
В предпочтительном варианте реализации изобретения пациента расценивают как кандидата на хирургическое вмешательство, например CABG, и проводят мониторинг эффекта поддающейся отслеживанию композиции LMWH с обратимым действием, а также (при необходимости) нейтрализацию избыточного эффекта. В предпочтительном варианте реализации изобретения пациенту проводят хирургическое вмешательство и мониторинг поддающейся отслеживанию композиции LMWH обратимого действия на одной и более или на всех стадиях: до, во время и после хирургического вмешательства. В одном из вариантов реализации изобретения перед хирургическим вмешательством, например CABG, у пациента проводят мониторинг ACT, причем необходимый диапазон ACT должен составлять приблизительно от 400 до 600, например, от 400 до 500.
В предпочтительном варианте реализации изобретения субъект получает лечение в связи с тромботическим заболеванием. В одном из вариантов реализации изобретения заболевание представляет собой один или более синдромов типа ACS, инфаркт миокарда, например, NSTEMI или STEMI, стабильную стенокардию или нестабильную стенокардию. Предпочтительным тромботическим заболеванием является артериальный тромбоз, включая повышение интервала ST (STEMI).
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу отслеживания субъекта, получающего лечение описанной здесь композицией LMWH обратимого действия, поддающейся отслеживанию. Указанный способ включает,
необязательно, введение субъекту описанной здесь композиции LMWH, поддающейся отслеживанию, и
оценку показателей aPTT и/или ACT у субъекта, которому была введена композиция LMWH, поддающаяся отслеживанию.
В одном из вариантов реализации изобретения у субъекта перед лечением препаратом LMWH определяют базовый уровень aPTT и/или ACT. В одном из вариантов реализации изобретения указанный способ включает сравнение показателей aPTT и/или ACT у субъекта, получающего лечение препаратом LMWH, с базовым уровнем aPTT и/или ACT.
В одном из вариантов реализации изобретения пациента наблюдают на одной и более или на всех стадиях, включая следующие: до, во время и после лечебного введения композиции LMWH. В одном из вариантов реализации изобретения субъекта наблюдают до, во время и/или после хирургического вмешательства, например PCI, установки стента или ангиопластики. В одном из вариантов реализации изобретения у пациента отслеживают действие композиции LMWH по уровню ACT до и/или во время хирургического вмешательства, например PCI, причем необходимый диапазон ACT должен составлять приблизительно от 200 до 350. Еще в одном варианте реализации изобретения действие композиции LMWH у пациента отслеживают перед CABG по уровню ACT, причем необходимый уровень ACT должен составлять приблизительно от 400 до 600, например, приблизительно от 400 до 500.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу лечения субъекта, получающего описанную здесь композицию LMWH обратимого действия. Указанный способ включает,
необязательно, введение пациенту описанной здесь композиции LMWH с обратимым действием, и
нейтрализацию композиции LMWH обратимого действия (например, как это описано здесь, например, посредством введения протаминсульфата).
В одном из вариантов реализации изобретения пациента наблюдают на одной и более или на всех стадиях, включая следующие: до, во время и после введения протаминсульфата.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу консультирования или предоставления инструкций (например, письменных, устных или генерированных компьютером) по использованию LMWH, обладающего высокой анти-IIa активностью, например, композиции LMWH, описанной в этой заявке. Указанный способ включает предоставление инструкций по использованию LMWH, например, в следующих ситуациях: пациентам с нарушенной функцией почек или диабетом, или связанным со сгустком тромбином, пациентам, расцененным как кандидаты на PCI, установку стента, CABG, ангиопластику и т.д., пациентам отделений инвазивной кардиологии, пациентам, нуждающимся в нейтрализации ранее введенного препарата LMWH, например, в нейтрализации протаминсульфатом, пациентам с повышенным риском эпидуральной или спинальной гематомы, геморрагии и/или кровотечения. В одном из вариантов реализации изобретения инструкции относятся к введению композиции LMWH по таким показаниям как ACS, инфаркт миокарда, например, NSTEMI или STEMI, стабильная стенокардия и нестабильная стенокардия, например, введение в избирательных категориях пациентов с нарушенной функцией почек или пациентов пожилого возраста (например, пациентов старше 60 лет). В одном из вариантов реализации изобретения инструкции относятся к введению композиции LMWH в связи с тромботическими заболеваниями, например тромботическими заболеваниями, связанными с хирургическим вмешательством, например PCI, установкой стента или ангиопластикой.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу консультирования по применению описанной здесь композиции LMWH, который включает предоставление инструкций по мониторингу анти-Xa и/или анти-IIa активности по таким показателям, как ACT и/или aPTT.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу производства композиции LMWH, например, описанной здесь композицию LMWH. Указанный способ включает одну или более из следующих стадий:
(1) проведение первого осаждения образца, содержащего гликозаминогликан (GAG), например, UFH, например, полярным органическим растворителем (например, спиртом, например, этанолом), полярным неорганическим растворителем (например, водой) и солью (например, солью натрия, например, ацетатом натрия, или солью кальция, например, ацетатом кальция) для получения первого супернатанта (надосадочной жидкости),
(2) проведение второго осаждения из первого супернатанта, например, полярным органическим растворителем (например, спиртом, например, этанолом) и полярным неорганическим растворителем (например, водой) для получения осадка (его можно использовать для получения фракции с высокой подвижностью, как это обсуждается в другом месте настоящей заявки),
(3) солюбилизация осадка, предпочтительно, в воде, а также очистка солюбилизированного осадка таким агентом, который расщепляет гликозидные связи несульфатированных уроновых кислот, например, прилегающие к остатку N-ацетилглюкозамина. Примером является описанный здесь фермент гепариназа III, предпочтительно, MO11, предпочтительно, в присутствии ацетата натрия, и, предпочтительно, до завершения реакции, например, подтвержденного по плато УФ, для получения расщепленного препарата,
(4) осаждение расщепленного препарата, например, солью, например солью натрия, предпочтительно хлоридом натрия, и полярным органическим растворителем, например спиртом, например метанолом, для получения твердого вещества, имеющего сахариды со средней длиной цепи от 8 до 14, например, дисахариды 8-12,
(5) проведение очистки материала в виде твердого вещества, например, хроматографической очистки, например, селекции по размеру, например, по методу вытеснительной хроматографии, ионообменной хроматографии или фильтрации, для получения препарата с более высокой молекулярной массой, чем на стадии (4). В предпочтительном варианте реализации изобретения препарат с более высокой молекулярной массой имеет среднюю длину цепи от 9 до 16 дисахаридов или среднюю молекулярную массу от 5000 до 9000 Да.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способам получения композиции LMWH, имеющей среднюю длину цепи приблизительно от 9 до 16 дисахаридов. Указанный способ включает
получение композиции-предшественника LMWH (например, промежуточной композиции по описанному здесь способу) со средней длиной цепи менее 9-16 дисахаридов, предпочтительно, от 8 до 14 дисахаридов, например, от 8 до 12 дисахаридов, и
обработку композиции-предшественника LMWH для получения LMWH, имеющего среднюю длину цепи приблизительно от 9 до 16 дисахаридов.
В предпочтительном варианте обработка включает селекцию по размеру, например, разделение в зависимости от размера, например, одним или более методов вытеснительной хроматографии, ионообменной хроматографии или фильтрации.
В одном из вариантов реализации изобретения композиция-предшественник LMWH представляет собой препарат со средней длиной цепи приблизительно от 8 до 14 дисахаридов, например, от 8 до 12 дисахаридов. В предпочтительном варианте реализации изобретения такую композицию получают способом, включающим осаждение солью и ферментативное переваривание препарата более высокой молекулярной массы, например UFH. В одном из вариантов реализации изобретения соль представляет собой соль моновалентного или бивалентного катиона. Примеры моновалентных и бивалентных катионов, пригодных для применения, включают натрий, калий, рубидий, цезий, барий, кальций, магний, стронций и их комбинации. В одном из вариантов реализации изобретения соль моновалентного или бивалентного катиона представляет собой ацетат моновалентного или бивалентного катиона.
В одном из вариантов реализации изобретения фермент (или ферменты), используемый для переваривания, расщепляет одну или более гликозидных связей с несульфатированными уроновыми кислотами, например, прилегающих к остатку N-ацетилглюкозамина. Примеры ферментов, пригодных для применения, включают гепариназу III, мутанты гепариназы III, например мутант гепариназы III, описанный в патенте США № 5896789 (например, мутант гепариназы III, имеющий один или более остатков гистидина, который можно выбрать из группы, состоящей из мутантов His 36, His105, His110, His139, His152, His225, His234, His241, His424, His469 и His539 с замещением аланином), а также гепарин-сульфат-гликозаминогликан-лиаза III из Bacteroides thetaiotaomicron. В предпочтительном варианте реализации изобретения фермент, используемый для переваривания, представляет собой мутантную гепариназу III, имеющую аминокислотную последовательность с заменой 225 остатка аланина на аланин.
В предпочтительном варианте реализации изобретения композицию-предшественник можно получить следующим образом:
(1) проведением первого осаждения образца, содержащего гликозаминогликан (GAG), например, UFH, например, полярным органическим растворителем (например, спиртом, например, этанолом), полярным неорганическим растворителем (например, водой) и солью (например, солью натрия, например, ацетатом натрия, или солью кальция, например, ацетатом кальция) для получения первого супернатанта,
(2) проведением второго осаждения из первого супернатанта, например, полярным органическим растворителем (например, спиртом, например, этанолом) и полярным неорганическим растворителем (например, водой) для получения осадка (его можно использовать для получения фракции с высокой подвижностью, как это обсуждается в другом месте настоящей заявки),
(3) солюбилизацией осадка и расщеплением солюбилизированного осадка ферментом гепариназой III, предпочтительно, MO11, предпочтительно, в присутствии ацетата натрия и, предпочтительно, до завершения реакции, например, подтвержденного по абсорбции УФ на уровне более 9,8, для получения расщепленного препарата.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу получения композиции LMWH, например, описанной здесь композицию LMWH. Указанный способ включает
(1) проведением первого осаждения образца, содержащего гликозаминогликан (GAG), например, UFH, например, полярным органическим растворителем (например, спиртом, например, этанолом), полярным неорганическим растворителем (например, водой) и солью натрия (например, ацетатом натрия) для получения первого супернатанта,
(2) проведением второго осаждения из первого супернатанта, например, полярным органическим растворителем (например, спиртом, например, этанолом) и полярным неорганическим растворителем (например, водой) для получения осадка (его можно использовать для получения фракции с высокой подвижностью, как это обсуждается в другом месте настоящей заявки),
(3) необязательно, солюбилизация осадка и расщепление солюбилизированного осадка описанным здесь ферментом, предпочтительно, в присутствии ацетата натрия и, предпочтительно, до завершения реакции, например, подтвержденного по абсорбции УФ на уровне более 9,8, для получения расщепленного препарата, а также
(4) необязательно, обработку фракции для получения препарата LMWH.
В одном из вариантов реализации изобретения фермент (или ферменты), используемый для переваривания, расщепляет одну или более гликозидных связей с несульфатированными уроновыми кислотами, например, прилегающих к остатку N-ацетилглюкозамина. Примеры ферментов, пригодных для применения, включают гепариназу III, мутанты гепариназы III, например, мутант гепариназы III, описанный в патенте США № 5896789 (например, мутант гепариназы III, имеющий один или более остатков гистидина, который можно выбрать из группы, состоящей из мутантов His 36, His105, His110, His139, His152, His225, His234, His241, His424, His469 и His539 с замещением аланином), а также гепарин-сульфат-гликозаминогликан-лиаза III из Bacteroides thetaiotaomicron. В предпочтительном варианте реализации изобретения фермент, используемый для переваривания, представляет собой мутантную гепариназу III, имеющую аминокислотную последовательность с заменой 225 остатка аланина на аланин.
В одном из вариантов реализации изобретения расщепленная фракция является конечным продуктом. В других вариантах реализации изобретения указанный способ может включать одну или более дополнительных стадий обработки для получения конечного продукта. В одном из вариантов реализации изобретения указанный способ включает обработку переваренной фракции для получения композиции LMWH со средней длиной цепи от 9 до 16 дисахаридов. В одном из вариантов реализации изобретения для получения композиции LMWH со средней длиной цепи от 9 до 16 дисахаридов можно использовать вытеснительную (по размеру) хроматографию, ионообменную хроматографию и/или фильтрацию.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу оценки процесса обработки GAG, например UFH, позволяющий определить пригодность GAG для такой обработки и включения в композицию LMWH, например, описанную здесь композицию LMWH. Указанный способ включает определение количества N-ацетила, представленного в препарате GAG, сравнение этого количества с заданным условием и принятие решения о препарате GAG, основанного на том, соблюдено ли заданное условие. В предпочтительном варианте реализации изобретения принимается решение или проводится стадия процесса, например, препарат GAG классифицируется, принимается или отбраковывается, перерабатывается в лекарственное вещество или лекарственный продукт, либо производится (изменяется) запись, отражающая выводы в зависимости от того, соблюдено ли заданное условие. В некоторых вариантах реализации изобретения, если заданное условие не соблюдено, может быть принято решение об изменении одной или более стадий в производстве композиции LMWH.
В одном из вариантов реализации изобретения заданное условие состоит в том, чтобы количественное содержание N-ацетила в препарате GAG составляло приблизительно 11% и более по отношению к общему содержанию глюкозамина (при определении по мол.%). Препарат GAG, имеющий содержание N-ацетила в этом диапазоне, подходит для переработки в композицию LMWH, например, в описанную здесь композицию LMWH. В тех вариантах реализации изобретения, когда это заданное условие соблюдено, препарат GAG принимается и перерабатывается в промежуточные продукты, лекарственное вещество и лекарственный продукт.
В одном из вариантов реализации изобретения количество N-ацетила в препарате GAG можно определить, например, методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
В предпочтительных вариантах реализации изобретения раскрытые здесь способы полезны с точки зрения процесса, например, для отслеживания и обеспечения постоянства и/или качества от партии к партии либо для оценки образца в отношении выполнения заданного условия.
В одном из аспектов изобретение относится к способу оценки или переработки промежуточного препарата LMWH, например, полученного описанным здесь способом, для определения пригодности этого промежуточного препарата к переработке в композицию LMWH. Промежуточный препарат LMWH представляет собой фракцию с высокой подвижностью, полученную, например, посредством солевого осаждения натрием или ацетатом натрия образца, содержащего гликозаминогликан (GAG), в растворителе, как это описано здесь. Указанный способ включает сравнение количества одного или более структурных компонентов, например, сульфатированной идуроновой кислоты, N-сульфатированного гексозамина, связанного с уроновой кислотой, эпоксида и 6-O сульфатированного гексозамина, в промежуточном препарате LMWH с количеством тех же структурных компонентов в исходном материале нефракционированного гепарина, а также принятие решения о промежуточном препарате LMWH, основанного на том, соблюдено ли заданное условие о соответствии между исходным материалом и промежуточным препаратом LMWH. В предпочтительном варианте реализации изобретения принимается решение или проводится стадия процесса, например, промежуточный препарат LMWH классифицируется, принимается или отбраковывается, перерабатывается в лекарственное вещество или лекарственный продукт, либо производится (изменяется) запись, отражающая выводы в зависимости от того, соблюдено ли заданное условие. В некоторых вариантах реализации изобретения, если заданное условие не соблюдено, может быть принято решение об изменении одной или более стадий в производстве композиции LMWH.
В одном из вариантов реализации изобретения заданное условие заключается в снижении количества сульфатированной идуроновой кислоты в промежуточном препарате по сравнению с исходным материалом. Пониженное содержание сульфатированной идуроновой кислоты в промежуточном препарате указывает на то, что такой промежуточный препарат пригоден для дальнейшей переработки в композицию LMWH, например, в описанную здесь композицию LMWH. В тех вариантах реализации изобретения, когда это заданное условие соблюдено, промежуточный препарат принимается и перерабатывается в последующие промежуточные продукты, лекарственное вещество или лекарственный продукт.
В одном из вариантов реализации изобретения заданное условие заключается в повышении количества N-сульфатированного гексозамина, связанного с уроновой кислотой (например, идуроновой и/или глюкуроновой кислотой) в промежуточном препарате по сравнению с исходным материалом. Увеличенное содержание N-сульфатированного гексозамина, связанного с уроновой кислотой, в промежуточном препарате указывает на то, что такой промежуточный препарат пригоден для дальнейшей переработки в композицию LMWH, например, в описанную здесь композицию LMWH. В тех вариантах реализации изобретения, когда это заданное условие соблюдено, промежуточный препарат принимается и перерабатывается в последующие промежуточные продукты, лекарственное вещество или лекарственный продукт.
В одном из вариантов реализации изобретения заданное условие заключается в снижении количества эпоксида в промежуточном препарате по сравнению с исходным материалом. Пониженное содержание эпоксида в промежуточном препарате указывает на то, что такой промежуточный препарат пригоден для дальнейшей переработки в композицию LMWH, например, в описанную здесь композицию LMWH. В тех вариантах реализации изобретения, когда это заданное условие соблюдено, промежуточный препарат принимается и перерабатывается в последующие промежуточные продукты, лекарственное вещество или лекарственный продукт.
В одном из вариантов реализации изобретения заданное условие заключается в увеличении количества 6-O сульфатированного гексозамина в промежуточном препарате по сравнению с исходным материалом. Пониженное содержание 6-O сульфатированного гексозамина в промежуточном препарате указывает на то, что такой промежуточный препарат пригоден для дальнейшей переработки в композицию LMWH, например, в описанную здесь композицию LMWH. В тех вариантах реализации изобретения, когда это заданное условие соблюдено, промежуточный препарат принимается и перерабатывается в последующие промежуточные продукты, лекарственное вещество или лекарственный продукт.
В одном из вариантов реализации изобретения количество структурного компонента в исходном материале и/или в промежуточном препарате определяют одним или более способов, включая ядерный магнитный резонанс (ЯМР), капиллярный электрофорез (КЭ) и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).
В предпочтительных вариантах реализации изобретения раскрытые здесь способы полезны с точки зрения процесса, например, для отслеживания и обеспечения постоянства и/или качества от партии к партии либо для оценки образца в отношении выполнения заданного условия.
Некоторые свойства могут сделать образец UFH более предпочтительным исходным материалом для получения LMWH, предлагаемого изобретением. В соответствии с этим еще в одном аспекте изобретение предлагает способ оценки препарата UFH как исходного материала для получения описанной здесь композиции LMWH.
Указанный способ включает оценку препарата UFH по тем параметрам, которые характеризуют пригодность образца UFH для применения в получении описанного здесь LMWH, а также, необязательно, определение того, насколько величина того или иного параметра (например, величина, коррелирующаяся с присутствием, количеством, распределением или отсутствием), соответствует заданному условию, например, определяется или находится в заданном диапазоне, то есть позволяет надежно оценить образец UFH.
В предпочтительном варианте реализации изобретения заданное условие выполняется, и образец UFH признается пригодным и перерабатывается в LMWH.
В предпочтительном варианте реализации изобретения оценочным параметром является присутствие или количественное содержание одной или более структур, перечисленных в таблице 2, предпочтительно, такой структуры, которая связана с эффективностью стадии в способе получения LMWH, например, структуры, которая стимулирует с расщеплением гепариназой или проявляет положительную корреляцию с ним, например, HNAc(внутр.).
В предпочтительном варианте реализации изобретения указанный способ включает определение того, насколько количество HNAc (внутр.) в образце UFH соответствует заданному условию, например равно заданной эталонной величине или превышает ее.
В предпочтительном варианте реализации изобретения также определяют значение определенного параметра в промежуточном продукте, используемом при получении LMWH, и, необязательно, величина этого параметра также должна соответствовать заданному условию при отборе образцов UFH для получения LMWH.
В одном из аспектов изобретение предлагает способ оценки препарата UFH как исходного материала для получения описанной здесь композиции LMWH.
Указанный способ включает, необязательно, проведение рабочей операции, например, осаждение в образце UFH для получения промежуточного продукта (предпочтительно, чтобы стадии получения этого промежуточного продукта и сам промежуточный продукт соответствовали стадиям и промежуточным продуктам в процессе получения LMWH), оценку промежуточного препарата по параметрам, связанным с пригодностью образца UFH для применения в получении описанной здесь композиции LMWH, а также, необязательно, определение того, насколько величина того или иного параметра (например, величина, коррелирующаяся с присутствием, количеством, распределением или отсутствием) соответствует заданному условию, например, определяется или находится в заданном диапазоне, то есть позволяет надежно оценить препарат UFH.
В предпочтительном варианте реализации изобретения заданное условие выполняется, то есть образец UFH признается пригодным и перерабатывается в LMWH.
В предпочтительном варианте реализации изобретения оценочным параметром является присутствие или количественное содержание структур, перечисленных в таблице 2, предпочтительно, такой структуры, которая связана с эффективностью стадии в способе получения LMWH, например, структуры, которая стимулирует с расщеплением гепариназой или проявляет положительную корреляцию с ним, например, HNAc(внутр.).
В предпочтительном варианте реализации изобретения указанный способ включает определение того, насколько количество HNAc(внутр.) в промежуточном продукте соответствует заданному условию, например, равно заданной эталонной величине или превышает ее.
В предпочтительном варианте реализации изобретения также определяют значение определенного параметра в образце UFH и, необязательно, величина этого параметра должна соответствовать заданному условию при отборе образцов UFH для получения LMWH.
В предпочтительных вариантах реализации любого из этих способов принимается решение или проводится стадия процесса, например, образец классифицируется, проходит отбор, принимается или отбраковывается, ликвидируется или сохраняется, перерабатывается в лекарственный продукт, транспортируется, перемещается в другое место, вводится в лекарственную рецептуру, маркируется, упаковывается, выпускается в коммерческую торговую сеть, продается или предлагается для продажи, либо производится запись или изменение, отражающие вывод о том, соблюдено ли заданное условие. Например, основываясь на результатах определения того, представлен ли в образце один или более необходимых компонентов, или на результатах сравнения с эталонным стандартом, партию, из которой был взят образец, могут подвергнуть дальнейшей обработке в соответствии с только что приведенным описанием.
В любом из двух способов предпочтительный вариант включает анализ образца методом ЯМР.
В предпочтительном варианте реализации изобретения любой из двух способов может включать процедуру сравнения величины, определенной по тому или иному параметру с эталонной величиной или величинами, посредством чего производится оценка образца. В предпочтительных вариантах реализации изобретения сравнение включает определение того, насколько тестируемая величина адекватна эталонной величине, то есть определение того, выполнено ли заданное условие по этому параметру. Величина (то есть показатель) не обязательно имеет численное значение, например, это просто может быть индикация о том, присутствует ли в исследуемом образце требуемый компонент.
Предпочтительный вариант реализации любого из двух способов может включать определение того, равна ли экспериментальная величина эталонной величине или отличается от нее (то есть больше или меньше нее), или попадает в диапазон (включения или исключения по одной или обеим конечным точкам).
В предпочтительных вариантах реализации любого из двух способов экспериментальная величина или указание о соблюдении заданного условия могут быть сохранены в памяти, например в считываемых записях на компьютерных носителях.
В предпочтительных вариантах реализации любого из двух способов получение промежуточного продукта происходит в процессе, включающем одну или более следующих стадий либо все указанные стадии:
(1) проведение первого осаждения образца UFH, например, полярным органическим растворителем (например, спиртом, например, этанолом), полярным неорганическим растворителем (например, водой) и солью (например, солью натрия, например, ацетатом натрия) для получения первого супернатанта,
(2) проведением второго осаждения из первого супернатанта, например, полярным органическим растворителем (например, спиртом, например, этанолом) и полярным неорганическим растворителем (например, водой) для получения осадка (его можно использовать для получения фракции с высокой подвижностью, как это обсуждается в другом месте настоящей заявки),
(3a) солюбилизация осадка, предпочтительно, в воде,
(3b) расщепление солюбилизированного осадка ферментом (или ферментами), который расщепляет гликозидные связи несульфатированных уроновых кислот, например, прилегающие к остатку N-ацетилглюкозамина, например, таким ферментом, как гепариназа III, предпочтительно, MO11, предпочтительно, в присутствии ацетата натрия и, предпочтительно, до завершения реакции, подтвержденного по абсорбции УФ на уровне более 9,8, для получения расщепленного препарата.
Предпочтительный промежуточный продукт, это продукт, полученный на стадии (2) или (3a), хотя в способе могут быть использованы и другие стадии.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу оценки описанного здесь препарата LMWH. Указанный способ включает получение описанного здесь препарата LMWH, определение того, обладает ли полученный препарат описанными здесь структурой, активностью или функцией, посредством чего производится оценка описанного здесь препарата LMWH. В предпочтительном варианте реализации изобретения указанное определение включает определение того, находятся ли структура, активность или функция препарата на заданном уровне или в заданном диапазоне, например на описанном здесь уровне или в обозначенном здесь диапазоне.
В соответствии с этим в одном из аспектов изобретение предлагает способ оценки процесса получения описанной здесь композиции LMWH. Указанный способ включает проведение оценки параметров, относящихся к пикам, представленным в таблице 10A. Такие параметры могут включать или представлять собой функцию присутствия, относительного распределения или количества пика, а также, необязательно, давать определение того, насколько экспериментальная величина (например, величина, коррелирующаяся с присутствием, количеством, распределением или отсутствием), определяемая в отношении того или иного параметра, соответствует заданному условию, например представлена ли она вообще или находится в заданном диапазоне, что позволяет оценивать процесс переработки смеси.
В предпочтительном варианте реализации изобретения указанный способ включает анализ, например ферментативное переваривание образца гепариназой I, гепариназой II, гепариназой III, и его разделение электрофорезом, например капиллярным электрофорезом.
В предпочтительном варианте реализации изобретения указанный способ включает оценку образца с определением того, представлены ли один или более пиков, перечисленных в таблице 10A.
В предпочтительном варианте реализации указанный способ включает процедуру сравнения величины, определенной по тому или иному параметру с эталонной величиной или величинами, посредством чего производится оценка образца. В предпочтительных вариантах реализации изобретения сравнение включает определение того, насколько тестируемая величина адекватна эталонной величине, то есть определение того, выполнено ли заданное условие по этому параметру. Величина (то есть показатель) не обязательно имеет численное значение, например, это просто может быть индикация о том, присутствует ли в исследуемом образце требуемый компонент.
В предпочтительном варианте реализации изобретения способ включает определение того, равна ли экспериментальная величина эталонной величине или отличается от нее (то есть больше или меньше нее), или попадает в диапазон (включения или исключения по одной или обеим конечным точкам). В качестве примера, можно определить количество пика, указанного в таблице 10A, и, необязательно, показать, что эта величина попадает в заданный диапазон, например в диапазон, соответствующий значениям, приведенным в таблице 10A. В предпочтительном варианте реализации изобретения количество каждого пика приблизительно соответствует данным, приведенным в таблице 10A, количество каждого пика попадает в диапазон, указанный в таблице 10A, количество пиков 10 и 11 соответствует диапазону, указанному в таблице 10A.
В предпочтительных вариантах реализации изобретения экспериментальная величина или указание о соблюдении заданного условия могут быть сохранены в памяти, например в считываемых записях на компьютерных носителях.
В предпочтительных вариантах реализации изобретения принимается решение или проводится стадия процесса, например образец классифицируется, проходит отбор, принимается или отбраковывается, ликвидируется или сохраняется, перерабатывается в лекарственный продукт, транспортируется, перемещается в другое место, вводится в лекарственную рецептуру, маркируется, упаковывается, выпускается в коммерческую торговую сеть, продается или предлагается для продажи, либо производится запись или изменение, отражающие вывод о том, соблюдено ли заданное условие. Например, основываясь на результатах определения того, представлен ли в образце один или более необходимых компонентов, или на результатах сравнения с эталонным стандартом, партию, из которой был взят образец, могут подвергнуть дальнейшей обработке в соответствии с только что приведенным описанием.
Структуры, представленные в таблице 10A, можно определить при помощи КЭ или, при необходимости, другими аналитическими методами.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу оценки описанного здесь процесса получения препарата LMWH. Указанный способ включает
получение препарата LMWH, который был переварен гепариназой I, гепариназой II, гепариназой III и разделен методом сепарации, например КЭ,
определение присутствия (или отсутствия) одного и более пиков, перечисленных в таблице 10A.
В предпочтительном варианте реализации изобретения указанный способ включает определение того, попадает ли пик, указанный в таблице 10A, в заданный диапазон, также указанный в таблице 10A. В предпочтительном варианте реализации изобретения количество каждого пика приблизительно соответствует данным, приведенным в таблице 10A, количество каждого пика попадает в диапазон, указанный в таблице 10A, количество пиков 10 и 11 соответствует диапазону, указанному в таблице 10A.
Еще в одном аспекте изобретение предлагает способ оценки описанного здесь процесса получения композиции LMWH.
Указанный способ включает оценку параметров, связанных со структурой или структурами, перечисленными в таблице 11A. Такие параметры могут включать или представлять собой функцию присутствия, относительного распределения или количества структуры, а также, необязательно, давать определение того, насколько экспериментальная величина (например, величина, коррелирующаяся с присутствием, количеством, распределением или отсутствием), определяемая в отношении того или иного параметра, соответствует заданному условию, например, представлена ли она вообще или находится в заданном диапазоне, что позволяет оценивать процесс переработки смеси.
В предпочтительном варианте реализации изобретения указанный способ включает анализ композиции методом 2D-ЯМР.
В предпочтительном варианте реализации изобретения указанный способ включает оценку образца с определением того, представлены ли одна или более структур, представленных в таблице 11A.
В предпочтительном варианте реализации изобретения указанный способ включает процедуру сравнения величины, определенной по тому или иному параметру, с эталонной величиной или величинами, посредством чего производится оценка образца. В предпочтительных вариантах реализации изобретения сравнение включает определение того, насколько тестируемая величина адекватна эталонной величине, то есть определение того, выполнено ли заданное условие по этому параметру. Величина (то есть показатель) необязательно имеет численное значение, например, это просто может быть индикация о том, присутствует ли в исследуемом образце требуемая структура.
В предпочтительном варианте реализации изобретения способ включает определение того, равна ли экспериментальная величина эталонной величине или отличается от нее (то есть больше или меньше нее), или попадает в диапазон (включения или исключения по одной или обеим конечным точкам). В качестве примера, можно определить количество структуры, представленной в таблице 11A, и, необязательно, показать, что эта структура попадает в заданный диапазон, например в диапазон, соответствующий значениям, приведенным в таблице 11A. В предпочтительном варианте реализации изобретения количество каждой структуры приблизительно соответствует данным, приведенным в таблице 11A, количество каждой структуры попадает в диапазон, указанный в таблице 11A.
В предпочтительных вариантах реализации изобретения экспериментальная величина или указание о соблюдении заданного условия могут быть сохранены в памяти, например, в считываемых записях на компьютерных носителях.
В предпочтительных вариантах реализации изобретения принимается решение или проводится стадия процесса, например образец классифицируется, проходит отбор, принимается или отбраковывается, ликвидируется или сохраняется, перерабатывается в лекарственный продукт, транспортируется, перемещается в другое место, вводится в лекарственную рецептуру, маркируется, упаковывается, выпускается в коммерческую торговую сеть, продается или предлагается для продажи, либо производится запись или изменение, отражающие вывод о том, соблюдено ли заданное условие. Например, основываясь на результатах определения того, представлены ли в образце одна или более необходимых структур, или на результатах сравнения с эталонным стандартом, партию, из которой был взят образец, могут подвергнуть дальнейшей обработке в соответствии с только что приведенным описанием.
Структуры, представленные в таблице 11A, можно определить при помощи 2D ЯМР или, при необходимости, другими аналитическими методами.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу оценки описанного здесь процесса получения препарата LMWH. Указанный способ включает
получение препарата LMWH, который был проанализирован методом 2D ЯМР;
определение присутствия (или отсутствия) одной и более структур, перечисленных в таблице 11A.
В предпочтительном варианте реализации изобретения указанный способ включает определение того, попадает ли структура, перечисленная в таблице 11A, в заданный диапазон, например диапазон, соответствующий диапазону 1 в таблице 11A. В предпочтительном варианте реализации изобретения количество каждой структуры приблизительно соответствует данным, приведенным в таблице 11A, количество каждой структуры попадает в диапазон, указанный в таблице 11A.
Некоторые способы, описанные здесь, включают определение того, представлен ли необходимый компонент на заданном уровне или в заданном диапазоне при отображении в специфических единицах измерения, например мол.%, например, в диапазоне X-Y мол.%. Можно реализовать способ, определяя количество необходимого компонента в мол.%, а затем сравнивая его с эталонной величиной, также выраженной в мол.%, в данном примере, X-Y мол.%. Однако нет необходимости делать измерения именно в мол.% и сравнивать результаты измерения с эталонными величинами, выраженными в мол.%. Если единицей измерения является мол.%, то фактический уровень необходимого компонента в образце можно представить как X-Y. Этот фактический уровень также можно выразить в других единицах, например в массовых процентах. Фактический уровень компонента остается одним и тем же независимо от единиц измерения и выражения. Спецификация мол.% в указанном способе просто отражает фактическое распространение необходимого компонента. Уровень необходимого компонента можно измерять (выражать) в других единицах, и эталонную величину также можно выражать в других единицах, при том условии, что выражение в других единицах соответствует тому же количеству необходимого компонента относительно эталонной величины, выраженной в мол.%, например X-Y мол.%, как в данном случае. Таким образом, способ, требующий представления необходимого компонента в виде X-Y мол.%, может быть реализован, исходя из того, что необходимый компонент будет представлен в диапазоне, выраженном альтернативными единицами измерения, например массовыми процентами, числом цепей или %AUC, при том условии, что диапазон, выраженный в других единицах измерения, соответствует тому же количеству необходимого компонента, который мог быть выражен в мол.%, в данном примере X-Y мол.%.
Можно установить диапазон функциональной эквивалентности для альтернативных единиц измерения, применяя к этой спецификации способы, известные в данной области знаний. Например, можно охарактеризовать образцы в диапазоне X-Y мол.%, а затем определить соответствующий диапазон для тех же образцов в альтернативных единицах измерения.
Другие отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут более очевидно представлены в последующем подробном описании и прилагаемой формуле изобретения.
Описание чертежей
Прежде всего дается краткое описание чертежей.
Фигура 1 представляет собой блок-схему, отображающую четыре стадии производственного процесса по выработке M118-REH.
Фигура 2A представляет собой график, отображающий профиль капиллярного электрофореза эноксапарина, переваренного гепариназой I, гепариназой II и гепариназой III. Фигура 2B представляет собой график, отображающий профиль капиллярного электрофореза M118-REH, переваренного гепариназой I, гепариназой II и гепариназой III.
Фигура 3 представляет собой график, отображающий сравнение профилей УФ и флуоресценции, порожденных послеколоночным мечением перевара M118-REH при анализе методом ОФ ВЭЖХ (обращенно-фазной хроматографии) с образованием ионных пар. Верхняя кривая отображает выявление УФ 232 нм, а нижняя кривая - выявление флуоресценции на длине волны 410 нм. Разновидности, помеченные стрелками, относятся, главным образом, к профилю флуоресценции и не наблюдаются на профиле УФ, они представляют сахариды нередуцирующих концов цепей M118-REH, которые происходят из начального материала UFH.
Фигура 4 представляет собой график, отображающий двумерный анализ M118-REH методом ЯМР HSQC (гетероядерной одноквантовой корреляции на основе ядерного магнитного резонанса).
Фигура 5 представляет собой диаграмму, демонстрирующую образование редуцирующих и нередуцирующих концов.
Фигура 6 представляет собой блок-схему производственного процесса по выработке инъекционного препарата M118-REH.
Фигура 7 представляет собой график, отображающий нейтрализацию препаратов LMWH протаминсульфатом in vitro. "M118" (условное обозначение M118-REH на этой фигуре) представлен светлой (пунктирной) линией, а эноксапарин-натрий темной (сплошной) линией. График показывает процентную величину остаточной анти-Xa активности в зависимости от соотношения между протамином и активностью LMWH.
Фигура 8 представляет собой график, отображающий высвобождение TFPI (ингибитора метаболического пути тканевого фактора) из эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) в результате воздействия разных гепаринов в дозе 0,01 мг/мл (лунки n=3, средняя ± стандартная ошибка средней). Имеется статистически значимое различие (p<0,01) между M118 (сокращенное обозначение M118-REH на этой фигуре) (второй столбик слева в каждой группе) и контролем (первый столбик слева в каждой группе), как после 24, так и после 48 часов инкубации.
Фигура 9 представляет собой график, отображающий фармакодинамику M118-REH по показателям ACT и aPTT после внутривенной инъекции в модели NHP.
Фигура 10 представляет собой график, отображающий сравнение показателя TTO для M118-REH в дозе 0,5 мг/кг (третий столбик) и 1 мг/кг (шестой столбик) с эноксапарин натрием в дозе 2, 3 и 4 мг/кг (второй, четвертый и пятый столбики соответственно) после внутривенной инъекции в модели тромбоза, индуцированного хлоридом железа. Все группы активной терапии демонстрировали статистически значимое увеличение TTO по сравнению с контролем (первый столбик). Имеется статистически значимое различие (p<0,01) между M118-REH (1 мг/кг) и эноксапарин натрием (3 мг/кг).
Фигура 11 представляет собой график, отображающий нейтрализацию протаминсульфатом анти-Xa активности гепаринов на крысиной модели Sprague-Dawley (M118-REH, эноксапарин натрий и UFH). График отображает процентный показатель остаточной анти-Xa активности в зависимости от времени при соотношениях 0,5 или 1 мг на 100 анти-Xa МЕ протамина к гепарину (либо 0,5 или 1 мг на 1 мг в случае UFH).
Фигура 12 представляет собой график, отображающий корреляцию показателей ACT с анти-Xa активностью M118-REH (треугольники и линия), эноксапарина (кружки и пунктирная линия) и UFH (квадраты и пунктирная линия). Эти данные позволяют предположить, что M118-REH в указанных дозах демонстрирует лучшую корреляцию ACT с анти-Xa активностью по сравнению с эноксапарином и UFH (r2=0,85).
Фигура 13. Активность антифактора Xa (вверху) и антифактора IIa (внизу) в зависимости от времени на собачьей модели тромбоза глубоких артерий (модель Lucchesi). Показанная на графике контрольная группа животных (пустой носитель) позднее получала M118-REH в дозе 150 МЕ/кг. Планки погрешностей соответствуют интервалу ±SE. UFH - нефракционированный гепарин.
Фигура 14. Корреляция активностей антифактора Xa и антифактора IIa на собачьей модели тромбоза глубоких артерий (модель Lucchesi). Отдельные точки представляют данные по одному животному. Показаны все животные во всех группах терапии. Коэффициенты корреляции (r2) составили 0,890 и 0,465 в группах M118-REH и нефракционированного гепарина (UFH) соответственно.
Фигура 15. Отношение активности антифактора Xa к активности антифактора IIa в зависимости от времени на собачьей модели тромбоза глубоких артерий. Планки погрешностей соответствуют + SE (для большей четкости показана только верхняя половина интервала ошибок). UFH - нефракционированный гепарин.
Фигура 16. Коагуляционная активность в зависимости от времени при оценке по показателям анализов ACT (вверху), aPTT (в середине) и PT (внизу) на собачьей модели тромбоза глубоких артерий. Показанная на графике контрольная группа животных (пустой носитель) позднее получала M118-REH в дозе 150 МЕ/кг. Планки погрешностей соответствуют интервалу ±SE. UFH - нефракционированный гепарин.
Фигура 17. Процентная доля животных с закупоркой бедренных артерий на собачьей модели тромбоза глубоких артерий. Животных отслеживали по доплеровскому потоку до 180 минут после возбуждения током. Закупорку определяли по уменьшению потока крови в поврежденной артерии до уровня <2% по сравнению с базовой (начальной) величиной потока. UFH - нефракционированный гепарин.
Подробное описание изобретения
Оптимизированные LMWH
Во многих клинических ситуациях имеющиеся в продаже препараты LMWH более предпочтительны по сравнению в препаратами UFH, поскольку LMWH имеют более предсказуемую фармакокинетику и могут быть использованы для подкожного введения. Однако у современных препаратов LMWH, поступающих в продажу, утрачены многие желательные свойства, которыми обладают препараты UFH, например, существенная анти-IIa активность, обратимость эффекта (или нейтрализация) при воздействии протаминсульфата, а также возможность отслеживания (мониторинга). Таким образом, существуют клинические ситуации, в которых LMWH не являются оптимальным или практичным выбором при лечении. Настоящее изобретение относится к препаратам LMWH, сконструированным с расчетом на клинические преимущества перед другими имеющимися в продаже препаратами LMWH и препаратами UFH. Такие преимущества основаны, например, на одном и более из следующих свойств: обратимость при воздействии протаминсульфата, предсказуемая фармакокинетика, анти-IIa активность, в достаточной степени постоянное соотношение анти-Xa и анти-IIa активностей, мониторинг уровней активности при использовании стандартных методов анализа, например ACT или aPTT, биологическая доступность при подкожном введении, и относительно редкое развитие HIT (тромбоцитопении, индуцированной гепарином).
Анти-II активность
Здесь раскрыты препараты LMWH со значительным числом цепей достаточно большой длины (которые могут быть описаны, например, на основе средней длины цепей в препарате и/или средней молекулярной массы активного вещества в препарате), обладающие анти-IIa активностью, например анти-IIa активностью приблизительно от 50 до 300 МЕ/мг, приблизительно от 70 до 280 МЕ/мг, приблизительно от 90 до 250 МЕ/мг, приблизительно от 100 до 140 МЕ/мг, приблизительно от 100 до 140 МЕ/мг, приблизительно от 150 до 200 МЕ/мг, приблизительно от 130 до 190 МЕ/мг, приблизительно от 155 до 195 МЕ/мг. Анти-IIa активность рассчитывают в международных единицах анти-IIa активности на миллиграмм с применением статистических методов для параллельной группы анализов. Описанный здесь уровень анти-IIa активности измеряют, применяя следующий принцип.
M118 + ATIII → [M118 • ATIII]
IIa
M118 • ATIII→[M118 • ATIII • IIa] + IIa (избыток)
IIa (избыток) + субстрат → пептид + pNA (спектрофотометрическое измерение)
Активность антифактора IIa определяют по потенцирующему воздействию образца на антитромбин (ATIII) при подавлении тромбина. Избыток тромбина можно косвенно измерять методом спектрофотометрии. Активность антифактора IIa можно измерять, например, анализатором Diagnostica Stago или в системе коагуляции ACL Futura™ с реактивами производства компании Chromogenix (субстрат S-2238, тромбин (53 nkat/флакон) и антитромбин), или в любой равноценной системе. Ответ анализатора калибруют, применяя 2-й международный стандарт для гепарина низкой молекулярной массы.
Длина цепей/молекулярная масса
Можно произвести определение того, включает ли препарат LMWH в своей структуре цепи достаточно большой длины, например, определяя среднюю длину цепи в препарате LMWH и/или определяя средневесовую молекулярную массу цепи в препарате LMWH. Если определяют среднюю длину цепи, то ее значение приблизительно от 5 до 20, например, от 7 до 18, предпочтительно, от 9 до 16 или от 8 до 14 дисахаридных повторов указывает на то, что значительное число цепей в препарате LMWH имеют достаточно большую длину.
Понятие "средняя длина цепи" при использовании в данном описании относится к средней длине повторов дисахарида уроновой кислоты/гексозамина, которые встречаются в цепи. Присутствие строительных блоков, не относящихся к уроновой кислоте и/или гексозамину (например, присоединенных компонентов PEG), не входит в определение средней длины цепи. Среднюю длину цепи рассчитывают путем деления среднечисленной молекулярной массы (Mn) на среднечисленную молекулярную массу дисахарида (500 Да). Способы определения среднечисленной молекулярной массы описаны ниже на основе метода SEC MALS.
Примеры таких препаратов LMWH включают следующие:
где R представляет собой H или SO3X,
R1 представляет собой SO3X или COCH3, X представляет собой моновалентный или бивалентный катион (например, Na или Ca), и среднее значение n составляет приблизительно от 9 до 16 или от 8 до 15.
где
R представляет собой H или SO3X,
R1 представляет собой SO3X или COCH3, X представляет собой моновалентный или бивалентный катион (например, Na или Ca), и среднее значение n составляет приблизительно от 9 до 16 или от 8 до 15.
где
X представляет собой моновалентный или бивалентный катион (например, Na или Ca),
R представляет собой H или SO3X,
R1 представляет собой SO3X или COCH3, и
среднее значение n составляет приблизительно от 8 до 12 или от 7 до 11, и
где
X представляет собой моновалентный или бивалентный катион (например, Na или Ca),
R представляет собой H или SO3X,
R1 представляет собой SO3X или COCH3,
среднее значение n составляет от 8 до 12 или от 7 до 11, и
Если определяют средневесовую молекулярную массу препарата, то ее значение приблизительно от 5000 до 9000 Да, приблизительно от 5000 до 8300 Да, предпочтительно, приблизительно от 5500 до 8000 Да, приблизительно от 5700 до 7900, или приблизительно от 5800 до 6800 Да указывает на то, что значительное число цепей в препарате LMWH имеют достаточно большую длину.
Понятие "средневесовая молекулярная масса" при использовании в данном описании относится к средней массе в дальтонах цепей дисахаридных повторов уроновой кислоты/гексозамина. Присутствие строительных блоков, не относящихся к уроновой кислоте и/или гексозамину, не входит в определение средневесовой молекулярной массы. Таким образом, молекулярная масса строительных блоков, не относящихся к уроновой кислоте и/или гексозамину, в цепи или в цепях препарата не должна включаться в определение средневесовой молекулярной массы. Средневесовую молекулярную массу (Mw) рассчитывают на основе следующего уравнения:
Mw = Σ(cimi)/Σci.
Переменная ci представляет собой концентрацию полимера в слое i, а mi представляет собой молекулярную массу полимера в слое i. Суммирование производят по хроматографическому пику, содержащему много слоев данных. Слой данных можно изобразить в виде вертикальной линии на графике хроматографического пика в зависимости от времени. Следовательно, пик элюирования можно разделить на много слоев. Расчет средневесовой молекулярной массы зависит от суммирования всех слоев концентрации и молекулярной массы. Можно измерить также средневесовую молярную массу, например, применяя компьютерную программу Wyatt Astra или любое подходящее программное обеспечение. В соответствии с приведенным здесь описанием средневесовую молекулярную массу определяют высокоэффективной жидкостной хроматографией с двумя колонками в серии, например, TSK G3000 SWXL и G2000 SWXL, последовательно соединенных с детектором многоуглового светорассеяния (MALS) и рефрактометрическим детектором. В качестве элюента используется 0,2 сульфат натрия, pH 5,0, при скорости потока 0,5 мл/мин.
Структура нередуцирующего конца
В дополнение к длине цепи приблизительно от 5 до 15 мол.%, от 7 до 14 мол.% или от 9 до 12 мол.% цепей в препарате могут иметь структуру ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S на нередуцирующем конце цепи или на расстоянии порядка двух, четырех или шести моносахаридов от этого конца. Способы, которые можно использовать для количественной оценки этой структуры, включают, например, капиллярный электрофорез (КЭ) и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), в частности обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ОФ ВЭЖХ). Для количественного определения мол.% ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S в препарате LMWH можно определить коэффициент чувствительности (RF) детектора для ΔUHNAc,6sGHNs,3S,6S. Определение также может включать уточнение RF для всех полученных разновидностей, например, с применением КЭ или ВЭЖХ, в частности, описанной здесь методики КЭ. Для того чтобы получить показатель RF для какой-либо разновидности или всех наблюдаемых разновидностей при помощи КЭ, например, описанной здесь методики КЭ, можно впрыснуть в КЭ известные концентрации стандарта для одной или более разновидностей, используя их для определения RF применительно к каждой разновидности. Полученные значения RF можно использовать для определения мол.%. Как описано здесь, образец имеет фактический уровень структуры, которая может экспрессироваться, например, от 5 до 15 при описании в таких единицах, как мол.%. Этот фактический уровень также можно выразить в других единицах, например в массовых процентах. Фактический уровень компонента остается одним и тем же, независимо от единиц измерения, в которых он выражен. Спецификация в таких единицах, как мол.% в указанном способе просто отражает фактическое распространение структуры. Уровень структуры можно измерять (выражать) в других единицах и эталонную величину также можно выражать в других единицах при том условии, что выражение в других единицах соответствует тому же количеству структуры относительно эталонной величины, выраженной в мол.%, например, от 5 до 15 мол.%, как в данном случае. Таким образом, способ, требующий представления структуры в виде 5-15 мол.%, может быть реализован, исходя из того, что структура будет представлена в диапазоне, выраженном альтернативными единицами измерения, например массовыми процентами, числом цепей или %AUC, при том условии, что диапазон, выраженный в других единицах измерения, соответствует тому же количеству структуры, которое могло быть выражено в мол.%, в данном примере от 5 до 15 мол.%.
Описанный здесь препарат LMWH может содержать на нередуцирующем конце цепей смесь ΔU и идуроновой кислоты (I)/глюкуроновой кислоты (G). Номенклатура "ΔU" относится к ненасыщенной уроновой кислоте (идуроновой кислоте (I), глюкуроновой кислоте (G) или галактуроновой кислоте), которая имеет двойную связь, введенную в 4-5 положении в результате, например, лиазного действия гепариназы, HSGAG-лиазы или другого фермента, обладающего сходной субстратной специфичностью. Предпочтительно, чтобы приблизительно от 15 до 35%, от 20 до 30% (например, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%) общего числа цепей в препарате имели ΔU на нередуцирующем конце цепи. Количество ΔU и/или I/G на нередуцирующем конце цепей в образце можно определить, например, методом 2D-ЯМР. В таких способах для определения общего числа цепей в препарате можно использовать число цепей, имеющих на редуцирующем конце ацетилированный гексозамин (HNAс), и/или число подтвержденных открытых колец на редуцирующем конце. Общую процентную долю цепей, имеющих ΔU и/или I/G на нередуцирующем конце, можно сопоставлять с общим числом цепей в препарате. Предпочтительно, чтобы в описанном здесь препарате LMWH сульфатированную ΔU на нередуцирующем конце имели менее 90%, 95%, 98%, 99% цепей или вообще не имела ни одна из цепей.
Структуры редуцирующего конца
В некоторых случаях предложенный здесь препарат LMWH по существу не имеет модифицированных структур на редуцирующем конце. В предпочтительных вариантах реализации изобретения по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или все цепи в препарате LMWH имеют на редуцирующем конце немодифицированную структуру.
Понятие "модифицированная структура на редуцирующем конце" относится к структуре, которая появляется на редуцирующем конце цепей препарата вследствие процесса выделения или приготовления препарата из природных источников. Например, многие имеющиеся в продаже препараты LMWH получены из нефракционированного гепарина, прежде всего, посредством химической или ферментативной деполимеризации полисахаридных цепей. Процесс, применяемый для получения LMWH, может вызвать одну или более уникальных структурных модификаций на редуцирующем конце полисахаридных цепей исходного материала из природного источника. Например, деполимеризация гепарина азотистой кислотой приводит к образованию 2,5-ангидроманнозы на редуцирующем конце, которая может быть восстановлена с образованием спирта, а также к деполимеризации через эстерификацию карбоксильной функциональной группы уроновой кислоты с последующим β-элиминированием, приводящей к образованию 1,6-ангидро-структур на редуцирующем конце некоторых цепей. Таким образом, 2,5-ангидроманноза и 1,6-ангидро-структуры являются примерами модифицированных структур на редуцирующем конце, которые можно обнаружить в некоторых цепях LMWH. Цепи в предложенном здесь препарате LMWH могут включать, например, по меньшей мере приблизительно 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или все цепи, имеющие на редуцирующем конце ацетилированный гексозамин.
Анти-Xa активность
Активность антифактора Xa играет роль в биологической активности препаратов LMWH. В предпочтительном варианте предлагаемый здесь препарат LMWH обладает анти-Xa активностью на уровне приблизительно от 100 до 400 МЕ/мг, например, приблизительно от 120 до 380 МЕ/мг, приблизительно от 150 до 350 МЕ/мг, приблизительно от 170 до 330 МЕ/мг, приблизительно от 180 до 300 МЕ/мг, например, приблизительно от 150 до 200 МЕ/мг и от 200 до 300 МЕ/мг. Анти-Xa активность препарата LMWH рассчитывают в международных единицах активности антифактора Xa на миллиграмм в параллельной группе анализов. Описанную здесь активность антифактора Xa для препаратов LMWH измеряют, применяя следующий принцип:
M118 + ATIII → [M118 • ATIII]
FXa
M118 • ATIII → [M118 • ATIII • FXa] + FXa(избыток)
FXa (избыток) + субстрат → пептид + pNA (спектрофотометрическое измерение)
Активность антифактора Xa определяют по потенцирующему воздействию образца на антитромбин (ATIII) при подавлении активированного фактора Xa (FXa). Избыток фактора Xa можно косвенно измерять методом спектрофотометрии. Активность антифактора Xa, можно измерять, например, анализатором Diagnostica Stago с набором для анализа гепарина Stachrom®, в системе коагуляции ACL Futura™ с гепариновым набором Coatest® производства компании Chromogenix или в любой равноценной системе. Ответ анализатора можно калибровать, применяя международный стандарт NIBSC для гепарина низкой молекулярной массы.
Соотношение анти-Xa/IIa
В некоторых аспектах предлагаемые здесь препараты LMWH имеют соотношение между анти-Xa активностью и анти-IIa активностью 3:1 или менее, например 2:1, 1,6:1, 1,5:1, 1,4:1, 1,3:1, 1,2:1, 1,1:1, 1:1. Способы определения активности антифактора Xa и активности антифактора IIa были описаны выше. Отношение активности антифактора Xa к активности антифактора IIa рассчитывают делением показателя активности антифактора Xa (сухой вес) на показатель активности антифактора IIa (сухой вес).
Активность гепарина и препаратов LMWH как типа анти-Xa, так и типа анти-IIa вовлекает связывание антитромбина III (ATIII) со специфической последовательностью, представленной структурой ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S в тех цепях, которые имеются в препарате. Связывание ATIII с этой последовательностью опосредует анти-Xa активность. В дополнение к этому, тромбин (фактор IIa) связывает гепарины в участке, соседствующем с сайтом связывания ATIII. В отличие от анти-Xa активности, для которой необходим только сайт связывания с ATIII, анти-IIa активность требует не только присутствия сайта связывания с ATIII, но и наличия цепи достаточно большой длины, расположенной дистальнее сайта связывания ATIII. Анти-IIa активность предлагаемых изобретением препаратов LMWH можно приписать, по меньшей мере частично, присутствию ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S на нередуцирующем конце или поблизости от нередуцирующего конца цепей в этих препаратах, а также длине многих цепей, присутствующих в препарате. Такая комбинация может привести к наличию в препарате цепей, которые вносят вклад как в анти-Xa активность, так и в анти-IIa активность. Когда и анти-Xa активность, и анти-IIa активность создаются одной и той же цепью или цепями, клиренс этой цепи или цепей может привести к снижению обоих типов активности: и антифактора Xa, и антифактора IIa. Анти-Xa активность и анти-IIa активность, как таковая, может оставаться относительно стабильной в течение всего времени введения препарата. Следовательно, в некоторых аспектах, предлагаемые здесь препараты LMWH сохраняют относительно постоянное соотношение между анти-Xa и анти-IIa активностями в течение всего времени введения этих препаратов, например, отношение анти-Xa активности к анти-IIa активности варьируется приблизительно в диапазоне ±1,5, ±1, ±0,5 или ±0,2 на протяжении приблизительно 30, 60, 120, 180, 240, 300 минут. Например, если начальное отношение анти-Xa активности к анти-IIa активности равно 2, то предпочтительно, чтобы при повторном измерении (например, через 30, 60, 120, 180, 240, 300 минут после начального введения препарата) оно составляло менее 3, предпочтительнее, приблизительно 2.
Нейтрализация
Действие предлагаемых здесь препаратов LMWH может быть нейтрализовано протаминсульфатом. Например, при введении протамина анти-IIa активность и/или анти-Xa активность можно нейтрализовать по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или на 100%. В продажу поступает протаминсульфат производства, например, фармацевтической компании Eli Lilly and Company. Нейтрализацию анти-Xa активности и анти-IIa активности можно измерять, например, стандартными методами анализов коагуляции, такими как ACT и aPTT, которые оба описаны в другом месте этой заявки. Протаминсульфат можно вводить внутривенно, например, в дозе приблизительно 1, 2, 3 мг на 100 анти-Xa МЕ препарата LMWH в плазме. В предпочтительном варианте протаминовая нейтрализация анти-Xa активности и/или анти-IIa активности происходит в течение 5, 10, 15, 20, 25 или 30 минут после введения протаминсульфата.
Полидисперсность
Полидисперсность предлагаемых настоящим изобретением препаратов LMWH составляет приблизительно 1,6 или менее, например, приблизительно от 1,6 или 1,5 до 1,1, включая все промежуточные значения.
Термин "полидисперсный" или "полидисперсность" относится к средневесовой молекулярной массе композиции (Mw), деленной на среднечисленную молекулярную массу (Mn). Среднечисленную молекулярную массу (Mn) рассчитывают по следующему уравнению:
Mn = ∑ci/(∑ci/mi).
Переменная ci представляет собой концентрацию полисахарида в слое i, а mi представляет собой молекулярную массу полисахарида в слое i. Суммирование производят по хроматографическому пику, содержащему много слоев данных. Слой данных можно изобразить в виде вертикальной линии на графике хроматографического пика в зависимости от времени. Следовательно, пик элюирования можно разделить на много слоев. Среднечисленная молекулярная масса зависит от фактической молекулярной массы и концентрации в каждом слое данных. Способы определения средневесовой молекулярной массы были описаны выше и также использованы для определения полидисперсности.
Для любых приведенных здесь диапазонов, например, относящихся к определенной структуре или активности, значения могут совпадать с раскрытыми здесь, но могут быть и другими. Так, диапазон, построенный от нижней точки одного диапазона, например определенного строительного блока или активности, может быть объединен с верхней точкой другого диапазона, например определенного строительного блока или активности, создавая новый диапазон.
"Выделенный" или "очищенный" препарат LMWH по существу свободен от клеточного материала или других загрязняющих белков клеточного или тканевого происхождения из тех источников, которые используются для получения LMWH, либо по существу свободен от химических предшественников или других химических веществ в тех случаях, когда его получают методом химического синтеза. Понятие "по существу свободен" означает, что степень чистоты препарата LMWH составляет по меньшей мере 50% (масс./масс.). В предпочтительном варианте реализации изобретения препарат LMWH содержит менее приблизительно 30%, 20%, 10% или, более предпочтительно, 5% (по сухому весу), негепариновых полисахаридов, белков или химических предшественников или других химических веществ, например, связанных с производственным процессом. Эти вещества могут также упоминаться здесь как "загрязнения". Примеры загрязнений, которые могут быть представлены в препарате LMWH, предлагаемом настоящим изобретением, включают, но не ограничиваясь ими, кальций, натрий, фермент гепариназу (или другой фермент, обладающий сходной субстратной специфичностью), метанол, этанол, хлорид, сульфат, дерматансульфат и хондроитинсульфат.
Способы мониторинга активности препаратов LMWH
Активность препарата LMWH, предлагаемого настоящим изобретением, можно отслеживать стандартными методами анализов антикоагуляции. Такие анализы включают, например, ACT и aPTT, которые входят в число стандартных больничных анализов и особенно часто применяются в повседневной практике операционных блоков больниц.
ACT - это аналитический тест, который применяют для мониторинга эффективности гепариновой терапии. Анализ ACT можно проводить прямо у постели пациента, например, в случаях легочной эмболии, экстракорпоральной мембранной оксигенации (ECMO) и гемодиализа. Мониторинг по ACT чаще всего проводят перед, во время или после хирургического вмешательства, например кардиопульмонарного шунтирования (CPB), PCI и установки стента. Эталонная величина ACT может варьироваться в диапазоне 70-180 секунд. Однако для некоторых процедур, таких как CPB, желательный диапазон ACT может превышать 400-500 секунд. Для определения времени образования сгустка методика ACT использует отрицательно заряженные частицы. Примеры различных частиц, которые можно использовать, включают целит, который имеет нормальный показатель длительности ACT приблизительно от 100 до 170 секунд, каолин с нормальным показателем длительности ACT приблизительно от 90 до 150 секунд и частицы стекла с нормальным показателем длительности ACT приблизительно от 190 до 300 секунд. Подходящие аппараты для измерения ACT включают, например, Hemochron и Medtronic HemoTec.
В аналитическом тесте aPTT, также известном под названием "частичное тромбопластиновое время" или "PTT", используется контактный активатор для стимуляции выработки фактора XIIa посредством реализации на поверхности контакта функции кининогена высокой молекулярной массы, калликреина и фактора XIIa. Эта контактная активация происходит в течение определенного промежутка времени. Затем добавляют кальций для запуска дальнейших реакций и измеряют время, необходимое для образования сгустка. В этом процессе необходимы фосфолипиды, способствующие образованию комплексов, которые активируют фактор X и протромбин. Показатели APTT можно измерять при помощи IL TestTM APTT-SP (жидкость). Эталонные величины aPTT составляют приблизительно от 25 до 35 секунд. Удлинение aPTT указывает на то, что свертывание крови длится дольше ожидаемого, например, вследствие лечения гепарином или LMWH.
Способы получения препаратов LMWH
В настоящем изобретении также рассматриваются различные способы получения препаратов LMWH, например, описанного здесь препарата LMWH. Например, такие способы включают способ получения препарата LMWH, имеющего среднюю длину цепи приблизительно от 8 до 16 или от 9 до 16 дисахаридов. Указанный способ включает получение препарата-предшественника LMWH со средней длиной цепи менее чем 8-16 или 9-16 дисахаридов и переработку препарата-предшественника LMWH для получения конечного препарата LMWH со средней длиной цепи приблизительно от 8 до 16 или от 9 до 16 дисахаридов. Предпочтительно, чтобы препарат-предшественник имел среднюю длину цепи приблизительно от 8 до 14, например, от 8 до 12 дисахаридов. Например, препарат-предшественник LMWH может иметь следующую структуру:
X представляет собой моновалентный или бивалентный катион (например, Na или Ca),
R представляет собой H или SO3X,
R1 представляет собой SO3X или COCH3,
n = 2-45, например, 2-35, и
предпочтительно, чтобы композиция имела среднее значение n от 7 до 13, например, от 7 до 11 или от 8 до 12.
Препарат-предшественник LMWH, используемый в этом методе, можно получить таким способом, который включает солевое осаждение и последующее ферментативное переваривание. В указанном способе получения препарата-предшественника LMWH можно использовать соль моновалентного или бивалентного катиона. Примеры моновалентных и бивалентных катионов, пригодных для применения, включают, например, натрий, калий, рубидий, цезий, барий, кальций, магний, стронций и их комбинации. Соль может быть, например, ацетатом моновалентного или бивалентного катиона. Ферментативное переваривание для получения предшественника LMWH может включать применение одного или более ферментов, которые расщепляют одну или более гликозидных связей в несульфатированных уроновых кислотах. Примеры таких ферментов включают гепариназу III, мутантные формы гепариназы III и HSGAG-лиазу III из Bacteroides thetaiotaomicron. Гепариназа III описана, например, в патентах США №№ 5681733 и 5919693. Мутанты гепариназы III описаны в патенте США № 5896789. Предпочтительные мутанты гепариназы III имеют одно или более замещение гистидина аланином в положениях His36, His1O5, His110, His139, His152, His225, His234, His424, His469 и His539.
Препарат-предшественник LMWH можно перерабатывать сепарацией, основанной на разделении по размеру, например, вытеснительной хроматографией, ионообменной хроматографией и фильтрацией. Для получения лекарственного продукта перед разделением по размеру можно задействовать другие стадии переработки.
Термин "лекарственный продукт" относится к препарату LMWH, имеющему такую степень чистоты, которая требуется для введения в рецептуры, пригодные для фармацевтического применения.
Термин "лекарственное вещество" относится к препарату LMWH, имеющему полисахаридные компоненты для фармацевтического применения, но необязательно в конечной форме и/или содержащему одно или более загрязнений, не входящих в конечный состав продукта (например, один или более неорганических продуктов, таких как сульфат, хлорид, белковое загрязнение, побочные продукты процесса, такие как гепариназа, кальций, натрий).
Другие способы получения препарата LMWH в соответствии с изобретением включают получение "фракции с высокой подвижностью" из образца, содержащего гликозаминогликан (GAG), например, из UFH. Фракцию с высокой подвижностью можно получить следующим образом:
(1) проведением образца, содержащего GAG, например, UFH, через первое осаждение, например, полярным органическим растворителем (например, спиртом, например, этанолом), полярным неорганическим растворителем (например, водой) и солью (предпочтительно, солью натрия, например, ацетатом натрия) для получения первого супернатанта,
(2) проведением первого супернатанта через второе осаждение, например, полярным органическим растворителем (например, спиртом, например, этанолом) и полярным неорганическим растворителем (например, водой) для получения осадка (этот осадок содержит фракцию с высокой подвижностью), и
(3) в предпочтительном варианте, солюбилизацией осадка.
Фракции образца, содержащие GAG, например, UFH, полученные другими способами, способными производить достаточно равноценный материал, например, имеющий длину цепи порядка 9-16 дисахаридов, также можно использовать как фракцию с высокой подвижностью.
В некоторых вариантах реализации изобретения фракция с высокой подвижностью имеет следующую структуру:
где
X представляет собой Na или Ca,
R представляет собой H или SO3Na,
R1 представляет собой SO3Na или COCH3,
n = 2-50, например, 2-40, и
предпочтительно, чтобы композиция имела среднее значение n от 9 до 16 или от 8 до 15.
Такая композиция может представлять собой промежуточный продукт для получения LMWH, например, продукт выпадения в осадок фракции с высокой подвижностью (как это обсуждается здесь).
Для получения LMWH, предлагаемого изобретением, фракцию с высокой подвижностью можно подвергнуть дальнейшей переработке. Переработка фракции с высокой подвижностью может включать переваривание фракции с высокой подвижностью химическим веществом или ферментом, способным расщеплять одну или более гликозидных связей в несульфатированной уроновой кислоте, например, одну или более гликозидных связей в несульфатированной уроновой кислоте, прилегающей к остатку N-ацетилглюкозамина, что позволяет получить препарат с описанными здесь качественными характеристиками. Ферменты можно оценивать по специфичности к субстрату следующими стадиями: 1) функциональный скрининг активности фермента в отношении двух субстратов HSGAG, имеющих разную плотность сульфатирования, например, гепарина и гепарансульфата, причем выбираются ферменты, имеющие большую специфичность к гепарансульфату, чем к гепарину, 2) фрагментарное картирование расщепленных субстратов из 1-й стадии для оценки субстратной специфичности, 3) расщепление промежуточного LMWH из 1-й стадии, например, M118-REH, или далтепарина ферментом, а также последующие стадии: 4) оценка анти-Xa активности и анти-IIa активности расщепленного субстрата и применение анализа in vitro и 5) оценка распределения по молекулярному весу (или по средней длине цепи) расщепленного субстрата с применением гель-проникающей хроматографии (GPC) и/или вытеснительной хроматографии в сочетании с многоугловым светорассеянием (SEC-MALS).
На 1-й стадии оценивают способность фермента действовать как HSGAG-лиаза, что можно идентифицировать по способности генерировать ненасыщенную связь C4-C5 на нередуцирующем конце продуктов расщепления, а также предпочтительному взаимодействию фермента с ненасыщенными субстратами, например гепарансульфатом. Активность фермента можно отслеживать спектрофотометрически посредством мониторинга УФ-поглощения на длине волны 232 нм. Поглощение на этой длине волны указывает на образование ненасыщенных уроновых кислот на нередуцирующих концах продукта расщепления. Активность фермента отслеживают как кинетически (по начальной скорости образования продукта), так и с точки зрения тотального образования продукта после полного переваривания (приблизительно от 12 до 15 часов). Предпочтительные ферменты обладают примерно вдвое большей активностью в отношении гепарансульфата по сравнению с гепарином и более чем двукратное (например, от 3 до 5 раз) различие по общей активности.
На второй стадии оценивают специфичность расщепления, осуществляемого ферментом. Ферменты, пригодные для получения описанных здесь композиций LMWH, преимущественно расщепляют недостаточно насыщенные области молекул гепарина и гепарансульфата. Если в качестве субстрата используют UFH, то это предпочтение демонстрируется очевидно недостаточным расщеплением субстрата (о чем свидетельствует присутствие удлиненных олигосахаридов) с выработкой любых дисахаридов, имеющих низкую плотность сульфатов. В отличие от этого, если в качестве субстрата используют гепарансульфат, то расщепление приводит в появлению большего количества дисахаридов, что свидетельствует о более высокой частоте разрезания.
Остальные стадии (3-5) могут быть проведены так, как это описано здесь в другом месте.
Примеры ферментов включают гепариназу III, мутантные формы гепариназы III и HSGAG-лиазу из Bacteroides thetaiotaomicron. В некоторых вариантах реализации изобретения фракцию с высокой подвижностью обрабатывают по меньшей мере частично, мутантной гепариназой III, которая в 225-м остатке аминокислотной последовательности имеет замену гистидина на аланин. Этот фермент также упоминается под названием "MO11".
Переваренный препарат LMWH может представлять собой конечный продукт, например лекарственное вещество или лекарственный продукт, либо может подвергаться дальнейшей переработке для получения конечного продукта, например лекарственного вещества или лекарственного продукта. Концентрированный препарат LMWH может подвергаться дальнейшей переработке, например, одним или более способов разделения по размеру (например, вытеснительной хроматографией, ионообменной хроматографией с фильтрацией), а также методом фильтрации. В предпочтительном варианте реализации изобретения концентрированный препарат LMWH подвергают дальнейшей переработке с разделением по размеру, причем полученный на этой стадии препарат LMWH имеет среднюю длину цепи приблизительно от 9 до 16 дисахаридов.
Способы оценки процесса получения препаратов LMWH
Капиллярный электрофорез
Ферменты
Анализ препаратов LMWH, например препарата M118-REH, с применением КЭ включает, например, расщепление препарата одним или более ферментом, разрушающим гепарин. Ферментом (ферментами), разрушающим гепарин, может быть одна или более гепариназ, гепариновая лиаза, HSGAG-лиаза, лиаза, описанная как GAG-лиаза, которая также разрушает гепарин, и/или любой полипептид, описанный как гидролаза, сульфатаза/сульфогидролаза или гликозилгидролаза/гликозидаза. Например, препарат LMWH может быть переварен одним или более из следующих ферментов: ненасыщенная глюкуронилгидролаза (например, Δ4,5 глюкуронидаза F. heparinum, Δ4,5 глюкуронидаза B. thetaiotaomicron), глюкуронилгидролаза (например, α-идуронидаза млекопитающих, β-глюкуронидаза), сульфогидролаза (например, 2-O-сульфатаза F. heparinum, 6-O-сульфатаза, 3-O-сульфатаза, 6-O-сульфатаза B. thetaiotaomicron, муцин-десульфатирующий фермент, N-ацетилглюкозамин-6-сульфатаза млекопитающих, 2-сульфатаза идуроновой кислоты млекопитающих), N-сульфамидаза (например, N-сульфамидаза F. heparinum, гепаран-N-сульфатаза млекопитающих), арилсульфатаза, гексозаминидаза, гликозилгидролаза (например, эндо-N-ацетилглюкозаминидаза), гепариназа (например, гепариназа I Flavobacterum heparinum, гепариназа II Flavobacterum heparinum, гепариназа III Flavobacterum heparinum, гепариназа IV Flavobacterum heparinum), эндоглюкуронидаза (например, гепариназа млекопитающих), гепарин/гепаран сульфат лиаза (например, HSGAG-лиаза I Bacteroides thetaiotaomicron, HSGAG-лиаза II Bacteroides thetaiotaomicron, HSGAG-лиаза III Bacteroides thetaiotaomicron, GAG-лиаза IV Bacteroides thetaiotaomicron), а также их функциональные фрагменты и варианты. К этим ферментам также относятся полипептиды, описанные выше (например, гепариназа или гепарин/гепарансульфат-лиаза), которые получены из других микроорганизмов помимо Flavobacterium heparinum (также известного под названием Pedobacter heparinus) или Bacteroides thetaiotaomicron. Например, Haloarcula marismortui, Agrobacterium tumefaciens, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus intermedius, Streptococcus suis, Enterococcus faecalis, Rhodopseudomonas palustris, Nitrobacter winogradskyi, Nitrobacter hamburgensis, Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium meloliti, Mesorhizobium loti, Spinghobacterium sp., Brucella abortus biovar, Brucella melitensis, Solibacter usitatus, Acidobacterium capsulatum, Microbulbifer degradans, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia pseudomonascepacia, Geobacter metallireducens, Prevotella sp., Serrata marcescens, Cornybacterium sp., Anaeromyxobacter dehalogenans, Rhodopirellula baltica, Pirellula marina и/или GeмМata obscuriglobus.
Предпочтительно, чтобы по меньшей мере один фермент, используемый для переваривания, был выбран по специфичности расщепления связей в гепарине. Например, этим ферментом может быть гепариназа I и/или HSGAG-лиаза I. В одном из вариантов реализации изобретения препарат LMWH переваривается гепариназой I Flavobacterium heparinum. В других вариантах реализации изобретения препарат гепарина переваривается HSGAG-лиазой I Bacteroides thetaiotaomicron.
Для переваривания можно выбирать и другие ферменты, если они способны расщеплять те структуры, которые не расщепляются при использовании только гепариназ I, II и III. Любые описанные здесь ферменты можно заменять другими ферментами с функционально равноценной активностью.
В предпочтительном варианте реализации изобретения переваривание проводят до завершения или по меньшей мере в достаточной степени для того, чтобы получить перевар, который содержит все продукты, перечисленные в таблице 10A и, предпочтительно, по существу, свободные от непереваренного материала.
Перед перевариванием образец можно лиофилизировать. Например, образец можно высушить в вакуумной печи, например, при температуре приблизительно 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 43°C, 46°C, 49°C, 52°C или 55°C в течение приблизительно 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24 часов. Например, образец можно лиофилизировать и/или высушить, соблюдая одно из следующих условий: например, образец можно лиофилизировать и/или высушить, соблюдая одно из следующих условий: 40°C в течение 12 часов, 46°C в течение 8 часов, 49°C в течение 6 часов, 52°C в течение 4 часов. Образец можно суспендировать в воде или в подходящем буфере (например, в 1 мМ ацетате кальция, 25 мМ ацетате натрия, pH 7,0 и 5% глицине) при концентрации приблизительно 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 или 500 мг/мл. К образцу можно добавлять один или более ферментов, разрушающих гепарин. В некоторых вариантах реализации изобретения к образцу добавляют гепариназу I или HSGAG-лиазу I (либо комбинацию этих ферментов), гепариназу II или HSGAG-лиазу II (либо комбинацию этих ферментов), а также гепариназу III или HSGAG-лиазу III (либо комбинацию этих ферментов). Образец подвергают перевариванию при температуре приблизительно 18°C, 25°C, 30°C, 37°C или 45°C в течение приблизительно 6, 12, 16, 18, 20 или 24 часов, например приблизительно при 25°C в течение 24 часов, при 30°C в течение приблизительно 18 часов, приблизительно при 37°C в течение 12 часов.
После переваривания фермент или ферменты удаляют из реакционной смеси, например, применяя колонку Ni2+, колонку с исключением по размеру, диализ, ультрафильтрацию и т.п. средства. После переваривания фермент или ферменты можно инактивировать нагреванием (например, при 65°C в течение 20 минут). В промежутке времени перед проведением анализа образец можно хранить, например, при температуре -85°C, -70°C, -20°C, 4°C, 18°C или 25°C.
Образцы, разделенные описанными здесь способами, можно исследовать разными приемами, например поглощением ультрафиолетовых лучей (например, с длиной волны 232 нм), испарительным светорассеянием, флуоресценцией, пульсирующей амперометрией и масс-спектрометрией. В некоторых вариантах реализации изобретения можно при исследовании одного и того же образца задействовать два или более средства выявления, например, последовательно или параллельно.
Для переваривания образца можно также использовать дополнительные ферменты. Например, это могут быть гепариназа I или HSGAG-лиаза I (либо комбинация этих ферментов), гепариназа II или HSGAG-лиаза II (либо комбинация этих ферментов), гепариназа III или HSGAG-лиаза III (либо комбинация этих ферментов), а также 2-O сульфатаза, Δ4,5 глюкуронидаза и/или гепариназа I или HSGAG-лиаза I (либо комбинация этих ферментов), гепариназа II или HSGAG-лиаза II (либо комбинация этих ферментов), гепариназа III или HSGAG-лиаза III (либо комбинация этих ферментов), которые можно применять для переваривания и, например, выявления посредством вышеописанных способов.
Продукты переваривания анализируют с применением инструмента Agilent 3D для капиллярного электрофореза. Капилляр представляет собой удлиненный световод из кварцевого стекла без покрытия с внутренним диаметром 75 мкм, эффективной длиной 72 см. В качестве буфера для КЭ применяют трис (50 мМ), 10 мкМ декстрансульфата с pH 2,5. Образцы впрыскивают под давлением 30 мбар в течение 20 секунд. Разделение проводят на обратной полярности, а вещество, определяемое при анализе, отслеживают на длине волны 232 нм при эталонной длине волны 310 нм. Новые капилляры предварительно обрабатывают в такой последовательности: вода, 1н гидроксид натрия, вода и сепарационный буфер. При каждом анализе образца капилляр предварительно обрабатывают буфером в течение 5 минут.
Дополнительную информацию по поводу описанных здесь способов можно найти, например, в ссылках: Linhardt et al. (1988) Biochem. J., 254:781-787; Chuang et al. (2001) J. Chromatogr. A, 932:65-74; and Yates et al. (2004) J. Med. Chem., 47:277-280, and Rhomberg et al. (1988) Proc Natl Acad Sci U S A. 95(8):4176-81.
Капиллярный электрофорез
Капиллярный электрофорез (КЭ) с применением, например, капилляра из кварцевого стекла без покрытия можно использовать для анализа LMWH, например, описанного здесь препарата LMWH. В условиях низкого pH необходимость разделения почти исключительно диктуется электрофоретической подвижностью анализируемого вещества. В связи с тем фактом, что все сахариды, относящиеся к LMWH, имеют общий отрицательный заряд из-за наличия таких компонентов, как карбоксилаты и сульфаты, разделение проводят в условиях обратной полярности. Кроме того, дополнительное внесение буфера из декстрансульфата с низким pH (2,5) предупреждает неспецифическую абсорбцию анионного гепариноподобного материала, что способствует симметричным очертаниям пиков и делает возможной точную квантификацию.
Биохимические разновидности в препарате LMWH можно разделить серийной последовательностью из пяти перевариваний (что подробно обсуждается здесь в другом месте), причем материал, полученный в результате каждого переваривания, подвергают капиллярному электрофорезу после добавления моносульфата нафталина в качестве внутреннего стандарта.
При помощи КЭ разделяют 14 индивидуальных компонентов (см., например, таблицу 10 в этом документе).
Восстановление массы в методологии анализа композиций оценивали следующим образом. Этот анализ проводили на двух уровнях: (1) восстановление массы после ферментативного переваривания и (2) восстановление массы после разделения капиллярным электрофорезом.
ЯМР (ядерный магнитный резонанс)
Двумерную спектроскопию на основе ядерного магнитного резонанса (2D ЯМР) можно использовать как средство для частичного разделения и идентификации сигналов с минимальным наложением друг на друга. Интегрирование сигналов 2D ЯМР с последующими несложными вычислениями помогает облегчить количественный композиционный анализ моносахаридов в полисахаридной смеси, например анализ препаратов LMWH, таких как описаны здесь.
Кроме того, методика 2D ЯМР может дать информацию об окружении соединений дисахаридной составляющей, например дисахарида H-U, что создает основу для анализа дисахаридных соединений, включая качественные и количественный анализ. В некоторых вариантах реализации изобретения анализ 2D ЯМР может дать информацию о состоянии эпимеризации соединения H-U, например информацию о том, связано ли состояние эпимеризации с остатком идуроновой кислоты или с остатком глюкуроновой кислоты (т.е. I или U).
В некоторых вариантах реализации изобретения эксперимент по методу 2D протонно-углеродной корреляционной спектроскопии (HSQC) может обеспечить количественный анализ композиции одного или более гликозаминогликанов. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения анализ методом 2D ЯМР может дать информацию о ближайшем окружении редуцирующего конца моносахарида. Такую информацию может дать, например, контекст последовательности, в котором конкретный моносахарид представлен в полисахаридной смеси, например, для LMWH, в частности, для описанного здесь препарата LMWH.
В некоторых вариантах реализации изобретения анализ методом 2D ЯМР позволяет провести различие между внутренними остатками и остатками редуцирующего конца. Идентификация измеряемого количества редуцирующего N-ацетилглюкозамина особенно специфична для описанных здесь LMWH.
В некоторых вариантах реализации изобретения анализ методом 2D ЯМР может дать информацию о нередуцирующих концах цепей LMWH, то есть о количестве ΔUAp2-OH, образовавшегося в результате ферментативного переваривания.
В некоторых вариантах реализации изобретения метод 2D ЯМР можно использовать для оценки полисахаридной смеси на наличие одной или более загрязняющих примесей, например дерматансульфата. Например, отсутствие сигнала в протонном ЯМР на уровне 2,06-2,09 м.д. может служить подтверждением того, что дерматансульфат не представлен на более высоком уровне, чем пороговый уровень выявления для данного инструмента (например, на уровне выше 1%).
В предпочтительном варианте реализации изобретения структуру сахарида оценивают, применяя 2D ЯМР, например, для анализа образца полисахаридной смеси с замещением D2O, лиофилизированной в течение ночи и повторно растворенной в D2O. Затем образец помещают в пробирку ЯМР для анализа и делают прогон на 303 K со спектрометром Bruker Avance 600 Мгц, оснащенным 5-мм датчиком TXI. Спектры HSQC с усиленным градиентом записывают с отщеплением углерода во время захвата. Затем получали данные с 16 сканированиями по каждому из 256 приращений в непрямом 13C-измерении. Задержку переноса поляризации устанавливают на 2,941 мс для оптимального переноса со скалярной связью IJCH 155 герц.
Затем данные в целом обрабатывают, например, матрицу размером 1K×256 обнуляют до 2K×1K, применяя квадратную косинусоидную функцию перед преобразованием Фурье. Пересекающиеся пики объединяют, например, применяя компьютерную программу MestreC 4.5, причем для объединения используют только положительные пики. Интегралы нормализуют по пику H2/C2 N-сульфатированного глюкозамина (3,26/60,5 м.д.). Пики в целом распределяют, используя опубликованные данные по химическим сдвигам и экспериментальные распределения, полученные в экспериментах COSY и TOCSY.
Процентный состав композиции рассчитывают, используя аномерные объемы пересекающихся пиков, применительно к которым все остатки уроновой кислоты имеют сходные соединения 1JCH со всеми остатками глюкозамина. Для аномерных пиков глюкозамина в тех случаях, когда перекрывание не позволяет провести точную квантификацию, в качестве альтернативы используют сигналы H2/C2. Количество каждого моносахарида выражают как процентную долю от общего содержания глюкозамина или уроновой кислоты. Соотношение между 6-O-сульфатированием и 6-O-десульфатированием рассчитывают через интегрирование сигналов H6/C6.
Данные о процентном составе композиций представлены в таблице 11A.
Дополнительную информацию по поводу описанных здесь способов можно найти, например, в ссылке Guerrini et al. (2005) Anal. Biochem., 337: 35-47.
Фармацевтические композиции
Настоящее изобретение предлагает композиции, в частности фармацевтически приемлемые композиции, которые включают описанный здесь препарат LMWH, введенный в лекарственную композицию вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
При использовании здесь термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые и все растворители, дисперсионные среды, изотонические средства, средства, замедляющие абсорбцию и т.п., физиологически совместимые вещества. Носитель может быть пригоден для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, ректального, спинального или эпидермального введения (например, посредством инъекции или вливания).
Композиции, предлагаемые этим изобретением, могут иметь самые разнообразные формы. К числу таких форм относятся, например, жидкие, полутвердые и твердые лекарственные формы по типу жидких растворов (например, инъекционных и инфузионных растворов), дисперсий или суспензий, липосом и суппозиториев. Предпочтительная форма лекарства зависит от его терапевтического предназначения и предполагаемого способа введения. Типичные предпочтительные композиции имеют форму инъекционных или инфузионных растворов. Предпочтительным способом введения считается парентеральный (например, внутривенный, подкожный, внутрибрюшинный, внутримышечный). В предпочтительном варианте реализации изобретения препарат LMWH вводят посредством внутривенного вливания или внутривенной инъекции. В другом предпочтительном варианте реализации изобретения препарат LMWH вводят посредством внутримышечной или подкожной инъекции.
Термин "парентеральное введение" и "парентерально введенный" при использовании здесь означают такие способы введения, которые отличаются от энтерального и топического (местного) введения, как правило, представляя собой инъекцию и включают, без ограничений, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, интракапсулярную, интраорбитальную, внутристекловидную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, внутритрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутирисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и внутригрудинную инъекцию или вливание.
В типичном случае терапевтические композиции должны быть стерильными и стабильными, как в условиях производства, так и в условиях хранения. Композиция может быть получена в форме раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, способной поддерживать высокую концентрацию (активного вещества). Стерильные инъекционные растворы можно изготавливать, включая необходимое количество активного соединения, то есть LMWH в подходящий растворитель, при необходимости, наряду с каким-либо ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше с последующей стерилизационной фильтрацией. Дисперсии обычно изготовляют, включая активное соединение в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из тех, что перечислены выше. В случае стерильных порошков для восстановления стерильных инъекционных растворов предпочтительный способ приготовления заключается в вакуумной сушке и сублимационной сушке, которые дают на выходе порошок, состоящий из активного ингредиента и любых желательных добавочных ингредиентов, извлеченных из предварительно стерилизованного фильтрационным способом раствора. Надлежащую текучесть жидкой лекарственной формы можно обеспечить, например, применяя такие покрытия как лецитин, который поддерживает нужный размер частиц в дисперсиях, а также используя поверхностно-активные вещества. Длительную абсорбцию инъекционных композиций можно обеспечить, включая в состав композиции агент, который замедляет всасывание, например какой-либо полимер, моностеаратную соль и желатин.
Препараты LMWH можно вводить самыми разными способами, известными в данной области знаний, хотя предпочтительным путем/способом введения для многих терапевтических вариантов применения считается внутривенная инъекция или инфузия. Компетентному специалисту должно быть понятно, что путь и/или способ введения лекарства может варьироваться в зависимости от конкретных показаний и ожидаемых результатов лечения. В некоторых вариантах реализации изобретения активное соединение может быть скомбинировано с носителем, который будет защищать соединение от быстрого высвобождения, то есть возможны лекарственные составы с контролируемым высвобождением активного вещества, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно также использовать биологически совместимые полимеры, подверженные биологическому распаду, например этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, полиортоэфиры и полимолочную кислоту. Многие способы приготовления таких лекарственных составов запатентованы или в целом известны компетентным специалистам. См., например, ссылку Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Лекарственные формы для инъекций можно производить в форме стандартных доз, например в ампулах или многодозовых контейнерах, в том числе с добавлением консерванта. Композиции могут иметь такие формы как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях, а также могут содержать формообразующие агенты, например суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.
В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаемый препарат LMWH можно вводить пероральным способом, например, в сочетании с инертным разбавителем и ассимилируемым годным в пищу носителем. Активное соединение (а также, по желанию, другие ингредиенты) можно также заключать в твердую или мягкую оболочку, в желатиновую капсулу, прессовать в таблетки или непосредственно включать в диету пациента. Для перорального терапевтического введения активные соединения можно комбинировать с наполнителями и изготовлять в форме проглатываемых таблеток, таблеток для медленного защечного растворения, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, вафель и т.п. Для введения соединения, предлагаемого изобретением, иными способами помимо парентерального необходимо защитить соединение покрытием или вводить его в организм пациента вместе с таким материалом, который будет предупреждать его инактивацию.
Сердцевины драже комбинируют с подходящими покрытиями. С этой целью можно использовать концентрированные растворы сахара, которые, необязательно, могут содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, карбополовый гель, полиэтиленгликоль и/или двуокись титана, лаковые растворы и подходящие органические растворители или смеси растворителей. К таблеткам или покрытиям драже можно добавлять красители или пигменты, которые бывают нужны для идентификации или характеристики разных комбинаций доз активного соединения. Фармацевтические композиции для перорального применения включают набивочные капсулы из желатина, а также мягкие, герметично закрытые капсулы, полученные из желатина и пластификатора, например глицерина или сорбита. Набивочные капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, например лактозой, связующими веществами, например крахмалами, и/или смазывающими веществами, например тальком или стеаратом магния, и, необязательно, со стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, например в жирных маслах, жидких парафинах или жидких полиэтиленгликолях. Кроме того, можно добавлять стабилизаторы. Можно также использовать микросферы, предназначенные для перорального введения. Такие микросферы уже давно и достаточно хорошо определены в данной области знаний. Все лекарственные формы для перорального введения должны выпускаться в дозах, подходящих для такого способа введения.
Композиции для защечного введения могут иметь форму таблеток или лепешек, составленных традиционным образом.
Для введения посредством ингаляции препарат LMWH может удобным образом доставляться в организм в виде аэрозольного спрея из упаковок, находящихся под давлением, или из небулайзера с применением подходящего сжатого вытеснителя, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, двуокиси углерода или другого подходящего газа. В случае применения аэрозоля, находящегося под давлением, стандартную дозировку можно обеспечить с помощью клапана, отмеряющего определенное количество лекарства. Капсулы или картриджи для применения в ингаляторе или инсуффляторе, полученные, например, из желатина, могут содержать порошковую смесь, состоящую из активного соединения и подходящей порошковой основы, например лактозы или крахмала. В дополнение ко всему изложенному выше, сухие порошковые формы для ингаляционной терапии также относятся к сфере настоящего изобретения. Такие сухие порошковые формы можно изготовлять таким образом, как это раскрыто в документе WO 02/32406.
Композиции также могут иметь форму, предназначенную для ректального или вагинального применения, например суппозитории и удерживающие клизмы, содержащие подходящую основу, например масло какао или другие глицериды.
В дополнение к композициям, описанным выше, предлагаемые соединения также могут иметь форму депонированных препаратов. Такие лекарственные формы длительного действия могут содержать подходящие полимерные или гидрофобные материалы (например, эмульсия в приемлемом масле) или ионообменные смолы, или малорастворимые дериваты, например малорастворимую соль.
Фармацевтические композиции также могут включать подходящие твердофазные или гелеобразные носители и наполнители. Примеры таких носителей и наполнителей включают, но не ограничиваясь ими, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, например полиэтиленгликоль.
Примеры композиций, которые можно применять для доставки другими способами, кроме парентерального (например, неинвазивной доставки), включают мерные количества композиции для введения в дыхательные пути через ингалятор, таблетки с определенной дозой лекарства для перорального введения, трансдермальные пластыри для доставки стандартных доз лекарства через кожу и суппозитории для ректальной или вагинальной доставки необходимых стандартных доз. Композиции могут быть заключены в контейнер, упаковку или диспенсер (дозатор) с прилагаемыми инструкциями по введению.
Препарат LMWH можно также вводить через имплантируемые устройства кратковременного или долговременного применения. Препараты в таких устройствах можно имплантировать подкожно, в ткани или органы (например, в коронарную артерию, сонную артерию, почечную артерию и другие периферийные артерии, вены, почки, сердце, роговицу, стекловидное тело глаза, головной мозг и т.д.) либо имплантировать в физиологические пространства вокруг тканей и органов (например, в капсулу почки, перикард, торакальное или перитонеальное пространство).
Препарат LMWH можно также применять для покрытия различных устройств медицинского назначения. Например, препаратом LMWH можно покрыть стент или экстракорпоральный контур (кровообращения). Такие лекарственные формы препаратов LMWH могут включать, например, применение бисера с управляемым высвобождением, геля, микросфер, а также различных полимеров, например, PLGA, целлюлозы, альгината или других полисахаридов.
Схемы введения доз подбирают таким образом, чтобы обеспечить оптимальный желательный ответ (например, лечебный эффект). Например, можно ввести одну дозу в виде болюса или несколько дробных доз с определенным интервалом по времени или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать в зависимости от требований, диктуемых клинической ситуацией. Особенно предпочтительно составлять парентеральные композиции в стандартной дозовой форме для простоты введения и однородности дозирования. Понятие "стандартная дозовая форма" при использовании здесь относится к физически дискретным единицам (порциям) лекарства, организованным в виде унитарных доз для субъекта, получающего лечение, причем каждая единица содержит предварительно определенное количество активного соединения, рассчитанное в целях получения желательного лечебного эффекта, в комбинации с необходимым фармацевтическим носителем. В соответствии с изобретением, спецификация для стандартных дозовых форм диктуется следующими факторами и находится в прямой зависимости от них: (a) уникальные характеристики активного соединения и конкретный ожидаемый лечебный эффект и (b) ограничения в лечебном применении активных соединений, связанные с индивидуальной чувствительностью пациентов.
Необходимо отметить, что величины доз могут варьироваться в зависимости от типа и тяжести патологического состояния, по поводу которого проводится лечение. Далее необходимо понять, что для любого конкретного субъекта специфическую схему дозирования препарата следует со временем корректировать в зависимости от индивидуальных потребностей и профессионального суждения специалиста, проводящего лечение субъекта указанными композициями и наблюдающего за результатами лечения.
Фармацевтические композиции, предлагаемые изобретением, могут включать "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" препарата LMWH. Определение "терапевтически эффективное количество" относится к такому количеству препарата, которое в назначенной дозировке и в течение определенного промежутка времени позволяет достичь желательного терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество препарата LMWH может варьироваться в зависимости от таких факторов, как статус заболевания, возраст, пол и вес субъекта, а также конкретный препарат LMWH, который назначен субъекту для достижения нужного результата. Под терапевтически эффективным количеством подразумевается также такое количество препарата LMWH, при котором любые токсические или вредные эффекты указанного препарата перевешиваются его полезными терапевтическими эффектами. "Терапевтически эффективная дозировка", предпочтительно, подавляет измеряемый параметр, например коагуляцию или тромбоз, например, количественно определяемый по показателям ACT и aPTT, по меньшей мере приблизительно на 20%, предпочтительнее, по меньшей мере приблизительно на 40%, еще предпочтительнее, по меньшей мере приблизительно на 60%, и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 80% по сравнению с субъектами, не получающими лечения. Способность соединения подавлять измеряемый параметр, например коагуляцию или тромбоз, можно оценить на животной модельной системе, позволяющей предсказать эффективность у человека. В альтернативном варианте это свойство композиции можно оценить, исследуя указанную способность соединения в аналитической системе in vitro. Примерные дозы препарата LMWH для внутривенного введения составляют приблизительно от 1 МЕ/кг до 200 МЕ/кг, например, 1 МЕ/кг, 2 МЕ/кг, 3 МЕ/кг, 4 МЕ/кг, 5 МЕ/кг, 6 МЕ/кг, 7 МЕ/кг, 8 МЕ/кг, 9 МЕ/кг, 10 МЕ/кг, 11 МЕ/кг, 12 МЕ/кг, 13 МЕ/кг, 14 МЕ/кг, 15 МЕ/кг, 16 МЕ/кг, 17 МЕ/кг, 18 МЕ/кг, 19 МЕ/кг, 20 МЕ/кг, 21 МЕ/кг, 22 МЕ/кг, 25 МЕ/мг, 30 МЕ/кг, 40 МЕ/кг, 50 МЕ/кг, 70 МЕ/кг, 100 МЕ/кг, 125 МЕ/кг, 150 МЕ/кг, 175 МЕ/кг, 200 МЕ/кг. Другие примерные дозы препарата LMWH для внутривенного введения составляют приблизительно от 0,03 мг/кг до 0,45 мг/кг, например, 0,03 мг/кг, 0,05 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,15 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,22 мг/кг, 0,25 мг/кг, 0,27 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,35 мг/кг, 0,37 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,44 мг/кг, в предпочтительных вариантах приблизительно 0,1 мг/кг, 0,15 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,25 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,35 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,44 мг/кг, 0,47 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,55 мг/кг, 0,60 мг/кг, 0,7 мг/кг, предпочтительнее, приблизительно от 0,30 до 0,50 мг/кг, например, 0,30 мг/кг, 0,35 мг/кг, 0,40 мг/кг, 0,42 мг/кг, 0,44 мг/кг, 0,47 мг/кг или 0,50 мг/кг.
Определение "профилактически эффективное количество" относится к такому количеству препарата, которое в назначенной дозировке и в течение определенного промежутка времени позволяет достичь желательного профилактического результата. В типичных ситуациях, если субъект получает профилактическую дозу до начала заболевания или на его ранней стадии, то профилактически эффективное количество препарата будет меньше его терапевтически эффективного количества.
Кроме того, к сфере изобретения относятся наборы, включающие описанный здесь препарат LMWH. Такой набор может содержать один и более других элементов, включая следующие: инструкции по применению, другие реактивы, например лечебное средство или протаминсульфат, устройства или другие материалы для подготовки препарата LMWH к введению, фармацевтически приемлемые носители, а также устройства или другие материалы для введения композиции субъекту. Инструкции по применению могут включать инструкции по мониторированию анти-Xa активности и/или анти-IIa активности по результатам анализов коагуляции, например, по показателям ACT и aPTT. Инструкции могут включать инструкции по терапевтическому применению композиций, в том числе предполагаемые дозировки и/или способы введения, например, пациенту, страдающему заболеванием, например описанным здесь заболеванием. Другие инструкции могут включать инструкции по реверсированию анти-Xa активности и/или анти-IIa активности препарата с применением протаминсульфата. Указанный набор может дополнительно содержать по меньшей мере один добавочный реактив, например диагностический или терапевтический реактив, как это описано здесь, введенный в один или более раздельных фармацевтических препаратов.
Профилактические и терапевтические варианты применения
Препараты LMWH можно применять для лечения субъекта. При использовании здесь термин "лечить" или "лечение" означает применение препарата LMWH, то есть его введение субъекту, например пациенту, или его введение в ткань или клетку, выделенную от субъекта, например пациента, которую затем возвращают в организм пациента. Под субъектом можно подразумевать пациента, страдающего заболеванием (например, описанным здесь заболеванием), имеющего симптом заболевания или предрасположенность к заболеванию. Лечение может быть направлено на то, чтобы излечить, исцелить, смягчить, ослабить, видоизменить, умерить, облегчить заболевание, симптомы заболевания или предрасположенность к заболеванию. При использовании здесь понятие "субъект" означает позвоночное, например человека, не человекообразного примата, корову, лошадь, свинью, овцу, козу, собаку, кошку или грызуна. Под субъектом может подразумеваться, например, экспериментальное животное, ветеринарное животное или человека. Лечение может быть терапевтическим, например, таким, которое излечивает, исцеляет, смягчает, ослабляет, видоизменяет, умеряет, облегчает заболевание или симптом заболевания, например уменьшает, облегчает или улучшает существующее нежелательное состояние или его симптомы, или профилактическим, например, таким, которое замедляет, например, предупреждает начало нежелательного состояния или его симптомов.
Гепарины и LMWH имеют много полезных терапевтических предназначений. Представленные здесь препараты LMWH могут быть использованы для лечения любого типа состояний, при которых полезна терапия гепарином или LMWH. Таким образом, описанные здесь препараты и способы полезны во многих вариантах применения in vitro, in vivo и ex vivo. Например, известно, что гепарины и LMWH полезны для предупреждения и лечения деменции, например, при болезни Альцгеймера, заболеваний, связанных с коагуляцией (например, DVT и PE), фиброзных заболеваний (например, фиброза крупного органа, фибропролиферативных заболеваний и рубцов, связанных с травмой), тромботических заболеваний (например, ACS, стабильной и нестабильной стенокардии, MI (например, STEMI и NSTEMI)) или сердечно-сосудистого заболевания (атеросклероза), сосудистых состояний или артериальной фибрилляции, аллергии или респираторных заболеваний (например, астмы, эмфиземы, синдрома дыхательного расстройства у взрослых (ARDS), муковисцидоза и реперфузионного повреждения легких), циркуляторного шока и родственных заболеваний, ангиогенных заболеваний, рака и метастатических заболеваний, сепсиса, стеноза и рестеноза, и остеопороза. Описанные здесь препараты LMWH можно также использовать для субъектов с переломами (например, переломом бедра) или для хирургических пациентов до, во время или после хирургического вмешательства (например, пересадки органа, ортопедической операции, замены тазобедренного сустава, замены коленного сустава, PCI, установки стента, ангиопластики и CABG). Каждое из этих заболеваний хорошо известно в медицине и описано, например, в книге Harrison's Principles of Internal Medicine (McGraw Hill, Inc., New York), которая включена сюда в качестве ссылки. Применение композиций HLGAG в различных методах терапии описано и обобщено в публикации Huang, J. and Shimamura, A., Coagulation Disorders, 12, 1251-1281 (1998).
Таким образом, препараты LMWH полезны для лечения или предупреждения заболеваний, связанных с коагуляцией. Когда в метаболическом пути коагуляции нарушается равновесие, то есть происходит сдвиг в сторону избыточной коагуляции, это приводит к развитию тромботических тенденций, которые часто проявляются сердечными приступами, апоплексическими ударами (инсультами), DVT, ACS, стабильной и нестабильной стенокардией и инфарктом миокарда. Термин "заболевание, связанное с коагуляцией" при использовании здесь относится к состояниям, характеризующимся местным воспалением, которое развивается в результате прекращения или уменьшения кровоснабжения ткани, что может происходить, например, при закупорке кровеносного сосуда, ответственного за кровоснабжение ткани и часто наблюдается при инфарктах миокарда и головного мозга или при периферическом сосудистом заболевании, или при образовании эмболов, связанном с такими состояниями как фибрилляция предсердия, DVT или PE. Лица, подвергающиеся хирургическим вмешательствам, анестезии и длительному постельному режиму или резкому снижению физической активности по другим причинам, часто становятся восприимчивыми к патологическому состоянию, известному под названием тромбоз глубоких вен или DVT, которое связано с образованием сгустков венозной крови в нижних конечностях и/или тазовом поясе. Такое свертывание крови наблюдается в связи с отсутствием мышечной активности в нижних конечностях, необходимой для подкачки венозной крови (стаз), местными сосудистыми повреждениями или состоянием гиперкоагуляции. Это состояние может создать угрозу для жизни пациента, если сгусток крови мигрирует в легкие, то есть проявит себя как "легочный эмбол" или иным образом создаст препятствие для сердечно-сосудистой циркуляции. Один из способов лечения основан на введении антикоагулянта.
Указанный способ полезен для лечения тромботических и сердечно-сосудистых заболеваний. Сердечно-сосудистые заболевания включают, но не ограничиваясь ими, атеросклероз и фибрилляцию предсердий. Фибрилляция предсердий представляет собой частую форму аритмии, обычно возникающей в результате эмоционального стресса или после хирургического вмешательства, интенсивной физической нагрузки или острой алкогольной интоксикации. Фибрилляция предсердий характеризуется дезорганизацией активности предсердий с отсутствием дискретных зубцов P на профиле ЭКГ. Эта дезорганизованная активность предсердий может привести к нарушению кровотока и образованию тромбов. Такие тромбы могут эмболизировать отдаленные сосуды, приводя к ишемии головного мозга и другим болезненным осложнениям.
Тромботические заболевания включают, но не ограничиваясь ими, ACS, например MI, стабильную и нестабильную стенокардию. Инфаркт миокарда представляет собой болезненное состояние, которое иногда развивается при резком снижении коронарного кровотока, сопровождающем тромботическую закупорку коронарной артерии, ранее суженной в ходе атеросклеротического процесса. Такое повреждение миокарда может быть вызвано или ускорено такими факторами как курение табака, гипертензия и накопление липидов. Стенокардия возникает в результате транзиторной ишемии миокарда. Это заболевание обычно ассоциируется с ощущениями тяжести, давления, сжатия, удушья или загромождения за грудиной. Приступы стенокардии обычно возникают при эмоциональном напряжении, но могут наблюдаться и в состоянии покоя. STEMI, также упоминаемый под названием "инфаркт миокарда с зубцом Q", означает MI с аномальной электрокардиограммой. NSTEMI или "инфаркт миокарда без зубца Q" не связан с нарушениями на ЭКГ. Приступы стабильной стенокардии предсказуемы по времени и связаны с определенным (в количественном смысле) напряжением или активностью. Нестабильная стенокардия может встречаться как изменение в обычном характере течения стабильной стенокардии. Она может включать боль в груди, которая возникает в состоянии покоя или при все меньшем и меньшем напряжении, причем приступы нестабильной стенокардии протекают тяжелее и продолжаются дольше, а также в меньшей степени реагируют на нитроглицерин. Нестабильная стенокардия означает, что коронарный кровоток стал хуже, что, по-видимому, связано с продолжающимся сужением коронарных артерий или с формированием в них мелких сгустков крови. Нестабильную стенокардию следует воспринимать как сигнал тревоги, предупреждающий о возможности развития инфаркта миокарда в ближайшем будущем.
Препарат LMWH можно использовать для лечения тромботических и сердечно-сосудистых расстройств, самостоятельно или в комбинации с другими терапевтическими средствами, для снижения риска развития сердечно-сосудистого заболевания или для лечения сердечно-сосудистого заболевания. Например, комбинированная терапия может включать препарат LMWH, включенный в одну и ту же лекарственную композицию и/или вводимый одновременно с одним или более дополнительных терапевтических средств, например, таких терапевтических средств, которые описаны здесь. Введение "в комбинации" при использовании здесь означает, что два (или более) средства лечения доставляются субъекту, страдающему заболеванием, например, два или более средства лечения доставляются после того, как у субъекта было диагностировано заболевание или идентифицирован повышенный риск развития заболевания, причем в результате такого лечения заболевание удается предупредить, излечить или элиминировать. В некоторых вариантах реализации изобретения доставка одного средства лечения продолжается и после начала доставки второго, таким образом доставка двух средств лечения перекрывается по времени. Иногда такая ситуация обозначается здесь как "одновременная" или "сопутствующая доставка". В других вариантах реализации изобретения доставка одного средства лечения завершается до начала доставки второго средства лечения. Доставка может осуществляться таким образом, что эффект первого средства лечения все еще можно выявить в период доставки второго средства лечения. Другие терапевтические средства включают, но не ограничиваясь ими, противовоспалительные средства, противотромботические средства, противотромбоцитарные средства, фибринолитические средства, тромболитики, средства, снижающие уровень липидов, прямые ингибиторы тромбина, ингибиторы анти-Xa, ингибиторы анти-IIa, ингибиторы рецепторов гликопротеина IIb/IIIa и прямые ингибиторы тромбина. Примеры средств, которые можно вводить в комбинации с описанными здесь препаратами LMWH, включают бивалирудин, гирудин, гируген, ангиомакс, агатробан, PPACK, аптамеры тромбина, аспирин, ингибиторы GPIIb/IIIa (например, Интегрелин), ингибиторы P2Y12, тиенопиридин, тиклопидин и клопидогрел.
Возможность отслеживания по таким стандартным показателям коагуляции как ACT и aPTT, а также обратимость эффекта описанных здесь препаратов LMWH создают условия для гибкой тактики лечения пациентов, например, поступивших в больницу и проходящих обследование для оценки показаний к хирургическому сердечно-сосудистому вмешательству. Такие выгоды высвечиваются в следующем сценарии. Пациент поступает в больницу с симптомами, которые могут быть связаны с различными тромботическими заболеваниями, например ACS, включая стабильную стенокардию, нестабильную стенокардию и инфаркт миокарда. Возможность отслеживания и обратимость эффекта описанных здесь препаратов LMWH позволяет назначить пациенту такие препараты, пока он/она проходит обследование для оценки перспектив возможного хирургического вмешательства на сердечно-сосудистой системе. Если врачи определяют, что пациенту будет проведено хирургическое вмешательство, например PCI или установка стента, то, благодаря возможности отслеживания эффекта препаратов LMWH, их анти-Xa активность и анти-IIa активность можно отслеживать во время процедуры, что позволяет при необходимости ввести пациенту одну или более дополнительных доз препаратов LMWH во время процедуры или после процедуры для поддержания этой активности на нужном уровне. Если врачи определяют, что пациенту будет проведено хирургическое вмешательство по типу CABG, то анти-Xa и анти-IIa активность препаратов LMWH можно нейтрализовать протаминсульфатом еще до хирургического вмешательства. В дополнение к этому, у пациента можно отслеживать анти-Xa активность и анти-IIa активность, убеждаясь в том, что она в достаточной степени понизилась перед хирургической операцией.
Описанные здесь препараты LMWH также полезны для лечения патологических сосудистых состояний. Патологические сосудистые состояния включают, но не ограничиваясь ими, такие заболевания как DVT, болезнь периферических сосудов, церебральную ишемию, включая инсульт, и PE. Церебральный ишемический приступ или церебральная ишемия представляет собой такое ишемическое состояние, когда блокируется приток крови в головной мозг. Это прекращение или ограничение притока крови в головной мозг может быть вызвано множеством причин, включая врожденную (наследственную) блокаду или закупорку кровеносных сосудов, как таковую, источник закупорки отдаленного происхождения, снижение перфузионного давления или увеличение вязкости крови, приводящее к нарушению мозгового кровообращения, или разрыв кровеносного сосуда в субарахноидальном пространстве или в мозговой ткани. Предлагаемые изобретением способы полезны для лечения церебральной ишемии. Церебральная ишемия может приводить или к временным, или к постоянным нарушениям, а тяжесть неврологических проявлений у пациента, подверженного приступам церебральной ишемии, зависит от интенсивности и длительности ишемического эпизода. Транзиторный ишемический приступ (TIA) заключается в том, что приток крови в головной мозг прекращается лишь ненадолго, вызывая кратковременные неврологические нарушения, которые обычно исчезают менее чем через 24 часа. Симптомы TIA включают онемение или слабость мышц лица и/или конечностей, потерю способности четко говорить и/или понимать речь окружающих, потерю или ослабление зрения и чувство головокружения. Перманентные церебральные ишемические приступы, также называемые инсультами, обусловлены длительным перерывом или снижением поступления крови в головной мозг в результате тромбоза или эмболии. Инсульт вызывает гибель нейронов с типичным последующим неврологическим дефицитом, который можно улучшить, но нельзя устранить полностью.
Тромбоэмболический инсульт развивается вследствие закупорки внечерепного или внутричерепного кровеносного сосуда тромбом или эмболом. Поскольку часто бывает трудно распознать, вызван ли инсульт тромбозом или эмболией, принято использовать термин "тромбоэмболия", который охватывает инсульты, обусловленные любым из двух механизмов.
Приведенные здесь способы также направлены на лечение острого тромбоэмболического инсульта препаратами LMWH, предлагаемыми изобретением. Острый инсульт представляет собой медицинский синдром, выражающийся в неврологическом повреждении, обусловленном ишемическим явлением, то есть перерывом или уменьшением притока крови в головной мозг.
Эффективное количество препарата LMWH в изолированном виде или в комбинации с другими лекарственными препаратами для лечения инсульта, это такое количество, которое достаточно для уменьшения повреждений головного мозга in vivo, которые могут произойти в результате инсульта. Под уменьшением повреждений мозга подразумевается любое предупреждение повреждений мозга, которые в противном случае могли бы развиться у субъекта, перенесшего тромбоэмболический инсульт, при отсутствии описанного здесь лечения. Для того чтобы оценить степень уменьшения повреждений головного мозга, можно использовать некоторые физиологические параметры, включая уменьшение размеров инфаркта, улучшение регионального кровотока в головном мозге и снижение внутричерепного давления, например, по сравнению с соответствующими параметрами у того же пациента до начала лечения, по сравнению с пациентами, перенесшими инсульт и не получавшими лечения или получавшими только тромболитические средства.
Препарат LMWH можно использовать самостоятельно или в комбинации с другим терапевтическим средством, применяемым для лечения заболеваний, связанных с коагуляцией. Примеры терапевтических средств, применяемых для лечения заболеваний, связанных с коагуляцией, включают антикоагулянты, противотромбоцитарные средства и тромболитики.
Антикоагулянтные средства предупреждают коагуляцию компонентов крови, то есть предупреждают образование сгустков крови. Антикоагулянты включают, но не ограничиваясь ими, варфарин, кумадин, дикумарол, фенпрокумон, аценокумарол, этилбискумацетат и производные индандиона. "Прямые ингибиторы тромбина" включают гирудин, гируген, ангиомакс, агатробан, PPACK, аптамеры тромбина. Противотромбоцитарные средства подавляют агрегацию тромбоцитов и нередко применяются для профилактики тромбоэмболических инсультов у пациентов, подверженных транзиторным ишемическим приступам и предрасположенных к инсульту. Тромболитические средства лизируют сгустки крови, которые могут вызвать тромбоэмболический инсульт. Тромболитические средства давно используются в лечении острой венозной тромбоэмболии и легочных эмболов, и достаточно хорошо известны в данной области знаний (см., например, ссылки Hennekens et al, J Am Coll Cardiol; v. 25 (7 supp), p. 18S-22S (1995); Holmes, et al., J Am Coll Cardiol; v. 25 (7 suppl), p. 10S-17S (1995)).
Термин "легочная эмболия" при использовании здесь относится к заболеванию, связанному с ущемлением сгустка крови в просвете легочной артерии, приводящим к тяжелой респираторной дисфункции. Легочные эмболы часто происходят из вен нижних конечностей, где сгустки крови формируются в глубоких венах голени, а затем попадают в легкие через венозную циркуляцию. Таким образом, легочная эмболия часто развивается как осложнение тромбоза глубоких вен нижних конечностей. Симптомы легочной эмболии включают острое начало таких явлений как диспноэ, боль в груди (усиливающуюся при дыхании), учащенные дыхание и сердцебиение. У некоторых пациентов может наблюдаться кровохарканье.
Описанные здесь препараты и способы также полезны для лечения или предупреждения атеросклероза. На разных экспериментальных моделях было показано, что гепарин полезен в предупреждении атеросклероза. Атеросклероз - это одна из форм артериосклероза, которая, по мнению специалистов, является причиной большинства случаев болезни коронарных артерий, аневризмы аорты и болезни артерий нижних конечностей, а также содействует развитию цереброваскулярной болезни.
Препараты LMWH также полезны до, во время и после хирургических процедур и процедур диализа. У хирургических пациентов, особенно в возрасте старше 40 лет, повышен риск развития DVT. Таким образом, в рамках настоящего изобретения рассматривается применение описанных здесь препаратов LMWH для профилактики развития тромбоза, связанного с хирургическими процедурами. В дополнение к общим хирургическим процедурам по типу чрескожных вмешательств (например, чрескожное коронарное вмешательство (PCI)), PCTA, стентированию и другим подобным подходам, замене тазобедренного и коленного сустава, сердечно-легочному шунтированию, коронарной реваскуляризации, ортопедическим операциям и операциям протезирования, описанные здесь способы также полезны для субъектов, подвергающихся процедуре трансплантации тканей или органов или получающих лечение по поводу переломов, например перелома бедра.
В дополнение к этому, описанные здесь препараты LMWH полезны для лечения респираторных заболеваний, например муковисцидоза, астмы, аллергии, эмфиземы, синдрома расстройства дыхания у взрослых (ARDS), реперфузионного повреждения легких и ишемического-реперфузионного повреждения легких.
Муковисцидоз - это хроническое прогрессирующее заболевание, поражающее органы дыхания. Одним из тяжелых последствий муковисцидоза является легочная инфекция, вызванная Pseudomonas aeruginosa, на долю которой приходится 90% заболеваемости и смертности при муковисцидозе. Лекарственные средства для пациентов муковисцидозом включают противомикробные препараты, направленные на борьбу с патогенными инфекциями.
Астма - это заболевание респираторной системы, характеризующееся воспалением, сужением дыхательных путей и их повышенной реактивностью на вдыхаемые вещества. Астма часто, но не обязательно, сочетается с симптомами атопии или аллергии. Астма может также включать астму, индуцированную физической нагрузкой, реакцию по типу бронхоспазма на бронхостимуляторы, гиперчувствительность замедленного типа, аутоиммунный энцефаломиелит и родственные заболевания. Аллергии обычно обусловлены выработкой антител IgE в ответ на аллергены. Эмфизема представляет собой растяжение воздушных полостей, расположенных дистальнее терминальных бронхиол, сопровождающееся разрушением альвеолярных перегородок. Эмфизема развивается в результате повреждения легких, индуцированного эластазой. "Синдром расстройства дыхания у взрослых" (ARDS) - это термин, который охватывает многие острые диффузные инфильтративные повреждения легких различной этиологии, сопровождающиеся тяжелой артериальной гипоксемией. Одной из наиболее частых причин ARDS является сепсис.
Воспалительные заболевания включают, но не ограничиваясь ими, аутоиммунные заболевания и атопические расстройства. Другие типы воспалительных заболеваний, которые поддаются лечению описанными здесь препаратами LMWH, представлены рефрактерным язвенным колитом, болезнью Крона, рассеянным склерозом, аутоиммунными заболеваниями, неспецифическим язвенным колитом, сепсисом и интерстициальным циститом.
Препараты LMWH можно применять для лечения фиброзных заболеваний, например фиброза крупных органов, фибропролиферативных заболеваний и рубцов, связанных с травмой. Заболевания, связанные с фиброзом крупных органов, включают, но не ограничиваясь ими, интерстициальное заболевание легких (ILD), цирроз печени, болезни почек (например, несахарный диабет и нелеченую почечную гипертензию), фиброз сердца и некоторые глазные болезни (например, дегенерацию желтого пятна, ретинопатию с поражением сетчатки или стекловидного тела). Примеры фибропролиферативных заболеваний включают системную и локальную склеродерму, келоидные и гипертрофические рубцы, атеросклероз, рестеноз, фибросаркому и ревматоидный артрит. Примеры рубцов, связанных с травмой, включают послеоперационные рубцы, фиброз, индуцированный химиотерапией, фиброз, индуцированный радиацией, рубцы, связанные с повреждениями или ожогами.
В одном из вариантов реализации изобретения препараты LMWH применяются для подавления ангиогенеза. Термин "ангиогенез" при использовании здесь означает неадекватное образование кровеносных сосудов. Ангиогенез часто наблюдается в опухолях, когда эндотелиальные клетки секретируют группу факторов роста, митогенных для эндотелия и вызывающих удлинение и пролиферацию эндотелиальных клеток, что приводит к формированию новых кровеносных сосудов. Некоторые из ангиогенных митогенов относятся к группе пептидов, связывающих гепарин, которые представляют собой факторы роста эндотелиальных клеток. Подавление ангиогенеза может привести к регрессии опухолей (по данным исследований на животных моделях), что позволяет думать о потенциальном применении описанных здесь препаратов в качестве терапевтических противораковых средств. Ангиогенные заболевания включают, но не ограничиваясь ими, неоваскулярные глазные заболевания, остеопороз, псориаз, артрит, рак и сердечно-сосудистые заболевания.
Препараты LMWH можно также применять для подавления роста и метастазирования раковых клеток. Таким образом, описанные здесь способы полезны для лечения и/или предупреждения пролиферации опухолевых клеток или метастазов опухоли у субъекта. Опухоли могут быть злокачественными или доброкачественными. Рак или опухоли включают, но не ограничиваясь ими, рак желчных протоков, рак головного мозга, рак молочной железы, рак шейки матки, хориокарциному, рак толстой кишки, рак эндометрия, рак пищевода, рак желудка, внутриэпителиальные новообразования, лейкозы, лимфомы, рак печени, рак легких (например, мелкоклеточный и немелкоклеточный), меланому, нейробластомы, рак полости рта, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак прямой кишки, саркомы, рак кожи, рак яичек, рак щитовидной железы, рак почек, а также другие карциномы и саркомы.
Субъектом, нуждающимся в лечении рака, может быть также субъект с высокой вероятностью развития рака. К числу таких субъектов относятся, например, субъекты с генетическими аномалиями, наличие которых (по данным научных исследований) проявляет корреляционную связь с высокой вероятностью развития рака, субъекты, контактирующие с канцерогенами, например с табаком, асбестом или другими химическими токсинами, а также субъекты, ранее получавшие лечение по поводу рака и находящиеся в состоянии явной ремиссии.
При введении пациенту, получающему противораковое лечение, препарат LMWH можно использовать в составе коктейля, содержащего другие противораковые средства. Препарат LMWH можно также включать в состав коктейлей, содержащих такие средства, которые направлены на лечение побочных эффектов лучевой терапии, например противорвотные средства, радиопротекторы и т.д.
Описанные здесь способы лечения могут также включать введение протаминсульфата для нейтрализации анти-Xa активности и/или анти-IIa активности препаратов LMWH, например, в такой ситуации, когда антикоагулянтная и антитромботическая активность больше не нужны. Протаминсульфат можно вводить, например, внутривенно в дозе приблизительно 1, 2, 3 мг протаминсульфата на 100 МЕ анти-Xa активности. Численный показатель МЕ для анти-Xa активности можно определить используя, например, описанные здесь анализы коагуляции.
Другие варианты реализации изобретения
Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, которые не следует рассматривать как ограничительные. Содержание всех ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, которые цитируются в этой заявке, включено сюда в качестве ссылки.
ПРИМЕРЫ
Способы производства M118-REH
Производственный процесс
Описание процесса производства M118-REH наглядно представлено на фигуре 1. Вкратце, на 1-й стадии процесса имеющийся в свободной продаже нефракционированный гепарин, USP (UFH) подвергали пошаговой серии осаждений в водном растворе этанола с ацетатом кальция (соотношение масс ацетата кальция и UFH 3:1) для экстрагирования части UFH с низкой молекулярной массой, которая также упоминается как часть UFH, по существу, представленная фракцией с высокой подвижностью. Продукт, полученный на 1-й стадии фракционирования, был обозначен как промежуточный продукт 1.
Вторая стадия включала переваривание промежуточного продукта 1 с применением модифицированного фермента гепариназы III, имеющей замену аланина на гистидин по 225-му остатку аминокислотной последовательности (MO11), в водном буфере ацетата натрия, pH 7,2, при 37°C для получения промежуточного продукта 2. Модифицированный фермент MO11 проводил расщепление посредством β-элиминации между остатками N-ацетилглюкозамина и в присутствии сульфатированных уроновых кислот производил цепи, имеющие группу Δ4,5 уроновой кислоты на нередуцирующем конце и N-ацетилглюкозамин на редуцирующем конце. Когда переваривание было завершено, подогрев выключали и к смеси добавляли хлорид натрия для достижения конечной концентрации раствора приблизительно 2% (мас./об.).
На 3-й стадии применяли вытеснительную хроматографию (SEC) для разделения промежуточного продукта 2 на компоненты с высокой активностью против факторов Xa и IIa и материал с низкой активностью. Продукт, полученный на этой стадии, был обозначен как промежуточный продукт 3.
На 4-й стадии отдельные или комбинированные материалы промежуточного продукта 3 растворяли в очищенной воде, фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 пм и лиофилизировали для получения лекарственного субстрата M118-REH.
Исходный материал в производстве M118-REH
Спецификации исходного материала
Исходный материал для получения M118-REH, UFH-натрий (USP) происходит из слизистой оболочки кишечника свиньи. В дополнение к тестам USP на месте проводятся дополнительные контрольные анализы. Эти контрольные анализы перечислены в таблице 1.
Таблица 1 Анализы UFH и спецификации в дополнение к DMF |
|
Тест | Спецификация |
Сертификат мощности анализа | NLT 160 МЕ/мг по сухой основе |
Агарозный гель-электрофорез | Отчет по гепарину с высокой подвижностью и низкой подвижностью Отчет по дерматансульфату и хондроитинсульфату |
Агарозный гель-электрофорез (AGE) полуколичественно разделяет разные компоненты материалов, основанных на гепарине, в частности дерматансульфат и хондроитинсульфат, на основе их электрофоретической подвижности. Горизонтальное разделение в 0,5% агарозном геле проводили в буфере ацетата бария, pH 5,8, с последующим применением буфера из 1,3-диаминопропанацетата, pH 9. Использовали специальную емкость для электрофореза, при помощи которой электродные камеры, содержащие жидкий буфер, перекрывали несмешивающимся с водой органическим растворителем низкой плотности (например, петролейным эфиром или гептаном). Такая конструкция обеспечивала эффективный перенос тепла между пластиной агарозного геля и охлаждающим металлическим поддоном, заполненным льдом.
Гепарины низкой молекулярной массы традиционно производят из UFH класса USP. Для получения лекарственного вещества гепарина с низкой молекулярной массой и большей мощностью исходный материал UFH для получения M118-REH сводили к материалу с мощностью более 160 МЕ/мг. Для контроля уровней дерматансульфата и хондроитинсульфата проводили измерение этих веществ в исходном материале UFH и на 1-й стадии производственного процесса M118-REH.
Структурный анализ промежуточных продуктов
Стадии производственного процесса по получению M118-REH описаны выше и наглядно представлены на фигуре 1. Технология снятия характеристик для исследования структуры сахаров дает понимание структурных признаков, которые подвергаются изменениям на каждой стадии описанного выше процесса переработки UFH. Такая информация нужна для контроля и обеспечения воспроизводимости производственного процесса, включая отбор исходного материала.
Анализ различных материалов 2-й стадии (или образцов промежуточного продукта 1) и исходных образцов UFH, использованных для их получения, выполнялся с применением анализа 2D-ЯМР (HSQC) и капиллярного электрофореза.
Строительные блоки, составляющие исходный материал, а также промежуточный продукт, были идентифицированы и определены количественно. Некоторые из исследованных материалов 2-й стадии не были идеальными субстратами для следующей стадии (ферментативного переваривания), поэтому были идентифицированы признаки, указывающие на предпочтительный материал 2-й стадии.
Ниже в таблице 2 и таблице 3 представлены данные анализа 2D ЯМР, которые иллюстрируют различия между исходным UFH и материалом 2-й стадии. Этот анализ позволяет определить общие различия в структурных признаках при прохождении материалов через 1-ю стадию производственного процесса M118-REH. Основываясь на данных, полученных из различных анализов, делали определенные выводы об исходном материале, промежуточных продуктах и производственном процессе.
Таблица 2 Анализ UFH и материалов 2-й стадии, полученных из него, методом 2D ЯМР. Эти материалы представляют предпочтительный материал 2-й стадии |
|||||
Моносахарид | UFH#1 | 2-я стадия | UFH#2 | 2-я стадия #3 |
|
#1 | #2 | ||||
Глюкозамин | |||||
HNS-(I2S) | 63,7 | 57 | 57,1 | 65,6 | 56,3 |
HNS-(I) | 9 | 11,1 | 12,3 | 7,4 | 12,3 |
HNS-(G) | 7,7 | 12,7 | 11,2 | 8,9 | 11,8 |
HNAc(внутренний) | 12,1 | 13,9 | 14,6 | 11,1 | 13,3 |
HNS,3S | 6,1 | 4,4 | 4,8 | 7 | 5,5 |
H6S | 78,2 | 85,3 | 85,8 | 82,5 | 86,7 |
Область связывания (L.R.) | 4,2 | 3,6 | 3,8 | 2,1 | 1,8 |
ΔU | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
I2S | 73 | 66,8 | 70,9 | 75,9 | 70,2 |
I-(HNS/Ac,6S) | 8,1 | 11,8 | 9,4 | 7,2 | 8,5 |
I-(HNS/Ac) | 1,4 | 2 | 1,4 | 0,8 | 1,1 |
G-(HNS) | 8,1 | 11,2 | 8,4 | 8 | 9,6 |
G-(HNS,3S) | 2,8 | 2,8 | 3,2 | 2,7 | 3,7 |
G-(HNAc) | 6,5 | 5,3 | 6,6 | 5,3 | 4,6 |
Эпоксид | 0 | 0 | 0 | 0 | 0,6 |
Материалы 2-й стадии имеют меньшее относительное содержание I2S по сравнению с исходным материалом, и это также нашло отражение в снижении показателей структуры HNS-(I2S), как показано в таблице. Это сопровождалось сопутствующим увеличением показателей структур HNS-(I) и HNS-(G) в соответствии с ожиданиями. Интересно, что также наблюдалось относительное увеличение количества 6-O-сульфатированного гексозамина (H6S).
Таблица 3 Анализ UFH и материалов 2-й стадии, полученных из него, методом 2D ЯМР. Эти материалы представляют менее предпочтительный материал 2-й стадии |
||||
Моносахарид | UFH#1 | 2-я стадия #1 |
UFH#2 | 2-я стадия #2 |
Глюкозамин | ||||
HNS-(I2S) | 68,1 | 63 | 66,6 | 61,8 |
HNS-(I) | 6,3 | 10,7 | 8,6 | 11,9 |
HNS-(G) | 8,5 | 12,7 | 9,5 | 11,1 |
HNAc(внутренний) | 11,2 | 8,3 | 9,8 | 8,1 |
HNS,3S | 5,9 | 5,3 | 5,4 | 6,8 |
H6S | 82,2 | 89,2 | 84,7 | 88,4 |
Область связывания (L.R.) | 2,1 | 1,5 | 1,8 | 1,1 |
ΔU | 0 | 0 | 0 | 0 |
I2S | 76,8 | 71,3 | 76,1 | 69,8 |
I-(HNS/Ac,6S) | 6,7 | 6,3 | 6,2 | 7,1 |
I-(HNS/Ac) | 0,6 | 0,8 | 2 | 1,6 |
G-(HNS) | 7,2 | 10 | 6,6 | 10,3 |
G-(HNS,3S) | 1,6 | 2,3 | 3,7 | 3 |
G-(HNAc) | 4,3 | 2,4 | 3,6 | 2,1 |
Эпоксид | 2,8 | 3,6 | 1,8 | 2,4 |
"Предпочтительные" материалы 2-й стадии - это такие материалы, которые служат хорошими субстратами для следующей стадии процесса, то есть для ферментативного переваривания MO11, тогда как "менее предпочтительные" материалы 2-й стадии дают субстраты худшего качества. При сравнении относительного количества HNAc(внутреннего) было отмечено, что в "предпочтительных" материалах 2-й стадии содержание HNAc фактически увеличивается после 1-й стадии, тогда как в "менее предпочтительных" материалах 2-й стадии оно уменьшается (см. таблицы 2 и 3). Еще одно наблюдение заключалось в том, что относительное количество блока G-HNAc было снижено в большей степени в "менее предпочтительных" материалах 2-й стадии по сравнению с "предпочтительными" материалами 2-й стадии. Эти наблюдения были обоснованы в контексте субстратной специфичности MO11, предпочитающей воздействовать на несульфатированную глюкуроновую кислоту (т.е. HNAc-G).
Посредством проведенного анализа были идентифицированы структурные признаки, которые изменяются на 1-й стадии производственного процесса (осаждение), то есть при получении из UFH материалов 2-й стадии. Поскольку содержание N-ацетила в материалах 2-й стадии оказывается важным для следующей стадии ферментативного переваривания, желательно использовать исходный материал UFH с повышенным содержанием N-ацетила, что позволит получить лучшие материалы 2-й стадии после осаждения. Таким образом, на основе этого анализа был идентифицирован критерий предварительного отбора для исходного материала UFH, что позволило лучше контролировать и оценивать производственный процесс M118-REH.
Другие анализы и спецификации процесса получения и переработки промежуточных продуктов представлены в таблице 4 и подробно описаны ниже.
Таблица 4 Анализы и спецификации промежуточных продуктов |
||
Промежуточный продукт | Анализ | Спецификация |
1 | Агарозный гель-электрофорез: дерматан- и хондроитинсульфат ниже предела выявления | Дерматан- и хондроитинсульфат ниже предела выявления |
2 | Автоматический хромогенный анализ | |
2 | SEC-MALS | |
3 | Автоматический хромогенный анализ | Активность антифактора Xa NLT 130 МЕ/мг |
Автоматический хромогенный анализ | ||
SEC-MALS | Молярная масса: 5000-9000 дальтон Полидисперсность (PD): NMT 1,5 |
Процесс агарозного гель-электрофореза был описан выше.
Активность антифактора Xa измеряли, как это описано выше. Активность антифактора Xa измеряли или в анализаторе Diagnostica Stago с аналитическим набором для гепарина Stachrom®, или в коагуляционной системе ACL Futura™ с набором для гепарина Coatest® производства компании Chromogenix. Ответ анализатора калибровали по международному стандарту NIBSC для гепарина низкой молекулярной массы, партия 01/608 или текущая партия. Мощность лекарственного вещества M118-REH рассчитывали в международных единицах активности антифактора Xa на миллиграмм с применением статистических методов для параллельной группы анализов.
Активность антифактора IIa измеряли, как это описано здесь, применяя следующий принцип. Активность антифактора IIa измеряли или анализатором Diagnostica Stago, или в системе коагуляции ACL Futura™ с реактивами производства компании Chromogenix (субстрат S-2238, тромбин (53 nkat/флакон) и антитромбин). Ответ анализатора калибровали по 2-му международному стандарту для гепарина низкой молекулярной массы, партия 01/608 или равноценная. Мощность лекарственного вещества M118-REH рассчитывали в международных единицах активности антифактора IIa на миллиграмм с применением статистических методов для параллельной группы анализов.
Средневзвешенную молярную массу, полидисперсность и распределение молярной массы промежуточных продуктов M118-REH измеряли с применением системы вытеснительной хроматографии (SEC), присоединенной к детектору многоуглового светорассеяния (MALS) модели Wyatt miniDAWN или к любому другому подходящему детектору MALS, а также интерферометрического рефрактометра (RID) модели Optilab rEX или другого подходящего RID в соответствии с USP <621>, текущая версия. Набор колонок SEC состоял из колонок, заполненных насадкой высокого разрешения L20, например колонки Tosoh SWXL guard, последовательно соединенной с колонками Tosoh TSKgel G3000SWXL и Tosoh TSKgel G2000SWXL. Система была уравновешена на скорости 0,5 мл/мин с мобильной фазой 0,2M сульфата натрия, pH которого был подогнан до 5,0 серной кислотой. В мобильную фазу добавляли азид натрия в концентрации 0,05%. Промежуточный продукт M118-REH растворяли в мобильной фазе, получая перед впрыскиванием раствор 10 мг/мл. Средневзвешенную молярную массу, полидисперсность и параметры распределения измеряли при помощи прикладного пакета компьютерных программ Wyatt Astra или любого подходящего программного обеспечения. Распределение было охарактеризовано по процентному содержанию цепей с молярной массой менее 5500 Да (M5500) и процентному содержанию цепей с молярной массой более 8000 Да (M8000) или по процентному содержанию цепей с молярной массой менее 5000 Да (M5000) и процентному содержанию цепей с молярной массой более 7500 Да (M8000).
На 2-й стадии производственного процесса M118-REH промежуточный продукт 1 переваривали ферментом MO11. Подобно ферменту, переваривавшему промежуточный субстрат 1, он генерировал промежуточный продукт 2, содержащий остатки Δ4,5 уроновой кислоты и обладающий свойством поглощения UV232. Для отслеживания прогресса в переваривании периодически отбирали пробы реакционного раствора и измеряли поглощение света на длине волны 232 нм. Переваривание на 2-й стадии считали завершенным, если поглощение света на длине волны 232 нм не изменялось более чем на 2 AU в течение 1 часа.
Таблица 5 показывает средневзвешенную молекулярную массу и распределение различных препаратов M118-REH. Таблица 6 показывает сравнение продуктов M118-REH, LMW и UFH.
Таблица 5 Молекулярная масса, полидисперсность и характеристики длины цепей в 5 различных партиях препарата M118-REH |
|||||
LOT# | Mw (Da) | PD | M5500 | M8000 | n |
1 | 7250 | 1,1 | 24,6% | 31,9% | 13 |
2 | 7300 | 1,1 | 26,4% | 33,0% | 13 |
3 | 7500 | 1,1 | 24,6% | 35,0% | 13 |
4 | 6350 | 1,1 | 38,6% | 17,7% | 12 |
5 | 6450 | 1,1 | 40,6% | 20,7% | 12 |
* MW рассчитан по dn/dc при измерении в материале M118-REH | |||||
Таблица 6 Сравнение продуктов M118, LMWH и UFH |
|||
Признак | M118-REH1 | Lovenox2 | UFH3 |
Анти-Xa активность (МЕ/мг) | 228 | 100 | 150 |
Анти-IIa активность (МЕ/мг) | 155 | 25 | 150 |
Соотношение анти-Xa/анти-IIa | 1,5:1 | 4:1 | 1:1 |
Средняя молекулярная масса | 6350 | 4500 | 12000 |
Полидисперсность | 1,1 | 1,3 | 1,6 |
Биологическая доступность при подкожном введении | Да | Да | Нет |
Обратимость эффекта при введении протамина | Полная | Частичная | Полная |
Мониторинг по показателям ACT/APTT | Да | Нет | Да |
1 Значения для партии, использованной при формулировании лекарственного продукта M118-REH; средний MW рассчитан по dn/dc согласно литературным данным по UFH 2 Упаковочный вкладыш Lovenox 3 Монография по гепарину USP |
Структурные характеристики M118-REH: идентификация структурных характеристик M118-REH
Был разработан подход к исследованию характеристик препарата M118-REH, который связан с применением нескольких различных аналитических методик, обеспечивающих взаимодополняющие наборы данных.
Такой подход позволяет всесторонне охарактеризовать M118-REH и позволяет понять, что именно делает M118-REH уникальным по сравнению с другими препаратами LMWH. Сводка данных, полученных по этим методикам исследования характеристик, помогает определить M118-REH, как уникальную смесь.
Исследование характеристик нефракционированного гепарина (UFH) и продуктов LMWH было завершено серией аналитических методик, которые привели к идентификации химических структур, уникальных для определенного LMWH, структур, которые представлены в нескольких разных LMWH, но в неодинаковом количестве, и структур, которые ответственны за биологические свойства гепаринов.
Анализ сложной смеси LMWH наподобие M118-REH нужен для того, чтобы объяснить не только присущую этим препаратам структурную вариабельность, возникающую в связи с биосинтезом гепарина, но и разнообразие структур, возникающих при ферментативном расщеплении и в производственных процессах. Эта проблема может быть разрешена при расшифровке природных и модифицированных (если таковые имеются) сигнатур на редуцирующих и нередуцирующих концах, представленных в смеси. В то же время необходимо подтвердить, что относительная "упорядоченность" дисахаридных блоков, определенная родительской молекулой UFH, не нарушается в производственном процессе. Таким образом, необходимо обосновать контекст последовательности, в которой эти модифицированные или природные строительные блоки представлены в цепях M118-REH. Для учета этих факторов был разработан подход к исследованию характеристик M118-REH, который связан с использованием данных, полученных на основе разных аналитических методик, обеспечивающих уникальные и взаимодополняющие наборы данных.
Анализ композиций проводили с применением методики КЭ, чтобы идентифицировать и квантифицировать отдельные строительные блоки, из которых состоят цепи M118-REH. Такие способы также позволяют идентифицировать структуру строительного блока, которая ответственна за анти-Xa активность и может упоминаться под названием "строительный блок анти-Xa".
Анализ строительных блоков/композиционный анализ
Композиционный анализ методом капиллярного электрофореза (КЭ)
Вкратце, этот способ основан на ферментативном переваривании M118-REH с его разделением на составляющие строительные блоки и последующей сепарации с применением КЭ (фигуры 2A и 2B).
КЭ - это методика сепарации с высокой разрешающей способностью, которая давно и широко применяется для анализа UFH и других гликозаминогликанов. Примененный способ был основан на использовании капиллярного зонального электрофореза в капиллярах из кварцевого стекла без покрытия. При капиллярном электрофорезе наиболее высокосульфатированные разновидности мигрировали через капилляр быстрее всего и обнаруживались первыми.
Репрезентативные данные
Профиль ферментативного перевара M118-REH, наблюдаемый при использовании КЭ, показан на фигуре 2. Можно обратить внимание на то, что при анализе M118-REH не наблюдалось никаких других модифицированных строительных блоков кроме тех, что уже были представлены в исходном UFH (на что указывают структуры 1,6, наблюдаемые при анализе эноксапарина). Еще одно интересное наблюдение заключалось в том, что количество 3-O-сульфатированных разновидностей было приблизительно удвоено в препарате M118-REH по сравнению с эноксапарином (на что указывает четверной пик AT-III). Это явление обнаруживало выраженную корреляцию с повышенной анти-Xa активностью, наблюдаемой у этой смеси, и соответствовало методологии выработки M118-REH. Степень общего сульфатирования по данным проведенных анализов с применением этой методики также была немного выше для M118-REH по сравнению с эноксапарином.
Указанная методика также была применена для выявления присутствия и квантификации каждого строительного блока сахаридных компонентов M118-REH (таблица 12).
Таблица 7 Строительные блоки сахаридов, наблюдаемые при анализе M118-REH методом КЭ |
|
Пик | Структура |
1 | ΔU2SHNS,6S |
2 | ΔU2SHNS |
3 | ΔUHNS,6S |
4 | ΔU2SHNAc,6S |
5 | ΔUHNS |
6 | ΔU2SHNAc |
7 | ΔUHNAc,6S |
8 | ΔUHNAc |
9 | ΔUHNAc,6SGHNS,3S |
10 | ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S |
11 | ΔU2SHNS,6SI2S |
12 | ΔU2SHNS,6SGHNS,3S,6S |
13 | ΔUgalHNS,6S |
14 | ΔUgalHNS |
В качественном аспекте в профиле M118-REH не наблюдалось строительных блоков 1,6-ангидро (характерных для эноксапарина) или структур 2,5-ангидро (характерных для далтепарина). Количественный анализ этих структур дает несколько интересных наблюдений. При сравнении относительного показателя мол.% для пика 10 (ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S) между эноксапарином и M118-REH было обнаружено более высокое значение этого пика для M118-REH (таблица 6), а это подтверждало, что производственный процесс M118-REH обогащал активные антикоагулянтные последовательности, представленные в гепарине. Количество трисахарида (ΔU2SHNS,6SI2S) в препарате M118-REH было относительно низким по сравнению с эноксапарином. Это отражает специфику производственного процесса. Химический процесс, используемый для получения эноксапарина, приводит к "слущиванию" олигосахаридов с редуцирующего конца, то есть к увеличению числа нечетных цепей. Совсем не так обстоит дело для M118-REH, и уровень трисахарида является прямым следствием того, что наблюдается в исходном материале UFH. Этот анализ указывает на то, что методология КЭ достаточно чувствительна для того, чтобы действительно уловить эти изменения, служащие признаком различий в процессах производства разных LMWH, то есть она может оказаться очень избирательной с позиций разделения.
Таблица 8 Количественное сравнение избранных структур: M118-REH и эноксапарин |
||
Структура | M118 | Эноксапарин |
ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S | 8,6 | 4,7 |
Δ2SHNS,6SI2S | 0,6 | 1,9 |
Композиционный анализ методом 2D ЯМР
Спектроскопия ЯМР была успешно использована для выявления и квантификации сигналов, связанных с мажорными (большими) и минорными (малыми) структурными признаками полисахаридов. Спектроскопия ЯМР - это также одна из немногих уникальных методик, позволяющих эффективно выявлять в смеси компоненты идуроновой и глюкуроновой кислот. Двумерная (2D)ЯМР спектроскопия была использована как средство разрешения и идентификации отдельных сигналов, соответствующих определенной совокупности моносахаридных остатков. Такой подход позволяет не только квантифицировать основные моносахаридные составляющие смеси, но и оценить их сцепленное окружение (также количественным образом).
Двумерный ЯМР обеспечивает добавочную методику композиционного анализа M118-REH в дополнение к КЭ. 2D ЯМР дает информацию об H-U связанных дисахаридах, то есть создает дополнительные возможности для анализа дисахаридных связей. Недавно разработанная экспериментальная методология 2D протонно-углеродной корреляционной спектроскопии (HSQC) продемонстрировала способность получения количественного композиционного анализа гликозаминогликанов.
Спектры аномерной области M118-REH, измеренные методом 2D протонно-углеродной корреляционной спектроскопии (HSQC), представлены на фигуре 4. Пересекающиеся пики в аномерной области показаны на фигуре.
Анализ аномерной области M118-REH дал очень интересную информацию о том, что делает M118-REH уникальным по отношению к другим LMWH. Во-первых, аномерная область организована намного проще по сравнению с другими LMWH, например эноксапарином. Во-вторых, при анализе остатков на редуцирующих концах цепей было обнаружено, что большинство цепей заканчиваются N-ацетилглюкозамином и лишь меньшинство цепей заканчиваются N-сульфоглюкозамином. Это является результатом специфичности фермента, использованного для получения M118-REH. В-третьих, данные ЯМР указывают на то, что приблизительно 30% цепей имеют ΔU остаток на нередуцирующем конце, что, опять-таки, является результатом специфичности фермента. В-четвертых, в M118-REH не наблюдалось присутствия G-HNAc дисахарида. И, наконец, в спектре ЯМР не наблюдался сахарид в области связывания. Процентный состав моносахаридов в композиции M118-REH и их сцепленное окружение представлены в таблице 7. Анализ методом ЯМР также позволяет определить соотношение идуроновая кислота/глюкуроновая кислота для M118-REH.
Таблица 9 Процентная композиция остатков глюкозамина и уроновой кислоты в M-118 (результаты двух экспериментов) |
|
M118-REH | |
Глюкозамин | |
HNS-(I2S) | 57,6/57,0 |
HNS-(I) | 9,8/12,0 |
HNS-(G) | 11,0/11,1 |
HNAc(внутренний) | 6,1/3,1 |
HNS,3S | 7,3/7,2 |
HNSred | 1,6/1,5 |
HNAcαredox | 4,6/5,1 |
HNAcβredox | 2,0/3,0 |
H6S | 90,4/90,5 |
L.R. | 0/<0,1 |
Уронаты | |
ΔU | 1,9/2,4 |
I2S | 68,7/70,2 |
I-(HNS/Ac,6S) | 9,9/9,5 |
I-(HNS/Ac) | 1,4/0,9 |
G-(HNS) | 8,7/7,7 |
G-(HNS,3S) | 5,9/4,8 |
G-(HNAc) | 0/0 |
GalA | 2,7 |
Epox | 0,8 |
Выводы
Были идентифицированы следующие структурные признаки M118-REH:
• Обогащение сахаридными цепями, содержащими 3-O-сульфат (тетрасахарид, связывающий AT-III) на основе относительного мол.% по сравнению с известными LMWH и исходным материалом UFH.
- Генерирование преобладающей структуры на редуцирующем конце (HNAc).
- Единственная модифицированная структура, наблюдаемая на нередуцирующем конце - ΔU.
- Сохранение природной дисахаридной структуры скелета UFH с ограниченным внесением изменений, связанных с производственным процессом, по сравнению с другими LMWH.
- Удаление из смеси тех компонентов UFH, которые не нужны для анти-Xa или анти-IIa активности (связывания тромбина), то есть создание более определенного гепарина.
- Специфичность процесса деполимеризации M118-REH сохраняет требуемую длину цепей и проксимальное разделение сайтов связывания, что позволяет сохранить анти-IIa активность.
Основное свойство всех продуктов LMWH заключается в том, что удлиненные полисахаридные цепи расщепляются на относительно мелкие фрагменты посредством многих способов деполимеризации, как это отображено на фигуре 5. Это расщепление, как событие, вызванное или химическими, или ферментативными реакциями, приводит к характерным сигнатурам, как на редуцирующем, так и на нередуцирующем конце молекулы. Характерные концевые группы, представленные в M118-REH, описаны ниже.
Структура на нередуцирующем конце
Специфичность ферментативного расщепления, приводящего к образованию нового нередуцирующего конца (аббревиатура AU), обеспечивает позиционирование сайта связывания AT-III в пределах полисахаридной цепи.
Структура на редуцирующем конце
Структуры глюкозамина на новых редуцирующих концах цепей M118-REH отражали специфичность фермента, использованного в процессе. В результате большинство структур редуцирующего конца M118-REH были представлены остатками N-ацетилированного гексозамина (HNAc).
Структурные различия между M118-REH и нефракционированным гепарином
1) M118-REH имеет более высокий показатель мол.% сахаридной последовательности, связывающей антитромбин, по сравнению с исходным нефракционированным гепарином (UFH).
2) M118-REH имеет пренебрежимо малое количественное содержание области связывания по сравнению с исходным UFH.
3) M118-REH имеет определенную процентную долю Δ4,5 глюкуроновой кислоты на нередуцирующих концах цепей, в то время как UFH не содержит этого модифицированного остатка на нередуцирующем конце.
В заключение можно констатировать, что M118-REH представляет собой гепариновый продукт, обладающий уникальными физическими и функциональными свойствами.
Большинство структурных признаков, обсуждавшихся выше, были прямым следствием специфических свойств фермента, использованного для получения M118-REH. Эти признаки включали преобладающую структуру редуцирующего конца (HNAc), единственную модифицированную структуру на нередуцирующем конце (ΔU), а также устранение области связывания. Кроме того, поскольку фермент преимущественно расщепляет низшие или несульфатированные домены в гепариновой смеси, он не оказывает воздействия на последовательность, связывающую AT-III, которая в результате богато представлена в продукте M118-REH.
Описанный выше протокол исследования характеристик продукта был использован для анализа 4 партий M118-REH. Этот анализ подтверждает постоянство условий в производственном процессе по выработке продукта M118-REH.
Таблица 10 Анализ нескольких партий M118-REH методом КЭ |
|||||
Пик | Структура | #1 | #2 | #3 | #4 |
1 | ΔU2SHNS,6S | 57,1 | 59,5 | 57,0 | 57,4 |
2 | ΔU2SHNS | 6,0 | 5,6 | 5,4 | 6,1 |
3 | ΔUHNS,6S | 13,2 | 12,3 | 12,2 | 12,7 |
4 | ΔU2SHNAc,6S | 1,8 | 1,6 | 1,7 | 1,8 |
5 | ΔUHNS | 0,6 | 0,7 | 0,6 | 0,7 |
6 | ΔU2SHNAc | 0,5 | 0,5 | 0,4 | 0,4 |
7 | ΔUHNAc,6S | 4,5 | 3,7 | 3,7 | 4,3 |
8 | ΔUHNAc | 1,8 | 1,3 | 1,5 | 1,8 |
9 | ΔUHNAc,6SGHNS,3S | 1,3 | 1,0 | 1,2 | 1,2 |
10 | ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S | 10,4 | 9,4 | 8,9 | 8,6 |
11 | ΔU2SHNS,6SI2S | 0,3 | 0,3 | 0,7 | 0,6 |
12 | ΔU2SHNS,6SGHNS,3S,6S | 0,5 | 0,7 | 1,0 | 0,9 |
13 | ΔUgalHNS,6S | 1,7 | 2,9 | 4,4 | 3,0 |
14 | ΔUgalHNS | 0,2 | 0,5 | 0,9 | 0,4 |
Таблица 10A Предпочтительные диапазоны пиков |
||
Пик | Структура | A |
1 | ΔU2SHNS,6S | 58±5 |
2 | ΔU2SHNS | 6±2,5 |
3 | ΔUHNS,6S | 13±3 |
4 | ΔUHNAc,6S | 1,5±1,5 |
5 | ΔUHNS | 0,6±1,0 |
6 | ΔU2SHNAc | 0,5±1,0 |
7 | ΔUHNAc,6S | 4±2 |
8 | ΔUHNAc | 1,5±2,0 |
9 | ΔUHNAc,6SGHNS,3S | 1,2±1,5 |
10 | ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S | 9,5±4 |
11 | ΔU2SHNS,6SI2S | 0,5±1,0 |
12 | ΔU2SHNS,6SGHNs,3s,6S | 0,7±2,0 |
13 | ΔUgalHNS,6S | 3,0±3,0 |
14 | ΔUgalHNS | 0,6±1,5 |
Таблица 11 Процентный состав M118-REH по остаткам глюкозамина и уроновой кислоты |
||||
Моносахарид | 1 | 2 | 3 | 4 |
Глюкозамин | ||||
HNS-(I2S) | 54,3 | 57,0 | 61,8 | 57,6 |
HNS-(I) | 12,5 | 12,0 | 11,0 | 9,8 |
HNS-(G) | 10,8 | 11,1 | 9,5 | 11,0 |
HNAc(внутренний) | 3,4 | 3,1 | 4,2 | 6,1 |
HNS,3S | 8,7 | 7,2 | 7,0 | 7,3 |
HNSred | 0,8 | 1,5 | 0,4 | 1,6 |
HNAcαred | 6,0 | 5,1 | 4,1 | 4,6 |
HNAcβred | 3,6 | 3,0 | 2,0 | 2,0 |
H6S | 90,0 | 90,5 | 91,3 | 90,4 |
Область связывания | <0,1 | <0,1 | <0,1 | <0,1 |
Уронаты | ||||
ΔU | 2,7 | 2,4 | 2,1 | 1,9 |
I2S | 69,8 | 70,2 | 70,6 | 68,7 |
I-(HNS/Ac,6S) | 11,8 | 9,5 | 9,2 | 9,9 |
I-(HNS/AC) | 1,4 | 0,9 | 1,2 | 1,4 |
G-(HNS) | 8,9 | 7,7 | 8,4 | 8,7 |
G-(HNS,3S) | 5,4 | 4,8 | 4,1 | 5,9 |
G-(HNАс) | 0 | 0 | 0 | 0 |
Галактуроновая кислота | 0 | 2,1 | 2,4 | 2,7 |
Эпоксид | 0 | 2,4 | 2,0 | 0,8 |
Таблица 11A Предпочтительные диапазоны структур |
|
Моносахарид | A |
Глюклозамин | |
HNS-(I2S) | 57,7±7 |
HNS-(I) | 11,3±5 |
HNS-(G) | 10,6±5 |
HNAc(внутренний) | 4,2±5 |
HNS,3S | 7,6±5 |
HNSred | 1,1±5 |
HNAcαred | 5,0±5 |
HNAcβred | 2,7±5 |
H6S | 90,6±6 |
Область связывания | <0,1-0,0 |
Уронаты | |
ΔU | 2,3±5 |
I2S | 69,8±6 |
I-(HNS/Ac,6S) | 10,1±6 |
I-(HNS/Ac) | 1,2±5 |
G-(HNS) | 8,4±5 |
G-(HNS,3S) | 5,1±5 |
G-(HNAc) | 0±2 |
Галактуроновая кислота | 1,8±5 |
Эпоксид | 1,3±5 |
Описание и композиция лекарственного продукта M118-REH для инъекций
Лекарственный продукт M118-REH для инъекций - это прозрачный бесцветный или слегка желтый раствор в одноразовых стеклянных флаконах 1-го типа емкостью 3 мл с пробкой из хлорбутилкаучука, закрытой сверху алюминиевой обжимной крышкой. Каждый флакон номинально содержит 5000 МЕ активности антифактора Xa в 2 мл.
Количественный состав препарата M118-REH для инъекций представлен в таблице 11. Состав указан в расчете на объем 2 мл, указанный на этикетке флакона. В соответствии с рекомендациями USP по избыточному заполнению флаконы заполняли объемом продукта 2,15 мл.
Таблица 12 Состав препарата M118-REH для инъекций |
|||
Компонент | Количество на единицу упаковки (флакон) | Функция | Стандарт качества |
Лекарственное вещество M118-REH | 5000 МЕ анти-Xa активности1 | Активный фармацевтический ингредиент | Не определен |
Хлорид натрия | Подгонка осмотического давления в процессе2 | Осмотический агент | USP |
Вода для инъекций | Сколько необходимо до объема 2 мл | Растворитель | USP |
1 Количество лекарственного вещества M118-REH рассчитывают на основе активности антифактора Xa (по сухому весу) и потерь при высушивании. При допущении об уровне активности антифактора Xa 200 МЕ/мг, количество лекарственного вещества M118-REH составляет 25 мг на флакон. 2 Количество хлорида натрия, необходимое для достижения осмотического давления 280-330 мОсм/л приблизительно составляет 8 мг/мл или 16 мг на флакон. |
Для применения препарата M118-REH для инъекций разбавитель не требовался.
Компоненты препарата M118-REH для инъекций
Препарат M118-REH для инъекций производят посредством растворения сухого вещества M118-REH в воде для инъекций. Сухое вещество M118-REH обладает высокой растворимостью в воде, поэтому распределение частиц вещества по размеру не имеет никакого значения и не влияет на действенность лекарственного продукта.
Хлорид натрия (класса USP) является единственным наполнителем, используемым в препарате M118-REH для инъекций (в приблизительной концентрации 8 мг/мл). Хлорид натрия был выбран как средство для подгонки осмотического давления, во избежание дискомфорта в месте инъекции и гемолиза при введении лекарства.
Разработки производственного процесса по получению препарата M118-REH для инъекций
Производственный процесс по получению препарата M118-REH для инъекций состоит из растворения лекарственного вещества M118-REH в воде для инъекций (USP) и подгонке осмотического давления хлоридом натрия (USP). Полученный раствор фильтруют через два последовательно соединенных фильтра с размером пор 0,2 пм и, соблюдая правила асептики, разливают по флаконам. Продукты гепарин-натрия подвержены разрушению при очень высоких температурах, поэтому их нельзя подвергать конечной стерилизации. Блок-схема процесса по получению препарата M118-REH для инъекций представлена на фигуре 6 (см. описание ниже).
Фигура 6 отображает блок-схему процесса получения препарата M118-REH для инъекций. Количество лекарственного вещества, вводимого в каждую производственную партию, рассчитывают на основе анализа (активность антифактора Xa) и значений потерь при сушке из сертификата анализа согласно следующей расчетной формуле:
2500 МЕ/мл/анализ (МЕ/мг) × 100/(100 - % потерь при сушке) × размер партии (мл) ÷ 1000 мг/г = количество лекарственного вещества, вводимого в производственную партию (г).
В сосуд для получения продукта добавляли воду для инъекций в количестве приблизительно 75% от конечного веса партии и начинали перемешивание. Расчетное количество лекарственного вещества M118-REH медленно добавляли в сосуд и перемешивали до растворения всех твердых частиц. Затем добавляли начальное количество хлорида натрия класса USP и перемешивали раствор до растворения всех твердых частиц. После этого добавляли воду для инъекций до конечного веса партии, продолжая перемешивать раствор еще 5-15 минут. Измеряли осмотическое давление и при необходимости добавляли нужное количество хлорида натрия класса USP для доведения осмотического давления до уровня 280-330 мОсм/л.
Для стерилизации полученной массы лекарственного продукта M118-REH использовали два последовательно соединенных предварительно стерилизованных фильтра Millipak 20 PVDF (поливинилиденфторид) с размером пор 0,22 мкм. Продукт фильтровали в наполняемый резервуар, и в конце фильтрования проверяли целостность фильтров.
Биологические и фармакологические свойства M118-REH
M118-REH представляет собой продукт ферментативного переваривания, который приводит к получению деполимеризованного гепарина с низкой молекулярной массой. Деполимеризованный пул обогащен активными антикоагулянтными и антитромботическими фракциями, которые могут быть следствием сайт-специфического расщепления специфической гликозаминогликанлиазой. Сайт-специфическая и ориентированная деполимеризация, осуществляемая этим ферментом, позволяла придать продукту M118-REH свойства высокоэффективной молекулы, создающей защиту от повреждения артерий. Кроме того, M118-REH обладает такими свойствами, как обратимость действия и возможность отслеживания с применением простых анализов у постели пациента.
Были проведены аналитические исследования M118-REH для выяснения его фармакологических и биологических свойств, кроме того, этот процесс позволил изучить механизмы его действия как in vitro, так и in vivo. Проводилось исследование механизма антикоагуляции и антитромботической функции. В этих исследованиях проводился предварительный анализ взаимосвязей структуры и активности (SAR). Эти исследования и их результаты, описанные ниже, представляют собой начальный анализ, направленный на создание профиля биофармакологической активности препарата M118-REH.
Анализ коагуляционной активности in vitro:
Анти-Xa активность препарата M118-REH in vitro варьируется в диапазоне 180-300 МЕ/мг, согласно 2-му международному стандарту для гепарина низкой молекулярной массы. Повышенная анти-Xa/IIa активность препаратов M118-REH in vitro пропорциональна количеству фракции ΔUHNАc,6SGHNs,3S,6S, содержащей 3-O-сульфатированный компонент.
Анти-Xa активность препарата M118-REH in vitro варьируется в диапазоне 100-250 МЕ/мг, согласно 2-му международному стандарту для гепарина низкой молекулярной массы.
M118-REH в дозе 2,4 мкг/мл может пролонгировать aPTT in vitro от 40 секунд до 80 секунд, причем изменение aPTT пропорционально анти-Xa и анти-IIa активности препарата.
Нейтрализация протаминсульфатом in vitro, измеряемая по анти-Xa активности:
Протамин может полностью нейтрализовать анти-Xa активность M118-REH в соотношении 1 мг : 100 анти-Xa МЕ в плазме человека. Этот эффект можно сравнить с другими препаратами LMWH. Например, протамин может нейтрализовать только 60% анти-Xa активности эноксапарина в соотношении 3 мг : 100 анти-Xa МЕ в плазме человека. Эти результаты показаны на фигуре 7.
Высвобождение эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC) ингибитора метаболического пути тканевого фактора (TFPI) в эксперименте in vitro:
Клеточный материал HUVEC из ATCC выращивали в 2% модифицированной среде FBS F12K без ECGS. M118-REH, Lovenox и UFH готовили в той же среде, получая конечную концентрацию 0,01 мг/мл и 0,005 мг/мл. Три лунки клеток в каждой группе эксперимента инкубировали при 37°C, в атмосфере с 5% CO2 и 95% O2 в течение 24 и 48 часов. Супернатант извлекали для анализа на высвобождение TFPI с применением набора ELISA производства компании ADI.
M118-REH в концентрации 0,005 мг/мл и 0,01 мг/мл значительно увеличивал высвобождение TFPI из HUVEC в точках времени 24 часа и 48 часов, как это показано на фигуре 8. M118-REH приводил к большему высвобождению TFPI из HUVEC в клеточную среду по сравнению с нефракционированным гепарином. Lovenox не вызывал повышенного высвобождения TFPI по сравнению с контролем.
Фармакокинетика M118-REH in vivo:
На таких моделях грызунов как крысы Sprague-Dawley и мыши B16B16 препарат M118-REH демонстрировал более длительный период полувыведения после внутривенной инъекции по сравнению с UFH, сходный по времени при сравнении с эноксапарином. M118-REH быстро всасывается после подкожной инъекции: показатель Tmax варьируется в диапазоне от 1 часа до 3 часов.
На кроличьей модели с использованием новозеландских белых кроликов было показано, что подкожная инъекция M118-REH приводила к более высокой биологической доступности в терминах анти-Xa и анти-IIa активности по сравнению с UFH, причем биологическая доступность составляла от 50% до 100% по сравнению с внутривенной инъекцией. Фармакокинетика M118-REH сравнима с таковой для эноксапарина: период полувыведения составляет от 3 до 5 часов, а основным механизмом выведения является почечная экскреция.
Таблица 13 Параметры фармакокинетики M118-REH, эноксапарина и UFH после внутривенной инъекции на кроличьей и крысиной модели |
||||
M118-REH | эноксапарин | UFH | ||
T1/2 (часы) кролик в/в 1,5 мг/кг |
анти-Xa активность |
0,87±0,25 | 1,93±0,45 | 0,54±0,03 |
анти-IIa активность |
0,85±0,05 | 1,78±0,63 | 0,89±0,05 | |
T1/2 (часы) крыса в/в анти-Xa |
1 мг/кг | 0,39±0,06 | 0,41±0,07 | 0,35±0,06 |
0,5 мг/кг | 0,29±0,12 | Не определено | 0,19±0,04 |
У NHP (нечеловекообразных приматов, например обезьян Cynomolоgus, период полувыведения M118-REH варьировался от 20 минут до 50 минут. Соотношение анти-Xa/IIa после внутривенной инъекции оставалось постоянным в течение всего периода исследования PK, варьируясь от 0,5 до 2, а препарат M118-REH по данным анализа фармакокинетических параметров распределялся в системе кровообращения и выводился из организма через почки. Таблица 14 отображает фармакокинетику M118-REH на модели NHP.
Таблица 14 Фармакокинетика M118-REH у NHP. |
|||||||||
Испытуемый материал | Группа | Доза (МЕ/кг) | Rsq | t1/2 (часы) | Cmax (МЕ/мл) | AUCINF_набл. с(ч×МЕ/мл) | Vz_набл. (мл/кг) | Cl_набл. (мл/ч/кг) | |
Анти-Xa | 1 | Средняя | 150,0 | 0,98 | 0,50 | 4,07 | 4,07 | 27,26 | 37,24 |
Ст. откл. | 0,9 | 0,02 | 0,04 | 0,15 | 0,54 | 5,57 | 4,65 | ||
Анти-IIa | 2 | Средняя | 150 | 1,0 | 0,68 | 2,733 | 3,45 | 43,17 | 43,92 |
Ст. откл. | 0,0 | 0,01 | 0,05 | 0,38 | 0,45 | 3,66 | 5,38 | ||
Фармакокинетика M118-REH представляет элиминацию первого порядка |
Концентрация TFPI in vivo оставалась на высоком уровне через 24 часа после введения дозы M118-REH. Показатели ACT и aPTT проявляли сильную корреляцию с анти-Xa активностью.
Фармакодинамическое исследование M118-REH in vivo:
На модели грызунов, таких как крысы Sprague-Dawley, животным проводили внутривенные инъекции M118-REH и UFH в дозах 1 или 2 мг/кг через яремную вену, тогда как эноксапарин вводили в дозах 0,5 или 1 мг/кг. Параметр ACT (активированное время свертывания) измеряли инструментом Hemochron Jr. На этой модели активированное частичное тромбопластиновое время (aPTT) и активированное время свертывания представляли ответную реакцию на возрастающие дозы M118-REH. Показатель ACT увеличивался в 1,5-3 раза после внутривенной инъекции M118-REH в дозе 0,5 мг/кг и в 2-4 раза после дозы 1 мг/кг. Фармакодинамический профиль был похож на фармакокинетику в отношении измерений анти-Xa/IIa, период полувыведения варьировался в диапазоне от 0,15 до 0,5 часа.
На кроличьей модели, с использованием новозеландских белых кроликов, показатели aPTT и ACT измеряли после внутривенного введения M118-REH. Было обнаружено, что aPTT и ACT увеличивались пропорционально дозе M118-REH. Соотношения анти-Xa/IIa оставались постоянными как после внутривенного, так и после подкожного введения препарата в дозе 1,5 мг/кг. В отличие от M118-REH, соотношения анти-Xa/IIa для эноксапарина и UFH после внутривенного введения заметно флюктуировали во временной динамике.
Как показано на фигуре 9, на моделях NHP, например, у обезьян Cynomologus, результаты показали, что показатели aPTT и ACT значительно увеличивались: в 2-4 раза и 1,5-3 раза, соответственно, после внутривенного введения M118-REH в дозе 150 анти-Xa МЕ/кг.
Болюсная внутривенная инъекция M118-REH усиливала высвобождение TFPI в системный кровоток в 2-20 раз, причем этот эффект длился более 24 часов.
Эффекты внутривенной болюсной инъекции M118-REH с последующим длительным вливанием также были исследованы на собачьей модели тромбоза глубоких артерий, индуцированного тяжелым электролитным повреждением. Подробности этого исследования приведены ниже в примере, озаглавленном "модель электролитического повреждения бедренной артерии у собак породы бигль".
Исследование эффективности M118-REH на доклинических моделях:
Повреждение сонной артерии, индуцированное хлоридом железа
Исследования по сравнению M118-REH и эноксапарина продемонстрировали зависимое от дозы подавление обтурирующего тромбоза. Препарат M118-REH в дозе 0,5 мг/кг статистически значимо (p<0,05) увеличивал промежуток времени до возникновения обтурации (TTO) по сравнению с солевым раствором (28,5±7,1 минут и 11,1±0,9 минут соответственно). В двадцати пяти процентах случаев (2/8) повреждения сонной артерии при инъекции 0,5 мг/кг M118-REH проходимость сосуда сохранялась на протяжении всего 60-минутного периода наблюдения. В отличие от этого, все поврежденные сонные артерии крыс (9/9) оставались непроходимыми после инъекции солевого раствора на протяжении всего 60-минутного периода наблюдения. Введение M118-REH в дозе 1 мг/кг дополнительно увеличивало TTO (55,3±3,6 минут) при сохранении проходимости сосуда на протяжении всего 60-минутного периода наблюдения в 83% случаев (10/12). У всех крыс, получивших эноксапарин в дозе 2, 3 или 4 мг/кг, показатель TTO был значительно больше, чем у животных, которым вводили контрольный солевой раствор (19,1±1,4, 36,0±5,6 и 40,2±6,3 минут соответственно). При введении эноксапарина у всех животных (7/7), получивших дозу 2 мг/кг, сонные артерии оставались непроходимыми на протяжении всего 60-минутного периода наблюдения, тогда как у животных, получивших дозу эноксапарина 3 и 4 мг/кг показатель непроходимости сосудов составил 62% (7/13) и 55% (6/11) соответственно. Препарат M118-REH (1 мг/кг) создавал наибольшую степень защиты от тромбоза, несмотря на меньшую анти-Xa активность по сравнению с дозами эноксапарина 3 и 4 мг/кг. Результаты представлены на фигуре 10 и в таблице 15.
Таблица 15 Статистический анализ данных по эффективности (критерий Стьюдента) |
||||||
Контроль | M118-REH 0,5 мг/кг |
M118-REH 1 мг/кг |
Эноксапарин натрий 2 мг/кг |
Эноксапарин натрий 3 мг/кг |
Эноксапарин натрий 4 мг/кг |
|
Средняя (мин) | 11,3 | 29,2** | 55,3#** | 23,2** | 36,0** | 41,8** |
Ст. откл. | 2,3 | 16,8 | 12,6 | 8,3 | 20,3 | 20,6 |
*p<0,05 по сравнению с контрольной группой; **p<0,01 по сравнению с контрольной группой; #p<0,01 по сравнению с эноксапарин натрием в дозе 3 мг/кг |
Модель электролитического повреждения бедренной артерии у собак породы бигль (модель Lucchesi):
Антитромботические и антикоагулянтные эффекты препарата M118-REH были исследованы на собачьей модели глубокого артериального тромбоза, индуцированного тяжелым электролитным повреждением.
Хирургические процедуры
Животным проводили премедикацию внутримышечным (в/м) сульфатом атропина в дозе 0,02 мг/кг и в/м ацепромазином (0,2 мг/кг, ≤3 мг на животное) по меньшей мере за 10-15 минут до индукции анестезии внутривенным пропофолом (4-8 мг/кг). Животных интубировали и поддерживали в состоянии наркоза при помощи ингаляционного анестетика изофлурана, который вводили через респиратор с регулируемым объемом.
На медиовентральной поверхности шеи делали продольный разрез для доступа к тканям, окружающим сонные артерии. Одну сонную артерию и обе яремные вены (одну для резерва) последовательно обнажали приблизительно на 2 см тупым рассечением тканей и фиксировали поддерживающими лигатурами на проксимальном и дистальном концах. Были сделаны еще два разреза, которые начинались на животе и были направлены дистально вдоль гребешковой мышцы на расстояние, охватывавшее 66-75% каждого бедра. По направлению каждого разреза вскрывали фасции и обнажали лежащую под ними бедренную артерию приблизительно на 2-3 см.
Инструментальные манипуляции на животных
Двадцати четырем собакам породы бигль, находящимся в состоянии наркоза, были установлены внутрисосудистые электроды, проведенные через стенку левой и правой бедренной артерий и расположенные в прямом контакте с интимой. Каждый электрод был соединен с источником постоянного тока, причем катод размещали в отдаленном месте под кожей. Стенозирующее устройство было размещено непосредственно дистальнее электрода, перваскулярный (чрессосудистый) датчик - проксимальнее электрода, а катетер был введен в сонную артерию, причем все устройства были соединены с физиологической платформой Gould Ponemah (Linton Instrumentation, Норфолк, Великобритания) для непрерывного отслеживания артериального давления, кровотока и частоты сердцебиений. Второй катетер вводили в яремную вену для отбора образцов крови. Наконец, в периферийную вену был вставлен постоянный катетер для капельных вливаний испытуемого препарата, а для записи электрокардиограммы были установлены отведения на конечности (снятие с отведения II).
Модель электролитического повреждения бедренной артерии
После установки инструментов каждое животное получало непрерывное внутривенное вливание носителя (0,9% стерильного физиологического раствора) в течение 90 минут. Через 15 минут после начала вливания на правую бедренную артерию (контрольную) подавали электрический ток (300 мкA) через внутрисосудистый электрод, непрерывно продолжая воздействие до полного образования тромба, определяемого по снижению допплеровского потока до уровня ≤2% по сравнению с исходными показателями, или до конца периода наблюдения, продолжавшегося 180 минут после начала электролитического воздействия, если сосуд оставался проходимым. После этого сосуд лигировали проксимальнее и дистальнее места электролитического повреждения, подвергавшийся воздействию тока сегмент извлекали и проводили взвешивание тромба, если таковой был представлен в сосуде.
В этой модели внутрисосудистые тромбы, содержащие много тромбоцитов, образуются поблизости от дистального артериального стеноза. В соответствии с этим стенозирующее устройство было настроено на ограничение индуцированной гипоксией реактивной гиперемии до уровня ≤80% от начального ответа на физическую окклюзию (базисную реактивную гиперемию определяли по каждой бедренной артерии непосредственно перед вливанием носителя или активного испытуемого препарата). Для обеспечения гемодинамики в месте повреждения на уровне нормального кровотока в бедренной артерии, целевые показатели артериального давления и частоты сердцебиений определили на уровне приблизительно 70 миллиметров ртутного столба и 100 ударов в минуту, соответственно, стараясь поддерживать эти показатели при ведении изофлуранового наркоза.
После окончания первого эксперимента по оценке базисных тромботических параметров у каждого животного на правой бедренной артерии точно такие же процедуры выполняли на левой бедренной артерии (активное лечение) в присутствии M118-REH или UFH, вводимых через внутривенное вливание. Животных распределили на 4 экспериментальные группы (n=6). Животные в первых трех группах получали внутривенные болюсные инъекции препарата M118-REH в дозах 37,5, 75 и 150 анти-Xa МЕ/кг, соответственно, с последующим непрерывным вливанием M118-REH в дозе 1,0 анти-Xa МЕ/кг/мин в течение 90 минут. Животные четвертой группы получали болюсную внутривенную инъекцию UFH в дозе 75 Ед/кг с последующим непрерывным вливанием UFH в дозе 1,0 Ед/кг/мин в течение 90 минут. Непрерывное электролитическое повреждение начинали через 15 минут после болюсной лечебной инъекции, а последующий анализ проводили точно так же, как и при введении носителя (контроль).
Анализы на время кожного кровотечения (CBT) и взятие образцов крови проводили в точки времени, указанные в протоколе (см. ниже). Физиологические параметры, отслеживаемые в ходе процедуры, включали частоту пульса, частоту дыханий, прямое кровяное давление, ректальную температуру, дыхательный объем, уровень углекислого газа в конце спокойного выдоха и насыщение O2.
Гематологические и коагулологические анализы
Для гематологических и коагулологических анализов образцы цельной крови (приблизительно 100 мкл) собирали в точках времени 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150, 165 и 180 минут для определения ACT. ACT оценивали в системе микрокоагуляции HEMOCHRON® Jr. Signature+ (ITC, Эдисон, штат Нью-Джерси, США) согласно инструкциям производителя. Две аликвотных пробы цельной крови (приблизительно по 1,3 мл каждая) брали через 15 минут, через 60 минут, а также либо через 180 минут, либо во время закупорки сосуда, если это было применимо, для гематологических и дополнительных коагулологических анализов. Гематологические параметры (WBC, RBC, HGB, CHT, MCV, MCH, MCHC, PLT, RTC, ARTC и WBC с дифференцированием по видам лейкоцитов) анализировали в гематологической системе Advia 120 (Bayer Diagnostics Norden, Люнгбю, Дания) согласно инструкциям производителя. Коагулологические анализы (протромбиновое время [PT], активированное частичное тромбопластиновое время [aPTT] и уровень фибриногена [FIB]) проводили с применением анализатора коагуляции MLA Electra 1400C (Beckman Coulter, Фуллертон, штат Калифорния, США) согласно инструкциям производителя.
Для определения уровней антифактора Xa и антифактора IIa образцы цельной цитратной крови, собранные через 0, 15 и 60 минут после начала лечения, центрифугировали на скорости 3000 g приблизительно в течение 10 минут в охлажденной центрифуге. Плазму собирали, быстро замораживали при -20°C и хранили при -80°C до момента готовности к хромогенному анализу. Для анализов антифактора Xa и антифактора IIa применяли гепариновый набор анти-Xa Stachrome (Diagnostica Stago, Аньер-на-Сене, Франция) и набор реактивов, состоящий из субстрата S2238, бычьего тромбина и антитромбина III человека (Chromogenix, Милан, Италия). Все хромогенные анализы были квантифицированы в анализаторе STA-R (Diagnostica Stago), следуя стандартной рабочей процедуре Momenta Pharmaceuticals, Inc. SOP по измерениям активности антифактора Xa и антифактора IIa. Показатель CBT определяли через 15 минут, через 60 минут, а также либо через 180 минут, либо во время закупорки сосуда, если это было применимо. Оценку CBT выполняли на передней лапе животного по методике Mielke с применением стандартной рабочей процедуры испытательной установки.
Статистика
Величины были представлены как средние ± стандартные отклонения (SD), если специально не указано иное. Сравнение средних проводили по t-критерию Стьюдента при допущении о равной дисперсии в разных группах эксперимента. Частоту закупорки сосудов в разных группах эксперимента (альтернативное лечение) сравнивали через вычисление шансов по отношению к контролю и с применением z-критерия для извлечения величины P. При всех сравнениях уровень значимости был определен величиной P 0,05.
Активность антифактора Xa и антифактора IIa в плазме
Разные дозы препарата M118-REH сравнивали со стандартной дозой UFH (75 Ед/кг). Препарат M118-REH демонстрировал зависимое от дозы подавление как фактора Xa, так и фактора IIa, причем самая высокая доза M118-REH (150 МЕ/кг) демонстрировала сходную активность антифактора Xa по сравнению с UFH (фигура 13 и таблица 16). Активность антифактора IIa увеличивалась пропорционально активности антифактора Xa, как для M118-REH, так и для UFH, хотя коэффициент корреляции был выше для M118-REH (r2=0,890), чем для UFH (r2=0,465) (фигура 14). Наконец, соотношение активностей антифактора Xa и антифактора IIa в плазме было более постоянным по времени для M118-REH, чем для UFH, что согласуется с известными данными о вариабельном метаболизме больших и полидисперсных молекул UFH (фигура 15).
Таблица 16 Сводка данных по избранным гематологическим показателям |
|||
Обработка | ACT (с)* | Антифактор Xa (МЕ±SD)* | Антифактор IIa (МЕ±SD)* |
Контроль | 69±6 | 0,0±0,0 | 0,0±0,0 |
M118-REH (37,5 МЕ/кг)† | 101±7‡ | 1,20±0,16 | 0,64±0,12 |
M118-REH (75 МЕ/кг)† | 108±13‡ | 1,66±0,37 | 0,71±0,20 |
M118-REH (150 МЕ/кг)† | 141±28§ | 2,31±0,13 | 1,06±0,09 |
UFH (75 Ед/кг)† | 163±55║ | 2,89±1,31 | 0,95±0,19 |
ACT - активированное время свертывания крови, МЕ - международная единица, SD - стандартное отклонение, UFH - нефракционированный гепарин * Записано через 60 минут после начала вливания испытуемого препарата, † Болюсная доза, ‡ P<0,05 при сравнении M118-REH с UFH, § P<0,01 при сравнении M118-REH с контролем, ║ P<0,01 при сравнении UFH с контролем. |
Анализы коагуляции
Затем антикоагулирующую активность препарата M118-REH сравнивали со стандартной дозой UFH. При использовании M118-REH подавление свертывания крови с эффектом дозовой зависимости развивалось уже через 15 минут во всех анализах коагуляции и поддерживалось в течение всего 60-минутного периода наблюдения (фигура 16). Через 60 минут значительно большее время свертывания в анализе наблюдалось после введения UFH по сравнению с M118-REH в дозах 37,5 или 75 анти-Xa МЕ/кг (таблица 16). Когда M118-REH вводили в дозе 150 анти-Xa МЕ/кг, различие между UFH и M118-REH в анализе ACT было статистически незначимым (таблица 16). Контрольные эксперименты продемонстрировали, что различия между группами альтернативной терапии в анализах коагуляции не объяснялись различиями в концентрации субстрата фибриногена (данные не представлены).
Антитромботические эффекты
Основываясь на том наблюдении, что M118-REH в дозе 150 анти-Xa МЕ/кг проявлял сходные антикоагуляционные свойства с гепарином в стандартной дозе 75 Е/кг, провели сравнительный анализ антитромботической эффективности M118-REH в дозе 150 анти-Xa МЕ/кг, а также в более низких дозах с UFH на собачьей модели глубокого артериального тромбоза. При вливании носителя полная закупорка контрольной артерии была отмечена у 24/24 [100%] животных в течение всего периода наблюдения продолжительностью 180 минут (фигура 17). В группе животных, получавших UFH, 5/6 (83,3%) животных достигли заданного моделью снижения допплеровского потока. По сравнению с этим полная закупорка наблюдалась у 3/6 (50%), 2/6 (33,3%) и 1/6 (16,7%) животных, получивших болюсные дозы M118-REH 37,5, 75 и 150 анти-Xa МЕ/кг, соответственно, что соответствовало эффекту дозовой зависимости. Различия эффектов лечения между M118-REH и носителем по частоте закупорки артерий были статистически значимыми для всех болюсных доз M118-REH (P<0,05). Различие между M118-REH в болюсной дозе 150 анти-Xa МЕ/кг и UFH также было статистически значимым (P<0,05). Таким образом, M118-REH в дозе 150 анти-Xa МЕ/кг продемонстрировал свое превосходство по эффективности над UFH в дозе 75 Е/кг, несмотря на тот факт, что антикоагулянтная активность M118-REH и UFH в этих дозах были вполне сравнимыми. M118-REH в более низких испытанных дозах (37,5 и 75 анти-Xa МЕ/кг), ассоциированных с меньшей антикоагулянтной активностью, давал антитромботический эффект, сходный с UFH.
Среднее время до развития закупорки составляло 59±25, 132±42, 165±23, 161±41 и 165±36 минут у животных, получавших носитель, UFH, M118-REH (37,5 анти-Xa МЕ/кг), M118-REH (75 анти-Xa МЕ/кг) и M118-REH (150 анти-Xa МЕ/кг) соответственно. Следует отметить, что среднее время до наступления закупорки в артериях животных, получавших активное лечение, получило заниженную оценку по сравнению с истинной величиной, поскольку во многих случаях артерии, особенно в группах животных, получавших M118-REH, оказывались не полностью закупоренными в заранее определенный конечный момент наблюдений 180 минут (в таких случаях для анализа время наступления закупорки регистрировали как 180 минут). Средний вес тромба составлял 24,0±9,15 мг в артериях животных, получавших носитель, 19,4±9,47 мг в артериях животных, получавших UFH, и 24,5±12,17 мг, 19,8±6,24 мг и 12,8±5,99 мг у животных, получавших M118-REH в дозе 37,5, 75 и 150 анти-Xa МЕ/кг соответственно. Различия между группами альтернативной терапии по среднему времени до развития закупорки и по среднему весу тромба не достигали уровня статистической значимости.
Время кожного кровотечения
При введении носителя в точках времени, указанных в протоколе, во всех группах животных показатель CBT варьировался от 80±15,5 до 160±52,5 секунд (таблица 17). Лечение UFH и M118-REH приводило к минимальному увеличению CBT, причем вариабельность эффекта была довольно высокой. Средние показатели в группах варьировались от 135±90,5 до 275±306,8 секунд после лечения UFH и от 110±36,3 до 190±86,3 секунд после введения M118-REH во всех точках времени.
Таблица 17 Время кожного кровотечения |
|||||
CBT (с±SD) | |||||
Обработка | Исходный уровень CBT (с±SD) | Бедренная артерия | 15 мин | 60 мин | 180 мин |
UFH (75 Е/кг) |
100±31,0 | Контроль | 125±29,5 | 138±45,5 | 100±36,3 |
Лечение | 135±90,5 | 145±35,1 | 275±306,8 | ||
M118-REH (37,5 МЕ/кг) |
95±35,1 | Контроль | 80±15,5 | 130±36,3 | 115±58,2 |
Лечение | 145±64,1 | 125±48,1 | 110±36,3 | ||
M118-REH (75 МЕ/кг) |
140±24,5 | Контроль | 130±36,3 | 130±17,3 | 160±52,5 |
Лечение | 160±45,2 | 190±86,3 | 160±31,0 | ||
M118-REH (150 МЕ/кг) |
110±41,0 | Контроль | 115±51,7 | 110±36,3 | 115±48,1 |
Лечение | 150±50,2 | 125±64,1 | 135±94,4 | ||
UFH - нефракционированный гепарин, SD - стандартное отклонение, МЕ - международные единицы, U - единицы |
Гемодинамические параметры
На протяжении всего эксперимента не наблюдалось каких-либо клинически значимых изменений в сердечно-сосудистых параметрах или показателях клинико-химических анализов. В рамках исследованной выборки различия постстенотической гиперемической реакции между группами животных, получавших носитель (контроль) и активное лечение, составили менее ≤13 мл/мин у всех животных. Цель снижения индуцированной гипоксией гиперемической реакции до уровня ≤80% от исходного ответа на физическую (механическую) окклюзию была достигнута на всех задействованных в эксперименте артериях кроме двух: в одном случае ответ составил 81% (M118-REH [75 анти-Xa МЕ/кг], контрольная артерия) и еще в одном случае ответ составил 88% (M118-REH [75 анти-Xa МЕ/кг], артерия с активным лечением). Средние показатели артериального давления и частоты сердечных сокращений по ходу процедуры во всех группах эксперимента составили 68-78 миллиметров ртутного столба и 96-111 ударов в минуту, соответственно, что было близко к предварительно заданным в протоколе значениям 70 миллиметров ртутного столба и 100 ударов в минуту. Максимальное различие по средним показателям артериального давления и частоты сердечных сокращений между артериями, получавшими носитель и активное лечение, у любого конкретного животного составило 6 миллиметров ртутного столба и 5 ударов в минуту, соответственно (значения P для этих различий были статистически незначимыми).
Резюме
Препарат M118-REH в дозе 150 анти-Xa МЕ/кг продемонстрировал статистически значимое превосходство по антитромботической эффективности перед стандартной дозой UFH (75 Е/кг), несмотря на тот факт, что M118-REH и UFH в тех же концентрациях показали сравнимую активность по показателям ACT, aPTT и PT. Таким образом, частота полной закупорки бедренной артерии, индуцированной тромбом, была значительно ниже у животных, получавших M118-REH, по сравнению с животными, получавшими UFH (1/6 [16,7%] и 5/6 [83,3%], соответственно, P<0,05).
Антитромботические эффекты, наблюдаемые в группах, получавших M118-REH, были достигнуты без явных осложнений. Не было документировано ни одного случая спонтанного кровотечения, а в отношении CBT наблюдалось лишь минимальное увеличение показателей при всех концентрациях M118-REH и во всех контрольных точках времени по ходу эксперимента. В дополнение к этому, не отмечено неожиданной смертности животных или клинически значимых изменений в сердечно-сосудистых параметрах и показателях клинико-химических анализов.
Две особенности коагуляции, выявленные в этом исследовании, заслуживают особого внимания. Во-первых, M118-REH был измерим с эффектом зависимости от дозы в анализах ACT на месте (у постели пациента). Ответная реакция ACT на этот препарат хорошо коррелировалась с активностью антифактора Xa при сравнении с UFH. Это свойство может упростить введение LMWH в условиях инвазивных вмешательств и хирургической практики. Вo-вторых, M118-REH проявлял не только активность антифактора Xa in vitro, но и значительную активность антифактора II, то есть свойство, которое дополнительно отличает M118-REH от других современных вариантов LMWH (J. Hirsh et al. "Heparin and low-molecular-weight heparin: mechanisms of action, pharmacokinetics, dosing, monitoring, efficacy, and safety," Chest. 2001; 119:64S-94S). Например, для эноксапарина характерно соотношение активностей антифактора Xa и антифактора IIa 17,2, по сравнению с этим такое же соотношение для UFH составляет 3,3 (U. Cornelli and J. Fareed. "Human pharmacokinetics of low molecular weight heparins," Semin Thromb Hemost. 1999; 25 Suppl 3:57-61). В этом исследовании препарат M118-REH демонстрировал соотношение активностей антифактора Xa и антифактора IIa приблизительно на уровне 2-2,5 (фигура 15), что свидетельствует о повышенной активности антифактора IIa по сравнению с другими LMWH. Это соотношение, в общем, было более постоянным по времени, чем у UFH, что предсказуемо, исходя из известных данных о вариабельном метаболизме больших и полидисперсных молекул UFH.
Таблица 18 Сводная таблица тромботических и избранных гематологических показателей |
||||||
Обработка | Закупорка (%) | Вес тромба (мг) | TTO (мин)a | ACT (сек)b | Антифактор Xab | Антифактор IIab |
Контроль (RFA) | 24/24 (100%) | 24,0±9,2 | 59±25 | 69±6c | 0,00±0,00 | 0,00±0,00 |
UFH (группа 1) | 5/6 (83%) | 19,4±9,5 | 132±42e | 163±55e | 2,89±1,31 | 0,95±0,19 |
M118 (группа 4) | 3/6 (50%)c | 24,5±12,2 | 165±23e | 101±7d | 1,20±0,16 | 0,64±0,12 |
M118 (группа 2) | 2/6 (33%)c | 19,8±6,2 | 161±41e | 108±13d | 1,66±0,37 | 0,71±0,20 |
M118 (группа 3) | 1/6 (17%)c,d | 12,8±6,0e | 165±36e | 131±16 | 2,31±0,13 | 1,06±0,09 |
TTO - время до закупорки, ACT - активированное время свертывания крови, RFA - правая бедренная артерия, UFH - нефракционированный гепарин, a TTO >180 минут регистрировалось как 180 минут. b Величина, записанная через 60 минут после начала вливания испытуемого лекарства, c P<0,05 по сравнению с контролем, d P<0,05 по сравнению с UFH, e P<0,01 по сравнению с контролем. |
Нейтрализация in vivo:
Исследования in vivo проводили на крысах Sprague-Dawley и на новозеландских кроликах. M118-REH, эноксапарин или два нефракционированных гепарина (UFH) вводили внутривенно в разных дозах, обозначая время введения как точку t0. Нейтрализацию фармакологических эффектов каждого из этих лекарств оценивали, проводя инъекцию протаминсульфата в вену хвоста через 5 минут после t0 в соотношениях 0,5 и 1 мг на 100 анти-Xa МЕ (или 100 единиц USP, или 1 мг для UFH). Образцы крови собирали и анализировали на анти-Xa и анти-IIa активность на исходном уровне (непосредственно перед инъекцией протамина), а также через 5, 30 и 60 минут после введения протамина.
Полная и быстрая нейтрализация анти-Xa активности препарата M118-REH протаминсульфатом in vivo достигалась в соотношениях 0,5 мг : 100 анти-Xa МЕ (>98%) у крыс и 1 мг : 100 анти-Xa МЕ (более 99% у крыс и 95% у кроликов) через 5 минут после внутривенной доставки протаминсульфата. В течение 1 часа наблюдений после введения протаминсульфата "возобновления" анти-Xa активности не наблюдалось.
Проводили сравнение M118-REH и UFH по нейтрализации анти-Xa активности в соотношениях 0,5 мг и 1 мг протамина на 100 анти-Xa МЕ (или 100 USP, или 1 мг UFH). Через 5 минут после инъекции протаминсульфата сохранялось более 40% и 20% анти-Xa активности у крыс, получавших эноксапарин, при соотношениях 0,5 и 1 мг протаминсульфата на 100 анти-Xa МЕ соответственно. Приблизительно 38% анти-Xa активности сохранялось у кроликов, получавших эноксапарин, при соотношении 1 мг протаминсульфата на 100 анти-Xa МЕ. При соотношениях 0,5 и 1 мг протаминсульфата на 100 анти-Xa МЕ было нейтрализовано более 90% анти-IIa активности каждого из гепаринов. Масштабы обратимости анти-IIa активности под воздействием протаминсульфата были равноценными для всех трех лекарств, то есть для M118-REH, эноксапарина и UFH. Результаты наглядно представлены на фигуре 11.
У обезьян cynomologus протаминсульфат (PS) нейтрализовал как анти-Xa, так и анти-IIa активность препарата M118-REH примерно в равной степени с эффектом дозовой зависимости. M118-REH вводили внутривенно находящимся в сознании обезьянам cynomologus, причем в некоторых случаях это сопровождалось последующим введением PS. Образцы крови собирали и анализировали на концентрацию M118-REH, измеряемую по анти-Xa и анти-IIa активности, а также по профилю коагуляции. Гематологические параметры, время кожного кровотечения и клинические признаки токсичности отслеживали в течение 24 часов.
Активность M118-REH поддавалась определению сразу же после внутривенного введения препарата в дозе 150 анти-Xa МЕ/кг. Наблюдалась кинетика элиминации первого порядка для M118-REH с показателями tl/2 0,50±0,04 часа (анти-Xa) и 0,68±0,05 часа (анти-IIa). Кроме того, PS быстро нейтрализовал анти-Xa и анти-IIa активность M118-REH с эффектом дозовой зависимости. Большая часть анти-Xa (93,6±1,2%) и анти-IIa (90,14±1,2%) активности была быстро нейтрализована PS в соотношении 1,5 мг PS на 100 МЕ анти-Xa активности, т.е. самой высокой проанализированной дозы. Измерения ACT и aPTT демонстрировали высокую корреляцию с анти-Xa активностью (r2=0,95 и 0,99 соответственно). M118-REH увеличивал ACT в 2-3 раза, причем этот эффект нейтрализовался с возвратом к исходному уровню в течение 5 минут после внутривенного введения PS. Никаких признаков клинической токсичности или побочного эффекта кровотечения не наблюдалось.
Введение M118-REH вызывает быстрый и длительный противосвертывающий эффект, который поддается быстрой нейтрализации при инъекции PS. Противосвертывающий эффект препарата M118-REH легко поддается измерению и мониторингу по таким показателям как ACT и aPTT. Обратимость и отслеживание эффекта M118-REH отражают уникальные свойства этого препарата по сравнению с другими LMWH, поступающими в продажу.
Результаты исследований по нейтрализации M118-REH на модели NHP представлены ниже в таблицах 19-21.
Таблица 19 Нейтрализация M118-REH на модели NHP - в большинстве случаев показатели aPTT и ACT возвращаются к норме после введения дозы |
|||||
UFHΛΛ 1 мг:100 МЕ |
M118-REHΛ 1 мг:100 анти-Xa МЕ |
M118-REHΛ 1,5 мг:100 анти-Xa МЕ |
M118-REHΛΛ 2 мг:100 анти-Xa МЕ |
||
ACT | Изначально | 99,5±9,2 | 85,3±4,2 | 93,0±5,1 | 97,0±4,2 |
После введения M118-REH | 168,5±14,9 | 174,3±12,3 | 193,0±9,7 | 139,0±21,2 | |
Через 5 минут после введения протамина | 97,5±14,9 | 103,0±4,4 (NS) |
99,2±7,5 (NS) |
89,5±0,7 (NS) |
|
aPTT | Изначально | 31,95±0,1 | 23,4±2,7 | 20,4±0,9 | 26,1±0,8 |
После введения M118-REH | 46,9±31,9† | 177,9±59,0* | 162,6±85,5* | 48,1±1,8 | |
Через 5 минут после введения протамина | 24,2±0,4 | 32,5±4,4 | 29,6±6,0 (NS) |
25,9±1,6 (NS) |
|
NS: статистически незначимое отличие от UFH * aPTT>212 секунд в некоторых образцах, † на ½ ниже изначального уровня после введения дозы UFH Λ доза M118-REH 150 МЕ/кг внутривенно; ΛΛ доза M118-REH 75 МЕ/кг, доза UFH 75 МЕ/кг |
Таблица 20 Нейтрализация M118-REH на модели NHP - сохранение значительной активности анти-Xa/IIa Remained |
|||||
UFH 1 мг:100 МЕ |
M118-REH 1 мг:100 анти-Xa МЕ |
M118-REH 1,5 мг:100 анти-Xa МЕ |
M118-REH 2 мг:100 анти-Xa МЕ |
||
Анти-Xa | Изначально | 0,3±0,4 | 0,0±0,0 | 0,0±0,0 | n/a |
После введения M118-REH | 2,0±0,3 | 3,6±0,4 | 6,1±0,8 | 1,2±0,1 | |
Через 5 минут после введения протамина | 0,1±0,1 | 0,5±0,0 | 0,4±0,1 | 0,2±0,1 | |
Анти-IIa | Изначально | 0,4±0,4 | 0,0±0,1 | 0,0±0,0 | n/a |
После введения M118-REH | 1,9±0,4 | 2,1±0,3 | 3,0±1,2 | 1,6±0,0 | |
Через 5 минут после введения протамина | 0,1±0,1 | 0,3±0,1 | 0,3±0,1 | 0,4±0,2 | |
Таблица 21 Нейтрализация M118-REH на модели NHP - процентные показатели снижения разных параметров после введения протамина |
||||
UFH 1 мг:100 МЕ |
M118-REH 1 мг:100 анти-Xa МЕ |
M118-REH 1,5 мг:100 анти-Xa МЕ |
M118-REH 2 мг:100 анти-Xa МЕ |
|
ACT | 41,5±14,0 | 40,8±2,2 | 47,7±1,2 | 34,9±9,4 |
aPTT | 32,4±46,9 | 80,6±5,4 | 74,8±16,2 | 46,0±16,9 |
Анти-Xa | 97,3±3,8 | 85,2±2,0 | 93,6±1,2 | 84,0±9,1* |
Анти-IIa | 97,2±3,9 | 83,4±4,2 | 90,1±1,2 | 75,1±10,1* |
† уравнение: (после M118-REH - после протамина)×100/после M118-REH * нестабильность в результатах анализов |
Исследование по мониторингу in vivo на месте (у постели пациента) на доклинических моделях:
M118-REH, эноксапарин и нефракционированный гепарин вводили внутривенно в разных дозах крысам или кроликам. Образцы крови собирали для измерения ACT и анализа на анти-Xa активность. Для измерений ACT применяли кювету Hemachron Junior и ACT plus, а для измерений анти-Xa активности - систему Coag-A-Mate MTX II. Корреляцию между анти-Xa активностью и ACT сравнивали для всех трех испытуемых гепаринов. При использовании в эксперименте новозеландских белых кроликов инъекции 1 мг/кг M118-REH и UFH проводили через краевую вену уха. Образцы крови собирали через 5, 15, 30 минут, 1, 2, 3, 4 часа после введения гепарина. Крысам Sprague-Dawley M118-REH и UFH вводили в дозах 0,5 мг/кг и 1 мг/кг, а эноксапарин в дозах 1 мг/кг и 2 мг/кг. Эти дозы приводили к значительному увеличению анти-Xa активности и ACT, как у крыс, так и у кроликов. Для M118-REH коэффициент корреляции (r2) между анти-Xa активностью и ACT составил 0,79 у кроликов и 0,85 у крыс. Соответствующие значения коэффициента корреляции (r2) между анти-Xa активностью и ACT для UFH составили 0,31 у кроликов и 0,79 у крыс, тогда как для эноксапарина он составил только 0,66 у крыс. Результаты показаны на фигуре 12.
На моделях NHP после внутривенной инъекции M118-REH представлял первый порядок элиминации с периодом полувыведения 0,50±0,04 или 0,68±0,05 часа по измерениям анти-Xa и анти-IIa активности соответственно. Показатели объема распределения (Vd) составляли 32,01±2,21 (анти-Xa) и 48,58±095 мл/кг (анти-IIa) соответственно. Клиренс (Cl) составлял 37,24±4,65 (анти-Xa) и 43,92±5,38 (анти-IIa) мл/ч/кг. Результаты по ACT и aPTT проявляли высокую корреляцию с анти-Xa активностью (коэффициент корреляции r2=0,95 и 0,99 соответственно).
Тест на геморрагию in vivo:
Гепарин низкой молекулярной массы возникает при деполимеризации нефракционированного гепарина в результате разных химических или ферментативных процессов. Измерения времени кровотечения часто служат аналитическим инструментом при разработке новых антитромботиков, как индикатор риска кровотечения. Цель описываемого здесь исследования заключалась в том, чтобы оценить риск кровотечения, измеряя стандартное время кровотечения для препарата M118-REH и проводя сравнение этого риска с соответствующим риском при лечении эноксапарином и нефракционированным гепарином.
M118-REH, эноксапарин и нефракционированный гепарин вводили внутривенно в виде разовой болюсной дозы 0,5 мг/кг в краевую вену уха у кроликов. Время кровотечения (BT) измеряли на ухе изначально, а также через 5, 15, 30, 60, 120 и 180 минут после введения испытуемого препарата. M118-REH вызывал 3-4-кратное увеличение BT через 5 минут по сравнению с 60 минутами после введения лекарства (p<0,05). Похожий ответ по BT наблюдался при лечении эноксапарином и UFH. Время кровотечения возвращалось в нормальный диапазон через 120 минут и оставалось близким к исходному уровню в остальных контрольных точках времени. Никаких других неблагоприятных клинических явлений ни в одной из групп эксперимента при введении испытуемых доз лекарств не наблюдалось.
Как показано в таблице 22, на моделях NHP препарат M118-REH после внутривенного введения вызывал удлинение времени кровотечения по Кертису (CBT), которое статистически не отличалось от начального уровня (p<0,05).
Таблица 22 CBT после внутривенной инъекции препарата M118-REH в дозе 150 анти-Xa МЕ/кг на модели NHP |
||||
Момент времени (часы) | 0 | 0,25 | 1 | 1,5 |
Время кровотечения (минуты) | 1,3±0,6 | 2,5±0,7 NS |
2,5±1,0 NS |
2,5±1,3 NS |
У собак породы бигль UFH удлинял CBT в большей степени по сравнению с M118-REH, как после болюсной инъекции, так и после непрерывного вливания.
Система коагуляции in vivo:
Взаимодействие тромбоцитов:
На моделях NHP не получено наблюдений о влиянии на агрегацию тромбоцитов, опосредованном ADP (АДФ), после болюсной внутривенной инъекции M118-REH.
Вмешательство в метаболический путь фибринолиза:
На моделях NHP, как показано ниже в таблице 18, после болюсной внутривенной инъекции M118-REH уровень фибриногена был постоянным и статистически не отличался от исходного.
Таблица 23 Фибриноген и протромбиновое время (PT) после внутривенной инъекции M118-REH в дозе 150 анти-Xa МЕ/кг на модели NHP |
||
Фибриноген (мг/дл) | Протромбиновое время (секунды) | |
изначально | 174,3±35,0 | 11,4±0,5 |
5 минут | 168,3±28,0 | 16,0±0,9** |
30 минут | 166,0±30,5 | 13,8±0,9* |
60 минут | 172,0±29,7 | 14,1±1,1* |
90 минут | 170,0±27,9 | 12,8±2,2 |
360 минут | 163,7±29,5 | 11,4±0,9 |
360 минут | 164,3±27,0 | 10,8±0,3 |
1440 минут | 176,0±2,0 | 10,7±0,3 |
Исследования множественных возрастающих доз
При исследовании повторных внутривенных доз у крыс было установлено, что увеличение контакта с лекарственным веществом M118 пропорционально увеличению дозы с 0-го по 13-й день эксперимента. У самцов крыс контакт с M118 в терминах общей анти-Xa активности увеличивался однородным по критерию общей анти-IIa активности. У самок крыс контакт с M118 снижался с 0-го по 13-й день. У самок крыс, по-видимому, имел место больший контакт с M118 в 0-й день, чем у самцов, но в 13-й день эксперимента контакт с M118 у животных обоего пола был примерно одинаковым. При исследовании повторных внутривенных доз у собак, системный контакт с M118 увеличивался по мере возрастания дозы в диапазоне от 5 до 50 мг/кг/день. Однако контакт с M118, в целом, не увеличивался с увеличением дозы M118. За 14-дневный период наблюдений не получено данных о накоплении лекарственного вещества. Период полувыведения по анти-Xa и анти-IIa активности у собак в плазме варьировался от 1,0 до 3,2 часов без каких-либо тенденций, связанных с дозой лекарства или полом животного. Наблюдалась тенденция к укорочению периода полувыведения в 13-й день по сравнению с 0-м днем. Не отмечено постоянной тенденции, связанной с дозировкой M118, в отношении явного системного клиренса или явного объема распределения анти-Xa и анти-IIa активности.
Claims (28)
1. Композиция гепарина низкой молекулярной массы, включающая олигосахаридные цепи, имеющие следующую структуру:
и олигосахаридные цепи, имеющие следующую структуру:
где R представляет собой H или SO3Na,
R1 представляет собой SO3Na или COCH3,
n=2-50;
причем композиция обладает следующими свойствами:
(a) среднее значение n составляет 9-16,
(b) содержание ΔUHNAc,6sGHNs,3s,6s составляет от 5 до 15 моль %,
(c) средневесовая молекулярная масса составляет от 5500 до 8500 Да,
(d) анти-Xa активность составляет от 170 до 330 МЕ/мг,
(e) отношение активности анти-Xa к активности анти-IIa составляет от 2:1 до 1:1, и
(f) соотношение (е) является постоянным в течение периода от 30 до 120 мин после введения пациенту.
и олигосахаридные цепи, имеющие следующую структуру:
где R представляет собой H или SO3Na,
R1 представляет собой SO3Na или COCH3,
n=2-50;
причем композиция обладает следующими свойствами:
(a) среднее значение n составляет 9-16,
(b) содержание ΔUHNAc,6sGHNs,3s,6s составляет от 5 до 15 моль %,
(c) средневесовая молекулярная масса составляет от 5500 до 8500 Да,
(d) анти-Xa активность составляет от 170 до 330 МЕ/мг,
(e) отношение активности анти-Xa к активности анти-IIa составляет от 2:1 до 1:1, и
(f) соотношение (е) является постоянным в течение периода от 30 до 120 мин после введения пациенту.
2. Композиция по п.1, имеющая анти-IIa активность от 130 до 190 МЕ/мг.
3. Композиция по любому из предшествующих пунктов, имеющая средневесовую молекулярную массу от 5700 до 7900 Да.
4. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где от 15 до 35% от общего числа цепей в составе композиции имеют на нередуцирующем конце цепи Δ4,5 несульфатированную уроновую кислоту.
5. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере 60% цепей в составе композиции имеют на редуцирующем конце цепи N-ацетилированный гексозамин.
6. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере 80% цепей в составе композиции имеют на редуцирующем конце цепи N-ацетилированный гексозамин.
7. Композиция по любому из предшествующих пунктов, имеющая содержание фермента гепариназы менее 1000 нг/мг; содержание метанола менее 1,0% (мас./мас.); содержание этанола менее 1,0% (мас./мас.); а также менее 2000 м.д. свободного сульфата.
8. Композиция по любому из предшествующих пунктов, имеющая анти-Xa - активность от 180 до 300 МЕ/мг.
9. Композиция по любому из предшествующих пунктов, имеющая анти-Ха - активность от 200 до 300 МЕ/мг.
10. Композиция по любому из предшествующих пунктов, имеющая анти-IIa - активность от 155 до 195 МЕ/мг.
11. Фармацевтическая композиция, включающая композицию по любому из пп.1-10 и фармацевтически приемлемый носитель.
12. Фармацевтическая композиция по п.11, которая является лиофилизированной.
13. Фармацевтическая композиция по п.11, которая является жидкой.
14. Применение композиции по любому из пп.1-10 или фармацевтической композиции по любому из пп.11-13 для лечения пациента, страдающего тромботическим заболеванием или подверженного риску развития тромботического заболевания.
15. Применение композиции по любому из пп.1-10 или фармацевтической композиции по любому из пп.11-13 для получения лекарственного средства для лечения пациента, страдающего тромботическим заболеванием или подверженного риску развития тромботического заболевания.
16. Применение по п.14 или 15, в котором заболевание представляет собой острый коронарный синдром.
17. Применение по п.14 или 15, в котором заболевание представляет собой инфаркт миокарда.
18. Применение по п.17, в котором заболевание представляет собой инфаркт миокарда с подъемом сегмента ST или инфаркт миокарда без подъема сегмента ST.
19. Применение по п.14 или 15, в котором заболевание связано с хирургическим вмешательством.
20. Применение по п.19, в котором хирургическое вмешательство выбрано из группы, состоящей из ангиопластики, чрескожного коронарного вмешательства и установки стента.
21. Применение по п.19, в котором пациент подвергается хирургическому вмешательству, или имеет риск подвергнуться хирургическому вмешательству, или выздоравливает после хирургического вмешательства.
22. Применение по п.21, в котором пациент имеет риск подвергнуться аортокоронарному шунтированию.
23. Применение по п.14 или 15, в котором заболевание представляет собой стабильную или нестабильную стенокардию.
24. Применение по п.14 или 15, в котором активность композиции можно отслеживать с использованием анализа коагуляции.
25. Применение по п.24, в котором анализ коагуляции представляет собой активированное время свертывания крови или активированное частичное тромбопластиновое время.
26. Применение по любому из пп.14-25, в котором анти-Xa - активность или анти-IIa - активность композиции может быть нейтрализована полностью или частично с помощью протаминсульфата.
27. Применение по п.26, в котором композицию нейтрализуют перед проведением аортокоронарного шунтирования.
28. Применение множества болюсных инъекций композиции по любому из пп.1-10 или фармацевтической композиции по пп.11-13 для поддержания целевой величины активированного частичного тромбопластинового времени у пациента, нуждающегося в поддержании целевой величины активированного частичного тромбопластинового времени.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US80913606P | 2006-05-25 | 2006-05-25 | |
US60/809,136 | 2006-05-25 | ||
US84957806P | 2006-10-04 | 2006-10-04 | |
US60/849,578 | 2006-10-04 | ||
US60/849,628 | 2006-10-05 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2008151420A RU2008151420A (ru) | 2010-06-27 |
RU2451515C2 true RU2451515C2 (ru) | 2012-05-27 |
Family
ID=42683323
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008151420/15A RU2451515C2 (ru) | 2006-05-25 | 2007-05-24 | Композиции гепарина низкой молекулярной массы и их применение |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
BR (1) | BRPI0713123A2 (ru) |
RU (1) | RU2451515C2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2799028C2 (ru) * | 2021-10-15 | 2023-07-03 | Алексей Георгиевич Александров | Средство, обладающее антикоагулирующим действием, и способ его применения |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998055515A1 (en) * | 1997-06-06 | 1998-12-10 | Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc. | Modified low molecular weight heparin that inhibits clot associated coagulation factors |
WO2001002443A1 (en) * | 1999-06-30 | 2001-01-11 | Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc | Heparin compositions that inhibit clot associated coagulation factors |
RU2005105423A (ru) * | 2005-03-01 | 2006-08-10 | ГУ Гематологический научный центр РАМН (RU) | Способ получения гепаринов с низкой молекулярной массой |
-
2007
- 2007-05-24 BR BRPI0713123-2A patent/BRPI0713123A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2007-05-24 RU RU2008151420/15A patent/RU2451515C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998055515A1 (en) * | 1997-06-06 | 1998-12-10 | Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc. | Modified low molecular weight heparin that inhibits clot associated coagulation factors |
WO2001002443A1 (en) * | 1999-06-30 | 2001-01-11 | Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc | Heparin compositions that inhibit clot associated coagulation factors |
RU2005105423A (ru) * | 2005-03-01 | 2006-08-10 | ГУ Гематологический научный центр РАМН (RU) | Способ получения гепаринов с низкой молекулярной массой |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2799028C2 (ru) * | 2021-10-15 | 2023-07-03 | Алексей Георгиевич Александров | Средство, обладающее антикоагулирующим действием, и способ его применения |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2008151420A (ru) | 2010-06-27 |
BRPI0713123A2 (pt) | 2012-04-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8609632B2 (en) | Low molecular weight heparin composition and uses thereof | |
JP4828795B2 (ja) | 硫酸化多糖類の分析 | |
US9351992B2 (en) | Non-anticoagulant polysaccharide compositions | |
US8071569B2 (en) | Oxidized heparin fractions and their use in inhibiting angiogenesis | |
Seo et al. | Preparation, separation, and conformational analysis of differentially sulfated heparin octasaccharide isomers using ion mobility mass spectrometry | |
JP5351770B2 (ja) | ビオチンまたはビオチン誘導体との少なくとも1つの共有結合を含む低分子量ヘパリン、これらの作製方法およびそれらの使用。 | |
US20110076729A1 (en) | Methods of making low molecular weight heparin compositions | |
Fareed et al. | Biochemical and pharmacologic heterogeneity in low molecular weight heparins. Impact on the therapeutic profile | |
US5721357A (en) | Preparation of sulfated polysaccharides for treatment or prevention of thromboses | |
Spadarella et al. | From unfractionated heparin to pentasaccharide: Paradigm of rigorous science growing in the understanding of the in vivo thrombin generation | |
US20120322760A1 (en) | Methods of treatment with a low molecular weight heparin composition | |
EP1731131A1 (en) | Hgf production accelerator containing heparin-like oligosaccharide | |
JP2010518251A (ja) | ビオチンまたはビオチン誘導体との少なくとも1つの共有結合を含むヘパリン、これらの調製方法およびこれらの使用 | |
US7008933B2 (en) | Process for prophylaxis and therapy of thrombotic processes employing heparin having particular average molecular weights | |
RU2451515C2 (ru) | Композиции гепарина низкой молекулярной массы и их применение | |
EP3569608A1 (en) | Oligosaccharide compound for inhibiting endogenous coagulation factor x-enzyme complex, and preparation method therefor and uses thereof | |
Fareed et al. | Low molecular weight heparins: a developmental perspective | |
Green | The heparins: Basic and clinical aspects | |
Jeske et al. | Pharmacologic profile of a low-molecular-weight heparin depolymerized by γ-irradiation | |
Kouta | Comparative Studies on Biochemical and Pharmacological Profiles of Unfractionated Heparins & Their Depolymerized Derivatives from Bovine, Ovine and Porcine Origins | |
Ma | Comparative biochemical and pharmacological studies on heparin-derived oligosaccharides | |
JP2002080371A (ja) | プラスミノーゲンアクチベーター活性促進剤 | |
US20050164983A1 (en) | Carboxyl-reduced derivatives of dermatan sulfate, preparation thereof, use thereof as a medicinal product and the pharmaceutical compositions containing them |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160525 |