JPS6227402A - グリコサミノグリカンの硫酸化方法、該方法によつて得られる新規グリコサミノグリカン及びその生物学的適用 - Google Patents
グリコサミノグリカンの硫酸化方法、該方法によつて得られる新規グリコサミノグリカン及びその生物学的適用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明はグリコサミノグリカンの硫酸化方法に係る。
本発明は更に、硫酸化度か可変な新規グリコサミノグリ
カン即ちＧＡＧ、及びその生物学的適用に係る。 以下の記載及び特許請求の範囲の記載中、ＧＡＧなる語
はＧＡＧ、 ＧＡＧのフラクンヨンもしくはフラグメン
ト、又は生理学的に許容可能なこれらの塩の１つを任意
に表すために使用される。 「ＷＬ酸化度」なる表現は、ウロン酸−アミノ糖（又は
逆）の二糖単位当たりの硫酸基ＳＯ３−の数、或いはＳ
Ｑ、−／Ｃｏｏ−比を表すものである。 ＧＡＧは、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、
フンドロイチン、コンドロイヂン硫酸又はヒアルロン酸
のような生物学的に活性な天然ＧＡＧのオリゴ及び多糖
鎖に見出だされる型のウロン酸−アミノ糖（又は逆）の
交互モチーフから本質的に形成されていることが知られ
ている。 ウロン酸モチーフは特にＤ−グルクロン又はＬ−イズロ
ン酸構造に対応し、アミノ糖モチーフはＤ−グルコサミ
ン又はＤ−ガラクトサミン構造に対応する。 特に凝固障害及び血管壁の不全に関連する疾患、特に血
栓形成、アテローム性静脈硬化症及び動脈硬化症の予防
及び治療用として、或いは組織の老化又は脱毛症のよう
な退行型症状に対抗するために上記天然ＧＡＧを治療薬
として使用することの重要性は既知である。 又、天然ＧＡＧの抽出、又は化学的もしくは酵素０脱重
合により、天然物質よりも重合度が低く、特に血液凝固
因子Ｘａに対して高い特異活性を有するＧＡＧを得られ
ることも知られている。重合度（又は省略形ｄｐ）とは
、グリコンド鎖のウロン酸又はアミノ糖から成る糖モチ
ーフの数を表す。 少なくと６２．５の硫酸化度、即ち天然ヘパリン及び既
知の低分子量のヘパリンよりも高い硫酸化度を存する脱
重合ヘパリンは、＾ｎｉｃ Ｓ、ｐ、Ａ、名義の１９８
３年１２月１６日付ヨーロッパ特許出願ＥＰ。 ０１１６８０１号に記載されており、抗血栓症性、低脂
肪症血性及び繊維素溶解性作用を有する医薬として提案
されている。 この脱重合ヘパリンは前記ヨーロッパ特許出願中では過
硫酸化ヘパリンと呼称されており、天然ヘパリン又はそ
のフラクションの１つを硫酸及び得られる。この過硫酸
化処理は酸の加水分解を生じ、ｄｐ＝８〜３０の鎖混合
物をもたらす。 発明者らはこの分野で研究した結果、所定の条件で所与
の硫酸化処理を実施することにより、構造及び重合度の
いずれをも変化させずに一般に実質的に高い収里でＧＡ
Ｇの硫酸化度を変化できるこさＵ・ることにより、特に
ある特性を増加させ別の特性を減少させろことにより作
用の特異性を改良できることが明らかになった。 本発明の目的は、充填率を所望通りに変化させろことの
可能な所定の生成物を得るための硫酸化方法を提供する
ことにある。 本発明の目的は更に、充填率が可変な新規ＧＡＧ、カ 特に所定の特徴、特にＡ−重合度を有するＧＡＧを提供
することにある。 硫酸化度の可変な本発明のＧＡＧの製造方法は、所与の
ＧＡＧを有機溶媒に可溶性の塩に変換し、これを有機溶
媒中に可溶化さき、溶解した塩を硫酸化剤により処理す
ることを特徴とする。 この構成はあらゆるＧＡＧに適用され、重合度及硫酸エ
ステル基−８０３−を所望の程度に従って導入でいる。 他の構造的特徴、特に重合度については既知通りである
。 従って、所望の生成物の関数として出発時に所与のＧＡ
Ｇを選択すれば十分である。 本発明の一具体例によると、出発ＧＡＧはＤ−グルコサ
ミン−ウロン酸夕（即ちＬ−イズロン酸又はＤ−グルク
ロン−交互モチーフを主体とする。この上うれる。 一好適具体例では、ヘパリン、ヘパラン硫酸、それらの
フラクション又はフラグメントを使用する。 別の好適具体例では、出発ＧＡＧはヘパリン又はヘパラ
ン硫酸よりし少ない糖モチーフ数、特に２〜３０の範囲
のモチーフ数を存する鎖混合物又は重合度に関する限り
において均一の鎖混合物から形成されろ低分子量のＧＡ
Ｇである。 こＣらの低分子量（省略形ＰＭ）のＧＡＧは特に以下の
物質を包含する。 −１９７８年１１月６日付仏国特許公開明細書第２４４
０３７６号及び１９７９年７月２０日付第−追加特許公
開明細書第２４６１７１９号の記載に従ってアルコール
抽出によりヘパリンから得られるようなムコ多糖。主特
許に記載の態様の１つによるとこれらの物質は、Ｙｉｎ
−Ｙｅｓｓ ｌｅｒ／ＵＳＰ比か少なくとも２であり分
子量が約２０００〜８０００の鎖混合物から形成される
。上記文献中に記載の物質中、ＹＷ／ＵＳＰ比が約３〜
５及び平均分子量が３０００〜５５００の物質を挙げる
ことができ、以下の文中ではこれをＣＹ２１６と呼称す
る。 −特に上記仏国特許公開明細書第２４４０３７６号の１
９８０年３月２０日付第二追加特許公開明細書第２４７
８６４６号及び１９８１年４月１０日付仏国特許公開明
細書第２５０３７１４号の記載に従ってヘパリンを亜硝
酸で脱重合することにより得られるようなムコ多糖。 これらの物質は一般に上記ムコ多糖と同様の特徴を有し
ており、且つ２．５−アンヒドロマンノ構造の基を末端
に有している。 この例としては、以下ＣＹ２２２と呼称するような２．
５−アンヒドロ−マンニトール末端を有する型のムコ多
糖、或いは２．５−アンヒドロマンノン酸末端を有する
型のムコ多糖が挙げられる。大多数の欠゛リコソド鎖の
分子量はより特定的には２０００〜３０００程度、特に
約２０００〜２６００である。Ｙｉｎ−％’ｅｓｓｌｅ
ｒ／［ＩＳＰ比は特に少なくともｌ０１Ｙ ｉ ｎ −
Ｙｅｓｓ ｌｅｒ値は少なくとも約２００ｕ／死である
。 −（１）平均分子量が３０００〜６０００ドルトン、特
に約４０００〜５０００ドルトンであり、（２）ＶＷ／
ＵＳＰ比が１０未満、特に６〜３であり、（３）２．５
−アンヒドロマンノ構造のモチーフを末端に有する鎖か
ら本質的に形成されており、例えば１９８４年１０月１
８日付仏国特許公開明細書第２５７２０８０号に記載の
方法に従って得られるようなムコ多糖、 −２０００ｕ／”ｇに達し得ろ高いＹｉｎ４ｅｓｓｌｅ
ｒ値と実質的にゼロに等しい小さいＵＳＰ値とを有して
おり、ＡＴＩＵに対して強い親和性を有する最大８個の
糖モチーフから形成されており、特に１９８０年ｌＯ月
６日付ヨーロッパ特許出願第００２７０８９号に記載さ
れているようなオリゴ糖。 一変形例によると、前記オリゴ糖は亜硝酸による脱重合
により得られ、２．５−アンヒドロ−マンノ構造の基を
末端に有している。 別の変形例によると鎖の発端モチーフは、ヘパリンをヘ
パリナーセで脱重合することにより形成されるような不
飽和ウロン酸モチーフに対応する。 特に、これらのオリゴ糖は下式・ に対応する構造ＡＢＣＤＥＦＧ１１のへ糖から形成され
る。 −前記へ糖をヘパリナーゼで処理することにより１９８
１年４月２９日付仏国特許公開明細書第２５０４９２８
号に記載の方法に従って得られるような六糖の均一組成
。特にこの組成は下式に対応する。 Ｃ’ ｐｌｌ−Ｆ ＣＴｌ−１−均一重合
度のオリゴ又は多糖、特に物質ＣＹ２２２、ＣＹ２１６
、ヘパリン又は他のＧＡＧをセファデックスのような材
料上でろ過することにより又はイオン強度勾配クロマト
グラフィにかけることにより得られるオリゴ又は多糖。 −ヘパリンに過沃素酸塩を作用させた後、塩基性溶媒中
で処理することにより得られるようなＧＡＧｏ−例えば
ヘパリンの脱重合混合物をゲル上でろ過することにより
得られるような重合度に関して均一のＧＡＧｏ −ヘパリンをヘパリナーゼ又は亜硝酸で脱型合し、ＡＴ
ＩＩＩ固定配列を有するフラクションを分離し、ＡＴ■
に対して親和性を有する多様な重合度のＧＡＧフラグメ
ントを得るべく前記フラクションをゲル濾過することに
より得られるようなＧＡＧ０而記ＧＡＧの例として、一
方ではｄｐか１２より大きいフラグメント、他方ではよ
り低い重合度、特に１２．１０，８，６．４及び２個の
糖モチーフに対応するｄｐ値を有するＧＡＧフラグメン
トとが挙げられる。 −上記と同様のＧＡＧでありながら、ＡＴＩＩＩを特異
的に認識ずろことの可能な配列を全＜ （＋ｉｉｉえず
且つゼロに等しい小さいＹＷ値を有するＧＡＧｏ特に、
ヘパリン又はＧＡＧをＡＴＩＴＩと接触後、多様なｄｐ
の均一フラグメントを得るへくゲル濾過する段階を含む
工程中にＡＴＩＩＩに固定されないオリゴ糖。 −ヘパリン中に見出だされるような連鎖を有しており、
グルコザミンモチーフの２位の−ＮＩＩＳＯ，ｌ−基の
一部、或いは大部分、或いは全体が−ＮＨ−アンル、特
に−ＮＩｌ−アセデル又は−Ｎｌ１２基により置換され
たＧＡＧＳｍ記ＧＡＧのフラクション及びフラグメント
。 −動物器官の処理により得られろＧＡＧの組成に対応す
る所謂全ＧＡＧ０ これらの各ＧＡＧは例示として列挙したものに過ぎず、
本願出願人に特に既知の物質であり、また本願出願人名
義の各特許及び特許出願中に記載されている物質に対応
するものと理解されたい。 ところで、上述したように本発明の方法は、任意の型の
ＧＡＧを使用できるという利点を有するものである。 従って本発明の更に別の一具体例によると、出発物質と
して使用されるＧＡＧはＤ−ガラクトザミンーウロン酸
交互モチーフを主体とする。 −好適具体例において、出発ＧＡＧはデルマタン硫酸、
コンドロイチン、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸
、これらのフラクション及びフラグメントから選択され
る。 一変形例ではデルマタン硫酸が有利である。 本発明の構成によると、上記ＧＡＧのグリコシド鎖の糖
モチーフの１又は数個の第一又は第ニー〇ｉｌ基は保護
基により保護されるので、所望に応じて別の位置を硫酸
化し、保護基の代わりに所与の基を導入し、更に保護さ
れた一０１１基を再生することかできる。 前記保護基は、アセチル、置換基を有するアセチル、ベ
ンゾイルのようなアシル基から選択される。 硫酸化処理を受けるＧＡＧ塩は、有機溶媒中に可溶性の
塩である。 好ましくはアミン塩が使用される。 アミン塩としては、式−Ｎ（Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３Ｘ式中、
ＲＩ。 Ｒ２及び／又はＲ３は水素原子又は１〜１０個の炭素原
子を存する脂肪族鎖である）で表されるアミンの塩、特
にトリエチルアミン又はトリブチルアミン或いは第四級
アンモニウム塩（例えばテトラブチルアンモニウム、テ
トラブチルアンモニウム又はベンゼトニウム）を使用す
ると有利である。 当然のことながら塩の性質は例えば立体的寸法により硫
酸化反応に影響するので、所定の位置を優先的に硫酸化
ずろことが可能である。 ＧＡｃｊ塩は有利には、酸性イオン交換樹脂を使用する
ことにより得られた酸形態のＧＡＧを、形成しようとす
る塩に対応するアミンの作用下におくことにより得られ
る。 ＧＡＧ塩は有機溶媒中に溶解される。より特定的にはジ
メヂルーホルムアミド（ＤＭＦ）、ノメチルスルポキノ
ド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメヂルホスポトリアミド（ＩＩ
ＭＰＴ）又はアセトニトリルのような二極性非プロトン
性溶媒が使用される。ピリジンを使用してもよい。 有利には、硫酸化剤は無水硫酸Ｓ０３とトリメヂ体から
選択される。 同様の硫酸化剤は、Ｅ、Ｅ、Ｇ１１ｂｅｒｔによりＣｈ
ｅｍｉｃａｌＲｅｖｉｅｗ、 １９６２． ｖｏｌ、６
２．５４９−５８９中に報告されている。 反応条件を検討した結果、十分な硫酸化率はＧＡＧの０
１１当量当たり約１〜５倍等量の複合体を使用すること
により得られることがわかった。 硫酸化反応は、有利にはＯ’Ｃ−１００℃程度、特に室
温程度又はそれ以上の温度で約１０〜１４時間実施され
る。場合によっては約２０℃というような室温より低い
温度も使用され得る。 反応条件、特に反応溶媒、温度及び時間は選択反応を実
施するのに好適な方法で選択される。 場合によって存在する保護基は、例えばＯ−アソル特に
Ｏ−アセチル保護基の場合は鹸化により、例えばベンゾ
イル基の場合には接触還元により脱離される。 生成物は、例えばゲル濾過又は限外ｐ過後カヂオン交換
樹脂により所望のカチオン形態にする処理を介して反応
混合物から回収される。その後、水に混和性の溶媒で生
成物を沈降させる。 −変形例によると、重合度に関して均一のＧＡＧを得る
ために、得られた過硫酸化ＧＡＧにゲル濾過処理を加え
る。 特に亜硝酸、ヘパリナーゼ又は過沃素酸塩を使用する方
法ではｄｐ対の鎖を得ることができる。 上記構成により、所望の硫酸化率に従って制御される硫
酸化が可能になり、オシド構造を劣化させることら又そ
の均一性を変化させることらなく所定の生成物に高い収
率を得ることができる。 特に注目すべき点として、出発物質の構造を変化させな
い本発明の硫酸化方法は、硫酸化以面又は以後に付加的
な分離段階を実施することにより、可変硫酸化率を有し
ており且っｄｐに関して均一のＧＡＧを得ることができ
る。 こうして所与の用途に適合する生成物を直接製造するこ
とができる。 重合度に関して均−又は混合形態の硫酸化修飾形の本発
明のＧＡＧは、下式１： ％式％ （式中、Ｒはウロン酸又は不飽和ウロン酸又はＯ１＋基
であり、Ｘは２位の炭素がＮ１（ＳＯ２−基により置換
され、グルコサミン及びヘパリン型の鎖の場合にはＮＨ
２又はＮｉ＋−アシル基により置換されたグルコサミン
又はガラクトサミンであり、Ｙはウロン酸即ちＤ−グル
クロン酸又はＬ−イズロン酸であり、ｎは０〜８０の整
数であり、Ｒｏは２位の炭素がＮＨＳＯ３−により置換
され、グルコサミン及びヘパリン型の鎖の場合にはＮＨ
，又はＮＨ−アシル基により置換されたグルコツであり
、Ｘ及びＹモチーフ及び場合によってはＲ及びＲｏの第
一又は第二〇ｉ＋基は、ＧＡＧの鎖における硫酸基の位
置及び／又は数が対応するＧＡＧの天然又は脱重合鎖に
おける位置及び／又は数と異なるように硫酸化されてい
る）又は薬理的に許容可能なそれらの塩に対応すること
を特徴とする。但し合計８〜３０個のグルコサミン−ウ
ロン酸モチーフを存する非修飾末端鎖の混合物はこれに
含まれない。 好適な生成物の族は下式■に対応する。 なお式中、Ｒ、ハＩＩ又ｉ、ｔＳＯ３−１Ｒ２ハ）ｌ、
５ｏ３−又ハアシル基、特にアセデル基であり、Ｒ及
びＲｏは上記と同義である。 別の好適な族において、Ｘ及び場合にょっごはＲｏはガ
ラクトサミンモチーフであり、ガラクトサミン−ウロン
酸モチーフ間の結合は１→４β、Ｄ型であり、場合によ
って存在するウロン酸−ガラクトサミンモチーフ間の結
合は１−３α、Ｌ型又は１−３α。 Ｄ型である。 これらの族の好適な群は１２以下の糖モチーフ数を有す
るＧＡＧを含んでいる。 特に、Ｒが不飽和ウロン酸であるＧＡＧが使用される。 変形例として、転位モチーフがグルコサミンである場合
にはＲｏか２．５−アンヒドロマンノ構造の基であり、
転位モチーフがガラクトサミンである場合にはＲｏが２
．５−アンヒドロヘキシトール構造であるようなＧＡＧ
が使用される。好適なＧＡＧにおいて、Ｒ“は２．５−
アンヒドロマンニトール構造の基である。 好適なこの群の有利なＧＡＧは、糖モチーフ数が４．６
又は８個の鎖を含む混合形態又は重合度に関して均一の
ＧＡＧの集合から構成されている。 これらのＧＡＧにおいて、Ｒ及びＲｏは同時にＯＨであ
るか又は夫々ウロン酸及びグルコサミンであり、或いは
Ｒｏは２．５−アンヒドロマンノ構造の基、好ましくは
２．５−アンヒドロマンニトール構造の基である。 別の有利なＧＡＧは、ｄｐが８、ｌＯ又は１２の鎖の混
合物から構成されており、Ｒ及び／又はＲｏは修飾され
た糖モチーフである。 別の有利なＧＡＧは、糖モチーフ数が８．１０又は１２
個の鎖を含む重合度に関して均一のＧＡＧから構成され
ている。 更に別のＧＡＧは、式Ｉに対応する鎖混合物から構成さ
れ、式中ｎは３〜１５の整数、Ｒ及び／又はＲｏは修飾
された糖モチーフである。 一変形例によると、上記各群におけるグルコサミンの２
位の炭素はＮｉ＋２又はＮｌ＋−アシル、特にＮｌ＋−
アセチル基により置換される。 このようなＧＡＧは、亜硝酸による脱重合によって得ら
れ、分子ｌ ２０００〜８０００の２．５−アンヒドロ
マンノ、特に２．５−アンヒドロマンニトール末端モチ
ーフを有しており、Ｙｉｎ４ｅｓｓｌｅｒ／ＵＳＰ比が
少なくと６３であり、Ｙｉｎ−Ｗｅｓｓｌｅｒ値が少な
くとも２００ｕ／Ｔｎｇ、であり平均分子量が２０００
〜３０００の鎖混合物から形成されるムコ多糖から有利
に製造される。 変形例においてこれらのＧＡＧは、亜硝酸による脱重合
により得られ、２，５−アンヒドロマンノ、特に２，５
−アンヒドロマンニトール末端モチーフを有しており、
約３〜６のＹｉｎ −Ｙｅｓｓ ｌｅｒ／ＵＳＰ比と４
０００〜５０００の平均分子量とを有する鎖混合物から
形成されるムコ多糖から構成される出発物質から製造さ
れる。 グルコサミン−ウロン酸又はガラクトサミン−ウロン酸
又はその逆の交互モチーフを含む族の他の好適な群は３
０個より多い糖モチーフ数を含んでいる。 有利なことには、本発明により得られるＧＡＧは所与の
生物学的特性を特異的に変調することが可能である。 硫酸化形態の修飾の関数として生物学的活性を変調する
特性は、複数の実験モデルで確認された。 碌固活性 ａ／活性化因子Ｘ（因子Ｘａ）に対する抑制活性。この
実験ではＴｅ１ｅｎ ｅｔ Ｌｉｅ、 １９７７、 Ｔ
ｈｒｏｍｂｏｓ、 Ｒｅｓ、。 限、 ３：３９９−４１０に記載の方法に従って色原体
５２２２２による定量モデル（ストックホルムＩ： ａ
ｂ ｉ社）を使用した。 結果を試験物質１当たりの単位で表した。 ｂ／活性化因子■（因子ＩＪａ）又はｌ・ロンビンに対
する抑制活性。モデルは、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＥ
）又はヘパリンの補因子（ＩＩＣＵ）の存在下で因子１
１ａの活性を５０％まで抑制することの可能なグリコサ
ミノグリカン濃度を検討する乙のである。 結果を蛯当たりの試験物質ｌ公債で表した。 ｃ／ＡＰＴＴ法（Ｃａｅｎ Ｊ、、 Ｌａｒｒｉｅｕ
Ｍ、Ｊ、 ｅｔ Ｓａｍａｍａ Ｍ、。 ｉｎ Ｉ’Ｈｃｍｏｓｔａｓｅ、Ｐａｒｉｓ、 Ｅｘｐ
ａｎｓｉｏｎ ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅＰｒａｎｃａ
ｉｓｅ、 １９６８． ｐｐ １３３−１３５参照）に
よる凝固時間の測定。 ここでは、凝固時間を２倍にするために必要な被試験物
質の濃度を検討した。 結果をｉ当たりの試験物質■値で表した。 ｄ／Ｗｅｓｓｌｅｒモデル（Ｗｅｓｓｌｅｒ Ｓ、、
Ｒｅｉｍｅｒ Ｓ、Ｍ、、 ｅｔＳｈｃｐｓ Ｍ、Ｃ１
、Ｊ、 Ａｐｐｌ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 １４（６）
９４３−９４６゜１９５９参照）によるウサギ生体内の
抗血栓症活性。 凝塊形成剤（ヒトトロンボプラスヂン）の投与の３分前
に、被試験物質をｌＯ〜５００μｇ／ｋｇの投与量で頚
動脈に注射した。 結果を血栓形成抑制百分率として表した。 内皮細胞への固定の検査 害渠是 一細胞培養 Ｊａｒｒｅ他の方法により形成したヒトｐ静脈内皮細胞
の１次培養物を、５％のＣＯ２を含む湿潤雰囲気内で、
子牛胎児血清（ＳＶＦ）２０％を加えた培地Ｍ１９９中
で培養した。 ５目ｌ」と６日目との間に融合細胞単層が得られる。 −ぼ夜］ｌ
カン即ちＧＡＧ、及びその生物学的適用に係る。 以下の記載及び特許請求の範囲の記載中、ＧＡＧなる語
はＧＡＧ、 ＧＡＧのフラクンヨンもしくはフラグメン
ト、又は生理学的に許容可能なこれらの塩の１つを任意
に表すために使用される。 「ＷＬ酸化度」なる表現は、ウロン酸−アミノ糖（又は
逆）の二糖単位当たりの硫酸基ＳＯ３−の数、或いはＳ
Ｑ、−／Ｃｏｏ−比を表すものである。 ＧＡＧは、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、
フンドロイチン、コンドロイヂン硫酸又はヒアルロン酸
のような生物学的に活性な天然ＧＡＧのオリゴ及び多糖
鎖に見出だされる型のウロン酸−アミノ糖（又は逆）の
交互モチーフから本質的に形成されていることが知られ
ている。 ウロン酸モチーフは特にＤ−グルクロン又はＬ−イズロ
ン酸構造に対応し、アミノ糖モチーフはＤ−グルコサミ
ン又はＤ−ガラクトサミン構造に対応する。 特に凝固障害及び血管壁の不全に関連する疾患、特に血
栓形成、アテローム性静脈硬化症及び動脈硬化症の予防
及び治療用として、或いは組織の老化又は脱毛症のよう
な退行型症状に対抗するために上記天然ＧＡＧを治療薬
として使用することの重要性は既知である。 又、天然ＧＡＧの抽出、又は化学的もしくは酵素０脱重
合により、天然物質よりも重合度が低く、特に血液凝固
因子Ｘａに対して高い特異活性を有するＧＡＧを得られ
ることも知られている。重合度（又は省略形ｄｐ）とは
、グリコンド鎖のウロン酸又はアミノ糖から成る糖モチ
ーフの数を表す。 少なくと６２．５の硫酸化度、即ち天然ヘパリン及び既
知の低分子量のヘパリンよりも高い硫酸化度を存する脱
重合ヘパリンは、＾ｎｉｃ Ｓ、ｐ、Ａ、名義の１９８
３年１２月１６日付ヨーロッパ特許出願ＥＰ。 ０１１６８０１号に記載されており、抗血栓症性、低脂
肪症血性及び繊維素溶解性作用を有する医薬として提案
されている。 この脱重合ヘパリンは前記ヨーロッパ特許出願中では過
硫酸化ヘパリンと呼称されており、天然ヘパリン又はそ
のフラクションの１つを硫酸及び得られる。この過硫酸
化処理は酸の加水分解を生じ、ｄｐ＝８〜３０の鎖混合
物をもたらす。 発明者らはこの分野で研究した結果、所定の条件で所与
の硫酸化処理を実施することにより、構造及び重合度の
いずれをも変化させずに一般に実質的に高い収里でＧＡ
Ｇの硫酸化度を変化できるこさＵ・ることにより、特に
ある特性を増加させ別の特性を減少させろことにより作
用の特異性を改良できることが明らかになった。 本発明の目的は、充填率を所望通りに変化させろことの
可能な所定の生成物を得るための硫酸化方法を提供する
ことにある。 本発明の目的は更に、充填率が可変な新規ＧＡＧ、カ 特に所定の特徴、特にＡ−重合度を有するＧＡＧを提供
することにある。 硫酸化度の可変な本発明のＧＡＧの製造方法は、所与の
ＧＡＧを有機溶媒に可溶性の塩に変換し、これを有機溶
媒中に可溶化さき、溶解した塩を硫酸化剤により処理す
ることを特徴とする。 この構成はあらゆるＧＡＧに適用され、重合度及硫酸エ
ステル基−８０３−を所望の程度に従って導入でいる。 他の構造的特徴、特に重合度については既知通りである
。 従って、所望の生成物の関数として出発時に所与のＧＡ
Ｇを選択すれば十分である。 本発明の一具体例によると、出発ＧＡＧはＤ−グルコサ
ミン−ウロン酸夕（即ちＬ−イズロン酸又はＤ−グルク
ロン−交互モチーフを主体とする。この上うれる。 一好適具体例では、ヘパリン、ヘパラン硫酸、それらの
フラクション又はフラグメントを使用する。 別の好適具体例では、出発ＧＡＧはヘパリン又はヘパラ
ン硫酸よりし少ない糖モチーフ数、特に２〜３０の範囲
のモチーフ数を存する鎖混合物又は重合度に関する限り
において均一の鎖混合物から形成されろ低分子量のＧＡ
Ｇである。 こＣらの低分子量（省略形ＰＭ）のＧＡＧは特に以下の
物質を包含する。 −１９７８年１１月６日付仏国特許公開明細書第２４４
０３７６号及び１９７９年７月２０日付第−追加特許公
開明細書第２４６１７１９号の記載に従ってアルコール
抽出によりヘパリンから得られるようなムコ多糖。主特
許に記載の態様の１つによるとこれらの物質は、Ｙｉｎ
−Ｙｅｓｓ ｌｅｒ／ＵＳＰ比か少なくとも２であり分
子量が約２０００〜８０００の鎖混合物から形成される
。上記文献中に記載の物質中、ＹＷ／ＵＳＰ比が約３〜
５及び平均分子量が３０００〜５５００の物質を挙げる
ことができ、以下の文中ではこれをＣＹ２１６と呼称す
る。 −特に上記仏国特許公開明細書第２４４０３７６号の１
９８０年３月２０日付第二追加特許公開明細書第２４７
８６４６号及び１９８１年４月１０日付仏国特許公開明
細書第２５０３７１４号の記載に従ってヘパリンを亜硝
酸で脱重合することにより得られるようなムコ多糖。 これらの物質は一般に上記ムコ多糖と同様の特徴を有し
ており、且つ２．５−アンヒドロマンノ構造の基を末端
に有している。 この例としては、以下ＣＹ２２２と呼称するような２．
５−アンヒドロ−マンニトール末端を有する型のムコ多
糖、或いは２．５−アンヒドロマンノン酸末端を有する
型のムコ多糖が挙げられる。大多数の欠゛リコソド鎖の
分子量はより特定的には２０００〜３０００程度、特に
約２０００〜２６００である。Ｙｉｎ−％’ｅｓｓｌｅ
ｒ／［ＩＳＰ比は特に少なくともｌ０１Ｙ ｉ ｎ −
Ｙｅｓｓ ｌｅｒ値は少なくとも約２００ｕ／死である
。 −（１）平均分子量が３０００〜６０００ドルトン、特
に約４０００〜５０００ドルトンであり、（２）ＶＷ／
ＵＳＰ比が１０未満、特に６〜３であり、（３）２．５
−アンヒドロマンノ構造のモチーフを末端に有する鎖か
ら本質的に形成されており、例えば１９８４年１０月１
８日付仏国特許公開明細書第２５７２０８０号に記載の
方法に従って得られるようなムコ多糖、 −２０００ｕ／”ｇに達し得ろ高いＹｉｎ４ｅｓｓｌｅ
ｒ値と実質的にゼロに等しい小さいＵＳＰ値とを有して
おり、ＡＴＩＵに対して強い親和性を有する最大８個の
糖モチーフから形成されており、特に１９８０年ｌＯ月
６日付ヨーロッパ特許出願第００２７０８９号に記載さ
れているようなオリゴ糖。 一変形例によると、前記オリゴ糖は亜硝酸による脱重合
により得られ、２．５−アンヒドロ−マンノ構造の基を
末端に有している。 別の変形例によると鎖の発端モチーフは、ヘパリンをヘ
パリナーセで脱重合することにより形成されるような不
飽和ウロン酸モチーフに対応する。 特に、これらのオリゴ糖は下式・ に対応する構造ＡＢＣＤＥＦＧ１１のへ糖から形成され
る。 −前記へ糖をヘパリナーゼで処理することにより１９８
１年４月２９日付仏国特許公開明細書第２５０４９２８
号に記載の方法に従って得られるような六糖の均一組成
。特にこの組成は下式に対応する。 Ｃ’ ｐｌｌ−Ｆ ＣＴｌ−１−均一重合
度のオリゴ又は多糖、特に物質ＣＹ２２２、ＣＹ２１６
、ヘパリン又は他のＧＡＧをセファデックスのような材
料上でろ過することにより又はイオン強度勾配クロマト
グラフィにかけることにより得られるオリゴ又は多糖。 −ヘパリンに過沃素酸塩を作用させた後、塩基性溶媒中
で処理することにより得られるようなＧＡＧｏ−例えば
ヘパリンの脱重合混合物をゲル上でろ過することにより
得られるような重合度に関して均一のＧＡＧｏ −ヘパリンをヘパリナーゼ又は亜硝酸で脱型合し、ＡＴ
ＩＩＩ固定配列を有するフラクションを分離し、ＡＴ■
に対して親和性を有する多様な重合度のＧＡＧフラグメ
ントを得るべく前記フラクションをゲル濾過することに
より得られるようなＧＡＧ０而記ＧＡＧの例として、一
方ではｄｐか１２より大きいフラグメント、他方ではよ
り低い重合度、特に１２．１０，８，６．４及び２個の
糖モチーフに対応するｄｐ値を有するＧＡＧフラグメン
トとが挙げられる。 −上記と同様のＧＡＧでありながら、ＡＴＩＩＩを特異
的に認識ずろことの可能な配列を全＜ （＋ｉｉｉえず
且つゼロに等しい小さいＹＷ値を有するＧＡＧｏ特に、
ヘパリン又はＧＡＧをＡＴＩＴＩと接触後、多様なｄｐ
の均一フラグメントを得るへくゲル濾過する段階を含む
工程中にＡＴＩＩＩに固定されないオリゴ糖。 −ヘパリン中に見出だされるような連鎖を有しており、
グルコザミンモチーフの２位の−ＮＩＩＳＯ，ｌ−基の
一部、或いは大部分、或いは全体が−ＮＨ−アンル、特
に−ＮＩｌ−アセデル又は−Ｎｌ１２基により置換され
たＧＡＧＳｍ記ＧＡＧのフラクション及びフラグメント
。 −動物器官の処理により得られろＧＡＧの組成に対応す
る所謂全ＧＡＧ０ これらの各ＧＡＧは例示として列挙したものに過ぎず、
本願出願人に特に既知の物質であり、また本願出願人名
義の各特許及び特許出願中に記載されている物質に対応
するものと理解されたい。 ところで、上述したように本発明の方法は、任意の型の
ＧＡＧを使用できるという利点を有するものである。 従って本発明の更に別の一具体例によると、出発物質と
して使用されるＧＡＧはＤ−ガラクトザミンーウロン酸
交互モチーフを主体とする。 −好適具体例において、出発ＧＡＧはデルマタン硫酸、
コンドロイチン、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸
、これらのフラクション及びフラグメントから選択され
る。 一変形例ではデルマタン硫酸が有利である。 本発明の構成によると、上記ＧＡＧのグリコシド鎖の糖
モチーフの１又は数個の第一又は第ニー〇ｉｌ基は保護
基により保護されるので、所望に応じて別の位置を硫酸
化し、保護基の代わりに所与の基を導入し、更に保護さ
れた一０１１基を再生することかできる。 前記保護基は、アセチル、置換基を有するアセチル、ベ
ンゾイルのようなアシル基から選択される。 硫酸化処理を受けるＧＡＧ塩は、有機溶媒中に可溶性の
塩である。 好ましくはアミン塩が使用される。 アミン塩としては、式−Ｎ（Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３Ｘ式中、
ＲＩ。 Ｒ２及び／又はＲ３は水素原子又は１〜１０個の炭素原
子を存する脂肪族鎖である）で表されるアミンの塩、特
にトリエチルアミン又はトリブチルアミン或いは第四級
アンモニウム塩（例えばテトラブチルアンモニウム、テ
トラブチルアンモニウム又はベンゼトニウム）を使用す
ると有利である。 当然のことながら塩の性質は例えば立体的寸法により硫
酸化反応に影響するので、所定の位置を優先的に硫酸化
ずろことが可能である。 ＧＡｃｊ塩は有利には、酸性イオン交換樹脂を使用する
ことにより得られた酸形態のＧＡＧを、形成しようとす
る塩に対応するアミンの作用下におくことにより得られ
る。 ＧＡＧ塩は有機溶媒中に溶解される。より特定的にはジ
メヂルーホルムアミド（ＤＭＦ）、ノメチルスルポキノ
ド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメヂルホスポトリアミド（ＩＩ
ＭＰＴ）又はアセトニトリルのような二極性非プロトン
性溶媒が使用される。ピリジンを使用してもよい。 有利には、硫酸化剤は無水硫酸Ｓ０３とトリメヂ体から
選択される。 同様の硫酸化剤は、Ｅ、Ｅ、Ｇ１１ｂｅｒｔによりＣｈ
ｅｍｉｃａｌＲｅｖｉｅｗ、 １９６２． ｖｏｌ、６
２．５４９−５８９中に報告されている。 反応条件を検討した結果、十分な硫酸化率はＧＡＧの０
１１当量当たり約１〜５倍等量の複合体を使用すること
により得られることがわかった。 硫酸化反応は、有利にはＯ’Ｃ−１００℃程度、特に室
温程度又はそれ以上の温度で約１０〜１４時間実施され
る。場合によっては約２０℃というような室温より低い
温度も使用され得る。 反応条件、特に反応溶媒、温度及び時間は選択反応を実
施するのに好適な方法で選択される。 場合によって存在する保護基は、例えばＯ−アソル特に
Ｏ−アセチル保護基の場合は鹸化により、例えばベンゾ
イル基の場合には接触還元により脱離される。 生成物は、例えばゲル濾過又は限外ｐ過後カヂオン交換
樹脂により所望のカチオン形態にする処理を介して反応
混合物から回収される。その後、水に混和性の溶媒で生
成物を沈降させる。 −変形例によると、重合度に関して均一のＧＡＧを得る
ために、得られた過硫酸化ＧＡＧにゲル濾過処理を加え
る。 特に亜硝酸、ヘパリナーゼ又は過沃素酸塩を使用する方
法ではｄｐ対の鎖を得ることができる。 上記構成により、所望の硫酸化率に従って制御される硫
酸化が可能になり、オシド構造を劣化させることら又そ
の均一性を変化させることらなく所定の生成物に高い収
率を得ることができる。 特に注目すべき点として、出発物質の構造を変化させな
い本発明の硫酸化方法は、硫酸化以面又は以後に付加的
な分離段階を実施することにより、可変硫酸化率を有し
ており且っｄｐに関して均一のＧＡＧを得ることができ
る。 こうして所与の用途に適合する生成物を直接製造するこ
とができる。 重合度に関して均−又は混合形態の硫酸化修飾形の本発
明のＧＡＧは、下式１： ％式％ （式中、Ｒはウロン酸又は不飽和ウロン酸又はＯ１＋基
であり、Ｘは２位の炭素がＮ１（ＳＯ２−基により置換
され、グルコサミン及びヘパリン型の鎖の場合にはＮＨ
２又はＮｉ＋−アシル基により置換されたグルコサミン
又はガラクトサミンであり、Ｙはウロン酸即ちＤ−グル
クロン酸又はＬ−イズロン酸であり、ｎは０〜８０の整
数であり、Ｒｏは２位の炭素がＮＨＳＯ３−により置換
され、グルコサミン及びヘパリン型の鎖の場合にはＮＨ
，又はＮＨ−アシル基により置換されたグルコツであり
、Ｘ及びＹモチーフ及び場合によってはＲ及びＲｏの第
一又は第二〇ｉ＋基は、ＧＡＧの鎖における硫酸基の位
置及び／又は数が対応するＧＡＧの天然又は脱重合鎖に
おける位置及び／又は数と異なるように硫酸化されてい
る）又は薬理的に許容可能なそれらの塩に対応すること
を特徴とする。但し合計８〜３０個のグルコサミン−ウ
ロン酸モチーフを存する非修飾末端鎖の混合物はこれに
含まれない。 好適な生成物の族は下式■に対応する。 なお式中、Ｒ、ハＩＩ又ｉ、ｔＳＯ３−１Ｒ２ハ）ｌ、
５ｏ３−又ハアシル基、特にアセデル基であり、Ｒ及
びＲｏは上記と同義である。 別の好適な族において、Ｘ及び場合にょっごはＲｏはガ
ラクトサミンモチーフであり、ガラクトサミン−ウロン
酸モチーフ間の結合は１→４β、Ｄ型であり、場合によ
って存在するウロン酸−ガラクトサミンモチーフ間の結
合は１−３α、Ｌ型又は１−３α。 Ｄ型である。 これらの族の好適な群は１２以下の糖モチーフ数を有す
るＧＡＧを含んでいる。 特に、Ｒが不飽和ウロン酸であるＧＡＧが使用される。 変形例として、転位モチーフがグルコサミンである場合
にはＲｏか２．５−アンヒドロマンノ構造の基であり、
転位モチーフがガラクトサミンである場合にはＲｏが２
．５−アンヒドロヘキシトール構造であるようなＧＡＧ
が使用される。好適なＧＡＧにおいて、Ｒ“は２．５−
アンヒドロマンニトール構造の基である。 好適なこの群の有利なＧＡＧは、糖モチーフ数が４．６
又は８個の鎖を含む混合形態又は重合度に関して均一の
ＧＡＧの集合から構成されている。 これらのＧＡＧにおいて、Ｒ及びＲｏは同時にＯＨであ
るか又は夫々ウロン酸及びグルコサミンであり、或いは
Ｒｏは２．５−アンヒドロマンノ構造の基、好ましくは
２．５−アンヒドロマンニトール構造の基である。 別の有利なＧＡＧは、ｄｐが８、ｌＯ又は１２の鎖の混
合物から構成されており、Ｒ及び／又はＲｏは修飾され
た糖モチーフである。 別の有利なＧＡＧは、糖モチーフ数が８．１０又は１２
個の鎖を含む重合度に関して均一のＧＡＧから構成され
ている。 更に別のＧＡＧは、式Ｉに対応する鎖混合物から構成さ
れ、式中ｎは３〜１５の整数、Ｒ及び／又はＲｏは修飾
された糖モチーフである。 一変形例によると、上記各群におけるグルコサミンの２
位の炭素はＮｉ＋２又はＮｌ＋−アシル、特にＮｌ＋−
アセチル基により置換される。 このようなＧＡＧは、亜硝酸による脱重合によって得ら
れ、分子ｌ ２０００〜８０００の２．５−アンヒドロ
マンノ、特に２．５−アンヒドロマンニトール末端モチ
ーフを有しており、Ｙｉｎ４ｅｓｓｌｅｒ／ＵＳＰ比が
少なくと６３であり、Ｙｉｎ−Ｗｅｓｓｌｅｒ値が少な
くとも２００ｕ／Ｔｎｇ、であり平均分子量が２０００
〜３０００の鎖混合物から形成されるムコ多糖から有利
に製造される。 変形例においてこれらのＧＡＧは、亜硝酸による脱重合
により得られ、２，５−アンヒドロマンノ、特に２，５
−アンヒドロマンニトール末端モチーフを有しており、
約３〜６のＹｉｎ −Ｙｅｓｓ ｌｅｒ／ＵＳＰ比と４
０００〜５０００の平均分子量とを有する鎖混合物から
形成されるムコ多糖から構成される出発物質から製造さ
れる。 グルコサミン−ウロン酸又はガラクトサミン−ウロン酸
又はその逆の交互モチーフを含む族の他の好適な群は３
０個より多い糖モチーフ数を含んでいる。 有利なことには、本発明により得られるＧＡＧは所与の
生物学的特性を特異的に変調することが可能である。 硫酸化形態の修飾の関数として生物学的活性を変調する
特性は、複数の実験モデルで確認された。 碌固活性 ａ／活性化因子Ｘ（因子Ｘａ）に対する抑制活性。この
実験ではＴｅ１ｅｎ ｅｔ Ｌｉｅ、 １９７７、 Ｔ
ｈｒｏｍｂｏｓ、 Ｒｅｓ、。 限、 ３：３９９−４１０に記載の方法に従って色原体
５２２２２による定量モデル（ストックホルムＩ： ａ
ｂ ｉ社）を使用した。 結果を試験物質１当たりの単位で表した。 ｂ／活性化因子■（因子ＩＪａ）又はｌ・ロンビンに対
する抑制活性。モデルは、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＥ
）又はヘパリンの補因子（ＩＩＣＵ）の存在下で因子１
１ａの活性を５０％まで抑制することの可能なグリコサ
ミノグリカン濃度を検討する乙のである。 結果を蛯当たりの試験物質ｌ公債で表した。 ｃ／ＡＰＴＴ法（Ｃａｅｎ Ｊ、、 Ｌａｒｒｉｅｕ
Ｍ、Ｊ、 ｅｔ Ｓａｍａｍａ Ｍ、。 ｉｎ Ｉ’Ｈｃｍｏｓｔａｓｅ、Ｐａｒｉｓ、 Ｅｘｐ
ａｎｓｉｏｎ ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅＰｒａｎｃａ
ｉｓｅ、 １９６８． ｐｐ １３３−１３５参照）に
よる凝固時間の測定。 ここでは、凝固時間を２倍にするために必要な被試験物
質の濃度を検討した。 結果をｉ当たりの試験物質■値で表した。 ｄ／Ｗｅｓｓｌｅｒモデル（Ｗｅｓｓｌｅｒ Ｓ、、
Ｒｅｉｍｅｒ Ｓ、Ｍ、、 ｅｔＳｈｃｐｓ Ｍ、Ｃ１
、Ｊ、 Ａｐｐｌ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 １４（６）
９４３−９４６゜１９５９参照）によるウサギ生体内の
抗血栓症活性。 凝塊形成剤（ヒトトロンボプラスヂン）の投与の３分前
に、被試験物質をｌＯ〜５００μｇ／ｋｇの投与量で頚
動脈に注射した。 結果を血栓形成抑制百分率として表した。 内皮細胞への固定の検査 害渠是 一細胞培養 Ｊａｒｒｅ他の方法により形成したヒトｐ静脈内皮細胞
の１次培養物を、５％のＣＯ２を含む湿潤雰囲気内で、
子牛胎児血清（ＳＶＦ）２０％を加えた培地Ｍ１９９中
で培養した。 ５目ｌ」と６日目との間に融合細胞単層が得られる。 −ぼ夜］ｌ
【へ９見劃茎訓Ｌ（（天」（各テストの２４
時間前にＳＶＦ含有培地を採取し、Ｕ ｌ ｔｒｏｓｅ
ｒを２０％含む培地で前述の培養物を洗浄する。標識し
たヘパリンとのインキュベーションな培地２ｍｌ中で行
なう。インキュベーション後前記細胞を１．５＋ｎｌの
リン酸緩衝液（＋’Ｂｓ、ｐＨ７，４＞で３回洗浄し、
次いでプロナーゼ０．５ｍｌ （１ｍｇ／ｉｔ ）及び
トリ１−ン（Ｔｒｉｔｏｎ） ｘ １００ ０．１％（
ｖ／ｖ）の中３７°Ｃで３インキユベーＩ〜することに
より切離して可溶化する。 ガンマ計数器Ｂｅｃｋｍａｎｎ ７０００ （”’ Ｉ
）を用いて細胞及びインキュベーション培地の放射能
を測定する。 前記細胞を種々の濃度の低温テスト物質（標準ヘパリン
、過硫酸化ヘパリン、等）の存在下でヘパリン（１２’
Ｉ）Ｊ度を低くして５時間インキュベーションた。 ヘパリンの固定阻止能力をｌ５０（標識したヘパリンの
固定を５０％で阻止する濃度）で評価した。 この値はテスト物質の内皮細胞に対するアフィニティを
示す。 一補一俸】ｊＬ固卦− ヘパリンはタンパク質Ｃ１ｂ及び８間の二分子複合体の
形成を阻止して補体の第２増幅Ｃ３転換酵素（ｃｏｎｖ
ｅｒｔａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｒｉｃｅ ａｌｔ
ｅｒｎｅ）の発生を阻止する。 結合Ｃ，ｂ−Ｂに対するヘパリン及びその誘導体の作用
を、＋２５１ （’２ｓｌ−［１）テ標識したタンパク
質Ｂとタンパク質Ｃ，ｂ （Ｅ Ｃ，ｂ）担持羊赤血球
とを用いて調べた。 複合体Ｃ，ｂ−Ｂの形成を５０％阻害するのに必要なヘ
パリン又はテスｌ−したオリゴ糖の濃度をＩＣ５０と称
する。 このヨ１１定は精製タンパク質系内でｉｎ ｖｉｔｒｏ
で行なう。 一火」シ［ ０，１％のゼラチンと５ｍＭのＭｇ２４とを含むヴエロ
ナール桜街液中で、１２Ｓｌ−３の濃度を変えながらＥ
Ｃ，ｂ（０，７５−２，５ｘ １０’）を３０’Ｃで
３０分間インキュへ−１・する。 ７０成の試料を各反応毎に２部づつ使用し、これら試１
′：１を０．５ｍｌポリプロピレン管内のジフヂルフタ
レーｈ （Ｍｅｒｃｋ−Ｃ１ｅｖｅｎｏｔ 、フランス
）とジノニルフタレ−１−（Ｃｏｇｅｒ−パリ）との混
合物（７：３Ｖ／Ｖ）３００成の上に配置する。 前記管をＢｅｃｋｍａｎのマイクロフユージュ（ｍ１ｃ
−ｒｏｆＢｅ、 ｆ３ｅｃｋｍａｎ、バリ）により８０
００ｇ″ｒ１分１８１遠心分離にかけ、次いで沈殿物の
直ぐ上で切断する。 結合したりガントの放射能を計測する。 エラスターゼ び力１プシンＧにえ る活性犬１ｂ紅 白血球エラスターゼを胸膜滲出液から得たラッｊ・多形
核球を用いて製造する。基貧としてはＮ−スクシニルト
リアラニンパラニトロアニリドを使用する。前記酵素を
テスト物資と共に室温（２０℃）で１時間インキュベー
１−した後で酵素活性を測定する。次いで前記基質３加
え、３７°Ｃで２０時間インキュベートし、４１０ｎｍ
”’Ｃ″読み収りを行なう。 ヒト多形核白血球から得たヒトカテブシンＧの場合は、
定景（ｄｏｓａＨｅ）をアゾカゼイン基質に関して行な
う。この場合も酵素をテストずべき物質と共に室温で１
時間インキュベートし、次いでアゾカゼインを加え、こ
の混合物３３７℃で５時間インキュベー１・する。トリ
クロロ酢酸を５２６（最終濃度）で沈殿させ、遠心分離
にかけ且つ３６６ｎｍて゛読み収りを行なう。 ５つの実験アセンブリを形成した。 実Ｊ々」−：ざがリンＩび過ｌｉｆ醜ゴヒヱｌレマタ乙
鴇Ｊし矢症迩」ｕＬ１９ＪυＬ ＠皿ｌ μ／ｗａｇ ＩＣ５０ １１＠／ｌ１１１ 標準ヘパリン １９２ ０．１０ ０．２９
Ｎ−アセチル化 デルマタン硫酸 １００ ５．８過硫
酸化 抗トロンビン活性（抗１１ａ）はＰｉ酸化率と共に増加
することが確認される。 過ＱＭ化Ｎ−アセチル化ヘパリンの場合はＩＩＣＩＩ存
在下での活性が出発ヘパリンより強化される（ＩＣ５０
が０，２９から０．０７７に変化）のに対し、ＡＴ Ｉ
ＩＩ存在下での活性は減少する（ＩＣ５０が０．１０か
ら０．３８に変化）。 ■／ｍ１ ＩＣ８４１５４５４，５ デルマタン硫酸 ５０ 過硫酸化 デルマタン硫酸 １５ ＩＣ８５１６１０ このモデルでは、過硫酸化がデルマタン硫酸の活性を増
加させるのに対し、過硫酸化ヘパリンは正常ヘパリンよ
り低い活性を示すことが確認される。 血漿媒質中での補足的操作の結果、正常ヘパリンの活性
はＡＴ ＩＩＩに依存し、過硫酸化ヘパリンの活性はい
ずれの補助因子にも依存しないことが判明した。 これらの操作からは、正常デルマタン硫酸の活性が完全
にＩＩＣＩＩに依＃するのに対し、過硫酸１ヒデルマタ
ン硫酸の活性はある程度しか依存しないことも判明した
。 ヒ１〜の１〜ロンボブラスチンを凝塊形成剤として使用
するＷｅｓｓｌｅｒのモデルで得られた結果によれば、
用量１００■７ｋｇでの血栓形成の予防は過硫酸化デル
マタン硫酸の場合が８０％であるのに対し、デルマタン
硫酸の場合には４０％に過ぎない。 このモデルではテストずへき物質のＡＴ ＩＩＩ及びＨ
ＣＩＩの存在下でのＩＣ５０を測定することにより因子
１１ａの阻害状態を調べる。 テスｌ−した物質は下記の通りである。 基準ヘパリン及び４（ｄｐ ４） 、６（ｄｐ ６）
、８（ｄｐ８）、１２（ｄｐ １２）、１６（ｄｐ １
６）に等しい重合度の断片、並びにこれらの適確ｅｉ（
ヒ同族体。 ナス１〜物質 抗１１ａ活性八Ｔ Ｉｆ
ｆ ＩＩＣＩＩ ＩＣ５０ μｇ／ｆｆｌ！ 標準ヘパリン ０．０３９ ０．１４ＩＣ
８４１４７７ｄｐ ４ １００ ”過硫
酸化 ＩＣ８５１５９７ｄｐ ４ １００ ’
ＩＣ８４１４７６ｄｐ ６ １００ 。 過硫酸化 Ｉｃ ８５１５９８ ｄｐ ６ １００
４２ＩＣ８４１４７５ｄｐ ８ １００
’過硫酸化 ＩＣ８５１５９９ｄｐ ６ １００ １１
ｆｃ ８５１４７３ ｄｐ １２ １００
５６過硫酸化 ＩＣ８５１６００ｄｐ １２ １００ ３．
６ＩＣ８５１６０１，ｄｐ １６ ’
０．６８°−５０％未達成。過硫酸化前の分子量の
小さい均一断片は、ヘパリンとは逆に、このモデルでは
＾ＴＩＩＩの存在下で抗ＩＩａ活性を示さない。これは
ＩＣ５０が１００を越えていることから明らかである。 これら断片は過硫酸化しても、＾Ｔ ＩＩＩの存在下で
は活性が変化することはない、ただし断片ｄｐ１６は過
硫酸化されると活性を少し得る。 これに対しＩＩＣＩＩを介する抗１１ａ活性は、特に分
子蓋が大きい場合には、過硫酸化によって増加する。 しかしながらＨＣＩＩを介する抗１１ａ活性はヘパリン
の同活性に比べるとやはり小さい（ｙｆｒ片ｄｐ１６は
例外）。 ｌＬｉ：標：したヘパリン １２５■ に・する ノ
の−・ によって゛ たヒＬｌｆｌＮ ・°
へΔｌＬへ１１ 一般的には、過硫酸化はヒト謄静脈内皮細胞への固定を
促進する。 ただし、短い鎖は内皮細胞に対するアフィニティが極め
て小さい。 ｌＬｉ：補准」レソケ止」− このモデルでは精製タンパク質系内でｉｎ ｖｉｔｒ。 の補体の第２Ｃ３転換酵素の形成を阻止する能力を測定
した。 テスト物質 ＩＣ５０ｕｇ／ｍｌ 標準ヘパリン ０．５過硫酸化
ヘパリン ＩＣ８４１５４５０，５３０ 過硫酸化Ｎ−アセチル化脱硫酸化 ヘパリンＩＣ８６１７４６０，３５ ＩＣ８４１５５２ｄｐ １６ ０．
７５過硫酸化ＩＣ８５１６０１ｄｐ １６
０．３０ＩＣ８４１５５２ｄｐ ｉ２
１．１過硫酸化ＩＣ８５１６０１ｄｐ １２
０．４０ＩＣ８４１４７５ｄｐ ８
３過ち（酸 ｆヒ ＩＣ８５
１５９９ｄｐ ８
１．ＩＩＣ８４１４７６ｄｐ ６
７過硫酸化ＩＣ８５１５９８ｄｐ
６ １．７５ＩＣ８４１４７７ｄｐ
４ ３０過硫酸化Ｉ
Ｃ８５１５９７ｄｐ ４ ７これらの結果
から明らかなように、過硫酸化はヘパリンの活性を変化
させることはない。 これに対し、ドアセチル化Ｎ−説硫酸化ヘバリンの阻害
活性及びｄｐ４から１６の断片の阻害活性は過硫酸化に
よって増加する。 ターゼ びメーブシンＧに対 る且パ性エラスターゼ
力テブシン 標準ヘパリン １００％ −過硫酸
化ヘパリン ＩＣ８４１５４５１００％ −ＩＣ８４１５
５５ｄｐ ２２ ９１％
５３％ＩＣ８４１５５４ｄｐ ２０ ９２％
５４％ＩＣ８４１５５２ｄｐ １
６ ８２％ ４９％過硫酸化 ＩＣ８５１６０１ｄｐ １Ｂ １００％
６０？ごＩＣ８４１４７３ｄｐ １２ ９２％
４６％過硫酸化 ＩＣ８５１６００ｄｐ １２ ９７％
５１％ＩＣ８４１４７５ｄｐ ８ ５３％
３４％過硫酸化 ＩＣ８５１５９９ｄｐ ８ ９５％
５３？６ＩＣ８４１４７６ｄｐ ６ ３８％
８％過硫酸化 Ｉｃ ８５１５９８ ｄｐ ６ ９１％
４３％ＩＣ８４１４７７ｄｐ ４ ２８％
７％過硫酸化 ＩＣ８５１５９７ｄｐ ４ ９３％特定の分子量
では阻害能力は過硫酸化によって著しく増加することが
確認される。 この現象は特に最も小さい分子量（ｄｐ４、ｄｐ６）に
関して見られる。 結論として、これらの実験モデル（凝血に対する作用又
は凝血系以外での作用）では過硫酸化の影響は一様では
ないと言える。 特に、分子量の極めて小さい断片（４−８個の基本単位
）では、補体系とエラスターゼとに対する阻害活性が過
硫酸化によって大幅に増加するのに対し、凝血に対する
作用はほとんどまたは全く変（ヒせず、極めて小さいま
まである。 本発明の生成物のｉｎ ｖｉｖｏ効果３下記の２つの実
験モデルを用いてテストした。 一次のプロ１〜コールに従う操作によりデキストランに
対して感作したラットを使用するモデル：Ｆｒｅｕｎｄ
の不完全アジュバント中に懸濁したデキストラン１Ｏ−
５０Ｂを注射することにより、ラッｌ−３デキストラン
に対して感作する。 この感作は複数のデキス１−ラン皮下注射からなる操作
を３回行うことによって実施する。投与量は各操作毎に
動物の体の種々の点に行う１０回の注射の間で分配する
。これらの注射操作は３週間間隔で行なう。 感作した動物をデキストランのみ又はデキストラン＋テ
スト物質を受容する２つのグループに分ける。１グルー
プの動物には何も与えず、陰性対照として使用する。 テスト物質はデキストラン注射の１１′４時間前に静脈
注射するか、又はデキストラン注射の１−２時間前に皮
下注射する。投与量は動物の体重１ｋｇ当たり１から１
０ｍｇである。 注射後５分、３０分及び４時間の時点て採取した処理動
物の血漿試料（０，５ｍ１）を用いて結果を評価した。 この結果の評価基準は次の通りである：ａ）ウサギの抗
ヒツジ赤血球抗体で被覆したヒツジ赤血球の細胞溶解の
測定（テスｌ” Ｃｌｌ ５０） 。 複数の連続的希釈度をテスｌ−Ｌ、結果３各希釈度での
赤血球の細胞溶解の血漿のパーセンテージで表す。細胞
溶解は透射ヘモグロビンの星によって評価され、この測
定は光学的濃度によって行なわれる。 （Ｋａｂａｔ
Ｅ、＾、及びＭｅｙｅｒ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｃｈａｒｌ
ｅｓ Ｃ，’Ｉ’ｈｏｍａｓＪ４、米国スフ゛リングフ
ィールド、イリノイ州（１９６７年）１４９ベージ；
Ｋａ７ａｔｃｂｋｉｎｅ Ｎ、 Ｄ、、 Ｉｌｎｕｐｔ
ｍａｎｎ Ｇ、。 及びＮｙｄｅｇｇｅｒυ３、’Ｉ’ｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｄｕ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ、ｌ Ｎ Ｓ Ｉ’、開成
、パリ（１９８５年）、２２−３０ページ。）ｂ）赤血
球凝集反応テス）・ このテストではデキス１〜ランで被覆したヒツジ赤血球
を使用し、微量滴定プレート内でその動物の血漿中に存
在する抗デキストラン抗体によるこれら赤血球の沈殿を
測定する。結果は前記沈殿を生起せしめる最大血漿希釈
度によって表す。 −下記のプロトコールに従う操作により、Ｆｒｅｕｎｄ
の完全アジュバントをラットに投与して生起せしめた関
節炎を使用する実験モデル：雄Ｌｅｉｕｉｓラット（１
６ｌ６０−２Ｏ０にＦｒｅｕｎｄの完全アジュハンｈ
（ＦＣＡ ０．１＋ａｌの牛酪酸（ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍＢｕｔｙｒｉｃｕｎ＋ ）及びパラフィン油懸
濁液８Ｂ／ｍｌ ）を注射する。この注射は左後脚の足
底弓に行う。 ３グループの動物を使用して、１グループにはＦＣＡの
み与え、別のグループにはＦＣΔ＋テスト物質を与え、
残りのグループは何も操作せずに対照として使用する。 デス１〜物質は、ＦＣ八へ射後の最初の１９日間にわた
り１−１０ｍｇ／ｋｇ日の割合で静脈注射又は皮下注射
により投与する。 結果は注射しなかった右後脚の大きさく２次傷害）と、
関節炎指数の測定とによって評価する。 （Ｐｅｒｐｅｒ Ｒ，Ｊ、 、Δ１ｖａｒｅｚ Ｂ、、
ＣｏｌｏｍｂＯＣ，。 Ｆｃｌ＋ｒｏｄｅｒ １１．（１９７１年） 、Ｐｒｏ
ｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、。 １３７．５０６−５１２ページ； ｌ１ａｒｔｌｅｔＬ
Ｒ，Ｒ１、５ｃｈｌｅｙｅｒ−ｂａｃｂ Ｒ，（１９
８５年）、Ｉｎｔ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｐｂａｒｍａ
ｃ、、第７巻、Ｎｏｌ、７−１８ページ。） 実施例５の過硫酸化オクトサツカリドの第１検査の結果
、これら２つのモデルに関しては好ましい効果が得られ
た。 本発明の種々の添加率のＧＡＧはまた、有利なことに毒
性を示さない。 ｆ水型２０ｇの雌スイスＣＦマウスをロット当たり５匹
ずつに別けて皮下注射することによりＤＬ ５０を調べ
た。注射量は０ 、５ Ｉｎ ｌ、最終薬用量６２．５
ｍｇ／ｋｇ、１２５＋ｎｇ／ｋｇ、２５０ＩＩ１ｇ／ｋ
ｇ、１００ＯＢ／ｋｇとした。 ＤＬ ５０は所定条件では、２つのテスト物質即ち実施
例２のＩＣ８６１７１６及び実施例５の過硫酸化デカサ
ツカリドＩＣ８［ｊ１７４６の場合に１００ｍｇ／ｋｇ
を越える。 注射の間に又はその後の７日間の観察期間に死亡した動
物は皆無である。 従ってこれらの物質は薬の製造にとって特に貴重である
。 抗凝血活性及び抗Ｉ・ロンビン活性を保持していた１２
を越えるｄｐを有する物質は、血栓形成の予防及び治療
に有用である。ｄｐの小さい物質、特にｄｐ８以下の物
質は主として血管壁障害、組織の老化及び退行性の症状
、特に例えば糸状体腎炎、リューマチ様関節炎及びアレ
ルギー症状として現れるある種の遅発感覚過敏性症状の
ごとき特定形態の免疫不均衡に起因する障害の治療に有
用である。 これらの物質はまた、ショック状態、特に重い火傷にも
使用し得る。 本発明の医薬製剤は前述のＧＡＧを製薬賦形剤と共に有
効量含むことを特徴とする。有利には、これらの医薬製
剤は非経口投与の場合にはピロゲン基質を含まない。 好ましい組成物は経口投与に適した製薬ビヒクルを含む
。この場合の本発明の投与形態は有利には背低抗性カプ
セル、錠剤、丸薬であり、又はリポソーム７の形態でも
存在する。 別の医薬組成物はこれらのＧＡＧを直腸投与に適した賦
形剤と共に含む。この場合の投与形態は座薬である。 別の医薬組成物では前記Ｇ八Ｇがエアゾール又はポマー
ドの形態で存在する。 本発明は静脈注射、筋向注射、又は皮下注射に適した注
射可能な滅菌又は滅菌可能医薬組成物にも係る。 これらの溶液は有利には１がら２００ｍｇ／ｎ＋ Ｉの
ＧＡＧを含み、これら溶液を皮下注射する時には好まし
くは２０から１５０＋ｇ／ｍ ｌのＧＡＧを含む０例え
ばこれら溶液は３０から１００ｍｇ／ｍｌ、特に静脈注
射又は潅流による投与の場合には４０がら５０Ｂ／＋ｎ
ｌのＧＡＧを含み得る。 この種の医薬製剤は有利には即使用可能な使捨て注射器
の形態で存在する。 本発明の医薬組成物は特にヒト又は動物の血液凝集の特
定段階を、特に患者が主として外科手術、アテロームプ
ロセス、腫瘍形成及びバクテリア又は酵素活性体による
凝血傷害に起因する過剰凝血性を示す危険がある場合に
コントロール（予防又は治療）するのに適している。 ある種の組成物は補体の作用を特に炎症性の症候群、例
えばリューマチ様関節炎に係わる炎症性症候群を変化さ
せ得る。実際、観察される障害のうちあるものは、少な
くとも部分的には、補体がある役割を果たす関節レベル
に大量の抗原−抗体複合体が存在するために生起するこ
とが知られている。 別の組成物は一般的に組織の老化又は脱毛のごとき退行
性症状に対して有効である。 本発明をより明らかにすべく、次にヒトに使用し得る薬
用量の一例を示す：約１ｍｇから１ ｇ／２４時間、好
ましくは約５から５００ｍｇ／２４時間、例えば約２０
０＋ｌ１ｇ７２４時間を静脈注射により断続的に、即ち
一定間隔をおいて投与するが、又は約２００がら１１０
００ＩＩ１／２４時間を経口投与する。これらの用量は
勿論予め行なう血液検査の結果、病気の種類及び一般的
には健康状態に応じて各患者毎に調整し得る。 本発明はまた、ラボラトリ−で特にプロテアーゼ阻止活
性テストにかけられる他の物質の検査の°比較対照とし
て使用し得る生物学的試薬の形成における本発明のＧＡ
Ｇの使用にも係る。 本発明の他の特徴及び利点は本発明の生成物の合成に関
する以下の実施例の説明によって明らかにされよう。 支膨■上二恋又通尺Ｎ土ブｐフィルを・つヘパリ″Ｌ！
！２ＪＬＬ（Ｉ Ｃ８４１５４５）先ずヘパリン酸Ｉ・
リュチルアンモニウム（ＴＥ＾〉を製造し、次いでこの
生成物を過硫酸化処理にかける。 水５０ｍ１中に溶解したヘパリン酸すＩ・リウム１ｇを
イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ ５０． ＩＩ” ）によ
りヘパリン酸に変換する。トリエチルアミンで中和し且
つ濃縮乾固すると１．３８のＴＥＡ塩が得られる。 ｂ ） ”１ＡＩｎＪＬ監 前述の塩０．９７８をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
２０ｍｌ中に溶解し、これに硫酸化用複合体ＴＭ＾／５
０３（６，８ｇ）を加える。５０℃で２４時間放置した
後、前記反応混合物を希釈し、次いで５ｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５ゲルカラムに通して当該生成物を回収する。 樹脂Ｄｏｗｅｘ ５０ Ｈ”での交換によって得た酸を
中和するとすｌ・リウム塩が得られる。凍結乾燥後７７
４Ｂの生成物か回収される。 Ｃ）ＶＬｉＬ 得られたヘパリンは３．０１の硫酸化度（硫酸塩／カル
ボン酸塩； ＳＯ，−／Ｃ００−）を示す。これに対し
出発生成物の硫酸化度は２．１６である。 反応時間を１時間に限定すると、ＳＯ３−／ＣＯＯ−・
２．７０になる。 硫酸化用複合体０．６８ｇの存在下で１時間処理すると
ｓｏ、−７ｃｏｏ−＝ｚ、４ｏになる。 ヘパリン及び過硫酸化ヘパリンのＮＭＲスペクトルを第
１図及び第２図に示した。これらのグラフからは特にＣ
Ｉｌ□０３Ｏ１への変換に起因して６２．４ｐｐ…でシ
グナルＣＨ２０１１が消失している。アノマー炭素領域
でも大きな変化が見られる（約１０１００ｐｐ。 実施例１と同様に操作するが、この場合は複合体ＴＭ＾
／ＳＯ１に代えてピリジン中のクロロスルホン酸をｔｆ
ｔ、に止剤として使用する。硫酸化にはピリジン５０ｎ
ｌに溶解したＴＥ八基塩０９７ｇを使用し、次いでク
ロロスルポン酸（１ｇ）を加える。 ０℃で２４時間放置した後、前記反応混合物を実施例１
１と同様に輻釈し処理する。 ヒ 前述Ｚ同様の特徴を持つヘパリンが得られる。 １ｉＬ１１：１歿！ Ｎ−アセチル ヘパリンの１克（
ＩＣ８６１７４６） ヘパリンを従来の方法でト脱硫酸化しく ＩｎｏｕｅＳ
、及びＮａｇａｓａｗａ Ｋ、、Ｃａｒｂｏｈｙｄ Ｒ
ｃｓ、、４６ （１９７８年）８７−９５）、次いで水
性塩基媒質中で無水酢酸によりアセチル化する０次いで
ＴＥＡ塩を実施例１ａと同様に製造する。 ｂ）（１此 Ｎ−アセチル化ヘパリン１ｇから得たＴＥＡ塩をＤＭＦ
（２５ｍｌ）中に溶解し、’ｒＭＡ／５Ｏｚ（０，８４
ｇ）ノ存在下チー晩１００℃に加熱する。硫酸化した生
成物を５ｃｐｈａｃｌｅｘ Ｇ ２５でのゲル濾過にか
けた後回収する。 これを一時的に酸の形態に変え後ナトリウム塩に変換す
る。凍結乾燥すると薄いベージュのナトリウム塩ＩＣ８
６１７１６が１．１４ｇ得られる。Ｎ−アセチル化ヘパ
リン及び対応過硫酸化生成物のＮＭＩ（スペクトルを第
４図及び第５図に示した。 ルアンモニウム上 ＴＡＢの ゛１ 塩基として水酸化テトラブチルアンモニウムを使用し且
つ分子量の小さいヘパリンを用いて実施例２ａ）と同様
に操作する。 ｂ）慶並進− 得られた塩（Ｉｇ）を複合体ピリジン／Ｓ０３（１ｇ）
によりピリジン（１０慎１ ）中室温で２４時間硫酸１
ヒする。ゲル濾過にかけ、次いでナトリウム塩に変換す
るとＮ−アセチル１ヒ低分子址ヘパリンのすｌ−リウム
塩が０．５ｇ得られる。 ｃ ） ＶＬ 例えば前述の主特許第２４４０３７６号の実施例１の方
法により得られるような生成物ＣＹ ２１０ （平均ｄ
ｐ約１４）に使用される前述の方法は、ＳＯ３−／ＣＯ
Ｏ−比２．８５の過硫酸化生成物（ＩＣ８４１５４８）
を製造せしめる。出発生成物の前記比は２．１２である
。 モニウム塩のパ告 低分子量ヘパリンＣＹ ２１Ｂを水に溶解しく０．５１
中に１０ｇ）次いで１１＋形悪の樹脂Ｄｏｗｅｘ ５０
ＷＸ４カラムに通すことにより酸に変換する。中和後、
得られたテトラブチルアンモニウムヘパリンを凍結乾燥
する。テトラブチルアンモニウム塩が１９．３４ｇ得ら
れる。 ｂ）！ｉＬｌ！ｕ− 前述の塩１ｇを無水ピリジン５０ｍ Ｉ中に溶解し、硫
酸化複合体（ピリジン／ＳＯｚ＞を加える。複合体の量
を変えながら３回テストを行なう。室温で２４時間反応
させた後この反応混合物を９５％エタノール中ソーダ（
２ｇ）溶液に加える。形成された沈殿物を濾過し、水に
溶解し、５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２５でクロマＩ・グラ
フィにかけ、凍結乾燥するとナトリウム塩が得られる。 ｃ）１１ 硫酸化複合体の質量を変えることによって形成生成物の
硫酸化度を変化させる０例えば硫酸化複合体の質量を夫
々０．１６ｇ、０．３２ｇ、０．４８ｇにすると、２．
２１．２．７５及び３．４１の硫酸化度が得られる。 過硫酸化ＣＹ ２１６のＮＭＲスベク１−ルを第３図に
示した。 無水マンニトールＣＩのシグナル（６３，６ｐｐｍ）が
消失しく Ｃｌ２Ｏ＋１ →Ｃ１１２０ＳＯ，−）、他
（７） ７ ンニｌ−−ルシグナル（領域７８．８６ｐ
ｐ＋ｎ）も変１ヒした。約ｐｐｍのアノマーグループの
シグナルも同様である。 オリゴ糖は所定条件下でヘパリナーゼ又は亜硝酸による
ヘパリンの脱重合の結果得られる混合物をゲルー過する
ことにより分留して得る。亜硝酸による脱型合法は例え
は１９８０年３月２０日の第２追加特許明細書第２４７
８６４６号及び１９８１年４月１０日の仏国特許出願第
２５０３７１４号に記載されており、ヘパリナーゼを用
いる脱重合操作は欧州特許出願第００２７０８９号に記
載されている。本出願人名義のこれら特許及び特許出願
については既に説明した。 使用する脱重合用混合物（１ｇ）を、０．２Ｍ塩塩ビヒ
ナトリウム溶液溶出した５ｅｐｈａｄｅＸＧ ５０ゲル
カラム（２，５ｘ ３００ｃｎ＋）の最上部に配置する
。明確に規定されたオリゴ糖（ジー、テＩ・ラー、ヘキ
サ−、オ、シ フタ−１１９，エイコサツカリドまで）に対応する分画
をまとめて濃縮し脱塩処理する。これらの生成物は凍結
乾燥後に得られる。 ｂ）：トラブールアンモニウム塩の′１゛告テトラブチ
ルアンモニウム塩を４ａの塩の製法と同じ方法で製造す
る。非還元性末端に位置する不飽和ウロン酸の残基で終
わる生成物のテトラ−、ヘキサ−、オクタ−、ドデカ−
及びヘキサデカ−サツカリドの塩が得られた。 Ｃ） リボ の砕６・ 硫酸化すべきオリゴ糖のテＩ・ラブチルアンモニウム塩
をＤＭＦ （２５０１□ｇ７５ｍｌ）中に溶解し、次い
で硫酸化複合体（］・リメチルアミン／ ＳＯ３； ２
５０ａ＋ｇ）を加える。この反応混合物を２４時間５０
’Ｃに加熱する。 水（５ｍｌ）で希釈し、５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２５で
反応混合物をクロマトグラフィにかけ、次いで凍結乾燥
するとオリゴ糖が得られる。 過硫酸１ヒジサツカリド ２４．１＜ ＩＣ８４１
４７７） 過硫酸化テ１〜ラサッカリド ４ ３．２０（
ＩＣ８５１５９７） （ＩＣ８４１４７８） 過硫酸１ヒジサツカリド ６３．００ （ＩＣ８５１５９８） オクタサツカリド ８ ２．４３（
ＩＣ８４１４７５） 過硫酸化オクタサツカリド ８ ３．０８（Ｉ
Ｃ８５１５９９） （ＩＣ８６１７４６） 過硫酸化デカサツカリド １０ ２．７６え
Ｉ１更：−硫 −ルマタンルに礼ｌ（ＩＣ８５１６１
０） ａ）？上５７’−％ｔｌ、＝７７Ｔ＝−：’）ムｑデル
マタン硫１２５＋ｎｇを酸に変換しくカチオン交換樹脂
）次いで水酸化テＩ〜ラブチルアンモニウムにより中和
する。乾燥凍結後４６ｍｇの塩が得られる。 ｂ）−ルマタン硫 の゛・砕２ 前述のごとく得られた塩（１５Ｂ）を複合体トリメチル
アミン／ ＳＯｙ （１５＋ｎｇ）の添加によりＤＭＦ
（Ｉｍｇ）中で過硫酸ｆヒする。この生成物は水による
希釈、５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２５ゲルでのクロマト
グラフィ及びイオン交換樹脂によるすトリウムの有機カ
チオンの交換の後で得られる。 出発生成物（０，８ｇ）を水に溶解し、酸に変換し且つ
トリエチルアミンによって中和する。その結果凍結乾燥
後に０．９１ｇのトリエチルアミン塩が得られる。 ｂ）過」ＪＵＬ 前述の塩（０，２４ｇ）をＤＭＦ（８ｍｌ）に高温で溶
解する。 硫酸化複合体（１’ＭΔ／Ｓｏ、； １．６８ｇ）を加
えた後２４時間５０℃に維持する。ゲルｐ過及びナトリ
ウム塩への変換後に２３８ｇの過硫酸化ヘパリンが得ら
れる。 この実施例は該製法の柔軟さを示すものである。 先ずＣａｒｂｏｈｙｄ、 Ｒｅｓ、 ５８（１９７７年
） ４７−５５に記載のＮＡＫΔＧＡＷΔ池の方法によ
りＮ、０−脱硫酸化ヘバリンを製造する。 次いでこのヘパリンを塩基ｐＨの複き体ピリジン／ＳＯ
，により選択的にＮ−再硫酸（ヒする。これを酸形態に
変え且つ水酸化テトラブチルアンモニウムにより中和す
ることによってテトラブチルアンモニウム塩に変換する
。このようにして得られた塩を真空下５０°Ｃで２４時
間乾燥する。 前記テトラブチルアンモニウム塩（０゜９２ｇ）を無水
ピリジン（１０ｍｌ）中に溶解する。無水酢酸（０，１
ｍ１）を加え室温で一晩放置する。硫酸（ヒ複合体（ピ
リジン／ＳＯコニ０．７２ｇ）添加後、該反応混合物を
１００℃で４時間加熱する。冷却後、これをソーダ（２
ｇ）３有エタノール（１００＋＋＋Ｉ）にゆっくり加え
る。４℃で一晩放置した後、形成された沈殿物を脱水に
かけ、水に溶解し次いで５ｅｐｂａｄｅｘ Ｇ ２５で
クロマトグラフィにかける。凍結乾燥（Ｈｏ、６℃ｇの
粉末が得られる。これを分析した結果、６０％の第１ア
ルコール官能基が遊離していた。 実施例５ａで説明したヘキササツカリド分画をピリジニ
ウム塩に変換し、次いで混合物ＤＨ５Ｏ／＋１２０（９
５１５；ｖ／ｖ）中５０℃で９０分間加熱することによ
りＮ−脱硫酸化する。ソーダ添加後、この反応混合物を
５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２５カラムでクロマトグラフィ
にがける。凍結乾燥後に当該生成物を道順アミンの形態
で回収する。これを従来の方法に従い塩基媒質中で無水
酢酸によりＮ−アセチル化する。 前記ドアセチル化誘導体（０，５ｇ）をテＩ・ラブチル
アンモニウム塩に変換する。次いでこれをＤＭＦ（１０
ｍｌ）中に溶解し、複合体トリメチルアミン／ＳＯ３（
０，５１？）の存在下１００℃で４時間硫酸化処理する
。冷却後この反応混合物をエタノール（９０ｍｌ）中０
．５Ｍ溶液にゆっくり加える。遠心３雛後残留物を回収
する。これを水に溶解し且つ凍結乾燥する。 その結果０．６１．の過硫酸化ドアセチル化ヘキササツ
カリドかすｌ・リウム塩の形態で得られる。 及１圧咀：過硫酸イ′デルマタン研酸訂 の製造デルマ
タン硫酸断片を従来の方法で得る（定期的酸化とそれに
次ぐ酸の所定加水分解： Ｔ ＯＬ Ｌ Ｅ Ｆ Ｓ
ＥＮ、 Ｎｏｕｖｅｌｌｃ Ｒｅｖｕｅ Ｆｒａ＋＋５
：ａｉｓｅ ｄ’ｌ１５＋ｎａｔｏｌｏｇｉｅ；２６（
１９８４年） ２３３−２３７、又はヒドラジン分解（
ｂｙｄ−ｒａｚｉｎｏｌｙｓｅ）とそれに次ぐ亜硝酸に
よるデグラデーション、又は前述の方法を用いる）。 デルマタン硫酸（Ｓｉｇｍａ製品） ５０ｍｇを塩酸０
．５Ｍ溶液（２＋ｎｌ）に溶解する。この混合物を１０
０℃で５分間加熱した後冷却する。次いで亜硝酸ナトリ
ウム水溶？１！（２，５％；１ｍ１）を加える。１分後
にソーダを加えて鎖酸を中和し、次いでホウ水素化ナト
リウム（ｂｏｒｏｈｙｄｒｕｒｅ ｄｅ ｓｏｄｉｕｍ
） （１０ｍｇ）を加える。この混合物を５ｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ ２５カラムで脱塩処理する。 凍結乾燥後、得られた生成物をトリエチルアミン塩に変
換し、次いでＩ・ツメチルアミン／ＳＯ５複合体（５０
ｍｇ）の存在下ＤＭＦ （５ｍｌ）中１００℃で硫酸化
する。４時間後にこの混合物を冷却し、次いで水で溶出
した５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ５０カラムの最上部に配置
する。酸形態への中間変化とソータによる中和とによっ
てナトリウム塩を得る。この中和は電導率測定の前に行
なわれ、２．４の硫酸塩／カルボキシル比を示す。 加水分解時間又は温度又は酸のモル密度は種々の大きさ
の断片を得るべく変化させてよい、硫酸化度もこの反応
の条件を変えることにより変化させ得る。 この反応は同一条件下でコンドロイチン硫酸にも使用さ
れる。
時間前にＳＶＦ含有培地を採取し、Ｕ ｌ ｔｒｏｓｅ
ｒを２０％含む培地で前述の培養物を洗浄する。標識し
たヘパリンとのインキュベーションな培地２ｍｌ中で行
なう。インキュベーション後前記細胞を１．５＋ｎｌの
リン酸緩衝液（＋’Ｂｓ、ｐＨ７，４＞で３回洗浄し、
次いでプロナーゼ０．５ｍｌ （１ｍｇ／ｉｔ ）及び
トリ１−ン（Ｔｒｉｔｏｎ） ｘ １００ ０．１％（
ｖ／ｖ）の中３７°Ｃで３インキユベーＩ〜することに
より切離して可溶化する。 ガンマ計数器Ｂｅｃｋｍａｎｎ ７０００ （”’ Ｉ
）を用いて細胞及びインキュベーション培地の放射能
を測定する。 前記細胞を種々の濃度の低温テスト物質（標準ヘパリン
、過硫酸化ヘパリン、等）の存在下でヘパリン（１２’
Ｉ）Ｊ度を低くして５時間インキュベーションた。 ヘパリンの固定阻止能力をｌ５０（標識したヘパリンの
固定を５０％で阻止する濃度）で評価した。 この値はテスト物質の内皮細胞に対するアフィニティを
示す。 一補一俸】ｊＬ固卦− ヘパリンはタンパク質Ｃ１ｂ及び８間の二分子複合体の
形成を阻止して補体の第２増幅Ｃ３転換酵素（ｃｏｎｖ
ｅｒｔａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｒｉｃｅ ａｌｔ
ｅｒｎｅ）の発生を阻止する。 結合Ｃ，ｂ−Ｂに対するヘパリン及びその誘導体の作用
を、＋２５１ （’２ｓｌ−［１）テ標識したタンパク
質Ｂとタンパク質Ｃ，ｂ （Ｅ Ｃ，ｂ）担持羊赤血球
とを用いて調べた。 複合体Ｃ，ｂ−Ｂの形成を５０％阻害するのに必要なヘ
パリン又はテスｌ−したオリゴ糖の濃度をＩＣ５０と称
する。 このヨ１１定は精製タンパク質系内でｉｎ ｖｉｔｒｏ
で行なう。 一火」シ［ ０，１％のゼラチンと５ｍＭのＭｇ２４とを含むヴエロ
ナール桜街液中で、１２Ｓｌ−３の濃度を変えながらＥ
Ｃ，ｂ（０，７５−２，５ｘ １０’）を３０’Ｃで
３０分間インキュへ−１・する。 ７０成の試料を各反応毎に２部づつ使用し、これら試１
′：１を０．５ｍｌポリプロピレン管内のジフヂルフタ
レーｈ （Ｍｅｒｃｋ−Ｃ１ｅｖｅｎｏｔ 、フランス
）とジノニルフタレ−１−（Ｃｏｇｅｒ−パリ）との混
合物（７：３Ｖ／Ｖ）３００成の上に配置する。 前記管をＢｅｃｋｍａｎのマイクロフユージュ（ｍ１ｃ
−ｒｏｆＢｅ、 ｆ３ｅｃｋｍａｎ、バリ）により８０
００ｇ″ｒ１分１８１遠心分離にかけ、次いで沈殿物の
直ぐ上で切断する。 結合したりガントの放射能を計測する。 エラスターゼ び力１プシンＧにえ る活性犬１ｂ紅 白血球エラスターゼを胸膜滲出液から得たラッｊ・多形
核球を用いて製造する。基貧としてはＮ−スクシニルト
リアラニンパラニトロアニリドを使用する。前記酵素を
テスト物資と共に室温（２０℃）で１時間インキュベー
１−した後で酵素活性を測定する。次いで前記基質３加
え、３７°Ｃで２０時間インキュベートし、４１０ｎｍ
”’Ｃ″読み収りを行なう。 ヒト多形核白血球から得たヒトカテブシンＧの場合は、
定景（ｄｏｓａＨｅ）をアゾカゼイン基質に関して行な
う。この場合も酵素をテストずべき物質と共に室温で１
時間インキュベートし、次いでアゾカゼインを加え、こ
の混合物３３７℃で５時間インキュベー１・する。トリ
クロロ酢酸を５２６（最終濃度）で沈殿させ、遠心分離
にかけ且つ３６６ｎｍて゛読み収りを行なう。 ５つの実験アセンブリを形成した。 実Ｊ々」−：ざがリンＩび過ｌｉｆ醜ゴヒヱｌレマタ乙
鴇Ｊし矢症迩」ｕＬ１９ＪυＬ ＠皿ｌ μ／ｗａｇ ＩＣ５０ １１＠／ｌ１１１ 標準ヘパリン １９２ ０．１０ ０．２９
Ｎ−アセチル化 デルマタン硫酸 １００ ５．８過硫
酸化 抗トロンビン活性（抗１１ａ）はＰｉ酸化率と共に増加
することが確認される。 過ＱＭ化Ｎ−アセチル化ヘパリンの場合はＩＩＣＩＩ存
在下での活性が出発ヘパリンより強化される（ＩＣ５０
が０，２９から０．０７７に変化）のに対し、ＡＴ Ｉ
ＩＩ存在下での活性は減少する（ＩＣ５０が０．１０か
ら０．３８に変化）。 ■／ｍ１ ＩＣ８４１５４５４，５ デルマタン硫酸 ５０ 過硫酸化 デルマタン硫酸 １５ ＩＣ８５１６１０ このモデルでは、過硫酸化がデルマタン硫酸の活性を増
加させるのに対し、過硫酸化ヘパリンは正常ヘパリンよ
り低い活性を示すことが確認される。 血漿媒質中での補足的操作の結果、正常ヘパリンの活性
はＡＴ ＩＩＩに依存し、過硫酸化ヘパリンの活性はい
ずれの補助因子にも依存しないことが判明した。 これらの操作からは、正常デルマタン硫酸の活性が完全
にＩＩＣＩＩに依＃するのに対し、過硫酸１ヒデルマタ
ン硫酸の活性はある程度しか依存しないことも判明した
。 ヒ１〜の１〜ロンボブラスチンを凝塊形成剤として使用
するＷｅｓｓｌｅｒのモデルで得られた結果によれば、
用量１００■７ｋｇでの血栓形成の予防は過硫酸化デル
マタン硫酸の場合が８０％であるのに対し、デルマタン
硫酸の場合には４０％に過ぎない。 このモデルではテストずへき物質のＡＴ ＩＩＩ及びＨ
ＣＩＩの存在下でのＩＣ５０を測定することにより因子
１１ａの阻害状態を調べる。 テスｌ−した物質は下記の通りである。 基準ヘパリン及び４（ｄｐ ４） 、６（ｄｐ ６）
、８（ｄｐ８）、１２（ｄｐ １２）、１６（ｄｐ １
６）に等しい重合度の断片、並びにこれらの適確ｅｉ（
ヒ同族体。 ナス１〜物質 抗１１ａ活性八Ｔ Ｉｆ
ｆ ＩＩＣＩＩ ＩＣ５０ μｇ／ｆｆｌ！ 標準ヘパリン ０．０３９ ０．１４ＩＣ
８４１４７７ｄｐ ４ １００ ”過硫
酸化 ＩＣ８５１５９７ｄｐ ４ １００ ’
ＩＣ８４１４７６ｄｐ ６ １００ 。 過硫酸化 Ｉｃ ８５１５９８ ｄｐ ６ １００
４２ＩＣ８４１４７５ｄｐ ８ １００
’過硫酸化 ＩＣ８５１５９９ｄｐ ６ １００ １１
ｆｃ ８５１４７３ ｄｐ １２ １００
５６過硫酸化 ＩＣ８５１６００ｄｐ １２ １００ ３．
６ＩＣ８５１６０１，ｄｐ １６ ’
０．６８°−５０％未達成。過硫酸化前の分子量の
小さい均一断片は、ヘパリンとは逆に、このモデルでは
＾ＴＩＩＩの存在下で抗ＩＩａ活性を示さない。これは
ＩＣ５０が１００を越えていることから明らかである。 これら断片は過硫酸化しても、＾Ｔ ＩＩＩの存在下で
は活性が変化することはない、ただし断片ｄｐ１６は過
硫酸化されると活性を少し得る。 これに対しＩＩＣＩＩを介する抗１１ａ活性は、特に分
子蓋が大きい場合には、過硫酸化によって増加する。 しかしながらＨＣＩＩを介する抗１１ａ活性はヘパリン
の同活性に比べるとやはり小さい（ｙｆｒ片ｄｐ１６は
例外）。 ｌＬｉ：標：したヘパリン １２５■ に・する ノ
の−・ によって゛ たヒＬｌｆｌＮ ・°
へΔｌＬへ１１ 一般的には、過硫酸化はヒト謄静脈内皮細胞への固定を
促進する。 ただし、短い鎖は内皮細胞に対するアフィニティが極め
て小さい。 ｌＬｉ：補准」レソケ止」− このモデルでは精製タンパク質系内でｉｎ ｖｉｔｒ。 の補体の第２Ｃ３転換酵素の形成を阻止する能力を測定
した。 テスト物質 ＩＣ５０ｕｇ／ｍｌ 標準ヘパリン ０．５過硫酸化
ヘパリン ＩＣ８４１５４５０，５３０ 過硫酸化Ｎ−アセチル化脱硫酸化 ヘパリンＩＣ８６１７４６０，３５ ＩＣ８４１５５２ｄｐ １６ ０．
７５過硫酸化ＩＣ８５１６０１ｄｐ １６
０．３０ＩＣ８４１５５２ｄｐ ｉ２
１．１過硫酸化ＩＣ８５１６０１ｄｐ １２
０．４０ＩＣ８４１４７５ｄｐ ８
３過ち（酸 ｆヒ ＩＣ８５
１５９９ｄｐ ８
１．ＩＩＣ８４１４７６ｄｐ ６
７過硫酸化ＩＣ８５１５９８ｄｐ
６ １．７５ＩＣ８４１４７７ｄｐ
４ ３０過硫酸化Ｉ
Ｃ８５１５９７ｄｐ ４ ７これらの結果
から明らかなように、過硫酸化はヘパリンの活性を変化
させることはない。 これに対し、ドアセチル化Ｎ−説硫酸化ヘバリンの阻害
活性及びｄｐ４から１６の断片の阻害活性は過硫酸化に
よって増加する。 ターゼ びメーブシンＧに対 る且パ性エラスターゼ
力テブシン 標準ヘパリン １００％ −過硫酸
化ヘパリン ＩＣ８４１５４５１００％ −ＩＣ８４１５
５５ｄｐ ２２ ９１％
５３％ＩＣ８４１５５４ｄｐ ２０ ９２％
５４％ＩＣ８４１５５２ｄｐ １
６ ８２％ ４９％過硫酸化 ＩＣ８５１６０１ｄｐ １Ｂ １００％
６０？ごＩＣ８４１４７３ｄｐ １２ ９２％
４６％過硫酸化 ＩＣ８５１６００ｄｐ １２ ９７％
５１％ＩＣ８４１４７５ｄｐ ８ ５３％
３４％過硫酸化 ＩＣ８５１５９９ｄｐ ８ ９５％
５３？６ＩＣ８４１４７６ｄｐ ６ ３８％
８％過硫酸化 Ｉｃ ８５１５９８ ｄｐ ６ ９１％
４３％ＩＣ８４１４７７ｄｐ ４ ２８％
７％過硫酸化 ＩＣ８５１５９７ｄｐ ４ ９３％特定の分子量
では阻害能力は過硫酸化によって著しく増加することが
確認される。 この現象は特に最も小さい分子量（ｄｐ４、ｄｐ６）に
関して見られる。 結論として、これらの実験モデル（凝血に対する作用又
は凝血系以外での作用）では過硫酸化の影響は一様では
ないと言える。 特に、分子量の極めて小さい断片（４−８個の基本単位
）では、補体系とエラスターゼとに対する阻害活性が過
硫酸化によって大幅に増加するのに対し、凝血に対する
作用はほとんどまたは全く変（ヒせず、極めて小さいま
まである。 本発明の生成物のｉｎ ｖｉｖｏ効果３下記の２つの実
験モデルを用いてテストした。 一次のプロ１〜コールに従う操作によりデキストランに
対して感作したラットを使用するモデル：Ｆｒｅｕｎｄ
の不完全アジュバント中に懸濁したデキストラン１Ｏ−
５０Ｂを注射することにより、ラッｌ−３デキストラン
に対して感作する。 この感作は複数のデキス１−ラン皮下注射からなる操作
を３回行うことによって実施する。投与量は各操作毎に
動物の体の種々の点に行う１０回の注射の間で分配する
。これらの注射操作は３週間間隔で行なう。 感作した動物をデキストランのみ又はデキストラン＋テ
スト物質を受容する２つのグループに分ける。１グルー
プの動物には何も与えず、陰性対照として使用する。 テスト物質はデキストラン注射の１１′４時間前に静脈
注射するか、又はデキストラン注射の１−２時間前に皮
下注射する。投与量は動物の体重１ｋｇ当たり１から１
０ｍｇである。 注射後５分、３０分及び４時間の時点て採取した処理動
物の血漿試料（０，５ｍ１）を用いて結果を評価した。 この結果の評価基準は次の通りである：ａ）ウサギの抗
ヒツジ赤血球抗体で被覆したヒツジ赤血球の細胞溶解の
測定（テスｌ” Ｃｌｌ ５０） 。 複数の連続的希釈度をテスｌ−Ｌ、結果３各希釈度での
赤血球の細胞溶解の血漿のパーセンテージで表す。細胞
溶解は透射ヘモグロビンの星によって評価され、この測
定は光学的濃度によって行なわれる。 （Ｋａｂａｔ
Ｅ、＾、及びＭｅｙｅｒ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｃｈａｒｌ
ｅｓ Ｃ，’Ｉ’ｈｏｍａｓＪ４、米国スフ゛リングフ
ィールド、イリノイ州（１９６７年）１４９ベージ；
Ｋａ７ａｔｃｂｋｉｎｅ Ｎ、 Ｄ、、 Ｉｌｎｕｐｔ
ｍａｎｎ Ｇ、。 及びＮｙｄｅｇｇｅｒυ３、’Ｉ’ｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｄｕ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ、ｌ Ｎ Ｓ Ｉ’、開成
、パリ（１９８５年）、２２−３０ページ。）ｂ）赤血
球凝集反応テス）・ このテストではデキス１〜ランで被覆したヒツジ赤血球
を使用し、微量滴定プレート内でその動物の血漿中に存
在する抗デキストラン抗体によるこれら赤血球の沈殿を
測定する。結果は前記沈殿を生起せしめる最大血漿希釈
度によって表す。 −下記のプロトコールに従う操作により、Ｆｒｅｕｎｄ
の完全アジュバントをラットに投与して生起せしめた関
節炎を使用する実験モデル：雄Ｌｅｉｕｉｓラット（１
６ｌ６０−２Ｏ０にＦｒｅｕｎｄの完全アジュハンｈ
（ＦＣＡ ０．１＋ａｌの牛酪酸（ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍＢｕｔｙｒｉｃｕｎ＋ ）及びパラフィン油懸
濁液８Ｂ／ｍｌ ）を注射する。この注射は左後脚の足
底弓に行う。 ３グループの動物を使用して、１グループにはＦＣＡの
み与え、別のグループにはＦＣΔ＋テスト物質を与え、
残りのグループは何も操作せずに対照として使用する。 デス１〜物質は、ＦＣ八へ射後の最初の１９日間にわた
り１−１０ｍｇ／ｋｇ日の割合で静脈注射又は皮下注射
により投与する。 結果は注射しなかった右後脚の大きさく２次傷害）と、
関節炎指数の測定とによって評価する。 （Ｐｅｒｐｅｒ Ｒ，Ｊ、 、Δ１ｖａｒｅｚ Ｂ、、
ＣｏｌｏｍｂＯＣ，。 Ｆｃｌ＋ｒｏｄｅｒ １１．（１９７１年） 、Ｐｒｏ
ｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、。 １３７．５０６−５１２ページ； ｌ１ａｒｔｌｅｔＬ
Ｒ，Ｒ１、５ｃｈｌｅｙｅｒ−ｂａｃｂ Ｒ，（１９
８５年）、Ｉｎｔ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｐｂａｒｍａ
ｃ、、第７巻、Ｎｏｌ、７−１８ページ。） 実施例５の過硫酸化オクトサツカリドの第１検査の結果
、これら２つのモデルに関しては好ましい効果が得られ
た。 本発明の種々の添加率のＧＡＧはまた、有利なことに毒
性を示さない。 ｆ水型２０ｇの雌スイスＣＦマウスをロット当たり５匹
ずつに別けて皮下注射することによりＤＬ ５０を調べ
た。注射量は０ 、５ Ｉｎ ｌ、最終薬用量６２．５
ｍｇ／ｋｇ、１２５＋ｎｇ／ｋｇ、２５０ＩＩ１ｇ／ｋ
ｇ、１００ＯＢ／ｋｇとした。 ＤＬ ５０は所定条件では、２つのテスト物質即ち実施
例２のＩＣ８６１７１６及び実施例５の過硫酸化デカサ
ツカリドＩＣ８［ｊ１７４６の場合に１００ｍｇ／ｋｇ
を越える。 注射の間に又はその後の７日間の観察期間に死亡した動
物は皆無である。 従ってこれらの物質は薬の製造にとって特に貴重である
。 抗凝血活性及び抗Ｉ・ロンビン活性を保持していた１２
を越えるｄｐを有する物質は、血栓形成の予防及び治療
に有用である。ｄｐの小さい物質、特にｄｐ８以下の物
質は主として血管壁障害、組織の老化及び退行性の症状
、特に例えば糸状体腎炎、リューマチ様関節炎及びアレ
ルギー症状として現れるある種の遅発感覚過敏性症状の
ごとき特定形態の免疫不均衡に起因する障害の治療に有
用である。 これらの物質はまた、ショック状態、特に重い火傷にも
使用し得る。 本発明の医薬製剤は前述のＧＡＧを製薬賦形剤と共に有
効量含むことを特徴とする。有利には、これらの医薬製
剤は非経口投与の場合にはピロゲン基質を含まない。 好ましい組成物は経口投与に適した製薬ビヒクルを含む
。この場合の本発明の投与形態は有利には背低抗性カプ
セル、錠剤、丸薬であり、又はリポソーム７の形態でも
存在する。 別の医薬組成物はこれらのＧＡＧを直腸投与に適した賦
形剤と共に含む。この場合の投与形態は座薬である。 別の医薬組成物では前記Ｇ八Ｇがエアゾール又はポマー
ドの形態で存在する。 本発明は静脈注射、筋向注射、又は皮下注射に適した注
射可能な滅菌又は滅菌可能医薬組成物にも係る。 これらの溶液は有利には１がら２００ｍｇ／ｎ＋ Ｉの
ＧＡＧを含み、これら溶液を皮下注射する時には好まし
くは２０から１５０＋ｇ／ｍ ｌのＧＡＧを含む０例え
ばこれら溶液は３０から１００ｍｇ／ｍｌ、特に静脈注
射又は潅流による投与の場合には４０がら５０Ｂ／＋ｎ
ｌのＧＡＧを含み得る。 この種の医薬製剤は有利には即使用可能な使捨て注射器
の形態で存在する。 本発明の医薬組成物は特にヒト又は動物の血液凝集の特
定段階を、特に患者が主として外科手術、アテロームプ
ロセス、腫瘍形成及びバクテリア又は酵素活性体による
凝血傷害に起因する過剰凝血性を示す危険がある場合に
コントロール（予防又は治療）するのに適している。 ある種の組成物は補体の作用を特に炎症性の症候群、例
えばリューマチ様関節炎に係わる炎症性症候群を変化さ
せ得る。実際、観察される障害のうちあるものは、少な
くとも部分的には、補体がある役割を果たす関節レベル
に大量の抗原−抗体複合体が存在するために生起するこ
とが知られている。 別の組成物は一般的に組織の老化又は脱毛のごとき退行
性症状に対して有効である。 本発明をより明らかにすべく、次にヒトに使用し得る薬
用量の一例を示す：約１ｍｇから１ ｇ／２４時間、好
ましくは約５から５００ｍｇ／２４時間、例えば約２０
０＋ｌ１ｇ７２４時間を静脈注射により断続的に、即ち
一定間隔をおいて投与するが、又は約２００がら１１０
００ＩＩ１／２４時間を経口投与する。これらの用量は
勿論予め行なう血液検査の結果、病気の種類及び一般的
には健康状態に応じて各患者毎に調整し得る。 本発明はまた、ラボラトリ−で特にプロテアーゼ阻止活
性テストにかけられる他の物質の検査の°比較対照とし
て使用し得る生物学的試薬の形成における本発明のＧＡ
Ｇの使用にも係る。 本発明の他の特徴及び利点は本発明の生成物の合成に関
する以下の実施例の説明によって明らかにされよう。 支膨■上二恋又通尺Ｎ土ブｐフィルを・つヘパリ″Ｌ！
！２ＪＬＬ（Ｉ Ｃ８４１５４５）先ずヘパリン酸Ｉ・
リュチルアンモニウム（ＴＥ＾〉を製造し、次いでこの
生成物を過硫酸化処理にかける。 水５０ｍ１中に溶解したヘパリン酸すＩ・リウム１ｇを
イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ ５０． ＩＩ” ）によ
りヘパリン酸に変換する。トリエチルアミンで中和し且
つ濃縮乾固すると１．３８のＴＥＡ塩が得られる。 ｂ ） ”１ＡＩｎＪＬ監 前述の塩０．９７８をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
２０ｍｌ中に溶解し、これに硫酸化用複合体ＴＭ＾／５
０３（６，８ｇ）を加える。５０℃で２４時間放置した
後、前記反応混合物を希釈し、次いで５ｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５ゲルカラムに通して当該生成物を回収する。 樹脂Ｄｏｗｅｘ ５０ Ｈ”での交換によって得た酸を
中和するとすｌ・リウム塩が得られる。凍結乾燥後７７
４Ｂの生成物か回収される。 Ｃ）ＶＬｉＬ 得られたヘパリンは３．０１の硫酸化度（硫酸塩／カル
ボン酸塩； ＳＯ，−／Ｃ００−）を示す。これに対し
出発生成物の硫酸化度は２．１６である。 反応時間を１時間に限定すると、ＳＯ３−／ＣＯＯ−・
２．７０になる。 硫酸化用複合体０．６８ｇの存在下で１時間処理すると
ｓｏ、−７ｃｏｏ−＝ｚ、４ｏになる。 ヘパリン及び過硫酸化ヘパリンのＮＭＲスペクトルを第
１図及び第２図に示した。これらのグラフからは特にＣ
Ｉｌ□０３Ｏ１への変換に起因して６２．４ｐｐ…でシ
グナルＣＨ２０１１が消失している。アノマー炭素領域
でも大きな変化が見られる（約１０１００ｐｐ。 実施例１と同様に操作するが、この場合は複合体ＴＭ＾
／ＳＯ１に代えてピリジン中のクロロスルホン酸をｔｆ
ｔ、に止剤として使用する。硫酸化にはピリジン５０ｎ
ｌに溶解したＴＥ八基塩０９７ｇを使用し、次いでク
ロロスルポン酸（１ｇ）を加える。 ０℃で２４時間放置した後、前記反応混合物を実施例１
１と同様に輻釈し処理する。 ヒ 前述Ｚ同様の特徴を持つヘパリンが得られる。 １ｉＬ１１：１歿！ Ｎ−アセチル ヘパリンの１克（
ＩＣ８６１７４６） ヘパリンを従来の方法でト脱硫酸化しく ＩｎｏｕｅＳ
、及びＮａｇａｓａｗａ Ｋ、、Ｃａｒｂｏｈｙｄ Ｒ
ｃｓ、、４６ （１９７８年）８７−９５）、次いで水
性塩基媒質中で無水酢酸によりアセチル化する０次いで
ＴＥＡ塩を実施例１ａと同様に製造する。 ｂ）（１此 Ｎ−アセチル化ヘパリン１ｇから得たＴＥＡ塩をＤＭＦ
（２５ｍｌ）中に溶解し、’ｒＭＡ／５Ｏｚ（０，８４
ｇ）ノ存在下チー晩１００℃に加熱する。硫酸化した生
成物を５ｃｐｈａｃｌｅｘ Ｇ ２５でのゲル濾過にか
けた後回収する。 これを一時的に酸の形態に変え後ナトリウム塩に変換す
る。凍結乾燥すると薄いベージュのナトリウム塩ＩＣ８
６１７１６が１．１４ｇ得られる。Ｎ−アセチル化ヘパ
リン及び対応過硫酸化生成物のＮＭＩ（スペクトルを第
４図及び第５図に示した。 ルアンモニウム上 ＴＡＢの ゛１ 塩基として水酸化テトラブチルアンモニウムを使用し且
つ分子量の小さいヘパリンを用いて実施例２ａ）と同様
に操作する。 ｂ）慶並進− 得られた塩（Ｉｇ）を複合体ピリジン／Ｓ０３（１ｇ）
によりピリジン（１０慎１ ）中室温で２４時間硫酸１
ヒする。ゲル濾過にかけ、次いでナトリウム塩に変換す
るとＮ−アセチル１ヒ低分子址ヘパリンのすｌ−リウム
塩が０．５ｇ得られる。 ｃ ） ＶＬ 例えば前述の主特許第２４４０３７６号の実施例１の方
法により得られるような生成物ＣＹ ２１０ （平均ｄ
ｐ約１４）に使用される前述の方法は、ＳＯ３−／ＣＯ
Ｏ−比２．８５の過硫酸化生成物（ＩＣ８４１５４８）
を製造せしめる。出発生成物の前記比は２．１２である
。 モニウム塩のパ告 低分子量ヘパリンＣＹ ２１Ｂを水に溶解しく０．５１
中に１０ｇ）次いで１１＋形悪の樹脂Ｄｏｗｅｘ ５０
ＷＸ４カラムに通すことにより酸に変換する。中和後、
得られたテトラブチルアンモニウムヘパリンを凍結乾燥
する。テトラブチルアンモニウム塩が１９．３４ｇ得ら
れる。 ｂ）！ｉＬｌ！ｕ− 前述の塩１ｇを無水ピリジン５０ｍ Ｉ中に溶解し、硫
酸化複合体（ピリジン／ＳＯｚ＞を加える。複合体の量
を変えながら３回テストを行なう。室温で２４時間反応
させた後この反応混合物を９５％エタノール中ソーダ（
２ｇ）溶液に加える。形成された沈殿物を濾過し、水に
溶解し、５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２５でクロマＩ・グラ
フィにかけ、凍結乾燥するとナトリウム塩が得られる。 ｃ）１１ 硫酸化複合体の質量を変えることによって形成生成物の
硫酸化度を変化させる０例えば硫酸化複合体の質量を夫
々０．１６ｇ、０．３２ｇ、０．４８ｇにすると、２．
２１．２．７５及び３．４１の硫酸化度が得られる。 過硫酸化ＣＹ ２１６のＮＭＲスベク１−ルを第３図に
示した。 無水マンニトールＣＩのシグナル（６３，６ｐｐｍ）が
消失しく Ｃｌ２Ｏ＋１ →Ｃ１１２０ＳＯ，−）、他
（７） ７ ンニｌ−−ルシグナル（領域７８．８６ｐ
ｐ＋ｎ）も変１ヒした。約ｐｐｍのアノマーグループの
シグナルも同様である。 オリゴ糖は所定条件下でヘパリナーゼ又は亜硝酸による
ヘパリンの脱重合の結果得られる混合物をゲルー過する
ことにより分留して得る。亜硝酸による脱型合法は例え
は１９８０年３月２０日の第２追加特許明細書第２４７
８６４６号及び１９８１年４月１０日の仏国特許出願第
２５０３７１４号に記載されており、ヘパリナーゼを用
いる脱重合操作は欧州特許出願第００２７０８９号に記
載されている。本出願人名義のこれら特許及び特許出願
については既に説明した。 使用する脱重合用混合物（１ｇ）を、０．２Ｍ塩塩ビヒ
ナトリウム溶液溶出した５ｅｐｈａｄｅＸＧ ５０ゲル
カラム（２，５ｘ ３００ｃｎ＋）の最上部に配置する
。明確に規定されたオリゴ糖（ジー、テＩ・ラー、ヘキ
サ−、オ、シ フタ−１１９，エイコサツカリドまで）に対応する分画
をまとめて濃縮し脱塩処理する。これらの生成物は凍結
乾燥後に得られる。 ｂ）：トラブールアンモニウム塩の′１゛告テトラブチ
ルアンモニウム塩を４ａの塩の製法と同じ方法で製造す
る。非還元性末端に位置する不飽和ウロン酸の残基で終
わる生成物のテトラ−、ヘキサ−、オクタ−、ドデカ−
及びヘキサデカ−サツカリドの塩が得られた。 Ｃ） リボ の砕６・ 硫酸化すべきオリゴ糖のテＩ・ラブチルアンモニウム塩
をＤＭＦ （２５０１□ｇ７５ｍｌ）中に溶解し、次い
で硫酸化複合体（］・リメチルアミン／ ＳＯ３； ２
５０ａ＋ｇ）を加える。この反応混合物を２４時間５０
’Ｃに加熱する。 水（５ｍｌ）で希釈し、５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２５で
反応混合物をクロマトグラフィにかけ、次いで凍結乾燥
するとオリゴ糖が得られる。 過硫酸１ヒジサツカリド ２４．１＜ ＩＣ８４１
４７７） 過硫酸化テ１〜ラサッカリド ４ ３．２０（
ＩＣ８５１５９７） （ＩＣ８４１４７８） 過硫酸１ヒジサツカリド ６３．００ （ＩＣ８５１５９８） オクタサツカリド ８ ２．４３（
ＩＣ８４１４７５） 過硫酸化オクタサツカリド ８ ３．０８（Ｉ
Ｃ８５１５９９） （ＩＣ８６１７４６） 過硫酸化デカサツカリド １０ ２．７６え
Ｉ１更：−硫 −ルマタンルに礼ｌ（ＩＣ８５１６１
０） ａ）？上５７’−％ｔｌ、＝７７Ｔ＝−：’）ムｑデル
マタン硫１２５＋ｎｇを酸に変換しくカチオン交換樹脂
）次いで水酸化テＩ〜ラブチルアンモニウムにより中和
する。乾燥凍結後４６ｍｇの塩が得られる。 ｂ）−ルマタン硫 の゛・砕２ 前述のごとく得られた塩（１５Ｂ）を複合体トリメチル
アミン／ ＳＯｙ （１５＋ｎｇ）の添加によりＤＭＦ
（Ｉｍｇ）中で過硫酸ｆヒする。この生成物は水による
希釈、５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２５ゲルでのクロマト
グラフィ及びイオン交換樹脂によるすトリウムの有機カ
チオンの交換の後で得られる。 出発生成物（０，８ｇ）を水に溶解し、酸に変換し且つ
トリエチルアミンによって中和する。その結果凍結乾燥
後に０．９１ｇのトリエチルアミン塩が得られる。 ｂ）過」ＪＵＬ 前述の塩（０，２４ｇ）をＤＭＦ（８ｍｌ）に高温で溶
解する。 硫酸化複合体（１’ＭΔ／Ｓｏ、； １．６８ｇ）を加
えた後２４時間５０℃に維持する。ゲルｐ過及びナトリ
ウム塩への変換後に２３８ｇの過硫酸化ヘパリンが得ら
れる。 この実施例は該製法の柔軟さを示すものである。 先ずＣａｒｂｏｈｙｄ、 Ｒｅｓ、 ５８（１９７７年
） ４７−５５に記載のＮＡＫΔＧＡＷΔ池の方法によ
りＮ、０−脱硫酸化ヘバリンを製造する。 次いでこのヘパリンを塩基ｐＨの複き体ピリジン／ＳＯ
，により選択的にＮ−再硫酸（ヒする。これを酸形態に
変え且つ水酸化テトラブチルアンモニウムにより中和す
ることによってテトラブチルアンモニウム塩に変換する
。このようにして得られた塩を真空下５０°Ｃで２４時
間乾燥する。 前記テトラブチルアンモニウム塩（０゜９２ｇ）を無水
ピリジン（１０ｍｌ）中に溶解する。無水酢酸（０，１
ｍ１）を加え室温で一晩放置する。硫酸（ヒ複合体（ピ
リジン／ＳＯコニ０．７２ｇ）添加後、該反応混合物を
１００℃で４時間加熱する。冷却後、これをソーダ（２
ｇ）３有エタノール（１００＋＋＋Ｉ）にゆっくり加え
る。４℃で一晩放置した後、形成された沈殿物を脱水に
かけ、水に溶解し次いで５ｅｐｂａｄｅｘ Ｇ ２５で
クロマトグラフィにかける。凍結乾燥（Ｈｏ、６℃ｇの
粉末が得られる。これを分析した結果、６０％の第１ア
ルコール官能基が遊離していた。 実施例５ａで説明したヘキササツカリド分画をピリジニ
ウム塩に変換し、次いで混合物ＤＨ５Ｏ／＋１２０（９
５１５；ｖ／ｖ）中５０℃で９０分間加熱することによ
りＮ−脱硫酸化する。ソーダ添加後、この反応混合物を
５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２５カラムでクロマトグラフィ
にがける。凍結乾燥後に当該生成物を道順アミンの形態
で回収する。これを従来の方法に従い塩基媒質中で無水
酢酸によりＮ−アセチル化する。 前記ドアセチル化誘導体（０，５ｇ）をテＩ・ラブチル
アンモニウム塩に変換する。次いでこれをＤＭＦ（１０
ｍｌ）中に溶解し、複合体トリメチルアミン／ＳＯ３（
０，５１？）の存在下１００℃で４時間硫酸化処理する
。冷却後この反応混合物をエタノール（９０ｍｌ）中０
．５Ｍ溶液にゆっくり加える。遠心３雛後残留物を回収
する。これを水に溶解し且つ凍結乾燥する。 その結果０．６１．の過硫酸化ドアセチル化ヘキササツ
カリドかすｌ・リウム塩の形態で得られる。 及１圧咀：過硫酸イ′デルマタン研酸訂 の製造デルマ
タン硫酸断片を従来の方法で得る（定期的酸化とそれに
次ぐ酸の所定加水分解： Ｔ ＯＬ Ｌ Ｅ Ｆ Ｓ
ＥＮ、 Ｎｏｕｖｅｌｌｃ Ｒｅｖｕｅ Ｆｒａ＋＋５
：ａｉｓｅ ｄ’ｌ１５＋ｎａｔｏｌｏｇｉｅ；２６（
１９８４年） ２３３−２３７、又はヒドラジン分解（
ｂｙｄ−ｒａｚｉｎｏｌｙｓｅ）とそれに次ぐ亜硝酸に
よるデグラデーション、又は前述の方法を用いる）。 デルマタン硫酸（Ｓｉｇｍａ製品） ５０ｍｇを塩酸０
．５Ｍ溶液（２＋ｎｌ）に溶解する。この混合物を１０
０℃で５分間加熱した後冷却する。次いで亜硝酸ナトリ
ウム水溶？１！（２，５％；１ｍ１）を加える。１分後
にソーダを加えて鎖酸を中和し、次いでホウ水素化ナト
リウム（ｂｏｒｏｈｙｄｒｕｒｅ ｄｅ ｓｏｄｉｕｍ
） （１０ｍｇ）を加える。この混合物を５ｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ ２５カラムで脱塩処理する。 凍結乾燥後、得られた生成物をトリエチルアミン塩に変
換し、次いでＩ・ツメチルアミン／ＳＯ５複合体（５０
ｍｇ）の存在下ＤＭＦ （５ｍｌ）中１００℃で硫酸化
する。４時間後にこの混合物を冷却し、次いで水で溶出
した５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ５０カラムの最上部に配置
する。酸形態への中間変化とソータによる中和とによっ
てナトリウム塩を得る。この中和は電導率測定の前に行
なわれ、２．４の硫酸塩／カルボキシル比を示す。 加水分解時間又は温度又は酸のモル密度は種々の大きさ
の断片を得るべく変化させてよい、硫酸化度もこの反応
の条件を変えることにより変化させ得る。 この反応は同一条件下でコンドロイチン硫酸にも使用さ
れる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）所与のグリコサミノグリカンを有機溶媒に可溶性
の塩に変換し、これを有機溶媒中に可溶化し、溶解した
塩を硫酸化剤により処理することを特徴とするグリコサ
ミノグリカン即ちＧＡＧの硫酸化方法。 （２）出発時のＧＡＧがＤ−グルコサミン−ウロン酸（
即ちＬ−イズロン酸又はＤ−グルクロン酸）の交互モチ
ーフを主体とすることを特徴とする特許請求の範囲第１
項に記載の方法。 （３）出発時のＧＡＧが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、そ
れらのフラクション又はフラグメントから選択されるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の方法。 （４）出発時のＧＡＧがヘパリン又はヘパラン硫酸より
も少ない２〜３０の範囲の糖モチーフ数を有する鎖混合
物又は重合度に関して均一の鎖混合物から形成される低
分子量のＧＡＧである特許請求の範囲第２項又は第３項
に記載の方法。 （５）出発時のＧＡＧが、 例えばアルコール抽出によりヘパリンから得られ、Ｙｉ
ｎ Ｗｅｓｓｌｅｒ／ＵＳＰ比が少なくとも２である分
子量約２０００〜８０００の鎖混合物から形成されるム
コ多糖、例えば３〜５程度のＹＷ／ＵＳＰ比と３０００
〜５５００の平均分子量とを有する生成物、 例えば亜硝酸によりヘパリンを脱重合することによって
得られ、一般に前記ムコ多糖と同様の特徴を有しており
且つ２，５−アンヒドロ−マンノ構造の基を末端に有す
るムコ多糖、特に２，５−アンヒドロ−マンニトール末
端又は２，５−アンヒドロ−マンノン酸末端を有してお
り、大部分が２０００〜３０００程度の分子量、特に約
２０００〜２６００の分子量を有しており且つＹｉｎ−
Ｗｅｓｓｌｅｒ／ＵＳＰ比が特に少なくとも１０であり
Ｙｉｎ−Ｗｅｓｓｌｅｒ値か少なくとも約２００ｕ／ｍ
ｇであるムコ多糖、 （１）平均分子量が３０００〜６０００ドルトン、特に
約４０００〜５０００であり、（２）ＹＷ／ＵＳＰ値が
１０未満、特に約６〜３であり、（３）２，５−アンヒ
ドロマンノ構造のモチーフを末端に有する鎖から本質的
に形成されるムコ多糖、 最大８個の糖モチーフから形成されており、２０００ｕ
／ｍｇに達し得る高いＷｉｎ−Ｗｅｓｓｌｅｒ値と実質
的にゼロに等しい低いＵＳＰ値とを有しており、ＡＴI
IIに対して強い親和性を有しており、２，５−アンヒド
ロマンノ構造の基を末端に有するか、又はヘパリンをヘ
パリナーゼで脱重合することにより形成されるような不
飽和ウロン酸モチーフに対応する鎖発端モチーフを有し
ており、下式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるＡＢＣＤＥＦＧＨ構造を有するオリゴ糖、下
式： ▲数式、化学式、表等があります▼ に対応する六糖の均一組成、 上記ＧＡＧをセファデックスのような材料上でろ過する
ことにより又はイオン強度勾配クロマトグラフィにかけ
ることにより得られる均一重合度のオリゴ又は多糖、 ヘパリンに過沃素酸塩を作用させた後、塩基性溶媒中で
処理し、場合によってはホウ水素化ナトリウムで還元処
理することにより得られるようなＧＡＧ、 ヘパリンをヘパリナーゼ又は亜硝酸で脱重合し、ＡＴI
II固定配列を有するフラクションを分離し、例えばｄｐ
が１２より大きいフラグメントのような多様な重合度の
ＧＡＧフラグメントと、特に１２、１０、８、６、４及
び２個の糖モチーフを含む低重合度のＧＡＧフラグメン
トとを得るべく前記フラクションをゲルろ過することに
より得られるようなＧＡＧ、 前記ＧＡＧと同様でありながら、ＡＴIIIを特異的に認
識し得る配列を実質的に全く備えず且つＹＷ値がゼロに
等しい小さい値であり、ヘパリン又はＧＡＧをＡＴIII
に接触させた後、多様なｄｐの均一フラグメントを得る
べくゲルろ過する段階を含む工程中でＡＴIIIに固定さ
れないＧＡＧ、 ヘパリンに見出だされるような連鎖を有しており、グル
コサミンモチーフの２位の−ＮＨＳＯ＿３基の一部、或
いは大部分或いは全体が−ＮＨ−アシル基、特に−ＮＨ
−アセチル基又はＮＨ＿２基で置換されたＧＡＧ、前記
ＧＡＧのフラクション及びフラグメント、 動物器官の処理により得られるＧＡＧの組成に対応する
所謂全ＧＡＧ、 から選択されることを特徴とする特許請求の範囲第４項
に記載の方法。 （６）出発時のＧＡＧがＤ−ガラクトサミン−ウロン酸
交互モチーフを主体とすることを特徴とする特許請求の
範囲第１項に記載の方法。 （７）出発時のＧＡＧがデルマタン硫酸、コンドロイチ
ン、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸、それらのフ
ラクション及びフラグメントから選択されることを特徴
とする特許請求の範囲第６項に記載の方法。 （８）使用されるＧＡＧのグリコシド鎖の糖モチーフの
１又は数個の第一又は第二−ＯＨ基が保護基により保護
されていることを特徴とする特許請求の範囲第１項から
第７項のいずれかに記載の方法。 （９）出発時のＧＡＧが重合度に関して均一であり、こ
れらのＧＡＧが例えば該ＧＡＧの脱重合混合物をゲル上
でろ過することにより得られることを特徴とする特許請
求の範囲第６項又は第７項に記載の方法。 （１０）使用されるＧＡＧの塩がアミン塩であることを
特徴とする特許請求の範囲第１項から第９項のいずれか
に記載の方法。 （１１）前記アミン塩が、式−Ｎ（Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ
＿３）（式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２及び／又はＲ＿３は水素
原子、又は１〜１０個の炭素原子を有する脂肪族鎖）で
表されるアミンの塩の群、特にトリエチルアミン又はト
リブチルアミン或いは第四級アンモニウム塩から選択さ
れることを特徴とする特許請求の範囲第１０項に記載の
方法。 （１２）使用されるＧＡＧの塩が、酸性イオンの交換樹
脂を使用することにより得られた酸形態のＧＡＧを、形
成しようとする塩に対応するアミンの作用下におくこと
により得られることを特徴とする特許請求の範囲第１項
から第１１項のいずれかに記載の方法。 （１３）ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド
又はピリジンから選択された有機溶媒中にＧＡＧの塩を
溶解させることを特徴とする特許請求の範囲第１項から
第１２項のいずれかに記載の方法。 （１４）硫酸化剤が、無水硫酸ＳＯ＿３とトリメチルア
ミン（ＴＭＡ）又はピリジンのような有機塩基との複合
体、或いはクロロスルホン酸とピリジンとの複合体であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項から第１３項
のいずれかに記載の方法。 （１５）ＧＡＧのＯＨ当量当たり１〜５倍当量の複合体
を使用することを特徴とする特許請求の範囲第１４項に
記載の方法。 （１６）０℃〜１００℃程度、又は２０℃以上の温度で
約１０〜１４時間硫酸化反応を実施することを特徴とす
る特許請求の範囲第１項から第１５項のいずれかに記載
の方法。 （１７）硫酸化段階後に、水酸基の−Ｏ−アシル及び−
Ｏ−ベンゾイル保護基を夫々鹸化又は接触還元により離
脱することを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第１
４項に記載の方法。 （１８）得られた硫酸ＧＡＧを回収し、重合度に関して
均一のＧＡＧを得るべくゲルろ過処理することを特徴と
する特許請求の範囲第１項から第１７項のいずれかに記
載の方法。 （１９）重合度に関する均一又は混合形態の硫酸化修飾
形ＧＡＧであって、下式 I ： Ｒ−（ＸＹ）＿ｎ−Ｒ′ （式中、Ｒはウロン酸又は不飽和ウロン酸又はＯＨ基で
あり、Ｘは２位の炭素がＮＨＳＯ＿３基により置換され
、グルコサミン及びヘパリン型の鎖の場合にはＮＨ＿２
又はＮＨ−アシル基により置換されたグルコサミン又は
ガラクトサミンであり、Ｙはウロン酸即ちＤ−グルクロ
ン酸又はＬ−イズロン酸であり、ｎは０〜８０の整数で
あり、Ｒ′は２位の炭素がＮＨＳＯ＿３＾−基により置
換され、グルコサミン及びヘパリン型の鎖の場合にはＮ
Ｈ＿２又はＮＨ−アシル基により置換されたグルコサミ
ン又はガラクトサミン、或いは−ＯＨ基、或いは２，５
−アンヒドロマンノ構造の基に転位したグルコサミンモ
チーフ、或いは２，５−アンヒドロヘキシトール構造の
基に転位したガラクトサミンモチーフであり、Ｘ及びＹ
及び場合によってはＲ及びＲ′のモチーフの第一又は第
二ＯＨ基は、ＧＡＧの鎖における硫酸基の位置及び／又
は数が対応するＧＡＧの天然又は脱重合鎖における位置
及び／又は数と異なるように硫酸化されている）又は薬
理的に許容可能なそれらの塩（但し、合計８〜３０個の
グルコサミン−ウロン酸モチーフを有する非修飾末端鎖
の混合物を除く）に対応することを特徴とするＧＡＧ。 （２０）下式II： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１はＨ又はＳＯ＿３＾−であり、Ｒ＿２は
Ｈ、ＳＯ＿３＾−又はアシル基、特にアセチル基であり
、Ｒ及びＲ′は上記と同義である）に対応することを特
徴とする特許請求の範囲第１９項に記載の生成物。 （２１）Ｘ及び場合によってはＲ′がガラクトサミンモ
チーフであり、ガラクトサミン−ウロン酸モチーフ間の
結合が１→４β、Ｄ型であり、場合によって存在するウ
ロン酸−ガラクトサミンモチーフ間の結合が１→３α、
Ｌ型又は１→３β、Ｄ型であることを特徴とする特許請
求の範囲第１９項に記載のＧＡＧ。 （２２）糖モチーフ数が１２以下であることを特徴とす
る特許請求の範囲第１９項から第２１項のいずれかに記
載のＧＡＧ。 （２３）Ｒが不飽和ウロン酸であることを特徴とする特
許請求の範囲第２２項に記載のＧＡＧ。 （２４）Ｒ′が２，５−アンヒドロマンノ構造の基であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第２２項に記載のＧ
ＡＧ。 （２５）Ｒ′が２，５−アンヒドロマンニトール構造の
基であることを特徴とする特許請求の範囲第２４項に記
載のＧＡＧ。 （２６）４又は６個の糖モチーフから成る鎖を有する重
合度に関して均一のＧＡＧの集合から構成されているこ
とを特徴とする特許請求の範囲第２２項に記載のＧＡＧ
。 （２７）Ｒ及びＲ′が同時にＯＨであるか又は夫々ウロ
ン酸及びグルコサミンであることを特徴とする特許請求
の範囲第２６項に記載のＧＡＧ。 （２８）Ｒ′が２，５−アンヒドロヘキシトール構造の
基であることを特徴とする特許請求の範囲第２６項に記
載のＧＡＧ。 （２９）Ｒ′が２，５−アンヒドロマンニトール構造の
基であることを特徴とする特許請求の範囲第２８項に記
載のＧＡＧ。 （３０）８、１０又は１２個の糖モチーフから成る鎖を
有するＧＡＧの均一集合から構成されていることを特徴
とする特許請求の範囲第２２項に記載のＧＡＧ。 （３１）上記式 I （式中、ｎは３〜１５の整数、Ｒ及
び／又はＲ′は修飾された糖モチーフである）に対応す
る鎖混合物を含んでいることを特徴とする特許請求の範
囲第１９項に記載のＧＡＧ。 （３２）亜硝酸による脱重合によって得られ、分子量２
０００〜８０００程度の２，５−アンヒドロマンノ、特
に２，５−アンヒドロマンニトール末端モチーフを有す
る鎖混合物から形成されており、Ｙｉｎ−Ｗｅｓｓｌｅ
ｒ／ＵＳＰ比が少なくとも３でありＹｉｎ−Ｗｅｓｓｌ
ｅｒ値が少なくとも２００ｕ／ｍｇであり且つ平均分子
量が２０００〜３０００であるようなムコ多糖から構成
される出発物質から製造されることを特徴とする特許請
求の範囲第３１項に記載のＧＡＧ。 （３３）亜硝酸による脱重合によって得られ、２，５−
アンヒドロマンノ、特に２，５−アンヒドロマンニトー
ル末端モチーフを有する鎖混合物から形成されており、
Ｙｉｎ−Ｗｅｓｓｌｅｒ／ＵＳＰが約３〜６であり且つ
平均分子量が４０００〜５０００であるムコ多糖から構
成される出発物質から製造されることを特徴とする特許
請求の範囲第３１項に記載のＧＡＧ。 （３４）グルコサミンの２位の炭素がＮＨ＿２又はＮＨ
−アシル、特にＮＨ−アセチル基により置換されている
ことを特徴とする特許請求の範囲第３１項に記載のＧＡ
Ｇ。 （３５）３０個より多い糖モチーフ数を含んでいること
を特徴とする特許請求の範囲第１９項に記載のＧＡＧ。 （３６）ヘパリンを除く過硫酸化天然物質であることを
特徴とする特許請求の範囲第３５項に記載のＧＡＧ。 （３７）グルコサミンの２位の炭素がＮＨ＿２又はＮＨ
−アシル、特にＮＨ−アセチル基により置換されている
ことを特徴とする特許請求の範囲第３６項に記載のＧＡ
Ｇ。 （３８）特許請求の範囲第１９項に記載の少なくとも１
個の硫酸化修飾形ＧＡＧから構成されることを特徴とす
る医薬活性成分。 （３９）特許請求の範囲第１９項から第３７項のいずれ
かに記載の少なくとも１個の有効量のＧＡＧを薬学的賦
形剤と共に含有していることを特徴とする製剤組成物。 （４０）１〜１００ｍｇのＧＡＧ、好ましくは皮下注射
用として使用する場合には２０〜８０ｍｇ／ｍｌ、静脈
内注射又は潅注用として使用する場合には３０〜６０ｍ
ｇ／ｍｌのＧＡＧを含有する注射可能な無菌溶液の形態
であることを特徴とする特許請求の範囲第３９項に記載
の組成物。 （４１）胃抵抗性カプセル、錠剤、ピル又はリポソーム
のような経口投与可能な形態であることを特徴とする特
許請求の範囲第３９項に記載の組成物。 （４２）坐薬形態であることを特徴とする特許請求の範
囲第３９項に記載の組成物。 （４３）特許請求の範囲第１９項から第３７項のいずれ
かに記載の硫酸化修飾形態のＧＡＧを含有していること
を特徴とする生物学的試薬。
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