CZ341097A3 - Sulfatované oligosacharidy, způsob jejich výroby a použití - Google Patents

Description

Vynález se týká sulfatovaných oligosacharidů, jejich přípravy a použití jako antiangiogenních,

Ή antimetastatických a protizánětlivých činidel.

Dosavadní stav techniky

Sulfáty heparanu patří k rodině glykosaminoglykaminů polysacharidů. Jsou přítomny ve většině vícebuněčných organismů a mají všudypřítomné rozšíření, přičemž jsou exprimovány na povrchu buněk a v extracelulárních matricích (ECMj většiny tkání (Dietrich, C. P., Ňader, Η. B. , Straus, A. J. (1983), Biochem. Biophys. Res. Comm. 111, 865 - 871; Kjellen, L., Lindahl, U. (1991), Annu. Rev. Biochem. 60, 443 - 475). Sulfáty heparanu obvykle existují jako proteoglykany a bylo dosaženo značného pokroku v sekvenční analýze a klonování základních polypeptidů této molekuly. Dosud bylo například identifikováno na buněčném povrchu alespoň osm různých základních polypeptidů proteoglykanů heparanových sulfátů (HSPG)(David, G. (1993), FASEB J. 7, —— 1023-1030)......—Původně se předpokládalo, že HSPG hrají převážně strukturní úlohu na buněčném povrchu a v ECM. Avšak řetězce sulfátů heparanu vykazují značnou strukturální různorodost (Kjellen, L., Lindahl, U. (1991), Annu. Rev. Biochem. 60, 443 - 475; Esko, J. D. (1991), Curr. Opin. Cell Biol. 3, '·> 805 - 816) , která naznačuje, že mohou poskytovat důležitou signální informaci pro mnoho biologických procesů. Tudíž, ačkoliv jsou řetězce sulfátu heparanu zpočátku syntetizovány jako střídající se opakování glukuronosylových a N-acetylglukosaminylových zbytků spojených vazbami β l->4 a a l->4, existuje mnoho následných modifikací. Polysacharid je N-deacetylován a Nsulfatován a následně podstupuje C5 epimerizaci na .... glukuronosylové jednotce na iduronosylovou jednotku, a dále různé O-sulfatace uronosylového a glukosaminylového zbytku. Variabilita těchto modifikací dovoluje třiceti rozdílným disacharidovým sekvencím při uspřádání v různém pořadí během řetězce sulfátu heparanu, teoreticky poskytnout velké množství rozdílných struktur sulfátu heparanu. Z tohoto hlediska představuje antikoagulační polysacharid heparin, přítomný pouze v granulích žírných buněk, extremní formu sulfátu heparanu, kde byla maximalizována epimerizace a sulfatace. Většina sulfátů heparanu obsahuje krátké úseky vysoce sulfatovaných zbytků spojené relativně dlouhými úseky nesulfatovaných jednotek.

Nyní je jasně prokázáno, že sulfáty heparanu hrají zásadní roli v širokém spektru biologických procesů (Kjellen, L., Lindahl, U. (1991), Annu. Rev. Biochem. 60, 443 - 475; David, G. (1993), FASEB J. 7, 1023 - 1030; Esko,

J. D. (1991) , Curr. Opin. Cell Biol. 3, 805 - 816) . Zvláště pak mohou působit jako ligandy pro adhezi molekul zapojených do interakcí buňka - buňka (Cole, G. J., Akeson, R. (1989) Neuron 2, 1157 - 1165; Coombe, D. R., Watt, S. M. a Parish C. R. Blood 84, 739 - 752), zúčastňovat se v interakcích buňka - ECM (Cole, G. J., Akeson, R. (1989) Neuron 2, 1157 - 1165; Coombe, D. R., Watt, S. M. a Parish C. R. Blood 84, 739 - 752) a působit jako nezbytné receptory buněčného povrchu pro růstové faktory jako je zásaditý fibroblastový růstový faktor (basic fibroblast growth factor - bFGF) (Yayon, A., Klagsbrun, M., Esko, J.

D., Leder, P. a Ornitz, D. M. (1991) . Cell 64, 841· - 848; Rapraeger, A. C., Krufka, A. a Olwin, B. B. (1991). Science 252, 1705 - 1708) a vaskulární- endotheliální^růstový^faktor_: —(vasculnr: ěndoth.el-ia-1 growth- -f actor VEG-Ek-- (Gitay-Goren,

H., Soker, S., Vlodavsky, I. a Neufeld, G. (1992), J. Biol.

Chem. 26/, if hlavní bariéru buněčné migrace (Yurchenco, r. D. a Schittny, J. C.

i 1 QQn\ i J. W !

4, 1577 - 1590). Bariéry bazálni membrány mohou být porušeny pouze v případě, že buňka nasadí řadu degradativních enzymů (Stetler, S. W., Aznavoorian, S. a Liotta, L. A. (1993) Annu. Rev. Cell Biol. 9, 541 - 573), které zahrnují endoglykosidázu, nazývanou heparanáza, která štěpí řetězce sulfátů heparanu (Eldor., A., Bar-Ner, N., Fuks, Z. a Vlodavsky, I. (1987). Semin. Thromb. Hemost. 13, 475 - 488; Nakajima, M., Irimura, T. a Nicolson, G.L.

(1988) J. Cell Biochem. 36, 157 - 167).

Bylo zjištěno, že mnoho biologických procesů,.kterých se účastní sulfáty heparanu, zahrnuje rozpoznání unikátní struktury sulfátu heparanu, přičemž pozice sulfátu v polysacharidovém řetězci má zásadní důležitost (David, G. (1993), FASEB J. 7, 1023 - 1030). Bylo například dokázáno, že definované sekvence sulfátu heparanu jsou rozpoznávány kyselým a zásaditým-FGF- (Turnbull, - J. E., Fernig, D. G., Ke, Y., Wilkinson, M. C. a Gallagher, J. T. (1992) J. Biol. Chem. 267, 10337 - 10341; Mach, H., Volkin, D., Burke, C.

J., Middaugh, C. R., Linhardt, R. J., Fromm, J. R a Loganathan, D. (1993), Biochemistry 32, 5480 - 5489; Nurcombe, V., Ford, M. D., Windschut, J. A. a Bartlett, P. F. (1993), Science 260, 103 - 106) a štěpeny heparanázami.

Na základě tohoto zjištění se původci tohoto vynálezu zaměřili na syntézu sulfatovaných oligosacharidů, které blokují rozpoznání sulfátu heparanu růstovými faktory, a inhibují štěpení sulfátu heparanu heparanázami. V případě blokování růstových faktorů bylo uvažováno, že by mohly být zvláště účinné nízkomolekulární látky podobné sulfátu heparanu, neboť se nyní soudí, že sulfáty heparanu na povrchu buněk zprostředkovávají příčné vazby růstových faktorů vázaných na své receptory (Spivak-Kroizman, T., Lemmon, M. a., Dikic, I., Ladbury, J. E., Pinchasi, D., Huang, J., Jaye, M., Crumley, G., Schlessinger, J. a Lax, I., Cell 79, 1015 - 1024). Navíc sulfatované oligosacharidy by mohly být účinnými inhibitory heparanázy, jelikož působí jako nerozštěpitelné substráty tohoto enzymu.

Sulfatované oligosacharidy s inhibiční aktivitou pro růstové faktory mají množství klinických použití. Růstové faktory vázající sulfáty heparinu/heparanu, jako jsou bFGF a VEGF, jsou silná činidla vyvolávající angiogenézi (Folkman, J. a Brém, H. (1992) Angiogenesis and inflamation „Inflamation. Basic Principles and Clinical Correlates.

Eds Gallin, J.I., Goldstein, I. M a Sndrerman, R. S., Raven Press, New York). U dospělých je angiogenéze relativně řídce se vyskytující jev s výjimkou hojení ran. Existuje však řada angiogenně dependantních chorob dospělých, kde má angiogenéze zásadní důležitost (Folkman, J. a Brém, H. (1992) Angiogenesis and inflamation. „Inflamation. Basic Principles and Clinical Correlates. Eds Gallin, J.I., Goldstein, I. M a Sndrerman, R. S., Raven Press, New York; Folkman, J.(1991) Tumor angiogenesis, „Cancer Medicine, Ed Holland, J. F., Lea & Febinger, Philadelphia; Folkman, J. a Klagsbrun, M. (1987) Science 235, 442 - 447).

Nej důležitější z nich je angiogenéze spojená s růstem pevných tumorů, proliferacní retinopathii a revmatickou arthritidou. Sulfatované oligosacharidy, které blokuji působeni klíčových angiogenních růstových faktorů, jako jsou bFGF a VEGF, mohou být využitelné zejména při léčení chorob závisejícich na angiogenézi (angiogenně ₌ . .

dependantni.cn cnoroo).=— ...... . ________... ., „

Obdobně mají množství klinických použití sulfatované oligosacharidy, které inhibuji působení.heparanázy. Subendotheliální bazálni membrána představuje hlavní fyzikální bariéru pro průchod endotheliálnich buněk, tumorových buněk a leukocytů přes cévní stěnu. Heparanázový enzym v kombinaci s řadou proteolytických enzymů (například plasmin, matricové mataloproteinázy) hraje hlavní roli při degradaci bazálni membrány u napadených buněk (Stetler, S. W., Aznavoorian, S. a Liotta, L. A. (1993) Annu. Rev. Cell Biol. 9, 541 - 573; Eldor., A., Bar-Ner, N., Fuks, Z. a Vlodavsky, I. (1987). Semin. Thromb. Hemost. 13, 475 - 488;

Nakajima, M., Irimura, T. a Nicolson, G.L. (1988) J. Cell Biochem. 36, 157 - 167; Ratner, S. (1992) Invasion Métastasis 12, 82 - 100). Proto prevencí degradace bazálnimembrány by mohly sulfatované oligosacharidy s inhibiční aktivitou pro heparanázu vykazovat antimetastatickou a protizánětlivou aktivitu, navíc mohou inhibóvat počáteční stádia angiogenéze. Použití sulfatovaných oligosacharidů, které současně inhibuji činnost angiogenních růstových faktorů a heparanázového' enzymu by mohlo být’ výhodné u mnoha klinických situací, například při léčbě vysoce metastázujícich pevných tumorů a revmatické arthritidy.

Mezinárodní patentová přihláška PCT/AU88/00017 (zveřejněna pod číslem WO 88/05301), která tvoří stav techniky, popisuje použití sulfatovaných polysacharidů jako je heparin, modifikovaný heparin, fucoidin, pentosansulfát, dextransulfát a karagenin lambda, které blokuji nebo inhibuji aktivitu heparanázy při antimetastatickém a/nebo protizánětlivém ošetřeni pacientů, a to jak zvířat, tak i lidí.

Při práci vedoucí k tomuto vynálezu původci připravili sulfatované oligosacharidyza použití buď přirozeně se vyskytujících oligosacharidů nebo zcela syntetických oligosacharidů, které zahrnovaly homopolymery obsahující hexózu. U některých z těchto sloučenin bylo zjištěno, že jsou.silnými inhibitory angiogenéze, metastáze tumoru a zánětů u lidí. Získané údaje odpovídají sulfatovaným oligosacharidům vykazujícím své biologické účinky inhibicí činnosti angiogenních růstových faktorů a/nebo funkce heparanázy, a určité získané sulfatované oligosacharidy jsou silnými inhibitory jak angiogenéze, tak heparanázové aktivity.

Podstata vynálezu

Podle jednoho aspektu se vynález týká sulfatovaných oligosacharidů, přičemž oligosacharidy mají obecný vzorec I:

Ri-(Rx)n-R₂ (I) \ kde Ri a R₂ a každé R_x představují monosacharidovou jednotku, přičemž všechny mohou být stejné nebo odlišné, sousední monosacharidové jednotky jsou spojeny glykosidickými vazbami l->2, l->3, l->4 a/nebo l-»6 a n je celé číslo od 1 do 6.

Sulfatované oligosacharidy podle tohoto vynálezu jsou založeny na polymerech monosacharidových jednotek, které mohou být spojeny glykosidickými vazbami l->2, l->3, 1—>4 a/nebo 1—>6 a které sestávají z 3 až 8 monosacharidových jednotek. Výhodně sestávají oligosacharidy z 3 až 6 monosacharidových jednotek (n je tedy od 1 do 4), zvláště výhodně- z- 5 až 6 monosacharidových jednotek (n je od 3 do 4)⁼. Polymery'mohou obsahovat homopolymery-obsahující pouze jeden typ monosacharidové jednotky nebo heterópolyméřy obsahuj ici dva nsoo vics jruznyoii uypu irionosacriaxluovycii jcuIíGLca. Monosacharidové jednotky, které jsou navzájem spojeny za tvorby oligosacharidů, jsou výhodně hexózy, a mohou být buď furanózy, jako je fruktóza, nebo pyranózy, jako je glukóza, mannóza, altróza, allóza, talóza, galaktóza, idóza nebo gulóza. Hexózy mohou být buď v konfiguraci D- nebo v konfiguraci L-.

V jednom provedení vynálezu jsou předkládány nové syntetické oligosacharidy mající obecný vzorec II:

R_y-(R_y)_n-R_y (II) kde všechny skupiny R_y jsou stejné a každá představuje monosacharidovou jednotku, přičemž sousední monosacharidové jednotky jsou spojeny glykosidickými vazbami 1—>3, l->4‘ a/nebo 1-46 a n je celé číslo od 1 do 6.

V tomto zvláštním provedeni vynález poskytuje také sulfatované oligosacharidy, přičemž oligosacharid má výše uvedený vzorec II.

Ve výhodném provedení je monosacharidovou jednotkou v homopolymerovém oligosacharidů vzorce II hexóza, jako je glukóza, mannóza, altróza, allóza, talóza, galaktóza, idóza nebo gulóza. Výhodně je také v tomto oligosacharidu n od 1 do 4, zvláště výhodně od 3 do 4.

Oligosacharidy obecného vzorce I a II také zahrnuji sloučeniny, kde monosacharidové jednotky jsou derivatizovány, zvláště ty, kde jednotky jsou fosfátové, acetátové nebo jiné esterové deriváty monosacharidů.

Sulfatované oligosacharidy podle tohoto vynálezu mohou být obecně připraveny sulfataci oligosacharidů metodami známými per se ve stavu techniky za vzniku odpovídájících O-sulfatovaných derivátů. Příklady vhodných metod sulfatace jsou uvedeny níže. Oligosacharidy k sulfataci mohou být přirozeně se vyskytující produkty včetně přirozeně se vyskytujících oligosacharidů jako takových (například rafinóza nebo stachyóza), stejně jako oligosacharidy připravené enzymatickou nebo chemickou degradací přirozeně se vyskytujících polysacharidů (například maltotetraóza, maltopentaóza a maltohexaóza; glukotrióza, glukotetraóza a glukopentaóza; tetra-, hexa- a oktasacharidy chondroitinu a fosfát mannopentaózy z kvasinky Pichia holstii).

Jak bylo popsáno výše, bylo dokázáno, že sulfatované oligosacharidy patřící do rozsahu tohoto vynálezu, vykazují inhibiční aktivitu pro heparanázu a/nebo inhibiční aktivitu pro růstový faktor a další aspekt vynálezu spočívá v použití výše popsaného sulfatovaného oligosacharidu jako antiangiogenního, antimetastatického a/nebo protizánětlivého činidla při léčbě teplokrevných živočichů (včetně lidí).

Vynález se tak týká i metody antiangiogenního, antimetastatického a protizánětlivého ošetření lidí nebo jiných teplokrevných živočichů, kteří vyžadují takové ošetření, které zahrnuje podávání účinného množství alespoň jednoho výše popsaného sulfatovaného oligosacharidu pacientovi.

Aktivní sloučenina je podávána v terapeuticky účinných množstvích. Terapeuticky účinné množství znamená množství nezbytné pro alespoňčástečné dosaženipožadovaného-účinku nebo pro pozdržení náběhu, obojího, náběhu nebo postupu určitého stavu, který je léčen. Takovéto množství bude záviset samozřejmě,na konkrétních léčených stavech, jejich úpornosti a individuálních parametrech pacienta, které zahrnují věk, fyzickou kondici, konstituci, hmotnost a souběžnou léčbu.

Tyto faktory jsou dobře známé odborníkovi v oboru a k jejich určení stačí pouze rutinní vyšetření. Obecně je výhodné, aby byla použita maximální dávka, to je nejvyšší bezpečná dávka podle zdravého úsudku lékaře. Odborník v oboru však ví, že mohou být z medicinálních důvodů, psychologických nebo jiných myslitelných důvodů ordinovány nižší nebo tolerovatelné dávky.

Vynález se také týká použití alespoň jednoho výše popsaného oligosacharidu pro výrobu farmaceutického prostředku pro antiangiogenní.,. antimetastatické a/nebo protizánětlivé léčení lidí nebo jiných teplokrevných živočichů.

Navíc tento vynález poskytuje farmaceutickou nebo veterinární kompozici pro antiangiogenní, antimetastatické a/nebo protizánětlivé ošetření, která obsahuje alespoň jeden výše popsaný sulfatovaný oligosacharid společně s jeho farmaceuticky nebo veterinárně přijatelným nosičem nebo rozpouštědlem.

Formulace takové terapeutické kompozice je dobře známa odborníkovi v oboru. Vhodné farmaceutické nebo veterinárně přijatelné nosiče a/nebo rozpouštědla zahrnuji jakákoli a všechna konvenčni rozpouštědla, dispergačni média, plnidla, pevné nosiče, vodné roztoky, povlékaci, antibakteriální a antifungálni činidla, isotonická a absorpci zpomalující činidla a podobně. Použití těchto médií a činidel pro farmaceuticky a veterinárně aktivní látky je dobře známé v oboru a je popsáno například v Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA. S výjimkou případu, kdy použiti nějakého obvyklého média nebo činidla není slučitelné s aktivní látkou, je předpokládáno jejich použiti ve farmaceutických a veterinárních kompozicích podle vynálezu. Do kompozice mohou být také zahrnuty doplňkové aktivní látky.

Zvláště výhodné je formulovat kompozici ve formě dávkových jednotek pro usnadnění podávání a pro jednotnost dávek. Pojem dávková jednotková forma je zde použit k označení určitých fyzikálních jednotek vhodných pro jednotné dávkování pro léčené lidské a zvířecí subjekty; každá jednotka obsahuje předem stanovené množství aktivní látky vypočtené tak, aby poskytovalo požadovaný terapeutický účinek ve spojení s požadovaným farmaceutickým nebo veterinárním nosičem a/nébo rozpouštědlem. Specifikace pro nové jednotkové dávkové formy podle vynálezu je diktována a přímo závislá na (a) jedinečných vlastnostech aktivní látky a konkrétních terapeutických účincích, kterých má být dosaženo, a (b) omezeních daných stavem techniky v sestavování takovýchto aktivních látek pro konkrétní ošetření.

Sulfatovaných oligosacharidů podle vynálezu může být užito při ošetření chorob závislých na angiogenézi včetně angiogenéze spojené s růstem pevných tumorů, proliferativní retinopathií a revmatickou arthritidou, stejně jako při ošetřeni zánětlivých onemocněni a stavů, kdy inhibični aktivita sulfatovaných oligosacharidů pro heparanázu může být zvláště užitečná při inhibici infiltrace leukocytů, včetně chronických zánětlivých onemocněni, kde je jako jsou revmatická arthritida, zánětlivá onemocněni střev, jako vředovitá colitida a C-h.ronova choroba, allografická rejekce a

V tomto popisu, pokud z kontextu nevyplývá jinak, slovo obsahuje nebo zahrnuje a jeho variace jako je zahrnujici, obsahujici je třeba chápat tak, že v sobě zahrnuje deklarovaný celek nebo skupinu celků, ale nevylučuje jakýkoli jiný celek nebo skupinu celků.

Detailní popis vynálezu

Jak bylo obecně popsáno výše, vynález se týká sulfatovaných oligosacharidů a jejich použití jako antiangiogenních, antimetastatických a/nebo protizánětlivých-činidel.. ...

Některé oligosacharidy mohou být získány pro následnou sulfataci z přírodních zdrojů, avšak je vysoce žádoucí najít jednoduchou metodu syntézy oligosacharidů o definované délce řetězce a stereochemii.-Vynález poskytuje zlepšenou metodu syntézy a izolace oligomerů hexózových cukrů z jednoduchých výchozích materiálů o dobré výtěžnosti, přičemž cukerné monomery těchto oligomerů jsou spojeny vazbou 1—>3, l->4 a/nebo 1—>6. Tato metoda výroby oligomerů hexózových cukrů ostře kontrastuje se způsoby, kterými se tyto oligomery cukrů vyráběly doposud, a to tím, že se dosahuje dobrých výtěžků, stupeň oligomerizace se snadno řídí a produkty odvozené touto metodou jsou homologní lineární oligomery, které lze snadno izolovat a čistit za použití jednoduchých chromatografických technik.

Ve vědecké a patentové literatuře lze nalézt mnoho příkladů popisuj ících metody -přípravy polymerů a oligomerů cukrů. Například v obecně používaném způsobu může být nemodifikovaný cukerný monomer, buď samotný nebo v přítomnosti rozpouštědla, zahříván v přítomnosti katalyzátoru za vzniku rozvětvených a lineárních polymerních produktů s různými a někdy nestandardně definovanými chemickými vazbami (Mora, P. T. a Wood, D., J. Amer. Chem. Soc. 80, 693; 0'Colla, P. s. a Lee E. E., (1964) . Chem. Soc. 2351 - 2354). Jiná metoda, kde cukr je taven v přítomnosti katexových pryskyřic (Evans W. L., Reynolds, D. D. a Talley, E. A., (1951) Adv. Carbohyd.

Chem. 6, 27) také dává vysokomolekulární vysoce rozvětvené polymery. V těchto dvou případech jsou polymery tvořeny za ztráty jedné molekuly vody na každou tvořenou polymerní vazbu. Jiným příkladem známé metody je postupná polymerace zahrnující využití Koenigs-Knorrovy reakce, kde cukr obsahující nehydroxylové skupiny (jako je atom bromu nebo chloru) v pozici 1 a chránící skupiny (jako je acetyl) na jiných hydroxylových skupinách cukru je podroben reakci v pozici 1 s hydroxylovou skupinou na jiném cukru (Evans W. L., Reynolds, D. D. a Talley, E. A., (1951) Adv. Carbohyd.

Chem. 6, 27) . Při těchto metodách je během tvorby polymerní vazby odštěpována molekula odlišná do vody, například HBr. Tato metoda přípravy oligosacharidů je únavná, vyžaduje přípravu složitých výchozích látek a dává nízkou celkovou výtěžnost (Goldstein, I. J. a Hullar, T. L., (1966) Adv.

Carbohyd. Chem. 21, 431 - 512) .

Obdobně je známo, že hexózový cukr obsahující primární alkoholickou skupinu na 6. uhlíku a O-chránící skupiny (j ako j· ě “ ace t y l·)⁼ v' po z i c i—2> ~3 - a^r 4 a- ods tupu j i c i s kup inu,- .

jako je bróm, v pozici i budou samovolně -kondenz-ova-t-,— zvláště v přítomnosti katalyzátoru, jako je oxid stříbra za vzniku polymerů spojených vazbami 1,6. Série

CfGTlt iÓdťíX iZx±1111 ijy±y p± xp±a.VeIiy u±ÍlluU ápUwvjJcMt — ΟΠΙΟ““

2,3,4-tri-O-acetyl-a-D-glukózy, avšak výtěžnost oligosacharidů byla nízká v důsledku tvorby 1, 6-anhydro-pD-glukózy odvozené od intramolekulární kondenzace; výtěžky dimeru (14 %) a trimeru (22 %) nebyly dobré a výtěžky tetrameru a pentameru byly ještě horší (méně nebo rovno

%) a hexamer byl izolován pouze s výtěžkem 1 % (Haq S. a Whelan, W. J., (1956) J. Chem. Soc. 4543).

Pozdější publikace popisují chemické syntézy polymerů β-pyranosylových jednotek spojených vazbami 1,6 (Okada, M., Sumitomo, H., Sumi K. a Sugimoto, T., (1984) J. Amer. Chem.

Soc. 17, 2451 - 2453) a D-dextranu (Okada, M., Sumitomo, H A, Hirsawa, Ť., Thara, K. a Ťada, (1986) Po-lym-. J., (Tokyo), 18, 601 - 611), vyrobených polymeračními reakcemi otevírajícími kruh anhydridových cukerných derivátů. Tato metoda je ztížena velkým úsilím potřebným k přípravě výchozího anhydridového cukerného materiálu a neexistuje žádný důkaz, že oligosacharidy.mohou být snadno připraveny touto metodou, i když se reakce provádí při, například, -60 °C. Jiná metoda využívá kysele katalyzovanou polymerizaci v tavenině 1,2,3,4-tetra-O-acetyl-p~D-glukózv k přípravě směsi acetátů oligosacharidů spojených vazbou 1,6', které po deacetylaci a podrobení chromatografické analýze, vykazovaly obsah hlavně mono a disacharidů, konkrétně glukózy (15 %), levoglukosanu (4 %) a gentiobiózy (16 %), zatímco výtěžnost oligosacharidů byla nepřijatelně nízká, konkrétně, gentiotriózy (4 %) a gentiotetraózy (0,6 %) (0'Colla, P. S. a McGrath, D., (1962) Chem. Ind.,

178 - 179). Tato metoda byla popsána následně detailněji (McGrath, D., Lee, E. E. a 0'Cola, P. S. (1969) Carbohydrate Res., 11. 453 - 460) a, ačkoliv byla výtěžnost polymerních produktů slabě vylepšena, zůstaly výtěžky požadovaných oligomerů jen velmi špatné.

Ž literatury tak vyplývá, že přestože již existuje několik způsobů přípravy řady oligosacharidů, nebyla dosud popsána metoda syntézy homooligosacharidů o dobré výtěžnosti ze snadno dostupných á levných výchozích látek.

Při práci vedoucí k tomuto vynálezu původci objevili způsob, při kterém mohou být syntetizovány specifické hexopyranooligosacharidy v dobrých výtěžcích ze snadno dostupných a levných výchozích látek. V souladu’s jedním aspektem vynálezu se předkládá způsob přípravy hexopyranooligosacharidů, který zahrnuje zahřívání acetylových nebo jiných esterových derivátů hexózy v inertním rozpouštědle za sníženého tlaku a v přítomnosti Lewisovy kyseliny nebo jiného katalyzátoru.

Podle tohoto způsobu oligomerace derivátů hexózových cukrů, které zahrnují, ale nejsou omezeny na 1,2, 3, 4-tetraO-acetylové deriváty glukózy, mannózy, galaktózy, altrózy, talózy, gulózy, idózy a allózy, může probíhat řízeně za vzniku O-acetylovaných hexózových oligosacharidů. Při tomto způsobu může být stupeň oligomerace (délka řetězce) snadno řízen změnami teploty, při kterých oligomerační reakce probíhá, a změnami času, po který.reakce probíhá. Po oligomerační reakci může být surová směs produktu podrobena další acetylaci, aby se acetylovaly zbývající hydroxylové skupiny oligosacharidů. Acetylované oligosacharidy mohou pák být snadno odděleny adsorpčni chromatografií. Acetylové skupiny vykazují v ultrafialovém světle absorbanci, umožňující použití spektrofotometrie pro identifikaci acetylovaných oligosacharidů tak,- jak se postupně vymývají z kolony. Acetylové chránící skupiny mohou být také odstraněny ze směsi oligosacharidů a výsledné oligosacharidy je možno separovat podle velikosti gelovou filtrační chromatografií (rozdělování podle velikosti molekuly - size exclusion).

Ve zde uvedených příkladech provedení jsou izolovány sulfatované oligosacharidy a použity jako odpovídající sodné soli. Rozumí se, že mohou být izolovány a použity odpovídajícím způsobem i jiné farmaceuticky přijatelné soli, jako jsou vápenaté nebo farmaceuticky přijatelné aminové soli. Obdobně pojem sulfatovaný oligosacharid je třeba chápat tak, že zahrnuje tyto sodné nebo jiné farmaceuticky přijatelné soli sulfatovaných oligosacharidů.

Další znaky vynálezu jsou detailněji popsány v následujících příkladech provedení vynálezu. Rozumí se však, že tento detailní popis je určen pouze pro doložení vynálezu příklady, a neměl byl být chápán jako jakékoli * omezení vůči výše uvedenému širšímu popisu vynálezu.

Příklady 1, 2 a 4 dokládají přípravu syntetických oligosacharidů novým zde popsaným způsobem, příklady 4, 5a 6 dokládají způsob sulfatace oligosacharidů a příklad 7 dokládá použití sulfatovaných oligosacharidů jako antiangiogenního, antimetastatického a/nebo protizánětlivého činidla. (V příkladech 1 a 2 představuje zkratka ND výraz not determined, tedy nezjištěno).

Popis obrázků na výkresech

Na přiložených výkresech:

Obrázek 1 ukazuje účinek sulfátu maltohexaózy na lidskou angiogenézi in vitro. Vrchní obrázek je digitální záznam kontrolní angiogenéze 14 dní po iniciaci kultury. Spodní obrázek ukazuje angiogenézi v přítomnosti 20 pg/ml sulfátu maltohexaózy.

Obrázek 2 ukazuje účinek různých koncentrací sulfátu maltózy (□) , sulfátu maltotetraózy (O) a sulfátu maltohexaózy () na lidskou angiogenézi in vitro. Údaje byly získány z digitálních záznamů angiogenní odpovědi 14 dní po iniciaci kultury. Každá hodnota znamená průměr ± standardní chybu (n = 4).

Obrázek 3 ukazuje účinekrůzných koncentraci (pg/ml) sulfatovaného fosfátu mannopentaózy z Pichia holstii na lidskou angiogenézi in vitro. Údaje byly získány z digitálních záznamů angiogenní odpovědi 19 dnů po iniciaci kultury. Každá hodnota znamená průměr ± standardní chybu (n = 4) .

Obrázek 4 ukazuje účinek sulfatovaných maltózových oligosacharidů o různé délce řetězce na metastázu krysího prsního adenokarcinomu 13762 MAT. Kontrolní zvířata dostala 13762 MAT buňky v nepřítomnosti oligosacharidů. Na panelu A - - ošetřená zvířata obdržela 2ung,._i .v., každé sloučeniny v . _ době injekce tumorové- buňky ,-^Na obdržela 4 mg, subcut., každé tuiHuruve JuunKy. Svisie itirizky

Obrázek 5 je zhodnocení schopnosti sulfatovaných maltózových oligosacharidů různé délky řetězce inhibovat vazbu buněčných povrchových sulfátů heparanu na buňkách BALB/c 3T3 k imobilizovanému aFGF. Vazby 3T3 buněk byly kvantifikovány Rose Bengálovou detekcí a měřením absorbance barviva při 540 nm. Stupeň sulfatace různých maltózových oligosacharidů je uveden v tabulce 2.

Obrázek 6 ukazuje účinek stupně sulfatace sulfátu maltohexaózy na schopnost inhibovat metastázu krysího prsního adenokarcinomu 13762 MAT. čísla na ose x udávají počet sulfátových skupin/molekulu maltohexaózy. Kontrolní zvířata dostala tumorové buňky v nepřítomnosti těchto sloučenin. Oligosacharidy byly podávány v dávce 2 mg/krysu, i .v., v -době injekce., tumorové .buňky. Svislé mři žky představují standardní chybu průměru.

Obrázek 7 ukazuje účinek maltohexaózy o různém počtu sulfátových skupin/molekulu na lidskou angiogenézi in vitro. Oligosacharidy byly přidány v množství 200 pg/ml a zkouška byla prováděna v médiu bez séra. Obdobná angiogenni odezva byla u tohoto experimentu získána, pokud zkouška probíhala v médiu obsahujícím sérum (20% FCS) nebo médiu bez séra (bez FCS). Maltohexaóza s 20 sulfáty/molekulu představuje maximálně sulfatovanou molekulu. Údaje představují průměr ± standardní chybu čtyř měření.

Obrázek 8 ukazuje účinek různých mannózu obsahujících oligosacharidů na lidskou angiogenézi in vitro. Hodnoty v závorkách představují % sulfatace oligosacharidů. Oligosacharidy byly přidány v množství 200 pg/ml a zkouška byla prováděna v médiu obsahujícím sérum. Údaje představují průměr ± standardní chybu čtyř měření.

Obrázek 9 ukazuje účinek sulfatovaných mannózových oligosacharidů o různé délce řetězce na metastázu krysího prsního adenokarcinomu 13762 MAT. Hodnoty v závorkách představují % sulfatace oligosacharidů. Kontrolní zvířata dostala 13762 MAT buňky v nepřítomnosti oligosacharidů. Ošetřená zvířata obdržela subkutánně buď 2 mg (A) nebo 4 mg (B) každé sloučeniny okamžitě po i.v. injekci tumorové buňky. Svislé mřížky představují standardní chyby průměru.

Obrázek .10 ukazuje účinek sulfatovaných galaktózových a glukózových oligosacharidů různé délky řetězce na metastázu krysího prsního adenokarcinomu 13762 MAT. Hodnoty v závorkách představují % sulfatace oligosacharidů. Kontrolní zvířata dostala 13762 MAT buňky v nepřítomnosti oligosacharidů. Ošetřená zvířata obdržela subkutánně 2 mg každé sloučeniny okamžitě po i.v. injekci tumorové buňky. Svislé mřížky představují standardní chyby průměru.

Vy

Příklad 1 způsobem: 1,2,3,4-tetra-O-acetylmannóza (Reynolds, D. υ. a

Evans, W. l.,

J. Amer. uhem. Sou. (1947),

1lu.hOx ) ci. uuiux Xaa ŽLXíiGCiici ů.y ν,,,Ί ,, 4 rrž \ 9 'ύ i ~ j * J jr ~— — — promíchány v tetramethylensulfonu (7 ml) , tato směs¹ byla zahřívána za sníženého tlaku za míchání při asi 110 °C po dobu 6 hodin; v tomto okamžiku reakční hmota ztuhla a přestaly se uvolňovat páry (kyselina octová). Během doby reakce byla mezi reakční nádobou a zdrojem vakua umístěna trubička s natronovým vápnem. Reakční směs byla ponechána vychladnout a část (11,0 g) výsledné směsi byla rozpuštěna v suchém pyridinu (20 ml) a do tohoto roztoku byl přidán acetanhydrid (2 ml), tato směs byla chráněna před atmosférickou vlhkostí a zahřívána na asi 50 °C za míchání po dobu 2 hodin. Po ochlazení byl přidán ethanol (10 ml) a směs byla ponechána v klidu po dobu 2 hodin. Pyridin, ethanol a-všechen vytvořený ethylacetát byly odpařeny za . sníženého tlaku a zbytek byl důkladně promyt vodou za účelem odstranění chloridu zinečnatého, tetramethylensulfonu a pyridinu. Zbytek byl rozpuštěn v dichloromethanu, promyt vodou a organická vrstva byla vysušena přes bezvodý síran sodný. Derivatizované oligosacharidy byly nejprve rozděleny na dvě frakce pomocí nanesení dichloromethanového roztoku na krátkou kolonu (4 x 40 cm) silikagelu 60 (130 g), která byla promývána nejprve chloroformem a poté acetonem. Eluce chloroformem poskytla směs plně acetylovaného monosacharidu a oligomerů obsahujících 3 až 5 mannózových jednotek (směs A). Následná eluce acetonem poskytla směs zcela O-acetylovaných oligomerů obsahujících převážně 6 až 12 mannózových jednotek na molekulu (směs B).

Směs A (4 g) byla nanesena na kolonu (3,3 x 135 cm) naplněnou silikagelem (H) stupně tle. Kolona byla promývána směsí acetoné/petrolether (rozmezí bodu varu 60 až 80 °C) s gradientem vycházejícím z poměru 1:5a vzrůstajícím procentickým zastoupením acetonu, až bylo dosaženo konečného poměru 1:1. Průtok byl <0,5 ml/min. Jímáním a shromažďováním příslušných frakcí (získaných analýzou tle na silikagelu) a odstraněním rozpouštědla za sníženého tlaku byly získány následující zcela O-acetylované mannózové oligosacharidy la-ld (n = počet mannózových zbytků; výtěžek, molekulární rotace (c = 2, CHC1₃) ) : la, (3; 0,7 g, 4,2 %, [a]²⁷D = +ND) ; lb, (4; 4,1 g, 8,4 %, [a]²⁷D = + 50); 1 c, (5; 1,2 g, 7,9 %, [a]²⁷D = +47,3); ld, (6; 0,8 g, 5,2 %, [cc]²⁷d = +36,0). Směs B (7,0 g) byla podrobena chromatografii obdobným způsobem jako směs A, ale eluční gradient vycházel z poměru aceton/petrolether (teplota varu 60 až 80 ’C) 4:5a procentické zastoupení acetonu vzrůstalo, až dosáhlo 100 %. Tímto způsobem byly získány následující zcela O-acetylované mannózové oligosacharidy ld - lj (n = počet mannózových zbytků; výtěžek, molekulární rotace (c=l, CHC1₃) ) : ld, (6; 1,6 g, 10,4%, [a]²⁷D = +ND) ; le, (7; 3,2 g, 21,2 %, [a]²⁷D= +50,0); lf, (8; 0,5 g, 3,4 %, [a]²⁷D = +47,0); lg, (9; 0,7 g, 4,7 %, [a]²⁷D = +59); lh, (10; 0,9 g, 5,7 %, [a]²⁷D = +54); li, (11; 0,02 g, 0,1 %, [a]²⁷D = +ND); lj, (12; 0,03 g, 0,2 %, [a]²⁷ _D = +ND) .

Sloučenina la (1,55 g) byla rozpuštěna v bezvodém methanolu (40 ml) a za míchání při pokojové teplotě byl přidán 1 M methanolický methoxid sodný (8,6 ml). Výsledný precipitát byl odfiltrován, důkladně promyt methanolem a vysušen. Produkt (2a; 0,61 g, 70 %, [a]²⁷ _D = +72°) byl identifikován jako mannotrióza pomocí prvkové analýzy (hodnota CHN byla ± 0,4 % očekávané),elektronové hmotové

Ij byly zpracovány obdubuě za v Zlil ku w X λ Π Λ Z-J ·, τ —í 4 Z—: 4 z“t Ví Hdo-xeuuj • Π.

Ooč-θt* τπΑΡπό zovvch zb vtků * % vvtěžek z acetvlovaných. derivátů, molekulární rotace (c =

*» ?T	Λ \	\ t A - *7 C	O i *7 O e \ *	O z—I	/ R *	QE. o, Γ/^12*7
+ / n.	20;	} ; i**/ f	δ f 0 — T / w ] ,		\ f	V O f
+ 80°	) ;	2d, (6; 98%,	[a]27 D = 84°); 2e,		98%,	[á]27o =
86, 3	°);	2f, (8; 99%,	[a]27 D = +98,0°) ;	2g,	(9;	99%, [a]27 D
+ 106	°);	2h, (10; 99%	, [afo = +100°);	2i,	dl;	98% [a]27 D =
ND) ;	2j	, (12; 98 %,	[a]27 D = ND) .

Alternativně mohou být tyto mannózové oligosacharidy izolovány gelovou filtrační („size exclusion) chromatografií. Tak byla získána směs acetylovaných mannózových oligosacharidů zahříváním důkladně míchané směsi 1,2,3,4-tetra-O-acetylmannózy (15,0 g, 43 mmol) a chloridu zinečnaťého (1,5 g) v tetramethylensulfonu (7 ml) za sníženého tlaku-při asi 110 °C po dobu 6 hodin, jak je popsáno výše. Reakční směs byla ponechána vychladnout, byla přidána voda (50 ml) a reakční směs byla míchána při pokojové teplotě po dobu 5 minut a vodná vrstva byla odpuštěna. Tato promývací procedura byla opakována a hmota byla následně rozředěna v chloroformu, promyta vodou a vysušena přes bezvodý síran sodný. Po přefiltrování byl chloroform odstraněn za sníženého tlaku za vzniku směsi surových acetylovaných oligosacharidů (11,3 g). Tato směs byla rozpuštěna v isopropanolu (20 ml) a methanolu (60 ml) a poté byl přidán 1 M methoxid sodný v methanolu (8 ml) a směs byla ponechána stát při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Výsledná sraženina byla odfiltrována a dvakrát promyta methanolem (30 ml). Po vysušení byla výsledná směs (6,5 g) nanesena na vršek gelové filtrační kolony naplněné gelem P2 „fine grade (BioRad)(oplášťovaná; 5 x 90 cm), která byla předtím stabilizována průchodem vody po dobu dvou dní (rychlost průtoku 0,5 ml za minutu) při 60 ^eC. Kolona byla promývána vodou při rychlosti průtoku 0,5 ml za minutu. Produkty eluované z kolony byly identifikovány jako píky pomocí diferenční refraktometrie a podle toho byly frakce shromažďovány. Tímto způsobem byly shromážděny frakce odpovídající plochám pod 11 různými píky. Každá z těchto frakcí byla opětně podrobena chromatografii na identické P2 gelové koloně udržované na 60 °C a eluována vodou při průtoku 0,5 ml/min. Tak například frakce identifikovaná jako odpovídající mannopentóze (0,9 g) z první gelové filtrace byla opětně podrobena chromatografii a poskytla hlavní centrální pík s jedním ramenem na každé straně. Produkt eluovaný v centrálním píku byl izolován odstraněním vody za sníženého tlaku, přičemž byl získán (0,5 g) materiál, který byl opět podroben chromatografii na identické P2 gelové koloně při 60 °C při průtoku 0,3 ml/min. Tímto způsobem byla získána mannopentaóza (0,3 g) identická s výše uvedeným produktem 2c. Byly naměřeny hodnoty C 38,4; H 6,7, přičemž C30H52O26.6 H₂O odpovídá C 38,5; H 6,8 %. Zjištěný obsah dusíku byl 0 % a očekávaný 0 %.

Pomocí HPLC bylo zjištěno, že sloučenina je v podstatě čistá. Zjištěno to bylo na systému Dionex HPLC o následující konfiguraci:.

Kolona: Code-CPMA1#1291 (+guard#1172). Kvartérní amoniová iontově výměnná kolona

Detektor: Elektrochemický detektor (ED40:IAMP)

Průtok: 1 ml/min.

Rozpouštědla: Roztok A: 0,1 M NaOH

Roztok B: 1 M acetát v 0,1 M NaOH

Gradient	čas -(min.)	% A	% B -	děj - · - .. - -
	- - “ Π------			... ----------------
	20	90	10	eluce
	25	0	xOO	eluče /yiOiuy l i
		zx v	«1, Λ J. U v	. li xJ i. Olu y

Elektronová hmotová spektrometrie ukázala, že tato sloučenina má hmotnost M⁺ 828, správnou molekulovou hmotnost mannopentaózy. Obdobně byly izolovány výše uvedené frakce 2a, 2b, 2d a 2e identické s mannotriózou, mannotetraózou, mannohexaózou a mannoheptaózou.

Přiklad 2

Tento přiklad ukázal účinek provedeni polymeračni reakce při teplotě nižší, než. u příkladu 1. Oligosacharidy glukózy byly získány polymerací 1,2,3,4-tetra-Oacetylglukózy stejným způsobem, jako u mannózových oligosacharidů vyrobených způsobem uvedeným v* příkladu 1 s tím rozdílem, že v tomto případě byla polymeračni reakce prováděna při 90 “C po dobu 8 hodin. Reakční směs byla zpracována jako v příkladě 1 a produkty byly izolovány chromatografií na koloně, přičemž kolona (7cmx 155 cm) byla naplněna silikagelem pro tle (Η). Použitím obdobných elučních metod jako u příkladu 1 byly získány následující zcela O-acetylované glukózové oligosacharidy 3a - 3e (n = počet glukózových zbytků; výtěžnost, molekulární rotace (c = 2, CHCls)): 3a, (3; 4,14 g, 24,9 %, [a]²⁷ _D = 37,5°); 3b,

(4; 2,92 g, 18,	4 % Ί o ,	[a]27 D = +44°)	; 3c, (5; 2,99 g, 19,
[a]27 D = +37,5°) ;	3d,	(6;	I,	37 g,	8,9 %, [a]27 D = +36°) ;
(7; 0,18 g, 1,2	Q.‘ o /	[a]27o	=	+39°).
Sloučenina	3a	(1,0	g)	byla	rozpuštěna v bezvodém

methanolu (30 ml) a za mícháni při pokojové teplotě byl přidán 1M methanolický methoxid sodný (5,5 ml) . Výsledný prečipitát byl odfiltrován, přomyt důkladně methanolem a vysušen. Produkt (4a; [a]²⁷D = 68,5°) byl identifikován jako glukotrióza prvkovou analýzou, elektronovou hmotovou spektrometrií (M⁺ = 504) a NMR spektroskopií. Oligomery 4b - 4e byly obdobně zpracovány za vzniku následujících glukózových oligosacharidů (n = počet glukózových zbytků; % výtěžnost, molekulární rotace (c = 2, H2O)): 4b, (4;

%, [a]²⁷D = +83°); 4c, (5; 90 %, [a]²⁷D = +84°); 4d, (6;

%, [α]²⁷ο = 86°).; 4e, (7; 89 %, [a]²⁷ _D = + 92,5°).

Alternativně mohou být tyto glukózové oligosacharidy izolovány gelovou filtrační („size exclusion) chromatografií. Tak byla získána směs acetylovaných glukózových oligosacharidů zahříváním důkladně míchané směsi 1,2,3,4-tetra-O-acetylglukózy (15,0 g, 43 mmol) a chloridu zinečnatého (1,5 g) v tetramethylensulfonu (7 ml) za sníženého tlaku při asi 110 ^eC po dobu 6 hodin, jak je popsáno výše. Reakční směs byla rozpuštěna v díchlormethanu, byla promyta vodou a vysušena přes bezvodý síran sodný. Dichlormethan byl odstraněn za sníženého tlaku a produkt byl zvážen a rozpuštěn v isopropanolu (20 ml) a methanolu (60 ml) a poté byl přidán 1 M methoxid sodný v methanolu (9 ml) a směs byla ponechána stát při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Výsledný prečipitát byl odfiltrován a dvakrát promyt methanolem (30 ml) . Část (7,6 g) této směsi byla rozpuštěna ve vodě (10 ml) a nanesena na 5 x 90 cm chromatografickou kolonu s vodním pláštěm plněnou gelem P2 „fine grade pro dělení částic podle velikosti (BioRad). Kolona byla naplněna, předehřívána a promývána při 60 ®C před použitím po dobu dvou dnů. Po nanesení směsi glukózovýcn oligosacharidů byla

m Ί /τη 4 ΤΊ \

At-U A X X / * i L· : r r>, Ί π ζλττ-i n A t-r Ir z-\ Ί ζλύ-ι r r Vx. tri t r 4 ti +- 4 ·Ρ 4 ! r 4 5 l'/x 4 Ιλχ F

-cxu:vvcaic x wxuxiy νγχγ xucn ux x j_ v em_y jánu pxixj oomocí diferenční refraktometrie a nedle toho bvlv shromažďovány frakce. Tímto způsobem byly shromážděny frakce odpovídající plochám pod 10 oddělenými píky. Každá z těchto frakcí byla opětně podrobena chromatografii na identické P2 gelové koloně při 60 °C a eluována vodou při průtoku 0,5 ml/min. Tímto způsobem byla například frakce identifikovaná jako odpovídající glukopentaóze (0,59 g) byla opětně podrobena chromatografii a poskytla hlavní centrální pík s jedním ramenem na každé straně. Produkt eluovaný v centrálním píku byl izolován odstraněním vody za sníženého tlaku, přičemž byl získán (0,3 g) materiál, který byl opět podroben chromatografii na identické P2 gelové koloně při 60 °C při průtoku 0,3 ml/min. Tímto způsobem byla získána glukopentaóza (0,2 g) identická s výše uvedeným produktem 4c. Obdobným způsobem Jbyly izolovány glukotrióza, glukotetraóza, glukohexaóza a glukoheptaóza identické s výše uvedenými produkty 4a, 4b, 4d a 4e.

Příklad 3 - — - - — —- - ...

Oligosacharidy jiných hexózových cukrů zahrnujících galaktózu, altrózu, talózu, gulózu, idózu a allózu mohou být získány opakováním metody popsané v příkladech 1 a 2.

Například galaktózové oligosacharidy byly získány následujícím způsobem: 1,2,3,4-tetra-O-acetylgalaktóza «

(21,0 g) a chlorid zinečnatý (2,1 g) byly pečlivě promíchány v tetramethylensulfonu (10 ml), tato směs byla zahřívána za sníženého tlaku za míchání při asi 90 °C po dobu 17 hodin; v tomto okamžiku reakčni hmota ztuhla a i

přestaly se uvolňovat páry (kyselina octová). Během doby reakce byla mezi reakčni nádobou a zdrojem vakua umístěna trubička s natronovým vápnem. Reakčni směs byla ponechána vychladnout,· reakčni hmota byla následně rozpuštěna v dichlormethanu, promyta vodou a vysušena přes bezvodý . síran sodný. Dichlormethan byl odstraněn za sníženého tlaku a produkt byl zvážen a rozpuštěn v isopropanolu (30 ml) a methanolu (70 ml) a poté byl přidán 1 M methoxid sodný v methanolu (10 ml) a směs byla ponechán stát při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Výsledný precipitát byl odfiltrován a dvakrát promyt methanolem (30 ml). Tato, směs byla separována gelovou filtrační chromatografií, jak bylo popsáno pro mannózové a glukózové polymery v příkladech 1 a 2 výše. Produkty eluované z kolony byly identifikovány jako píky pomocí diferenční refraktometrie a podle toho byly shromažďovány frakce. Tímto způsobem bylo získáno 8 frakcí. Sedm z těchto frakcí bylo dvakrát opětně podrobeno chromatografií na identické P2 gelové koloně při 60 °C a eluováno vodou při průtoku 0,5 ml/min během prvního opakování a 0,3 ml/min při druhém. Tímto způsobem byly získány následující galaktózové oligosacharidy: galaktotrióza, 1,03 g, 5,3 %; galaktotetraóza, 1,15 g, 6,0 %; galaktopentaóza, 1,21 g, 6,3 %; galaktohexaóza, 4,26 g, 22,1 %; galaktoheptaóza, 2,11 g, 11 %;

galaktooktaóza, 1,91 g, 9,9 %; a galaktononaóza, 0,08 g, 0,4 %.

Přiklad 4

K roztoku komplexu oxid sírový-pyridin (0,8 g) (Aldrich) v čerstvě destilovaném DMF (1 ml) při 80 °C byl přidán po kapkách roztok mannopentaózy (2c) (0,1 g) v suchém pyridinu (3 ml)—a-celek-byl-zahříván^přf 80 °C po dalších -90- min. Supernatant byl dekantovan, ^dtiinco oyl ještě horký, a lepkavý zbytek byl třikrát důkladně promyt

A Π Π 1 θϊΤ·.

ťo dekantaci zbývajícího methanolu, byl (b lux/ a ueUtíaiízován (na pH asi

6) octanem barnatým (přibližně 0,4 g v 2 ml vody) za intenzivního míchání. Po odstředění (3000 x g) byla svrchní kapalina dekantována a uchována a vysrážená peleta síranu barnatého byla důkladně promyta vodou (3 x 10 ml). Uchovaná svrchní kapalina a proplachy byly spojeny a zavedeny do kolony (1,0 x 14 cm) s katexovou pryskyřicí DOWEX 50W-X8400 (H+ forma). Kolona byla promývána vodou, dokud nebyl eluát neutrální. Eluát (asi 50 ml) byl míchán a neutralizován (na pH asi 7) octanem sodným (0,7 g). Roztok byl zředěn acetonem (200 ml) a odstředěn (1750 x g) za účelem oddělení produktu. Peleta byla jemně rozdrcena na prášek pod methanolem a potom rozmíchána stále pod methanolem a.poté odfiltrována. Pevná-látka byla promyta několikráte methanolem, čímž byla získána čistá (prostá anorganických solí) sloučenina (0,2 g; 66 %). Produkt nebyl znečištěn bariovými ionty (stanoveno mikroanalýzou a plamenovou ionizací) ani_ dusíkem, (mikroanalýza)-. Bylo zjištěno, že produkt, sulfatovaná mannopentaóza, má 11 ze možných 17 pozic sulfatovaných. Bylo stanoveno · složení C 14,2; H 3,0; S 14,1; Na 7,3. C₃oH₆oO59SiiNa₈.36 H₂O odpovídají hodnoty C 14,1; H 5,2; S 13,8; Na 7,2 %. Hodnoty dusíku a baria byly nalezeny 0 % a předpokládány 0 %.

Příklad 5

Ke směsi komplexu oxid sírový-pyridin (Aldrich Chemical Company) (4 g) v suchém DMF (5 ml) byl přidán suchý pyridin (10 ml) pod atmosférou suchého dusíku. Tato směs byla zahřáta na 50 °C a za intenzivního míchání byla najednou přidána glukohexaóza (4d) (0,5 g) izolovaná způsobem popsaným ve výše uvedeném příkladu 2. Byl přidán další pyridin (5 ml) a směs byla pak zahřívána za stálého míchání na 80 °C po 90 minut. Reakční směs byla pak ponechána při 4 °C přes noc. Kapalina pak byla z reakční nádoby odstraněna dekantací, byl přidán methanol (3 ml) a polotuhá hmota byla rozbita a důkladně rozmixována s methanolem. Po usazení byl methanol oddělen dekantací a tato procedura byla zopakována. Ke zbylé pevné látce byla přidána voda (5 ml) a výsledný roztok byl umístěn do 50 ml zkumavky. Reakční nádoba byla opláchnuta další vodou (5 ml), která byla spojena s prvním roztokem. Výsledný roztok byl upraven na pH asi 7 až 8 pomocí 40% NaOH, načež byl přidán methanol (40 ml). Výsledný zakalený roztok byl odstředěn (3 000 x g) po dobu 25 min. a od precipitátu byl dekantován čirý roztok. Zbylá pevná látka byla opět rozpuštěna ve vodě (10 ml), byl přidán methanol (40 ml) a zkumavka byla odstředěna za výše uvedených podmínek. Po dekantací čistého rozpouštědla.byla-pevná látka rozpuštěna ve vodě (10 ml) á roztok byl ponechán projít gelovou odsolovací kolonou P2 (2,5 cm x 250 cm; gel P2 fine grade BioRad), čímž byla získána požadovaná sodná sůl sulfatovaného derivátu 1,6-glukohexaózy.

Příklad 6

Přestože syntéza hexózových homopolymerů je popsána v příkladech 1, 2 a 3, je obvykle velmi obtížené syntetizovat většinu oligosacharidových struktur. Proto je jednodušší způsob sulfatace oligosacharidů definovaných struktur z přírodních zdrojů.Přírodní _o1igosacharidy . První třída obsanovala oligosacharidy, dearadaci a frakcionaci. Pří klady této třídy jsou maltóza.

raffinóza a stachyóza. Druhá třída sestávala z oligosacharidů získaných z přirozeně se vyskytujících polysacharidů, které byly částečně degradovány enzymaticky nebo chemicky a frakcionovány na základě velkosti. Příklady této třídy jsou oligosacharidy odvozené od amylózy, chondroitinu a dextranu a fosfát mannopentaózy z kvasinky Pichia holstii.

Maltóza, raffinóza a stachyóza byly získány od Sigma

Chemical Co., St Louis, MO. Maltotrióza, maltotetraóza, maltopentaóza, maltohexaóza a maltoheptaóza byly získány od firmy Seikagaku, Tokyo, Japonsko a představují oligosacharidy přečištěné z limitovaného amylázového štěpení glukózového homopolymerů spojeného vazbami a 1-4, amylózy. Tetra-,· hexa- a oktasacharidy chondroitinu-byly přečištěny gelovou filtrační frakcionací štěpů chondroitin6-sulfátu získaných pomocí hovězí testikulární hyaluronidázy, jak bylo popsáno v (Glaser, J. H. a Conrad, Η. E. (1979) J. Biol... Chem.. 254, 6588 659.7) . Cyklohexa-, hepta- a okta-amylózy byly získány od firmy Sigma. Tyto oligosacharidy mohou být sulfatovány, jak je popsáno v příkladu 5.

Například sulfát maltohexaózy byl připraven následujícím způsobem. K roztoku komplexu oxid sírový30 pyridin (4,0 g) (Aldrich) v čerstvě předestilovaném DMF (5 ml) při 80 °C byl po kapkách přidán roztok maltohexaózy (0,5 g) v suchém pyridinu (15 ml) a celková směs byla zahřívána na 80 °C po dobu dalších 90 minut. Supernatant byl ještě za tepla oddělen dekantací a lepkavý zbytek byl důkladně promyt třikrát methanolem (10 ml). Po dekantaci zbylého methanolu byl produkt rozpuštěn ve vodě (15 ml) a neutralizován (na pH asi 6) pomocí octanu barnatého (asi 2,0 g v 10 ml vody) za intenzivního míchání. Po odstředění (3 000 x g) byla svrchní kapalina dekantována a uchována a vysrážená peleta síranu barnatého byla důkladně promyta vodou (3 x 10 ml). Uchovaná svrchní kapalina a průplachy byly spojeny a naneseny na kolonu (2,5 x 14 cm) s katexovou pryskyřicí DOWEX 50W-X8-400 (H+ forma). Kolona byla promývána vodou, dokud nebyl eluát neutrální. Eluát (asi 250 ml) byl promíchán a neutralizován (na pH asi 7) octanem sodným (3,5 g). Roztok byl za účelem oddělení produktu rozředěn acetonem (1 1) a odstředěn (1750 x g). Peleta byla jemně rozdrcena na prášek pod methanolem a poté stále pod methanolem rozmíchána a poté odfiltrována. Filtrát byl několikrát promyt methanolem za vzniku čisté (bez anorganických solí) sloučeniny (0,88 g; 55 %). Produkt nebyl kontaminován ionty baria (zjišťováno mikroanalýzou a plamenovou ionizací) ani dusíkem (mikroanalýza).

Bylo—zj-ištěno, že produkt má sulfatovaných 14 pozic z 20 možných. Bylo stanoveno složení C 13,9; H 2,2; S 14,3; Na 6,7. C₃6H7iO7₃Si4Na₉.45 H₂O odpovídá C 13,8; H 5,1; S 14,3; Na 6,6 %. Stanovené hodnoty obsahu dusíku a baria byly 0,32 a 0 % a předpokládané u obou 0 %.

Hodnoty ^:Η NMR (300 MHZ - Gemini 300; srovnáváno z acetonu 2,25 ppm na pozadí z TMS) pro výše uvedený sulfát

- 31 maltohexaózy udávají, že 14 z možných 20 pozic bylo sulfatováno. To bylo zjištěno z chemických posunů vodíkových atomů soustředěných okolo 4,15 ppm (integrování pro 20 H) ve srovnání š těmi, které byly soustředěny okolo 4,4 ppm (integrování pro 16 H) . Dá se předpokládat, že všechny primární OH skupiny, to jest ty, které jsou \^T pozici 6, budou sulfatovány, protože toto .je nejméně stericky chráněná pozice. Rovněž se dá předpokládat, že ve vnitřních cukerných zbytcích bude pouze jedna další pozice sulfatována. Každý z koncových cukerných zbytků bude mít kromě pozice 6 další dvě pozice sulfatovány.

Fosfát mannopentaózy byl připraven z exopolysacharidu produkovaného diploidní kvasinkou Pichia holstii (kmen NRRL Y-2448, dříve Hansenula holstii). Způsob kultivace P. holstii a izolace fosfátu mannopentaózy byl založen na dříve popsaných postupech (Anderson, R. F., Cadmus, M. C., Benedict, R. G. a Slodki, Μ. E. (1960) Arch. Biochem. Biophys. 89, 289 - 292; Bretthauer, R. K., Kaczorowski, G. J. a Weise, M. J. (1973) Biochemistry 12, 1251 - 1256) . Ve stručnosti: surový exopolysacharid byl izolován ze supernatantů aerobní kvasničné kultury jako draselná .sůl pomocí ethanolového srážení. K uvolnění fosfátu mannopentaózy z monoesterového fosfomannanového jádra (PPME - phosphomannan monoester core) exopolysacharidu bylo použito kyselé hydrolýzy. PPME a fosfát mannopentaózy byly odděleny od sebejako barnaté soli diferenční ethanolovou precipitací a následně gelovou filtrací. Oligosacharid měl strukturu P-6-Man-a- (1—»3) -Man-α- (1—>3) -Man—a- (1—>3) -Man—a(l->2)Man (Bretthauer, R. K., Kaczorowski, G. J. a Weise,

M. J. (1973) Biochemistry 12, 1251 - 1256).

Sulfát kvasničného fosfátu mannopentaózy (Anderson, R. F., Cadmus, M. C., Benedict, R. G. a Slodki, Μ. E. (1960) Arch. Biochem. Biophys. 89, 289 - 292; Bretthauer, R. K., Kaczorowski, G. J. a Weise, M. J. (1973) Biochemistry 12, 1251 - 1256) izolovaný z exopolysacharidu kvasinky byl připraven následujícím způsobem. Suspenze kvasničného fosfátu mannopentaózy (0,09 g) v DMF (2 ml) a pyridin . (3 ml) byly přidány k roztoku komplexu oxid sírový-pyridin (0,8 g) (Aldrich) v DMF (1 ml). Směs byla zahřívána na °C po 2 hodiny. Supernatant byl oddělen dekantací ještě za tepla a lepkavý zbytek byl důkladně promyt třikrát methanolem (2 ml). Po dekantaci zbylého methanolu byl produkt rozpuštěn ve vodě (5 ml) a neutralizován (na pH 6) pomocí octanu barnatého (asi 0,7 g v 5 ml vody) za intenzivního míchání. Po odstředění (3 000 x g) byla svrchní kapalina dekantována a vysrážená peleta síranu barnatého byla důkladně promyta vodou (3 x 10 ml) . Svrchní kapalina a průplachy byly spojeny a naneseny na kolonu (2,5 x 14 cm) s katexovou pryskyřicí DOWEX 50W-X8-400 (H⁺ forma). Kolona byla promývána vodou, dokud nebyl eluát neutrální. Eluát (asi 50 ml) byl promíchán a neutralizován (na pH 7) octanem sodným (asi 0,4 g). Roztok byl za účelem oddělení produktu rozředěn acetonem (150 ml) a odstředěn (1750 x g). Peleta byla jemně rozdrcena na prášek pod _ methanolem a poté rovněž pod methanolem rozmíchána a poté odfiltrována. Pevný podíl byl několikrát promyt methanolem za vzniku sulfatovaného kvasničného fosfátu mannopentaózy (0,18 g). Produkt nebyl kontaminován ionty baria (zjišťováno mikroanalýzou a plamenovou ionizací) ani dusíkem (mikroanalýza).

í * Bylo zjištěno, že produkt má sulfatovaných 10 pozic z

Ě^··· možných. Bylo stanoveno složení C 15,35; H 2,7; P 1,2;

Γ * r r _r ^{r r r} > Λ f f ·» i* <* -· r

S 13,7; Na 8,5. C₃oH4i059PS₁₀Na₉.25 H₂0 odpovídá C 15,3;

H 3,5; P 1,3; S 13,6; Na 8,8 %. Stanovené hodnoty obsahu dusíku a baria byly 0,16 a 0 % a předpokládané u obou 0 %.

1,6-a-glukózové oligosacharidy byly připraveny kyselou hydrolýzou dextranu' (průměrná¹molekulová hmotnost 71 000;-- ' - -Sigma Chemical Go). Dextran (5'g) byl rozpuštěn v destilované vodě (100 ml) a tento roztok byl upraven na pH 1,8 pomocí 1M kyseliny chlorovodíkové. Směs byla zahřívána (100 '0/ pod zpětným chladičem po 48 hodin. Směs byla vysušena za sníženého tlaku a doplněna na 100 ml destilovanou vodou a podruhé vysušena za sníženého tlaku.

Ke zbytku byl přidán a pak odpařen za sníženého tlaku absolutní ethanol (100 ml). Zbytek byl doplněn na 4 ml destilovanou vodou a nanesen na 5 x 90 cm chromatografickou kolonu s vodním pláštěm plněnou gelem P2 „fine grade pro dělení částic podle velikosti (BioRad). Před použitím byla kolona naplněna, předehřátá a promývána při 60 *C po dobu dvou dnů. Po přídavku směsi 1,6-a-glukózových oligosacharidů byla kolona udržována na 60 °C a promývána . vodou (1 ml/min.). Produkty eluované z kolony byly identifikovány jako píky diferenční refraktometrií a podle toho byly shromažďovány frakce. Tímto způsobem byly shromážděny frakce odpovídající plochám pod oddělenými píky. Každá z těchto frakcí byla opětně podrobena chromatografii na identické P2 gelové koloně při 60 °C a eluována vodou při průtoku 0,5 ml/min. Takto byla například - frakce identifikovaná jako odpovídající 1,6-a-glukohexaóze (0,19 g) opětně podrobena chromatografii, čímž byl získán centrální pík s jedním ramenem na každé straně. Produkt eluovaný v centrálním píku byl izolován odstraněním vody za sníženého tlaku za vzniku (0,16 g) látky, která byla opět * * r <· podrobena chromatografii na identické P2 gelové koloně při 60 °C při průtoku 0,3 ml/min. Tímto způsobem byla získána glukohexaóza (0,14 g) (M⁺ přibližně 990). Obdobným způsobem byly izolovány 1,6—α-glukotrióza, 1,6—a-glukotetraóza (0,21 g) a 1,6-a-glukopentaóza (0,17 g).

Příklad 7

A: Materiál a metody

Antikoagulační aktivita sulfatovaných oligosacharidů

Antikoagulační aktivita každého sulfatovaného oligosacharidů byla zkoušena známými způsoby (Parish, C. R., Coombe, D. R., Jakobsen, K. B., Bennett, F. A. a Underwood, P. A. (1987). Int. J. Cancer 40, 511 - 518), za použití jak postupu měření času pro thrombin, tak pro aktivovaný parciální thromboplastin. Aktivita každého preparátu byla srovnána s heparinovou kontrolou a antikoagulační aktivita byla vyjádřena jako procenta aktivity heparinu.

Zkouška lidské angiogenéze

Použitá metoda byla popsána v mezinárodní patentové přihlášce číslo PCT/AU95/00105, na kterou se tímto odkazuje. Cévy, přibližně o průměru 1 až 2 mm a délky 2 až 5 cm, byly získány z povrchu lidských placent do 6 hodin od porodu. Cévy byly umístěny do Hankova BBS obsahujícího 2,5 mg/ml fungizonu a nařezány na fragmenty o délce 1 až 2 mm za použití jemných řezacích kleštiček a iridektomických nůžek. Cévní fragmenty byly zbaveny zbytkových sraženin a před použitím byly uloženy do Hankova BBS. Rozřezání a naporcování cév bylo provedeno za pomoci

zvětšovací lampy (Maggylamp, Newbound, Balmain, NSW, Austrálie). Obdobné angiogenní odezvy byly získány u cév venulárního i arteriálního původu, ale pro každou zkoušku byly použity cévní fragmenty pouze z jedné cévy.

--- Angiogenní - zkoušky-byly^provedeny na- 24- nebo 48jamkových kultivačních destičkách (Costar, Cambridge , U 24 jamkového provedení bylo ďo každé hovězího thrombinu (50 NIH jednotek/ml nU J _ Ί /*1 _ rs X. T . 2 — %/A \ Λ. , 1

Cl -L · f w C Lívlíxu ; j u* iiCCiis-.

v 0,10 M NaCi;

μΐ

Xyiiičt médiu 199. Thrombin centra jamky byl mg./ml hovězího fibrinogénu (Sigma) v a fibrinogen byly rychle smíchány a do před vytvořením sraženiny rychle umístěn cévní fragment. Obvykle k vytvoření fibrinu došlo za 30 sekund a cévní fragment byl ponechán suspendován v gelu. Následně po vytvoření gelu byl přidán 1,0 ml/jamku média 199 doplněného

20% fetálním telecím sérem (FCS), 0,2 mg kyseliny ε-aminokapronové, L-glutaminem a antibiotiky (gentamycin a fungazon). U 48 jamkového provedení byla množství všech reagencií poloviční. Cévy byly kultivovány při 37° C ve vlhkém prostředí po dobu 14 až 21 dnů, přičemž médium bylo vyměňováno dvakrát týdně. Angiogenéze byla kvantitativně

-* vyhodnocena-na základě počítačové analýzy digitálních snímků kultur získaných digitální kamerou Dycam umístěnou na mvertnim mikroskopu (Olympus, Tokyo, Japonsko) za použití softwaru NIH Image.

Heparanázová zkouška

Heparanázová zkouška je založena na poznatku, že sérový protein, na hystidin bohatý glykoprotein (histidinerich glykoprotein - HRG), se váže na řetězce sulfátu heparanu a maskuje místa štěpení heparanázou. Na základě * r zjištění, že heparanázou štěpený sulfát heparanu se neváže k HRG, byla vyvinuta heparanázová zkouška, která zahrnuje štěpení řetězců sulfátu heparanu označených izotopem ³H pomocí heparanázy, vazbu rozštěpeného sulfátu heparanu k HRG navázanému na kuličkách a měření množství nenavázané značky ³H. Se vzrůstajícím štěpením substrátu není schopno zvyšující se množství značky ³H vazby ke kuličkám HRG. Tato metoda tak představuje jednoduchý a rychlý způsob měření heparanázové aktivity v tkáňových extraktech a zjišťování inhibice heparanázy různými sloučeninami.

Nejprve byl sulfát hovězího intestinálního heparanu (průměrná molekulová hmotnost 32 kDa) de-N-acetylován zahřátím v hydrátu hydrazinu (Guo, Y. aConrad, Η. E. (1989). Anal. Biochem. 176, 96 - 104) a reacetylován pomocí ³H-acetanhydridu. Kuřecí HRG, přečištěný metodou podle Rylatta a kol. (Rylatt, D. B., Sia, D. Y., Mundy, J. R. a Parish, C. R. (1981). Eur. J. Biochem. 119,. 641 - 646) byl navázán na Sepharose 4B (Pharmacia) aktivovanou CNBr podle návodu výrobce.

Aktivita heparanázy lidských krevních destiček byla stanovena inkubací (37 °C, 30 min) přečištěné heparanázy lidských krevních destiček (která vykazovala stejnou aktivitu vůči sulfátu heparanu jako heparanázová aktivita přítomná ve vysoce metastatických kultivovaných buněčných liniích lidského karcinomu HCT 116, krysího adenokarcinomu 13762 MAT a myšího melanomu B16) s 60 pmol ³H-radioaktivně značeným sulfátem hovězího intestinálního heparanu. Aktivita byla stanovena na základě rychlosti produkce menších (přibližně 5 kDa) fragmentů sulfátu heparanu, které nebyly vázány následným průchodem inkubační směsi (100 μΐ) přes mini-kolony HRG-Sepharose (200 μΐ náplně kuliček), f r > r r r ♦ τ e ♦ f* r r r » · r- ·r • ,-»·*«» ® · · » a ®ř f r- ♦ · · ·>f r r- «β ® ® ® 9 ® 9 9 f * Γ které zadržely větší nerozštěpený a částečně rozštěpený substrát.

Při zkouškách inhibice heparanázy byly přidávány různé koncentrace inhibitoru k enzymu před přídavkem radioaktivně značeného substrátu, přičemž inhibitor zůstávaL=v_.,-rea-kční· __ směsi během-ínkubační doby- -· - ·-·Antimetastatická aktivita různých sulrabovaných

Ί vyj.

. -u-. 4

1'JUiJ uLiiCií. _LkU.Li

rn®·!· pq i^- ^ ·) ϊ ckphγυ krysího prsního adenokarcinomu 13762 MAT (Parish, C. R.,

Coombe, D. R., Jakobsen, K. B., Bennett, F. A. a Underwood,

P. A. (1987). Int. J. Cancer 40, 511 -518). Tumorové buňky byly udržovány in vitro, jak bylo dříve popsáno v (Parish, C. R., Coombe, D. R., Jakobsen, K. B., Bennett, F.

A. a Underwood, P. A. (1987). Int. J. Cancer 40, 511 518). Samicím Fisherových krys 344, (stáří 10 až 13 týdnů) byly injektovány i. v. v množství 2 x 10⁵ buňky 13762 MAT v 0,6 ml RPMI 1640 médiu obsahujícím 10 % FCS. V době injekce tumorové buňky byly zvířatům také injektovány 2 mg sulfatovaných oligosacharidů, přičemž obdobné výsledky byly získány, “ pokud byly oligosacharidy injektovány!; v,. i; p. nebo subkutánně. Po 13 dnech od injekce tumorové buňky-byly zvířatům odebrány plíce, umístěny do Bouinova roztoku alespoň na 24 hodin a poté byly pod disekčním mikroskopem vyšetřeny- na plicni metastázy.-Počet plícních metastáz^u krys ošetřených sulfatovanými oligosacharidy byl porovnán s počtem zjištěným u kontrolních zvířat, přičemž v každé skupině byla minimálně čtyři zvířata.

Účinek sulfatovaných oligosacharidů na interakci f *9 r fr r · · ♦ r · » · 9 9 f r r ♦ 9 99 r f ♦ * 9 9 9 9 9 9 9 9 r Γ

FGF-sulfát heparinu/heparanu

Za účelem měření vazby aFGF a bFGFna heparin a zjišťováni schopnosti různých sulfatovaných oligosacharidů inhibovat tuto interakci byla provedena vazebná zkouška která je detailně popsáno v (Brown, K. J., Henry, I. A. a Parish, C. R. (1995) Exp. Cell Res. 217, 132 - 139). Ve stručnosti, FGF byly imobilizovány v jamkách 96 jamkových PVC desek a byla zkoumána vazba radioaktivně zriačeného heparinu na imobilizované FGF. V inhibičních zkouškách byla u série ředění sulfatovaných oligosacharidů zkoušena jejich schopnost inhibovat interakci FGF-heparin. Výsledky inhibice byly vyjádřeny jalco koncentrace sulfatovaných oligosacharidů potřebné k inhibici vazby heparinu na imobilizované FGF o 20 % nebo 50 %. Jako kontrola ve všech stanoveních inhibice vazby byl použit néznačený heparin.

Dříve popsanou metodou (Brown, K. J. a Parish, C. R. (1994). Biochemistry 33, 13918 - 13927), pomocí stanovení vazby BALB/c 3T3 fibroblastů k FGF imobilizovaným na PVC, byla měřena interakce FGF-sulfát heparanu, přičemž vazba buněk byla stanovena Rose Bengálovou detekcí pomocí vybarvení ulpělých buněk. U sulfatovaných oligosacharidů byla zkoumána jejich schopnost inhibovat proces adheze k buňce, který je zcela závislý na strukturách sulfátu heparanu na povrchu BALB/c 3T3 buněk (Brown, K. J. a Parish, C.‘ R. (1994). Biochemistry 33, 13918 - 13927). Výsledky byly vyjádřeny jako koncentrace sulfatovaného oligosacharidů, při které dochází k inhibici adheze k buňkám o 50 % (IC50).

Model zánětu vzduchového váčku

Tato zkouška je založena na dříve popsaném způsobu (Forrest, M. J., Brooks, P. M., Takagi, T. a Kowanko, I. (1988) . „CRC Handbook of Animal Models for the Rheumatic Diseases. Eds.. Greenwald, R. A. and Diamond, K. S., CRS Press, Boča Raton, vol. 1, str. 125) . První den byly na zádech myší vytvořenv podkožní vzduchové váčky pomocí injekce 5 ml sterilního vzduchu pod kůži v oholené oblasti mezi lopatkami myši pod anestézi. Třetí den byl váček obnoven injekcí 2,5 ml vzduchu. Zánět byl vyvolán 6. den přímou injekcí do váčku buď 1.0 ml 56 mcr/itil. thioglykolátu nebo 1,0 ml fyziologického roztoku jako kontroly. Přibližně po 17 až 20 hodinách po injekci thioglykolátu byla zvířata usmrcena cervikální dislokací a buněčný obsah váčku byl získán pomoci injekce 2,5 ml ledového PBS/5% FCS. Sulfatované oligosacharidy byly testovány na svoji schopnost inhibovat zánětlivou reakci, přičemž byly injektovány subkutánně (50 μΐ v PBS) na zvláštním místě okamžitě po podání thioglykolátu. Jako kontrolní protizánětlivá látka byla použit prednisolon, který byl injektován subkutánně v oleji v dávce 25 mg/kg. Celkové počty buněk v každém váčku byly stanoveny za použití přístroje Coulter Counter a různé subpopulace leůkocytů byly testovány imunofluorescenční proudovou cytometrií.

Model astma myší

Dříve publikovaný model astma myší’ (Foster, P\ S., Hogan, S. P., Ramsay, A. J., Matthaei, K. I. a Young, (1996). J. Exp. Med. 183, 195 - 201) byl použit ke zjištění schopnosti sulfatovaných oligosacharidů inhibovat aeroallergenem (ovalbuminem, OVA) vyvolanou infiltraci eosinofilů do plic. Myši (C57BL/6, 6 až 10 týdnů staré) f Γ r r byly senzitivovány i. p. injekcí 50 mg OVA/1 mg alhydrogelu (CSL Ltd., Pakrville, Austrálie) v 0,9% sterilním fyziologickém roztoku ve dnech 0 a 12. V den 24 byly myši vystaveny působení aerosolu OVA (10 mg/ml) v 0,9% fyziologickém roztoku po dobu 30 min. třikrát (v 1 hodinových intervalech) a poté vystaveny obdobné iniciaci ve dnech 26 a 28. Aerosol byl vytvářen v množství litrů/minutu nebulizerem, který produkoval částice o průměru 39 μπι do uzavřené komory o objemu 800 cm³. V den 2 9 byly myši zabity cervikální dislokací. Do trachejí byly zavedeny kanyly a vzduchové cesty byly promyty 4 x 1 ml 0,9% fyziologického roztoku obsahujícího BSA (0,1 % hmotn./obj.) při 37 °C. Při každém promytí bylo získáno asi 0,8 ml nakapané tekutiny. Bronchoalveolární výplachová tekutina (BALF) získaná z jednoho zvířete byla shromážděna a za použití standardního hemocytometru byl stanoven počet buněk. Buňky BALF byly také podrobeny cytocentrifugaci a diferenčně vybarveny May-Grunwald-Giemsovým roztokem, přičemž za použití morfologických kritérií byly identifikovány eosinofily. Zjištěné hodnoty byly přepočteny jako easinofily/ml BALF. Sulfatované oligosacharidy byly podávány zvířatům buď systemicky i. p. podáváním miniosmotickými pumpami Alzet nebo přes plíce ve formě aerosolu. Miniosmotické pumpy, byly vloženy 23. den, 24 hodin před zavedením OVA a kontinuálně dodávaly léčivo až do doby, dokud nebyla zvířata usmrcena (29. den). V případě podávání aerosolem byly myši vystaveny působení aerosolu sulfatovaných oligosacharidů v 0,9% fyziologickém roztoku třikrát po 30 minutách (v hodinových intervalech) 23., 25. a 27. den.

* *

Experimentální model autoimunní encefalomyelitidy (EAE)

Dříve popsaným způsobem (Willenborg, D. 0. a Parish,

C. R. (1988). J. Immunol, 140, 3401 - 3405) byly připraveny . s 1 e z inné buňky cro trans fer.EAE. V krát kos t i, Lewi so vy.

slezinné buňky byly aktivovány pomocí ConA in vitro a· přeneseno i= v._s do každého příjemce- Miniosmótické pumpy implantovány subkutánně v době přenosu buněk a dávkovaly dávku 70 mg/kg/den po dobu 14 dnů. Klinické EAE byly odstupňovány podle následujícího schématu: 0, bez symptomů;

1, ochablá distální část ocasu; 2, ochablý celý ocas; 3, ataxie, potíže se vztyčováním; 4, slabost zadních končetin;

a 5, paralýza zadních končetin.

Model zánětlivé choroby střev

Zánětlivá choroba střev byla vyvolána u myší přídavkem 5 % (hmotn./obj.) sodné soli sulfátu dextranu (dextřan sodium sulphate - DSS^ dodávaný TdB Coňsultancy, Uppsala, Švédsko) do pitné vody. Roztok byl upraven na pH 8,0 a přefiltrován přes membránu 0,45 μ. Roztoky DSS byly denně shromažďovány, přefiltrovány a objemy doplněny čerstvým zásobním DSS. U samců myší BALB/c ve stáří 6 až 7 týdnů byla sledována tělesná hmotnost a ti, u nichž byla 20 až 23 g, byli rozdělováni do klecí do skupin, kde v jedné kleci bylo 5 myší.

Myším byl injektován sulfatovaný fosfát manopentaózy (20 mg/kg/den) nebo vehikulum (sterilní voda) v 8 hodinových intervalech ode dne 0. do 10. dne. Objem injekce

r r r f r · ♦ · · r » · ·« · 9 * « r * r využitelnost pro tuto indikaci vzhledem ke své silné antikoagulační aktivitě.

Tři z těchto sulfatovaných přirozeně se vyskytujících oligosacharidů byly dosti silné inhibitory lidské angiogenéze, konkrétně sulfatovaný fosfát mannopentaózy (odvozený od P. holstii), sulfát maltotetraózy a sulfát maltohexaózy. Fosfát mannopentaózy a maltohexaóza byly nej silnější z těchto sloučenin s 50% inhibiční koncentrací 2 μg/ml, kdežto maltotetraóza vykazovala 50% inhibici při 20 gg/ml. Příklad popsané inhibice angiogenéze indukované 20 gg/ml sulfátu maltohexaózy je uveden na obrázku 1. Je třeba poznamenat, že je zajímavé, že heparin měl malou antiangiogenní aktivitu. Zdá se tedy pravděpodobné, že sulfatované oligosacharidy s relativně krátkou délkou řetězce jsou požadovány pro tento typ aktivity. Dokonalejší vyhodnocení inhibice angiogenéze pomocí maltózové série je uvedeno na obrázku 2 a pomocí sulfatovaného fosfátu mannopentaózy na obrázku 3. U maltózové série je vidět, že sulfát maltózy měl malou inhibiční aktivitu, kdežto sulfáty maltotetraózy a maltohexaózy byly dosti silnými inhibitory (obrázek 2).

Všechny experimenty s angiogenézí uvedené v tabulce 1 zahrnovaly přídavek oligosacharidů do kultivačního média na začátku stanovení angiogenéze. Avšak předběžné studie (údaje nejsou uvedeny) naznačovaly, že přídavek sulfátu maltohexaózy po začátku angiogenní odezvy může také inhibovat další narůstání cév, přestože k nejúčinnější inhibici dochází, když je sloučenina přidána na začátku kultivace.

Sulfatované oligosacharidy se také markantně liší ve své aktivitě inhibovat heparanázu. Nejsilnějšími inhibitory jsou sulfatovaný fosfát mannopentaózy a sulfát maltohexaózy, přičemž aktivita těchto dvou sloučenin se podobá heparinu (tabulka 1). Je zajímavé, že tyto dvě sloučeniny jsou také účinnými antiangiogenními činidly.

. Avšak inhibice angiogenéze nekoreluje s inhibični aktivitou pro heparanázu u mnoha sloučenin.

cykloamylózy byly dosti silné inhibitory heparanázy, ale angi

Maltozová série poskytla také τπτίγϊΙίπ ino vztH^u délVw řetězce a inhihicA heparanázu u kompletní maltózové série, v rozsahu od discharidu (maltóza) až k heptasacharidu (maltoheptaóza) . Maltóza nevykazovala inhibični aktivitu, maltotrióza slabou, maltotetraóza vykazovala střední, zatímco penta-, hexa- a hepta-sacharidy vykazovaly vysokou inhibični aktivitu. Pro optimální inhibici heparanázy jsou proto potřeba sulfatované pentasacharidy a vyšší oligosacharidy.

Mnoho sulfatovaných cukrů bylo také testováno in vivo na antimetastatickou aktivitu (tabulka 1). Obecně platí, že je.poměrně dobrá korelace mezi inhibici heparanázy a antimetastatickou aktivitou. Sulfatovaný fosfát mannopentaózy a” sulfát 'maltohexaózy, dvě sloučeniny s nejvyšší inhibični aktivitou pro heparanázu, vykazují nejvyšši antimetastatickou aktivitu, fakticky se neliší podstatně od heparinu ve své schopnosti zabraňovat metastázi (tabulka .1)... Dvě jiné sloučeniny,_sulfát cyklooktaamylózy a sulfát stachyózy byly také poměrně účinnými antimetastatiky, což odpovídá střední inhibični aktivitě pro heparanázu. Souhrnně tyto údaje dokládájí, . že sulfatovaný fosfát mannopentaózy a sulfát maltohexaózy mají současně značnou antiangiogenní a antimetastatickou aktivitu a inhibični aktivitu pro heparanázu.

ř »> · * * r ♦ r r ·♦·,- · · · e 1» · r .

’ * · · » r ·♦ »««»··· f “ r

Antimetastatická aktivita maltózové série sulfatovaných oligosacharidů je detailněji uvedena na obrázku 4. Se vzrůstající délkou řetězce docházelo ke stálému nárůstu antimetastatické aktivity oligosacharidů, přičemž nejaktivnější byly penta-, hexa- a hepta-sacháridy. Při intravenózním podávání v dávce 2 mg/krysu nevykazoval sulfát maltózy žádný účinek na metastázu (obrázek 4A) , ale při subkutánním podání v dávce 4 mg/krysu byla pozorována zřetelná inhibice metastázy (obrázek 4). Následné experimenty potvrdily, že nezávisle na způsobu injekce (to je i. v., subcut. nebo i. p.) sulfatované oligosacharidy vykazovaly srovnatelnou antimetastatickou aktivitu (údaje nejsou uvedeny). Antimetastatická aktivita sulfátu maltózy byla ve skutečnosti pozorována pouze v případě, když byly zvířatům podávány vysoké dávky. Protože·sulfát maltózy je velmi slabý inhibitor heparanázy, tento výsledek naznačuje, že inhibice heparanázy nemusí být jediný způsob, kterým sulfatované oligosacharidy inhibují matastázování tumoru, zvláště v případě, když jsou užity vysoké dávky oligosacharidů.

Cykloamylózy byly sulfatovány a zahrnuty do výzkumu jakožto zástupci nelineárních oligosacharidů. Je zajímavé, že'tyto sloučeniny byly pouze středně aktivní (tabulka 1), což vede k závěru, že z hlediska optimální aktivity mohou být požadoványlinearní oligosacharidy. Kromě toho nej aktivnější sulfatované oligosacharidy byly mnohem účinnějšími inhibitory angiogenéze, metastázy a heparanázy, než suramin (tabulka 1), léčivo, které jev současnosti podrobováno klinickým zkouškám jakožto antiangiogenní sloučenina (Lelievre, S. a Larsen, A. K. (1994). Cancer Res. 54, 3993 - 3997).

r- r t *· * 1» r

• · ř rf * ® tr ♦ • * » f * ·

99 * · » 9 · ·* »

Protože antiangiogenní aktivita sloučenin ne vždy koreluje s jejich inhibiční aktivitou pro heparanázu, zdá se být pravděpodobné, že sulfatované oligosacharidy mohou inhibovat angiogenézi nějakým jiným mechanismem. Jak bylo -- -uvedeno - výše? je vysoce-.pravděpodobné, že _ ně které. _ sulfatované oligosacharidy-mohou rušit působeni angiogennich růstových faktorů tím, že ruší interakce růstový faktor - sulfát heparanu. Předchozí analýzy (viz — -- < X. - — X

AUC Z> íxitii OkÁii X ywXviiÍ.

že zkouška lidské angiogenéze použitá v tomto příkladě je dosti závislá na působení endogenního bFGF a v menším rozsahu na aFGF a VEGF. Proto byly různé sulfatované oligosacharidy testovány na svou schopnost působit jako kompetitory interakcí bFGF, aFGF a VEGF s heparinem nebo sulfátem heparanu.

Bylo zjištěno, že se vzrůstající délkou řetězce se sulfatované oligosacharidy maltózové série stávají stále účinnějšími inhibitory interakcí bFGF a aFGF se sulfáty heparanu z buněčného povrchu (tabulka 2), to znamená, že maltóza byla slabým inhibitorem, zatímco penta-, hexa- a hepta-sacharidy byly nej aktivnější. Sulfatovaný fosfát mannopentaózy také vykazoval značnou'inhibiční aktivitu * v tomto systému (tabulka 2). Úplné inhibiční křivky pro inhibici interakcí aFGF - sulfát heparanu sulfatovanými oligosacharidy maltózové série jsou uvedeny na obrázku 5.

- Další studie ukázaly, -že-sulfát-maltohexaózy je -také = silným inhibitorem vazby radioaktivně značeného heparinu k bFGF a aFGF (údaje nejsou uvedeny).

Protože sulfát maltohexaózy byl jednou z nejaktivnějšich antiangiogenních a antimetastatických sloučenin, byl dále detailněji zjišťován vliv stupně '47 » · r * r ♦ r * ♦ r · f r · e · r ♦ ♦ r • · ♦ r * ♦ · T «· * · sulfatace na jeho biologickou aktivitu. Zpočátku bylo pozorováno, že i když byla detekována určitá antikoagulační aktivita u nejvíce sulfatované maltohexaózy, tato aktivita byla ještě příliš nízká ve srovnání s heparinem (tabulka 2) . Se vzrůstající sulfatací však docházelo k neustálému nárůstu schopnosti maltohexaózy inhibovat aktivitu heparanázy a vazbu FGF k sulfátu heparanu (tabulka 2). Inhibiční aktivita však dosahovala nejvyšší úrovně u obou systémů, pokud sulfatace byla 85 % nebo větší.

Studie inhibice metastázy (obrázek 6) také ukázaly, že se vzrůstajícím stupněm sulfatace se sulfát maltohexaózy stává účinnějším antimetastatickým činidlem. V kontrastu s tím byl předpoklad, že velmi vysoce sulfatované maltohexaózy (90 až 100% sulfatace) jsou méně účinné inhibitory angiogenéze (obrázek 7). Tato data naznačují, že existují jemné rozdíly v optimální struktuře sulfatovaných oligosacharidů požadované k inhibici angiogenéze a metastázy. Přesto však byla zjištěna řada sulfatovaných oligosacharidů odvozených od přirozeně se vyskytujících oligosacharidů, které vykazují současně silnou antimetastatickou a antiangiogenní aktivitu. Těmito sloučeninami jsou sulfatovaný fosfát mannopentaózy z P. holstii a sulfáty maltopentaózy, maltohexaózy a maltoheptaózy.

Antiangiogenní a antimetastatická aktivita sulfatovaných syntetických oligosacharidů

Syntetické sulfatované oligosacharidy popsané v příkladech 1 až 5 byly také testovány na svoji biologickou aktivitu. Tabulka 3 shrnuje schopnost sulfatovaných syntetických oligosacharidů obsahujících mannózu, galaktózu nebo glukózu inhibovat koagulaci, působeni heparanázy a vazbu růstový faktor - sulfát heparanu. Všechny tyto testované syntetické sulfatované oligosacharidy vykazovaly nepatrnou antikoagulační aktivitu. Avšak, s výjimkou —trisacharidů mannózy.-a^glukózy, všechny ostatní sulfatované..

.oligosacharidy byly poměrně heparanázy a vazby růstový faktor sulfát heparanu

Celkový závěr je prakticky ten, že sulfatované synt r í 1 f Ί Δ až 6 hexózovvch jednotek /to ’ 1)·1ιΐ3ι11ιυ 2 3 / aiSKLOZd Rebo

F'.— τη;

-M y J- Xr JU j V j v těchto zkouškách. Výjimku tvoří sulfát galaktotriózy, který byl v podstatě stejně aktivní, jako jiné členy galaktózové série.

Při testování ve zkouškách lidské angiogenéze vykazovaly sulfatované mannózové oligosacharidy inhibiční aktivitu, ačkoli penta- a hexa-sacharidy byly více aktivní než tetrasahcaridy (obrázek 8), čímž se podobaly svou účinnosti sulfatovanému fosfátu mannopentaózy. Obdobně byly sulfatované mannózové tetra-, penta- a hexa-sacharidy stejně účinné jako sulfatovaný fosfát mannopentaózy jako antimetastatická léčiva (obrázek 9). Sulfatované oligosacharidy“obsahujíci galáktózu a sulfát glukohexaózy také inhibovaly metastázu (obrázek 10), ačkoli měly tendenci vykazovat slabě nižší aktivitu než sloučeniny obsahující mannózu.

Protizánětlivá aktivita sulfatovaných oligosacharidů

Jak bylo uvedeno výše, klíčovou bariérou vstupu leukocytů do zanícených míst je subendotheliální bazální membrána. Aby prošly touto membránou, musí leukocyty využít komplex degradativních enzymů (Stetler, S. W., Aznavoorian, r r

S. a Liotta, L. A. (1993) Annu. Rev. Cell Biol. 9, 541 573). Zvláště se to týká endoglykosidázy heparanázy, která štěpí řetězce sulfátu heparanu spojené s bazální membránou, a je nezbytná pro extravazaci leukocytů (Eldor., A., BarNer, N., Fuks, Z. a Vlodavsky, I. (1987). Semin. Thromb. Hemost. 13, 475 - 488; Nakajima, M., Irimura, T. a Nicolson, G.L. (1988) J. Cell Biochem. 36, 157 - 167). Ve * skutečnosti, jak dokládají studie věnující se inhibici metastázy (Parish, C. R., Coombe, D. R., Jakobsen, K. B., Bennett, F. A. a Underwood, P. A. (1987). Int. J. Cancer 40, 511 - 518), sulfatované polysacharidy, které inhibují aktivitu heparanázy, jsou silnými inhibitory zánětů (Willenborg, D. O. a Parish, C. R. (1988). J. Immunol. 140, 3401 - 3405; Bartlett, M. R., Cowden, W. B. a Parish, C. R. (1995). J. Leuk. Biol. 57, 207 - 213). Na základě těchto zjištění může odborník v oboru odvodit, že sulfatované oligosacharidy, které jsou silnými antiangiogenními a antimetastatickými činidly, budou velmi účinnými protizánětlivými sloučeninami. Zvláštní důležitost v tomto smyslu má sulfát maltohexaózy a sulfát mannopentaózy. Navíc, protože angiogenéze je spojená s chronickými zánětlivými chorobami, jako je revmatická arthritida (Folkman, J. a Brém, H. (1992) Angiogenesis and inflamation. „Inflamation. Basic Principles and Clinical „ Correlates. Eds Gallin, J.I., Goldstein, I. M a Sndrerman,

R. S., Raven Press, New York), angiogenní aktivita těchto sloučenin by mohla představovat další pozitivum při ošetření zánětů.

Důkazy potvrzující správnost těchto předpokladů byly získány u několika modelů zánětu u zvířat. Za prvé, sulfát * maltohexaózy, sulfát mannopentaózy a sulfatovaný fosfát mannopentaózy byly schopny výrazně inhibovat zánět vzduchového váčku vyvolaný thioglykolátem (tabulka 4).

Prakticky v jednom experimentu jediná injekce sulfátu mannopentaózy byla stejně účinná jako prednisolon při inhibici leukocytové infiltrace, která byla převážně co do

Žid QrUne, sUiiatuvaue uilyuoauuaxluy ioyxy í.eSW»aiij íia svojí schopnost inhibovat chronické astma na myším modelu. Tento model se vyznačuje masívním influxem eosinofilů do plic myší, který je indukován aeroalergenovým podnětem (Foster, P. S., Hogan, S. P., Ramsay, A. J., Matthaei, K. I. a Young, (1996). J. Exp. Med. 183, 195 - 201). Taková zánětlivá odezva je charakteristická pro chronické astma u lidí. Sulfát maltohexaózy a sulfát mannopentaózy při podávání prostřednictvím miniosmotických pump podstatně inhibovaly shromažďování eosinofilů v myších plicích (tabulka 5). Sulfát maltohexaózy také vykazoval určitou protizánětlivou aktivitu při podávání ve formě aerosolu (40 mg/ml roztoku).

Za třetí, jak sulfát mannopentaózy, tak sulfatovaný fosfát mannopentaózy výrazně inhibovaly EAE u krysího modelu choroby (tabulka 6). Některá zvířata ošetřená sulfatovanými oligosacharidy prakticky nevykazovala symptomy vývinu choroby . Tato data“ j sou“ ve shodě s - dřívějšími studiemi, které ukazovaly, že sulfatované polysacharidy, které inhibují aktivitu heparanázy mohou redukovat závažnost EAE (Willenborg, D. O. a Parish, C. R. (1988). J. Immunol. 140, 3401 - 3405),

9 • * r r

- 51 9

Za poslední, fosfát mannopentaózy byl zkoušen na svou schopnost inhibovat zánětlivou chorobu střev u myší. Tento model, který se vyvolává sulfátem dextranu v pitné vodě, indukuje kolitidu, která se podobá vředové kolitidě a, v menším rozsahu, Chronově chorobě. Bylo zjištěno, že v dávce 20 mg/kg/den sulfatovaný fosfát mannopentaózy způsoboval viditelné oslabení akutní kolitidy a také zabraňoval i snížení tělesné hmotnosti způsobené chorobou (tabulka 7).

s Kontrolní zvířata v tomto experimentu dostávala injekce sulfátu oligosacharidu, ale ne sulfát dextranu v pitné vodě.

ř' ’ . .

Ě • ♦ ♦ • *·»*** -- r

Tabulka 1

Inhibice lidské angiogenéze, heparanázové aktivity a metastázy sulfatovanými formami různých přirozeně se vyskytujících oligosacharidů

Sloučenina	Počet šáchatidov-ých jednotek	Antikoa- gůlační“ aktivita3 (%)	Koncentrace 50 % inhibice“! pg/ml)	Metastázý i O 1 . — ~ (•5?. jS.Oll”’ , troly)b
angiogenéze t.	heparanáza
heparin	přibližně 60 ‘	100	>2000	1	20±3
fosfát mannopentaózy SO4 C	5	0,2	2	2	31±3
ra f ί ηή?a ζΠ,	3	1,6	200	50	48±9
stachyóza S04	4	3,2	2000	12	36±4‘
maltóza SO4	2	0	2000	>1000	99±9
maltotetraóza SO4	4	CO v O	20	10	72±9
maltohexaóza SO4	6	1,6	2	1,5	24±7
cyklohexaamylóza SO4	6	0,4	200 '	8	107±7
cykloheptaamylóza SO4	7	O 00	200	7	81±14
cyklookaamylóza SO4	8	1,6	200	5	36±6
chondroitin tetra SO4	4	0	2000	>30	ND
chondroitin hexa SO4	6 -	0,2	... 2 000	-- 45.... ..	.. ND
chondroitin ' okta SO4	8	ND	1000.	ND	ND
suramin	-	0,1	50	8	74±8

a Antikoaguláční aktivita jako procenta aktivity heparinu (100 %) . _ _ _________x b Procento kontrolní metastázy ± standardní chyba průměru (n=4) v plicích krys, které obdržely 13762 MAT buňky i.v. a 2 mg/krysu každého oligosacharidů v době injekce tumorových buněk. Podtržené hodňoty představují složeniny s nejvyšším antimetastatickým účinkem.

c Fosfát mannopentoázy izolovaný z kvasinky Pichia holstii.

ND Nestanoveno.

9 t r · Tabulka 2

Inhibice heparanázové aktivity a vazby růstového faktoru na sulfáty heparanu sulfatovanym fosfátem mannopentaózy a maltózové série sulfatovaných oligosacharidů

Sulfatovaný oligosachar id ·.....	sulfatacea	% sulfatace	antikoagulační aktivita (%)b	IC50 (pg/ml)c
heparanáza	.. bFGF	aFGF
maltóza	6/8	75	0,2	>100	>200	134
maltotrióza	10/11	91	0,8	100	145	58,7
maltotetroáza	11/14	79	1,6	25	65	31,5
maltopentaóza	15/17	88	3,2	4 '	37,5	27
maltohexaóza	18/20	90	2	5	31,3	27
maltoheptaóza	18/23	78	3,9	'3	10	27
fosfát man- nopentaózy0	10/16	63	0,2	5	25	22
maltohexaóza	3/20	15	0	>100	187	>200
maltohexaóza	9/20	45	0, 8	50	45, 6	79
maltohexaóza	14/20	70	0,4	20	12,5	12,5
maltohexaóza	17/20	85	1,7	6	5,4	10, 4
maltohexaóza	18/20	90	2	6	5,4	18, 8
maltohexaóza	20/20	100	3,3	5	5,4	19, 7

a Dosažený skutečný počet sulfátových skupin/teoretický maximální počet sulfátových skupin, které mohou být navázány na každou molekulu.

b Antikoagulační aktivita jako procento aktivity heparinu (100%).

Γ c Koncentrace sloučeniny požadovaná k inhibici 50 % heparanázové aktivity lidských destiček, nebo vazby myších buněk 3T3 k imobilizovanému aFGF/bFGF. V případě heparanázové zkoušky bylo IC50 pro heparin 2 pg/ml.

d Fosfát mannopentaózy izolovaný z kvasinky Pichia holstii.

ND = Nestanoveno.

ř· í St/

Tabulka 3

Inhibice heparanázové aktivity, sul táty neparanu suirauova-uynix oligosacharidů

Sulfatovaný oligosacharid	sulfatace“	% sulfatace	antikoagulační aktivita (%)b	IC50 (pg/ml)c j i
heparanáza	bFGh	aFGF
mahnotrióza	7/11	z- A 04	0,3	__ O £	ND	ND
manno- L «Ξ L-1- d z, ct	iu/14	i i		zr	9 Ω	η
mannopentaóza .	12/17	71	0,4	4	15	5
mannohexaóza	11/20	55	0, 8	3	11	5
galaktotrióza	6,6/11	60	0,7	4	25	ND
galaktotetraóza	8,3/14	59	1,0	3, 5	9	ND
galaktohexaóza	14,5/17	72,5	0,7	3, 5	11	ND
glukotrióza	ND	ND	0,1	30	47	ND
glukohexaóza	13,4/20	67	0,4	3, 5	15	ND

a Dosažený skutečný počet sulfátových skupin/teoretický maximální počet sulfátových skupin, které mohou být navázány na každou molekulu.

b Antikoagulačňí heparinu (100%).

aktivita jako

aktivity c Koncentrace sloučeniny požadovaná k inhibici 50 % heparanázové aktivity lidských destiček, nebo vazby myších buněk 3T3 k imobilizovánému aFGF/bFGF. V případě heparanázové zkoušky bylo IC5O pro heparin 2 pg/ml.

ND = Nestanoveno.— ...

- 55 tTabulka 4

Účinek sulfatovaných oligosacharidů na zánět vzduchového váčku^a

Ošetření	dávka	leukocytový infiltrát ve vzduchovém váčkub (% kontrolv)
příklad 1	příklad 2
maltohexaóza S04	50 mg/kg	76 ± 7	44 ± 12
mannopentaóza S04	50 mg/kg	57 ± 7	16 ± 2
fosfát mannopentaózy (P. holstii) S04	50 mg/kg	ND	51 ± 9
prednisolon	25 mg/kg	56 ± 14	44 ± 3

a Zánět vzduchového váčku byl vyvolán injekcí thioglykolátu a influx leukocytů vyhodnocován po 17 hodinách. Léčivo bylo podáváno subkutánní injekcí ve stejné době jako thioglykolát pro příklad 1. U příkladu 2 byly sulfatované oligosacharidy injektovány subkutánně 0 a 7 hodin po injekci thioglykollátu.

b Údaje jsou prezentovány jako procento počtu leukocytů v infiltrátech vzduchového váčku u kontrolních zvířat ± standardní chyba průměru. Kontrolním zvířatům byl injektován thioglykolát, ale neobdržela žádné léčivo, pouze injekci fyziologického roztoku. Pozadí leukocytového infiltrátu ve vzduchových váčcích těch, která dostala pouze injekci fyziologického roztoku, bylo 9 ± 2 % toho, které bylo pozorováno po injekci thioglykolátu.

ND = Nestanoveno.

Tabulka 5

Účinek sulfatovaných oligosacharidů na ovalbuminem (OVA) indukovanou akumulaci’ eosinofilů v myších plicích³

Sulfatovaný oligosacharid	forma podání	dávka	eosinofily/ml BALF (% kontroly)13
maltohexaóza	pumpa, i.p.	50 mg/kg/den	57 ± 2
maltohexaóza	pumpa, i.p.	115 mg/kg/den	9 ± 7
maltohexaóza	aerosol	10 mg/mlc	98 ± 24
maltohexaóza	aerosol	40 mg/mlc	63 ± 23
mannopentaóza	pumpa, i.p.	50 mg/kg/den	63 ± 12

a Myši byly senzitivovány k OVA a poté byl indukován plicni influx eosinofilů podáním aerosolu OVA. Sulfatované oligosacharidy byly podávány buď i.p. pomocí lux li j. osuto u i c Kýcn ρυπιρ aerosol.

M.

kontrolu tvořila b Údaje jsou vyjádřeny jako procenta z počtu eosinofilů v bronchoalveoTární výplachové tekutině (BALF) kontrolních zvířat ± standardní chyba, zvířata, která byla aktivována OVA a obdržela fyziologický roztok buď prostřednictvím miniosmotických pump, nebo prostřednictvím ©líc iako aerosol.

Ji

IVVIXV'-. aerosolu.

e sulfatovaných oligosacharidů v roztoku

Tabulka 6

Účinek sulfatovaných oligosacharidů na adoptivně přenesenou experimentální autoimunní encephalomyelitis (EAE)^a

Sulfatovaný oligosacharidb	počet s EAE/ celkový počet	průměrný denní náporc	úpornost choroby (% kontroly)0
kontrola	6/6	5,5 ± 0,2	100 ± 11
mannopentaóza	3/5	5,3 ± 0,3	31,5 ± 15,1
fosfát mannopentaózy (P. holstii) . ·	4/5	5,3 ± 0,3	47,9 ± 16,4

a EAE byla indukována u Lewísových krys pomocí EAE efektorových buněk aktivovaných 30 x 10⁶ ConA.

b Sulfatované oligosacharidy byly podávány subkutánně miniosmotickými pumpami zavedenými v době buněčného přenosu, které dodávaly dávku 70 mg/kg/den.

c Průměrný denní nápor EAE u zvířat, u kterých se rozvinula choroba.

d Úpornost choroby představuje kumulativní klinické skóre u zvířat.

» » • ·

♦ r • * • » r r r

• »

Tabulka 7

Účinek sulfatovaného fosfátu mannopentaózy na zánětlivou chorobu střev u myši³

Denb	neošetřené0	ošetřené0
průměrné hodnocení choroby (skóre)d	tělesná hmotnost (gm)	průměrné hodnocení choroby (skóre)d	tělesná hmotnost (om)
0	0	23,1	0	22,1
1	0	23,2	0	22,1
2	0	23, 6	0	22, 6
3	0	23,5	0	22,5
4	0	23, 3	0	21, 9
5	0	23,4	0	21,9
6	0,47	23, 3	0, 07	22, 4
7	1,40	22,7	0, 40	22,4
8	2, 47	22,1	0, 40	22,3
9	2,87 '	21,4	0, 67	22,2
10	2,00	20,7	0, 93	22,1

a Zánětlivé onemocnění střev bylo vyvoláno podáváním sulfátu dextranu v pitné vodě.

b Dny od začátku podávání sulfátu dextranu.

> . ,1 c Neošetřená zvířata obdržela třikrát denně injekce vehikula, zatímco ošetřená zvířata dostávala třikrát denně injekce sulfatovaných fosfátů mannopentaózy v dávce 20 mg/kg/den.

d Střední hodnocení (skóre) představuje sumu hodnocení průjmu a rektálního krvácení pro zvířata v každém časovém okamžiku.

| ______ a

- -€3

Odkazy

1. Dietrich, C. P., Ňader,· Η- B, . Straus, A. J. (1983), Biochem. Biophys. Res. Comm. 111, 865 - 871.

2. Kjellen, L.,

Lmaarii, u.

Rev. Biochem. 60,

Q Q Q Γ?. C1?P .T ?

\ X / g 1. 1_| 1-J W « tg

1023 - 1030

4. Esko, J. D. (1991), Curr. Opin. Cell Biol. 3, 805 - 816.

5. Cole, G. J., Akeson, R. (1989) Neuron 2, 1157 - 1165

6. Coombe, D. R., Watt, S. M. a Parish C. R. Blood 84, 739

- 752

7. Yayon, A., Klagsbrun, M., Esko, J. D., Leder, P. a Ornitz, D. M. (1991). Cell 64, 841 - 848.

8. Rapraeger, A. C., Krufka, A. a Olwin, B. B. (1991) . Science 252, 1705 - 1708.

9. Gitay-Goren, H., Soker, S., Vlodavsky, I. a Neufeld, G.

(1992), J. Biol. Chem. 267, 6093 - 6098. .

10. Yurcnenco, P. D. a Schittny, J. C. (1990) FASEB J. 4, 1577 - 1590

11. Stetler, S. W., Aznavoorian, S. a Liotta, L. A. (1993)

Annu. Řev. Cell Biol. 9, 541 - '573

12. Eldor., A., Bar-Ner, N., Fuks, Z. a Vlodavsky, I.

(1987). Semin. Thromb. Hemost. 13, 475 - 488

13. Nakajima, M., Irimura, T.' a Nicolson, G.L. (1988) J.

Cell Biochem. 36, 157 - 167

-/64-

14. Turnbull, J. E., Fernig, D. G., Ke, Y., Wilkinson, M. C. a Gallagher, J. T. (1992) J. Biol. Chem. 267, 10337 10341

15. Mach, H., Volkin, d., Burke, C. J., Middaugh, C. R., Linhardt, R. J., Fromm, J. R a Loganathan, D. (1993), Biochemistry 32, 5480 - 5489

16. Nurcombe, V., Ford, M. D., Windschut, J. A. a Bartlett, P. F. (1993), Science 260, 103 - 106.

17. Spivak-Kroizman, T., Lemmon, M. a., Dikic, I., Ladbury, J. E., Pinchasi, D., Huang, J., Jaye, M., Crumley, G., Schlessinger, J. a Lax, I., Cell 79, 1015 - 1024

18. Folkman, J. a Brém, H. (1992) Angiogenesis and inflamation. „Inflamation. Basic Principles and Clinical

Correlates. Eds Gallin, J.I., Goldstein, I. M a

Sndrerman, R. S., Raven Press, New York

19. Folkman, J.(1991) Tumor angiogenesis, „Cancer Medicine, Ed Holland, J. F., Lea & Febinger, Philadelphia

20. Folkman, J. a Klagsbrun, M. (1987) Science 235, 442 447

21. Ratner, S. (1992) Invasion Metastasis 12, 82 - 100

22. Mora, P. T. a Wood, D., J. Amer. Chem. Soc. 80, 693

23. 0'Colla, P. s. a Lee É. E., (1964) . Chem. Soc. 2351 2354

24. Evans W. L., Reynolds, D. D. a Talley, E. A., (1951)

Adv. Carbohyd. Chem. 6, 27.

25. Goldstein, I. J. a Hullar, T. L., (1966) Adv. Carbohyd.

Chem. 21, 431 - 512

26. Haq S. a Whelan, W. J., (1956) J. Chem. Soc. 4543

6*

- ,β-5

27.	Okada,	M., Sumitorno,	H., Sumi K. a Sugimoto,	T., (1984)
J.	Amer.	Chem. Soc. 17,	2451 - 2453.
28.	Okada,	M., Sumitorno,	H., Hirsawa, T., Ihara,	K. a Tada,

Y., (1986) Polym. J., (Tokyo), 18, 601 - 611

29. ”Ó~CÓÍÍa^ ΡΪ šTa Hc^rath; D; ΓΊΪ9 62 nchemflnd 1,^17 8^

179 .

30. McGrath, D., Lee, E. E. a 0'Cola, P. S. (1969)

Carbohvdrate Res., 11. 453 - 460

RcynoJ-dti/ u . 'D. a &Vcins_z (1947), 69, 66

32. Glaser, J. H. a Conrad, Η. E. (1979) J. Biol. Chem.

254, 6588 - 6597

33. Anderson, R. F., Cadmus, M. C., Benedict, R. G. a Slodki, Μ. E. (1960) Arch. Biochem. Biophys. 89, 289 292

34. Bretthauer, R. K., Kaczorowski, G. J. a Weise, M. J. (1973) Biochemistry 12, 1251 - 1256.

35. Parish, C. R., Coombe, D. R., Jakobsen, K. B., Bennett, F. A. a Underwood, P. A. (1987). Int. J. Cancer 40, 511 v - - 518 ..... ... . ....... „ . ...

36. Guo, Y. a Conrad, Η. E. (1989). Anal. Biochem. 176, 96 - 104

37. Rylatt, D. B., Sia, D. Y., Mundy, J. R. a Parish, C. R.

(1981). Eur. J. Biochem. 119, 641 - 646 ~

38. Brown, K. J., Henry, I. A. a Parish, C. R. (1995) Exp. Cell Res. 217, 132 - 139

39. Brown, K. J. a Parish, C. R. (1994). Biochemistry 33, 13918 - 13927.

- 6^-

40. Forrest, M. J., Brooks, P. M., Takagi, T. a Kowanko, I. (1988). „CRC Handbook of Animal Models for the Rheumatic Diseases. Eds.. Greenwald, R. A. and Diamond, K. S., CRS Press, Boča Raton, vol. 1, str. 125

41. Foster, P. S., Hogan, S. P., Ramsay, A. J., Matthaei,

K. I. a Young, (1996). J. Exp. Med. 183, 195 - 201

42. Lelievre, S. a Larsen, A. K. (1994). Cancer Res. 54, 3993 - 3997

43. Willenborg, D. O. a Parish, C. R. (1988). J. Immunol. 140, 3401 - 3405

44. Bartlett, M. R., Cowden, W. B. a Parish, C. R. (1995). J. Leuk. Biol. 57, 207 - 213.

Claims (24)

1. Sulfatovaný oligosacharid# kde oligosacharid má. obecný vzorec I:

Ri-(Rx)n-R₂ ^: ‘(if kde Ri a R₂ a každý R_x představují monosacharidovou jednotku, z nichž všechny mohou být stejné nebo různé, přičemž sousední monosacharidové jednotky jsou vázány glvkosidickými vazbami l->2, l->3, l->4 a/nebo l->6 a n je celé číslo od 1 do 6.

2. Sulfatovaný oligosacharid podle nároku 1, kde n je od 1 do 4, výhodně 3 nebo 4.

3. Sulfatovaný oligosacharid podle nároku 1 nebo nároku 2, kde monosacharidové jednotky jsou hexózy vybrané ze skupiny obsahující fruktózu, glukózu, mannózu, altrózu, allózu, talózu, galaktózu, idózu a gulózu.

4. Sulfatovaný oligosacharid podle nároku 1, kde oligosacharid má obecný vzorec II:

Ry~(Ry)n^-Ry (¹¹) kde všechny skupiny R_y jsou stejné a každá představuje monosacharidovou jednotku, přičemž sousední monosacharidové jednotky jsou spojeny glykosidickými vazbami 1—>3, 1—>4 a/nebo l->6; a n je celé číslo od 1 do 6.

5. Sulfatovaný oligosacharid podle nároku 4, kde n je do 1 do 4, výhodně 3 nebo 4.

£3

6. Sulfatovaný oligosacharid podle nároku 4 nebo nároku 5, kde R_y představuje monosacharidovou jednotku, kterou je hexóza vybraná ze skupiny sestávající z glukózy, mannózy, altrózy, allózy, talózy, galaktózy, idózy a gulózy.

7. Sulfatovaný oligosacharid podle nároku 6, kde R_y představuje glukózu, mannózu nebo galaktózu.·

8. Sulfatovaný oligosacharid podle nároku 1, kde oligosacharid je přirozeně se vyskytující oligosacharid.

9. Sulfatovaný oligosacharid podle nároku 8, kde oligosacharid je vybrán z rafinózy a stachyózy. .

10. Sulfatovaný oligosacharid podle nároku 1, kde oligosacharid je připraven enzymatickou nebo chemickou degradací přirozeně se vyskytujícího polysacharidu.

11. Sulfatovaný oligosacharid podle nároku 10, kde oligosacharid je oligosacharid odvozený od amylózy, chondroitinu nebo dextranu.

12. Sulfatovaný oligosacharid podle nároku 11, kde oligosacharid je vybraný z maltotetraózy, maltopentaózy, maltohexaózy, glukotriózy, glukotetraózy, glukopentaózy a tetra-, hexa- a oktasacharidů chondroitinu.

13. Sulfatovaný oligosacharid podle nároku 10, kde oligosacharid je fosfát mannopentaózy z kvasinky Pichia holstii.

- /6Ů - • *

14. Způsob antiangiogenního, antimetastatického a/nebo protizánětlivého ošetření pacienta, kterým je člověk nebo jiný teplokrevný živočich, který potřebuje takové ošetření, které zahrnuje podávání účinného množství alespoň jednoho oligosacharidů podle nároků 1 až 13 pacientu.

15. Použití sulfatovaného oligosacharidů podle některého z nároků 1 až 13 jako antiangiogenního, antimetastatického a/nebo protizánětlivého činidla při ošetření pacienta, kterým je teplokrevný živočich (včetně člověka)._ &

16. Způsob nebo použití podle nároku 14 nebo nároku 15, kde ošetření zahrnuje ošetření angiogenně dependantních chorob, včetně angiogenéze spojené s růstem pevných tumorů, proliferativní retinopathií a revmatickou arthritidou.

17. Způsob nebo použití podle nároku 14 nebo nároku 15, kde ošetření zahrnuje ošetření zánětlivých chorob a stavů, ve kterých inhibiční aktivita pro heparanázu inhibuje infiltraci leukocytů, včetně chronických zánětlivých chorob, jako je revmatická arthritida, roztroušená skleróza, diabetes mellitus závislý na insulinu;

jako je vředová kolitis a Crohnova zánětlivá choroba střev, allograftová rejekce a chronické astma.

18. Farmaceutická nebo veterinární kompozice pro antiangiogenní, antimetastatické a/nebo protizánětlivé ” ošetření, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden sulfatovaný oligosacharid podle některého z nároků 1 až 13, spolu s jejich farmaceuticky a veterinárně přijatelným nosičem nebo ředidlem.

- 6Γ-

19. Použiti alespoň jednoho sulfatovaného oligosacharidů podle některého z nároků 1 až 13 při výrobě farmaceutického prostředku pro antiangiogenní, antimetastatické a/nebo protizánětlivé ošetření pacienta, kterým je člověk nebo jiný teplokrevný živočich.

20. Oligosacharid obecného vzorce II:

R_y-(R_y)_n-Ř_y (II) kde všechny skupiny R_y jsou stejné a každá představuje monosacharidovou jednotku, přičemž sousední monosacharidové jednotky jsou vázány glykosidickými vazbami 1—>3, Ί—>4 a/nebo l-»6; a n je celé číslo od 1 do 6.

21. Oligosacharid podle nároku 20, kde n je od 1 do 4, výhodně 3 nebo 4.

22. Oligosacharid podle nároku 20 nebo nároku 21, kde R_y představuje monosacharidovou jednotku, kterou je hexóza vybraná ze skupiny obsahující glukózu, mannózu, altrózu, allózu, talózu, galaktózu, idózu a gulózu.

23. Oligosacharid podle nároku 22, kde R_y představuje glukózu, mannózu nebo galaktózu.

24. Oligosacharid podle nároku 20 kde R_y je zcela 0acetylovaný monosacharid, nebo kde R_y je monosacharid zcela O-esterifikovaný s acylovou polovinou jinou než acetyl.