BR9608041B1

BR9608041B1 - oligossacarìdeo sulfatado, e, composição farmacêutica ou veterinária para tratamento anti-angiogênico, anti-metastático e/ou anti-inflamatório.

Info

Publication number: BR9608041B1
Application number: BRPI9608041-8A
Authority: BR
Inventors: Christopher Richard Parish; William Butler Cowden
Priority date: 1995-04-28
Filing date: 1996-04-24
Publication date: 2012-02-22
Also published as: ZA963339B; IL118047A; EA001199B1; FI974060A; MX9708289A; JPH11504018A; BR9608041B8; WO1996033726A1; JP4514240B2; KR19990008198A; HUP9802394A2; CN1183043A; NO974911L; EE9700277A; IS4596A; CA2218872C; AUPN261895A0; DE69638158D1; EA199700347A1; KR100591960B1

Description

"OLIGOSSACARÍDEO SULFATADO, Ε, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA OU VETERINÁRIA PARA TRATAMENTO ANTI-ANGIOGÊNICO, ANTI-METASTÁTICO E/OU ANTI- INFLAMATÓRIO"

CAMPO DA INVENÇÃO

A apresente invenção refere-se a oligossacarídeos sulfatados, à sua preparação e uso como agentes anti-angiogênicos, anti-metastáticos e/ou anti-inflamatórios.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os sulfatos de heparan pertencem à família do glicosaminoglicano de polissacarídeos. Eles estão presentes na maior parte dos animais multicelulares e têm uma distribuição onipresente, sendo expressos na superfície da célula e nas matrizes extracelulares (ECM) da maior parte dos tecidos (1, 2). Os sulfatos de heparan ocorrem normalmente como proteoglicanos, e tem havido um progresso considerável na colocação em seqüência e clonagem dos polipeptídeos centrais da molécula. Até o presente, por exemplo, pelo menos oito polipeptídeos centrais de proteoglicano de sulfato de heparan (HSPG) diferentes foram identificados na superfície da célula (3).

Inicialmente, considerava-se que os HSPGs desempenhavam principalmente um papel estrutural na superfície da célula e nas ECMs. No entanto, as cadeias de sulfato de heparan apresentam uma diversidade estrutural marcante (2, 4) que sugere que elas podem fornecer importantes informações de sinalização para muitos processos biológicos. Desse modo, embora as cadeias de sulfato de heparan sejam inicialmente sintetizadas como uma repetição alternativa simples de resíduos de glucuronosil e N- acetil glucosaminil unidos por ligações β 1-4 e α1-4, há muitas modificações subsequentes. O polissacarídeo é N-desacetilado e N-sulfatado, e é submetido a seguir a epimerização em C5 das unidades de glucuronosil em unidades iduronosil, e várias O-sulfatações dos resíduos de urosonil e glucosaminil. A variabilidade dessas modificações permite umas trinta seqüências de dissacarídeos diferentes que, quando arranjadas em ordens diferentes ao longo da cadeia de sulfato de heparan, podem resultar teoricamente em um número enorme de estruturas de sulfato de heparan diferentes. A esse respeito, o anticoagulante heparina de polissacarídeo, presente apenas em grânulos de células da mama, representa uma forma extrema de sulfato de heparan onde a epimerização e a sulfatação foram maximizadas. A maior parte dos sulfatos de heparan contém trechos curtos de resíduos altamente sulfatados unidos por trechos relativamente longos de unidades não sulfatadas.

Há agora uma clara evidência de que os sulfatos de heparan desempenham um papel crítico em uma ampla gama de processos biológicos (2-4). Em particular, eles podem agir como ligantes para as moléculas de aderência envolvidas nas interações de célula-célula (5, 6), participam nas interações de célula-ECM (5, 6) e agem como receptores de superfície de célula essenciais para fatores de crescimento tais como o fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF) (7, 8) e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (9). Os HSPGs também constituem um componente chave das membranas da base, o que representa uma grande barreira à migração das células (10). As barreiras de membranas da base só podem ser rompidas quando as células desenvolvem uma gama de enzimas degradativas (11) que incluem uma endoglicosidase, chamada de heparanase, que cliva as cadeias de sulfato de heparan (12, 13).

Foi observado que muitos dos processos biológicos nos quais os sulfatos de heparan participam envolvem o reconhecimento das estruturas de sulfato de heparan singulares, onde a posição dos sulfatos na cadeia de polissacarídeo é de importância crítica (3). Por exemplo, foi demonstrado que as seqüências de sulfato de heparan definidas são reconhecidas por FGF ácido e básico (14-16) e clivadas por heparanases. Com base nessas observações, um objetivo dos autores da presente invenção foi a sintetização de oligossacarídeos sulfatados que bloqueiam o reconhecimento de sulfato de heparan por fatores de crescimento, e inibem a clivagem de sulfatos de heparan por heparanases. No caso do bloqueio de fatores de crescimento, foi considerado que um imitação de baixo peso molecular de sulfato de heparan deve ser particularmente eficaz, uma vez que agora se acredita que os sulfatos de heparan da superfície da célula mediam a reticulação de fatores de crescimento ligados a seus receptores (17). Além disso, os oligossacarídeos sulfatados devem ser inibidores de heparanase eficazes ao agirem como substratos não cliváveis dessa enzima.

Os oligossacarídeos sulfatados com atividade inibidora de fator de crescimento têm uma série de usos clínicos. Os fatores de crescimento de ligação de heparina/sulfato de heparan, tais como bFGF e VEGF, são indutores potentes de angiogênese (18). Nos adultos, a angiogênese é uma ocorrência relativamente rara, exceto durante a cura de ferimentos. No entanto, há uma série de "doenças dependentes de angiogênese" em adultos onde a angiogênese é criticamente importante (18- 20). A mais importante delas é a angiogênese associada com o crescimento de tumores sólidos, retinopatias proliferativas e artrite reumatóide. Os oligossacarídeos sulfatados que bloqueiam a ação de fatores de crescimento angiogênicos chaves, tais como bFGF e VEGF, devem ser particularmente úteis no tratamento dessas doenças dependentes de angiogênese.

De maneira análoga, os oligossacarídeos sulfatados que inibem a ação da heparanase têm uma série de aplicações clínicas. A membrana de base subendotelial representa uma grande barreira física à passagem das células endoteliais, células de tumores e leucócitos através da parede do vaso sangüíneo. A enzima de heperanase, combinada com uma gama de enzimas proteolíticas (por exemplo, plasmin, metaloproteinases de matriz), desempenha um papel essencial na degradação da membrana da base ao invadir as células (11-13, 21). Desse modo, com o impedimento da degradação de membrana da base, os oligossacarídeos sulfatados com atividade inibidora de heparanase devem apresentar atividade anti- metastática e anti-inflamatória, e além disso podem inibir os estágios iniciais da angiogênese. O uso de oligossacarídeos sulfatados que inibem simultaneamente o fator de crescimento angiogênico e a enzima de heparanase deve ser o preferido em muitas situações clínicas, por exemplo, no tratamento de tumores sólidos altamente metastáticos e de artrite reumatóide.

O Pedido de Depósito de Patente de Invenção Internacional No. PCT/AU88/00017 anterior (Publicação No. WO 88/05301) apresenta o uso de polissacarídeos sulfatados tais como heparina e heparina modificada, fucoidina, sulfato de pentosan, sulfato de dextrano e carragenano lambda, que bloqueiam ou inibem a atividade da heparanase, no tratamento anti- metastático e/ou anti-inflamatório de um paciente animal ou humano.

No trabalho que levou à presente invenção, os autores da invenção prepararam oligossacarídeos sulfatados ao usarem oligossacarídeos de ocorrência natural ou oligossacarídeos totalmente sintéticos contendo homopolímeros contendo hexose. Foi demonstrado que alguns desses compostos são inibidores potentes de angiogênese humana, metástase de tumor e inflamação. Os dados obtidos são compatíveis com os oligossacarídeos sulfatados que apresentam os seus efeitos biológicos ao inibirem a ação do fator de crescimento angiogênico e/ou a função da heparanase, e foram obtidos determinados oligossacarídeos sulfatados que são inibidores potentes da angiogênese e da atividade da heparanase. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com um aspecto, a presente invenção apresenta oligossacarídeos sulfatados, nos quais o oligossacarídeo tem a fórmula geral I:

R1-(Rx)11-R2 (I)

na qual:

R1 e R2 e cada Rx representam uma unidade de monossacarídeo, sendo que todos eles podem ser idênticos ou diferentes, e as unidades de monossacarídeos adjacentes são ligadas por ligações glicosídicas 1->2, 1->3, 1->4 e/ou 1->6; e

η é um número inteiro positivo de 1 a 6.

Os oligossacarídeos sulfatados de acordo com a presente invenção são baseados em polímeros de unidades de monossacarídeo, os quais podem ser ligados por ligações glicosídicas 1->2, 1->3, 1->4 e/ou 1->6 e que podem consistir em três a oito unidades de monossacarídeos. De preferência, os oligossacarídeos consistem em três a seis unidades de monossacarídeos (ou seja, η varia de 1 a 4), com maior preferência de cinco a seis unidades de monossacarídeos (n varia de 3 a 4). Os polímeros podem compreender homopolímeros contendo apenas um tipo de unidade de monossacarídeo, ou heteropolímeros contendo dois ou mais tipos diferentes de unidades de monossacarídeos.

As unidades de monossacarídeos que são ligadas entre si para formar os oligossacarídeos são de preferência hexoses, e podem ser furanoses tal como a frutose, ou piranoses tais como glicose, manose, alose, talose, galactose, idose ou gulose. As hexoses podem estar na configuração D ou L.

Em um aspecto particular da presente invenção, são apresentados novos oligossacarídeos sintéticos que têm a fórmula geral II:

Ry-(Ry)n-Ry(H)

na qual: cada grupo Rv é o mesmo, e cada um representa uma unidade de monossacarídeo, sendo que as unidades de monossacsndeo adjacentes são ligadas por ligações glicosídicas 1->3, 1->4 e/ou 1->6; e

η é um número inteiro positivo de 1 a 6.

Neste aspecto particular, a invenção também apresenta oligossacarídeos sulfatados, nos quais o oligossacarídeo tem a fórmula geral II acima.

De preferência, nos oligossacarídeos homopoliméricos de fórmula II, a unidade de monossacarídeo é uma hexose tal como glicose, manose, altrose, alose, talose, galactose, idose ou gulose. De preferência, nesses oligossacarídeos também η varia de 1 a 4, e com maior preferência é 3 ou 4.

Os oligossacarídeos de fórmulas gerais I e II também incluem compostos nos quais as unidades de monossacarídeos são derivatizadas, em particular onde as unidades são fosfato, acetila ou outros derivados de éster de monossacarídeos.

Em geral, os oligossacrídeos da presente invenção podem ser preparados através da sulfatação dos oligossacarídeos por métodos conhecidos 'per se' no estado da técnica para que se obtenha os seus derivados O-sulfatados correspondentes. Os métodos de sulfatação adequados estão exemplificados a seguir. Os oligossacarídeos a serem sulfatados podem ser produtos de ocorrência natural que incluem os oligossacarídeos de ocorrência natural como se apresentam (por exemplo, rafinose e estaquiose), bem como os oligossacarídeos preparados por meio de degradação enzimática ou química de polissacarídeos de ocorrência natural (por exemplo, meltotetraose, maltopentoase e malto-hexaose; glicotriose; glicotetraose e glicopentaose; tetra-, hexa- e octa-sacarídeos de condroitina; e fosfato de manopentaose do levedo Pichia holstií).

Tal como descrito acima, foi observado que os oligossacarídeos que se enquadram no âmbito da presente invenção apresentam atividade inibidora de heparanase e/ou inibidora de fator de crescimento e, por conseguinte, em um outro aspecto da presente invenção, estende-se ao uso de um oligossacarídeo sulfatado tal como descrito acima como agente anti-angiogênico, anti-metastático e/ou anti-inflamatório no tratamento de um paciente animal de sangue quente (incluindo um ser humano).

Desse modo, a presente invenção estende-se a um método para o tratamento anti-angiogênico, anti-metastático e/ou anti-inflamatório de um paciente humano ou outro paciente animal de sangue quente que precisa desse tratamento, o qual compreende a administração de uma quantidade eficaz de pelo menos um oligossacarídeo sulfatado tal como descrito acima ao paciente.

O componente ativo é administrado em quantidades terapeuticamente eficazes. Uma quantidade terapeuticamente eficaz significa a quantidade necessária pelo menos parcialmente para se obter o efeito desejado, ou para retardar o início, inibir o andamento, ou interromper por completo o início ou o andamento da condição particular que estiver sendo tratada. E claro que essas quantidades irão depender da condição particular que estiver sendo tratada, da gravidade da condição e dos parâmetros do paciente individual incluindo a idade, a condição física, o tamanho, o peso e o tratamento concomitante. Esses fatores são bem conhecidos dos elementos versados na técnica e podem ser atacados com apenas uma experimentação de rotina. Em geral, é preferível que seja usada uma dose máxima, ou seja, a dose que for a mais segura de acordo com o julgamento médico de peso. No entanto, deve ficar entendido pelos elementos versados na técnica que uma dose menor ou uma dose tolerável pode ser administrada por motivos médicos, motivos psicológicos ou virtualmente por outros motivos.

A invenção também se estende ao uso na fabricação de um medicamento para o tratamento anti-angiogênico, anti-metastático e/ou anti- inflamatório de um paciente humano ou outro paciente animal de sangue quente de pelo menos um oligossacarídeo sulfatado tal como descrito acima.

Além disso, a presente invenção apresenta uma composição farmacêutica ou veterinária para o tratamento anti-angiogênico, anti- metastático e/ou anti-inflamatório, a qual compreende pelo menos um oligossacarídeo sulfatado tal como descrito acima, junto com um veículo ou diluente farmacêutica e veterinariamente aceitável para ele.

A formulação dessas composições terapêuticas é bem conhecida dos elementos versados neste campo. Os veículos e/ou diluentes farmacêutica ou veterinariamente adequados aceitáveis incluem todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, cargas, veículos sólidos soluções aquosas, revestimentos, agentes bactericidas e fungicidas, agentes isotônicos e retardadores de absorção, e outros do gênero. O uso desses meios e agentes para as substâncias farmacêutica e veterinariamente ativas é bem conhecido no estado da técnica, e está descrito, a título de exemplifícação, em RemingtonfS Pharmaceutical Sciences, 18a. edição, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA. Exceto quanto ao caso em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o ingrediente ativo, o seu uso nas composições farmacêuticas e veterinárias da presente invenção é contemplado. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados às composições.

E especialmente vantajoso formular as composições em forma de unidades de dosagem para facilitar a administração e a uniformidade da dosagem. A forma de unidade de dosagem, tal como aqui empregada, refere- se a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos humanos ou animais a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de ingrediente ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo e/ou diluente farmacêutico ou veterinário requerido. As especificações para as novas formas de unidade de dosagem da invenção são ditadas e dependem diretamente (a) das características singulares do ingrediente ativo e do efeito terapêutico particular a ser obtido, e (b) das limitações inerentes o estado da técnica de composição desse ingrediente ativo para o tratamento particular.

Os oligossacarídeos sulfatados da presente invenção podem ser usados no tratamento de doenças dependentes de angiogênese, incluindo a angiogênese associada com o crescimento de tumores sólidos, retinopatias proliferativas e artrite reumatóide, bem como no tratamento de doenças inflamatórias e condições nas quais a atividade inibidora de heparanase dos oligossacarídeos sulfatados deve ser particularmente útil na inibição da infiltração de leucócitos, incluindo doenças inflamatórias crônicas nas quais a infiltração de leucócitos é um elemento chave, tais como artrite reumatóide, esclerose múltipla, diabetes mellitus dependente de insulina, doenças inflamatórias do intestino tais como colite ulcerativa e doença de Chron, rejeição a aloenxerto e asma crônica.

Em todo o presente relatório descritivo, exceto onde o contexto exija o contrário, a palavra "compreendem", ou variações tais como "compreende" ou "que compreende", deve ser entendida como implicando na inclusão de um número inteiro positivo ou grupo de números inteiros positivos indicado, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro positivo ou grupo de números inteiros positivos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Tal como descrito acima de modo amplo, a presente invenção refere-se a oligossacarídeos sulfatados e ao seu uso como agentes anti- angiogênicos, anti-metastáticos e/ou anti-inflamatórios.

Alguns oligossacarídeos podem ser obtidos a partir de fontes naturais para a sulfatação subsequente; no entanto, um procedimento simples para a sintetização de oligossacarídeos de comprimento de cadeia e estereoquímica definidos é altamente desejável. A presente invenção apresenta um método aperfeiçoado para sintetizar e isolar oligômeros de açúcares de hexose a partir de materiais de partida simples com bons rendimentos, onde os monômeros de açúcar desses oligômeros são ligados com uma ligação 1->3, 1->4 e/ou 1->6. Esse método para a fabricação de oligômeros de açúcares de hexose contrasta bastante com a maneira na qual esses oligômeros de açúcar eram fabricados anteriormente, uma vez que são obtidos bons rendimentos, o grau de oligomerização é controlado de imediato, e os produtos derivados desse método são oligômeros lineares homólogos que são isolados e purificados com facilidade ao se empregar técnicas cromatográficas simples.

Muitos exemplos que descrevem os métodos para a preparação de polímeros e oligômeros de açúcar podem ser encontrados na literatura científica e de patentes. Por exemplo, em um procedimento normalmente usado, um monômero de açúcar não modificado, tanto sozinho quanto na presença de um solvente, pode ser aquecido na presença de um catalisador para se obter produtos poliméricos ramificados e lineares com várias ligações químicas algumas vezes mal definidas (22, 23). Outro método no qual o açúcar é derretido na presença de resinas de troca catiônica (24) também resulta em polímeros altamente ramificados de alto peso molecular.

Nesses dois exemplos, os polímeros são formados com a perda concomitante de uma molécula de água para cada ligação de polímero formada. Outro exemplo de um método conhecido de polimerização por etapas envolve a utilização da reação de Koenigs-Knorr onde os açúcares possuem grupos não hidroxílicos (tal como um átomo de bromo ou cloro) na posição 1 e grupos de proteção (tal como acetila) em outros grupos hidroxila de açúcar são levados a reagir na posição 1 com um grupo hidroxila em outro açúcar (24). Nesse métodos, uma molécula que não de água, por exemplo, de ácido bromídrico, é perdida durante a formação da ligação de polímero. Esse método de preparação de oligossacarídeos é tedioso, requer a preparação de materiais de partida complexos e resulta em fracos rendimentos tctais (25).

De maneira semelhante, é sabido que um açúcar de hexose que contém um grupo de álcool primário no carbono 6 e grupos de O- proteção (tal como acetila) nas posições 2, 3 e 4 e um grupo nucleófugo tal como bromo na posição 1 se auto-condensa, em especial na presença de um catalisador tal como óxido de prata, para se obter polímeros ligados em 1,6; uma série de gentiodextrinas foi preparada dessa maneira a partir de 1- bromo-2,3,4-tri-0-acetil-alfa-D-glicose; no entanto, os rendimentos dos oligossacrídeos foram baixos devido à formação de 1,6-anidro-beta-D- glicose derivada da condensação intramolecular; os rendimentos do dímero (14%) e do trímero (22%) não foram bons, e os rendimentos do tetrâmero e do pentâmero foram piores (<5%), e o hexâmero foi isolado em um rendimento de apenas 1% (26).

Publicações mais recentes descrevem as sínteses químicas de polímeros de unidades beta-piranosila ligadas em 1,6 (27) e D-dextrano (28), produzidos através da reação de polimerização com abertura de anel de derivados de anidro-açúcar. Esse método é prejudicado pelo esforço considerável necessário para a preparação do material de partida de anidro- açúcar, e não há nenhuma evidência de que os oligossacarídeos possam ser preparados de imediato por esse método mesmo que as reações sejam levadas a efeito, por exemplo, a -60°C. Outro método empregou a polimerização de fusão catalisada à ácido de 1,2,3,4-tetra-O-acetil-beta-D-glicose para preparar uma mistura de acetatos de oligossacarídeo ligados em 1,6' que, com a desacetilação e a sujeição ao exame cromatográfico, revelou conter principalmente mono- e dissacarídeos, ou seja, glicose (15%), levoglucosan (4%) e gentiobiose (16%), enquanto que o rendimento de oligossacarídeo foi inaceitavelmente baixo, especificamente gentiotriose *4%) e gentiotetraose (0,6%) (29). Esse método foi descrito subseqüentemente em mais detalhes (30), e embora o rendimento de produtos polimerizados tenha sido aumentado ligeiramente, resultou apenas em rendimentos muito fracos dos oligômeros esperados.

Desse modo, parece, a partir da literatura, que embora já haja vários procedimentos para a preparação de uma série de oligossacarídeos, até a presente data não foi descrito nenhum método para sintetizar homo- oligossacarídeos com um bom rendimento a partir de material de partida de disponibilidade imediata e barato.

No trabalho que levou à presente invenção, os autores da invenção descobriram um processo por meio do qual hexopirano- oligossacarídeos específicos podem ser sintetizados em bons rendimentos a partir de materiais de partida de disponibilidade imediata e baratos. De acordo com esse aspecto da invenção, é apresentado um processo para a preparação de hexopirano-oligossacarídeos que compreende o aquecimento de um derivado de acetila ou um derivado de outro éster de uma hexose em um solvente inerte sob pressão reduzida e na presença de um ácido de Lewis ou um outro catalisador.

De acordo com esse processo, a oligomerização dos açúcares de hexose derivatizados, incluindo mas não ficando limitados aos derivados de 1,2,3,4-tetra-O-acetila de glicose, manose, galactose, altrose, talose, gulose, idose e alose, pode ser levada a efeito de uma maneira controlada para se obter oligossacarídeos de hexose O-acetilados. Nesse processo, o grau de oligomerização (comprimento da cadeia) pode ser controlado de imediato através da manipulação da temperatura à qual a reação de oligomerização é levada a efeito e ao se variar o período durante o qual a reação é levada a efeito. Depois da reação de oligomerização, a mistura de produtos crus pode ser submetida a mais acetilação, a fim de acetilar os grupos hidroxila livres remanescentes dos oligossacarídeos. Os oligossacarídeos acetilados podem ser então separados de imediato através de cromatografia de adsorção. O grupos acetila têm absorvência de luz ultravioleta, facilitando o uso de espectrofotometria para identificar os oligossacarídeos aoetüados à medida que eles forem eluídos em seqüência da coluna. Os grupos de proteção de acetila também podem ser removidos da mistura de oligossacarídeos, e os oligossacarídeos resultantes separados de acordo com o tamanho por meio de cromatografia com filtragem em gel (exclusão de tamanho).

Nos Exemplos aqui descritos, os oligossacarídeos sulfatados são isolados e usados como seus respectivos sais de sódio. Deve ficar entendido que outros sais farmaceuticamente aceitáveis, tais como sais de cálcio ou de amina farmaceuticamente aceitáveis, podem ser isolados e usados na maneira correspondente. Por conseguinte, as referências aqui a um "oligossacarídeo sulfatado" devem ser entendidas como incluindo sais de sódio ou outros sais farmaceuticamente aceitáveis do oligossacarídeo sulfatado.

Outras características da presente invenção estão descritas de modo mais completo no(s) Exemplo(s) a seguir. No entanto, deve ficar entendido que esta descrição detalhada é incluída apenas para fins de exemplificação da presente invenção, e não deve ser entendida de modo algum como uma restrição na descrição ampla da invenção tal como indicado acima.

Os Exemplos 1, 2 e 3 exemplificam a preparação de oligossacarídeos sintéticos pelo novo processo aqui apresentado, os Exemplos 4, 5 e 6 exemplificam os processos para a sulfatação de oligossacarídeos, e o Exemplo 7 exemplifica o uso de ν sulfatados como agentes anti-angiogênicos, anti-metastáticos e/ou anti-inflamatórios. (Nos Exemplos 1 e 2, "ND" representa "não determinado").

Nos desenho anexos:

A Figura 1 mostra o efeito de sulfato de maltohexaose na angiogênese humana in vitro. A figura de cima é uma imagem digital da angiogênese de controle catorze dias depois do início da cultura. A figura de baixo mostra a angiogênese na presença de 20 μg/ml de sulfato de maltohexaose.

A Figura 2 mostra o efeito de concentrações diferentes de sulfato de maltose (), sulfato de maltotetraose (R)) e sulfato de maltotetraose (0) na angiogênese humana in vitro. Os dados obtidos foram obtidos a partir das imagens digitais da resposta de angiogênica catorze dias depois do início da cultura. Cada valor médio ± erro padrão (n = 4).

A Figura 3 mostra o efeito de concentrações diferentes ug/ml) de fosfato de manopentaose sulfatado de Pichia holstii na angiogênese humana in vitro. Os dados foram obtidos a partir das imagens digitais da resposta angiogênica 19 dias depois do início da cultura. Cada valor médio ± erro padrão (n = 4).

A Figura 4 mostra o efeito de oligossacarídeos de maltose sulfatados de comprimentos de cadeia diferentes na metástase do adeno carcinoma mamário de rato 13762 ΜΑΤ. Os animais de controle receberam células de 13762 MAT na ausência de oligossacarídeo. No painel A, os animais tratados receberam 2 mg, i.v., de cada composto no momento da injeção de células de tumor. No painel B, os animais tratados receberam 4 mg, subcutaneamente., de cada composto no momento da injeção de células de tumor. As barras verticais representam os erros padrão das médias.

A Figura 5 é uma determinação da capacidade de oligossacarídeos de maltose sulfatados de comprimentos de cadeia diferentes inibirem a ligação de sulfatos de heparan da superfície da célula em células de BALB/c 3T3 a aFGF imobilizado. As células de 3T3 ligadas foram quantificadas através de tingimento com Rose Bengal e ao se medir a absorvência de corante a 540 nm. O grau de sulfatação de oligossacarídeos de maltose diferentes está listado na Tabela 2.

A Figura 6 mostra o efeito do grau de sulfatação de sulfato de maltohexaose na sua capacidade de inibir a metástase de adeno carcinoma mamário de rato 13762 ΜΑΤ. Os números ao longo do eixo χ raferem-se ao número de grupos sulfato por molécula de maltohexaose. Os animais de controle receberam células de tumor na ausência de compostos. Os oligossacarídeos foram administrados a uma dose de 2 mg/rato, i.v., no momento da injeção de células de tumor. As barras verticais representam os erros das médias.

A Figura 7 mostra o efeito de maltohexaose com números diferentes de grupos sulfato por molécula na angiogênese humana in vitro. Os oligossacarídeos foram adicionados a 200 μg/ml, e a análise foi levada a efeito em meio sem soro. Uma resposta angiogênica semelhante foi observada nesta experiência, quer a análise tenha sido levada a efeito em um meio contendo soro (20% de FCS) ou sem soro (sem FCS). A maltohexaose com 20 sulfatos por molécula representa a molécula mais sulfatada de todas. Média de dados ± erro padrão de quatro determinações.

A Figura 8 mostra o efeito de oligossacarídeos contendo manose diferentes na angiogênese humana in vitro. Os valores entre parênteses representam a percentagem de sulfatação de oligossacarídeos. Os oligossacarídeos foram adicionados a 200 μg/ml, e a análise foi levada a efeito em um meio contendo soro. Média de dados ± erro padrão de quatro determinações.

A Figura 9 mostra o efeito de oligossacarídeos de manose sulfatados de comprimentos de cadeia diferentes na metástase do adeno carcinoma mamário de rato 13762 ΜΑΤ. Os valores entre parênteses representam a percentagem de sulfatação de oligossacarídeos. Os animais de controle receberam células de 13762 MAT na ausência de oligossacarídeo. Os animais tratados receberam 2 mg (A) ou então 4 mg (B), subcutan., de cada composto imediatamente depois da injeção i.v. de células de tumor. As barras verticais representam os erros padrão das médias. A Figura 10 mostra o efeito de oligossacarídeos de galactose e glicose sulfatados de comprimentos de cadeia díferer^es m- metastaso do adeno carcinoma mamário de rato 13762 ΜΑΤ. Os valores entre parênteses representam a percentagem de sulfatação de oligossacarídeos. Os animais de controle receberam células de 13762 MAT na ausência de oligossacarídeo. Os animais tratados receberam 2 mg, subcutan., de cada composto imediatamente depois da injeção i.v. de células de tumor. As barras verticais representam os erros padrão das médias.

EXEMPLO 1

Os oligossacarídeos de manose foram obtidos da seguinte maneira: 1,2,3,4-tetra-O-acetil manose (31) (15,0 g, 43 mmol) e cloreto de zinco (1,5 g) foram misturados integralmente em tetrametileno-sulfona (7 ml), essa mistura foi aquecida sob pressão reduzida com agitação a cerca de 110°C por seis horas; a essa altura, a massa de reação tinha endurecido e tinha cessado a geração de vapor (ácido acético). Durante todo o tempo da reação, um tubo de cal de soda ficou situado entre o vaso de reação e a fonte de vácuo. A mistura de reação foi arrefecida, e uma porção (11,0 g) da mistura de produtos foi dissolvida em piridina seca (20 ml), e a essa solução foi adicionado anidrido acético (2 ml), essa mistura foi protegida contra a umidade atmosférica e aquecida a cerca de 50°C com agitação por duas horas. Depois do arrefecimento, foi adicionado etanol (10 ml), e a mistura foi colocada em repouso por duas horas. A piridina, o etanol e todo acetato de etila formado foram evaporados sob pressão reduzida, e o resíduo foi lavado intensamente com água, para remover o cloreto de zinco, a tetrametileno sulfona e a piridina. O resíduo foi dissolvido em dicloro metano, lavado com água, e a camada orgânica secada em sulfato de sódio anidro. Os oligossacarídeos derivatizados foram inicialmente separados em duas frações ao se aplicar a solução de dicloro metano a uma coluna curta (4 χ 40 cm) de gel de sílica 60 (130 g), a qual foi primeiramente eluída com clorofórmio e a seguir com acetona. A eluição com clorofórmio resultou em uma mistura do monossacarídeo totalmente acetilado e oligômeros contendo tres a cinco unidades de manose (Mistura A). A eluição subsequente com acetona resultou em uma mistura de oligômeros totalmente O-acetilados contendo principalmente seis até doze unidades de manose por molécula (Mistura B).

A Mistura A (4 g) foi aplicada a uma coluna (3,3 χ 135 cm) contendo gel de sílica de grau tlc (Η). A coluna foi eluída com acetona/petróleo leve (ponto de ebulição de 60°C-80°C) com um gradiente começando em 1:5 e ao se aumentar a percentagem de acetona até ser atingida uma razão final de 1:1. A vazão era igual ou menor do que 0,5 ml/min. Ao se coletar e agrupar as frações apropriadas (determinadas pela análise tlc com gel de sílica) e ao se remover o solvente sob pressão reduzida, oligossacarídeos de manose totalmente O-acetilados 1a-1d foram obtidos tal como segue (n = número de resíduos de manose; rendimento, rotação molecular (c = 2, CHCl3)); 1a, (3; 0,7 g, 4,2%, [a]27D = +ND); 1b, (4; 4,1 g, 8,4%, [a]27D = +50); lc, (5; 1,2 g, 7,9%, [a]27D = +47,3); 1d, (6; 0,8 g, 5,2%, [cc]27d = +36,0). A Mistura B (7,0 g) foi submetida à cromatografia de uma maneira semelhante à Mistura A, mas o gradiente de eluição começou com acetona/petróleo leve (ponto de ebulição de 60°C-80°C) 4:5, e a percentagem de acetona aumentou até ficar sendo 100%. Dessa maneira, os oligossacarídeos de manose totalmente O-acetilados 1d-1j foram obtidos tal como segue: (n = número de resíduos de manose; rendimento, rotação molecular (c = 1, CHCl3)); 1d, (6; 1,6 g, 10,4%, [α]27D = +ND); 1e, (7; 3,2 g, 21,2%, [α]27D = +50,0); 1f, (8; 0,5 g, 3,4%, [α]27D = +47,0); 1g, (9; 0,7 g, 4,7%, [α]27D = +59); 1h, (10; 0,9 g, 5,7%, [α]27D =+54); 1i, (11; 0,02 g, 0,1%, [cc]27d = +ND); lj, (12; 0,03 g, 0,2%, [α]27D = +ND).

O composto 1a (1,55 g) foi dissolvido em metanol seco (40 ml), e metóxido de sódio metanólico 1 M (8,6 ml) foi adicionado com agitação à temperatura ambiente. O precipitado resultante foi filtrado, lavado integralmente com metanol, e secado. O produto (2a; 0,61 g, 70%, [a]27D = +72°) foi identificado como manotriose por meio de análise elementar (os valores de CHN foram 0,4% do esperado), espectrometria de massa com eletroaspersão (M+504) e espectroscopia nmr. Os oligômeros lb-lj foram tratados de maneira semelhante, para se obter os oligossacarídeos de manose seguintes (n = número de resíduos de manose; rendimento % de derivados acetilados, rotação molecular (c = 1, H2O)); 2b, (4; 75%, [ot]27D = +78°); 2c, (5; 85%, [a]27D = +80°); 2d, (6; 98%, [a]27D = 84°); 2e, (7; 98%, [a]27D = 86,3°); 2f, (8; 99%, [a]27D = +98,0°); 2g, (9; 99%, [cx]27D = +106°); 2h, (10; 99%, [a]27D = +100°); 2i, (11; 98%, [a]27D = ND); 2j, (12; 98%, [a]27D = ND).

Alternativamente, esses oligossacarídeos de manose podem ser isolados através de cromatografia de filtragem com gel (exclusão de tamanho). Desse modo, uma mistura de oligossacarídeos de manose acetilados foi obtida ao se aquecer uma mistura totalmente agitada de 1,2,3,4- tetra-O-acetil manose (15,0 g, 43 mmol) e cloreto de zinco (1,5 g) em tetrametileno-sulfona (7 ml) sob pressão reduzida a cerca de 110°C por seis horas tal como descrito acima. A mistura de reação foi arrefecida, e foi adicionada água (50 ml), e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por cinco minutos, e a camada de água foi descartada. Esse procedimento de lavagem foi repetido, e a massa foi dissolvida a seguir em clorofórmio, lavada com água e secada em sulfato de sódio anidro. Depois da filtragem, o clorofórmio foi removido sob pressão reduzida, para se obter a mistura de oligossacarídeo actilado cru (11,3). Essa mistura foi dissolvida em isopropanol (20 ml) e metanol (60 ml), e então foi adicionado metóxido de sódio 1 M em metanol (8 ml), e a mistura foi colocada em repouso à temperatura ambiente por uma hora. O precipitado resultante foi filtrado e lavado duas vezes com metanol (30 ml). Depois da secagem, essa mistura de produto (6,5 g) foi aplicada ao topo de uma coluna de filtragem de gel com gel P2 de grau fino (BioRad) (com camisa; 5 x 90 cm) que tinha sido estabilizada ao ser eluída por dois dias com água (vazão de 0,5 ml por minuto) a 60°C. A coluna foi eluída com água a Tima vazão de 0,5 :-nl por minuto. Os produtos eluídos da coluna foram identificados como picos através de refratometria diferencial, e as frações foram coletadas de modo correspondente. Dessa maneira, foram coletadas as frações correspondentes às áreas sob onze picos separados. Cada uma dessas frações foi submetida novamente à cromatografia em uma coluna de gel P2 idêntica mantida a 60°C e eluída com água a uma vazão de 0,5 ml/min. Desse modo, a título de exemplo, a fração identificada como correspondente a manopentaose (0,9 g) da primeira filtragem com gel foi submetida novamente à cromatografia, para se obter um pico central principal com um ressalto de cada lado. O produto eluído no pico central foi isolado ao se remover a água sob pressão reduzida, para se obter (0,5 g) de material, o qual foi novamente submetido à cromatografia em uma coluna de gel P2 idêntica a 60°C idêntica a 2c acima.

Obtido: C, 38,4; H, 6,7, C30H52O26. 6H20 requer C, 38,5; H, 6,8%. O valor de nitrogênio foi de 0% obtido e de 0% esperado.

meio de HPLC. Isso foi determinado em um sistema HPLC Dionex configurado tal como segue.

Foi verificado que o composto era substancialmente puro, por

Coluna:

Código - CPMA1#1291 (+ protetor#l 172). Uma coluna de Troca Iônica de Amônio Quaternário.

Detector: Detector Eletroquímico (ED40:IAMP).

Vazão: 1 ml/min.

Solventes: Solução A: hidróxido de sódio 0,1 M

Solução B: Acetato 1 M em NaOH 0,1 M Gradiente: Tempoímin.)

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A espectrometria de massa com eletroaspersão revelou que esse composto tinha uma massa M+ de 828, o peso molecular correto de manopentaose. De uma maneira semelhante, foram isoladas manotriose, manotetraose, mano-hexaose e mano-heptaose de modo idêntico a 2a, 2b, 2d e 2e acima.

EXEMPLO 2

Este exemplo mostra o efeito da realização da reação de polimerização a uma temperatura mais baixa do que no Exemplo 1. Os oligossacarídeos de glicose foram obtidos através da polimerização de 1,2,3,4-tetra-O-acetil glicose da mesma maneira que para os oligossacarídeos de manose produzidos pelo método indicado no Exemplo 1 acima, exceto pelo fato que neste caso a reação de polimerização foi levada a efeito a 90°C por oito horas. A mistura de reação foi tratada tal como no Exemplo 1, e os produtos foram isolados através de cromatografia de coluna, onde a coluna (7 cm χ 155 cm) continha gel de sílica de grau tlc (H). Ao se empregar métodos de eluição semelhantes àqueles descritos no Exemplo 1, os oligossacarídeos de glicose totalmente O-acetilados 3a - 3e foram obtidos tal como segue: (n = número de resíduos de glicose; rendimento, rotação molecular (c = 2, CHCl3)); 3a, (3; 4,14 g, 24,9%, [a]27D = 37,5°); 3b, (4; 2,92 g, 18,4%, [a]27D = +44°); 3c, (5; 2,99 g, 19,1%, [a]27D = +37,5°); 3d, (6; 1,37 g, 8,9%, [cc]27D = +36°); 3e, (7; 0,18 g, 1,2%, [cc]27D = +39°).

O composto 3a (1,0 g) foi dissolvido em metanol seco (30 ml), e metóxido de sódio metanólico 1 M (5,5 ml) foi adicionado com agitação à temperatura ambiente. O precipitado resultante foi filtrado, lavado integralmente com metanol, e secado. O produto (4a; ([a]27D = 68,5°) foi identificado como glicotriose por meio de análise ele-r-ea-al, csp&ctrometria de massa com eletroaspersão (M+ = 504) e espectroscopia nmr. Os oligômeros 4b - 4e foram tratados de maneira semelhante, para se obter os oligossacarídeos de glicose seguintes (n = número de resíduos de glicose; rendimento %, rotação molecular (c = 2, H2O)); 4b, (4; 85%, [a]27D = +83°); 4c, (5; 890%, [a]27D = +84°); 4d, (6; 90%, [a]27D = +86°); 4e, (7; 89%, [a]27D = +92,5°).

Alternativamente, esses oligossacarídeos de glicose podem ser isolados através de cromatografia de filtragem com gel (exclusão de tamanho). Desse modo, uma mistura de oligossacarídeos de glicose acetilados foi obtida ao se aquecer uma mistura totalmente agitada de 1,2,3,4- tetra-O-acetil glicose (15,0 g, 43 mmol) e cloreto de zinco (1,5 g) em tetrametileno-sulfona (7 ml) sob pressão reduzida a cerca de 1100C por seis horas, tal como descrito acima. A massa de reação foi dissolvida em dicloro metano, lavada com água e secada em sulfato de sódio anidro. O dicloro metano foi removido sob pressão reduzida, e o produto foi pesado e dissolvido em isopropanol (20 ml) e metanol (60 ml), e então foi adicionado metóxido de sódio 1 M em metanol (9 ml), e a mistura foi colocada em repouso à temperatura ambiente por uma hora. O precipitado resultante foi filtrado e lavado duas vezes com metanol (30 ml). Uma porção (7,6 g) dessa mistura foi dissolvida em água (10 ml) e aplicada a uma coluna de cromatografia com camisa de água de 5 χ 90 cm que continha gel de exclusão de tamanho P2 de grau fino (BioRad). A coluna tinha sido preenchida, pré- aquecida e eluída a 60°C por dois dias antes de ser usada. Depois da adição da mistura de oligossacarídeos de glicose, a coluna foi mantida a 60°C e eluída com água (1 ml/min.). Os produtos eluídos da coluna foram identificados como picos através de refratometria diferencial, e as frações foram coletadas de modo correspondente. Dessa maneira, foram coletadas as frações correspondentes às áreas sob dez picos separados. Cada uma dessas frações foi outra vez submetida à cromatografia em uma coluna de gel P2 idêntica mantida a 60°C e eluída com água a uma vazão de 0,5 ml/min. Desse modo, a título de exemplo, a fração identificada como correspondente a glicopentaose (0,59 g) foi submetida novamente à cromatografia, para se obter um pico central principal com um ressalto de cada lado. O produto eluído no pico central foi isolado ao se remover a água sob pressão reduzida, para se obter (0,3 g) de material, o qual foi novamente submetido à cromatografia em uma coluna de gel P2 idêntica a 60°C idêntica a uma vazão de 0,3 ml/min. Dessa maneira, foi obtida glicopentaose (0,2 g), de maneira idêntica a 4c acima. De uma maneira semelhante, foram isoladas a glicotriose, glicotetraose, glico-hexaose e glico-heptaose tal como em 4a, 4b, 4d e 4e acima.

EXEMPLO 3

Os oligossacarídeos e outros açúcares de hexose incluindo a galactose, altrose, talose, gulose, idose e alose, podem ser obtidos ao se seguir os métodos apresentados nos Exemplos 1 e 2.

Por exemplo, os oligossacarídeos de galactose foram obtidos da seguinte maneira: 1,2,3,4-tetra-O-acetil galactose (21,0 g) e cloreto de zinco (2,1 g) foram misturados integralmente em tetrametileno-sulfona (10 ml), essa mistura foi aquecida sob pressão reduzida com agitação a cerca de 90°C por dezessete horas; a essa altura, a massa da mistura de reação tinha endurecido e tinha cessado a geração de vapor (ácido acético). Durante toda a reação, um tubo de cal de soda ficou situado entre o vaso de reação e a fonte de vácuo. A mistura de reação foi arrefecida, a massa de reação foi dissolvida a seguir em dicloro metano, lavada com água e secada em sulfato de sódio anidro. O dicloro metano foi removido sob pressão reduzida, e o produto foi pesado e dissolvido em isopropanol (30 ml) e metanol (70 ml), e a seguir foi adicionado metóxido de sódio 1 M em metanol (10 ml), e a mistura foi colocada em repouso à temperatura ambiente por uma hora. O precipitado resultante foi filtrado e lavado duas vezes com metanol (30 ml). Essa mistura foi separada por meio de cromatografia de filtragem com gel, tal como descrito para os polímeros de manose e glicose nos Exemplos 1 e 2 acima. Os produtos eluídos da coluna foram identificados como picos através de refractometria diferencial, e as frações foram coletadas de modo correspondente. Dessa maneira, foram coletadas oito frações. Sete dessas frações foram submetidas mais duas vezes à cromatografia em uma coluna de gel P2 idêntica a 60°C e eluídas com água a uma vazão de 0,5 ml/min durante a primeira eluição e 0,3 ml/min na segunda eluição. Dessa maneira, foram obtidos os oligossacarídeos de galactose seguintes: galactotriose, 1,03 g, 5,3%; galactotetraose, 1,15 g, 6,0%; galactopentaose, 1,21 g, 6,3%; galacto- hexaose, 4,26 g, 22,1%; galacto-heptaose, 2,11 g, 11%; galactooctaose, 1,91 g, 9,9%; e galactononaose, 0,08 g, 0,4%.

EXEMPLO 4

A uma solução de complexo de trióxido de enxofre-piridina (0,8 g) (Aldrich) em DMF recém destilada (1 ml) a 80°C, foi adicionada em gotas uma solução de manopentaose (2c) (0,1 g) em piridina seca (3 ml), e isso tudo foi aquecido a 80°C por mais noventa minutos. O sobrenadante foi decantado enquanto ainda quente, e o resíduo pegajoso foi lavado integralmente com metanol (2 ml) três vezes. Depois do metanol residual ser decantado, o produto foi dissolvido em água (5 ml) e neutralizado (até um pH ~6) com acetato de bário (cerca de 0,4 g em 2 ml de água) com agitação vigorosa. Depois da centrifiigação (3.000 χ g), o líquido sobrejacente foi decantado e retido, e a pelota de sulfato de bário precipitada foi lavada integralmente com água (3 χ 10 ml). O líquido sobrejacente retido e o material lavado foram combinados e colocados em uma coluna (1,0 χ 14 cm) de resina de troca catiônica DOWEX 50W-X8-400 (forma de H+). A coluna foi eluída com água, até o material eluído ficar neutro. O material eluído (-50 ml) foi agitado e neutralizado (até um pH ~7) com acetato de sódio (0,7 g). A solução foi diluída com acetona (200 ml) e centrifugada (1.750 χ g) para separar o produto. A pelota foi finamente pulverizada através de trituração sob metanol, e a seguir agitada enquanto ainda sob metanol, e filtrada. O sólido foi lavado várias vezes com metanol, para se obter o composto puro (sem sal inorgânico) (0,2 g; 66%). O produto não foi contaminado com íons de bário (por micro-análise e ionização de chama) nem nitrogênio (micro- análise).

Foi observado que o produto, manopentaose sulfatada, tinha 11 de 17 possíveis posições sulfatadas. Obtido: C, 14,2; H, 3,0; S, 14,1; Na, 7,3. C30H60O59S11Na8. 36H20 requer: C, 14,1; H, 5,2; S, 13,8; Na, 7,2%. Os valores de nitrogênio e bário foram de 0% obtido e 0% esperado.

EXEMPLO 5

A uma mistura de complexo de trióxido de enxofre-piridina (Aldrich Chemical Company) (4 g) em DMF seca (5 ml), foi adicionada piridina seca (10 ml) sob uma atmosfera de nitrogênio seco. Essa mistura foi aquecida até 50°C e agitada rapidamente, enquanto gluco-hexaose (4d) (0,5 g), isolada pelo método descrito no Exemplo 2 acima, foi adicionada em uma só adição. Piridina adicional (5 ml) foi adicionada, e a mistura foi então aquecida, com agitação contínua, a 80°C por noventa minutos. A mistura de reação foi então mantida a 4°C por toda a noite. O líquido foi decantado do vaso de reação, foi adicionado metanol (3 ml), e o semi-sólido foi despedaçado e misturado integralmente com o metanol. Depois da sedimentação, o metanol foi decantado, e esse procedimento foi repetido. Foi adicionada água (5 ml) ao sólido remanescente, e a solução resultante foi colocada em um tubo de ensaio de 50 ml. O vaso de reação foi enxaguado com mais água (5 ml), a qual foi combinada com a primeira solução. A solução resultante foi ajustada a um pH de cerca de 7-8 com hidróxido de sódio a 40%, após o que foi adicionado metanol (40 ml). A solução nublada resultante foi centrifugada (3.000 χ g) por 25 minutos, e a solução clara foi decantada do material precipitado. O sólido remanescente foi dissolvido outra vez em água (10 ml), foi adicionado metanol (40 ml), e o tubo foi centrifugado tal como antes. Depois da decantação do solvente sobrejacente claro, o sólido foi dissolvido em água (10 ml) e eluído através de uma coluna de dessalinação com gel P2 (2,5 cm χ 250 cm; gel P2 de grau fino - BioRad), para se obter o sal de sódio esperado do derivado sulfatado de 1,6- glicohexaose.

EXEMPLO 6

Embora a síntese de homopolímeros de hexose esteja descrita nos Exemplos 1, 2 e 3, normalmente é extremamente difícil sintetizar a maior parte das estruturas de oligossacarídeos. Desse modo, uma abordagem mais simples consiste em sulfatar os oligossacarídeos de estrutura definida a partir de fontes naturais. Os oligossacarídeos de produtos naturais usados neste exemplo eram de duas classes. A primeira classe continha oligossacarídeos que não precisavam de mais degradação e fracionamento. Os exemplos dessa classe incluem a maltose, a rafinose e a estaquiose. A segunda classe consistia em oligossacarídeos obtidos a partir de polissacarídeos de ocorrência natural que eram parcialmente degradados enzimática ou quimicamente, e fracionados por tamanho. Os exemplos dessa classe são os oligossacarídeos derivados de amilose, condroitina e dextrana e o fosfato de manopentaose do levedo Pichia holstii.

A maltose, a rafinose e a estaquiose foram adquiridas junto à Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. A maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose e malto-heptaose foram obtidas junto à Seikagaku, Tokyo, Japan, e representam os oligossacarídeos purificados a partir de materiais digeridos de amilase limitadas do homopolímero de glicose ligado em alfal-4, amilose. Os tetra-, hexa- e octassacarídeos de condroitina foram purificados através de fracionamento de filtragem com gel de um material digerido de hialuronidase de testículo de bovino de sulfato de 6-condroitina, tal como descrito anteriormente, As ciclo-hexa-- hepta- e octaamiloses foram obtidas junto à Sigma. Esses oligossacarídeos podem ser sulfatados tal como descrito no Exemplo 5.

A título de exemplo, o sulfato de maltohexaose foi preparado da maneira a seguir. A uma solução de complexo de trióxido de enxofre- piridina (4,0 g) (Aldrich) em DMF recém destilada (5 ml) a 80°C, foi adicionada em gotas uma solução de maltohexaose (0,5 g) em piridina seca (15 ml), e essa mistura foi aquecida a 80°C por mais noventa minutos. O sobrenadante foi decantado enquanto ainda quente, e o resíduo pegajoso foi lavado integralmente com metanol (10 ml) três vezes. Depois do metanol residual ter sido decantado, o produto foi dissolvido em água (15 ml) e neutralizado (até um pH ~6) com acetato de bário (cerca de 2,0 g em 10 ml de água) com agitação vigorosa. Depois da centrifugação (3.000 χ g), o líquido sobrejacente foi decantado e retido, e a pelota de sulfato de bário precipitada foi lavada integralmente com água (3 χ 10 ml). O líquido sobrejacente retido e o material lavado foram combinados e colocados em uma coluna (2,5 χ 14 cm) de resina de troca catiônica DOWEX 50W-X8-400 (forma de H+). A coluna foi eluída com água, até o material eluído ficar neutro. O material eluído (-250 ml) foi agitado e neutralizado (até um pH ~7) com acetato de sódio (3,5 g). A solução foi diluída com acetona (1 litro) e centrifugada (1.750 χ g) para separar o produto. A pelota foi finamente pulverizada através de trituração sob metanol, e a seguir agitada enquanto ainda sob metanol, e então filtrada. O material filtrado foi lavado várias vezes com metanol, para se obter o composto puro (sem sal inorgânico) (0,88 g; 55%). O produto não foi contaminado com íons de bário (determinado através de micro-análise e ionização de chama) nem nitrogênio (micro- análise).

Foi observado que o produto tinha 14 de 20 possíveis posições sulfatadas. Obtido: C, 13,9; H, 2,2; S, 14,3; Na, 6,7. C36H71O73S14Na9. 45H20 requer: C, 13,8; H, 5,1; S, 14,3; Na, 6,6%. Os valores de nitrogênio e bário foram 0,32% e 0% obtidos, respectivamente, e 0% esperado.

Os dados de 1H NMR (300 MHz - Gemini 300; referência a partir de acetona, 2,25 ppm do campo descendente de TMS) para o sulfato de maltohexaose acima indicaram que 14 de 20 possíveis posições foram sulfatadas. Isso foi determinado a partir das alterações químicas dos hidrogênios centralizados em torno de 4,15 ppm (integrando para 20 H) versus aqueles centralizados em torno de 4,4 ppm (integrando para 16 H). Pode-se supor que todos os grupos OH primários, ou seja, aqueles na posição 6, serão sulfatados, uma vez que essa é a posição menos estericamente impedida possível. Também pode-se supor que nos resíduos de açúcar integrais vai ser sulfatada apenas uma outra posição. Cada um dos resíduos de açúcar integrais, além daquele na posição 6, vai ter duas outras posições sulfatadas.

O fosfato de manopentaose foi preparado a partir do exopolissacarídeo produzido pelo levedo diplóide de Pichia holstii (cepa BRRL Y-2448, anteriormente Hansenula holstii). O método para o cultivo de P. holstii e o isolamento do fosfato de manopentaose foi baseado naquele descrito anteriormente (33, 34). Em resumo, o exopolissacarídeo cru foi isolado de sobrenadantes de cultura de levedo cultivados aerobicamente como um sal de potássio através de precipitação com etanol. A hidrólise ácido foi então usada para liberar o fosfato de manopentaose do núcleo de monoéster de fosfomanan (PPME) do exopolissacarídeo. O PPME e o fosfato de manopentaose foram então separados um do outro como sais de bário por meio de precipitação com etanol diferencial e a seguir através de filtragem com gel. O oligossacarídeo tem a estrutura P-6-Man-alfa-(l->3)-Man-alfa-(l- >3 )-Man-alfa-( 1 ->3 )-Man-alfa-( 1 ->2)-Man (34).

O sulfato do fosfato de manopentaose de levedo (33, 34) isolado do exopolissacarídeo de levedo foi preparado da maneira a seguir. Uma suspensão de fosfato de manopentaose de levedo (0,09 g) ern DMF (2 ml) e piridina (3 ml) foi adicionada a uma solução de complexo de trióxido de enxofre-piridina (0,8 g) (Aldrich) em DMF (1 ml). A mistura foi aquecida a 80°C por duas horas. O sobrenadante foi decantado enquanto ainda quente, e o resíduo pegajoso foi lavado integralmente com metanol (2 ml) três vezes.

Depois do metanol residual ser decantado, o produto foi dissolvido em água (5 ml) e neutralizado (até um pH ~6) com acetato de bário (cerca de 0,7 g em 5 ml de água) com agitação vigorosa. Depois da centrifiigação (3.000 χ g), o líquido sobrejacente foi decantado e retido, e a pelota de sulfato de bário precipitada foi lavada integralmente com água (3 χ 10 ml). O líquido sobrejacente e o material lavado foram combinados e colocados em uma coluna (2,5 χ 14 cm) de resina de troca catiônica DOWEX 50W-X8-400 (forma de H+). A coluna foi eluída com água, até o material eluído ficar neutro. O material eluído (cerca de 50 ml) foi agitado e neutralizado (até um pH = 7) com acetato de sódio (cerca de 0,4 g). A solução foi diluída com acetona (150 ml) e centrifugada (1.750 χ g) para separar o produto. A pelota foi finamente pulverizada através de trituração sob metanol, e a seguir agitada enquanto ainda sob metanol, e filtrada. O sólido foi lavado várias vezes com metanol, para se obter o fosfato de manopentaose de levedo sulfatado (0,18 g). O produto não foi contaminado com íons de bário (determinado através de micro-análise e ionização de chama) nem nitrogênio (micro-análise).

Foi observado que esse produto tinha 10 de 16 possíveis posições sulfatadas. Obtido: C, 15,35; H, 2,7; P, 1,2; S, 13,7; Na, 8,5. C30H41O59PS10Na9. 25H2O requer: C, 15,3; H, 3,5; P, 1,3; S, 13,6; Na, 8,8%. Os valores de nitrogênio e bário foram 0,16% e 0% obtidos, respectivamente, e 0% esperado para cada um.

Os oligossacarídeos de 1,6-alfa-glicose foram preparados pela hidrólise ácido de dextrana (peso molecular médio de 71.000; Sigma Chemical Co.). Desse modo, a dextrana (5 g) foi dissoivida em água destilada 9100 ml), e essa solução foi ajustada a um pH = 1,8 com ácido clorídrico 1 Μ. A mistura foi refluxada (IOO0C) por 48 horas. A mistura foi secada sob pressão reduzida e completada até 100 ml com água destilada, e secada uma segunda vez sob pressão reduzida. Etanol absoluto (100 ml) foi adicionado ao resíduo, e evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi completado até 4 ml com água destilada e aplicado a uma coluna de cromatografia com camisa de água de 5 χ 90 cm contendo gel de exclusão de tamanho P2 de grau fino (BioRad). A coluna tinha sido preenchida, pré-aquecida e eluída a 60°C por dois dias antes de ser usada. Depois da adição da mistura de oligossacarídeos de 1,6-alfa-glicose, a coluna foi mantida a 60°C e eluída com água (1 ml/min.). Os produtos eluídos da coluna foram identificados como picos através de refratometria diferencial, e as frações foram coletadas de modo correspondente. Dessa maneira, foram coletadas as frações correspondentes às áreas sob picos separados. Cada uma dessas frações foi submetida novamente à cromatografia em uma coluna de gel P2 idêntica a 60°C e eluída com água a uma vazão de 0,5 ml/min. Desse modo, a título de exemplo, a fração identificada como correspondente a 1,6-alfa-glicohexaose (0,19 g) foi submetida novamente à cromatografia, para se obter um pico central principal com um ressalto de cada lado. O produto eluído no pico central foi isolado ao se remover a água sob pressão reduzida, para se obter (0,16 g) de material, o qual foi novamente submetido à cromatografia em uma coluna de gel P2 idêntica a 60°C idêntica a uma vazão de 0,3 ml/min. Dessa maneira, foi obtida a glico-hexaose (0,14 g) (eletroaspersão M+ = 990). De maneira semelhante, foram isoladas a 1,6-alfa-glicotetraose (0,21 g) e a 1,6-alfa- glicopentaose (0,17 g).

EXEMPLO 7

A. MATERIAIS R MÉTODOS Atividade Anticoagulante de Oligossacarídeos Sulfatados

A atividade anticoagulante de cada cligos^acarídeo sulfatado foi determinada tal como descrito anteriormente (35), ao se usar procedimentos de tempo de trombina e de tempo de tromboplastina parcial ativada. A atividade de cada preparado foi comparada com um controle de heparina, e a atividade anticoagulante foi expressa como uma percentagem da atividade da heparina.

Análise de Angiogênese Humana

O método de análise está descrito no Pedido de Depósito de Patente de Invenção Internacional No. PCT/AU95/00105, cuja citação está aqui incorporada a título de referência. Os vasos sangüíneos, com cerca de 1 a 2 mm de diâmetro e 2 a 5 cm de comprimento, foram excisados da superfície de placentas humanas dentro de seis horas após o nascimento. Os vasos colocados em BSS de Hank contendo 2,5 mg/ml de fungizona e cortados em fragmentos de 1 a 2 mm de comprimento ao se usar forceps de dissecção e tesoura de iridectomia. Foram removidos os coágulos dos fragmentos de vasos, e estes foram mergulhados em BSS de Hank antes do uso. A dissecção e o seccionamento dos vasos foram levados a efeito com a ajuda de uma lâmpada ampliadora (Maggylamp, Nwebound, Balmain, NSW, Austrália). Respostas angiogênicas semelhantes foram obtidas de vasos sangüíneos de origem venular e arterial, porém, para cada análise, foram usados os fragmentos de vaso de apenas um vaso.

As análises de angiogênese foram feitas em lâminas de cultura de 24 ou 28 cavidades (Costar, Cambridge, MA). No formato de 24 cavidades, 30 microlitros de trombina bovina (50 unidades NIH/ml em cloreto de sódio 0,15 M; Sigma Chemical Co., St Louis, MO) foram adicionados a cada cavidade, e em seguida 1,0 ml/cavidade de 3 mg/ml de fibrinogênio bovino (Sigma) no Meio 199. A trombina e o fibrinogênio foram misturados rapidamente e um fragmento de vaso foi colocado rapidamente no centro da cavidade antes da formação de coágulo. Normalmente, a formação de gel de fibrina ocorreu em irinta segundos, e o fragmento de vaso foi deixado suspenso no gel. Depois da formação do gel, foi adicionado 1,0 ml/cavidade do Meio 199 suplementado com soro fetal de bezerro (FCS) a 20%, 0,2 mg de ácido ε-amino capróico, L-glutamina e antibióticos (gentamicina e fungazona). No formato de 48 cavidades, todos os volumes dos reagentes foram usados pela metade. Os vasos foram cultivados a 37°C em um ambiente úmido por 14 a 21 dias, sendo que o meio era trocado duas vezes por semana. A angiogênese foi quantificada através de análise de imagem baseada em computador, ao se usar o software NIH Image, das imagens digitais das culturas obtidas com uma câmera digital Dycam montada em um microscópio invertido (Olympus, Tokyo, Japan). Análise de Heparanase

A análise da heparanase é baseada na observação de que a proteína de soro, glicoproteína rica em histidina (HRG)5 é ligada às cadeias de sulfato de heparan e mascara o local de clivagem de heparanase. Com base na descoberta que o sulfato de heparan clivado com heparanase não consegue se ligar à HRG, foi desenvolvida uma análise de heparanase que envolve a digestão de cadeias de sulfato de heparan com rotulação 3H com heparanase, a ligação do sulfato de heparan digerido a grânulos acoplados com HRG, e a medição do rótulo 3H não ligado. Com a maior digestão do substrato, uma quantidade maior de rótulo 3H não consegue se ligar aos grânulos de HRG. Desse modo, este método representa um procedimento simples e rápido para medir a atividade de heparanase em extratos de tecido e para determinar a inibição de heparanase por vários compostos.

Inicialmente, o sulfato de heparan do intestino de bovino (Mr av 32 kDa) foi desacetilado parcialmente através de aquecimento em hidrato de hidrazina (36) e reacetilado com anidrido acético rotulado com 3H. HRG de galinha, purificada pelo método de Rylatt et al. (1981) (37), foi acoplada a Sepharose 4Β ativada por CNBr (Pharmacia) de acordo com as instruções do fabricante.

A atividade de heparanase de plaquetas humanas foi determinada pela incubação (37°C, 30 min.) de heparanase de plaquetas humanas purificada (que tinha revelado a mesma atividade em relação a sulfato de heparan que a atividade de heperanase presente em linhagens de células de carcinoma humano cultivado altamente metastático HCT 116, adeno carcinoma de rato 13762 MAT e melanoma de camundongo B16) com 60 pmoles de sulfato de heparan do intestino de bovino com rádio-rotulado com 3H. A atividade foi determinada pelo índice de produção de fragmentos de sulfato de heparan menores (cerca de 5 kDa) que não tinham sido ligados depois da passagem da mistura de incubação (100 microlitros) através de mini-colunas de HRG-Sepharose (200 microlitros de grânulos inseridos) que retinham o substrato não clivado e parcialmente clivado maior.

Nas análises de inibição de heparanase, concentrações diferentes de inibidor foram adicionadas à enzima antes da adição do substrato rádio-rotulado, sendo que o inibidor foi retido na mistura de reação durante todo o período de incubação.

Análise da Metástase

A atividade anti-metastática dos oligossacarídeos sulfatados diferentes foi determinada ao se usar o adeno carcinoma mamário de rato altamente metastático 13762 MAT (35). As células de tumor foram mantidas in vitro tal como descrito anteriormente (35). 334 ratos fêmeas Fisher (10 a 13 semanas de idade) foram injetados i.v. com 2 χ IO5 células de 13762 MAT em 0,6 ml de meio RPMI 1640 contendo FCS a 10%. No momento da injeção das células de tumor, os animais também foram injetados com 2 mg de oligossacarídeo sulfatado, e resultados semelhantes são obtidos caso o oligossacarídeo seja injetado i.v., i.p. ou subcutaneamente. Os pulmões foram removidos dos ratos treze dias depois da injeção de células de tumor, colocados em uma solução de Bouin por pelo menos 24 horas, e as metástases dos pulmões foram então determinadas sob um microscópio de dissecção. O número de metástases de pulmão em ratos tratados com oligossacarídeos sulfatados foi comparado com aquele observado nos animais de controle, com um mínimo de quatro animais incluído em cada grupo.

Efeito dos Oligossacarídeos Sulfatados na Interação de FGF- Hepraina/Sulfato de Heparan

Uma análise de ligação, que está descrita em detalhes em outra parte (38), foi usada para medir a ligação de aFGF e bFGF à heparina, e determina a capacidade de oligossacarídeos sulfatados diferentes inibirem essa interação. Em resumo, as FGFs foram imobilizadas nas cavidades de lâminas de PVC de 96 cavidades, e foi determinada a ligação da heparina rádio-rotulada às FGFs imobilizadas. Nas análises de inibição, diluições seriais de oligossacarídeos sulfatados foram examinadas quanto à sua capacidade de inibir a interação de FGF-heparina. Os resultados da inibição foram expressos como a concentração de oligossacarídeo sulfatado necessária para inibir a ligação de heparina às FGFs imobilizadas em 20% ou 50%. A heparina não rotulada foi incluída como controle em todas as experiências de inibição de ligação.

A interação de FGF-heparina foi determinada, tal como indicado anteriormente (39), ao se medir a ligação de fibroblastos de BALB/c 3T3 a FGFs imobilizadas em PVC, sendo que a ligação das células é detectada pelo tingimento com Rose Bengal das células aderentes. Os oligossacarídeos sulfatados foram examinados quanto à sua capacidade de inibir esse processo de aderência de células, o que é totalmente dependente das estruturas de sulfato de heparan na superfície das células de BALB/c 3T3 (39). Os dados foram expressos como a concentração de oligossacarídeo sulfatado que inibiu a aderência das células em 50% (IC50). Modelo de Inflamação de Bolsa de Ar

A análise é baseada em um procedimento indicado anteriormente (40). Bolsas de ar subcutâneas foram formadas nas costas de camundongos ao se injetar 5 ml de ar estéril abaixo da pele de uma área barbeada entre as escápulas de um camundongo anestesiado no primeiro dia.

No terceiro dia, a bolsa foi inflada através da injeção de 2,5 ml de ar. A inflamação foi induzida no sexto dia ao se injetar diretamente na bolsa 1,0 ml de 56 mg/ml de tioglicolato ou 1,0 ml de solução salina como controle. Cerca de dezessete a vinte horas depois da injeção de tioglicolato, os animais foram mortos por deslocamento cervical, e o conteúdo celular das bolsas foi recuperado através da injeção de 2,5 ml de PBS gelado/FCS a 5%. Os oligossacarídeos sulfatados foram testados quanto à sua capacidade de inibir a reação inflamatória ao serem injetados subcutaneamente (50 microlitros em PBS) em um local separado imediatamente após a administração do tioglicolato. Prednisolona foi usada como droga anti-inflamatória de controle, sendo injetada subcutaneamente em óleo a 25 mg/kg. O conteúdo celular total de cada bolsa foi determinado ao se usar um Contador Coulter, e as sub- populaçòes de leucócitos diferentes foram determinadas através de citometria de fluxo imunofluorescente.

Modelo de Asma de Camundongo

Um modelo de asma de camundongo indicado anteriormente (41) foi usado para testar a capacidade dos oligossacarídeos sulfatados inibirem a infiltração de eosinofil induzida por aeroalergina (ovalbumina, OVA) em pulmões. Os camundongos (C57BL/6, 6 a 10 semanas de idade) foram sensibilizados através de injeção i.p. com 50 mg de OVA/1 mg de Alhydrogel (CSL Ltd, Parkville, Australia) em solução salina estéril a 0,9% no dia zero e no décimo segundo dia. No vigésimo quarto dia, os camundongos foram expostos a um aerossol de OVA (10 mg/ml) em solução salina a 0,99% por trinta minutos três vezes (a intervalos de uma hora), e a seguir expostos a um desafio semelhante no vigésimo sexto e vigésimo oitavo dias. O aerossol foi gerado a 6 litros/min, por um nebulisador que produzia um diâmetro médio de partícula de 39 micrômetros em uma câmara fechada de 800 cm3. No vigésimo nono dia, os camundongos foram mortos por deslocamento cervical. As traquéias foram canuladas e as luminas das vias aéreas foram lavadas com 4 a 1 ml de solução salina a 0,9% contendo BSA (0,1% em peso/volume) a 37°C. Cerca de 0,8 ml do fluído instilado foi recuperado por lavagem. O fluído de lavagem broncoalveolar (BALF) obtido de um animal foi agrupado, e os números de células foram determinados ao se usar um hemocitômetro padrão. As células de BALF também foram centrifugadas e tingidas diferencialmente com solução de May-Grunwald- Giemsa, e os eosinófilos foram identificados ao se empregar critérios morfológicos. Os dados foram calculados como o número de eosinófilos por mililitro de BALF. Os oligossacarídeos sulfatados foram administrados aos animais tanto sistemicamente por meio de bombas miniosmóticas de Alzet i.p. quanto através dos pulmões como um aerossol. As bombas miniosmóticas foram inseridas no vigésimo terceiro dia 24 horas antes do desafio com OVA, e a droga foi administrada continuamente até os animais serem sacrificados no vigésimo nono dia. No caso da administração com aerossol, os camundongos foram expostos a um aerossol de oligossacarídeos sulfatados em solução salina a 0,9% por trinta minutos (a intervalos de uma hora) no vigésimo, vigésimo quinto e vigésimo sétimo dias. Modelo de EncefalomieIite de Autoimunização Experimental (EAE)

Células do baço foram preparadas para a transferência seletiva de EAE tal como descrito acima (43). Em resumo, ratos Lewis foram sensibilizados à proteína básica de mielina, as células de baço imunes foram ativadas por ConA in vitro, e 30 χ IO6 células de efetor de EAE ativadas por ConA foram transferidas i.v. para cada recipiente. As bombas miniosmóticas (Alzet) contendo oligossacarídeos sulfatados foram implantadas subcutaneamente no momento da transferência de células e foi aplicada uma dose de 70 mg/kg/dia por catorze dias. A EAE clínica foi graduada de acordo com o esquema a seguir: 0, assintomático; 1, metade distai da cauda flácida ; 2, cauda total flácida; 3, ataxia, dificuldade no endireitamento; 4, fraqueza nos membros traseiros; e 5, paralisia dos membros traseiros.

Modelo de Doença Intestinal Inflamatória

A doença intestinal inflamatória foi induzida em camundongos através da suplementação da água de beber com 5% (peso/volume) de sulfato de sódio e dextrana (DSS) fornecido pela TdB Consultancy, Uppsala, Sweden. A solução foi ajustada a um valor de pH = 8,0 e filtrada através de uma membrana de meio de 0,45 mícron. As soluções de DSS foram coletadas diariamente, refiltradas, e os volumes foram ajustados com material de DSS fresco. Camundongos BALB/c machos de seis a sete semanas de idade foram selecionados pelo peso corpóreo, e aqueles entre 20 e 23 g foram agrupados em gaiolas com cinco camundongos por gaiola.

Os camundongos foram injetados com fosfato de manopentaose sulfatada (20 mg/kg/dia) ou veículo (água estéril) a intervalos de oito horas, do dia zero ao décimo dia. O volume de injeção foi padronizado como 10 microlitros e injetado subcutaneamente na nuca.

O índice de consumo de DSS, o peso corpóreo e os sintomas foram classificados diariamente para todos os camundongos. Os sintomas de diarréia e sangramento retal foram classificados individualmente como ligeiro e intenso e receberam valores numéricos de 1 e 4, respectivamente. A presença de muco também foi observada e incluída como pontuação de diarréia leve. A soma das pontuações de diarréia e sangramento retal foi então dividida pelo número de animais sobreviventes nesse grupo nesse dia. A pontuação total é a soma de das pontuações de diarréia e sangramento retal. Β. RESULTADOS

Atividade Anti-angiogênica e Anti-metastática de Oligossacarídeos de Ocorrência Natural Sulfatados

Uma vez sintetizada uma gama de oligossacarídeos de ocorrência natural sulfatados, estes foram examinados em uma gama de análises biológicas. A Tabela 1 resume os resultados obtidos com as formas sulfatadas de doze oligossacarídeos de ocorrência natural. As atividades biológicas da suramina (um composto que tem uma atividade anti- angiogênica e inibidora de heparanase moderada) (42), e de heparina também estão incluídas na Tabela 1, para comparação.

Inicialmente, foi demonstrado que todos os oligossacarídeos testados tinham uma atividade anti-coagulante insignificante, ou seja, atividade de heparina de menos de 2% (Tabela 1). Essa era uma propriedade importante, uma vez que a heparina, um potente composto anti-metastático, tem uma utilidade clínica limitada para essa indicação devido à sua potente atividade anti-coagulante.

Três dos oligossacarídeos de ocorrência natural sulfatados eram inibidores bastante potentes da angiogênese humana, ou seja, fosfato de manopentaose sulfatado (derivado de P. holstii), sulfato de maltotetraose e sulfato de maltohexaose. O fosfato de manopentaose e de maltohexaose eram os mais potentes desses compostos, com uma concentração inibidora de 2 μg/ml, enquanto que a maltotetraose resultou em 50% de inibição a 20 μg/ml. Um exemplo da inibição pronunciada de angiogênese induzida por 20 μg/ml de maltohexaose está indicado na Figura 1. É interessante observar que a heparina tinha pouca atividade anti-angiogênica. Desse modo, parece provável que os oligossacarídeos sulfatados de comprimento de cadeia relativamente curto são necessários para esse tipo de atividade. Uma titulação mais completa da inibição da angiogênese pela série da maltose está indicada na Figura 2 e pelo sulfato de manopentaose sulfatado na Figura 3. Pode-se observar que, com a série da maltose, o sulfato de maltose teve uma pequena atividade inibidora, enquanto que a maltotetraose e o sulfato de maltotetraose foram inibidores bastante potentes (Figura 2).

Todas as experiências com angiogênese apresentadas na Tabela 1 envolveram a adição de oligossacarídeo ao meio de cultura no início da análise de angiogênese. No entanto, os estudos preliminares (dados não mostrados) indicam que a adição de sulfato de maltohexaose, depois do início da resposta de angiogênese, também pode inibir o crescimento adicional de vaso, embora a inibição mais eficaz ocorra quando o composto é adicionado no início da cultura.

Os oligossacarídeos sulfatados também diferiram de modo marcante na sua atividade inibidora de heparanase, sendo que os inibidores mais potentes são o fosfato de manopentaose sulfatado e o sulfato de mano- hexaose, e a atividade desses dois compostos se parece com a da heparina (Tabela 1). E interessante notar que esses dois compostos também são compostos anti-angiogênicos eficazes. No entanto, a inibição de angiogênese não foi correlacionada com a atividade inibidora de heparanase de muitos compostos. Por exemplo, as cicloamiloses sulfatadas eram inibidores de heparanase bastante potentes, porém fracos inibidores de angiogênese. A série da maltose também foi muito informativa com respeito ao comprimento de cadeia e a inibição de heparanase. A Tabela 3 apresenta a atividade inibidora de heparanase para a série completa da maltose, variando do dissacarídeo (maltose) ao heptassacarídeo (malto-heptaose). A maltose não era inibidora, a maltotriose era fracamente inibidora, a maltotetraose exibia uma atividade inibidora modesta, enquanto que os penta-, hexa- e heptassacarídeos exibiam uma elevada atividade inibidora. Desse modo, um polissacarídeo sulfatado é necessário para uma inibição ótima de heparanase.

Muitos dos açúcares sulfatados também tinham sido testados in vivo quanto à atividade anti-metastática (Tabela 1). Em geral, há uma correlação razoavelmente boa entre a inibição da heparanase e a atividade anti-metastática. Desse modo, o fosfato de manopentaose sulfatado e o sulfato de maltohexaose, os dois compostos com a mais alta atividade inibidora de heparanase, exibem a maior atividade anti-metastática; de fato, eles não diferem significativamente da heparina na sua capacidade de impedir a metástase (Tabela 1). Dois outros compostos, o sulfato de ciclo-octa- amilose e o sulfato de estaquiose, também eram agentes anti-metastáticos razoavelmente eficazes, uma propriedade compatível com a sua modesta atividade inibidora de heparanase. Coletivamente, esses dados sugerem que o fosfato de manopentaose sulfatado e o sulfato de maltohexaose possuem simultaneamente atividades anti-angiogênica, anti-metastática e inibidora de heparanase consideráveis.

A atividade anti-metastática da série da maltose de oligossacarídeos sulfatados está apresentada em mais detalhes na Figura 4.

Com o comprimento de cadeia crescente, havia um aumento estável na atividade anti-metastática dos oligossacarídeos, sendo que os penta-, hexa- e heptassacarídeos eram os mais ativos. Quando administrado intravenosamente a uma dose de 2 mg/rato, o sulfato de maltose não teve nenhum efeito sobre a metástase (Figura 4A), mas quando aplicado subcutaneamente a 4mg/rato foi observada uma inibição significativa da metástase (Figura 4B). As experiências subsequentes revelaram que, independente da rota de injeção (ou seja, i.v., subcutan. ou i.p.), os oligossacarídeos sulfatados exibiam uma atividade anti-metastática comparável (dados não mostrados). De fato, a atividade anti-metastática do sulfato de maltose só foi observada quando altas doses foram administradas aos animais. Uma vez que o sulfato de maltose é um inibidor de heparanase muito fraco, esse resultado sugere que a inibição de heparanase pode não ser a única maneira pela qual os oligossacarídeos sulfatados inibem a metástase de tumor, em particular quando são usadas doses elevadas dos oligossacarídeos.

As cicloamiloses foram sulfatadas e incluídas nc estudo, uma vez que elas representam oligossacarídeos não lineares. É interessante observar que esses compostos só eram modestamente ativos (Tabela 1), implicando que oligossacarídeos lineares podem ser necessários para uma atividade ótima. Além disso, os oligossacarídeos sulfatados mais ativos eram inibidores de angiogênese, metástase e heparanase muito mais eficazes do que a suramina (Tabela 1), uma droga atualmente sendo testada clinicamente como composto anti-angiogênico (42).

Uma vez que a atividade anti-angiogênica dos compostos nem sempre é diretamente correlacionada com a sua atividade inibidora de heparanase, parecia provável que os oligossacarídeos sulfatados pudessem inibir a angiogênese por algum outro mecanismo. Tal como acima mencionado, é altamente provável que alguns oligossacarídeos sulfatados possam perturbar a ação de fatores de crescimento angiogênico mediante o rompimento das interações de fator de crescimento-sulfato de heparan. As análises anteriores (vide o Pedido de Depósito de Patente de Invenção Internacional No. PCT/AU95/00105) revelaram que a análise de angiogênese humana usada neste exemplo depende bastante da ação de bFGF endógena, e até um grau menor de aFGF e VEFG. Desse modo, os vários oligossacarídeos sulfatados foram examinados quanto à sua capacidade de agir como concorrentes da interação de bFGF, aFGF e VEFG com heparina ou sulfato de heparan.

Foi verificado que, com o aumento do comprimento da cadeia, a série da maltose de oligossacarídeos sulfatados transformou-se em inibidores mais eficazes da interação de bFGF e aFGF com sulfatos de heparan de superfície de célula (Tabela 2), ou seja, a maltose era fracamente inibidora, enquanto que os penta-, hexa- e heptassacarídeos eram os mais ativos. O fosfato de manopentaose sulfatado também exibiu uma considerável atividade inibidora nesse sistema (Tabela 2). As curvas de inibição completa para a inibição da interação de aFGF-sulíato dc heparan pela série da maltose de oligossacarídeos sulfatados estão apresentadas na Figura 5. Estudos adicionais revelaram que o sulfato de maltohexaose também era um potente inibidor da ligação de heparina rádio-rotulada a bFGF e aFGF (dados não mostrados).

Uma vez que o sulfato de maltohexaose era um dos mais ativos compostos anti-angiogênicos e anti-metastáticos, a influência do grau de sulfatação em sua atividade biológica foi examinada em alguns detalhes. Inicialmente, foi observado que, até mesmo quando alguma atividade anti- coagulante foi detectada com a maltohexaose mais altamente sulfatada, essa atividade ainda era extremamente baixa quando comparada com a heparina (Tabela 2). No entanto, com o aumento da sulfatação, houve um aumento estável na capacidade da maltohexaose inibir a atividade de heparanase e a ligação de FGF a sulfato de heparan (Tabela 2). No entanto, a atividade inibidora estagnou nos dois sistemas quando a sulfatação era igual ou maior do que 85%.

Os estudos de inibição de metástase (Figura 6) também demonstraram que com graus decrescentes de sulfatação o sulfato de maltohexaose tornou-se uma droga anti-metastática mais eficaz. Por outro lado, houve uma sugestão de que a maltohexaose muito altamente sulfatada (90% a 100% sulfatada) era um inibidor menos eficaz da angiogênese (Figura 7). Esses dados sugerem que há diferenças sutis na estrutura de oligossacarídeo sulfatado ótima necessária para inibir a angiogênese e a metástase. No entanto, foi identificada uma série de oligossacarídeos sulfatados, derivados de oligossacarídeos de ocorrência natural, que exibem simultaneamente potentes atividades anti-metastática e anti-angiogênica. Esses compostos são o sulfato de manopentaose sulfatado de P. holstii e os sulfatos de malto-pentaose, -hexaose e -heptaose. Atividade Anti-angiogênica e Anti-metastática de Oligossacarídeos Sintéticos Sulfatados

Os oligossacarídeos sintéticos sulfatados descritos nos Exemplos 1 a 5 também foram testados quanto à sua atividade biológica. A Tabela 3 resume a capacidade dos oligossacarídeos sintéticos sulfatados que contêm manose, galactose ou glicose de inibirem a coagulação, a ação da heparanase e a ligação de fator de crescimento-sulfato de heparan. Todos os oligossacarídeos sintéticos sulfatados testados exibiram uma atividade anti- coagulante insignificante. No entanto, com exceção dos trissacarídeos de manose e glicose, todos os outros oligossacarídeos sulfatados eram inibidores razoavelmente eficazes da atividade de heparanase e da ligação de fator de crescimento-sulfato de heparan. De fato, a conclusão geral é que os oligossacarídeos sintéticos sulfatados contendo quatro a seis unidades de hexose (ou seja, D-manose, D-galactose ou D-glicose) são altamente ativos nessas análises. Uma exceção é o sulfato de galactotriose, que era essencialmente tão ativo quanto os outros membros da série da galactose.

Quando testados na análise de angiogênese humana, os oligossacarídeos de manose sulfatados foram inibidores, embora os penta- e hexassacarídeos fossem mais ativos do que o tetrassacarídeo (Figura 8), se parecendo com o fosfato de manopentaose sulfatado em sua eficácia. De maneira análoga, os tetra-, penta- e hexassacarídeos de manose sulfatados eram tão eficazes quanto o sulfato de manopentaose sulfatado como drogas anti-metastáticas (Figura 9). Os oligossacarídeos sulfatados contendo galactose e o sulfato de glico-hexaose também inibiram a metástase (Figura 10), embora tendessem a ser ligeiramente menos ativos do que os compostos contendo manose.

Atividade Anti-inflamatória de Oligossacarídeos Sulfatados

Tal como acima mencionado, uma barreira chave contra a entrada de leucócitos nos locais inflamatórios é a membrana base subendotelial. A fim de atravessar essa membrana, os leucócitos devem empregar uma bateria de enzimas degradai;vas (11). É de importância particular a endoglicosidade, heparanase, que cliva as cadeias de sulfato de heparan associadas com a membrana base e é essencial para o extravasamento de leucócitos (12, 13). De fato, tal como nos estudos de inibição da metástase (35), os polissacarídeos sulfatados que inibem a atividade da heparanase são potentes inibidores da inflamação (43, 44). Com base nessas observações, deve ser considerado pelos elementos versados na técnica o fato que os oligossacarídeos sulfatados que eram potentes agentes anti-angiogênicos e anti-metastáticos deviam ser compostos anti- inflamatórios muito eficazes. A esse respeito, são de importância particular o sulfato de maltohexaose e o sulfato de manopentaose. Além disso, uma vez que a angiogênese é associada com as doenças inflamatórias crônicas tais como artrite reumatóide (18), a atividade anti-angiogênica desses compostos deve ser de valor adicional no tratamento da inflamação.

Foi obtida uma evidência a favor dessa previsão em vários modelos animais de inflamação. Em primeiro lugar, o sulfato de maltohexaose, o sulfato de manopentaose e o fosfato de manopentaose sulfatado puderam inibir de maneira significativa a inflamação de bolsa de ar induzida por tioglicolato (Tabela 4). De fato, em uma experiência uma só injeção de sulfato de manopentaose foi tão eficaz quanto prednosol na inibição da infiltração de leucócitos, que era de natureza predominantemente neutrófila, enquanto que o sulfato de maltohexaose era um pouco menos eficaz. Uma inibição da resposta inflamatória até mesmo maior foi observada quando os oligossacarídeos sulfatados foram injetados em duas doses iguais com um espaçamento de seis horas.

Em segundo lugar, os oligossacarídeos sulfatados foram testados quanto à sua capacidade de inibirem um modelo de camundongo de asma crônica. Esse modelo é caracterizado por um influxo maciço de eosinófilos nos pulmões de camundongos que é induzido pelo desafio com aeroalergênco (41). Essa resposta inflamatória é csrac.terír.tica da asma crônica em seres humanos. Quando administrados através de bombas miniosmóticas, o sulfato de maltohexaose e o sulfato de manopentaose inibiram de maneira significativa o acúmulo de eosinófilos nos pulmões de camundongos (Tabela 5). O sulfato de maltohexaose também exibiu alguma atividade anti-inflamatória quando administrado como um aerossol (solução a 40 mg/ml).

Em terceiro lugar, o sulfato de manopentaose e o fosfato de manopentaose sulfatado inibiram de maneira significativa a EAE em um modelo de rato da doença (Tabela 6). De fato, alguns animais tratados com os oligossacarídeos sulfatados não conseguiram desenvolver sintomas da doença. Esses dados são compatíveis com os estudos anteriores revelando que os polissacarídeos sulfatados que inibem a atividade da heparanase podem reduzir a gravidade da EAE (43).

Por fim, o fosfato de manopentaose foi examinado quanto à sua capacidade de inibir um modelo de doença intestinal inflamatória em camundongos. Esse modelo, que é induzido pelo sulfato de dextrana na água de beber, induz uma colite que se parece com a colite ulcerativa e, até um menor grau, a doença de Chron. Foi verificado que a 20 mg/kg/dia de fosfato de manopentaose sulfatado causou uma atenuação marcante de colite aguda e também impediu a perda de peso corpóreo causada pela doença (Tabela 7).

Os controles nesta experiência receberam as injeções de oligossacarídeo sulfatado mas não o sulfato de dextrana em sua água de beber. TABELA 1

<table>table see original document page 46</column></row><table> a Atividade anti-coagulante como percentagem da atividade da heparina (100%).

b Percentagem de controle da metastase ± erro padrao da media (n=4) em pulmoes de ratos recebendo celulas de 13762 MAI i.v. e 2 mg/rato de cada oligossacarideo no momento da injeijao de celulas de tumor. Os valores sublinhados representam os compostos com o maior efeito anti-metastatico.

c Fosfato de manopentaose isolado do levedo Pichia liolstii. ND Nao determinado. Tabela 2

<table>table see original document page 48</column></row><table> a^ Numero real de grupos sulfato ligados/numero teorico maximo de grupos sulfato que podem ser acoplados a cada molecula.

b^ Atividade anti-coagulante como percentagem da atividade da heparina (100%).

c^ Concentracao de composto necessaria para inhibir em 50% a atividade de heparanase, o valor de celulas de 3T3 de camundongo a aFGF/bFGF imolizado. No caso da analise de heparanase, o valor de IC50 para a Heparina foi de 2 µg/ml.

d^ fosfato de manopentaose isolado do levedo pichia holstii. ND = Nao Determinado. TABELA 3

INIBICAO DA AT1V1DADE DE HEPARANASE E DA LIGA^AO DE FATOR DE CRESCIMENTO A SULFATOS DE HEPARAN PQR FORM AS SULFATADAS OL1GOSSACARIDEOS SULFATADOS DIFERENTES

<formula>formula see original document page 50</formula>

a Numero real de grupos sulfato ligados/numero teorico maximo de grupos sulfato que podem ser acoplados a cada molccula.

b Atividade anti-coagulante como percentagem da atividade da heparina (100%).

c Concentrafao de composto necessaria para inibir em 50% a atividade de heparanase de plaquetas humanas, on a iiga^ao de celulas de 3T3 de camundongo a aFGF/bFGF imobilizado. No caso da analise de heparanase, o valor de IC50 para a heparina foi de 2 fig/ml. ND = Nao determinado.

ND= Nao determinado TABELA 4

EFEITO DE OLIGOSSACARÍDEOS SULFATADOS NA INFLAMAÇÃO DE BOLSA DE Ara

<table>table see original document page 51</column></row><table>

a Inflamação de bolsa de ar induzida por injeção de triglicolato e influxo e leucócitos determinado dezessete horas mais tarde. Os tratamentos com drogas foram injetados subcutaneamente no mesmo momento que o tioglicolato para a Experiência 1. Na Experiência 2, os oligossacarídeos sulfatados foram injetados subcutaneamente na hora zero e na sétima hora depois da injeção de tioglicolato.

Dados apresentados como percentagem de controle do número de leucócitos no material infiltrado da bolsa de ar ± erro padrão da média. Os controles foram injetados com o tioglicolato mas não receberam nenhuma tratamento com drogas, apenas uma injeção de solução salina. O material infiltrado de leucócitos de base nas bolsas de ar que foram injetadas só com solução salina era de 9±2% daquele observado depois da injeção de tioglicolato.

ND = Não determinado. TABELA 5

EFEITO DE OLIGOSSACARÍDEOS SULFATADOS NO ACÚMULO DE EOSINÓFILOS INDUZIDO POR OVALBUMINA (OVA) EM PULMÕES DE CAMUNDONGOSa

<table>table see original document page 52</column></row><table>

a Camundongos sensibilizados a OVA e a seguir um influxo de eosinófilos de pulmão induzido pela administração em aerossol de OVA. Os oligossacarídeos sulfatados administrados tanto i.p. com bombas miniosmóticas quanto através dos pulmões como um aerossol

b Dados expressos como percentagem de controle do número de eosinófilos no fluído de lavagem broncoalveolar (BALF) ± erro padrão, sendo que os controles são animais que foram desafiados com OVA e receberam solução salina tanto através de bombas miniosmóticas quanto através dos pulmões como um aerossol.

c Concentração de oligossacarídeo sulfatado na solução de aerossol. TABELA 6

EFEITO DE OLIGOSSACARÍDEOS SULFATADOS NA ENCEFALOMIELITE DE AUATOIMUN1ZAÇÃO EXPERIMENTAL ADOTIVAMENTE TRANSFERIDA (EAE)3

<table>table see original document page 53</column></row><table>

a EAE induzida em ratos com 30 χ IO6 células de efetor de EAE ativadas por ConA.

b Oligossacarideos sulfatados, administrados subcutaneamente através de bombas miniosmóticas inseridas no momento da transferência das células, aplicados a uma dose de 70 mg/kg/dia.

c Média diária de começo de EAE em animais com doença desenvolvida.

d A gravidade da doença representa a pontuação clínica cumulativa de animais. TABELA 7

EFEITO DE FOSFATO DE MANOPENTAOSE SULFATADO EM DOENÇA INTESTINAL INFLAMATÓRIA EM CAMUNDONGOSa

<table>table see original document page 54</column></row><table>

a Doença intestinal inflamatória induzida pela administração de sulfato de dextrana na água de beber.

b Dias depois do início da administração de sulfato de dextrana.

c Os animais não tratados receberam injeções de veículo três vezes ao dia, enquanto que os animais tratados receberam injeções de fosfato de manopentaose sulfatado três vezes ao dia a uma dose de 20 mg/kg/dia.

d A pontuação média da doença representa a soma de pontuações de diarréia e sangramento retal para os animais em cada ponto no tempo. Referências

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Claims

1. Oligossacarídeo sulfatado sintético, caracterizado pelo fato de que o oligossacarídeo tem a fórmula geral I: Ry-(Ry)n-Ry (II) na qual: cada grupo Ry é o mesmo, e cada um representa uma unidade monossacarídica de hexose, que é manose ou galactose, sendo que as unidades monossacarídicas adjacentes são ligadas por ligações glicosídicas -1→3, 1→4 e/ou 1→6; e η é um número inteiro de 3 a 6; pelo menos 55% dos grupos hidroxila disponíveis nas unidades monossacarídicas de hexose são O-sulfatados; e Ry é opcionalmente fosforilado.

2. Oligossacarídeo sulfatado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que η é 3 ou 4.

3. Oligossacarídeo sulfatado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o oligossacarídeo é derivado de um oligossacarídeo de ocorrência natural.

4. Oligossacarídeo sulfatado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o oligossacarídeo é derivado do exopolissacarídeo produzido pela levedura diplóide Pichia holstii.

5. Oligossacarídeo sulfatado de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o oligossacarídeo é fosfato de manopentaose da levedura Pichia holstii.

6. Composição farmacêutica ou veterinária para tratamento anti-angiogênico, anti-metastático e/ou anti-inflamatório, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos um oligossacarídeo sulfatado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, juntamente com um veículo ou diluente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável para o mesmo.