JP2004059506A - セレクチン及びケモカインに作用する過硫酸化オリゴ糖 - Google Patents
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Abstract
【課題】Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインとリガンドとの結合の調節等を達成する糖化合物、炎症性疾患等の疾患症状を改善し、生体で高親和性を示す治療又は予防剤を提供すること。
【解決手段】式（Ｉ）：
【化１】
（Ｒ１ 、Ｒ２ 、Ｒ３ 、Ｒ４ は、水素原子又はスルホン酸基を示す）、式（ＩＩ）：
【化２】
（Ｒ５ 、Ｒ６ 、Ｒ７ 、Ｒ８ は、水素原子又はスルホン酸基を示す）、式（ＩＩＩ） ：
【化３】
（Ｒ９ 、Ｒ１０は、水素原子又はスルホン酸基、ｍは、３又は４である）、又は式（ＩＶ）：
【化４】
（式中、Ｒ１１、Ｒ１２は、水素原子又はスルホン酸基、ｎは、３又は４である）の糖化合物、該糖化合物を含有した治療又は予防剤。
【選択図】 なし
【解決手段】式（Ｉ）：
【化１】
（Ｒ１ 、Ｒ２ 、Ｒ３ 、Ｒ４ は、水素原子又はスルホン酸基を示す）、式（ＩＩ）：
【化２】
（Ｒ５ 、Ｒ６ 、Ｒ７ 、Ｒ８ は、水素原子又はスルホン酸基を示す）、式（ＩＩＩ） ：
【化３】
（Ｒ９ 、Ｒ１０は、水素原子又はスルホン酸基、ｍは、３又は４である）、又は式（ＩＶ）：
【化４】
（式中、Ｒ１１、Ｒ１２は、水素原子又はスルホン酸基、ｎは、３又は４である）の糖化合物、該糖化合物を含有した治療又は予防剤。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、向炎症分子であるＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインに相互作用する糖化合物並びにＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれにより介される生物学的事象が発症に関連する疾患の治療又は予防剤に関する。より詳しくは、本発明は、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ケモカイン等に介される生物学的事象が発症に関連する疾患の治療若しくは予防薬、該治療若しくは予防薬の創薬のためのリード化合物、又は該リード化合物のデザイン等に有用な糖化合物、並びに炎症性疾患、アレルギー性疾患、癌転移、心筋障害、多臓器不全等の疾患の治療又は予防に有用な治療又は予防剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
炎症は、白血球上の接着分子と血管内皮細胞との接着を促進する分子により誘発され、特定の接着分子が関与することが知られている。前記接着分子としては、例えば、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチンに代表されるセレクチンファミリー等が挙げられる。
【０００３】
前記Ｌ−セレクチン又はＰ−セレクチンと、そのリガンドとの相互作用において、該リガンドの硫酸化は、重要な役割を果たすことが知られている。例えば、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１のチロシン硫酸化は、該Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１と、Ｌ−セレクチン及びＰ−セレクチンのそれぞれとの相互作用に必要とされることが知られている ［サコ（Ｓａｋｏ， Ｄ．）ら、Ｃｅｌｌ， ８３， ３２３−３３１ （１９９５）； ポウヤニ（Ｐｏｕｙａｎｉ， Ｔ．） ら、Ｃｅｌｌ， ８３， ３３３−３４３ （１９９５）； 及びスペルチーニ（Ｓｐｅｒｔｉｎｉ， Ｏ．）ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １３５， ５２３−５３１ （１９９６）］ 。
【０００４】
また、高内皮性小静脈上のＬ−セレクチンのリガンドは、硫酸化依存性様式でＬ−セレクチンに結合することが知られている ［イマイ（Ｉｍａｉ， Ｙ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ， ３６１， ５５５−５５７ （１９９３）；（Ｈｉｒａｏｋａ， Ｎ．） ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １１， ７９−８９ （１９９９）； ビストラップ（Ｂｉｓｔｒｕｐ， Ａ．） ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １４５， ８９９−９１０ （１９９９）］ 。さらに、ＨＮＫ−１反応性スルホグルクロニル糖脂質 ［ニードハム（Ｎｅｅｄｈａｍ， Ｌ． Ｋ．）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９０， １３５９−１３６３ （１９９３）］、ヘパリンオリゴ糖 ［ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ， Ｒ． Ｍ．） ら、Ｂｌｏｏｄ， １１， ３２５３−３２５８ （１９９３）］及びヒアルロン酸グリコサミノグリカン ［ケニック（Ｋｏｅｎｉｇ， Ａ．）ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， １０１， ８７７−８８９ （１９９８）］は、Ｌ−セレクチン及びＰ−セレクチンのそれぞれに結合することが知られている。
【０００５】
しかしながら、Ｌ−セレクチン及びＰ−セレクチンのそれぞれに結合する化合物は、いずれも高分子量であり、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等とリガンドとの結合を調節しうるリード化合物のデザインは、困難であり、いまだ、医薬品として開発に成功していないのが現状である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれとそのリガンドとの結合を調節すること、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれに介される生物学的事象を調節すること、並びに該生物学的事象が発症に関連する疾患の症状を改善すること、該疾患の治療又は予防剤のためのリード化合物を提供すること等を達成しうる糖化合物を提供することを目的とする。また、本発明は、炎症性疾患、アレルギー疾患、癌転移、心筋障害、多臓器不全等の疾患の症状を改善し、生体において高い親和性を呈しうる、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれにより介される生物学的事象が発症に関連する疾患の治療又は予防剤を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、
〔１〕 一般式（Ｉ）：
【０００８】
【化５】
【０００９】
（式中、Ｒ１ 、Ｒ２ 、Ｒ３ 及びＲ４ は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す）
又は
一般式（ＩＩ）：
【００１０】
【化６】
【００１１】
（式中、Ｒ５ 、Ｒ６ 、Ｒ７ 及びＲ８ は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す）
で表わされる糖化合物、
〔２〕 一般式（ＩＩＩ） ：
【００１２】
【化７】
【００１３】
（式中、Ｒ９ 及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示し、ｍは、３又は４である）
又は
一般式（ＩＶ）：
【００１４】
【化８】
【００１５】
（式中、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示し、ｎは、３又は４である）
で表わされる糖化合物、並びに
〔３〕 前記〔１〕又は〔２〕記載の糖化合物を有効成分として含有してなる、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれにより介される生物学的事象が発症に関連する疾患の治療又は予防剤、
に関する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明は、硫酸化グリコサミノグリカンのうち、一般式（ＩＩＩ） ：
【００１７】
【化９】
【００１８】
（式中、Ｒ９ 及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す）
の二糖部分、又は
一般式（ＩＶ）：
【００１９】
【化１０】
【００２０】
（式中、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す）
の二糖部分
を構成単位として含有する糖化合物、特に、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）を繰返し単位とする四糖化合物又はＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）を繰返し単位とする四糖化合物が、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれと相互作用するという驚くべき知見、及び前記四糖化合物が、ケモカインの生理活性等を阻害するという驚くべき知見に基づく。
【００２１】
なお、本明細書において、「ＧｌｃＡ」は、Ｄ−グルクロン酸残基を示し、「ＧａｌＮＡｃ」は、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＩｄｏＡ」は、Ｌ−イズロン酸残基を示し、「ＨｅｘＡ」は、ヘキスロン酸残基を示す。また、「β１−３」は、β１−３結合を意味し、「α１−３」は、α１−３結合を意味する。
【００２２】
本発明の糖化合物としては、一般式（Ｉ）：
【００２３】
【化１１】
【００２４】
（式中、Ｒ１ 、Ｒ２ 、Ｒ３ 及びＲ４ は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す）
又は
一般式（ＩＩ）：
【００２５】
【化１２】
【００２６】
（式中、Ｒ５ 、Ｒ６ 、Ｒ７ 及びＲ８ は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す）
で表わされる糖化合物、及び一般式（ＩＩＩ） ：
【００２７】
【化１３】
【００２８】
（式中、Ｒ９ 及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示し、ｍは、３又は４である）
又は
一般式（ＩＶ）：
【００２９】
【化１４】
【００３０】
（式中、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示し、ｎは、３又は４である）
で表わされる糖化合物である。本発明の糖化合物は、四糖〜八糖からなる化合物であるにもかかわらず、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれと相互作用し、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれが関連する生理的機能等を調節することができるという優れた効果を発揮する。さらに、本発明の糖化合物は、四糖〜八糖からなる化合物であるため、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインからなる群より選ばれた少なくとも１種と、そのリガンドとの結合を調節しうる低分子化合物として、あるいはそのリード化合物のデザインのための基礎として用いることができるという優れた効果を発揮する。
【００３１】
本発明においては、分子量の観点から、特に、前記一般式（Ｉ）又は一般式（ＩＩ）で表わされる糖化合物が好ましい。
【００３２】
前記一般式（Ｉ）において、Ｒ１ 、Ｒ２ 、Ｒ３ 及びＲ４ は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す。また、前記スルホン酸基は、本発明の目的を阻害しないものであれば、置換基を有していてもよい。前記一般式（Ｉ）の任意のＲ１ 、Ｒ２ 、Ｒ３ 及びＲ４ がスルホン酸基である糖化合物は、例えば、三酸化イオウ−トリアルキルアミン複合体、三酸化イオウ−ピリジン複合体、硫酸−トリアルキルアミン複合体又は硫酸−ピリジン複合体により得られうる。
【００３３】
また、前記一般式（ＩＩ）において、Ｒ５ 、Ｒ６ 、Ｒ７ 及びＲ８ は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す。また、前記スルホン酸基は、本発明の目的を阻害しないものであれば、置換基を有していてもよい。前記一般式（ＩＩ）の任意のＲ５ 、Ｒ６ 、Ｒ７ 及びＲ８ がスルホン酸基である化合物は、例えば、三酸化イオウ−トリアルキルアミン複合体、三酸化イオウ−ピリジン複合体、硫酸−トリアルキルアミン複合体又は硫酸−ピリジン複合体により得られうる。
【００３４】
さらに、前記一般式（ＩＩＩ） において、Ｒ９ 及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す。また、前記スルホン酸基は、本発明の目的を阻害しないものであれば、置換基を有していてもよい。前記一般式（ＩＩＩ） において、Ｒ９ 及び／又はＲ１０がスルホン酸基である化合物は、例えば、三酸化イオウ−トリアルキルアミン複合体、三酸化イオウ−ピリジン複合体、硫酸−トリアルキルアミン複合体又は硫酸−ピリジン複合体により得られうる。
【００３５】
また、前記一般式（ＩＶ）において、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す。また、前記スルホン酸基は、本発明の目的を阻害しないものであれば、置換基を有していてもよい。前記一般式（ＩＶ）において、Ｒ１１及び／又はＲ１２がスルホン酸基である化合物は、例えば、三酸化イオウ−トリアルキルアミン複合体、三酸化イオウ−ピリジン複合体、硫酸−トリアルキルアミン複合体又は硫酸−ピリジン複合体により得られうる。
【００３６】
本発明の糖化合物としては、具体的には、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−スルフェート）、ＩｄｏＡα１−３ＧｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−スルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−スルフェート）、ＩｄｏＡα１−３ＧｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−スルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−スルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−スルフェート）、ＩｄｏＡα１−３ＧｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）等が挙げられる。また、前記糖化合物のなかでも、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインとの相互作用を十分に発揮させる観点から、硫酸化の度合いが高い化合物であることが望ましい。
【００３７】
本発明の糖化合物は、例えば、
（ａ） イカ軟骨 ［スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｓ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４３， １５４３−１５５０ （１９６８）］、肥満細胞 ［カッツ（Ｋａｔｚ， Ｈ． Ｒ．） ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６１， １３３９３−１３３９６ （１９８６）；及びスティーブンス（Ｓｔｅｖｅｎｓ， Ｒ． Ｌ．）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８５， ２２８４−２２８７ （１９８８）］、好中球 ［オオハシ（Ｏｈｈａｓｈｉ， Ｙ．） ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．， ２１７， １９９−２０７ （１９８４）； 及びピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ． Ｆ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４， １２３７６−１２３８２ （１９９９）］、単球 ［ウーリン−ハンセン（Ｕｈｌｉｎ−Ｈａｎｓｅｎ， Ｌ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４， １４９１６−１４９２２ （１９８９）；マックジー（ＭｃＧｅｅ， Ｍ． Ｐ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ２６１０９−２６１１５ （１９９５）］、糸球体 ［コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｓ．） ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙ． Ａｃｔａ， ８４１， ７１−８０ （１９８５）］ 、糸球体間質細胞 ［（Ｙａｏｉｔａ， Ｅ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６５， ５２２−５３１ （１９９０）］等に見出される過硫酸化コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖を、例えば、ヒアルロニダーゼで消化する工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた消化産物を高速液体クロマトグラフィーに供して、オリゴ糖画分を得る工程、
を行なうことにより得られうる。
【００３８】
前記工程（ａ）において、過硫酸化コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖は、慣用の手法により得られうる。また、前記過硫酸化コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖の供給源は、前述の例示に特に限定されるものではなく、過硫酸化コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖を保持する他の生物、組織、細胞等であってもよい。
【００３９】
ついで、工程（ｂ）において、前記（ａ）で得られた消化産物を、クロマトグラフィー、例えば、高速液体クロマトグラフィーに供する。工程（ｂ）においては、単一種類のオリゴ糖を、単一ピークとして得られるように、慣用の各種クロマトグラフィーを行なえばよい。例えば、イカ軟骨由来コンドロイチンＡ、イカ軟骨由来コンドロイチンＣ及びイカ軟骨由来コンドロイチンＥの場合、前記クロマトグラフィーとして、１６ｍＭ〜１Ｍ ＮａＨ２ ＰＯ４ のリニアグラジェントによるアミン結合シリカゲルカラムクロマトグラフィーと、つづくゲル濾過カラムクロマトグラフィーとの組合せ等が行なわれうる。ここで、クロマトグラフィーに用いられる溶液は、前記オリゴ糖等を分離するのに適した水溶液又は水溶性有機溶媒と水との混合溶液であればよい。
【００４０】
前記工程（ｂ）により得られた糖化合物を三酸化イオウ−トリアルキルアミン複合体、三酸化イオウ−ピリジン複合体、硫酸−トリアルキルアミン複合体又は硫酸−ピリジン複合体により硫酸化することもできる。特に、コンドロイチン硫酸の６−Ｏ−硫酸化、デルマタン硫酸の６−Ｏ−硫酸化は、好ましくは、ナガサワらの方法 ［ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ， Ｋ．）ら， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．， １５８， １８３−１９０ （１９８６）］ により行なうことが望ましい。
【００４１】
本発明の糖化合物は、
▲１▼Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれと相互作用、例えば、結合する；
▲２▼バーシカンと、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれとの結合を調節、具体的には、阻害する；
▲３▼ケモカインの生理活性を阻害する
という性質を発現する。したがって、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれにより介される生物学的事象が発症に関連する疾患の治療又は予防への応用が期待される。
【００４２】
したがって、本発明により、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれにより介される生物学的事象が発症に関連する疾患の治療又は予防剤が提供される。
【００４３】
本発明の治療又は予防剤は、本発明の糖化合物を有効成分として含有することに１つの特徴がある。
【００４４】
前記「Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれが介する生物学的事象」としては、例えば、炎症における組織浸潤、サイトカイン産生調節、リンパ球ホーミング、血小板凝集、腫瘍巣の血管新生、癌転移、心筋虚血再灌流障害等が挙げられる。また、前記疾患としては、炎症性疾患、感染症、喘息、アレルギー性炎症、間質性肺炎、全身性炎症反応症候群、炎症性疾患等が挙げられる。
【００４５】
本発明の治療又は予防剤によれば、本発明の糖化合物を有効成分として含有するため、例えば、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれと相互作用して、炎症性疾患における炎症の誘因、例えば、前記Ｌ−セレクチン及び／又はＰ−セレクチンを介した白血球と血管内皮細胞との接着を調節、具体的には阻害すること、及びケモカインの生理活性（サイトカイン産生調節、Ｃａ２＋動員等）を調節、具体的には、阻害することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の治療又は予防剤によれば、本発明の糖化合物を有効成分として含有するため、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインからなる群より選ばれた少なくとも１種とそのリガンドとの結合を調節することができる。したがって、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれを介した生物学的事象が関連する炎症性疾患、アレルギー疾患、癌転移を治療、症状を抑制又は予防することができるという優れた効果を発揮する。すなわち、本発明の治療又は予防剤は、抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗癌剤等として使用されうる。
【００４６】
本発明の治療又は予防剤の作用、例えば、結合阻害能は、例えば、以下のように、表面プラズモン共鳴解析等により評価されうる。すなわち、本発明の治療又は予防剤の作用は、
（ｉ）Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン又はケモカインをセンサーチップ上に固定し、Ｌ−セレクチン固定化センサーチップ、Ｐ−セレクチン固定化センサーチップ及びケモカイン固定化センサーチップのそれぞれを得るステップ、
（ｉｉ）本発明の治療又は予防剤の存在下、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれのリガンドを、一定の流速で、前記リガンドに対応して、Ｌ−セレクチン固定化センサーチップ、Ｐ−セレクチン固定化センサーチップ及びケモカイン固定化センサーチップのいずれかに負荷するステップ、及び
（ｉｉｉ） 適切な検出手段〔例えば、光学的検出（蛍光度、蛍光偏向度等）、質量分析計との組み合わせ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計：ＥＳＩ−ＭＳ 等）〕により、光学的変動又は質量の変動として相互作用を検出し、それにより、センサーグラムを得るステップ
を含む評価方法を行なうことにより評価されうる。
【００４７】
なお、前記ステップ（ｉ）において、リガンドをセンサーチップに固定化してもよく、この場合、ステップ（ｉｉ）において、治療又は予防剤の存在下、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのいずれかを、一定の流速で、対応するリガンド固定化センサーチップ上に負荷すればよい。
【００４８】
前記評価方法においては、本発明の治療又は予防剤の非存在下、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれと、そのリガンドとの複合体の形成を示すセンサーグラムが提示された場合、例えば、光学的センサーグラム又は質量センサーグラムが、送液によるリガンドの導入により変動した場合を陰性対照とする。したがって、本発明の治療又は予防剤による結合の阻害は、本発明の治療又は予防剤の非存在下の場合と同様の反応系で、本発明の治療又は予防剤の存在下、複合体の形成を示すセンサーグラムが提示されない場合又は複合体の形成までの時間が遅延した場合を指標とする。
【００４９】
本発明の治療又は予防剤の作用、例えば、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれに介される生物学的事象の調節は、本発明の治療又は予防剤の存在下における培養細胞中の生物学的事象の有無、程度を測定することにより評価されうる。例えば、二次リンパ様組織ケモカインが介するＣａ２＋動員に関し、
ｉ）Ｌ１．２／ＣＣＲ７細胞（１×１０６ 細胞／ｍｌ）を、Ｆｕｒａ−２で負荷し、本発明の治療又は予防剤（１００μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下に、二次リンパ様組織ケモカインで刺激するステップ、及び
ｉｉ）ヒロセ（Ｈｉｒｏｓｅ， Ｊ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ５２２８−５２３４ （２００１） の記載に従い、蛍光率を測定することにより、細胞内カルシウム濃度をモニターするステップ、
を含む評価方法を行なうことにより評価されうる。
【００５０】
さらに、本発明の治療又は予防剤の作用、例えば、生体における炎症性疾患の治療又は予防効果は、炎症疾患モデル動物に、本発明の治療又は予防剤を投与し、炎症部位における症状の変化を観察すること、好中球浸潤を組織ミエロパーオキシダーゼの活性を指標として検出すること等により評価されうる。
【００５１】
本発明の治療又は予防剤の剤形としては、投与形態に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤等の経口投与剤；スプレー剤、軟膏等の外用薬；皮下、皮内、筋肉内、静脈内等への注射剤等が挙げられる。
【００５２】
したがって、本発明の治療又は予防剤中における有効成分の含有量は、前記疾患の治療又は予防を必要とする個体の年齢、体重、病態等に応じて、適宜設定することができ、例えば、投与形態が、静脈注射の場合、１０〜５００ｍｇ、皮下注射の場合、１０〜５００ｍｇであることが望ましい。
【００５３】
また、個体への本発明の治療又は予防剤の投与量は、前記疾患の治療又は予防を必要とする個体の年齢、体重、病態等に応じて、適宜設定することができ、例えば、有効成分の量として、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、１ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇであることが望ましい。
【００５４】
本発明の治療又は予防剤は、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれに介される生物学的事象が発症に関連する疾患の状態、投与対象となる個体、器官、局所部位、組織等に応じて、薬学的に許容されうる助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等をさらに含有してもよい。
【００５５】
また、本発明の治療又は予防剤は、前記有効成分を安定に維持しうる担体に該有効成分を担持させて得られた剤であってもよい。具体的には、例えば、投与対象となる個体、器官、局所部位、組織等の生体への導入を容易にしうる薬学的に許容されうる担体に、有効成分を保持させてもよい。
【００５６】
【実施例】
以下、本発明を実施例等により詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例等により限定されるものではない。なお、本実施例に用いられた試薬は、特に記載しないかぎり、カワシマ（Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｈ．） ら［Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７５， ３５４４８−３５４５６ （２０００）］ 及びヒロセ（Ｈｉｒｏｓｅ， Ｊ．）ら［Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ５２２８−５２３４ （２００１）］ に記載の試薬と同様である。また、細胞の培地組成等については、フレシュニー（Ｆｒｓｈｎｅｙ， Ｒ． Ｉａｎ） 、カルチャー・オブ・アニマルセルズ・ア・マニュアル・オブ・ベーシック・テクニック、第２版（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， ２ｎｄ ｅｄ．） 、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ． Ｉｎｃ．， ６６−８４ （１９８７）等が参照されうる。
【００５７】
実施例１
硫酸化の代謝インヒビターである塩素酸ナトリウムでＡＣＨＮ細胞を処理することにより、バーシカン中のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖（以下、ＣＳ／ＤＳ鎖とも表記する）と、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びＣＤ４４のそれぞれとの相互作用における硫酸化の必要性を検討した。
【００５８】
（１）ヒトＣＤ４４−Ｉｇの作製
ヒト由来ＣＤ４４ ｃＤＮＡを、センスプライマー（配列番号：１）：
【００５９】
【化１５】
【００６０】
（太字部分は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位であり、下線部は、ヒトＣＤ４４の最初の７アミノ酸のコドンである）と、アンチセンスプライマー（配列番号：２）：
【００６１】
【化１６】
【００６２】
（太字部分は、ＸｂａＩ制限酵素認識部位であり、下線部は、ヒトＣＤ４４の１７２〜１７８位のアミノ酸のコドンである）とを用いたＰＣＲにより調製した。得られた増幅産物を、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）Ｂ〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＣＤ４４発現ベクターを得た。また、前記増幅産物について、配列決定した。
【００６３】
製造者の説明書に従って、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ試薬〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕を用い、前記ヒトＣＤ４４発現ベクターを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。得られたトランスフェクト細胞を、２０重量％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中、ＣＯ２ インキュベーター内で、３７℃で４日間細胞を培養し、馴化培地を得た。
【００６４】
その後、前記馴化培地を、抗ＣＤ４４モノクローナル抗体ＢＲＩＣ ２３５結合ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂでのイムノアフィニティークロマトグラフィーに供して、単量体ＣＤ４４を得た。得られた可溶性ＣＤ４４を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色に供した。その結果、得られた可溶性ＣＤ４４の純度は、９５％を超える純度であった。
【００６５】
ついで、得られたＣＤ４４を用い、トヤマ−ソリマチ（Ｔｏｙａｍａ−Ｓｏｒｉｍａｃｈｉ， Ｎ．）ら ［Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ７４３７−７４４４， （１９９５）］ に記載の方法に従って、ヒトＣＤ４４−イムノグロブリン（Ｉｇ）を作製した。
【００６６】
（２） ［３５Ｓ］ 硫酸ナトリウム又は ［３５Ｓ］ メチオニンを用いたＡＣＨＮ細胞の代謝標識
１０重量％ ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ １６４０中、３０ｍＭ 塩素酸ナトリウムの存在下又は非存在下に、ＡＣＨＮ細胞を、３７℃で６時間プレインキュベートした。得られたＡＣＨＮ細胞のコンフルエントな単層を、
（ｉ）０．２ｍＣｉ／ｍｌの ［３５Ｓ］ Ｎａ２ ＳＯ４ 〔商品名：Ｓｕｌｆｅｒ−３５；アイシーエヌ ラジオケミカルズ（ＩＣＮ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社製〕の存在下、２重量％ 透析ウシ胎仔血清を含むイーグル最少基本培地ＳＭＥＭ〔硫酸不含；バイオウィッテーカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）社製〕、又は
（ｉｉ）０．２ｍＣｉ／ｍｌの ［３５Ｓ］ −メチオニン〔アイシーエヌ ラジオケミカルズ（ＩＣＮ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社製〕の存在下、２重量％透析ウシ胎仔血清を含むメチオニン不含ＲＰＭＩ １６４０培地〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕
のいずれかの培地中、３０ｍＭ 塩素酸ナトリウムの存在下又は非存在下、１８時間インキュベートして標識した。
【００６７】
（３）免疫沈降
緩衝液Ａ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ２ ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，ｐＨ６．８）を用いて、ビーズを洗浄したことを除き、カワシマ（Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｈ）らの文献［Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １１， ３９３−４０５ （１９９９）］に記載の方法に従い、以下のように免疫沈降を行なった。
【００６８】
図１に示された抗体及びＩｇキメラのそれぞれ（１０μｇ 相当量）と、プロテインＡ−セファロースカラム（１０μｌ 相当量）とを、慣用の方法により結合させ、抗体結合プロテインＡ−セファロース又はＩｇキメラ結合プロテインＡ−セファロースを得た。ついで、前記緩衝液Ａ １ｍｌ中、各抗体結合プロテインＡ−セファロース又は各Ｉｇキメラ結合プロテインＡ−セファロース（１０μｌ ゲル相当量）と、馴化培地とを、４℃で一晩インキュベートした。なお、抗バーシカンポリクローナル抗体である抗Ｄ ［ツィマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ， Ｄ． Ｒ．） ら， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １２４， ８１７−８２５ （１９９４）］ は、ディーテル Ｒ．ツィマーマン博士（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｚｕｅｒｉｃｈ）により提供されたものであり、ヒトＬ−セレクチン−Ｉｇは、アールアンドディー システムズ インコーポレーティド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）製である。
【００６９】
その後、前記ビーズを、前記緩衝液Ａで洗浄し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、ＳＤＳ−アガロース−ＰＡＧＥに供し、ついで、ゲル上の３５Ｓ標識に由来するシグナルをオートラジオグラフィーで検出した。その結果を図１に示す。
【００７０】
図１のレーン５〜８に示すように、バーシカンのコアタンパク質は、合成されたものの、レーン１〜４に示されるように、塩素酸ナトリウムによる処理により、未処理の場合に対して、９０％を超える硫酸化の阻害をもたらした。
【００７１】
また、図１のレーン１１、１２、１５及び１６に示されるように、前記塩素酸ナトリウム処理により、バーシカンと、Ｌ−セレクチン−Ｉｇ及びＰ−セレクチン−Ｉｇのそれぞれとの相互作用が阻害された。したがって、バーシカンのＣＳ／ＤＳ鎖の硫酸化が、バーシカンと、Ｌ−セレクチン及びＰ−セレクチンのそれぞれとの相互作用に必要とされることが示唆された。一方、図１のレーン１３及び１４に示すように、非硫酸化バーシカンは、カワシマ（Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｈ．） ら、［Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７５， ３５４４８−３５４５６， （２０００）］のように、Ｅ−セレクチン−Ｉｇとは相互作用しなかった。
【００７２】
対照的に、図１のレーン１７及び１８に示されるように、バーシカンとＣＤ４４−Ｉｇとの間の相互作用は、塩素酸ナトリウム処理により阻害されなかった。しかしながら、バーシカンとＣＤ４４−Ｉｇとの間の相互作用が、塩素酸ナトリウム処理により阻害されなかったことは、バーシカンとヒアルロン酸とＣＤ４４−Ｉｇとからなる３分子複合体の形成によるものであることも考えられた。
【００７３】
そこで、ＡＣＨＮ細胞の ［３５Ｓ］ メチオニン標識馴化培地を、文献 ［カワシマ（Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｈ．） ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７５， ３５４４８−３５４５６， （２０００）］ の記載と同様に、ヒアルロニダーゼＳＤ（図１中、「ＨＡ’ａｓｅ」；５０ｍＵ／ｍｌ）で３時間処理し、ついで、得られた馴化培地と、ＣＤ４４−Ｉｇとをインキュベートした。
【００７４】
その結果、前記ヒアルロン酸は、前記ヒアルロニダーゼＳＤによる処理により、ほぼ完全に分解・除去されたが、図１のレーン１９及び２０に示されるように、バーシカンとＣＤ４４−Ｉｇとの相互作用は、全く影響されなかった。したがって、バーシカンの硫酸化が、バーシカンとＣＤ４４との相互作用に必要とされないこと、すなわち、バーシカンのＣＳ／ＤＳ鎖が、硫酸化非依存性様式でＣＤ４４と相互作用することが確認された。
【００７５】
実施例２
種々のＣＳ／ＤＳ鎖を用いて阻害アッセイを行ない、それにより、セレクチン及びＣＤ４４のそれぞれと相互作用する構造を検討した。
【００７６】
（１）ＣＳ／ＤＳ鎖の二糖組成解析
阻害アッセイに用いたＣＳ／ＤＳ鎖は、コンドロイチン（表１中、「ＣＨ」）、コンドロイチン硫酸Ａ（表１中、「ＣＳ Ａ」）、コンドロイチンポリ硫酸（表１中、「ＣＰＳ」）、デルマタン、雄鶏の鶏冠から精製されたデルマタン硫酸〔表１中、「ＤＳ」；生化学工業株式会社製；ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ， Ｋ．）ら， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．， １３１， ３０１−３１４， （１９８４） 〕、デルマタンポリ硫酸（表１中、「ＤＰＳ」）、コンドロイチン硫酸Ｅ（表１中、「ＣＳ Ｅ」）である。前記コンドロイチンは、クジラ軟骨由来コンドロイチン硫酸Ａの化学的脱硫ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ， Ｋ．）， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ８６， １３２３−１３２９ （１９７９）］ により生産されたものである。前記コンドロイチンポリ硫酸（生化学工業株式会社製）は、コンドロイチン硫酸Ａの選択的６−Ｏ−硫酸化 ［ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ， Ｋ．）ら， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．， １５８， １８３−１９０ （１９８６）］ により生産されたものである。前記デルマタンポリ硫酸（生化学工業株式会社製）は、デルマタン硫酸の選択的６−Ｏ−硫酸化 ［ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ， Ｋ．）ら， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．， １５８， １８３−１９０ （１９８６）］ により生産されたものである。デルマタン（生化学工業株式会社製）は、前記デルマタン硫酸の化学的脱硫 ［ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ， Ｋ．）， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ８６， １３２３−１３２９ （１９７９）］ により生産されたものである。
【００７７】
フジモト（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ， Ｔ．）ら ［Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３， ３５９−３６６ （２００１）］のように、前記ＣＳ／ＤＳ鎖を、コンドロイチナーゼＡＢＣ（１単位／ｍｌ）により３７℃で７時間処理した。得られた産物を、アミン結合シリカＰＡ−０３カラムでのＨＰＬＣに供し、それにより、二糖組成を決定した。結果を表１に示す。
【００７８】
【表１】
【００７９】
コンドロイチンポリ硫酸、コンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチンのそれぞれの鎖長及び原子価は、同一であるが、これらのグリコサミノグリカンの硫酸化の程度は異なる。同様に、デルマタンポリ硫酸、デルマタン硫酸及びデルマタンは、硫酸化のみが異なる。
【００８０】
（２）結合阻害アッセイ
バーシカンと、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びＣＤ４４のそれぞれとの結合の阻害アッセイを、以下のように行なった。まず、Ｌ−セレクチン−Ｉｇ（３μｇ／ｍｌ）、Ｐ−セレクチン−Ｉｇ（４μｇ／ｍｌ）又はＣＤ４４−Ｉｇ（０．２５μｇ／ｍｌ）を用いて、慣用の手法で、９６ウェル平底マイクロタイタープレート（コスターＥＩＡ／ＲＩＡプレート ナンバー３６９０）上の各ウェルをコートした。ついで、得られたプレート上のウェルに、種々の濃度のケラタン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、デルマタンポリ硫酸及びコンドロイチン硫酸Ｅのそれぞれと、ビオチン化バーシカンとをウェルに添加し、プレートを、室温で２時間インキュベートした。その後、前記緩衝液Ａでプレートを洗浄し、カワシマ（Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｈ．） ら［Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５， ３５４４８−３５４５６ （２０００）］に記載のように、酵素結合免疫吸着定量法を行なった。アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンとＢｌｕｅ ＰｈｏｓＴＭ基質とを用い、６２０ｎｍにおける吸収を測定することにより、結合を測定した。
【００８１】
結果を図２に示す。図２中、十字は、ケラタン硫酸、白三角は、コンドロイチン、白四角は、コンドロイチン硫酸Ａ、白丸は、コンドロイチンポリ硫酸、黒三角は、デルマタン、黒四角は、デルマタン硫酸、黒丸−実線は、デルマタンポリ硫酸、黒丸−点線は、コンドロイチン硫酸Ｅを示す。また、図２中、パネルＡは、バーシカンとＬ−セレクチンとの結合に関する結果である、パネルＢは、バーシカンとＰ−セレクチンとの結合に関する結果である、パネルＣは、バーシカンとＣＤ４４との結合に関する結果である。
【００８２】
図２に示されるように、ビオチン化バーシカンと、Ｌ−セレクチン−Ｉｇ及びＰ−セレクチン−Ｉｇのそれぞれとの結合は、主要な二糖成分として、ＧｌｃＡβ１／ＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）を含むグリコサミノグリカン（コンドロイチンポリ硫酸、デルマタンポリ硫酸及びコンドロイチン硫酸Ｅ）により、用量依存的に阻害されるが、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、デルマタン、デルマタン硫酸等の低硫酸化若しくは非硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖又はケラタン硫酸により阻害されなかった。対照的に、ビオチン化バーシカンとＣＤ４４−Ｉｇとの結合は、低硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖、非硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖等の調べられた全ＣＳ／ＤＳ鎖により阻害されたが、ケラタン硫酸により阻害されなかった。
【００８３】
これらの結果は、硫酸化が、バーシカンのＣＳ／ＤＳ鎖と、Ｌ−セレクチン及びＰ−セレクチンのそれぞれとの相互作用に重要な役割を果たすが、バーシカンのＣＳ／ＤＳ鎖とＣＤ４４との相互作用には役割を果たさないという前記実施例１の結果と一致した。
【００８４】
実施例３
バーシカンのグリコサミノグリカン構造をキャラクタライズした。
【００８５】
（１）バーシカン由来グリコサミノグリカンの調製
プロナーゼ〔９０Ｕ以上 カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社製〕を含む溶液（組成：５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＣＨ３ ＣＯＯＮａ，１ｍＭＣａＣｌ２ ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，ｐＨ８．０） ２ｍｌ中、精製バーシカン（８０μｇ）を３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、得られた産物に、０．５ｍｌの溶液（組成：１Ｍ ＮａＢＨ４ 、５Ｍ ＮａＯＨ）を添加し、３７℃でインキュベートした。２４時間インキュベーション後、得られた産物に０．５ｍｌのＣＨ３ ＣＯＯＨを添加することにより、反応を終了させ、バーシカン由来グリコサミノグリカンを含む反応混合物を得た。得られた反応混合物について、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析膜〔分子量排除限界３，５００；ザ スペクトラムコーポレーション（Ｔｈｅ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｏ．）社製〕を用いて、蒸留水に対して透析し、バーシカン由来グリコサミノグリカンを得た。
【００８６】
（２）バーシカン由来グリコサミノグリカンの高感度二糖組成解析
コンドロ−６−スルファターゼ〔０．３１Ｕ／ｍｌ 緩衝液Ｂ（トリエチルアミンでｐＨ７．０に調整された３％ 酢酸）〕の存在下又は非存在下、前記（１）で得られたバーシカン由来グリコサミノグリカンと、コンドロイチナーゼＡＢＣ（０．３８Ｕ／ｍｌ）とを、３７℃で１時間インキュベートし、得られた産物を乾燥させ、二糖産物を得た。ついで、キノシタらの方法 ［キノシタ（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ， Ａ．） ら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２６９， ３６７−３７８ （１９９９）］に従って、前記二糖産物（０．１〜５０ｎｍｏｌ）と、誘導体化試薬混合物〔組成：ジメチルスルホキシド中、０．３５Ｍ ２−アミノベンゾアミド（２−ＡＢ）、１．０Ｍ ＮａＣＮＢＨ４ 、３０重量％ 酢酸〕 ５μｌとを混合し、得られた混合物を、６５℃で２時間インキュベートした。ついで、得られた産物を、クロロホルム：蒸留水（１：１）で分画し、誘導体化二糖を含む水層を回収した。
【００８７】
得られた誘導体化二糖を含む水層について、既報 ［フジモト（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ， Ｔ．）ら、Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３， ３５９−３６６ （２００１）］ のように、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により解析した。抽出物について、蛍光検出器を用いて３３０ｎｍの励起波長及び４２０ｎｍの発光波長のそれぞれをモニターした。結果を図３に示す。なお、図３中、０Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−０Ｓの溶出位置、４Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−４Ｓの溶出位置、６Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−６Ｓの溶出位置、ｄｉＳＤ は、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ｄｉ（２，６）Ｓの溶出位置、ｄｉＳＥ は、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ｄｉ（４，６）Ｓの溶出位置、ＵＡ２Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ＵＡ２Ｓの溶出位置を示す。また、二糖標品の略称の対応表を表２に示す。
【００８８】
【表２】
【００８９】
図３のパネルＡに示されるように、コンドロイチナーゼＡＢＣにより処理されたバーシカン由来グリコサミノグリカンについては、二糖標品の溶出位置に対応する５つのピークが検出された。また、図３のパネルＢに示されるように、コンドロ−６−スルファターゼとコンドロイチナーゼＡＢＣとにより処理されたバーシカン由来グリコサミノグリカンについては、ΔＤｉ−０Ｓ、ΔＤｉ−ＵＡ−２Ｓ及びΔＤｉ−４Ｓに対応する３つのピークが検出され、図３のパネルＡにおいて検出された５つのピークが、ΔＤｉ−０Ｓ、ΔＤｉ−６Ｓ、ΔＤｉ−４Ｓ、ΔＤｉ−ｄｉ（２，６）Ｓ及びΔＤｉ−ｄｉ（４，６）Ｓであることが確認された。
【００９０】
図３のパネルＡにおけるΔＤｉ−０Ｓ、ΔＤｉ−６Ｓ、ΔＤｉ−４Ｓ、ΔＤｉ−ｄｉ（２，６）Ｓ及びΔＤｉ−ｄｉ（４，６）Ｓのそれぞれのピーク面積は、０．８％、１５．７％、７７．６％、１．４％及び４．５％であった。二糖標品に対応しない小さい付加的なピーク（６．３％）が検出されたが、コンドロイチナーゼＡＢＣの代わりにコンドロイチナーゼＡＣＩＩを用いて、同様の結果が、得られた。これらの結果により、バーシカンのグリコサミノグリカンが、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）を含み、主要なＣＳ鎖と、コンドロイチナーゼＡＣＩＩに耐性であるマイナーなＤＳ鎖との混合物から構成されたヘテロポリマーであることが示唆された。
【００９１】
実施例４
バーシカンは、接着分子だけでなく、特定のケモカインとも相互作用しうることが示されている ［ヒロセ（Ｈｉｒｏｓｅ， Ｊ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ５２２８−５２３４ （２００１）］。そこで、バーシカンとケモカインとの相互作用に対する硫酸化の必要性を検討した。
【００９２】
（１）低硫酸化バーシカンの調製
１０重量％ ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ １６４０中１００ｍＭ 塩素酸ナトリウムの存在下又は非存在下にＡＣＨＮ細胞を２日間培養した。馴化培地を取り出した後、無血清培地であるＥＸ−ＣＥＬＬ ６１０ ＨＳＦ〔ジェイアールエイチ バイオサイエンス（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製〕中、１００ｍＭ 塩素酸ナトリウムの存在下又は非存在下に、細胞をさらに４日間培養した。馴化培地を回収し、１０，０００×ｇで１５分間４℃でスピンして、塩素酸ナトリウム処理馴化培地及び塩素酸ナトリウム非処理馴化培地のそれぞれを得た。
【００９３】
塩素酸ナトリウム処理馴化培地又は塩素酸ナトリウム非処理馴化培地と、２０濁度減少単位／ｍｌ ヒアルロニダーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙａｌｕｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）とを、３７℃で４．５時間インキュベートした。その後、得られた産物のそれぞれと、抗Ｄ抗体（１０μｇ）結合プロテインＡ−セファロースビーズ（１０μｌビーズ）とをインキュベートして、各馴化培地からバーシカンを沈澱させた。得られたビーズを洗浄し、該ビーズを、１単位／ｍｌ コンドロイチナーゼＡＢＣと１単位／ｍｌ コンドロイチナーゼＡＣＩＩとの存在下、３７℃で２時間をインキュベートした。その後、二糖産物を回収し、前記キノシタらの方法に従って、２−ＡＢで、二糖産物を誘導体化した。得られた誘導体化二糖産物をＨＰＬＣで解析した。その結果を図４のパネルＡに示す。なお、図４のパネルＡ中、０Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−０Ｓの溶出位置、４Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−４Ｓの溶出位置、６Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−６Ｓの溶出位置、ｄｉＳＤ は、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ｄｉ（２，６）Ｓの溶出位置、ｄｉＳＥ は、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ｄｉ（４，６）Ｓの溶出位置を示す。
【００９４】
図４のパネルＡに示されるように、塩素酸ナトリウム処理した馴化培地から得られたバーシカン由来グリコサミノグリカンの場合、ΔＤｉ−０Ｓのみがバーシカン由来グリコサミノグリカンにおける主要ピーク（８２．８％）として検出され、ΔＤｉ−６Ｓ（７．２％）及びΔＤｉ−４Ｓ（１０．０％）は、マイナーピークとして検出され、ΔＤｉ−ｄｉ（２，６）Ｓ又はΔＤｉ−ｄｉ（４，６）は検出されなかった。したがって、塩素酸ナトリウム処理により、主に非硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖を生じる低硫酸化バーシカンを生じることがわかる。
【００９５】
（２）サンドウィッチ型酵素結合免疫吸着定量法
得られた低硫酸化バーシカン及びインタクトなバーシカンのそれぞれと、ケモカインとの結合を、サンドウィッチ型酵素結合免疫吸着定量法で調べた。
【００９６】
ＢＳＡ（６μｇ／ｍｌ）、抗バーシカンモノクローナル抗体２Ｂ１（図４中、「２Ｂ１」；５μｇ／ｍｌ）、Ｌ−セレクチン−Ｉｇ（図４中、「Ｌ−Ｉｇ」；３μｇ／ｍｌ）、Ｅ−セレクチン−Ｉｇ（図４中、「Ｅ−Ｉｇ」；３μｇ／ｍｌ）、Ｐ−セレクチン−Ｉｇ（図４中、「Ｐ−Ｉｇ」；３μｇ／ｍｌ）、ＣＤ４４−Ｉｇ（３μｇ／ｍｌ）、二次リンパ様組織ケモカイン（図４中、「ＳＬＣ」；３μｇ／ｍｌ）、Ｃ末端切形型二次リンパ様組織ケモカイン（図４中、「ＳＬＣ−Ｔ」；３μｇ／ｍｌ）、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０（図４中、「ＩＰ−１０」；３μｇ／ｍｌ）、血小板因子４（図４中、「ＰＦ４」；６μｇ／ｍｌ）、間質細胞由来因子−１β（図４中、「ＳＤＦ−１β」；６μｇ／ｍｌ）又は間質細胞由来因子−１α（図４中、「ＳＤＦ−１α」；６μｇ／ｍｌ）で、９６ウェル平底マイクロタイタープレートのウェルをコートし、ついで、３重量％ ＢＳＡを含むリン酸緩衝化生理的食塩水で、該ウェルをブロックした。なお、前記Ｃ末端切形型二次リンパ様組織ケモカインとして、メリッサ スウォープ−ウィリス博士〔ベルテックス ファーマシューティカル コーポレーション（Ｖｅｒｔｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．）により提供されたものを用いた。
【００９７】
得られたプレート上のウェルに、塩素酸ナトリウム処理ＡＣＨＮ細胞の馴化培地又は塩素酸ナトリウム非処理ＡＣＨＮ細胞の馴化培地を添加し、１時間インキュベートした。前記緩衝液Ａでウェルを洗浄した後、１μｇ／ｍｌ ビオチン化抗Ｄ抗体を添加し、１時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンとＢｌｕｅ ＰｈｏｓＴＭ基質とを用い、６２０ｎｍにおける吸収を測定することにより、結合を測定した。結果を図４のパネルＢに示す。なお、図４のパネルＢ中、黒バーは、非処理馴化培地由来バーシカンを用いた場合の結果を示し、斜線バーは、塩素酸ナトリウム処理馴化培地由来バーシカンを用いた場合の結果を示す。各バーは、４連の測定の平均±標準偏差を示す。
【００９８】
図４のパネルＢに示されるように、インタクトなバーシカンと低硫酸化バーシカンとの両方が、抗バーシカンモノクローナル抗体２Ｂ１及びＣＤ４４−Ｉｇに結合し、インタクトなバーシカンのみが、Ｌ−セレクチン−Ｉｇ及びＰ−セレクチン−Ｉｇと結合し、図１に示される結果と一致した。
【００９９】
また、図４のパネルＢに示されるように、インタクトであるが低硫酸化でないバーシカン（黒バー）は、顕著に、二次リンパ様組織ケモカイン、γ−インターフェロン誘導タンパク質−１０、血小板因子４、間質細胞由来因子−１β等のケモカインと結合した。したがって、バーシカンのＣＳ／ＤＳ鎖のにおける硫酸化が、ケモカインと相互作用するのに必要であることが示唆された。
【０１００】
さらに、図４のパネルＢに示されるように、インタクト及び低硫酸化のいずれの型のバーシカンも、塩基性アミノ酸クラスターを含むＣ末端３２アミノ酸を欠損した組換切形型二次リンパ様組織ケモカインとほとんど結合せず、あったとしてもごくわずかしか結合しなかった。また、インタクト及び低硫酸化のいずれの型のバーシカンも、間質細胞由来因子−１βのＣ末端４アミノ酸を天然に欠損した間質細胞由来因子−１αに結合しなかった。これらの結果により、バーシカンのＣＳ／ＤＳ鎖が、二次リンパ様組織ケモカインのＣ末端領域及び間質細胞由来因子−１βのＣ末端領域のそれぞれと相互作用することが示唆された。
【０１０１】
実施例５
バーシカンとケモカインとの結合における過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖の影響を調べた。
【０１０２】
ＢＳＡ（５μｇ／ｍｌ）、抗バーシカンモノクローナル抗体２Ｂ１（５μｇ／ｍｌ）、ＣＤ４４−Ｉｇ（７μｇ／ｍｌ）、Ｌ−セレクチン−Ｉｇ（３μｇ／ｍｌ）、Ｐ−セレクチン−Ｉｇ（３μｇ／ｍｌ）又はケモカイン（１μｇ／ｍｌ）で９６ウェル平底マイクロタイタープレートのウェルをコートし、ついで、３重量％ ＢＳＡを含むリン酸緩衝化生理的食塩水でブロックした。なお、前記ケモカインとして、二次リンパ様組織ケモカイン、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０、血小板因子４、間質細胞由来因子−１β〔ペプロ テック（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）社製〕及び間質細胞由来因子−１α〔ペプロ テック（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）社製〕を用いた。
【０１０３】
得られたプレート上のウェル中、ビオチン化バーシカン（０．２５μｇ／ｍｌ）を、１００μｇ／ｍｌの各グリコサミノグリカン（コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタンポリ硫酸及びコンドロイチン硫酸Ｅ）の存在下又は非存在下に、室温で２時間インキュベートした。その後、前記緩衝液Ａでプレートを洗浄し、既報 ［カワシマ（Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｈ．） ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７５， ３５４４８−３５４５６ （２０００）］のように、酵素結合免疫吸着定量法を行なった。アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンとＢｌｕｅ ＰｈｏｓＴＭ基質とを用い、６２０ｎｍにおける吸収を測定することにより、結合を測定した。結果を図５に示す。なお、図５中、横軸の表記は、図４と同様である。また、各レーン中、バー１は、グリコサミノグリカン非存在下における結果、バー２は、コンドロイチン、バー３は、コンドロイチン硫酸Ａ、バー４は、コンドロイチンポリ硫酸、バー５は、デルマタンポリ硫酸、バー６は、コンドロイチン硫酸Ｅを示す。
【０１０４】
図５に示されるように、ビオチン化バーシカンと、二次リンパ様組織ケモカイン、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０、血小板因子４、間質細胞由来因子−１β、Ｌ−セレクチン及びＰ−セレクチンのそれぞれとの結合のそれぞれは、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタンポリ硫酸、コンドロイチン硫酸Ｅ等の過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖により同程度まで阻害された。また、前記に示したように、ビオチン化バーシカンとＣＤ４４−Ｉｇとの結合は、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、デルマタンポリ硫酸及びコンドロイチン硫酸Ｅのそれぞれにより阻害されたが、コンドロイチンポリ硫酸の影響は、本実験の系で用いられた用量範囲において顕著でなかった。バーシカンと抗バーシカンモノクローナル抗体２Ｂ１との結合は、調べられたグリコサミノグリカンのいずれかの添加によっても、影響をうけなかった。すなわち、これらの結果により、ＣＳ／ＤＳ鎖の硫酸化が、ケモカインとの相互作用に必要とされ、ＧｌｃＡβ１／ＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）を含む過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖が、ケモカインと相互作用することが示唆された。
【０１０５】
実施例６
ＢＩＡｃｏｒｅＴＭバイオセンサー〔ビアコア エービー（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ）社製〕を用いた表面プラズモン共鳴により、種々のＣＳ／ＤＳ鎖と、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＣＤ４４及びケモカインのそれぞれとの相互作用の親和性速度論を調べた。
【０１０６】
全実験を２５℃で行なった。洗浄及び解離段階において、ランニングバッファーとして、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ２ ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，ｐＨ６．８）を用いた。
【０１０７】
まず、アミンカップリングキット〔アマシャム−バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製〕を用い、製造者により提供された説明書に従って、一級アミン基を介して、約１．８−２．０キロレゾナンス単位（１キロレゾナンス単位＝１ｎｇ／ｍｍ２ ）のストレプトアビジンをＢ１センサーチップに共有結合的に固定化した。残りの活性化基を、１５０μｌの１Ｍ エタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）でブロックした。ついで、サディール（Ｓａｄｉｒ） らの方法 ［Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ８２８８−８２９６ （２００１）］に従って、ＥＺ−ｌｉｎｋＴＭ ビオチン−ＬＣ−ヒドラジド〔ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）社製〕を用い、還元末端でビオチン化した各グリコサミノグリカンを、約１５０レゾナンス単位の固定化レベルを得るように、センサーチップ表面にインジェクトした。
【０１０８】
種々の濃度の二次リンパ様組織ケモカイン、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０、間質細胞由来因子−１β、単量体Ｌ−セレクチン〔ジェンザイム−テック（Ｇｅｎｚｙｍｅ−Ｔｅｃｈｎｅ）社製〕、単量体Ｐ−セレクチン〔ジェンザイム−テック（Ｇｅｎｚｙｍｅ−Ｔｅｃｈｎｅ）社製〕及び単量体ＣＤ４４を、グリコサミノグリカン結合センサーチップに流速３０μｌ／分で０〜９０秒間、連続的にインジェクトし、ついで、ランニングバッファーをインジェクトすることにより、結合アッセイを行なった。レゾナンス単位での応答を時間の関数として記録した。
【０１０９】
なお、センサーチップ表面について、ケモカイン又はＣＤ４４を用いた場合、３００μｌの１Ｍ ＮａＣｌで再生し、セレクチンを用いた場合、３００μｌの１Ｍ ＮａＣｌと、つづく１００μｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）とで再生した。センサーチップ表面を再生した結果、ベースラインにおける顕著な変化は、観察されなかった。
【０１１０】
単一部位結合モデルを用いたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ ｓｏｆｔｗａｒｅ〔ファルマシアバイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）社製〕により、親和性速度論的パラメーターを決定した。図６に、固定化グリコサミノグリカンと、ケモカイン、Ｌ−セレクチン及びＣＤ４４それぞれとの相互作用を記録したＢＩＡｃｏｒｅのセンサーグラムを示し、該相互作用の速度論的パラメータ〔会合速度定数（ｋｏｎ）、解離速度定数（ｋｏｆｆ ）及び平衡解離定数（ｋｄ ）〕を、表３に示す。なお、図６及び表３中、ＳＬＣは、二次リンパ様組織ケモカインを、ＩＰ−１０は、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０を、ＳＤＦ−１βは、間質細胞由来因子−１βを示し、ＣＳ Ｅは、コンドロイチン硫酸Ｅを、ＣＳ Ａは、コンドロイチン硫酸Ａを示す。また、表３中、単量体ＣＤ４４とコンドロイチン硫酸Ｅとの間の相互作用のＫｄ 値は、平衡時の結合量から算出された値であり、ＣＤ４４とヒアルロン酸との間の相互作用のＫｄ 値は、ＣＤ４４−Ｉｇを用いて算出された値である。
【０１１１】
【表３】
【０１１２】
図６に示されるように、二次リンパ様組織ケモカイン、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０、間質細胞由来因子−１β、単量体Ｌ−セレクチン及び単量体Ｐ−セレクチンは、センサーチップ表面に固定化されたコンドロイチン硫酸Ｅに、用量依存的に結合した。同様の親和性速度論が、コンドロイチン硫酸Ｅの代わりに、コンドロイチンポリ硫酸又はデルマタンポリ硫酸を用いた場合に観察された。対照的に、セレクチン及びケモカインは、コンドロイチン硫酸Ａ又はコンドロイチンと相互作用しなかった。これらの結果は、図２及び図５に示される前記阻害アッセイの結果と一致した。
【０１１３】
さらに、表３に示された親和性速度論的パラメータの評価により、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインが、ＧｌｃＡβ１／ＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）を含む過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖と高い親和性（Ｋｄ ２１．１〜２９３ｎＭ）で相互作用することが示された。対照的に、ＣＤ４４とグリコサミノグリカンとの相互作用は、セレクチンとグリコサミノグリカンとの相互作用及びケモカインとグリコサミノグリカンとの相互作用とはかなり異なることが示された。また、表３の結果より、単量体ＣＤ４４が、低い親和性（Ｋｄ ８５．２〜１２９μＭ）でコンドロイチン硫酸Ａ又はコンドロイチンと結合することが示された。単量体ＣＤ４４は、コンドロイチン硫酸Ｅに弱く（Ｋｄ ２１１μＭ）結合し、コンドロイチンポリ硫酸又はデルマタンポリ硫酸には結合しなかった。調べられたＣＳ／ＤＳ鎖は、いずれも、単量体Ｅ−セレクチン、Ｃ末端切形型二次リンパ様組織ケモカイン及び間質細胞由来因子−１αと、ほとんど相互作用せず、あったとしてもごくわずかしか相互作用しなかった。一方、表３に示されるように、過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖は、Ｌ−セレクチン又はＰ−セレクチンの場合と同様に、高い親和性で特定のケモカインと相互作用した。過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖とケモカイン（二次リンパ様組織ケモカイン、γ−インターフェロン誘導タンパク質−１０、間質細胞由来因子−１β）との高親和性結合により、これらのケモカインが、イン・ビボで過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖により、直ちにトラップされるであろうことが示唆される。この仮定は、過硫酸化ＣＳ／ＤＳ−ケモカイン複合体形成が、速い会合速度（０．８６４〜４．１５×１０４ Ｍ−１ｓ−１）により特徴付けられることを示した表面プラズモン共鳴解析による速度論解析により支持される。
【０１１４】
従来、単量体Ｌ−セレクチンは、低い親和性（Ｋｄ ＝１０８μＭ）で、非常に速い会合速度（≧１０５ Ｍ−１ｓ−１）及び解離速度（≧１０５ ｓ−１）で、固定化されたグリコシル化依存性細胞接着分子−１（ＧｌｙＣＡＭ−１）と結合することが報告されている ［ニコルソン（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ， Ｍ． Ｗ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３， ７６３−７７０ （１９９８）］。また、単量体Ｐ−セレクチンは、相対的に高い親和性（Ｋｄ 〜３００ｎＭ）で、速い会合速度（４．４×１０６ Ｍ−１ｓ−１）及び解離速度（１．４ｓ−１）で、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１と結合することが報告されている ［メータ（Ｍｅｈｔａ， Ｐ．） ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３， ３２５０６−３２５１３ （１９９８）］。これらの性質は、速い接着と脱接着とにより媒介されるセレクチン媒介ローリング接着動態に重要であると推定されている。
【０１１５】
しかしながら、驚くべきことに、図６及び表３に示されるように、表面プラズモン共鳴解析により、過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖と、Ｌ−セレクチン及びＰ−セレクチンのそれぞれとの結合親和性は、既知リガンドと、Ｌ−セレクチン及びＰ−セレクチンのそれぞれとの結合親和性よりも高いことが示された。したがって、適切なＣＳ／ＤＳ鎖が局所的に発現される場合、表３に示されるような遅い解離速度での、過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖と、Ｌ−セレクチン及びＰ−セレクチンのそれぞれとの高親和性結合が、異なるローリング速度での白血球のローリング相互作用及び／又は静的接着相互作用を可能にすると考えられる。
【０１１６】
実施例７
ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼによる消化により、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｅのそれぞれから各種オリゴ糖断片を調製し、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＣＤ４４及びケモカインのそれぞれと直接的に相互作用する構造単位を調べた。
【０１１７】
（１） コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｅのいずれか由来のストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ結合ビオチン化オリゴ糖断片の調製
イカ軟骨由来コンドロイチン硫酸Ｅ（１ｍｇ）を、０．６ｍｇ ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼ〔１，８００単位；シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕を含む溶液（組成：５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１３３ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０４％ ゼラチン，ｐＨ５．０）に懸濁した。得られた反応液を、３７℃で全６８．５時間インキュベートして、コンドロイチン硫酸Ｅ由来オリゴ糖断片を含む消化産物を得た。なお、インキュベーション開始から、２４時間経過時及び４５．５時間経過時に、追加の２ｍｇ（６，０００単位）の酵素を反応液に添加した。
【０１１８】
また、クジラ軟骨由来コンドロイチン硫酸Ａ及びサメ軟骨由来コンドロイチン硫酸Ｃのそれぞれを、０．６ｍｇ ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼ〔１，８００単位；シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕を含む溶液（組成：５０ｍＭ 酢酸ナトリウム，ｐＨ５．０）に懸濁した。得られた各反応液を、３７℃で２４時間インキュベートし、コンドロイチン硫酸Ａ由来オリゴ糖断片を含む消化産物及びコンドロイチン硫酸Ｃ由来オリゴ糖断片を含む消化産物のそれぞれを得た。
【０１１９】
得られた消化産物のそれぞれを、１６ｍＭ〜１Ｍ ＮａＨ２ ＰＯ４ のリニアグラジェントによるアミン結合シリカＰＡ−０３カラムを用いたＨＰＬＣにより分画した。得られた各画分を、蒸留水で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム〔１×３０ｃｍ；アマシャム−バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製〕に供した。２１０ｎｍにおける吸収により、溶出をモニターした。その結果、図７のパネルＡに示される画分ａと画分ｃと画分ｅ−１と画分ｅ−２とが得られた。
【０１２０】
（２）オリゴ糖断片の炭化水素構造の解析
画分ａ、画分ｃ、画分ｅ−１及び画分ｅ−２のそれぞれを、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ（０．３単位／ｍｌ）で３７℃１時間消化し、得られた消化産物を２−ＡＢで誘導体化した。ついで、得られた各産物について、１６〜６０６ｍＭ ＮａＨ２ ＰＯ４ ４５分間のリニアグラジェント溶出によるアミン結合シリカＰＡ−０３カラムを用いたＨＰＬＣで解析した。
【０１２１】
図７のパネルＢに示すように、コンドロイチナーゼＡＣＩＩで処理した画分ｅ−１について、Ｄｉ−ｄｉ（４，６）ＳとΔＤｉ−４Ｓとが、約１：１のモル比で検出された。これらのピークは、コンドロイチナーゼＡＣＩＩとコンドロ−６−スルファターゼとの混合物による処理後、それぞれ、Ｄｉ−４Ｓ及びΔＤｉ−４Ｓ位置にシフトし、コンドロイチナーゼＡＣＩＩとコンドロ−６−スルファターゼとコンドロ−４−スルファターゼとの混合物による処理後、さらに、それぞれ、Ｄｉ−０Ｓ及びΔＤｉ−０Ｓ位置にシフトした。したがって、これらの結果により、画分ｅ−１が、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−スルフェート）の構造に相当することが示唆され、かかる構造は、マススペクトルからも支持された。
【０１２２】
同様に、画分ａの構造は、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−スルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−スルフェート）に相当し、画分ｃの構造は、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−スルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−スルフェート）に相当し、画分ｅ−２の構造は、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）に相当することが決定された。
【０１２３】
以上の結果を、図７のパネルＣに、オリゴ糖の構造の模式図として示す。図７のパネルＣ中、黒三角は、ＧｌｃＡ、斜線丸は、ＧａｌＮＡｃ、４Ｓは、４−Ｏ−硫酸化、６Ｓは、６−Ｏ−硫酸化、β３は、β１−３結合、β４は、β１−４結合を表わす。
【０１２４】
（３）オリゴ糖断片と、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＣＤ４４及びケモカインのそれぞれとの相互作用の解析
画分ａ、画分ｃ、画分ｅ−１及び画分ｅ−２のそれぞれに含まれるオリゴ糖と、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＣＤ４４及びケモカインのそれぞれとの相互作用を調べた。
【０１２５】
まず、ビオチン−ＬＣ−ヒドラジドにより、各オリゴ糖を還元末端においてビオチン化した。前記（２）で得られた画分ａ、画分ｃ、画分ｅ−１及び画分ｅ−２のそれぞれに、１２５ｍＭ ＥＺ−ｌｉｎｋＴＭビオチン−ＬＣ−ヒドラジドとジメチルスルホキシド／酢酸（７：３）中１Ｍ ＮａＣＮＢＨ３ とを添加した。得られた反応混合物を、３時間６５℃でインキュベートし、ついで、３７℃で１２．５〜１８．５時間インキュベートすることにより、オリゴ糖をビオチン化した。得られた各反応産物を、前記のようにセファデックスＧ−２５カラムに供して、未反応のビオチン−ＬＣ−ヒドラジドを除去し、ビオチン化オリゴ糖を含む画分を回収した。ついで、得られた画分を、蒸発乾固した。
【０１２６】
得られたビオチン化オリゴ糖画分の一部を、コンドロイチナーゼＡＣＩＩで消化し、ついで、得られた消化産物を２−ＡＢ誘導体化した。得られた産物を、ＨＰＬＣにより解析した結果、還元末端由来不飽和二糖でなく、非還元末端由来二糖が検出された。したがって、約１００％のオリゴ糖がビオチン化されたことが明らかとなった。
【０１２７】
ついで、１６ｐｍｏｌの各ビオチン化オリゴ糖を含む画分の一部を、前記緩衝液Ａ ０．５ｍｌに溶解し、得られた各溶液と１μｌ（２ｐｍｏｌ）のストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕とを、４℃で一晩インキュベートした。
【０１２８】
得られた各産物を緩衝液Ａで３倍に希釈し、得られた各溶液を、ＢＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）、Ｌ−セレクチン−Ｉｇ（５μｇ／ｍｌ）、Ｅ−セレクチン−Ｉｇ（５μｇ／ｍｌ）、Ｐ−セレクチン−Ｉｇ（５μｇ／ｍｌ）、ＣＤ４４−Ｉｇ（５μｇ／ｍｌ）、二次リンパ様組織ケモカイン（５μｇ／ｍｌ）、Ｃ末端切形型二次リンパ様組織ケモカイン（５μｇ／ｍｌ）、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０（１０μｇ／ｍｌ）、血小板因子４（２．５μｇ／ｍｌ）、間質細胞由来因子−１β（５μｇ／ｍｌ）又は間質細胞由来因子−１α（５μｇ／ｍｌ）でコートされた９６ウェル平底マイクロタイタープレート（コスターＥＩＡ／ＲＩＡプレートナンバー３６９０）のウェルに供した。Ｂｌｕｅ ＰｈｏｓＴＭ基質を用い、６２０ｎｍにおける吸収を測定することにより、結合を測定した。結果を図７のパネルＤに示す。なお、図７のパネルＤ中、横軸の表記は、前記図４と同様である。また、各レーン中、バー１は、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果、バー２は、ビオチン化画分ａ結合ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果、バー３は、ビオチン化画分ｃ結合ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果、バー４は、ビオチン化画分ｅ−１結合ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果、バー５は、ビオチン化画分ｅ−２結合ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果を示す。
【０１２９】
図７のパネルＤに示すように、興味深いことに、ｅ−２画分のみがＬ−セレクチン−Ｉｇ、Ｐ−セレクチン−Ｉｇ、二次リンパ様組織ケモカイン、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０及び間質細胞由来因子−１βと結合したが、他は結合しなかった。ｅ−１画分は、血小板因子４と穏やかに結合したが、他のケモカイン又はＬ−及びＰ−セレクチンとは結合しなかった。これらの結果により、繰り返しＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）単位は、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及び調べられた多数のケモカインにより特異的に認識され、単独のＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）は、恐らく血小板因子４との相互作用に十分であろうことが示された。
【０１３０】
図７に示されるように、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれが、繰り返しＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）単位から構成された四糖と優先的に結合し、また、前記表３に示されるように、ＣＤ４４が、非硫酸化コンドロイチン硫酸鎖又は低硫酸化コンドロイチン硫酸鎖と優先的に相互作用するため、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）単位がグリコサミノグリカン中にクラスターとして存在する場合、恐らく、これらの単位が、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれと相互作用すると思われる。また、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−スルフェート）又はＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−スルフェート）を含む異なる構造が、ＣＤ４４と相互作用すると思われる。
【０１３１】
実施例８
過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖がケモカイン活性をも阻害するかどうかを調べた。Ｌ１．２／ＣＣＲ７細胞（１×１０６ 細胞／ｍｌ）を、Ｆｕｒａ−２で負荷し、グリコサミノグリカン（１００μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下に、二次リンパ様組織ケモカイン（図８中、「ＳＬＣ」）又はＣ末端切形型二次リンパ様組織ケモカイン（図８中、「ＳＬＣ−Ｔ」）で刺激した。既報 ［ヒロセ（Ｈｉｒｏｓｅ， Ｊ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ５２２８−５２３４ （２００１）］のように、蛍光率を測定することにより、細胞内カルシウム濃度をモニターした。前記グリコサミノグリカンとして、コンドロイチン硫酸Ｅ（図８中、「ＣＳ Ｅ」）及びコンドロイチン硫酸Ａ（図８中、「ＣＳ Ａ」）を用いた。結果を図８に示す。なお、図８中、矢頭は、刺激を与えた時点を示す。
【０１３２】
図８に示されるように、二次リンパ様組織ケモカイン単独、又はコンドロイチン硫酸Ａと共にプレインキュベートされた二次リンパ様組織ケモカインは、該二次リンパ様組織ケモカインのレセプターであるＣＣＲ７をトランスフェクトされたＬ１．２細胞における顕著なＣａ２＋動員を誘導したが、コンドロイチン硫酸Ｅと共にプレインキュベートされた二次リンパ様組織ケモカインは、Ｃａ２＋動員を誘導しなかった。同様に、コンドロイチンポリ硫酸又はデルマタンポリ硫酸と共にプレインキュベートされた二次リンパ様組織ケモカインは、Ｃａ２＋動員を誘導しなかった。一方、Ｃ末端切形型二次リンパ様組織ケモカインにより誘導されたＣａ２＋動員は、これらの過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖のいずれによっても影響されなかった。これらの結果により、過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖が、二次リンパ様組織ケモカインのＣ末端領域と相互作用することにより、二次リンパ様組織ケモカインの生理活性を阻害することが示唆された。
【０１３３】
また、図８に示されるように、これらのグリコサミノグリカンがケモカイン活性を阻害するため、過硫酸化ＣＳ／ＤＳ結合型のケモカインが、ケモカインレセプターのアゴニストとして機能せず、むしろ、過硫酸化ＣＳ／ＤＳ−ケモカイン複合体が、イン・ビボでのケモカインのリザーバーとして機能するであろうと考えられる。ケモカインと過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖との相互作用において観察される遅い解離速度（２．７８×１０−４〜５．３０×１０−３ｓ−１）は、この考えを支持する。
【０１３４】
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、ＣＤ４４遺伝子増幅用プライマーの配列を示す。
【０１３５】
配列番号：２は、ＣＤ４４遺伝子増幅用プライマーの配列を示す。
【０１３６】
【発明の効果】
本発明の糖化合物は、その製造の際、簡便に製造することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の糖化合物によれば、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれとそのリガンドとの結合を調節することができ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれに介される生物学的事象を調節することができ、該生物学的事象が発症に関連する疾患の症状を改善することができ、該疾患の治療又は予防剤のためのリード化合物を提供することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の治療又は予防剤によれば、炎症性疾患、アレルギー性疾患、癌転移、心筋障害、多臓器不全等の疾患の症状を改善し、生体において高い親和性を呈するという優れた性質を発現するため、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれにより介される生物学的事象が発症に関連する疾患の症状を改善することができるという優れた効果を奏する。
【０１３７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、バーシカン中のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖と、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びＣＤ４４のそれぞれとの相互作用における硫酸化の影響について、免疫沈降で調べた結果を示す図である。
【図２】図２は、バーシカンと、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びＣＤ４４のそれぞれとの結合における過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖の影響について、酵素結合免疫吸着定量法で調べた結果を示す図である。図２中、十字は、ケラタン硫酸、白三角は、コンドロイチン、白四角は、コンドロイチン硫酸Ａ、白丸は、コンドロイチンポリ硫酸、黒三角は、デルマタン、黒四角は、デルマタン硫酸、黒丸−実線は、デルマタンポリ硫酸、黒丸−点線は、コンドロイチン硫酸Ｅを示す。また、図２中、パネルＡは、バーシカンとＬ−セレクチンとの結合に関する結果である、パネルＢは、バーシカンとＰ−セレクチンとの結合に関する結果である、パネルＣは、バーシカンとＣＤ４４との結合に関する結果である。
【図３】図３は、バーシカン由来グリコサミノグリカンの二糖組成を示す図である。パネルＡは、コンドロイチナーゼＡＢＣにより処理し、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）で誘導体化されたバーシカン由来グリコサミノグリカンの二糖組成解析の結果を示し、パネルＢは、コンドロ−６−スルファターゼとコンドロイチナーゼＡＢＣとにより処理し、２−ＡＢで誘導体化されたバーシカン由来グリコサミノグリカンの二糖組成解析の結果を示す。また、図３中、０Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−０Ｓ、４Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−４Ｓ、６Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−６Ｓ、ｄｉＳＤ は、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ｄｉ（２，６）Ｓ、ｄｉＳＥ は、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ｄｉ（４，６）Ｓ、ＵＡ２Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ＵＡ２Ｓの溶出位置を示す。
【図４】図４は、バーシカンとケモカインとの相互作用における硫酸化の影響を調べた結果を示す図である。パネルＡは、２−アミノベンズアミドで誘導体化した産物の二糖組成を示し、０Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−０Ｓ、４Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−４Ｓ、６Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−６Ｓ、ｄｉＳＤ は、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ｄｉ（２，６）Ｓ、ｄｉＳＥ は、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ｄｉ（４，６）Ｓの溶出位置を示す。パネルＢは、バーシカンとケモカインとの相互作用における硫酸化の影響について、酵素結合免疫吸着定量法で調べた結果を示し、ＢＳＡは、ウシ血清アルブミン、２Ｂ１は、抗バーシカンモノクローナル抗体２Ｂ１、Ｌ−Ｉｇは、Ｌ−セレクチン−Ｉｇ、Ｅ−Ｉｇは、Ｅ−セレクチン−Ｉｇ、Ｐ−Ｉｇは、Ｐ−セレクチン−Ｉｇ、ＳＬＣは、二次リンパ様組織ケモカイン、ＳＬＣ−Ｔは、Ｃ末端切形型二次リンパ様組織ケモカイン、ＩＰ−１０は、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０、ＰＦ４は、血小板因子４、ＳＤＦ−１βは、間質細胞由来因子−１β、ＳＤＦ−１αは、間質細胞由来因子−１αを示す。パネルＢにおける各バーは、４連の測定の平均±標準偏差を示し、黒バーは、非処理馴化培地由来バーシカン、斜線バーは、塩素酸ナトリウム処理馴化培地についての結果である。各バーは、４連の測定の平均±標準偏差を示す。
【図５】図５は、バーシカンとケモカインとの結合における過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖の影響について、酵素結合免疫吸着定量法で調べた結果を示す図である。横軸の表記は、図４と同様である。また、各レーン中、バー１は、グリコサミノグリカン非存在下における結果、バー２は、コンドロイチン、バー３は、コンドロイチン硫酸Ａ、バー４は、コンドロイチンポリ硫酸、バー５は、デルマタンポリ硫酸、バー６は、コンドロイチン硫酸Ｅを示す。各バーは、３連の測定の平均±標準偏差を示す。
【図６】図６は、固定化グリコサミノグリカンと、ケモカイン、Ｌ−セレクチン及びＣＤ４４それぞれとの相互作用を記録したＢＩＡｃｏｒｅのセンサーグラムを示す。図６中、ＳＬＣは、二次リンパ様組織ケモカインを、ＩＰ−１０は、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０を、ＳＤＦ−１βは、間質細胞由来因子−１βを示し、ＣＳ Ｅは、コンドロイチン硫酸Ｅを、ＣＳ Ａは、コンドロイチン硫酸Ａを示す。図６中、共鳴単位での応答を時間の関数として記録した。
【図７】図７は、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれと相互作用する断片の構造を同定した結果を示す図である。パネルＡは、コンドロイチン硫酸Ａ（図中、ＣＳ Ａ）、コンドロイチン硫酸Ｃ（図中、ＣＳ Ｃ）及びコンドロイチン硫酸Ｅ（図中、ＣＳ Ｅ）のそれぞれのヒアルロニダーゼ消化産物のＨＰＬＣによるクロマトグラムを示す。パネルＢは、画分ａ、画分ｃ、画分ｅ−１及び画分ｅ−２のそれぞれの二糖組成を示す。パネルＣは、画分ａ、画分ｃ、画分ｅ−１及び画分ｅ−２のそれぞれの構造の模式図であり、黒三角は、ＧｌｃＡ、斜線丸は、ＧａｌＮＡｃ、４Ｓは、４−Ｏ−硫酸化、６Ｓは、６−Ｏ−硫酸化、β３は、β１−３結合、β４は、β１−４結合を表わす。パネルＤは、画分ａ、画分ｃ、画分ｅ−１及び画分ｅ−２のそれぞれに含まれるオリゴ糖と、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＣＤ４４及びケモカインのそれぞれとの相互作用を調べた結果を示し、横軸の表記は、前記図４と同様である。また、各レーン中、バー１は、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果、バー２は、ビオチン化画分ａ結合ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果、バー３は、ビオチン化画分ｃ結合ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果、バー４は、ビオチン化画分ｅ−１結合ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果、バー５は、ビオチン化画分ｅ−２結合ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果を示す。各バーは、４連の測定の平均±標準偏差を示す。
【図８】図８は、ケモカイン活性に対する過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖の影響を調べた結果を示す図である。図８中、ＳＬＣは、二次リンパ様組織ケモカイン、ＳＬＣ−Ｔは、Ｃ末端切形型二次リンパ様組織ケモカイン、ＣＳ Ｅは、コンドロイチン硫酸Ｅ、ＣＳ Ａは、コンドロイチン硫酸Ａを示す。また、図８中、矢頭は、刺激を与えた時点を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、向炎症分子であるＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインに相互作用する糖化合物並びにＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれにより介される生物学的事象が発症に関連する疾患の治療又は予防剤に関する。より詳しくは、本発明は、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ケモカイン等に介される生物学的事象が発症に関連する疾患の治療若しくは予防薬、該治療若しくは予防薬の創薬のためのリード化合物、又は該リード化合物のデザイン等に有用な糖化合物、並びに炎症性疾患、アレルギー性疾患、癌転移、心筋障害、多臓器不全等の疾患の治療又は予防に有用な治療又は予防剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
炎症は、白血球上の接着分子と血管内皮細胞との接着を促進する分子により誘発され、特定の接着分子が関与することが知られている。前記接着分子としては、例えば、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチンに代表されるセレクチンファミリー等が挙げられる。
【０００３】
前記Ｌ−セレクチン又はＰ−セレクチンと、そのリガンドとの相互作用において、該リガンドの硫酸化は、重要な役割を果たすことが知られている。例えば、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１のチロシン硫酸化は、該Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１と、Ｌ−セレクチン及びＰ−セレクチンのそれぞれとの相互作用に必要とされることが知られている ［サコ（Ｓａｋｏ， Ｄ．）ら、Ｃｅｌｌ， ８３， ３２３−３３１ （１９９５）； ポウヤニ（Ｐｏｕｙａｎｉ， Ｔ．） ら、Ｃｅｌｌ， ８３， ３３３−３４３ （１９９５）； 及びスペルチーニ（Ｓｐｅｒｔｉｎｉ， Ｏ．）ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １３５， ５２３−５３１ （１９９６）］ 。
【０００４】
また、高内皮性小静脈上のＬ−セレクチンのリガンドは、硫酸化依存性様式でＬ−セレクチンに結合することが知られている ［イマイ（Ｉｍａｉ， Ｙ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ， ３６１， ５５５−５５７ （１９９３）；（Ｈｉｒａｏｋａ， Ｎ．） ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １１， ７９−８９ （１９９９）； ビストラップ（Ｂｉｓｔｒｕｐ， Ａ．） ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １４５， ８９９−９１０ （１９９９）］ 。さらに、ＨＮＫ−１反応性スルホグルクロニル糖脂質 ［ニードハム（Ｎｅｅｄｈａｍ， Ｌ． Ｋ．）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９０， １３５９−１３６３ （１９９３）］、ヘパリンオリゴ糖 ［ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ， Ｒ． Ｍ．） ら、Ｂｌｏｏｄ， １１， ３２５３−３２５８ （１９９３）］及びヒアルロン酸グリコサミノグリカン ［ケニック（Ｋｏｅｎｉｇ， Ａ．）ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， １０１， ８７７−８８９ （１９９８）］は、Ｌ−セレクチン及びＰ−セレクチンのそれぞれに結合することが知られている。
【０００５】
しかしながら、Ｌ−セレクチン及びＰ−セレクチンのそれぞれに結合する化合物は、いずれも高分子量であり、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン等とリガンドとの結合を調節しうるリード化合物のデザインは、困難であり、いまだ、医薬品として開発に成功していないのが現状である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれとそのリガンドとの結合を調節すること、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれに介される生物学的事象を調節すること、並びに該生物学的事象が発症に関連する疾患の症状を改善すること、該疾患の治療又は予防剤のためのリード化合物を提供すること等を達成しうる糖化合物を提供することを目的とする。また、本発明は、炎症性疾患、アレルギー疾患、癌転移、心筋障害、多臓器不全等の疾患の症状を改善し、生体において高い親和性を呈しうる、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれにより介される生物学的事象が発症に関連する疾患の治療又は予防剤を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、
〔１〕 一般式（Ｉ）：
【０００８】
【化５】
（式中、Ｒ１ 、Ｒ２ 、Ｒ３ 及びＲ４ は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す）
又は
一般式（ＩＩ）：
【００１０】
【化６】
（式中、Ｒ５ 、Ｒ６ 、Ｒ７ 及びＲ８ は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す）
で表わされる糖化合物、
〔２〕 一般式（ＩＩＩ） ：
【００１２】
【化７】
（式中、Ｒ９ 及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示し、ｍは、３又は４である）
又は
一般式（ＩＶ）：
【００１４】
【化８】
（式中、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示し、ｎは、３又は４である）
で表わされる糖化合物、並びに
〔３〕 前記〔１〕又は〔２〕記載の糖化合物を有効成分として含有してなる、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれにより介される生物学的事象が発症に関連する疾患の治療又は予防剤、
に関する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明は、硫酸化グリコサミノグリカンのうち、一般式（ＩＩＩ） ：
【００１７】
【化９】
（式中、Ｒ９ 及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す）
の二糖部分、又は
一般式（ＩＶ）：
【００１９】
【化１０】
（式中、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す）
の二糖部分
を構成単位として含有する糖化合物、特に、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）を繰返し単位とする四糖化合物又はＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）を繰返し単位とする四糖化合物が、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれと相互作用するという驚くべき知見、及び前記四糖化合物が、ケモカインの生理活性等を阻害するという驚くべき知見に基づく。
【００２１】
なお、本明細書において、「ＧｌｃＡ」は、Ｄ−グルクロン酸残基を示し、「ＧａｌＮＡｃ」は、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＩｄｏＡ」は、Ｌ−イズロン酸残基を示し、「ＨｅｘＡ」は、ヘキスロン酸残基を示す。また、「β１−３」は、β１−３結合を意味し、「α１−３」は、α１−３結合を意味する。
【００２２】
本発明の糖化合物としては、一般式（Ｉ）：
【００２３】
【化１１】
（式中、Ｒ１ 、Ｒ２ 、Ｒ３ 及びＲ４ は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す）
又は
一般式（ＩＩ）：
【００２５】
【化１２】
（式中、Ｒ５ 、Ｒ６ 、Ｒ７ 及びＲ８ は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す）
で表わされる糖化合物、及び一般式（ＩＩＩ） ：
【００２７】
【化１３】
（式中、Ｒ９ 及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示し、ｍは、３又は４である）
又は
一般式（ＩＶ）：
【００２９】
【化１４】
（式中、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示し、ｎは、３又は４である）
で表わされる糖化合物である。本発明の糖化合物は、四糖〜八糖からなる化合物であるにもかかわらず、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれと相互作用し、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれが関連する生理的機能等を調節することができるという優れた効果を発揮する。さらに、本発明の糖化合物は、四糖〜八糖からなる化合物であるため、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインからなる群より選ばれた少なくとも１種と、そのリガンドとの結合を調節しうる低分子化合物として、あるいはそのリード化合物のデザインのための基礎として用いることができるという優れた効果を発揮する。
【００３１】
本発明においては、分子量の観点から、特に、前記一般式（Ｉ）又は一般式（ＩＩ）で表わされる糖化合物が好ましい。
【００３２】
前記一般式（Ｉ）において、Ｒ１ 、Ｒ２ 、Ｒ３ 及びＲ４ は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す。また、前記スルホン酸基は、本発明の目的を阻害しないものであれば、置換基を有していてもよい。前記一般式（Ｉ）の任意のＲ１ 、Ｒ２ 、Ｒ３ 及びＲ４ がスルホン酸基である糖化合物は、例えば、三酸化イオウ−トリアルキルアミン複合体、三酸化イオウ−ピリジン複合体、硫酸−トリアルキルアミン複合体又は硫酸−ピリジン複合体により得られうる。
【００３３】
また、前記一般式（ＩＩ）において、Ｒ５ 、Ｒ６ 、Ｒ７ 及びＲ８ は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す。また、前記スルホン酸基は、本発明の目的を阻害しないものであれば、置換基を有していてもよい。前記一般式（ＩＩ）の任意のＲ５ 、Ｒ６ 、Ｒ７ 及びＲ８ がスルホン酸基である化合物は、例えば、三酸化イオウ−トリアルキルアミン複合体、三酸化イオウ−ピリジン複合体、硫酸−トリアルキルアミン複合体又は硫酸−ピリジン複合体により得られうる。
【００３４】
さらに、前記一般式（ＩＩＩ） において、Ｒ９ 及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す。また、前記スルホン酸基は、本発明の目的を阻害しないものであれば、置換基を有していてもよい。前記一般式（ＩＩＩ） において、Ｒ９ 及び／又はＲ１０がスルホン酸基である化合物は、例えば、三酸化イオウ−トリアルキルアミン複合体、三酸化イオウ−ピリジン複合体、硫酸−トリアルキルアミン複合体又は硫酸−ピリジン複合体により得られうる。
【００３５】
また、前記一般式（ＩＶ）において、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子又はスルホン酸基を示す。また、前記スルホン酸基は、本発明の目的を阻害しないものであれば、置換基を有していてもよい。前記一般式（ＩＶ）において、Ｒ１１及び／又はＲ１２がスルホン酸基である化合物は、例えば、三酸化イオウ−トリアルキルアミン複合体、三酸化イオウ−ピリジン複合体、硫酸−トリアルキルアミン複合体又は硫酸−ピリジン複合体により得られうる。
【００３６】
本発明の糖化合物としては、具体的には、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−スルフェート）、ＩｄｏＡα１−３ＧｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−スルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−スルフェート）、ＩｄｏＡα１−３ＧｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−スルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−スルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−スルフェート）、ＩｄｏＡα１−３ＧｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）等が挙げられる。また、前記糖化合物のなかでも、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインとの相互作用を十分に発揮させる観点から、硫酸化の度合いが高い化合物であることが望ましい。
【００３７】
本発明の糖化合物は、例えば、
（ａ） イカ軟骨 ［スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｓ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４３， １５４３−１５５０ （１９６８）］、肥満細胞 ［カッツ（Ｋａｔｚ， Ｈ． Ｒ．） ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６１， １３３９３−１３３９６ （１９８６）；及びスティーブンス（Ｓｔｅｖｅｎｓ， Ｒ． Ｌ．）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８５， ２２８４−２２８７ （１９８８）］、好中球 ［オオハシ（Ｏｈｈａｓｈｉ， Ｙ．） ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．， ２１７， １９９−２０７ （１９８４）； 及びピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ． Ｆ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４， １２３７６−１２３８２ （１９９９）］、単球 ［ウーリン−ハンセン（Ｕｈｌｉｎ−Ｈａｎｓｅｎ， Ｌ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４， １４９１６−１４９２２ （１９８９）；マックジー（ＭｃＧｅｅ， Ｍ． Ｐ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ２６１０９−２６１１５ （１９９５）］、糸球体 ［コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｓ．） ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙ． Ａｃｔａ， ８４１， ７１−８０ （１９８５）］ 、糸球体間質細胞 ［（Ｙａｏｉｔａ， Ｅ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６５， ５２２−５３１ （１９９０）］等に見出される過硫酸化コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖を、例えば、ヒアルロニダーゼで消化する工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた消化産物を高速液体クロマトグラフィーに供して、オリゴ糖画分を得る工程、
を行なうことにより得られうる。
【００３８】
前記工程（ａ）において、過硫酸化コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖は、慣用の手法により得られうる。また、前記過硫酸化コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖の供給源は、前述の例示に特に限定されるものではなく、過硫酸化コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖を保持する他の生物、組織、細胞等であってもよい。
【００３９】
ついで、工程（ｂ）において、前記（ａ）で得られた消化産物を、クロマトグラフィー、例えば、高速液体クロマトグラフィーに供する。工程（ｂ）においては、単一種類のオリゴ糖を、単一ピークとして得られるように、慣用の各種クロマトグラフィーを行なえばよい。例えば、イカ軟骨由来コンドロイチンＡ、イカ軟骨由来コンドロイチンＣ及びイカ軟骨由来コンドロイチンＥの場合、前記クロマトグラフィーとして、１６ｍＭ〜１Ｍ ＮａＨ２ ＰＯ４ のリニアグラジェントによるアミン結合シリカゲルカラムクロマトグラフィーと、つづくゲル濾過カラムクロマトグラフィーとの組合せ等が行なわれうる。ここで、クロマトグラフィーに用いられる溶液は、前記オリゴ糖等を分離するのに適した水溶液又は水溶性有機溶媒と水との混合溶液であればよい。
【００４０】
前記工程（ｂ）により得られた糖化合物を三酸化イオウ−トリアルキルアミン複合体、三酸化イオウ−ピリジン複合体、硫酸−トリアルキルアミン複合体又は硫酸−ピリジン複合体により硫酸化することもできる。特に、コンドロイチン硫酸の６−Ｏ−硫酸化、デルマタン硫酸の６−Ｏ−硫酸化は、好ましくは、ナガサワらの方法 ［ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ， Ｋ．）ら， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．， １５８， １８３−１９０ （１９８６）］ により行なうことが望ましい。
【００４１】
本発明の糖化合物は、
▲１▼Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれと相互作用、例えば、結合する；
▲２▼バーシカンと、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれとの結合を調節、具体的には、阻害する；
▲３▼ケモカインの生理活性を阻害する
という性質を発現する。したがって、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれにより介される生物学的事象が発症に関連する疾患の治療又は予防への応用が期待される。
【００４２】
したがって、本発明により、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれにより介される生物学的事象が発症に関連する疾患の治療又は予防剤が提供される。
【００４３】
本発明の治療又は予防剤は、本発明の糖化合物を有効成分として含有することに１つの特徴がある。
【００４４】
前記「Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれが介する生物学的事象」としては、例えば、炎症における組織浸潤、サイトカイン産生調節、リンパ球ホーミング、血小板凝集、腫瘍巣の血管新生、癌転移、心筋虚血再灌流障害等が挙げられる。また、前記疾患としては、炎症性疾患、感染症、喘息、アレルギー性炎症、間質性肺炎、全身性炎症反応症候群、炎症性疾患等が挙げられる。
【００４５】
本発明の治療又は予防剤によれば、本発明の糖化合物を有効成分として含有するため、例えば、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれと相互作用して、炎症性疾患における炎症の誘因、例えば、前記Ｌ−セレクチン及び／又はＰ−セレクチンを介した白血球と血管内皮細胞との接着を調節、具体的には阻害すること、及びケモカインの生理活性（サイトカイン産生調節、Ｃａ２＋動員等）を調節、具体的には、阻害することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の治療又は予防剤によれば、本発明の糖化合物を有効成分として含有するため、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインからなる群より選ばれた少なくとも１種とそのリガンドとの結合を調節することができる。したがって、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれを介した生物学的事象が関連する炎症性疾患、アレルギー疾患、癌転移を治療、症状を抑制又は予防することができるという優れた効果を発揮する。すなわち、本発明の治療又は予防剤は、抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗癌剤等として使用されうる。
【００４６】
本発明の治療又は予防剤の作用、例えば、結合阻害能は、例えば、以下のように、表面プラズモン共鳴解析等により評価されうる。すなわち、本発明の治療又は予防剤の作用は、
（ｉ）Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン又はケモカインをセンサーチップ上に固定し、Ｌ−セレクチン固定化センサーチップ、Ｐ−セレクチン固定化センサーチップ及びケモカイン固定化センサーチップのそれぞれを得るステップ、
（ｉｉ）本発明の治療又は予防剤の存在下、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれのリガンドを、一定の流速で、前記リガンドに対応して、Ｌ−セレクチン固定化センサーチップ、Ｐ−セレクチン固定化センサーチップ及びケモカイン固定化センサーチップのいずれかに負荷するステップ、及び
（ｉｉｉ） 適切な検出手段〔例えば、光学的検出（蛍光度、蛍光偏向度等）、質量分析計との組み合わせ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計：ＥＳＩ−ＭＳ 等）〕により、光学的変動又は質量の変動として相互作用を検出し、それにより、センサーグラムを得るステップ
を含む評価方法を行なうことにより評価されうる。
【００４７】
なお、前記ステップ（ｉ）において、リガンドをセンサーチップに固定化してもよく、この場合、ステップ（ｉｉ）において、治療又は予防剤の存在下、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのいずれかを、一定の流速で、対応するリガンド固定化センサーチップ上に負荷すればよい。
【００４８】
前記評価方法においては、本発明の治療又は予防剤の非存在下、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれと、そのリガンドとの複合体の形成を示すセンサーグラムが提示された場合、例えば、光学的センサーグラム又は質量センサーグラムが、送液によるリガンドの導入により変動した場合を陰性対照とする。したがって、本発明の治療又は予防剤による結合の阻害は、本発明の治療又は予防剤の非存在下の場合と同様の反応系で、本発明の治療又は予防剤の存在下、複合体の形成を示すセンサーグラムが提示されない場合又は複合体の形成までの時間が遅延した場合を指標とする。
【００４９】
本発明の治療又は予防剤の作用、例えば、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれに介される生物学的事象の調節は、本発明の治療又は予防剤の存在下における培養細胞中の生物学的事象の有無、程度を測定することにより評価されうる。例えば、二次リンパ様組織ケモカインが介するＣａ２＋動員に関し、
ｉ）Ｌ１．２／ＣＣＲ７細胞（１×１０６ 細胞／ｍｌ）を、Ｆｕｒａ−２で負荷し、本発明の治療又は予防剤（１００μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下に、二次リンパ様組織ケモカインで刺激するステップ、及び
ｉｉ）ヒロセ（Ｈｉｒｏｓｅ， Ｊ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ５２２８−５２３４ （２００１） の記載に従い、蛍光率を測定することにより、細胞内カルシウム濃度をモニターするステップ、
を含む評価方法を行なうことにより評価されうる。
【００５０】
さらに、本発明の治療又は予防剤の作用、例えば、生体における炎症性疾患の治療又は予防効果は、炎症疾患モデル動物に、本発明の治療又は予防剤を投与し、炎症部位における症状の変化を観察すること、好中球浸潤を組織ミエロパーオキシダーゼの活性を指標として検出すること等により評価されうる。
【００５１】
本発明の治療又は予防剤の剤形としては、投与形態に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤等の経口投与剤；スプレー剤、軟膏等の外用薬；皮下、皮内、筋肉内、静脈内等への注射剤等が挙げられる。
【００５２】
したがって、本発明の治療又は予防剤中における有効成分の含有量は、前記疾患の治療又は予防を必要とする個体の年齢、体重、病態等に応じて、適宜設定することができ、例えば、投与形態が、静脈注射の場合、１０〜５００ｍｇ、皮下注射の場合、１０〜５００ｍｇであることが望ましい。
【００５３】
また、個体への本発明の治療又は予防剤の投与量は、前記疾患の治療又は予防を必要とする個体の年齢、体重、病態等に応じて、適宜設定することができ、例えば、有効成分の量として、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、１ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇであることが望ましい。
【００５４】
本発明の治療又は予防剤は、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれに介される生物学的事象が発症に関連する疾患の状態、投与対象となる個体、器官、局所部位、組織等に応じて、薬学的に許容されうる助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等をさらに含有してもよい。
【００５５】
また、本発明の治療又は予防剤は、前記有効成分を安定に維持しうる担体に該有効成分を担持させて得られた剤であってもよい。具体的には、例えば、投与対象となる個体、器官、局所部位、組織等の生体への導入を容易にしうる薬学的に許容されうる担体に、有効成分を保持させてもよい。
【００５６】
【実施例】
以下、本発明を実施例等により詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例等により限定されるものではない。なお、本実施例に用いられた試薬は、特に記載しないかぎり、カワシマ（Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｈ．） ら［Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７５， ３５４４８−３５４５６ （２０００）］ 及びヒロセ（Ｈｉｒｏｓｅ， Ｊ．）ら［Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ５２２８−５２３４ （２００１）］ に記載の試薬と同様である。また、細胞の培地組成等については、フレシュニー（Ｆｒｓｈｎｅｙ， Ｒ． Ｉａｎ） 、カルチャー・オブ・アニマルセルズ・ア・マニュアル・オブ・ベーシック・テクニック、第２版（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， ２ｎｄ ｅｄ．） 、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ． Ｉｎｃ．， ６６−８４ （１９８７）等が参照されうる。
【００５７】
実施例１
硫酸化の代謝インヒビターである塩素酸ナトリウムでＡＣＨＮ細胞を処理することにより、バーシカン中のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖（以下、ＣＳ／ＤＳ鎖とも表記する）と、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びＣＤ４４のそれぞれとの相互作用における硫酸化の必要性を検討した。
【００５８】
（１）ヒトＣＤ４４−Ｉｇの作製
ヒト由来ＣＤ４４ ｃＤＮＡを、センスプライマー（配列番号：１）：
【００５９】
【化１５】
（太字部分は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位であり、下線部は、ヒトＣＤ４４の最初の７アミノ酸のコドンである）と、アンチセンスプライマー（配列番号：２）：
【００６１】
【化１６】
（太字部分は、ＸｂａＩ制限酵素認識部位であり、下線部は、ヒトＣＤ４４の１７２〜１７８位のアミノ酸のコドンである）とを用いたＰＣＲにより調製した。得られた増幅産物を、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）Ｂ〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＣＤ４４発現ベクターを得た。また、前記増幅産物について、配列決定した。
【００６３】
製造者の説明書に従って、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ試薬〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕を用い、前記ヒトＣＤ４４発現ベクターを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。得られたトランスフェクト細胞を、２０重量％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中、ＣＯ２ インキュベーター内で、３７℃で４日間細胞を培養し、馴化培地を得た。
【００６４】
その後、前記馴化培地を、抗ＣＤ４４モノクローナル抗体ＢＲＩＣ ２３５結合ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂでのイムノアフィニティークロマトグラフィーに供して、単量体ＣＤ４４を得た。得られた可溶性ＣＤ４４を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色に供した。その結果、得られた可溶性ＣＤ４４の純度は、９５％を超える純度であった。
【００６５】
ついで、得られたＣＤ４４を用い、トヤマ−ソリマチ（Ｔｏｙａｍａ−Ｓｏｒｉｍａｃｈｉ， Ｎ．）ら ［Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ７４３７−７４４４， （１９９５）］ に記載の方法に従って、ヒトＣＤ４４−イムノグロブリン（Ｉｇ）を作製した。
【００６６】
（２） ［３５Ｓ］ 硫酸ナトリウム又は ［３５Ｓ］ メチオニンを用いたＡＣＨＮ細胞の代謝標識
１０重量％ ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ １６４０中、３０ｍＭ 塩素酸ナトリウムの存在下又は非存在下に、ＡＣＨＮ細胞を、３７℃で６時間プレインキュベートした。得られたＡＣＨＮ細胞のコンフルエントな単層を、
（ｉ）０．２ｍＣｉ／ｍｌの ［３５Ｓ］ Ｎａ２ ＳＯ４ 〔商品名：Ｓｕｌｆｅｒ−３５；アイシーエヌ ラジオケミカルズ（ＩＣＮ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社製〕の存在下、２重量％ 透析ウシ胎仔血清を含むイーグル最少基本培地ＳＭＥＭ〔硫酸不含；バイオウィッテーカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）社製〕、又は
（ｉｉ）０．２ｍＣｉ／ｍｌの ［３５Ｓ］ −メチオニン〔アイシーエヌ ラジオケミカルズ（ＩＣＮ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社製〕の存在下、２重量％透析ウシ胎仔血清を含むメチオニン不含ＲＰＭＩ １６４０培地〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕
のいずれかの培地中、３０ｍＭ 塩素酸ナトリウムの存在下又は非存在下、１８時間インキュベートして標識した。
【００６７】
（３）免疫沈降
緩衝液Ａ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ２ ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，ｐＨ６．８）を用いて、ビーズを洗浄したことを除き、カワシマ（Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｈ）らの文献［Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １１， ３９３−４０５ （１９９９）］に記載の方法に従い、以下のように免疫沈降を行なった。
【００６８】
図１に示された抗体及びＩｇキメラのそれぞれ（１０μｇ 相当量）と、プロテインＡ−セファロースカラム（１０μｌ 相当量）とを、慣用の方法により結合させ、抗体結合プロテインＡ−セファロース又はＩｇキメラ結合プロテインＡ−セファロースを得た。ついで、前記緩衝液Ａ １ｍｌ中、各抗体結合プロテインＡ−セファロース又は各Ｉｇキメラ結合プロテインＡ−セファロース（１０μｌ ゲル相当量）と、馴化培地とを、４℃で一晩インキュベートした。なお、抗バーシカンポリクローナル抗体である抗Ｄ ［ツィマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ， Ｄ． Ｒ．） ら， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １２４， ８１７−８２５ （１９９４）］ は、ディーテル Ｒ．ツィマーマン博士（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｚｕｅｒｉｃｈ）により提供されたものであり、ヒトＬ−セレクチン−Ｉｇは、アールアンドディー システムズ インコーポレーティド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）製である。
【００６９】
その後、前記ビーズを、前記緩衝液Ａで洗浄し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、ＳＤＳ−アガロース−ＰＡＧＥに供し、ついで、ゲル上の３５Ｓ標識に由来するシグナルをオートラジオグラフィーで検出した。その結果を図１に示す。
【００７０】
図１のレーン５〜８に示すように、バーシカンのコアタンパク質は、合成されたものの、レーン１〜４に示されるように、塩素酸ナトリウムによる処理により、未処理の場合に対して、９０％を超える硫酸化の阻害をもたらした。
【００７１】
また、図１のレーン１１、１２、１５及び１６に示されるように、前記塩素酸ナトリウム処理により、バーシカンと、Ｌ−セレクチン−Ｉｇ及びＰ−セレクチン−Ｉｇのそれぞれとの相互作用が阻害された。したがって、バーシカンのＣＳ／ＤＳ鎖の硫酸化が、バーシカンと、Ｌ−セレクチン及びＰ−セレクチンのそれぞれとの相互作用に必要とされることが示唆された。一方、図１のレーン１３及び１４に示すように、非硫酸化バーシカンは、カワシマ（Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｈ．） ら、［Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７５， ３５４４８−３５４５６， （２０００）］のように、Ｅ−セレクチン−Ｉｇとは相互作用しなかった。
【００７２】
対照的に、図１のレーン１７及び１８に示されるように、バーシカンとＣＤ４４−Ｉｇとの間の相互作用は、塩素酸ナトリウム処理により阻害されなかった。しかしながら、バーシカンとＣＤ４４−Ｉｇとの間の相互作用が、塩素酸ナトリウム処理により阻害されなかったことは、バーシカンとヒアルロン酸とＣＤ４４−Ｉｇとからなる３分子複合体の形成によるものであることも考えられた。
【００７３】
そこで、ＡＣＨＮ細胞の ［３５Ｓ］ メチオニン標識馴化培地を、文献 ［カワシマ（Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｈ．） ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７５， ３５４４８−３５４５６， （２０００）］ の記載と同様に、ヒアルロニダーゼＳＤ（図１中、「ＨＡ’ａｓｅ」；５０ｍＵ／ｍｌ）で３時間処理し、ついで、得られた馴化培地と、ＣＤ４４−Ｉｇとをインキュベートした。
【００７４】
その結果、前記ヒアルロン酸は、前記ヒアルロニダーゼＳＤによる処理により、ほぼ完全に分解・除去されたが、図１のレーン１９及び２０に示されるように、バーシカンとＣＤ４４−Ｉｇとの相互作用は、全く影響されなかった。したがって、バーシカンの硫酸化が、バーシカンとＣＤ４４との相互作用に必要とされないこと、すなわち、バーシカンのＣＳ／ＤＳ鎖が、硫酸化非依存性様式でＣＤ４４と相互作用することが確認された。
【００７５】
実施例２
種々のＣＳ／ＤＳ鎖を用いて阻害アッセイを行ない、それにより、セレクチン及びＣＤ４４のそれぞれと相互作用する構造を検討した。
【００７６】
（１）ＣＳ／ＤＳ鎖の二糖組成解析
阻害アッセイに用いたＣＳ／ＤＳ鎖は、コンドロイチン（表１中、「ＣＨ」）、コンドロイチン硫酸Ａ（表１中、「ＣＳ Ａ」）、コンドロイチンポリ硫酸（表１中、「ＣＰＳ」）、デルマタン、雄鶏の鶏冠から精製されたデルマタン硫酸〔表１中、「ＤＳ」；生化学工業株式会社製；ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ， Ｋ．）ら， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．， １３１， ３０１−３１４， （１９８４） 〕、デルマタンポリ硫酸（表１中、「ＤＰＳ」）、コンドロイチン硫酸Ｅ（表１中、「ＣＳ Ｅ」）である。前記コンドロイチンは、クジラ軟骨由来コンドロイチン硫酸Ａの化学的脱硫ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ， Ｋ．）， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ８６， １３２３−１３２９ （１９７９）］ により生産されたものである。前記コンドロイチンポリ硫酸（生化学工業株式会社製）は、コンドロイチン硫酸Ａの選択的６−Ｏ−硫酸化 ［ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ， Ｋ．）ら， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．， １５８， １８３−１９０ （１９８６）］ により生産されたものである。前記デルマタンポリ硫酸（生化学工業株式会社製）は、デルマタン硫酸の選択的６−Ｏ−硫酸化 ［ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ， Ｋ．）ら， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．， １５８， １８３−１９０ （１９８６）］ により生産されたものである。デルマタン（生化学工業株式会社製）は、前記デルマタン硫酸の化学的脱硫 ［ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ， Ｋ．）， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ８６， １３２３−１３２９ （１９７９）］ により生産されたものである。
【００７７】
フジモト（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ， Ｔ．）ら ［Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３， ３５９−３６６ （２００１）］のように、前記ＣＳ／ＤＳ鎖を、コンドロイチナーゼＡＢＣ（１単位／ｍｌ）により３７℃で７時間処理した。得られた産物を、アミン結合シリカＰＡ−０３カラムでのＨＰＬＣに供し、それにより、二糖組成を決定した。結果を表１に示す。
【００７８】
【表１】
コンドロイチンポリ硫酸、コンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチンのそれぞれの鎖長及び原子価は、同一であるが、これらのグリコサミノグリカンの硫酸化の程度は異なる。同様に、デルマタンポリ硫酸、デルマタン硫酸及びデルマタンは、硫酸化のみが異なる。
【００８０】
（２）結合阻害アッセイ
バーシカンと、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びＣＤ４４のそれぞれとの結合の阻害アッセイを、以下のように行なった。まず、Ｌ−セレクチン−Ｉｇ（３μｇ／ｍｌ）、Ｐ−セレクチン−Ｉｇ（４μｇ／ｍｌ）又はＣＤ４４−Ｉｇ（０．２５μｇ／ｍｌ）を用いて、慣用の手法で、９６ウェル平底マイクロタイタープレート（コスターＥＩＡ／ＲＩＡプレート ナンバー３６９０）上の各ウェルをコートした。ついで、得られたプレート上のウェルに、種々の濃度のケラタン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、デルマタンポリ硫酸及びコンドロイチン硫酸Ｅのそれぞれと、ビオチン化バーシカンとをウェルに添加し、プレートを、室温で２時間インキュベートした。その後、前記緩衝液Ａでプレートを洗浄し、カワシマ（Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｈ．） ら［Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５， ３５４４８−３５４５６ （２０００）］に記載のように、酵素結合免疫吸着定量法を行なった。アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンとＢｌｕｅ ＰｈｏｓＴＭ基質とを用い、６２０ｎｍにおける吸収を測定することにより、結合を測定した。
【００８１】
結果を図２に示す。図２中、十字は、ケラタン硫酸、白三角は、コンドロイチン、白四角は、コンドロイチン硫酸Ａ、白丸は、コンドロイチンポリ硫酸、黒三角は、デルマタン、黒四角は、デルマタン硫酸、黒丸−実線は、デルマタンポリ硫酸、黒丸−点線は、コンドロイチン硫酸Ｅを示す。また、図２中、パネルＡは、バーシカンとＬ−セレクチンとの結合に関する結果である、パネルＢは、バーシカンとＰ−セレクチンとの結合に関する結果である、パネルＣは、バーシカンとＣＤ４４との結合に関する結果である。
【００８２】
図２に示されるように、ビオチン化バーシカンと、Ｌ−セレクチン−Ｉｇ及びＰ−セレクチン−Ｉｇのそれぞれとの結合は、主要な二糖成分として、ＧｌｃＡβ１／ＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）を含むグリコサミノグリカン（コンドロイチンポリ硫酸、デルマタンポリ硫酸及びコンドロイチン硫酸Ｅ）により、用量依存的に阻害されるが、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、デルマタン、デルマタン硫酸等の低硫酸化若しくは非硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖又はケラタン硫酸により阻害されなかった。対照的に、ビオチン化バーシカンとＣＤ４４−Ｉｇとの結合は、低硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖、非硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖等の調べられた全ＣＳ／ＤＳ鎖により阻害されたが、ケラタン硫酸により阻害されなかった。
【００８３】
これらの結果は、硫酸化が、バーシカンのＣＳ／ＤＳ鎖と、Ｌ−セレクチン及びＰ−セレクチンのそれぞれとの相互作用に重要な役割を果たすが、バーシカンのＣＳ／ＤＳ鎖とＣＤ４４との相互作用には役割を果たさないという前記実施例１の結果と一致した。
【００８４】
実施例３
バーシカンのグリコサミノグリカン構造をキャラクタライズした。
【００８５】
（１）バーシカン由来グリコサミノグリカンの調製
プロナーゼ〔９０Ｕ以上 カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社製〕を含む溶液（組成：５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＣＨ３ ＣＯＯＮａ，１ｍＭＣａＣｌ２ ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，ｐＨ８．０） ２ｍｌ中、精製バーシカン（８０μｇ）を３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、得られた産物に、０．５ｍｌの溶液（組成：１Ｍ ＮａＢＨ４ 、５Ｍ ＮａＯＨ）を添加し、３７℃でインキュベートした。２４時間インキュベーション後、得られた産物に０．５ｍｌのＣＨ３ ＣＯＯＨを添加することにより、反応を終了させ、バーシカン由来グリコサミノグリカンを含む反応混合物を得た。得られた反応混合物について、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析膜〔分子量排除限界３，５００；ザ スペクトラムコーポレーション（Ｔｈｅ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｏ．）社製〕を用いて、蒸留水に対して透析し、バーシカン由来グリコサミノグリカンを得た。
【００８６】
（２）バーシカン由来グリコサミノグリカンの高感度二糖組成解析
コンドロ−６−スルファターゼ〔０．３１Ｕ／ｍｌ 緩衝液Ｂ（トリエチルアミンでｐＨ７．０に調整された３％ 酢酸）〕の存在下又は非存在下、前記（１）で得られたバーシカン由来グリコサミノグリカンと、コンドロイチナーゼＡＢＣ（０．３８Ｕ／ｍｌ）とを、３７℃で１時間インキュベートし、得られた産物を乾燥させ、二糖産物を得た。ついで、キノシタらの方法 ［キノシタ（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ， Ａ．） ら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２６９， ３６７−３７８ （１９９９）］に従って、前記二糖産物（０．１〜５０ｎｍｏｌ）と、誘導体化試薬混合物〔組成：ジメチルスルホキシド中、０．３５Ｍ ２−アミノベンゾアミド（２−ＡＢ）、１．０Ｍ ＮａＣＮＢＨ４ 、３０重量％ 酢酸〕 ５μｌとを混合し、得られた混合物を、６５℃で２時間インキュベートした。ついで、得られた産物を、クロロホルム：蒸留水（１：１）で分画し、誘導体化二糖を含む水層を回収した。
【００８７】
得られた誘導体化二糖を含む水層について、既報 ［フジモト（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ， Ｔ．）ら、Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３， ３５９−３６６ （２００１）］ のように、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により解析した。抽出物について、蛍光検出器を用いて３３０ｎｍの励起波長及び４２０ｎｍの発光波長のそれぞれをモニターした。結果を図３に示す。なお、図３中、０Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−０Ｓの溶出位置、４Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−４Ｓの溶出位置、６Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−６Ｓの溶出位置、ｄｉＳＤ は、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ｄｉ（２，６）Ｓの溶出位置、ｄｉＳＥ は、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ｄｉ（４，６）Ｓの溶出位置、ＵＡ２Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ＵＡ２Ｓの溶出位置を示す。また、二糖標品の略称の対応表を表２に示す。
【００８８】
【表２】
図３のパネルＡに示されるように、コンドロイチナーゼＡＢＣにより処理されたバーシカン由来グリコサミノグリカンについては、二糖標品の溶出位置に対応する５つのピークが検出された。また、図３のパネルＢに示されるように、コンドロ−６−スルファターゼとコンドロイチナーゼＡＢＣとにより処理されたバーシカン由来グリコサミノグリカンについては、ΔＤｉ−０Ｓ、ΔＤｉ−ＵＡ−２Ｓ及びΔＤｉ−４Ｓに対応する３つのピークが検出され、図３のパネルＡにおいて検出された５つのピークが、ΔＤｉ−０Ｓ、ΔＤｉ−６Ｓ、ΔＤｉ−４Ｓ、ΔＤｉ−ｄｉ（２，６）Ｓ及びΔＤｉ−ｄｉ（４，６）Ｓであることが確認された。
【００９０】
図３のパネルＡにおけるΔＤｉ−０Ｓ、ΔＤｉ−６Ｓ、ΔＤｉ−４Ｓ、ΔＤｉ−ｄｉ（２，６）Ｓ及びΔＤｉ−ｄｉ（４，６）Ｓのそれぞれのピーク面積は、０．８％、１５．７％、７７．６％、１．４％及び４．５％であった。二糖標品に対応しない小さい付加的なピーク（６．３％）が検出されたが、コンドロイチナーゼＡＢＣの代わりにコンドロイチナーゼＡＣＩＩを用いて、同様の結果が、得られた。これらの結果により、バーシカンのグリコサミノグリカンが、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）を含み、主要なＣＳ鎖と、コンドロイチナーゼＡＣＩＩに耐性であるマイナーなＤＳ鎖との混合物から構成されたヘテロポリマーであることが示唆された。
【００９１】
実施例４
バーシカンは、接着分子だけでなく、特定のケモカインとも相互作用しうることが示されている ［ヒロセ（Ｈｉｒｏｓｅ， Ｊ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ５２２８−５２３４ （２００１）］。そこで、バーシカンとケモカインとの相互作用に対する硫酸化の必要性を検討した。
【００９２】
（１）低硫酸化バーシカンの調製
１０重量％ ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ １６４０中１００ｍＭ 塩素酸ナトリウムの存在下又は非存在下にＡＣＨＮ細胞を２日間培養した。馴化培地を取り出した後、無血清培地であるＥＸ−ＣＥＬＬ ６１０ ＨＳＦ〔ジェイアールエイチ バイオサイエンス（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製〕中、１００ｍＭ 塩素酸ナトリウムの存在下又は非存在下に、細胞をさらに４日間培養した。馴化培地を回収し、１０，０００×ｇで１５分間４℃でスピンして、塩素酸ナトリウム処理馴化培地及び塩素酸ナトリウム非処理馴化培地のそれぞれを得た。
【００９３】
塩素酸ナトリウム処理馴化培地又は塩素酸ナトリウム非処理馴化培地と、２０濁度減少単位／ｍｌ ヒアルロニダーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙａｌｕｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）とを、３７℃で４．５時間インキュベートした。その後、得られた産物のそれぞれと、抗Ｄ抗体（１０μｇ）結合プロテインＡ−セファロースビーズ（１０μｌビーズ）とをインキュベートして、各馴化培地からバーシカンを沈澱させた。得られたビーズを洗浄し、該ビーズを、１単位／ｍｌ コンドロイチナーゼＡＢＣと１単位／ｍｌ コンドロイチナーゼＡＣＩＩとの存在下、３７℃で２時間をインキュベートした。その後、二糖産物を回収し、前記キノシタらの方法に従って、２−ＡＢで、二糖産物を誘導体化した。得られた誘導体化二糖産物をＨＰＬＣで解析した。その結果を図４のパネルＡに示す。なお、図４のパネルＡ中、０Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−０Ｓの溶出位置、４Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−４Ｓの溶出位置、６Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−６Ｓの溶出位置、ｄｉＳＤ は、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ｄｉ（２，６）Ｓの溶出位置、ｄｉＳＥ は、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ｄｉ（４，６）Ｓの溶出位置を示す。
【００９４】
図４のパネルＡに示されるように、塩素酸ナトリウム処理した馴化培地から得られたバーシカン由来グリコサミノグリカンの場合、ΔＤｉ−０Ｓのみがバーシカン由来グリコサミノグリカンにおける主要ピーク（８２．８％）として検出され、ΔＤｉ−６Ｓ（７．２％）及びΔＤｉ−４Ｓ（１０．０％）は、マイナーピークとして検出され、ΔＤｉ−ｄｉ（２，６）Ｓ又はΔＤｉ−ｄｉ（４，６）は検出されなかった。したがって、塩素酸ナトリウム処理により、主に非硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖を生じる低硫酸化バーシカンを生じることがわかる。
【００９５】
（２）サンドウィッチ型酵素結合免疫吸着定量法
得られた低硫酸化バーシカン及びインタクトなバーシカンのそれぞれと、ケモカインとの結合を、サンドウィッチ型酵素結合免疫吸着定量法で調べた。
【００９６】
ＢＳＡ（６μｇ／ｍｌ）、抗バーシカンモノクローナル抗体２Ｂ１（図４中、「２Ｂ１」；５μｇ／ｍｌ）、Ｌ−セレクチン−Ｉｇ（図４中、「Ｌ−Ｉｇ」；３μｇ／ｍｌ）、Ｅ−セレクチン−Ｉｇ（図４中、「Ｅ−Ｉｇ」；３μｇ／ｍｌ）、Ｐ−セレクチン−Ｉｇ（図４中、「Ｐ−Ｉｇ」；３μｇ／ｍｌ）、ＣＤ４４−Ｉｇ（３μｇ／ｍｌ）、二次リンパ様組織ケモカイン（図４中、「ＳＬＣ」；３μｇ／ｍｌ）、Ｃ末端切形型二次リンパ様組織ケモカイン（図４中、「ＳＬＣ−Ｔ」；３μｇ／ｍｌ）、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０（図４中、「ＩＰ−１０」；３μｇ／ｍｌ）、血小板因子４（図４中、「ＰＦ４」；６μｇ／ｍｌ）、間質細胞由来因子−１β（図４中、「ＳＤＦ−１β」；６μｇ／ｍｌ）又は間質細胞由来因子−１α（図４中、「ＳＤＦ−１α」；６μｇ／ｍｌ）で、９６ウェル平底マイクロタイタープレートのウェルをコートし、ついで、３重量％ ＢＳＡを含むリン酸緩衝化生理的食塩水で、該ウェルをブロックした。なお、前記Ｃ末端切形型二次リンパ様組織ケモカインとして、メリッサ スウォープ−ウィリス博士〔ベルテックス ファーマシューティカル コーポレーション（Ｖｅｒｔｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．）により提供されたものを用いた。
【００９７】
得られたプレート上のウェルに、塩素酸ナトリウム処理ＡＣＨＮ細胞の馴化培地又は塩素酸ナトリウム非処理ＡＣＨＮ細胞の馴化培地を添加し、１時間インキュベートした。前記緩衝液Ａでウェルを洗浄した後、１μｇ／ｍｌ ビオチン化抗Ｄ抗体を添加し、１時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンとＢｌｕｅ ＰｈｏｓＴＭ基質とを用い、６２０ｎｍにおける吸収を測定することにより、結合を測定した。結果を図４のパネルＢに示す。なお、図４のパネルＢ中、黒バーは、非処理馴化培地由来バーシカンを用いた場合の結果を示し、斜線バーは、塩素酸ナトリウム処理馴化培地由来バーシカンを用いた場合の結果を示す。各バーは、４連の測定の平均±標準偏差を示す。
【００９８】
図４のパネルＢに示されるように、インタクトなバーシカンと低硫酸化バーシカンとの両方が、抗バーシカンモノクローナル抗体２Ｂ１及びＣＤ４４−Ｉｇに結合し、インタクトなバーシカンのみが、Ｌ−セレクチン−Ｉｇ及びＰ−セレクチン−Ｉｇと結合し、図１に示される結果と一致した。
【００９９】
また、図４のパネルＢに示されるように、インタクトであるが低硫酸化でないバーシカン（黒バー）は、顕著に、二次リンパ様組織ケモカイン、γ−インターフェロン誘導タンパク質−１０、血小板因子４、間質細胞由来因子−１β等のケモカインと結合した。したがって、バーシカンのＣＳ／ＤＳ鎖のにおける硫酸化が、ケモカインと相互作用するのに必要であることが示唆された。
【０１００】
さらに、図４のパネルＢに示されるように、インタクト及び低硫酸化のいずれの型のバーシカンも、塩基性アミノ酸クラスターを含むＣ末端３２アミノ酸を欠損した組換切形型二次リンパ様組織ケモカインとほとんど結合せず、あったとしてもごくわずかしか結合しなかった。また、インタクト及び低硫酸化のいずれの型のバーシカンも、間質細胞由来因子−１βのＣ末端４アミノ酸を天然に欠損した間質細胞由来因子−１αに結合しなかった。これらの結果により、バーシカンのＣＳ／ＤＳ鎖が、二次リンパ様組織ケモカインのＣ末端領域及び間質細胞由来因子−１βのＣ末端領域のそれぞれと相互作用することが示唆された。
【０１０１】
実施例５
バーシカンとケモカインとの結合における過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖の影響を調べた。
【０１０２】
ＢＳＡ（５μｇ／ｍｌ）、抗バーシカンモノクローナル抗体２Ｂ１（５μｇ／ｍｌ）、ＣＤ４４−Ｉｇ（７μｇ／ｍｌ）、Ｌ−セレクチン−Ｉｇ（３μｇ／ｍｌ）、Ｐ−セレクチン−Ｉｇ（３μｇ／ｍｌ）又はケモカイン（１μｇ／ｍｌ）で９６ウェル平底マイクロタイタープレートのウェルをコートし、ついで、３重量％ ＢＳＡを含むリン酸緩衝化生理的食塩水でブロックした。なお、前記ケモカインとして、二次リンパ様組織ケモカイン、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０、血小板因子４、間質細胞由来因子−１β〔ペプロ テック（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）社製〕及び間質細胞由来因子−１α〔ペプロ テック（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）社製〕を用いた。
【０１０３】
得られたプレート上のウェル中、ビオチン化バーシカン（０．２５μｇ／ｍｌ）を、１００μｇ／ｍｌの各グリコサミノグリカン（コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタンポリ硫酸及びコンドロイチン硫酸Ｅ）の存在下又は非存在下に、室温で２時間インキュベートした。その後、前記緩衝液Ａでプレートを洗浄し、既報 ［カワシマ（Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｈ．） ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７５， ３５４４８−３５４５６ （２０００）］のように、酵素結合免疫吸着定量法を行なった。アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンとＢｌｕｅ ＰｈｏｓＴＭ基質とを用い、６２０ｎｍにおける吸収を測定することにより、結合を測定した。結果を図５に示す。なお、図５中、横軸の表記は、図４と同様である。また、各レーン中、バー１は、グリコサミノグリカン非存在下における結果、バー２は、コンドロイチン、バー３は、コンドロイチン硫酸Ａ、バー４は、コンドロイチンポリ硫酸、バー５は、デルマタンポリ硫酸、バー６は、コンドロイチン硫酸Ｅを示す。
【０１０４】
図５に示されるように、ビオチン化バーシカンと、二次リンパ様組織ケモカイン、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０、血小板因子４、間質細胞由来因子−１β、Ｌ−セレクチン及びＰ−セレクチンのそれぞれとの結合のそれぞれは、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタンポリ硫酸、コンドロイチン硫酸Ｅ等の過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖により同程度まで阻害された。また、前記に示したように、ビオチン化バーシカンとＣＤ４４−Ｉｇとの結合は、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、デルマタンポリ硫酸及びコンドロイチン硫酸Ｅのそれぞれにより阻害されたが、コンドロイチンポリ硫酸の影響は、本実験の系で用いられた用量範囲において顕著でなかった。バーシカンと抗バーシカンモノクローナル抗体２Ｂ１との結合は、調べられたグリコサミノグリカンのいずれかの添加によっても、影響をうけなかった。すなわち、これらの結果により、ＣＳ／ＤＳ鎖の硫酸化が、ケモカインとの相互作用に必要とされ、ＧｌｃＡβ１／ＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）を含む過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖が、ケモカインと相互作用することが示唆された。
【０１０５】
実施例６
ＢＩＡｃｏｒｅＴＭバイオセンサー〔ビアコア エービー（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ）社製〕を用いた表面プラズモン共鳴により、種々のＣＳ／ＤＳ鎖と、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＣＤ４４及びケモカインのそれぞれとの相互作用の親和性速度論を調べた。
【０１０６】
全実験を２５℃で行なった。洗浄及び解離段階において、ランニングバッファーとして、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ２ ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，ｐＨ６．８）を用いた。
【０１０７】
まず、アミンカップリングキット〔アマシャム−バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製〕を用い、製造者により提供された説明書に従って、一級アミン基を介して、約１．８−２．０キロレゾナンス単位（１キロレゾナンス単位＝１ｎｇ／ｍｍ２ ）のストレプトアビジンをＢ１センサーチップに共有結合的に固定化した。残りの活性化基を、１５０μｌの１Ｍ エタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）でブロックした。ついで、サディール（Ｓａｄｉｒ） らの方法 ［Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ８２８８−８２９６ （２００１）］に従って、ＥＺ−ｌｉｎｋＴＭ ビオチン−ＬＣ−ヒドラジド〔ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）社製〕を用い、還元末端でビオチン化した各グリコサミノグリカンを、約１５０レゾナンス単位の固定化レベルを得るように、センサーチップ表面にインジェクトした。
【０１０８】
種々の濃度の二次リンパ様組織ケモカイン、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０、間質細胞由来因子−１β、単量体Ｌ−セレクチン〔ジェンザイム−テック（Ｇｅｎｚｙｍｅ−Ｔｅｃｈｎｅ）社製〕、単量体Ｐ−セレクチン〔ジェンザイム−テック（Ｇｅｎｚｙｍｅ−Ｔｅｃｈｎｅ）社製〕及び単量体ＣＤ４４を、グリコサミノグリカン結合センサーチップに流速３０μｌ／分で０〜９０秒間、連続的にインジェクトし、ついで、ランニングバッファーをインジェクトすることにより、結合アッセイを行なった。レゾナンス単位での応答を時間の関数として記録した。
【０１０９】
なお、センサーチップ表面について、ケモカイン又はＣＤ４４を用いた場合、３００μｌの１Ｍ ＮａＣｌで再生し、セレクチンを用いた場合、３００μｌの１Ｍ ＮａＣｌと、つづく１００μｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）とで再生した。センサーチップ表面を再生した結果、ベースラインにおける顕著な変化は、観察されなかった。
【０１１０】
単一部位結合モデルを用いたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ ｓｏｆｔｗａｒｅ〔ファルマシアバイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）社製〕により、親和性速度論的パラメーターを決定した。図６に、固定化グリコサミノグリカンと、ケモカイン、Ｌ−セレクチン及びＣＤ４４それぞれとの相互作用を記録したＢＩＡｃｏｒｅのセンサーグラムを示し、該相互作用の速度論的パラメータ〔会合速度定数（ｋｏｎ）、解離速度定数（ｋｏｆｆ ）及び平衡解離定数（ｋｄ ）〕を、表３に示す。なお、図６及び表３中、ＳＬＣは、二次リンパ様組織ケモカインを、ＩＰ−１０は、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０を、ＳＤＦ−１βは、間質細胞由来因子−１βを示し、ＣＳ Ｅは、コンドロイチン硫酸Ｅを、ＣＳ Ａは、コンドロイチン硫酸Ａを示す。また、表３中、単量体ＣＤ４４とコンドロイチン硫酸Ｅとの間の相互作用のＫｄ 値は、平衡時の結合量から算出された値であり、ＣＤ４４とヒアルロン酸との間の相互作用のＫｄ 値は、ＣＤ４４−Ｉｇを用いて算出された値である。
【０１１１】
【表３】
図６に示されるように、二次リンパ様組織ケモカイン、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０、間質細胞由来因子−１β、単量体Ｌ−セレクチン及び単量体Ｐ−セレクチンは、センサーチップ表面に固定化されたコンドロイチン硫酸Ｅに、用量依存的に結合した。同様の親和性速度論が、コンドロイチン硫酸Ｅの代わりに、コンドロイチンポリ硫酸又はデルマタンポリ硫酸を用いた場合に観察された。対照的に、セレクチン及びケモカインは、コンドロイチン硫酸Ａ又はコンドロイチンと相互作用しなかった。これらの結果は、図２及び図５に示される前記阻害アッセイの結果と一致した。
【０１１３】
さらに、表３に示された親和性速度論的パラメータの評価により、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインが、ＧｌｃＡβ１／ＩｄｏＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）を含む過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖と高い親和性（Ｋｄ ２１．１〜２９３ｎＭ）で相互作用することが示された。対照的に、ＣＤ４４とグリコサミノグリカンとの相互作用は、セレクチンとグリコサミノグリカンとの相互作用及びケモカインとグリコサミノグリカンとの相互作用とはかなり異なることが示された。また、表３の結果より、単量体ＣＤ４４が、低い親和性（Ｋｄ ８５．２〜１２９μＭ）でコンドロイチン硫酸Ａ又はコンドロイチンと結合することが示された。単量体ＣＤ４４は、コンドロイチン硫酸Ｅに弱く（Ｋｄ ２１１μＭ）結合し、コンドロイチンポリ硫酸又はデルマタンポリ硫酸には結合しなかった。調べられたＣＳ／ＤＳ鎖は、いずれも、単量体Ｅ−セレクチン、Ｃ末端切形型二次リンパ様組織ケモカイン及び間質細胞由来因子−１αと、ほとんど相互作用せず、あったとしてもごくわずかしか相互作用しなかった。一方、表３に示されるように、過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖は、Ｌ−セレクチン又はＰ−セレクチンの場合と同様に、高い親和性で特定のケモカインと相互作用した。過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖とケモカイン（二次リンパ様組織ケモカイン、γ−インターフェロン誘導タンパク質−１０、間質細胞由来因子−１β）との高親和性結合により、これらのケモカインが、イン・ビボで過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖により、直ちにトラップされるであろうことが示唆される。この仮定は、過硫酸化ＣＳ／ＤＳ−ケモカイン複合体形成が、速い会合速度（０．８６４〜４．１５×１０４ Ｍ−１ｓ−１）により特徴付けられることを示した表面プラズモン共鳴解析による速度論解析により支持される。
【０１１４】
従来、単量体Ｌ−セレクチンは、低い親和性（Ｋｄ ＝１０８μＭ）で、非常に速い会合速度（≧１０５ Ｍ−１ｓ−１）及び解離速度（≧１０５ ｓ−１）で、固定化されたグリコシル化依存性細胞接着分子−１（ＧｌｙＣＡＭ−１）と結合することが報告されている ［ニコルソン（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ， Ｍ． Ｗ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３， ７６３−７７０ （１９９８）］。また、単量体Ｐ−セレクチンは、相対的に高い親和性（Ｋｄ 〜３００ｎＭ）で、速い会合速度（４．４×１０６ Ｍ−１ｓ−１）及び解離速度（１．４ｓ−１）で、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１と結合することが報告されている ［メータ（Ｍｅｈｔａ， Ｐ．） ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３， ３２５０６−３２５１３ （１９９８）］。これらの性質は、速い接着と脱接着とにより媒介されるセレクチン媒介ローリング接着動態に重要であると推定されている。
【０１１５】
しかしながら、驚くべきことに、図６及び表３に示されるように、表面プラズモン共鳴解析により、過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖と、Ｌ−セレクチン及びＰ−セレクチンのそれぞれとの結合親和性は、既知リガンドと、Ｌ−セレクチン及びＰ−セレクチンのそれぞれとの結合親和性よりも高いことが示された。したがって、適切なＣＳ／ＤＳ鎖が局所的に発現される場合、表３に示されるような遅い解離速度での、過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖と、Ｌ−セレクチン及びＰ−セレクチンのそれぞれとの高親和性結合が、異なるローリング速度での白血球のローリング相互作用及び／又は静的接着相互作用を可能にすると考えられる。
【０１１６】
実施例７
ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼによる消化により、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｅのそれぞれから各種オリゴ糖断片を調製し、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＣＤ４４及びケモカインのそれぞれと直接的に相互作用する構造単位を調べた。
【０１１７】
（１） コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｅのいずれか由来のストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ結合ビオチン化オリゴ糖断片の調製
イカ軟骨由来コンドロイチン硫酸Ｅ（１ｍｇ）を、０．６ｍｇ ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼ〔１，８００単位；シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕を含む溶液（組成：５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１３３ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０４％ ゼラチン，ｐＨ５．０）に懸濁した。得られた反応液を、３７℃で全６８．５時間インキュベートして、コンドロイチン硫酸Ｅ由来オリゴ糖断片を含む消化産物を得た。なお、インキュベーション開始から、２４時間経過時及び４５．５時間経過時に、追加の２ｍｇ（６，０００単位）の酵素を反応液に添加した。
【０１１８】
また、クジラ軟骨由来コンドロイチン硫酸Ａ及びサメ軟骨由来コンドロイチン硫酸Ｃのそれぞれを、０．６ｍｇ ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼ〔１，８００単位；シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕を含む溶液（組成：５０ｍＭ 酢酸ナトリウム，ｐＨ５．０）に懸濁した。得られた各反応液を、３７℃で２４時間インキュベートし、コンドロイチン硫酸Ａ由来オリゴ糖断片を含む消化産物及びコンドロイチン硫酸Ｃ由来オリゴ糖断片を含む消化産物のそれぞれを得た。
【０１１９】
得られた消化産物のそれぞれを、１６ｍＭ〜１Ｍ ＮａＨ２ ＰＯ４ のリニアグラジェントによるアミン結合シリカＰＡ−０３カラムを用いたＨＰＬＣにより分画した。得られた各画分を、蒸留水で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム〔１×３０ｃｍ；アマシャム−バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製〕に供した。２１０ｎｍにおける吸収により、溶出をモニターした。その結果、図７のパネルＡに示される画分ａと画分ｃと画分ｅ−１と画分ｅ−２とが得られた。
【０１２０】
（２）オリゴ糖断片の炭化水素構造の解析
画分ａ、画分ｃ、画分ｅ−１及び画分ｅ−２のそれぞれを、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ（０．３単位／ｍｌ）で３７℃１時間消化し、得られた消化産物を２−ＡＢで誘導体化した。ついで、得られた各産物について、１６〜６０６ｍＭ ＮａＨ２ ＰＯ４ ４５分間のリニアグラジェント溶出によるアミン結合シリカＰＡ−０３カラムを用いたＨＰＬＣで解析した。
【０１２１】
図７のパネルＢに示すように、コンドロイチナーゼＡＣＩＩで処理した画分ｅ−１について、Ｄｉ−ｄｉ（４，６）ＳとΔＤｉ−４Ｓとが、約１：１のモル比で検出された。これらのピークは、コンドロイチナーゼＡＣＩＩとコンドロ−６−スルファターゼとの混合物による処理後、それぞれ、Ｄｉ−４Ｓ及びΔＤｉ−４Ｓ位置にシフトし、コンドロイチナーゼＡＣＩＩとコンドロ−６−スルファターゼとコンドロ−４−スルファターゼとの混合物による処理後、さらに、それぞれ、Ｄｉ−０Ｓ及びΔＤｉ−０Ｓ位置にシフトした。したがって、これらの結果により、画分ｅ−１が、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−スルフェート）の構造に相当することが示唆され、かかる構造は、マススペクトルからも支持された。
【０１２２】
同様に、画分ａの構造は、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−スルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−スルフェート）に相当し、画分ｃの構造は、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−スルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−スルフェート）に相当し、画分ｅ−２の構造は、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）β１−４ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）に相当することが決定された。
【０１２３】
以上の結果を、図７のパネルＣに、オリゴ糖の構造の模式図として示す。図７のパネルＣ中、黒三角は、ＧｌｃＡ、斜線丸は、ＧａｌＮＡｃ、４Ｓは、４−Ｏ−硫酸化、６Ｓは、６−Ｏ−硫酸化、β３は、β１−３結合、β４は、β１−４結合を表わす。
【０１２４】
（３）オリゴ糖断片と、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＣＤ４４及びケモカインのそれぞれとの相互作用の解析
画分ａ、画分ｃ、画分ｅ−１及び画分ｅ−２のそれぞれに含まれるオリゴ糖と、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＣＤ４４及びケモカインのそれぞれとの相互作用を調べた。
【０１２５】
まず、ビオチン−ＬＣ−ヒドラジドにより、各オリゴ糖を還元末端においてビオチン化した。前記（２）で得られた画分ａ、画分ｃ、画分ｅ−１及び画分ｅ−２のそれぞれに、１２５ｍＭ ＥＺ−ｌｉｎｋＴＭビオチン−ＬＣ−ヒドラジドとジメチルスルホキシド／酢酸（７：３）中１Ｍ ＮａＣＮＢＨ３ とを添加した。得られた反応混合物を、３時間６５℃でインキュベートし、ついで、３７℃で１２．５〜１８．５時間インキュベートすることにより、オリゴ糖をビオチン化した。得られた各反応産物を、前記のようにセファデックスＧ−２５カラムに供して、未反応のビオチン−ＬＣ−ヒドラジドを除去し、ビオチン化オリゴ糖を含む画分を回収した。ついで、得られた画分を、蒸発乾固した。
【０１２６】
得られたビオチン化オリゴ糖画分の一部を、コンドロイチナーゼＡＣＩＩで消化し、ついで、得られた消化産物を２−ＡＢ誘導体化した。得られた産物を、ＨＰＬＣにより解析した結果、還元末端由来不飽和二糖でなく、非還元末端由来二糖が検出された。したがって、約１００％のオリゴ糖がビオチン化されたことが明らかとなった。
【０１２７】
ついで、１６ｐｍｏｌの各ビオチン化オリゴ糖を含む画分の一部を、前記緩衝液Ａ ０．５ｍｌに溶解し、得られた各溶液と１μｌ（２ｐｍｏｌ）のストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕とを、４℃で一晩インキュベートした。
【０１２８】
得られた各産物を緩衝液Ａで３倍に希釈し、得られた各溶液を、ＢＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）、Ｌ−セレクチン−Ｉｇ（５μｇ／ｍｌ）、Ｅ−セレクチン−Ｉｇ（５μｇ／ｍｌ）、Ｐ−セレクチン−Ｉｇ（５μｇ／ｍｌ）、ＣＤ４４−Ｉｇ（５μｇ／ｍｌ）、二次リンパ様組織ケモカイン（５μｇ／ｍｌ）、Ｃ末端切形型二次リンパ様組織ケモカイン（５μｇ／ｍｌ）、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０（１０μｇ／ｍｌ）、血小板因子４（２．５μｇ／ｍｌ）、間質細胞由来因子−１β（５μｇ／ｍｌ）又は間質細胞由来因子−１α（５μｇ／ｍｌ）でコートされた９６ウェル平底マイクロタイタープレート（コスターＥＩＡ／ＲＩＡプレートナンバー３６９０）のウェルに供した。Ｂｌｕｅ ＰｈｏｓＴＭ基質を用い、６２０ｎｍにおける吸収を測定することにより、結合を測定した。結果を図７のパネルＤに示す。なお、図７のパネルＤ中、横軸の表記は、前記図４と同様である。また、各レーン中、バー１は、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果、バー２は、ビオチン化画分ａ結合ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果、バー３は、ビオチン化画分ｃ結合ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果、バー４は、ビオチン化画分ｅ−１結合ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果、バー５は、ビオチン化画分ｅ−２結合ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果を示す。
【０１２９】
図７のパネルＤに示すように、興味深いことに、ｅ−２画分のみがＬ−セレクチン−Ｉｇ、Ｐ−セレクチン−Ｉｇ、二次リンパ様組織ケモカイン、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０及び間質細胞由来因子−１βと結合したが、他は結合しなかった。ｅ−１画分は、血小板因子４と穏やかに結合したが、他のケモカイン又はＬ−及びＰ−セレクチンとは結合しなかった。これらの結果により、繰り返しＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）単位は、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及び調べられた多数のケモカインにより特異的に認識され、単独のＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）は、恐らく血小板因子４との相互作用に十分であろうことが示された。
【０１３０】
図７に示されるように、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれが、繰り返しＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）単位から構成された四糖と優先的に結合し、また、前記表３に示されるように、ＣＤ４４が、非硫酸化コンドロイチン硫酸鎖又は低硫酸化コンドロイチン硫酸鎖と優先的に相互作用するため、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４，６−Ｏ−ジスルフェート）単位がグリコサミノグリカン中にクラスターとして存在する場合、恐らく、これらの単位が、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれと相互作用すると思われる。また、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４−Ｏ−スルフェート）又はＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６−Ｏ−スルフェート）を含む異なる構造が、ＣＤ４４と相互作用すると思われる。
【０１３１】
実施例８
過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖がケモカイン活性をも阻害するかどうかを調べた。Ｌ１．２／ＣＣＲ７細胞（１×１０６ 細胞／ｍｌ）を、Ｆｕｒａ−２で負荷し、グリコサミノグリカン（１００μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下に、二次リンパ様組織ケモカイン（図８中、「ＳＬＣ」）又はＣ末端切形型二次リンパ様組織ケモカイン（図８中、「ＳＬＣ−Ｔ」）で刺激した。既報 ［ヒロセ（Ｈｉｒｏｓｅ， Ｊ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ５２２８−５２３４ （２００１）］のように、蛍光率を測定することにより、細胞内カルシウム濃度をモニターした。前記グリコサミノグリカンとして、コンドロイチン硫酸Ｅ（図８中、「ＣＳ Ｅ」）及びコンドロイチン硫酸Ａ（図８中、「ＣＳ Ａ」）を用いた。結果を図８に示す。なお、図８中、矢頭は、刺激を与えた時点を示す。
【０１３２】
図８に示されるように、二次リンパ様組織ケモカイン単独、又はコンドロイチン硫酸Ａと共にプレインキュベートされた二次リンパ様組織ケモカインは、該二次リンパ様組織ケモカインのレセプターであるＣＣＲ７をトランスフェクトされたＬ１．２細胞における顕著なＣａ２＋動員を誘導したが、コンドロイチン硫酸Ｅと共にプレインキュベートされた二次リンパ様組織ケモカインは、Ｃａ２＋動員を誘導しなかった。同様に、コンドロイチンポリ硫酸又はデルマタンポリ硫酸と共にプレインキュベートされた二次リンパ様組織ケモカインは、Ｃａ２＋動員を誘導しなかった。一方、Ｃ末端切形型二次リンパ様組織ケモカインにより誘導されたＣａ２＋動員は、これらの過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖のいずれによっても影響されなかった。これらの結果により、過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖が、二次リンパ様組織ケモカインのＣ末端領域と相互作用することにより、二次リンパ様組織ケモカインの生理活性を阻害することが示唆された。
【０１３３】
また、図８に示されるように、これらのグリコサミノグリカンがケモカイン活性を阻害するため、過硫酸化ＣＳ／ＤＳ結合型のケモカインが、ケモカインレセプターのアゴニストとして機能せず、むしろ、過硫酸化ＣＳ／ＤＳ−ケモカイン複合体が、イン・ビボでのケモカインのリザーバーとして機能するであろうと考えられる。ケモカインと過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖との相互作用において観察される遅い解離速度（２．７８×１０−４〜５．３０×１０−３ｓ−１）は、この考えを支持する。
【０１３４】
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、ＣＤ４４遺伝子増幅用プライマーの配列を示す。
【０１３５】
配列番号：２は、ＣＤ４４遺伝子増幅用プライマーの配列を示す。
【０１３６】
【発明の効果】
本発明の糖化合物は、その製造の際、簡便に製造することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の糖化合物によれば、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれとそのリガンドとの結合を調節することができ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれに介される生物学的事象を調節することができ、該生物学的事象が発症に関連する疾患の症状を改善することができ、該疾患の治療又は予防剤のためのリード化合物を提供することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の治療又は予防剤によれば、炎症性疾患、アレルギー性疾患、癌転移、心筋障害、多臓器不全等の疾患の症状を改善し、生体において高い親和性を呈するという優れた性質を発現するため、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれにより介される生物学的事象が発症に関連する疾患の症状を改善することができるという優れた効果を奏する。
【０１３７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、バーシカン中のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸鎖と、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びＣＤ４４のそれぞれとの相互作用における硫酸化の影響について、免疫沈降で調べた結果を示す図である。
【図２】図２は、バーシカンと、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びＣＤ４４のそれぞれとの結合における過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖の影響について、酵素結合免疫吸着定量法で調べた結果を示す図である。図２中、十字は、ケラタン硫酸、白三角は、コンドロイチン、白四角は、コンドロイチン硫酸Ａ、白丸は、コンドロイチンポリ硫酸、黒三角は、デルマタン、黒四角は、デルマタン硫酸、黒丸−実線は、デルマタンポリ硫酸、黒丸−点線は、コンドロイチン硫酸Ｅを示す。また、図２中、パネルＡは、バーシカンとＬ−セレクチンとの結合に関する結果である、パネルＢは、バーシカンとＰ−セレクチンとの結合に関する結果である、パネルＣは、バーシカンとＣＤ４４との結合に関する結果である。
【図３】図３は、バーシカン由来グリコサミノグリカンの二糖組成を示す図である。パネルＡは、コンドロイチナーゼＡＢＣにより処理し、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）で誘導体化されたバーシカン由来グリコサミノグリカンの二糖組成解析の結果を示し、パネルＢは、コンドロ−６−スルファターゼとコンドロイチナーゼＡＢＣとにより処理し、２−ＡＢで誘導体化されたバーシカン由来グリコサミノグリカンの二糖組成解析の結果を示す。また、図３中、０Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−０Ｓ、４Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−４Ｓ、６Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−６Ｓ、ｄｉＳＤ は、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ｄｉ（２，６）Ｓ、ｄｉＳＥ は、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ｄｉ（４，６）Ｓ、ＵＡ２Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ＵＡ２Ｓの溶出位置を示す。
【図４】図４は、バーシカンとケモカインとの相互作用における硫酸化の影響を調べた結果を示す図である。パネルＡは、２−アミノベンズアミドで誘導体化した産物の二糖組成を示し、０Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−０Ｓ、４Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−４Ｓ、６Ｓは、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−６Ｓ、ｄｉＳＤ は、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ｄｉ（２，６）Ｓ、ｄｉＳＥ は、２−ＡＢ−誘導体化ΔＤｉ−ｄｉ（４，６）Ｓの溶出位置を示す。パネルＢは、バーシカンとケモカインとの相互作用における硫酸化の影響について、酵素結合免疫吸着定量法で調べた結果を示し、ＢＳＡは、ウシ血清アルブミン、２Ｂ１は、抗バーシカンモノクローナル抗体２Ｂ１、Ｌ−Ｉｇは、Ｌ−セレクチン−Ｉｇ、Ｅ−Ｉｇは、Ｅ−セレクチン−Ｉｇ、Ｐ−Ｉｇは、Ｐ−セレクチン−Ｉｇ、ＳＬＣは、二次リンパ様組織ケモカイン、ＳＬＣ−Ｔは、Ｃ末端切形型二次リンパ様組織ケモカイン、ＩＰ−１０は、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０、ＰＦ４は、血小板因子４、ＳＤＦ−１βは、間質細胞由来因子−１β、ＳＤＦ−１αは、間質細胞由来因子−１αを示す。パネルＢにおける各バーは、４連の測定の平均±標準偏差を示し、黒バーは、非処理馴化培地由来バーシカン、斜線バーは、塩素酸ナトリウム処理馴化培地についての結果である。各バーは、４連の測定の平均±標準偏差を示す。
【図５】図５は、バーシカンとケモカインとの結合における過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖の影響について、酵素結合免疫吸着定量法で調べた結果を示す図である。横軸の表記は、図４と同様である。また、各レーン中、バー１は、グリコサミノグリカン非存在下における結果、バー２は、コンドロイチン、バー３は、コンドロイチン硫酸Ａ、バー４は、コンドロイチンポリ硫酸、バー５は、デルマタンポリ硫酸、バー６は、コンドロイチン硫酸Ｅを示す。各バーは、３連の測定の平均±標準偏差を示す。
【図６】図６は、固定化グリコサミノグリカンと、ケモカイン、Ｌ−セレクチン及びＣＤ４４それぞれとの相互作用を記録したＢＩＡｃｏｒｅのセンサーグラムを示す。図６中、ＳＬＣは、二次リンパ様組織ケモカインを、ＩＰ−１０は、γ−インターフェロン誘導性タンパク質−１０を、ＳＤＦ−１βは、間質細胞由来因子−１βを示し、ＣＳ Ｅは、コンドロイチン硫酸Ｅを、ＣＳ Ａは、コンドロイチン硫酸Ａを示す。図６中、共鳴単位での応答を時間の関数として記録した。
【図７】図７は、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれと相互作用する断片の構造を同定した結果を示す図である。パネルＡは、コンドロイチン硫酸Ａ（図中、ＣＳ Ａ）、コンドロイチン硫酸Ｃ（図中、ＣＳ Ｃ）及びコンドロイチン硫酸Ｅ（図中、ＣＳ Ｅ）のそれぞれのヒアルロニダーゼ消化産物のＨＰＬＣによるクロマトグラムを示す。パネルＢは、画分ａ、画分ｃ、画分ｅ−１及び画分ｅ−２のそれぞれの二糖組成を示す。パネルＣは、画分ａ、画分ｃ、画分ｅ−１及び画分ｅ−２のそれぞれの構造の模式図であり、黒三角は、ＧｌｃＡ、斜線丸は、ＧａｌＮＡｃ、４Ｓは、４−Ｏ−硫酸化、６Ｓは、６−Ｏ−硫酸化、β３は、β１−３結合、β４は、β１−４結合を表わす。パネルＤは、画分ａ、画分ｃ、画分ｅ−１及び画分ｅ−２のそれぞれに含まれるオリゴ糖と、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＣＤ４４及びケモカインのそれぞれとの相互作用を調べた結果を示し、横軸の表記は、前記図４と同様である。また、各レーン中、バー１は、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果、バー２は、ビオチン化画分ａ結合ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果、バー３は、ビオチン化画分ｃ結合ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果、バー４は、ビオチン化画分ｅ−１結合ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果、バー５は、ビオチン化画分ｅ−２結合ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いた場合の結果を示す。各バーは、４連の測定の平均±標準偏差を示す。
【図８】図８は、ケモカイン活性に対する過硫酸化ＣＳ／ＤＳ鎖の影響を調べた結果を示す図である。図８中、ＳＬＣは、二次リンパ様組織ケモカイン、ＳＬＣ−Ｔは、Ｃ末端切形型二次リンパ様組織ケモカイン、ＣＳ Ｅは、コンドロイチン硫酸Ｅ、ＣＳ Ａは、コンドロイチン硫酸Ａを示す。また、図８中、矢頭は、刺激を与えた時点を示す。
Claims (3)
- 一般式（Ｉ）：
又は
一般式（ＩＩ）：
で表わされる糖化合物。 - 一般式（ＩＩＩ） ：
又は
一般式（ＩＶ）：
で表わされる糖化合物。 - 請求項１又は２記載の糖化合物を有効成分として含有してなる、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインのそれぞれにより介される生物学的事象が発症に関連する疾患の治療又は予防剤。
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