JPS6227402A - グリコサミノグリカンの硫酸化方法、該方法によつて得られる新規グリコサミノグリカン及びその生物学的適用 - Google Patents
グリコサミノグリカンの硫酸化方法、該方法によつて得られる新規グリコサミノグリカン及びその生物学的適用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明はグリコサミノグリカンの硫酸化方法に係る。
本発明は更に、硫酸化度か可変な新規グリコサミノグリ
カン即ちGAG、及びその生物学的適用に係る。 以下の記載及び特許請求の範囲の記載中、GAGなる語
はGAG、 GAGのフラクンヨンもしくはフラグメン
ト、又は生理学的に許容可能なこれらの塩の1つを任意
に表すために使用される。 「WL酸化度」なる表現は、ウロン酸−アミノ糖(又は
逆)の二糖単位当たりの硫酸基SO3−の数、或いはS
Q、−/Coo−比を表すものである。 GAGは、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、
フンドロイチン、コンドロイヂン硫酸又はヒアルロン酸
のような生物学的に活性な天然GAGのオリゴ及び多糖
鎖に見出だされる型のウロン酸−アミノ糖(又は逆)の
交互モチーフから本質的に形成されていることが知られ
ている。 ウロン酸モチーフは特にD−グルクロン又はL−イズロ
ン酸構造に対応し、アミノ糖モチーフはD−グルコサミ
ン又はD−ガラクトサミン構造に対応する。 特に凝固障害及び血管壁の不全に関連する疾患、特に血
栓形成、アテローム性静脈硬化症及び動脈硬化症の予防
及び治療用として、或いは組織の老化又は脱毛症のよう
な退行型症状に対抗するために上記天然GAGを治療薬
として使用することの重要性は既知である。 又、天然GAGの抽出、又は化学的もしくは酵素0脱重
合により、天然物質よりも重合度が低く、特に血液凝固
因子Xaに対して高い特異活性を有するGAGを得られ
ることも知られている。重合度(又は省略形dp)とは
、グリコンド鎖のウロン酸又はアミノ糖から成る糖モチ
ーフの数を表す。 少なくと62.5の硫酸化度、即ち天然ヘパリン及び既
知の低分子量のヘパリンよりも高い硫酸化度を存する脱
重合ヘパリンは、^nic S、p、A、名義の198
3年12月16日付ヨーロッパ特許出願EP。 0116801号に記載されており、抗血栓症性、低脂
肪症血性及び繊維素溶解性作用を有する医薬として提案
されている。 この脱重合ヘパリンは前記ヨーロッパ特許出願中では過
硫酸化ヘパリンと呼称されており、天然ヘパリン又はそ
のフラクションの1つを硫酸及び得られる。この過硫酸
化処理は酸の加水分解を生じ、dp=8〜30の鎖混合
物をもたらす。 発明者らはこの分野で研究した結果、所定の条件で所与
の硫酸化処理を実施することにより、構造及び重合度の
いずれをも変化させずに一般に実質的に高い収里でGA
Gの硫酸化度を変化できるこさU・ることにより、特に
ある特性を増加させ別の特性を減少させろことにより作
用の特異性を改良できることが明らかになった。 本発明の目的は、充填率を所望通りに変化させろことの
可能な所定の生成物を得るための硫酸化方法を提供する
ことにある。 本発明の目的は更に、充填率が可変な新規GAG、カ 特に所定の特徴、特にA−重合度を有するGAGを提供
することにある。 硫酸化度の可変な本発明のGAGの製造方法は、所与の
GAGを有機溶媒に可溶性の塩に変換し、これを有機溶
媒中に可溶化さき、溶解した塩を硫酸化剤により処理す
ることを特徴とする。 この構成はあらゆるGAGに適用され、重合度及硫酸エ
ステル基−803−を所望の程度に従って導入でいる。 他の構造的特徴、特に重合度については既知通りである
。 従って、所望の生成物の関数として出発時に所与のGA
Gを選択すれば十分である。 本発明の一具体例によると、出発GAGはD−グルコサ
ミン−ウロン酸夕(即ちL−イズロン酸又はD−グルク
ロン−交互モチーフを主体とする。この上うれる。 一好適具体例では、ヘパリン、ヘパラン硫酸、それらの
フラクション又はフラグメントを使用する。 別の好適具体例では、出発GAGはヘパリン又はヘパラ
ン硫酸よりし少ない糖モチーフ数、特に2〜30の範囲
のモチーフ数を存する鎖混合物又は重合度に関する限り
において均一の鎖混合物から形成されろ低分子量のGA
Gである。 こCらの低分子量(省略形PM)のGAGは特に以下の
物質を包含する。 −1978年11月6日付仏国特許公開明細書第244
0376号及び1979年7月20日付第−追加特許公
開明細書第2461719号の記載に従ってアルコール
抽出によりヘパリンから得られるようなムコ多糖。主特
許に記載の態様の1つによるとこれらの物質は、Yin
−Yess ler/USP比か少なくとも2であり分
子量が約2000〜8000の鎖混合物から形成される
。上記文献中に記載の物質中、YW/USP比が約3〜
5及び平均分子量が3000〜5500の物質を挙げる
ことができ、以下の文中ではこれをCY216と呼称す
る。 −特に上記仏国特許公開明細書第2440376号の1
980年3月20日付第二追加特許公開明細書第247
8646号及び1981年4月10日付仏国特許公開明
細書第2503714号の記載に従ってヘパリンを亜硝
酸で脱重合することにより得られるようなムコ多糖。 これらの物質は一般に上記ムコ多糖と同様の特徴を有し
ており、且つ2.5−アンヒドロマンノ構造の基を末端
に有している。 この例としては、以下CY222と呼称するような2.
5−アンヒドロ−マンニトール末端を有する型のムコ多
糖、或いは2.5−アンヒドロマンノン酸末端を有する
型のムコ多糖が挙げられる。大多数の欠゛リコソド鎖の
分子量はより特定的には2000〜3000程度、特に
約2000〜2600である。Yin−%’essle
r/[ISP比は特に少なくともl01Y i n −
Yess ler値は少なくとも約200u/死である
。 −(1)平均分子量が3000〜6000ドルトン、特
に約4000〜5000ドルトンであり、(2)VW/
USP比が10未満、特に6〜3であり、(3)2.5
−アンヒドロマンノ構造のモチーフを末端に有する鎖か
ら本質的に形成されており、例えば1984年10月1
8日付仏国特許公開明細書第2572080号に記載の
方法に従って得られるようなムコ多糖、 −2000u/”gに達し得ろ高いYin4essle
r値と実質的にゼロに等しい小さいUSP値とを有して
おり、ATIUに対して強い親和性を有する最大8個の
糖モチーフから形成されており、特に1980年lO月
6日付ヨーロッパ特許出願第0027089号に記載さ
れているようなオリゴ糖。 一変形例によると、前記オリゴ糖は亜硝酸による脱重合
により得られ、2.5−アンヒドロ−マンノ構造の基を
末端に有している。 別の変形例によると鎖の発端モチーフは、ヘパリンをヘ
パリナーセで脱重合することにより形成されるような不
飽和ウロン酸モチーフに対応する。 特に、これらのオリゴ糖は下式・ に対応する構造ABCDEFG11のへ糖から形成され
る。 −前記へ糖をヘパリナーゼで処理することにより198
1年4月29日付仏国特許公開明細書第2504928
号に記載の方法に従って得られるような六糖の均一組成
。特にこの組成は下式に対応する。 C’ pll−F CTl−1−均一重合
度のオリゴ又は多糖、特に物質CY222、CY216
、ヘパリン又は他のGAGをセファデックスのような材
料上でろ過することにより又はイオン強度勾配クロマト
グラフィにかけることにより得られるオリゴ又は多糖。 −ヘパリンに過沃素酸塩を作用させた後、塩基性溶媒中
で処理することにより得られるようなGAGo−例えば
ヘパリンの脱重合混合物をゲル上でろ過することにより
得られるような重合度に関して均一のGAGo −ヘパリンをヘパリナーゼ又は亜硝酸で脱型合し、AT
III固定配列を有するフラクションを分離し、AT■
に対して親和性を有する多様な重合度のGAGフラグメ
ントを得るべく前記フラクションをゲル濾過することに
より得られるようなGAG0而記GAGの例として、一
方ではdpか12より大きいフラグメント、他方ではよ
り低い重合度、特に12.10,8,6.4及び2個の
糖モチーフに対応するdp値を有するGAGフラグメン
トとが挙げられる。 −上記と同様のGAGでありながら、ATIIIを特異
的に認識ずろことの可能な配列を全< (+iiiえず
且つゼロに等しい小さいYW値を有するGAGo特に、
ヘパリン又はGAGをATITIと接触後、多様なdp
の均一フラグメントを得るへくゲル濾過する段階を含む
工程中にATIIIに固定されないオリゴ糖。 −ヘパリン中に見出だされるような連鎖を有しており、
グルコザミンモチーフの2位の−NIISO,l−基の
一部、或いは大部分、或いは全体が−NH−アンル、特
に−NIl−アセデル又は−Nl12基により置換され
たGAGSm記GAGのフラクション及びフラグメント
。 −動物器官の処理により得られろGAGの組成に対応す
る所謂全GAG0 これらの各GAGは例示として列挙したものに過ぎず、
本願出願人に特に既知の物質であり、また本願出願人名
義の各特許及び特許出願中に記載されている物質に対応
するものと理解されたい。 ところで、上述したように本発明の方法は、任意の型の
GAGを使用できるという利点を有するものである。 従って本発明の更に別の一具体例によると、出発物質と
して使用されるGAGはD−ガラクトザミンーウロン酸
交互モチーフを主体とする。 −好適具体例において、出発GAGはデルマタン硫酸、
コンドロイチン、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸
、これらのフラクション及びフラグメントから選択され
る。 一変形例ではデルマタン硫酸が有利である。 本発明の構成によると、上記GAGのグリコシド鎖の糖
モチーフの1又は数個の第一又は第ニー〇il基は保護
基により保護されるので、所望に応じて別の位置を硫酸
化し、保護基の代わりに所与の基を導入し、更に保護さ
れた一011基を再生することかできる。 前記保護基は、アセチル、置換基を有するアセチル、ベ
ンゾイルのようなアシル基から選択される。 硫酸化処理を受けるGAG塩は、有機溶媒中に可溶性の
塩である。 好ましくはアミン塩が使用される。 アミン塩としては、式−N(R1、R2,R3X式中、
RI。 R2及び/又はR3は水素原子又は1〜10個の炭素原
子を存する脂肪族鎖である)で表されるアミンの塩、特
にトリエチルアミン又はトリブチルアミン或いは第四級
アンモニウム塩(例えばテトラブチルアンモニウム、テ
トラブチルアンモニウム又はベンゼトニウム)を使用す
ると有利である。 当然のことながら塩の性質は例えば立体的寸法により硫
酸化反応に影響するので、所定の位置を優先的に硫酸化
ずろことが可能である。 GAcj塩は有利には、酸性イオン交換樹脂を使用する
ことにより得られた酸形態のGAGを、形成しようとす
る塩に対応するアミンの作用下におくことにより得られ
る。 GAG塩は有機溶媒中に溶解される。より特定的にはジ
メヂルーホルムアミド(DMF)、ノメチルスルポキノ
ド(DMSO)、ヘキサメヂルホスポトリアミド(II
MPT)又はアセトニトリルのような二極性非プロトン
性溶媒が使用される。ピリジンを使用してもよい。 有利には、硫酸化剤は無水硫酸S03とトリメヂ体から
選択される。 同様の硫酸化剤は、E、E、G11bertによりCh
emicalReview、 1962. vol、6
2.549−589中に報告されている。 反応条件を検討した結果、十分な硫酸化率はGAGの0
11当量当たり約1〜5倍等量の複合体を使用すること
により得られることがわかった。 硫酸化反応は、有利にはO’C−100℃程度、特に室
温程度又はそれ以上の温度で約10〜14時間実施され
る。場合によっては約20℃というような室温より低い
温度も使用され得る。 反応条件、特に反応溶媒、温度及び時間は選択反応を実
施するのに好適な方法で選択される。 場合によって存在する保護基は、例えばO−アソル特に
O−アセチル保護基の場合は鹸化により、例えばベンゾ
イル基の場合には接触還元により脱離される。 生成物は、例えばゲル濾過又は限外p過後カヂオン交換
樹脂により所望のカチオン形態にする処理を介して反応
混合物から回収される。その後、水に混和性の溶媒で生
成物を沈降させる。 −変形例によると、重合度に関して均一のGAGを得る
ために、得られた過硫酸化GAGにゲル濾過処理を加え
る。 特に亜硝酸、ヘパリナーゼ又は過沃素酸塩を使用する方
法ではdp対の鎖を得ることができる。 上記構成により、所望の硫酸化率に従って制御される硫
酸化が可能になり、オシド構造を劣化させることら又そ
の均一性を変化させることらなく所定の生成物に高い収
率を得ることができる。 特に注目すべき点として、出発物質の構造を変化させな
い本発明の硫酸化方法は、硫酸化以面又は以後に付加的
な分離段階を実施することにより、可変硫酸化率を有し
ており且っdpに関して均一のGAGを得ることができ
る。 こうして所与の用途に適合する生成物を直接製造するこ
とができる。 重合度に関して均−又は混合形態の硫酸化修飾形の本発
明のGAGは、下式1: %式% (式中、Rはウロン酸又は不飽和ウロン酸又はO1+基
であり、Xは2位の炭素がN1(SO2−基により置換
され、グルコサミン及びヘパリン型の鎖の場合にはNH
2又はNi+−アシル基により置換されたグルコサミン
又はガラクトサミンであり、Yはウロン酸即ちD−グル
クロン酸又はL−イズロン酸であり、nは0〜80の整
数であり、Roは2位の炭素がNHSO3−により置換
され、グルコサミン及びヘパリン型の鎖の場合にはNH
,又はNH−アシル基により置換されたグルコツであり
、X及びYモチーフ及び場合によってはR及びRoの第
一又は第二〇i+基は、GAGの鎖における硫酸基の位
置及び/又は数が対応するGAGの天然又は脱重合鎖に
おける位置及び/又は数と異なるように硫酸化されてい
る)又は薬理的に許容可能なそれらの塩に対応すること
を特徴とする。但し合計8〜30個のグルコサミン−ウ
ロン酸モチーフを存する非修飾末端鎖の混合物はこれに
含まれない。 好適な生成物の族は下式■に対応する。 なお式中、R、ハII又i、tSO3−1R2ハ)l、
5o3−又ハアシル基、特にアセデル基であり、R及
びRoは上記と同義である。 別の好適な族において、X及び場合にょっごはRoはガ
ラクトサミンモチーフであり、ガラクトサミン−ウロン
酸モチーフ間の結合は1→4β、D型であり、場合によ
って存在するウロン酸−ガラクトサミンモチーフ間の結
合は1−3α、L型又は1−3α。 D型である。 これらの族の好適な群は12以下の糖モチーフ数を有す
るGAGを含んでいる。 特に、Rが不飽和ウロン酸であるGAGが使用される。 変形例として、転位モチーフがグルコサミンである場合
にはRoか2.5−アンヒドロマンノ構造の基であり、
転位モチーフがガラクトサミンである場合にはRoが2
.5−アンヒドロヘキシトール構造であるようなGAG
が使用される。好適なGAGにおいて、R“は2.5−
アンヒドロマンニトール構造の基である。 好適なこの群の有利なGAGは、糖モチーフ数が4.6
又は8個の鎖を含む混合形態又は重合度に関して均一の
GAGの集合から構成されている。 これらのGAGにおいて、R及びRoは同時にOHであ
るか又は夫々ウロン酸及びグルコサミンであり、或いは
Roは2.5−アンヒドロマンノ構造の基、好ましくは
2.5−アンヒドロマンニトール構造の基である。 別の有利なGAGは、dpが8、lO又は12の鎖の混
合物から構成されており、R及び/又はRoは修飾され
た糖モチーフである。 別の有利なGAGは、糖モチーフ数が8.10又は12
個の鎖を含む重合度に関して均一のGAGから構成され
ている。 更に別のGAGは、式Iに対応する鎖混合物から構成さ
れ、式中nは3〜15の整数、R及び/又はRoは修飾
された糖モチーフである。 一変形例によると、上記各群におけるグルコサミンの2
位の炭素はNi+2又はNl+−アシル、特にNl+−
アセチル基により置換される。 このようなGAGは、亜硝酸による脱重合によって得ら
れ、分子l 2000〜8000の2.5−アンヒドロ
マンノ、特に2.5−アンヒドロマンニトール末端モチ
ーフを有しており、Yin4essler/USP比が
少なくと63であり、Yin−Wessler値が少な
くとも200u/Tng、であり平均分子量が2000
〜3000の鎖混合物から形成されるムコ多糖から有利
に製造される。 変形例においてこれらのGAGは、亜硝酸による脱重合
により得られ、2,5−アンヒドロマンノ、特に2,5
−アンヒドロマンニトール末端モチーフを有しており、
約3〜6のYin −Yess ler/USP比と4
000〜5000の平均分子量とを有する鎖混合物から
形成されるムコ多糖から構成される出発物質から製造さ
れる。 グルコサミン−ウロン酸又はガラクトサミン−ウロン酸
又はその逆の交互モチーフを含む族の他の好適な群は3
0個より多い糖モチーフ数を含んでいる。 有利なことには、本発明により得られるGAGは所与の
生物学的特性を特異的に変調することが可能である。 硫酸化形態の修飾の関数として生物学的活性を変調する
特性は、複数の実験モデルで確認された。 碌固活性 a/活性化因子X(因子Xa)に対する抑制活性。この
実験ではTe1en et Lie、 1977、 T
hrombos、 Res、。 限、 3:399−410に記載の方法に従って色原体
52222による定量モデル(ストックホルムI: a
b i社)を使用した。 結果を試験物質1当たりの単位で表した。 b/活性化因子■(因子IJa)又はl・ロンビンに対
する抑制活性。モデルは、抗トロンビンIII(ATE
)又はヘパリンの補因子(IICU)の存在下で因子1
1aの活性を50%まで抑制することの可能なグリコサ
ミノグリカン濃度を検討する乙のである。 結果を蛯当たりの試験物質l公債で表した。 c/APTT法(Caen J、、 Larrieu
M、J、 et Samama M、。 in I’Hcmostase、Paris、 Exp
ansion 5cientifiquePranca
ise、 1968. pp 133−135参照)に
よる凝固時間の測定。 ここでは、凝固時間を2倍にするために必要な被試験物
質の濃度を検討した。 結果をi当たりの試験物質■値で表した。 d/Wesslerモデル(Wessler S、、
Reimer S、M、、 etShcps M、C1
、J、 Appl、 Physiol、 14(6)
943−946゜1959参照)によるウサギ生体内の
抗血栓症活性。 凝塊形成剤(ヒトトロンボプラスヂン)の投与の3分前
に、被試験物質をlO〜500μg/kgの投与量で頚
動脈に注射した。 結果を血栓形成抑制百分率として表した。 内皮細胞への固定の検査 害渠是 一細胞培養 Jarre他の方法により形成したヒトp静脈内皮細胞
の1次培養物を、5%のCO2を含む湿潤雰囲気内で、
子牛胎児血清(SVF)20%を加えた培地M199中
で培養した。 5目l」と6日目との間に融合細胞単層が得られる。 −ぼ夜]l
カン即ちGAG、及びその生物学的適用に係る。 以下の記載及び特許請求の範囲の記載中、GAGなる語
はGAG、 GAGのフラクンヨンもしくはフラグメン
ト、又は生理学的に許容可能なこれらの塩の1つを任意
に表すために使用される。 「WL酸化度」なる表現は、ウロン酸−アミノ糖(又は
逆)の二糖単位当たりの硫酸基SO3−の数、或いはS
Q、−/Coo−比を表すものである。 GAGは、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、
フンドロイチン、コンドロイヂン硫酸又はヒアルロン酸
のような生物学的に活性な天然GAGのオリゴ及び多糖
鎖に見出だされる型のウロン酸−アミノ糖(又は逆)の
交互モチーフから本質的に形成されていることが知られ
ている。 ウロン酸モチーフは特にD−グルクロン又はL−イズロ
ン酸構造に対応し、アミノ糖モチーフはD−グルコサミ
ン又はD−ガラクトサミン構造に対応する。 特に凝固障害及び血管壁の不全に関連する疾患、特に血
栓形成、アテローム性静脈硬化症及び動脈硬化症の予防
及び治療用として、或いは組織の老化又は脱毛症のよう
な退行型症状に対抗するために上記天然GAGを治療薬
として使用することの重要性は既知である。 又、天然GAGの抽出、又は化学的もしくは酵素0脱重
合により、天然物質よりも重合度が低く、特に血液凝固
因子Xaに対して高い特異活性を有するGAGを得られ
ることも知られている。重合度(又は省略形dp)とは
、グリコンド鎖のウロン酸又はアミノ糖から成る糖モチ
ーフの数を表す。 少なくと62.5の硫酸化度、即ち天然ヘパリン及び既
知の低分子量のヘパリンよりも高い硫酸化度を存する脱
重合ヘパリンは、^nic S、p、A、名義の198
3年12月16日付ヨーロッパ特許出願EP。 0116801号に記載されており、抗血栓症性、低脂
肪症血性及び繊維素溶解性作用を有する医薬として提案
されている。 この脱重合ヘパリンは前記ヨーロッパ特許出願中では過
硫酸化ヘパリンと呼称されており、天然ヘパリン又はそ
のフラクションの1つを硫酸及び得られる。この過硫酸
化処理は酸の加水分解を生じ、dp=8〜30の鎖混合
物をもたらす。 発明者らはこの分野で研究した結果、所定の条件で所与
の硫酸化処理を実施することにより、構造及び重合度の
いずれをも変化させずに一般に実質的に高い収里でGA
Gの硫酸化度を変化できるこさU・ることにより、特に
ある特性を増加させ別の特性を減少させろことにより作
用の特異性を改良できることが明らかになった。 本発明の目的は、充填率を所望通りに変化させろことの
可能な所定の生成物を得るための硫酸化方法を提供する
ことにある。 本発明の目的は更に、充填率が可変な新規GAG、カ 特に所定の特徴、特にA−重合度を有するGAGを提供
することにある。 硫酸化度の可変な本発明のGAGの製造方法は、所与の
GAGを有機溶媒に可溶性の塩に変換し、これを有機溶
媒中に可溶化さき、溶解した塩を硫酸化剤により処理す
ることを特徴とする。 この構成はあらゆるGAGに適用され、重合度及硫酸エ
ステル基−803−を所望の程度に従って導入でいる。 他の構造的特徴、特に重合度については既知通りである
。 従って、所望の生成物の関数として出発時に所与のGA
Gを選択すれば十分である。 本発明の一具体例によると、出発GAGはD−グルコサ
ミン−ウロン酸夕(即ちL−イズロン酸又はD−グルク
ロン−交互モチーフを主体とする。この上うれる。 一好適具体例では、ヘパリン、ヘパラン硫酸、それらの
フラクション又はフラグメントを使用する。 別の好適具体例では、出発GAGはヘパリン又はヘパラ
ン硫酸よりし少ない糖モチーフ数、特に2〜30の範囲
のモチーフ数を存する鎖混合物又は重合度に関する限り
において均一の鎖混合物から形成されろ低分子量のGA
Gである。 こCらの低分子量(省略形PM)のGAGは特に以下の
物質を包含する。 −1978年11月6日付仏国特許公開明細書第244
0376号及び1979年7月20日付第−追加特許公
開明細書第2461719号の記載に従ってアルコール
抽出によりヘパリンから得られるようなムコ多糖。主特
許に記載の態様の1つによるとこれらの物質は、Yin
−Yess ler/USP比か少なくとも2であり分
子量が約2000〜8000の鎖混合物から形成される
。上記文献中に記載の物質中、YW/USP比が約3〜
5及び平均分子量が3000〜5500の物質を挙げる
ことができ、以下の文中ではこれをCY216と呼称す
る。 −特に上記仏国特許公開明細書第2440376号の1
980年3月20日付第二追加特許公開明細書第247
8646号及び1981年4月10日付仏国特許公開明
細書第2503714号の記載に従ってヘパリンを亜硝
酸で脱重合することにより得られるようなムコ多糖。 これらの物質は一般に上記ムコ多糖と同様の特徴を有し
ており、且つ2.5−アンヒドロマンノ構造の基を末端
に有している。 この例としては、以下CY222と呼称するような2.
5−アンヒドロ−マンニトール末端を有する型のムコ多
糖、或いは2.5−アンヒドロマンノン酸末端を有する
型のムコ多糖が挙げられる。大多数の欠゛リコソド鎖の
分子量はより特定的には2000〜3000程度、特に
約2000〜2600である。Yin−%’essle
r/[ISP比は特に少なくともl01Y i n −
Yess ler値は少なくとも約200u/死である
。 −(1)平均分子量が3000〜6000ドルトン、特
に約4000〜5000ドルトンであり、(2)VW/
USP比が10未満、特に6〜3であり、(3)2.5
−アンヒドロマンノ構造のモチーフを末端に有する鎖か
ら本質的に形成されており、例えば1984年10月1
8日付仏国特許公開明細書第2572080号に記載の
方法に従って得られるようなムコ多糖、 −2000u/”gに達し得ろ高いYin4essle
r値と実質的にゼロに等しい小さいUSP値とを有して
おり、ATIUに対して強い親和性を有する最大8個の
糖モチーフから形成されており、特に1980年lO月
6日付ヨーロッパ特許出願第0027089号に記載さ
れているようなオリゴ糖。 一変形例によると、前記オリゴ糖は亜硝酸による脱重合
により得られ、2.5−アンヒドロ−マンノ構造の基を
末端に有している。 別の変形例によると鎖の発端モチーフは、ヘパリンをヘ
パリナーセで脱重合することにより形成されるような不
飽和ウロン酸モチーフに対応する。 特に、これらのオリゴ糖は下式・ に対応する構造ABCDEFG11のへ糖から形成され
る。 −前記へ糖をヘパリナーゼで処理することにより198
1年4月29日付仏国特許公開明細書第2504928
号に記載の方法に従って得られるような六糖の均一組成
。特にこの組成は下式に対応する。 C’ pll−F CTl−1−均一重合
度のオリゴ又は多糖、特に物質CY222、CY216
、ヘパリン又は他のGAGをセファデックスのような材
料上でろ過することにより又はイオン強度勾配クロマト
グラフィにかけることにより得られるオリゴ又は多糖。 −ヘパリンに過沃素酸塩を作用させた後、塩基性溶媒中
で処理することにより得られるようなGAGo−例えば
ヘパリンの脱重合混合物をゲル上でろ過することにより
得られるような重合度に関して均一のGAGo −ヘパリンをヘパリナーゼ又は亜硝酸で脱型合し、AT
III固定配列を有するフラクションを分離し、AT■
に対して親和性を有する多様な重合度のGAGフラグメ
ントを得るべく前記フラクションをゲル濾過することに
より得られるようなGAG0而記GAGの例として、一
方ではdpか12より大きいフラグメント、他方ではよ
り低い重合度、特に12.10,8,6.4及び2個の
糖モチーフに対応するdp値を有するGAGフラグメン
トとが挙げられる。 −上記と同様のGAGでありながら、ATIIIを特異
的に認識ずろことの可能な配列を全< (+iiiえず
且つゼロに等しい小さいYW値を有するGAGo特に、
ヘパリン又はGAGをATITIと接触後、多様なdp
の均一フラグメントを得るへくゲル濾過する段階を含む
工程中にATIIIに固定されないオリゴ糖。 −ヘパリン中に見出だされるような連鎖を有しており、
グルコザミンモチーフの2位の−NIISO,l−基の
一部、或いは大部分、或いは全体が−NH−アンル、特
に−NIl−アセデル又は−Nl12基により置換され
たGAGSm記GAGのフラクション及びフラグメント
。 −動物器官の処理により得られろGAGの組成に対応す
る所謂全GAG0 これらの各GAGは例示として列挙したものに過ぎず、
本願出願人に特に既知の物質であり、また本願出願人名
義の各特許及び特許出願中に記載されている物質に対応
するものと理解されたい。 ところで、上述したように本発明の方法は、任意の型の
GAGを使用できるという利点を有するものである。 従って本発明の更に別の一具体例によると、出発物質と
して使用されるGAGはD−ガラクトザミンーウロン酸
交互モチーフを主体とする。 −好適具体例において、出発GAGはデルマタン硫酸、
コンドロイチン、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸
、これらのフラクション及びフラグメントから選択され
る。 一変形例ではデルマタン硫酸が有利である。 本発明の構成によると、上記GAGのグリコシド鎖の糖
モチーフの1又は数個の第一又は第ニー〇il基は保護
基により保護されるので、所望に応じて別の位置を硫酸
化し、保護基の代わりに所与の基を導入し、更に保護さ
れた一011基を再生することかできる。 前記保護基は、アセチル、置換基を有するアセチル、ベ
ンゾイルのようなアシル基から選択される。 硫酸化処理を受けるGAG塩は、有機溶媒中に可溶性の
塩である。 好ましくはアミン塩が使用される。 アミン塩としては、式−N(R1、R2,R3X式中、
RI。 R2及び/又はR3は水素原子又は1〜10個の炭素原
子を存する脂肪族鎖である)で表されるアミンの塩、特
にトリエチルアミン又はトリブチルアミン或いは第四級
アンモニウム塩(例えばテトラブチルアンモニウム、テ
トラブチルアンモニウム又はベンゼトニウム)を使用す
ると有利である。 当然のことながら塩の性質は例えば立体的寸法により硫
酸化反応に影響するので、所定の位置を優先的に硫酸化
ずろことが可能である。 GAcj塩は有利には、酸性イオン交換樹脂を使用する
ことにより得られた酸形態のGAGを、形成しようとす
る塩に対応するアミンの作用下におくことにより得られ
る。 GAG塩は有機溶媒中に溶解される。より特定的にはジ
メヂルーホルムアミド(DMF)、ノメチルスルポキノ
ド(DMSO)、ヘキサメヂルホスポトリアミド(II
MPT)又はアセトニトリルのような二極性非プロトン
性溶媒が使用される。ピリジンを使用してもよい。 有利には、硫酸化剤は無水硫酸S03とトリメヂ体から
選択される。 同様の硫酸化剤は、E、E、G11bertによりCh
emicalReview、 1962. vol、6
2.549−589中に報告されている。 反応条件を検討した結果、十分な硫酸化率はGAGの0
11当量当たり約1〜5倍等量の複合体を使用すること
により得られることがわかった。 硫酸化反応は、有利にはO’C−100℃程度、特に室
温程度又はそれ以上の温度で約10〜14時間実施され
る。場合によっては約20℃というような室温より低い
温度も使用され得る。 反応条件、特に反応溶媒、温度及び時間は選択反応を実
施するのに好適な方法で選択される。 場合によって存在する保護基は、例えばO−アソル特に
O−アセチル保護基の場合は鹸化により、例えばベンゾ
イル基の場合には接触還元により脱離される。 生成物は、例えばゲル濾過又は限外p過後カヂオン交換
樹脂により所望のカチオン形態にする処理を介して反応
混合物から回収される。その後、水に混和性の溶媒で生
成物を沈降させる。 −変形例によると、重合度に関して均一のGAGを得る
ために、得られた過硫酸化GAGにゲル濾過処理を加え
る。 特に亜硝酸、ヘパリナーゼ又は過沃素酸塩を使用する方
法ではdp対の鎖を得ることができる。 上記構成により、所望の硫酸化率に従って制御される硫
酸化が可能になり、オシド構造を劣化させることら又そ
の均一性を変化させることらなく所定の生成物に高い収
率を得ることができる。 特に注目すべき点として、出発物質の構造を変化させな
い本発明の硫酸化方法は、硫酸化以面又は以後に付加的
な分離段階を実施することにより、可変硫酸化率を有し
ており且っdpに関して均一のGAGを得ることができ
る。 こうして所与の用途に適合する生成物を直接製造するこ
とができる。 重合度に関して均−又は混合形態の硫酸化修飾形の本発
明のGAGは、下式1: %式% (式中、Rはウロン酸又は不飽和ウロン酸又はO1+基
であり、Xは2位の炭素がN1(SO2−基により置換
され、グルコサミン及びヘパリン型の鎖の場合にはNH
2又はNi+−アシル基により置換されたグルコサミン
又はガラクトサミンであり、Yはウロン酸即ちD−グル
クロン酸又はL−イズロン酸であり、nは0〜80の整
数であり、Roは2位の炭素がNHSO3−により置換
され、グルコサミン及びヘパリン型の鎖の場合にはNH
,又はNH−アシル基により置換されたグルコツであり
、X及びYモチーフ及び場合によってはR及びRoの第
一又は第二〇i+基は、GAGの鎖における硫酸基の位
置及び/又は数が対応するGAGの天然又は脱重合鎖に
おける位置及び/又は数と異なるように硫酸化されてい
る)又は薬理的に許容可能なそれらの塩に対応すること
を特徴とする。但し合計8〜30個のグルコサミン−ウ
ロン酸モチーフを存する非修飾末端鎖の混合物はこれに
含まれない。 好適な生成物の族は下式■に対応する。 なお式中、R、ハII又i、tSO3−1R2ハ)l、
5o3−又ハアシル基、特にアセデル基であり、R及
びRoは上記と同義である。 別の好適な族において、X及び場合にょっごはRoはガ
ラクトサミンモチーフであり、ガラクトサミン−ウロン
酸モチーフ間の結合は1→4β、D型であり、場合によ
って存在するウロン酸−ガラクトサミンモチーフ間の結
合は1−3α、L型又は1−3α。 D型である。 これらの族の好適な群は12以下の糖モチーフ数を有す
るGAGを含んでいる。 特に、Rが不飽和ウロン酸であるGAGが使用される。 変形例として、転位モチーフがグルコサミンである場合
にはRoか2.5−アンヒドロマンノ構造の基であり、
転位モチーフがガラクトサミンである場合にはRoが2
.5−アンヒドロヘキシトール構造であるようなGAG
が使用される。好適なGAGにおいて、R“は2.5−
アンヒドロマンニトール構造の基である。 好適なこの群の有利なGAGは、糖モチーフ数が4.6
又は8個の鎖を含む混合形態又は重合度に関して均一の
GAGの集合から構成されている。 これらのGAGにおいて、R及びRoは同時にOHであ
るか又は夫々ウロン酸及びグルコサミンであり、或いは
Roは2.5−アンヒドロマンノ構造の基、好ましくは
2.5−アンヒドロマンニトール構造の基である。 別の有利なGAGは、dpが8、lO又は12の鎖の混
合物から構成されており、R及び/又はRoは修飾され
た糖モチーフである。 別の有利なGAGは、糖モチーフ数が8.10又は12
個の鎖を含む重合度に関して均一のGAGから構成され
ている。 更に別のGAGは、式Iに対応する鎖混合物から構成さ
れ、式中nは3〜15の整数、R及び/又はRoは修飾
された糖モチーフである。 一変形例によると、上記各群におけるグルコサミンの2
位の炭素はNi+2又はNl+−アシル、特にNl+−
アセチル基により置換される。 このようなGAGは、亜硝酸による脱重合によって得ら
れ、分子l 2000〜8000の2.5−アンヒドロ
マンノ、特に2.5−アンヒドロマンニトール末端モチ
ーフを有しており、Yin4essler/USP比が
少なくと63であり、Yin−Wessler値が少な
くとも200u/Tng、であり平均分子量が2000
〜3000の鎖混合物から形成されるムコ多糖から有利
に製造される。 変形例においてこれらのGAGは、亜硝酸による脱重合
により得られ、2,5−アンヒドロマンノ、特に2,5
−アンヒドロマンニトール末端モチーフを有しており、
約3〜6のYin −Yess ler/USP比と4
000〜5000の平均分子量とを有する鎖混合物から
形成されるムコ多糖から構成される出発物質から製造さ
れる。 グルコサミン−ウロン酸又はガラクトサミン−ウロン酸
又はその逆の交互モチーフを含む族の他の好適な群は3
0個より多い糖モチーフ数を含んでいる。 有利なことには、本発明により得られるGAGは所与の
生物学的特性を特異的に変調することが可能である。 硫酸化形態の修飾の関数として生物学的活性を変調する
特性は、複数の実験モデルで確認された。 碌固活性 a/活性化因子X(因子Xa)に対する抑制活性。この
実験ではTe1en et Lie、 1977、 T
hrombos、 Res、。 限、 3:399−410に記載の方法に従って色原体
52222による定量モデル(ストックホルムI: a
b i社)を使用した。 結果を試験物質1当たりの単位で表した。 b/活性化因子■(因子IJa)又はl・ロンビンに対
する抑制活性。モデルは、抗トロンビンIII(ATE
)又はヘパリンの補因子(IICU)の存在下で因子1
1aの活性を50%まで抑制することの可能なグリコサ
ミノグリカン濃度を検討する乙のである。 結果を蛯当たりの試験物質l公債で表した。 c/APTT法(Caen J、、 Larrieu
M、J、 et Samama M、。 in I’Hcmostase、Paris、 Exp
ansion 5cientifiquePranca
ise、 1968. pp 133−135参照)に
よる凝固時間の測定。 ここでは、凝固時間を2倍にするために必要な被試験物
質の濃度を検討した。 結果をi当たりの試験物質■値で表した。 d/Wesslerモデル(Wessler S、、
Reimer S、M、、 etShcps M、C1
、J、 Appl、 Physiol、 14(6)
943−946゜1959参照)によるウサギ生体内の
抗血栓症活性。 凝塊形成剤(ヒトトロンボプラスヂン)の投与の3分前
に、被試験物質をlO〜500μg/kgの投与量で頚
動脈に注射した。 結果を血栓形成抑制百分率として表した。 内皮細胞への固定の検査 害渠是 一細胞培養 Jarre他の方法により形成したヒトp静脈内皮細胞
の1次培養物を、5%のCO2を含む湿潤雰囲気内で、
子牛胎児血清(SVF)20%を加えた培地M199中
で培養した。 5目l」と6日目との間に融合細胞単層が得られる。 −ぼ夜]l
【へ9見劃茎訓L((天」(各テストの24
時間前にSVF含有培地を採取し、U l trose
rを20%含む培地で前述の培養物を洗浄する。標識し
たヘパリンとのインキュベーションな培地2ml中で行
なう。インキュベーション後前記細胞を1.5+nlの
リン酸緩衝液(+’Bs、pH7,4>で3回洗浄し、
次いでプロナーゼ0.5ml (1mg/it )及び
トリ1−ン(Triton) x 100 0.1%(
v/v)の中37°Cで3インキユベーI〜することに
より切離して可溶化する。 ガンマ計数器Beckmann 7000 (”’ I
)を用いて細胞及びインキュベーション培地の放射能
を測定する。 前記細胞を種々の濃度の低温テスト物質(標準ヘパリン
、過硫酸化ヘパリン、等)の存在下でヘパリン(12’
I)J度を低くして5時間インキュベーションた。 ヘパリンの固定阻止能力をl50(標識したヘパリンの
固定を50%で阻止する濃度)で評価した。 この値はテスト物質の内皮細胞に対するアフィニティを
示す。 一補一俸】jL固卦− ヘパリンはタンパク質C1b及び8間の二分子複合体の
形成を阻止して補体の第2増幅C3転換酵素(conv
ertase amplificatrice alt
erne)の発生を阻止する。 結合C,b−Bに対するヘパリン及びその誘導体の作用
を、+251 (’2sl−[1)テ標識したタンパク
質Bとタンパク質C,b (E C,b)担持羊赤血球
とを用いて調べた。 複合体C,b−Bの形成を50%阻害するのに必要なヘ
パリン又はテスl−したオリゴ糖の濃度をIC50と称
する。 このヨ11定は精製タンパク質系内でin vitro
で行なう。 一火」シ[ 0,1%のゼラチンと5mMのMg24とを含むヴエロ
ナール桜街液中で、12Sl−3の濃度を変えながらE
C,b(0,75−2,5x 10’)を30’Cで
30分間インキュへ−1・する。 70成の試料を各反応毎に2部づつ使用し、これら試1
′:1を0.5mlポリプロピレン管内のジフヂルフタ
レーh (Merck−C1evenot 、フランス
)とジノニルフタレ−1−(Coger−パリ)との混
合物(7:3V/V)300成の上に配置する。 前記管をBeckmanのマイクロフユージュ(m1c
−rofBe、 f3eckman、バリ)により80
00g″r1分181遠心分離にかけ、次いで沈殿物の
直ぐ上で切断する。 結合したりガントの放射能を計測する。 エラスターゼ び力1プシンGにえ る活性犬1b紅 白血球エラスターゼを胸膜滲出液から得たラッj・多形
核球を用いて製造する。基貧としてはN−スクシニルト
リアラニンパラニトロアニリドを使用する。前記酵素を
テスト物資と共に室温(20℃)で1時間インキュベー
1−した後で酵素活性を測定する。次いで前記基質3加
え、37°Cで20時間インキュベートし、410nm
”’C″読み収りを行なう。 ヒト多形核白血球から得たヒトカテブシンGの場合は、
定景(dosaHe)をアゾカゼイン基質に関して行な
う。この場合も酵素をテストずべき物質と共に室温で1
時間インキュベートし、次いでアゾカゼインを加え、こ
の混合物337℃で5時間インキュベー1・する。トリ
クロロ酢酸を526(最終濃度)で沈殿させ、遠心分離
にかけ且つ366nmて゛読み収りを行なう。 5つの実験アセンブリを形成した。 実J々」−:ざがリンIび過lif醜ゴヒヱlレマタ乙
鴇Jし矢症迩」uL19JυL @皿l μ/wag IC50 11@/l111 標準ヘパリン 192 0.10 0.29
N−アセチル化 デルマタン硫酸 100 5.8過硫
酸化 抗トロンビン活性(抗11a)はPi酸化率と共に増加
することが確認される。 過QM化N−アセチル化ヘパリンの場合はIICII存
在下での活性が出発ヘパリンより強化される(IC50
が0,29から0.077に変化)のに対し、AT I
II存在下での活性は減少する(IC50が0.10か
ら0.38に変化)。 ■/m1 IC8415454,5 デルマタン硫酸 50 過硫酸化 デルマタン硫酸 15 IC851610 このモデルでは、過硫酸化がデルマタン硫酸の活性を増
加させるのに対し、過硫酸化ヘパリンは正常ヘパリンよ
り低い活性を示すことが確認される。 血漿媒質中での補足的操作の結果、正常ヘパリンの活性
はAT IIIに依存し、過硫酸化ヘパリンの活性はい
ずれの補助因子にも依存しないことが判明した。 これらの操作からは、正常デルマタン硫酸の活性が完全
にIICIIに依#するのに対し、過硫酸1ヒデルマタ
ン硫酸の活性はある程度しか依存しないことも判明した
。 ヒ1〜の1〜ロンボブラスチンを凝塊形成剤として使用
するWesslerのモデルで得られた結果によれば、
用量100■7kgでの血栓形成の予防は過硫酸化デル
マタン硫酸の場合が80%であるのに対し、デルマタン
硫酸の場合には40%に過ぎない。 このモデルではテストずへき物質のAT III及びH
CIIの存在下でのIC50を測定することにより因子
11aの阻害状態を調べる。 テスl−した物質は下記の通りである。 基準ヘパリン及び4(dp 4) 、6(dp 6)
、8(dp8)、12(dp 12)、16(dp 1
6)に等しい重合度の断片、並びにこれらの適確ei(
ヒ同族体。 ナス1〜物質 抗11a活性八T If
f IICII IC50 μg/ffl! 標準ヘパリン 0.039 0.14IC
841477dp 4 100 ”過硫
酸化 IC851597dp 4 100 ’
IC841476dp 6 100 。 過硫酸化 Ic 851598 dp 6 100
42IC841475dp 8 100
’過硫酸化 IC851599dp 6 100 11
fc 851473 dp 12 100
56過硫酸化 IC851600dp 12 100 3.
6IC851601,dp 16 ’
0.68°−50%未達成。過硫酸化前の分子量の
小さい均一断片は、ヘパリンとは逆に、このモデルでは
^TIIIの存在下で抗IIa活性を示さない。これは
IC50が100を越えていることから明らかである。 これら断片は過硫酸化しても、^T IIIの存在下で
は活性が変化することはない、ただし断片dp16は過
硫酸化されると活性を少し得る。 これに対しIICIIを介する抗11a活性は、特に分
子蓋が大きい場合には、過硫酸化によって増加する。 しかしながらHCIIを介する抗11a活性はヘパリン
の同活性に比べるとやはり小さい(yfr片dp16は
例外)。 lLi:標:したヘパリン 125■ に・する ノ
の−・ によって゛ たヒLlflN ・°
へΔlLへ11 一般的には、過硫酸化はヒト謄静脈内皮細胞への固定を
促進する。 ただし、短い鎖は内皮細胞に対するアフィニティが極め
て小さい。 lLi:補准」レソケ止」− このモデルでは精製タンパク質系内でin vitr。 の補体の第2C3転換酵素の形成を阻止する能力を測定
した。 テスト物質 IC50ug/ml 標準ヘパリン 0.5過硫酸化
ヘパリン IC8415450,530 過硫酸化N−アセチル化脱硫酸化 ヘパリンIC8617460,35 IC841552dp 16 0.
75過硫酸化IC851601dp 16
0.30IC841552dp i2
1.1過硫酸化IC851601dp 12
0.40IC841475dp 8
3過ち(酸 fヒ IC85
1599dp 8
1.IIC841476dp 6
7過硫酸化IC851598dp
6 1.75IC841477dp
4 30過硫酸化I
C851597dp 4 7これらの結果
から明らかなように、過硫酸化はヘパリンの活性を変化
させることはない。 これに対し、ドアセチル化N−説硫酸化ヘバリンの阻害
活性及びdp4から16の断片の阻害活性は過硫酸化に
よって増加する。 ターゼ びメーブシンGに対 る且パ性エラスターゼ
力テブシン 標準ヘパリン 100% −過硫酸
化ヘパリン IC841545100% −IC8415
55dp 22 91%
53%IC841554dp 20 92%
54%IC841552dp 1
6 82% 49%過硫酸化 IC851601dp 1B 100%
60?ごIC841473dp 12 92%
46%過硫酸化 IC851600dp 12 97%
51%IC841475dp 8 53%
34%過硫酸化 IC851599dp 8 95%
53?6IC841476dp 6 38%
8%過硫酸化 Ic 851598 dp 6 91%
43%IC841477dp 4 28%
7%過硫酸化 IC851597dp 4 93%特定の分子量
では阻害能力は過硫酸化によって著しく増加することが
確認される。 この現象は特に最も小さい分子量(dp4、dp6)に
関して見られる。 結論として、これらの実験モデル(凝血に対する作用又
は凝血系以外での作用)では過硫酸化の影響は一様では
ないと言える。 特に、分子量の極めて小さい断片(4−8個の基本単位
)では、補体系とエラスターゼとに対する阻害活性が過
硫酸化によって大幅に増加するのに対し、凝血に対する
作用はほとんどまたは全く変(ヒせず、極めて小さいま
まである。 本発明の生成物のin vivo効果3下記の2つの実
験モデルを用いてテストした。 一次のプロ1〜コールに従う操作によりデキストランに
対して感作したラットを使用するモデル:Freund
の不完全アジュバント中に懸濁したデキストラン1O−
50Bを注射することにより、ラッl−3デキストラン
に対して感作する。 この感作は複数のデキス1−ラン皮下注射からなる操作
を3回行うことによって実施する。投与量は各操作毎に
動物の体の種々の点に行う10回の注射の間で分配する
。これらの注射操作は3週間間隔で行なう。 感作した動物をデキストランのみ又はデキストラン+テ
スト物質を受容する2つのグループに分ける。1グルー
プの動物には何も与えず、陰性対照として使用する。 テスト物質はデキストラン注射の11′4時間前に静脈
注射するか、又はデキストラン注射の1−2時間前に皮
下注射する。投与量は動物の体重1kg当たり1から1
0mgである。 注射後5分、30分及び4時間の時点て採取した処理動
物の血漿試料(0,5m1)を用いて結果を評価した。 この結果の評価基準は次の通りである:a)ウサギの抗
ヒツジ赤血球抗体で被覆したヒツジ赤血球の細胞溶解の
測定(テスl” Cll 50) 。 複数の連続的希釈度をテスl−L、結果3各希釈度での
赤血球の細胞溶解の血漿のパーセンテージで表す。細胞
溶解は透射ヘモグロビンの星によって評価され、この測
定は光学的濃度によって行なわれる。 (Kabat
E、^、及びMeyer、Experimental
Immunochemistry、第2版、Charl
es C,’I’homasJ4、米国スフ゛リングフ
ィールド、イリノイ州(1967年)149ベージ;
Ka7atcbkine N、 D、、 Ilnupt
mann G、。 及びNydeggerυ3、’I’echnique
du Complement、l N S I’、開成
、パリ(1985年)、22−30ページ。)b)赤血
球凝集反応テス)・ このテストではデキス1〜ランで被覆したヒツジ赤血球
を使用し、微量滴定プレート内でその動物の血漿中に存
在する抗デキストラン抗体によるこれら赤血球の沈殿を
測定する。結果は前記沈殿を生起せしめる最大血漿希釈
度によって表す。 −下記のプロトコールに従う操作により、Freund
の完全アジュバントをラットに投与して生起せしめた関
節炎を使用する実験モデル:雄Leiuisラット(1
6l60−2O0にFreundの完全アジュハンh
(FCA 0.1+alの牛酪酸(mycobacte
riumButyricun+ )及びパラフィン油懸
濁液8B/ml )を注射する。この注射は左後脚の足
底弓に行う。 3グループの動物を使用して、1グループにはFCAの
み与え、別のグループにはFCΔ+テスト物質を与え、
残りのグループは何も操作せずに対照として使用する。 デス1〜物質は、FC八へ射後の最初の19日間にわた
り1−10mg/kg日の割合で静脈注射又は皮下注射
により投与する。 結果は注射しなかった右後脚の大きさく2次傷害)と、
関節炎指数の測定とによって評価する。 (Perper R,J、 、Δ1varez B、、
ColombOC,。 Fcl+roder 11.(1971年) 、Pro
c、Soc、Exp、Biol、Med、。 137.506−512ページ; l1artletL
R,R1、5chleyer−bacb R,(19
85年)、Int、 J、 Immunopbarma
c、、第7巻、Nol、7−18ページ。) 実施例5の過硫酸化オクトサツカリドの第1検査の結果
、これら2つのモデルに関しては好ましい効果が得られ
た。 本発明の種々の添加率のGAGはまた、有利なことに毒
性を示さない。 f水型20gの雌スイスCFマウスをロット当たり5匹
ずつに別けて皮下注射することによりDL 50を調べ
た。注射量は0 、5 In l、最終薬用量62.5
mg/kg、125+ng/kg、250II1g/k
g、100OB/kgとした。 DL 50は所定条件では、2つのテスト物質即ち実施
例2のIC861716及び実施例5の過硫酸化デカサ
ツカリドIC8[j1746の場合に100mg/kg
を越える。 注射の間に又はその後の7日間の観察期間に死亡した動
物は皆無である。 従ってこれらの物質は薬の製造にとって特に貴重である
。 抗凝血活性及び抗I・ロンビン活性を保持していた12
を越えるdpを有する物質は、血栓形成の予防及び治療
に有用である。dpの小さい物質、特にdp8以下の物
質は主として血管壁障害、組織の老化及び退行性の症状
、特に例えば糸状体腎炎、リューマチ様関節炎及びアレ
ルギー症状として現れるある種の遅発感覚過敏性症状の
ごとき特定形態の免疫不均衡に起因する障害の治療に有
用である。 これらの物質はまた、ショック状態、特に重い火傷にも
使用し得る。 本発明の医薬製剤は前述のGAGを製薬賦形剤と共に有
効量含むことを特徴とする。有利には、これらの医薬製
剤は非経口投与の場合にはピロゲン基質を含まない。 好ましい組成物は経口投与に適した製薬ビヒクルを含む
。この場合の本発明の投与形態は有利には背低抗性カプ
セル、錠剤、丸薬であり、又はリポソーム7の形態でも
存在する。 別の医薬組成物はこれらのGAGを直腸投与に適した賦
形剤と共に含む。この場合の投与形態は座薬である。 別の医薬組成物では前記G八Gがエアゾール又はポマー
ドの形態で存在する。 本発明は静脈注射、筋向注射、又は皮下注射に適した注
射可能な滅菌又は滅菌可能医薬組成物にも係る。 これらの溶液は有利には1がら200mg/n+ Iの
GAGを含み、これら溶液を皮下注射する時には好まし
くは20から150+g/m lのGAGを含む0例え
ばこれら溶液は30から100mg/ml、特に静脈注
射又は潅流による投与の場合には40がら50B/+n
lのGAGを含み得る。 この種の医薬製剤は有利には即使用可能な使捨て注射器
の形態で存在する。 本発明の医薬組成物は特にヒト又は動物の血液凝集の特
定段階を、特に患者が主として外科手術、アテロームプ
ロセス、腫瘍形成及びバクテリア又は酵素活性体による
凝血傷害に起因する過剰凝血性を示す危険がある場合に
コントロール(予防又は治療)するのに適している。 ある種の組成物は補体の作用を特に炎症性の症候群、例
えばリューマチ様関節炎に係わる炎症性症候群を変化さ
せ得る。実際、観察される障害のうちあるものは、少な
くとも部分的には、補体がある役割を果たす関節レベル
に大量の抗原−抗体複合体が存在するために生起するこ
とが知られている。 別の組成物は一般的に組織の老化又は脱毛のごとき退行
性症状に対して有効である。 本発明をより明らかにすべく、次にヒトに使用し得る薬
用量の一例を示す:約1mgから1 g/24時間、好
ましくは約5から500mg/24時間、例えば約20
0+l1g724時間を静脈注射により断続的に、即ち
一定間隔をおいて投与するが、又は約200がら110
00II1/24時間を経口投与する。これらの用量は
勿論予め行なう血液検査の結果、病気の種類及び一般的
には健康状態に応じて各患者毎に調整し得る。 本発明はまた、ラボラトリ−で特にプロテアーゼ阻止活
性テストにかけられる他の物質の検査の°比較対照とし
て使用し得る生物学的試薬の形成における本発明のGA
Gの使用にも係る。 本発明の他の特徴及び利点は本発明の生成物の合成に関
する以下の実施例の説明によって明らかにされよう。 支膨■上二恋又通尺N土ブpフィルを・つヘパリ″L!
!2JLL(I C841545)先ずヘパリン酸I・
リュチルアンモニウム(TE^〉を製造し、次いでこの
生成物を過硫酸化処理にかける。 水50m1中に溶解したヘパリン酸すI・リウム1gを
イオン交換樹脂(Dowex 50. II” )によ
りヘパリン酸に変換する。トリエチルアミンで中和し且
つ濃縮乾固すると1.38のTEA塩が得られる。 b ) ”1AInJL監 前述の塩0.978をジメチルホルムアミド(DMF)
20ml中に溶解し、これに硫酸化用複合体TM^/5
03(6,8g)を加える。50℃で24時間放置した
後、前記反応混合物を希釈し、次いで5ephadex
G−25ゲルカラムに通して当該生成物を回収する。 樹脂Dowex 50 H”での交換によって得た酸を
中和するとすl・リウム塩が得られる。凍結乾燥後77
4Bの生成物か回収される。 C)VLiL 得られたヘパリンは3.01の硫酸化度(硫酸塩/カル
ボン酸塩; SO,−/C00−)を示す。これに対し
出発生成物の硫酸化度は2.16である。 反応時間を1時間に限定すると、SO3−/COO−・
2.70になる。 硫酸化用複合体0.68gの存在下で1時間処理すると
so、−7coo−=z、4oになる。 ヘパリン及び過硫酸化ヘパリンのNMRスペクトルを第
1図及び第2図に示した。これらのグラフからは特にC
Il□03O1への変換に起因して62.4pp…でシ
グナルCH2011が消失している。アノマー炭素領域
でも大きな変化が見られる(約10100pp。 実施例1と同様に操作するが、この場合は複合体TM^
/SO1に代えてピリジン中のクロロスルホン酸をtf
t、に止剤として使用する。硫酸化にはピリジン50n
lに溶解したTE八基塩097gを使用し、次いでク
ロロスルポン酸(1g)を加える。 0℃で24時間放置した後、前記反応混合物を実施例1
1と同様に輻釈し処理する。 ヒ 前述Z同様の特徴を持つヘパリンが得られる。 1iL11:1歿! N−アセチル ヘパリンの1克(
IC861746) ヘパリンを従来の方法でト脱硫酸化しく InoueS
、及びNagasawa K、、Carbohyd R
cs、、46 (1978年)87−95)、次いで水
性塩基媒質中で無水酢酸によりアセチル化する0次いで
TEA塩を実施例1aと同様に製造する。 b)(1此 N−アセチル化ヘパリン1gから得たTEA塩をDMF
(25ml)中に溶解し、’rMA/5Oz(0,84
g)ノ存在下チー晩100℃に加熱する。硫酸化した生
成物を5cphaclex G 25でのゲル濾過にか
けた後回収する。 これを一時的に酸の形態に変え後ナトリウム塩に変換す
る。凍結乾燥すると薄いベージュのナトリウム塩IC8
61716が1.14g得られる。N−アセチル化ヘパ
リン及び対応過硫酸化生成物のNMI(スペクトルを第
4図及び第5図に示した。 ルアンモニウム上 TABの ゛1 塩基として水酸化テトラブチルアンモニウムを使用し且
つ分子量の小さいヘパリンを用いて実施例2a)と同様
に操作する。 b)慶並進− 得られた塩(Ig)を複合体ピリジン/S03(1g)
によりピリジン(10慎1 )中室温で24時間硫酸1
ヒする。ゲル濾過にかけ、次いでナトリウム塩に変換す
るとN−アセチル1ヒ低分子址ヘパリンのすl−リウム
塩が0.5g得られる。 c ) VL 例えば前述の主特許第2440376号の実施例1の方
法により得られるような生成物CY 210 (平均d
p約14)に使用される前述の方法は、SO3−/CO
O−比2.85の過硫酸化生成物(IC841548)
を製造せしめる。出発生成物の前記比は2.12である
。 モニウム塩のパ告 低分子量ヘパリンCY 21Bを水に溶解しく0.51
中に10g)次いで11+形悪の樹脂Dowex 50
WX4カラムに通すことにより酸に変換する。中和後、
得られたテトラブチルアンモニウムヘパリンを凍結乾燥
する。テトラブチルアンモニウム塩が19.34g得ら
れる。 b)!iLl!u− 前述の塩1gを無水ピリジン50m I中に溶解し、硫
酸化複合体(ピリジン/SOz>を加える。複合体の量
を変えながら3回テストを行なう。室温で24時間反応
させた後この反応混合物を95%エタノール中ソーダ(
2g)溶液に加える。形成された沈殿物を濾過し、水に
溶解し、5ephadex G 25でクロマI・グラ
フィにかけ、凍結乾燥するとナトリウム塩が得られる。 c)11 硫酸化複合体の質量を変えることによって形成生成物の
硫酸化度を変化させる0例えば硫酸化複合体の質量を夫
々0.16g、0.32g、0.48gにすると、2.
21.2.75及び3.41の硫酸化度が得られる。 過硫酸化CY 216のNMRスベク1−ルを第3図に
示した。 無水マンニトールCIのシグナル(63,6ppm)が
消失しく Cl2O+1 →C1120SO,−)、他
(7) 7 ンニl−−ルシグナル(領域78.86p
p+n)も変1ヒした。約ppmのアノマーグループの
シグナルも同様である。 オリゴ糖は所定条件下でヘパリナーゼ又は亜硝酸による
ヘパリンの脱重合の結果得られる混合物をゲルー過する
ことにより分留して得る。亜硝酸による脱型合法は例え
は1980年3月20日の第2追加特許明細書第247
8646号及び1981年4月10日の仏国特許出願第
2503714号に記載されており、ヘパリナーゼを用
いる脱重合操作は欧州特許出願第0027089号に記
載されている。本出願人名義のこれら特許及び特許出願
については既に説明した。 使用する脱重合用混合物(1g)を、0.2M塩塩ビヒ
ナトリウム溶液溶出した5ephadeXG 50ゲル
カラム(2,5x 300cn+)の最上部に配置する
。明確に規定されたオリゴ糖(ジー、テI・ラー、ヘキ
サ−、オ、シ フタ−119,エイコサツカリドまで)に対応する分画
をまとめて濃縮し脱塩処理する。これらの生成物は凍結
乾燥後に得られる。 b):トラブールアンモニウム塩の′1゛告テトラブチ
ルアンモニウム塩を4aの塩の製法と同じ方法で製造す
る。非還元性末端に位置する不飽和ウロン酸の残基で終
わる生成物のテトラ−、ヘキサ−、オクタ−、ドデカ−
及びヘキサデカ−サツカリドの塩が得られた。 C) リボ の砕6・ 硫酸化すべきオリゴ糖のテI・ラブチルアンモニウム塩
をDMF (2501□g75ml)中に溶解し、次い
で硫酸化複合体(]・リメチルアミン/ SO3; 2
50a+g)を加える。この反応混合物を24時間50
’Cに加熱する。 水(5ml)で希釈し、5ephadex G 25で
反応混合物をクロマトグラフィにかけ、次いで凍結乾燥
するとオリゴ糖が得られる。 過硫酸1ヒジサツカリド 24.1< IC841
477) 過硫酸化テ1〜ラサッカリド 4 3.20(
IC851597) (IC841478) 過硫酸1ヒジサツカリド 63.00 (IC851598) オクタサツカリド 8 2.43(
IC841475) 過硫酸化オクタサツカリド 8 3.08(I
C851599) (IC861746) 過硫酸化デカサツカリド 10 2.76え
I1更:−硫 −ルマタンルに礼l(IC85161
0) a)?上57’−%tl、=77T=−:’)ムqデル
マタン硫125+ngを酸に変換しくカチオン交換樹脂
)次いで水酸化テI〜ラブチルアンモニウムにより中和
する。乾燥凍結後46mgの塩が得られる。 b)−ルマタン硫 の゛・砕2 前述のごとく得られた塩(15B)を複合体トリメチル
アミン/ SOy (15+ng)の添加によりDMF
(Img)中で過硫酸fヒする。この生成物は水による
希釈、5ephadex G 25ゲルでのクロマト
グラフィ及びイオン交換樹脂によるすトリウムの有機カ
チオンの交換の後で得られる。 出発生成物(0,8g)を水に溶解し、酸に変換し且つ
トリエチルアミンによって中和する。その結果凍結乾燥
後に0.91gのトリエチルアミン塩が得られる。 b)過」JUL 前述の塩(0,24g)をDMF(8ml)に高温で溶
解する。 硫酸化複合体(1’MΔ/So、; 1.68g)を加
えた後24時間50℃に維持する。ゲルp過及びナトリ
ウム塩への変換後に238gの過硫酸化ヘパリンが得ら
れる。 この実施例は該製法の柔軟さを示すものである。 先ずCarbohyd、 Res、 58(1977年
) 47−55に記載のNAKΔGAWΔ池の方法によ
りN、0−脱硫酸化ヘバリンを製造する。 次いでこのヘパリンを塩基pHの複き体ピリジン/SO
,により選択的にN−再硫酸(ヒする。これを酸形態に
変え且つ水酸化テトラブチルアンモニウムにより中和す
ることによってテトラブチルアンモニウム塩に変換する
。このようにして得られた塩を真空下50°Cで24時
間乾燥する。 前記テトラブチルアンモニウム塩(0゜92g)を無水
ピリジン(10ml)中に溶解する。無水酢酸(0,1
m1)を加え室温で一晩放置する。硫酸(ヒ複合体(ピ
リジン/SOコニ0.72g)添加後、該反応混合物を
100℃で4時間加熱する。冷却後、これをソーダ(2
g)3有エタノール(100+++I)にゆっくり加え
る。4℃で一晩放置した後、形成された沈殿物を脱水に
かけ、水に溶解し次いで5epbadex G 25で
クロマトグラフィにかける。凍結乾燥(Ho、6℃gの
粉末が得られる。これを分析した結果、60%の第1ア
ルコール官能基が遊離していた。 実施例5aで説明したヘキササツカリド分画をピリジニ
ウム塩に変換し、次いで混合物DH5O/+120(9
515;v/v)中50℃で90分間加熱することによ
りN−脱硫酸化する。ソーダ添加後、この反応混合物を
5ephadex G 25カラムでクロマトグラフィ
にがける。凍結乾燥後に当該生成物を道順アミンの形態
で回収する。これを従来の方法に従い塩基媒質中で無水
酢酸によりN−アセチル化する。 前記ドアセチル化誘導体(0,5g)をテI・ラブチル
アンモニウム塩に変換する。次いでこれをDMF(10
ml)中に溶解し、複合体トリメチルアミン/SO3(
0,51?)の存在下100℃で4時間硫酸化処理する
。冷却後この反応混合物をエタノール(90ml)中0
.5M溶液にゆっくり加える。遠心3雛後残留物を回収
する。これを水に溶解し且つ凍結乾燥する。 その結果0.61.の過硫酸化ドアセチル化ヘキササツ
カリドかすl・リウム塩の形態で得られる。 及1圧咀:過硫酸イ′デルマタン研酸訂 の製造デルマ
タン硫酸断片を従来の方法で得る(定期的酸化とそれに
次ぐ酸の所定加水分解: T OL L E F S
EN、 Nouvellc Revue Fra++5
:aise d’l15+natologie;26(
1984年) 233−237、又はヒドラジン分解(
byd−razinolyse)とそれに次ぐ亜硝酸に
よるデグラデーション、又は前述の方法を用いる)。 デルマタン硫酸(Sigma製品) 50mgを塩酸0
.5M溶液(2+nl)に溶解する。この混合物を10
0℃で5分間加熱した後冷却する。次いで亜硝酸ナトリ
ウム水溶?1!(2,5%;1m1)を加える。1分後
にソーダを加えて鎖酸を中和し、次いでホウ水素化ナト
リウム(borohydrure de sodium
) (10mg)を加える。この混合物を5ephad
ex G 25カラムで脱塩処理する。 凍結乾燥後、得られた生成物をトリエチルアミン塩に変
換し、次いでI・ツメチルアミン/SO5複合体(50
mg)の存在下DMF (5ml)中100℃で硫酸化
する。4時間後にこの混合物を冷却し、次いで水で溶出
した5ephadex G 50カラムの最上部に配置
する。酸形態への中間変化とソータによる中和とによっ
てナトリウム塩を得る。この中和は電導率測定の前に行
なわれ、2.4の硫酸塩/カルボキシル比を示す。 加水分解時間又は温度又は酸のモル密度は種々の大きさ
の断片を得るべく変化させてよい、硫酸化度もこの反応
の条件を変えることにより変化させ得る。 この反応は同一条件下でコンドロイチン硫酸にも使用さ
れる。
時間前にSVF含有培地を採取し、U l trose
rを20%含む培地で前述の培養物を洗浄する。標識し
たヘパリンとのインキュベーションな培地2ml中で行
なう。インキュベーション後前記細胞を1.5+nlの
リン酸緩衝液(+’Bs、pH7,4>で3回洗浄し、
次いでプロナーゼ0.5ml (1mg/it )及び
トリ1−ン(Triton) x 100 0.1%(
v/v)の中37°Cで3インキユベーI〜することに
より切離して可溶化する。 ガンマ計数器Beckmann 7000 (”’ I
)を用いて細胞及びインキュベーション培地の放射能
を測定する。 前記細胞を種々の濃度の低温テスト物質(標準ヘパリン
、過硫酸化ヘパリン、等)の存在下でヘパリン(12’
I)J度を低くして5時間インキュベーションた。 ヘパリンの固定阻止能力をl50(標識したヘパリンの
固定を50%で阻止する濃度)で評価した。 この値はテスト物質の内皮細胞に対するアフィニティを
示す。 一補一俸】jL固卦− ヘパリンはタンパク質C1b及び8間の二分子複合体の
形成を阻止して補体の第2増幅C3転換酵素(conv
ertase amplificatrice alt
erne)の発生を阻止する。 結合C,b−Bに対するヘパリン及びその誘導体の作用
を、+251 (’2sl−[1)テ標識したタンパク
質Bとタンパク質C,b (E C,b)担持羊赤血球
とを用いて調べた。 複合体C,b−Bの形成を50%阻害するのに必要なヘ
パリン又はテスl−したオリゴ糖の濃度をIC50と称
する。 このヨ11定は精製タンパク質系内でin vitro
で行なう。 一火」シ[ 0,1%のゼラチンと5mMのMg24とを含むヴエロ
ナール桜街液中で、12Sl−3の濃度を変えながらE
C,b(0,75−2,5x 10’)を30’Cで
30分間インキュへ−1・する。 70成の試料を各反応毎に2部づつ使用し、これら試1
′:1を0.5mlポリプロピレン管内のジフヂルフタ
レーh (Merck−C1evenot 、フランス
)とジノニルフタレ−1−(Coger−パリ)との混
合物(7:3V/V)300成の上に配置する。 前記管をBeckmanのマイクロフユージュ(m1c
−rofBe、 f3eckman、バリ)により80
00g″r1分181遠心分離にかけ、次いで沈殿物の
直ぐ上で切断する。 結合したりガントの放射能を計測する。 エラスターゼ び力1プシンGにえ る活性犬1b紅 白血球エラスターゼを胸膜滲出液から得たラッj・多形
核球を用いて製造する。基貧としてはN−スクシニルト
リアラニンパラニトロアニリドを使用する。前記酵素を
テスト物資と共に室温(20℃)で1時間インキュベー
1−した後で酵素活性を測定する。次いで前記基質3加
え、37°Cで20時間インキュベートし、410nm
”’C″読み収りを行なう。 ヒト多形核白血球から得たヒトカテブシンGの場合は、
定景(dosaHe)をアゾカゼイン基質に関して行な
う。この場合も酵素をテストずべき物質と共に室温で1
時間インキュベートし、次いでアゾカゼインを加え、こ
の混合物337℃で5時間インキュベー1・する。トリ
クロロ酢酸を526(最終濃度)で沈殿させ、遠心分離
にかけ且つ366nmて゛読み収りを行なう。 5つの実験アセンブリを形成した。 実J々」−:ざがリンIび過lif醜ゴヒヱlレマタ乙
鴇Jし矢症迩」uL19JυL @皿l μ/wag IC50 11@/l111 標準ヘパリン 192 0.10 0.29
N−アセチル化 デルマタン硫酸 100 5.8過硫
酸化 抗トロンビン活性(抗11a)はPi酸化率と共に増加
することが確認される。 過QM化N−アセチル化ヘパリンの場合はIICII存
在下での活性が出発ヘパリンより強化される(IC50
が0,29から0.077に変化)のに対し、AT I
II存在下での活性は減少する(IC50が0.10か
ら0.38に変化)。 ■/m1 IC8415454,5 デルマタン硫酸 50 過硫酸化 デルマタン硫酸 15 IC851610 このモデルでは、過硫酸化がデルマタン硫酸の活性を増
加させるのに対し、過硫酸化ヘパリンは正常ヘパリンよ
り低い活性を示すことが確認される。 血漿媒質中での補足的操作の結果、正常ヘパリンの活性
はAT IIIに依存し、過硫酸化ヘパリンの活性はい
ずれの補助因子にも依存しないことが判明した。 これらの操作からは、正常デルマタン硫酸の活性が完全
にIICIIに依#するのに対し、過硫酸1ヒデルマタ
ン硫酸の活性はある程度しか依存しないことも判明した
。 ヒ1〜の1〜ロンボブラスチンを凝塊形成剤として使用
するWesslerのモデルで得られた結果によれば、
用量100■7kgでの血栓形成の予防は過硫酸化デル
マタン硫酸の場合が80%であるのに対し、デルマタン
硫酸の場合には40%に過ぎない。 このモデルではテストずへき物質のAT III及びH
CIIの存在下でのIC50を測定することにより因子
11aの阻害状態を調べる。 テスl−した物質は下記の通りである。 基準ヘパリン及び4(dp 4) 、6(dp 6)
、8(dp8)、12(dp 12)、16(dp 1
6)に等しい重合度の断片、並びにこれらの適確ei(
ヒ同族体。 ナス1〜物質 抗11a活性八T If
f IICII IC50 μg/ffl! 標準ヘパリン 0.039 0.14IC
841477dp 4 100 ”過硫
酸化 IC851597dp 4 100 ’
IC841476dp 6 100 。 過硫酸化 Ic 851598 dp 6 100
42IC841475dp 8 100
’過硫酸化 IC851599dp 6 100 11
fc 851473 dp 12 100
56過硫酸化 IC851600dp 12 100 3.
6IC851601,dp 16 ’
0.68°−50%未達成。過硫酸化前の分子量の
小さい均一断片は、ヘパリンとは逆に、このモデルでは
^TIIIの存在下で抗IIa活性を示さない。これは
IC50が100を越えていることから明らかである。 これら断片は過硫酸化しても、^T IIIの存在下で
は活性が変化することはない、ただし断片dp16は過
硫酸化されると活性を少し得る。 これに対しIICIIを介する抗11a活性は、特に分
子蓋が大きい場合には、過硫酸化によって増加する。 しかしながらHCIIを介する抗11a活性はヘパリン
の同活性に比べるとやはり小さい(yfr片dp16は
例外)。 lLi:標:したヘパリン 125■ に・する ノ
の−・ によって゛ たヒLlflN ・°
へΔlLへ11 一般的には、過硫酸化はヒト謄静脈内皮細胞への固定を
促進する。 ただし、短い鎖は内皮細胞に対するアフィニティが極め
て小さい。 lLi:補准」レソケ止」− このモデルでは精製タンパク質系内でin vitr。 の補体の第2C3転換酵素の形成を阻止する能力を測定
した。 テスト物質 IC50ug/ml 標準ヘパリン 0.5過硫酸化
ヘパリン IC8415450,530 過硫酸化N−アセチル化脱硫酸化 ヘパリンIC8617460,35 IC841552dp 16 0.
75過硫酸化IC851601dp 16
0.30IC841552dp i2
1.1過硫酸化IC851601dp 12
0.40IC841475dp 8
3過ち(酸 fヒ IC85
1599dp 8
1.IIC841476dp 6
7過硫酸化IC851598dp
6 1.75IC841477dp
4 30過硫酸化I
C851597dp 4 7これらの結果
から明らかなように、過硫酸化はヘパリンの活性を変化
させることはない。 これに対し、ドアセチル化N−説硫酸化ヘバリンの阻害
活性及びdp4から16の断片の阻害活性は過硫酸化に
よって増加する。 ターゼ びメーブシンGに対 る且パ性エラスターゼ
力テブシン 標準ヘパリン 100% −過硫酸
化ヘパリン IC841545100% −IC8415
55dp 22 91%
53%IC841554dp 20 92%
54%IC841552dp 1
6 82% 49%過硫酸化 IC851601dp 1B 100%
60?ごIC841473dp 12 92%
46%過硫酸化 IC851600dp 12 97%
51%IC841475dp 8 53%
34%過硫酸化 IC851599dp 8 95%
53?6IC841476dp 6 38%
8%過硫酸化 Ic 851598 dp 6 91%
43%IC841477dp 4 28%
7%過硫酸化 IC851597dp 4 93%特定の分子量
では阻害能力は過硫酸化によって著しく増加することが
確認される。 この現象は特に最も小さい分子量(dp4、dp6)に
関して見られる。 結論として、これらの実験モデル(凝血に対する作用又
は凝血系以外での作用)では過硫酸化の影響は一様では
ないと言える。 特に、分子量の極めて小さい断片(4−8個の基本単位
)では、補体系とエラスターゼとに対する阻害活性が過
硫酸化によって大幅に増加するのに対し、凝血に対する
作用はほとんどまたは全く変(ヒせず、極めて小さいま
まである。 本発明の生成物のin vivo効果3下記の2つの実
験モデルを用いてテストした。 一次のプロ1〜コールに従う操作によりデキストランに
対して感作したラットを使用するモデル:Freund
の不完全アジュバント中に懸濁したデキストラン1O−
50Bを注射することにより、ラッl−3デキストラン
に対して感作する。 この感作は複数のデキス1−ラン皮下注射からなる操作
を3回行うことによって実施する。投与量は各操作毎に
動物の体の種々の点に行う10回の注射の間で分配する
。これらの注射操作は3週間間隔で行なう。 感作した動物をデキストランのみ又はデキストラン+テ
スト物質を受容する2つのグループに分ける。1グルー
プの動物には何も与えず、陰性対照として使用する。 テスト物質はデキストラン注射の11′4時間前に静脈
注射するか、又はデキストラン注射の1−2時間前に皮
下注射する。投与量は動物の体重1kg当たり1から1
0mgである。 注射後5分、30分及び4時間の時点て採取した処理動
物の血漿試料(0,5m1)を用いて結果を評価した。 この結果の評価基準は次の通りである:a)ウサギの抗
ヒツジ赤血球抗体で被覆したヒツジ赤血球の細胞溶解の
測定(テスl” Cll 50) 。 複数の連続的希釈度をテスl−L、結果3各希釈度での
赤血球の細胞溶解の血漿のパーセンテージで表す。細胞
溶解は透射ヘモグロビンの星によって評価され、この測
定は光学的濃度によって行なわれる。 (Kabat
E、^、及びMeyer、Experimental
Immunochemistry、第2版、Charl
es C,’I’homasJ4、米国スフ゛リングフ
ィールド、イリノイ州(1967年)149ベージ;
Ka7atcbkine N、 D、、 Ilnupt
mann G、。 及びNydeggerυ3、’I’echnique
du Complement、l N S I’、開成
、パリ(1985年)、22−30ページ。)b)赤血
球凝集反応テス)・ このテストではデキス1〜ランで被覆したヒツジ赤血球
を使用し、微量滴定プレート内でその動物の血漿中に存
在する抗デキストラン抗体によるこれら赤血球の沈殿を
測定する。結果は前記沈殿を生起せしめる最大血漿希釈
度によって表す。 −下記のプロトコールに従う操作により、Freund
の完全アジュバントをラットに投与して生起せしめた関
節炎を使用する実験モデル:雄Leiuisラット(1
6l60−2O0にFreundの完全アジュハンh
(FCA 0.1+alの牛酪酸(mycobacte
riumButyricun+ )及びパラフィン油懸
濁液8B/ml )を注射する。この注射は左後脚の足
底弓に行う。 3グループの動物を使用して、1グループにはFCAの
み与え、別のグループにはFCΔ+テスト物質を与え、
残りのグループは何も操作せずに対照として使用する。 デス1〜物質は、FC八へ射後の最初の19日間にわた
り1−10mg/kg日の割合で静脈注射又は皮下注射
により投与する。 結果は注射しなかった右後脚の大きさく2次傷害)と、
関節炎指数の測定とによって評価する。 (Perper R,J、 、Δ1varez B、、
ColombOC,。 Fcl+roder 11.(1971年) 、Pro
c、Soc、Exp、Biol、Med、。 137.506−512ページ; l1artletL
R,R1、5chleyer−bacb R,(19
85年)、Int、 J、 Immunopbarma
c、、第7巻、Nol、7−18ページ。) 実施例5の過硫酸化オクトサツカリドの第1検査の結果
、これら2つのモデルに関しては好ましい効果が得られ
た。 本発明の種々の添加率のGAGはまた、有利なことに毒
性を示さない。 f水型20gの雌スイスCFマウスをロット当たり5匹
ずつに別けて皮下注射することによりDL 50を調べ
た。注射量は0 、5 In l、最終薬用量62.5
mg/kg、125+ng/kg、250II1g/k
g、100OB/kgとした。 DL 50は所定条件では、2つのテスト物質即ち実施
例2のIC861716及び実施例5の過硫酸化デカサ
ツカリドIC8[j1746の場合に100mg/kg
を越える。 注射の間に又はその後の7日間の観察期間に死亡した動
物は皆無である。 従ってこれらの物質は薬の製造にとって特に貴重である
。 抗凝血活性及び抗I・ロンビン活性を保持していた12
を越えるdpを有する物質は、血栓形成の予防及び治療
に有用である。dpの小さい物質、特にdp8以下の物
質は主として血管壁障害、組織の老化及び退行性の症状
、特に例えば糸状体腎炎、リューマチ様関節炎及びアレ
ルギー症状として現れるある種の遅発感覚過敏性症状の
ごとき特定形態の免疫不均衡に起因する障害の治療に有
用である。 これらの物質はまた、ショック状態、特に重い火傷にも
使用し得る。 本発明の医薬製剤は前述のGAGを製薬賦形剤と共に有
効量含むことを特徴とする。有利には、これらの医薬製
剤は非経口投与の場合にはピロゲン基質を含まない。 好ましい組成物は経口投与に適した製薬ビヒクルを含む
。この場合の本発明の投与形態は有利には背低抗性カプ
セル、錠剤、丸薬であり、又はリポソーム7の形態でも
存在する。 別の医薬組成物はこれらのGAGを直腸投与に適した賦
形剤と共に含む。この場合の投与形態は座薬である。 別の医薬組成物では前記G八Gがエアゾール又はポマー
ドの形態で存在する。 本発明は静脈注射、筋向注射、又は皮下注射に適した注
射可能な滅菌又は滅菌可能医薬組成物にも係る。 これらの溶液は有利には1がら200mg/n+ Iの
GAGを含み、これら溶液を皮下注射する時には好まし
くは20から150+g/m lのGAGを含む0例え
ばこれら溶液は30から100mg/ml、特に静脈注
射又は潅流による投与の場合には40がら50B/+n
lのGAGを含み得る。 この種の医薬製剤は有利には即使用可能な使捨て注射器
の形態で存在する。 本発明の医薬組成物は特にヒト又は動物の血液凝集の特
定段階を、特に患者が主として外科手術、アテロームプ
ロセス、腫瘍形成及びバクテリア又は酵素活性体による
凝血傷害に起因する過剰凝血性を示す危険がある場合に
コントロール(予防又は治療)するのに適している。 ある種の組成物は補体の作用を特に炎症性の症候群、例
えばリューマチ様関節炎に係わる炎症性症候群を変化さ
せ得る。実際、観察される障害のうちあるものは、少な
くとも部分的には、補体がある役割を果たす関節レベル
に大量の抗原−抗体複合体が存在するために生起するこ
とが知られている。 別の組成物は一般的に組織の老化又は脱毛のごとき退行
性症状に対して有効である。 本発明をより明らかにすべく、次にヒトに使用し得る薬
用量の一例を示す:約1mgから1 g/24時間、好
ましくは約5から500mg/24時間、例えば約20
0+l1g724時間を静脈注射により断続的に、即ち
一定間隔をおいて投与するが、又は約200がら110
00II1/24時間を経口投与する。これらの用量は
勿論予め行なう血液検査の結果、病気の種類及び一般的
には健康状態に応じて各患者毎に調整し得る。 本発明はまた、ラボラトリ−で特にプロテアーゼ阻止活
性テストにかけられる他の物質の検査の°比較対照とし
て使用し得る生物学的試薬の形成における本発明のGA
Gの使用にも係る。 本発明の他の特徴及び利点は本発明の生成物の合成に関
する以下の実施例の説明によって明らかにされよう。 支膨■上二恋又通尺N土ブpフィルを・つヘパリ″L!
!2JLL(I C841545)先ずヘパリン酸I・
リュチルアンモニウム(TE^〉を製造し、次いでこの
生成物を過硫酸化処理にかける。 水50m1中に溶解したヘパリン酸すI・リウム1gを
イオン交換樹脂(Dowex 50. II” )によ
りヘパリン酸に変換する。トリエチルアミンで中和し且
つ濃縮乾固すると1.38のTEA塩が得られる。 b ) ”1AInJL監 前述の塩0.978をジメチルホルムアミド(DMF)
20ml中に溶解し、これに硫酸化用複合体TM^/5
03(6,8g)を加える。50℃で24時間放置した
後、前記反応混合物を希釈し、次いで5ephadex
G−25ゲルカラムに通して当該生成物を回収する。 樹脂Dowex 50 H”での交換によって得た酸を
中和するとすl・リウム塩が得られる。凍結乾燥後77
4Bの生成物か回収される。 C)VLiL 得られたヘパリンは3.01の硫酸化度(硫酸塩/カル
ボン酸塩; SO,−/C00−)を示す。これに対し
出発生成物の硫酸化度は2.16である。 反応時間を1時間に限定すると、SO3−/COO−・
2.70になる。 硫酸化用複合体0.68gの存在下で1時間処理すると
so、−7coo−=z、4oになる。 ヘパリン及び過硫酸化ヘパリンのNMRスペクトルを第
1図及び第2図に示した。これらのグラフからは特にC
Il□03O1への変換に起因して62.4pp…でシ
グナルCH2011が消失している。アノマー炭素領域
でも大きな変化が見られる(約10100pp。 実施例1と同様に操作するが、この場合は複合体TM^
/SO1に代えてピリジン中のクロロスルホン酸をtf
t、に止剤として使用する。硫酸化にはピリジン50n
lに溶解したTE八基塩097gを使用し、次いでク
ロロスルポン酸(1g)を加える。 0℃で24時間放置した後、前記反応混合物を実施例1
1と同様に輻釈し処理する。 ヒ 前述Z同様の特徴を持つヘパリンが得られる。 1iL11:1歿! N−アセチル ヘパリンの1克(
IC861746) ヘパリンを従来の方法でト脱硫酸化しく InoueS
、及びNagasawa K、、Carbohyd R
cs、、46 (1978年)87−95)、次いで水
性塩基媒質中で無水酢酸によりアセチル化する0次いで
TEA塩を実施例1aと同様に製造する。 b)(1此 N−アセチル化ヘパリン1gから得たTEA塩をDMF
(25ml)中に溶解し、’rMA/5Oz(0,84
g)ノ存在下チー晩100℃に加熱する。硫酸化した生
成物を5cphaclex G 25でのゲル濾過にか
けた後回収する。 これを一時的に酸の形態に変え後ナトリウム塩に変換す
る。凍結乾燥すると薄いベージュのナトリウム塩IC8
61716が1.14g得られる。N−アセチル化ヘパ
リン及び対応過硫酸化生成物のNMI(スペクトルを第
4図及び第5図に示した。 ルアンモニウム上 TABの ゛1 塩基として水酸化テトラブチルアンモニウムを使用し且
つ分子量の小さいヘパリンを用いて実施例2a)と同様
に操作する。 b)慶並進− 得られた塩(Ig)を複合体ピリジン/S03(1g)
によりピリジン(10慎1 )中室温で24時間硫酸1
ヒする。ゲル濾過にかけ、次いでナトリウム塩に変換す
るとN−アセチル1ヒ低分子址ヘパリンのすl−リウム
塩が0.5g得られる。 c ) VL 例えば前述の主特許第2440376号の実施例1の方
法により得られるような生成物CY 210 (平均d
p約14)に使用される前述の方法は、SO3−/CO
O−比2.85の過硫酸化生成物(IC841548)
を製造せしめる。出発生成物の前記比は2.12である
。 モニウム塩のパ告 低分子量ヘパリンCY 21Bを水に溶解しく0.51
中に10g)次いで11+形悪の樹脂Dowex 50
WX4カラムに通すことにより酸に変換する。中和後、
得られたテトラブチルアンモニウムヘパリンを凍結乾燥
する。テトラブチルアンモニウム塩が19.34g得ら
れる。 b)!iLl!u− 前述の塩1gを無水ピリジン50m I中に溶解し、硫
酸化複合体(ピリジン/SOz>を加える。複合体の量
を変えながら3回テストを行なう。室温で24時間反応
させた後この反応混合物を95%エタノール中ソーダ(
2g)溶液に加える。形成された沈殿物を濾過し、水に
溶解し、5ephadex G 25でクロマI・グラ
フィにかけ、凍結乾燥するとナトリウム塩が得られる。 c)11 硫酸化複合体の質量を変えることによって形成生成物の
硫酸化度を変化させる0例えば硫酸化複合体の質量を夫
々0.16g、0.32g、0.48gにすると、2.
21.2.75及び3.41の硫酸化度が得られる。 過硫酸化CY 216のNMRスベク1−ルを第3図に
示した。 無水マンニトールCIのシグナル(63,6ppm)が
消失しく Cl2O+1 →C1120SO,−)、他
(7) 7 ンニl−−ルシグナル(領域78.86p
p+n)も変1ヒした。約ppmのアノマーグループの
シグナルも同様である。 オリゴ糖は所定条件下でヘパリナーゼ又は亜硝酸による
ヘパリンの脱重合の結果得られる混合物をゲルー過する
ことにより分留して得る。亜硝酸による脱型合法は例え
は1980年3月20日の第2追加特許明細書第247
8646号及び1981年4月10日の仏国特許出願第
2503714号に記載されており、ヘパリナーゼを用
いる脱重合操作は欧州特許出願第0027089号に記
載されている。本出願人名義のこれら特許及び特許出願
については既に説明した。 使用する脱重合用混合物(1g)を、0.2M塩塩ビヒ
ナトリウム溶液溶出した5ephadeXG 50ゲル
カラム(2,5x 300cn+)の最上部に配置する
。明確に規定されたオリゴ糖(ジー、テI・ラー、ヘキ
サ−、オ、シ フタ−119,エイコサツカリドまで)に対応する分画
をまとめて濃縮し脱塩処理する。これらの生成物は凍結
乾燥後に得られる。 b):トラブールアンモニウム塩の′1゛告テトラブチ
ルアンモニウム塩を4aの塩の製法と同じ方法で製造す
る。非還元性末端に位置する不飽和ウロン酸の残基で終
わる生成物のテトラ−、ヘキサ−、オクタ−、ドデカ−
及びヘキサデカ−サツカリドの塩が得られた。 C) リボ の砕6・ 硫酸化すべきオリゴ糖のテI・ラブチルアンモニウム塩
をDMF (2501□g75ml)中に溶解し、次い
で硫酸化複合体(]・リメチルアミン/ SO3; 2
50a+g)を加える。この反応混合物を24時間50
’Cに加熱する。 水(5ml)で希釈し、5ephadex G 25で
反応混合物をクロマトグラフィにかけ、次いで凍結乾燥
するとオリゴ糖が得られる。 過硫酸1ヒジサツカリド 24.1< IC841
477) 過硫酸化テ1〜ラサッカリド 4 3.20(
IC851597) (IC841478) 過硫酸1ヒジサツカリド 63.00 (IC851598) オクタサツカリド 8 2.43(
IC841475) 過硫酸化オクタサツカリド 8 3.08(I
C851599) (IC861746) 過硫酸化デカサツカリド 10 2.76え
I1更:−硫 −ルマタンルに礼l(IC85161
0) a)?上57’−%tl、=77T=−:’)ムqデル
マタン硫125+ngを酸に変換しくカチオン交換樹脂
)次いで水酸化テI〜ラブチルアンモニウムにより中和
する。乾燥凍結後46mgの塩が得られる。 b)−ルマタン硫 の゛・砕2 前述のごとく得られた塩(15B)を複合体トリメチル
アミン/ SOy (15+ng)の添加によりDMF
(Img)中で過硫酸fヒする。この生成物は水による
希釈、5ephadex G 25ゲルでのクロマト
グラフィ及びイオン交換樹脂によるすトリウムの有機カ
チオンの交換の後で得られる。 出発生成物(0,8g)を水に溶解し、酸に変換し且つ
トリエチルアミンによって中和する。その結果凍結乾燥
後に0.91gのトリエチルアミン塩が得られる。 b)過」JUL 前述の塩(0,24g)をDMF(8ml)に高温で溶
解する。 硫酸化複合体(1’MΔ/So、; 1.68g)を加
えた後24時間50℃に維持する。ゲルp過及びナトリ
ウム塩への変換後に238gの過硫酸化ヘパリンが得ら
れる。 この実施例は該製法の柔軟さを示すものである。 先ずCarbohyd、 Res、 58(1977年
) 47−55に記載のNAKΔGAWΔ池の方法によ
りN、0−脱硫酸化ヘバリンを製造する。 次いでこのヘパリンを塩基pHの複き体ピリジン/SO
,により選択的にN−再硫酸(ヒする。これを酸形態に
変え且つ水酸化テトラブチルアンモニウムにより中和す
ることによってテトラブチルアンモニウム塩に変換する
。このようにして得られた塩を真空下50°Cで24時
間乾燥する。 前記テトラブチルアンモニウム塩(0゜92g)を無水
ピリジン(10ml)中に溶解する。無水酢酸(0,1
m1)を加え室温で一晩放置する。硫酸(ヒ複合体(ピ
リジン/SOコニ0.72g)添加後、該反応混合物を
100℃で4時間加熱する。冷却後、これをソーダ(2
g)3有エタノール(100+++I)にゆっくり加え
る。4℃で一晩放置した後、形成された沈殿物を脱水に
かけ、水に溶解し次いで5epbadex G 25で
クロマトグラフィにかける。凍結乾燥(Ho、6℃gの
粉末が得られる。これを分析した結果、60%の第1ア
ルコール官能基が遊離していた。 実施例5aで説明したヘキササツカリド分画をピリジニ
ウム塩に変換し、次いで混合物DH5O/+120(9
515;v/v)中50℃で90分間加熱することによ
りN−脱硫酸化する。ソーダ添加後、この反応混合物を
5ephadex G 25カラムでクロマトグラフィ
にがける。凍結乾燥後に当該生成物を道順アミンの形態
で回収する。これを従来の方法に従い塩基媒質中で無水
酢酸によりN−アセチル化する。 前記ドアセチル化誘導体(0,5g)をテI・ラブチル
アンモニウム塩に変換する。次いでこれをDMF(10
ml)中に溶解し、複合体トリメチルアミン/SO3(
0,51?)の存在下100℃で4時間硫酸化処理する
。冷却後この反応混合物をエタノール(90ml)中0
.5M溶液にゆっくり加える。遠心3雛後残留物を回収
する。これを水に溶解し且つ凍結乾燥する。 その結果0.61.の過硫酸化ドアセチル化ヘキササツ
カリドかすl・リウム塩の形態で得られる。 及1圧咀:過硫酸イ′デルマタン研酸訂 の製造デルマ
タン硫酸断片を従来の方法で得る(定期的酸化とそれに
次ぐ酸の所定加水分解: T OL L E F S
EN、 Nouvellc Revue Fra++5
:aise d’l15+natologie;26(
1984年) 233−237、又はヒドラジン分解(
byd−razinolyse)とそれに次ぐ亜硝酸に
よるデグラデーション、又は前述の方法を用いる)。 デルマタン硫酸(Sigma製品) 50mgを塩酸0
.5M溶液(2+nl)に溶解する。この混合物を10
0℃で5分間加熱した後冷却する。次いで亜硝酸ナトリ
ウム水溶?1!(2,5%;1m1)を加える。1分後
にソーダを加えて鎖酸を中和し、次いでホウ水素化ナト
リウム(borohydrure de sodium
) (10mg)を加える。この混合物を5ephad
ex G 25カラムで脱塩処理する。 凍結乾燥後、得られた生成物をトリエチルアミン塩に変
換し、次いでI・ツメチルアミン/SO5複合体(50
mg)の存在下DMF (5ml)中100℃で硫酸化
する。4時間後にこの混合物を冷却し、次いで水で溶出
した5ephadex G 50カラムの最上部に配置
する。酸形態への中間変化とソータによる中和とによっ
てナトリウム塩を得る。この中和は電導率測定の前に行
なわれ、2.4の硫酸塩/カルボキシル比を示す。 加水分解時間又は温度又は酸のモル密度は種々の大きさ
の断片を得るべく変化させてよい、硫酸化度もこの反応
の条件を変えることにより変化させ得る。 この反応は同一条件下でコンドロイチン硫酸にも使用さ
れる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)所与のグリコサミノグリカンを有機溶媒に可溶性
の塩に変換し、これを有機溶媒中に可溶化し、溶解した
塩を硫酸化剤により処理することを特徴とするグリコサ
ミノグリカン即ちGAGの硫酸化方法。 (2)出発時のGAGがD−グルコサミン−ウロン酸(
即ちL−イズロン酸又はD−グルクロン酸)の交互モチ
ーフを主体とすることを特徴とする特許請求の範囲第1
項に記載の方法。 (3)出発時のGAGが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、そ
れらのフラクション又はフラグメントから選択されるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第2項に記載の方法。 (4)出発時のGAGがヘパリン又はヘパラン硫酸より
も少ない2〜30の範囲の糖モチーフ数を有する鎖混合
物又は重合度に関して均一の鎖混合物から形成される低
分子量のGAGである特許請求の範囲第2項又は第3項
に記載の方法。 (5)出発時のGAGが、 例えばアルコール抽出によりヘパリンから得られ、Yi
n Wessler/USP比が少なくとも2である分
子量約2000〜8000の鎖混合物から形成されるム
コ多糖、例えば3〜5程度のYW/USP比と3000
〜5500の平均分子量とを有する生成物、 例えば亜硝酸によりヘパリンを脱重合することによって
得られ、一般に前記ムコ多糖と同様の特徴を有しており
且つ2,5−アンヒドロ−マンノ構造の基を末端に有す
るムコ多糖、特に2,5−アンヒドロ−マンニトール末
端又は2,5−アンヒドロ−マンノン酸末端を有してお
り、大部分が2000〜3000程度の分子量、特に約
2000〜2600の分子量を有しており且つYin−
Wessler/USP比が特に少なくとも10であり
Yin−Wessler値か少なくとも約200u/m
gであるムコ多糖、 (1)平均分子量が3000〜6000ドルトン、特に
約4000〜5000であり、(2)YW/USP値が
10未満、特に約6〜3であり、(3)2,5−アンヒ
ドロマンノ構造のモチーフを末端に有する鎖から本質的
に形成されるムコ多糖、 最大8個の糖モチーフから形成されており、2000u
/mgに達し得る高いWin−Wessler値と実質
的にゼロに等しい低いUSP値とを有しており、ATI
IIに対して強い親和性を有しており、2,5−アンヒド
ロマンノ構造の基を末端に有するか、又はヘパリンをヘ
パリナーゼで脱重合することにより形成されるような不
飽和ウロン酸モチーフに対応する鎖発端モチーフを有し
ており、下式: ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるABCDEFGH構造を有するオリゴ糖、下
式: ▲数式、化学式、表等があります▼ に対応する六糖の均一組成、 上記GAGをセファデックスのような材料上でろ過する
ことにより又はイオン強度勾配クロマトグラフィにかけ
ることにより得られる均一重合度のオリゴ又は多糖、 ヘパリンに過沃素酸塩を作用させた後、塩基性溶媒中で
処理し、場合によってはホウ水素化ナトリウムで還元処
理することにより得られるようなGAG、 ヘパリンをヘパリナーゼ又は亜硝酸で脱重合し、ATI
II固定配列を有するフラクションを分離し、例えばdp
が12より大きいフラグメントのような多様な重合度の
GAGフラグメントと、特に12、10、8、6、4及
び2個の糖モチーフを含む低重合度のGAGフラグメン
トとを得るべく前記フラクションをゲルろ過することに
より得られるようなGAG、 前記GAGと同様でありながら、ATIIIを特異的に認
識し得る配列を実質的に全く備えず且つYW値がゼロに
等しい小さい値であり、ヘパリン又はGAGをATIII
に接触させた後、多様なdpの均一フラグメントを得る
べくゲルろ過する段階を含む工程中でATIIIに固定さ
れないGAG、 ヘパリンに見出だされるような連鎖を有しており、グル
コサミンモチーフの2位の−NHSO_3基の一部、或
いは大部分或いは全体が−NH−アシル基、特に−NH
−アセチル基又はNH_2基で置換されたGAG、前記
GAGのフラクション及びフラグメント、 動物器官の処理により得られるGAGの組成に対応する
所謂全GAG、 から選択されることを特徴とする特許請求の範囲第4項
に記載の方法。 (6)出発時のGAGがD−ガラクトサミン−ウロン酸
交互モチーフを主体とすることを特徴とする特許請求の
範囲第1項に記載の方法。 (7)出発時のGAGがデルマタン硫酸、コンドロイチ
ン、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸、それらのフ
ラクション及びフラグメントから選択されることを特徴
とする特許請求の範囲第6項に記載の方法。 (8)使用されるGAGのグリコシド鎖の糖モチーフの
1又は数個の第一又は第二−OH基が保護基により保護
されていることを特徴とする特許請求の範囲第1項から
第7項のいずれかに記載の方法。 (9)出発時のGAGが重合度に関して均一であり、こ
れらのGAGが例えば該GAGの脱重合混合物をゲル上
でろ過することにより得られることを特徴とする特許請
求の範囲第6項又は第7項に記載の方法。 (10)使用されるGAGの塩がアミン塩であることを
特徴とする特許請求の範囲第1項から第9項のいずれか
に記載の方法。 (11)前記アミン塩が、式−N(R_1、R_2、R
_3)(式中、R_1、R_2及び/又はR_3は水素
原子、又は1〜10個の炭素原子を有する脂肪族鎖)で
表されるアミンの塩の群、特にトリエチルアミン又はト
リブチルアミン或いは第四級アンモニウム塩から選択さ
れることを特徴とする特許請求の範囲第10項に記載の
方法。 (12)使用されるGAGの塩が、酸性イオンの交換樹
脂を使用することにより得られた酸形態のGAGを、形
成しようとする塩に対応するアミンの作用下におくこと
により得られることを特徴とする特許請求の範囲第1項
から第11項のいずれかに記載の方法。 (13)ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド
又はピリジンから選択された有機溶媒中にGAGの塩を
溶解させることを特徴とする特許請求の範囲第1項から
第12項のいずれかに記載の方法。 (14)硫酸化剤が、無水硫酸SO_3とトリメチルア
ミン(TMA)又はピリジンのような有機塩基との複合
体、或いはクロロスルホン酸とピリジンとの複合体であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第1項から第13項
のいずれかに記載の方法。 (15)GAGのOH当量当たり1〜5倍当量の複合体
を使用することを特徴とする特許請求の範囲第14項に
記載の方法。 (16)0℃〜100℃程度、又は20℃以上の温度で
約10〜14時間硫酸化反応を実施することを特徴とす
る特許請求の範囲第1項から第15項のいずれかに記載
の方法。 (17)硫酸化段階後に、水酸基の−O−アシル及び−
O−ベンゾイル保護基を夫々鹸化又は接触還元により離
脱することを特徴とする特許請求の範囲第1項又は第1
4項に記載の方法。 (18)得られた硫酸GAGを回収し、重合度に関して
均一のGAGを得るべくゲルろ過処理することを特徴と
する特許請求の範囲第1項から第17項のいずれかに記
載の方法。 (19)重合度に関する均一又は混合形態の硫酸化修飾
形GAGであって、下式 I : R−(XY)_n−R′ (式中、Rはウロン酸又は不飽和ウロン酸又はOH基で
あり、Xは2位の炭素がNHSO_3基により置換され
、グルコサミン及びヘパリン型の鎖の場合にはNH_2
又はNH−アシル基により置換されたグルコサミン又は
ガラクトサミンであり、Yはウロン酸即ちD−グルクロ
ン酸又はL−イズロン酸であり、nは0〜80の整数で
あり、R′は2位の炭素がNHSO_3^−基により置
換され、グルコサミン及びヘパリン型の鎖の場合にはN
H_2又はNH−アシル基により置換されたグルコサミ
ン又はガラクトサミン、或いは−OH基、或いは2,5
−アンヒドロマンノ構造の基に転位したグルコサミンモ
チーフ、或いは2,5−アンヒドロヘキシトール構造の
基に転位したガラクトサミンモチーフであり、X及びY
及び場合によってはR及びR′のモチーフの第一又は第
二OH基は、GAGの鎖における硫酸基の位置及び/又
は数が対応するGAGの天然又は脱重合鎖における位置
及び/又は数と異なるように硫酸化されている)又は薬
理的に許容可能なそれらの塩(但し、合計8〜30個の
グルコサミン−ウロン酸モチーフを有する非修飾末端鎖
の混合物を除く)に対応することを特徴とするGAG。 (20)下式II: ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、R_1はH又はSO_3^−であり、R_2は
H、SO_3^−又はアシル基、特にアセチル基であり
、R及びR′は上記と同義である)に対応することを特
徴とする特許請求の範囲第19項に記載の生成物。 (21)X及び場合によってはR′がガラクトサミンモ
チーフであり、ガラクトサミン−ウロン酸モチーフ間の
結合が1→4β、D型であり、場合によって存在するウ
ロン酸−ガラクトサミンモチーフ間の結合が1→3α、
L型又は1→3β、D型であることを特徴とする特許請
求の範囲第19項に記載のGAG。 (22)糖モチーフ数が12以下であることを特徴とす
る特許請求の範囲第19項から第21項のいずれかに記
載のGAG。 (23)Rが不飽和ウロン酸であることを特徴とする特
許請求の範囲第22項に記載のGAG。 (24)R′が2,5−アンヒドロマンノ構造の基であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第22項に記載のG
AG。 (25)R′が2,5−アンヒドロマンニトール構造の
基であることを特徴とする特許請求の範囲第24項に記
載のGAG。 (26)4又は6個の糖モチーフから成る鎖を有する重
合度に関して均一のGAGの集合から構成されているこ
とを特徴とする特許請求の範囲第22項に記載のGAG
。 (27)R及びR′が同時にOHであるか又は夫々ウロ
ン酸及びグルコサミンであることを特徴とする特許請求
の範囲第26項に記載のGAG。 (28)R′が2,5−アンヒドロヘキシトール構造の
基であることを特徴とする特許請求の範囲第26項に記
載のGAG。 (29)R′が2,5−アンヒドロマンニトール構造の
基であることを特徴とする特許請求の範囲第28項に記
載のGAG。 (30)8、10又は12個の糖モチーフから成る鎖を
有するGAGの均一集合から構成されていることを特徴
とする特許請求の範囲第22項に記載のGAG。 (31)上記式 I (式中、nは3〜15の整数、R及
び/又はR′は修飾された糖モチーフである)に対応す
る鎖混合物を含んでいることを特徴とする特許請求の範
囲第19項に記載のGAG。 (32)亜硝酸による脱重合によって得られ、分子量2
000〜8000程度の2,5−アンヒドロマンノ、特
に2,5−アンヒドロマンニトール末端モチーフを有す
る鎖混合物から形成されており、Yin−Wessle
r/USP比が少なくとも3でありYin−Wessl
er値が少なくとも200u/mgであり且つ平均分子
量が2000〜3000であるようなムコ多糖から構成
される出発物質から製造されることを特徴とする特許請
求の範囲第31項に記載のGAG。 (33)亜硝酸による脱重合によって得られ、2,5−
アンヒドロマンノ、特に2,5−アンヒドロマンニトー
ル末端モチーフを有する鎖混合物から形成されており、
Yin−Wessler/USPが約3〜6であり且つ
平均分子量が4000〜5000であるムコ多糖から構
成される出発物質から製造されることを特徴とする特許
請求の範囲第31項に記載のGAG。 (34)グルコサミンの2位の炭素がNH_2又はNH
−アシル、特にNH−アセチル基により置換されている
ことを特徴とする特許請求の範囲第31項に記載のGA
G。 (35)30個より多い糖モチーフ数を含んでいること
を特徴とする特許請求の範囲第19項に記載のGAG。 (36)ヘパリンを除く過硫酸化天然物質であることを
特徴とする特許請求の範囲第35項に記載のGAG。 (37)グルコサミンの2位の炭素がNH_2又はNH
−アシル、特にNH−アセチル基により置換されている
ことを特徴とする特許請求の範囲第36項に記載のGA
G。 (38)特許請求の範囲第19項に記載の少なくとも1
個の硫酸化修飾形GAGから構成されることを特徴とす
る医薬活性成分。 (39)特許請求の範囲第19項から第37項のいずれ
かに記載の少なくとも1個の有効量のGAGを薬学的賦
形剤と共に含有していることを特徴とする製剤組成物。 (40)1〜100mgのGAG、好ましくは皮下注射
用として使用する場合には20〜80mg/ml、静脈
内注射又は潅注用として使用する場合には30〜60m
g/mlのGAGを含有する注射可能な無菌溶液の形態
であることを特徴とする特許請求の範囲第39項に記載
の組成物。 (41)胃抵抗性カプセル、錠剤、ピル又はリポソーム
のような経口投与可能な形態であることを特徴とする特
許請求の範囲第39項に記載の組成物。 (42)坐薬形態であることを特徴とする特許請求の範
囲第39項に記載の組成物。 (43)特許請求の範囲第19項から第37項のいずれ
かに記載の硫酸化修飾形態のGAGを含有していること
を特徴とする生物学的試薬。
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JP61163491A Pending JPS6227402A (ja) | 1985-07-12 | 1986-07-11 | グリコサミノグリカンの硫酸化方法、該方法によつて得られる新規グリコサミノグリカン及びその生物学的適用 |
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Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6236394A (ja) * | 1985-08-01 | 1987-02-17 | ユニリ−バ−・ナ−ムロ−ゼ・ベンノ−トシヤ−プ | オリゴ糖 |
JPH05506431A (ja) * | 1990-02-14 | 1993-09-22 | アメリカ合衆国 | リューマチ疾患治療のためのスラミンの使用 |
JP2005504067A (ja) * | 2001-08-31 | 2005-02-10 | イヴァックス リサーチ インコーポレイテッド | サッカライド硫酸化方法 |
JP2005220347A (ja) * | 2004-02-04 | 2005-08-18 | Syntex Sa | 局所的送達の治療用抗血栓剤として有用なトリエタノールアミンを伴う低分子量ヘパリン塩、それらの調製方法、ヘパリン塩の吸湿性を除去するためのプロセス、抗血栓療法における局所的使用のための薬学組成物及びそれにおける使用 |
JP2005344073A (ja) * | 2004-06-07 | 2005-12-15 | Maruho Co Ltd | 多硫酸化コンドロイチン硫酸の製造方法 |
JP2006517185A (ja) * | 2002-10-10 | 2006-07-20 | アベンティス・ファーマ・ソシエテ・アノニム | ヘパリン誘導多糖類混合物、その製造およびそれを含有する医薬組成物 |
JP2007262426A (ja) * | 1994-03-23 | 2007-10-11 | Fidia Farmaceutici Spa | 新規なヘパリン様硫酸化多糖類 |
WO2016159296A1 (ja) * | 2015-03-31 | 2016-10-06 | 生化学工業株式会社 | グリコサミノグリカンの硫酸化方法 |
JP2017165681A (ja) * | 2016-03-16 | 2017-09-21 | 地方独立行政法人青森県産業技術センター | 多硫酸化プロテオグリカン |
Families Citing this family (59)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0300099A1 (en) * | 1987-07-20 | 1989-01-25 | Akzo N.V. | New pentasaccharides |
EP0333243A3 (en) * | 1988-03-10 | 1989-09-27 | Akzo N.V. | Sulphated k5 antigen and sulphated k5 antigen fragments |
FR2634485B1 (fr) * | 1988-07-21 | 1992-02-28 | Sanopi | Glycosaminoglycanes selectivement o-acyles, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant |
US5340932A (en) * | 1989-08-18 | 1994-08-23 | Ajorca S.A. | Substances with heparin-like structure and their method of production |
ATE98656T1 (de) * | 1989-10-04 | 1994-01-15 | Akzo Nv | Sulfatierte glykosaminoglykuronane mit antithrombotischer wirkung. |
IT1237518B (it) * | 1989-11-24 | 1993-06-08 | Renato Conti | Eparine supersolfatate |
FR2655267B1 (fr) * | 1989-12-04 | 1992-04-03 | Roussel Uclaf | Nouveau derive sulfate du galactanne extrait de klebsiella, procede de preparation, application a titre de medicaments et compositions pharmaceutiques le renfermant. |
AU7742591A (en) * | 1990-04-06 | 1991-10-30 | Washington University | Anticoagulant oligosaccharides |
FR2669932B1 (fr) * | 1990-12-03 | 1994-07-01 | Sanofi Sa | Nouvel heparosane-n,o-sulfate, son procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui le contiennent. |
SE9101155D0 (sv) * | 1991-04-18 | 1991-04-18 | Kabi Pharmacia Ab | Novel heparin derivatives |
US5605938A (en) * | 1991-05-31 | 1997-02-25 | Gliatech, Inc. | Methods and compositions for inhibition of cell invasion and fibrosis using dextran sulfate |
US5705178A (en) * | 1991-05-31 | 1998-01-06 | Gliatech, Inc. | Methods and compositions based on inhibition of cell invasion and fibrosis by anionic polymers |
IT1251183B (it) * | 1991-08-28 | 1995-05-04 | Opocrin Spa | Dermatan solfato ad alto titolo, dotato di elevata attivita' trombolitica, e forme farmaceutiche che lo contengono. |
AU2865692A (en) * | 1991-10-04 | 1993-05-03 | Virginia Commonwealth University | Von willebrand factor-specific heparin fractions |
US5714376A (en) * | 1991-10-23 | 1998-02-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Heparinase gene from flavobacterium heparinum |
FR2684385B1 (fr) * | 1991-11-28 | 1997-08-01 | Sanofi Elf | Heparosanes-n,o-sulfates de haute masse moleculaire, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent. |
GB2266239B (en) * | 1992-03-25 | 1996-03-06 | Jevco Ltd | Wound healing compositions containing chondroitin sulphate oligosaccharides |
US5346997A (en) * | 1992-08-26 | 1994-09-13 | Murphy James G | Agents for complexing sodium under biological conditions |
AU4859793A (en) * | 1992-09-11 | 1994-04-12 | Regents Of The University Of California, The | Sulfated ligands for l-selectins and use of chlorates and or sulfatases for the treatment of inflammation |
US5695752A (en) * | 1992-09-11 | 1997-12-09 | The Regents Of The University Of California | Treating inflammation via the administration of specific sulfatase enzymes and/or sulfation inhibitor |
US5389539A (en) | 1992-11-30 | 1995-02-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Purification of heparinase I, II, and III from Flavobacterium heparinum |
AU7205894A (en) * | 1993-06-08 | 1995-01-03 | Neogenix, Inc. | Purified natural and synthetic compounds for the treatment of osteoarthritis |
SG67928A1 (en) * | 1993-09-30 | 1999-10-19 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Antithrombotic |
US5514665A (en) * | 1993-12-30 | 1996-05-07 | University Of British Columbia | Method of preventing or reducing the risk of infection by bacterial pathogens utilizing simple and conjugated dextrans |
US5639469A (en) * | 1994-06-15 | 1997-06-17 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Transmucosal delivery system |
HU218600B (hu) * | 1994-07-01 | 2000-10-28 | Seikagaku Corporation | Eljárás deszulfatált poliszacharid előállítására, deszulfatált heparin alkalmazása gyógyászati készítmény előállítására |
FR2729575B1 (fr) * | 1995-01-24 | 1997-07-04 | Elf Aquitaine | Dispositif d'ionophorese pour l'administration transcutanee d'un principe actif de type glycosaminoglycane anionique de basse masse moleculaire |
DE69621528T2 (de) * | 1995-02-07 | 2003-01-16 | Shiseido Co. Ltd., Tokio/Tokyo | Anti-inflamatorische agenzien |
US5744457A (en) * | 1995-03-31 | 1998-04-28 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Compositions and methods for inhibiting thrombogenesis |
US6001820A (en) * | 1995-03-31 | 1999-12-14 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Compositions and methods for inhibiting thrombogenesis |
US5763427A (en) * | 1995-03-31 | 1998-06-09 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Compositions and methods for inhibiting thrombogenesis |
US5646130A (en) * | 1995-06-30 | 1997-07-08 | Ocean University Of Oingdao | Low molecular weight sulfated polysaccharides and uses thereof |
US5980865A (en) * | 1995-08-18 | 1999-11-09 | Baker Norton Pharmaceuticals, Inc. | Method for treating late phase allergic reactions and inflammatory diseases |
CA2230385A1 (en) * | 1995-09-05 | 1997-03-13 | Cambridge Neuroscience, Inc. | Analogs for specific oliogosaccharide-neuregulin interactions and uses thereof |
US5922690A (en) * | 1996-04-25 | 1999-07-13 | Van Gorp; Cornelius L. | Dermatan disulfate, an inhibitor of thrombin generation and activation |
US5767269A (en) * | 1996-10-01 | 1998-06-16 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Processes for the preparation of low-affinity, low molecular weight heparins useful as antithrombotics |
IT1289613B1 (it) * | 1997-02-07 | 1998-10-15 | Inalco Spa | Polisaccaridi batterici o-solfatati |
IT1290814B1 (it) * | 1997-03-24 | 1998-12-11 | Istituto Scient Di Chimica E B | Glicosaminoglicani aventi elevata attivita' antitrombotica |
DE19813234A1 (de) * | 1998-03-26 | 1999-09-30 | Knoell Hans Forschung Ev | Verfahren zur Herstellung hochsulfatierter Hyaluronsäuren |
US6388060B1 (en) * | 1998-11-06 | 2002-05-14 | Vascular Therapeutics Inc. | Process for the sulfation of uronic acid-containing polysaccharides |
DE29900874U1 (de) * | 1999-01-20 | 1999-07-22 | Knoll AG, 67061 Ludwigshafen | Organprotektive Lösungen |
US6409987B1 (en) | 1999-04-07 | 2002-06-25 | Intimax Corporation | Targeted agents useful for diagnostic and therapeutic applications |
IT1306644B1 (it) | 1999-04-08 | 2001-10-02 | Fidia Advanced Biopolymers Srl | Strutture tridimensionali comprendenti derivati dell'acido ialuronicoottenibili mediante la tecnica antisolvente supercritico. |
JP2003504428A (ja) * | 1999-06-30 | 2003-02-04 | ハミルトン シビック ホスピタルズ リサーチ ディベロップメント インコーポレイテッド | クロット関連凝固因子を阻害するヘパリン組成物 |
US6518244B2 (en) | 2000-03-09 | 2003-02-11 | Intimax Corporation | Combinations of heparin cofactor II agonist and platelet IIb/IIIa antagonist, and uses thereof |
BR0113886A (pt) * | 2000-09-08 | 2003-07-15 | Hamilton Civic Hospitals Res | Composição, composição farmacêutica, tratamento de combinação para prevenir ou inibir a geração ou atividade de trombina num paciente, método para inibir ou prevenir a geração ou atividade de trombina num paciente, uso de uma composição ou tratamento de combinação, uso de uma composição, uso e kit |
DE60138115D1 (de) * | 2000-09-12 | 2009-05-07 | Massachusetts Inst Technology | Verfahren und produkte, die mit niedermolekularem heparin assoziiert sind |
DE10053053A1 (de) * | 2000-10-19 | 2002-05-16 | Knoell Hans Forschung Ev | Pharmazeutische Formulierungen zur Hemmung von entzündlichen Arthritiden |
JP4828795B2 (ja) * | 2002-03-11 | 2011-11-30 | モメンタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 硫酸化多糖類の分析 |
US20060183712A1 (en) * | 2005-02-17 | 2006-08-17 | The Texas A&M University System | Affinity purified heparin/heparan sulfate for controlling the biological activity of the FGF receptor |
ATE552004T1 (de) | 2005-11-30 | 2012-04-15 | Istituto G Ronzoni | Oral verabreichbare heparinderivate |
US9139876B1 (en) | 2007-05-03 | 2015-09-22 | Momenta Pharmacueticals, Inc. | Method of analyzing a preparation of a low molecular weight heparin |
CN102177180A (zh) | 2008-04-04 | 2011-09-07 | 犹他州大学研究基金会 | 烷基化半合成的糖胺聚糖醚及其制备和使用方法 |
EP2526122B1 (en) * | 2010-01-19 | 2020-06-10 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Evaluating heparin preparations |
WO2012115952A1 (en) | 2011-02-21 | 2012-08-30 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Evaluating heparin preparations |
JP6062917B2 (ja) | 2011-03-23 | 2017-01-18 | ザ ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデイション | 泌尿器科の炎症の治療及び予防の方法 |
EP2981556A4 (en) | 2013-04-02 | 2016-11-30 | Univ California | HYALURONIC ACID BIOPOLYMERS ETHYLSULFONATED AND METHODS OF USE |
WO2018053111A1 (en) | 2016-09-15 | 2018-03-22 | University Of Utah Research Foundation | In situ gelling compositions for the treatment or prevention of inflammation and tissue damage |
CN111228653A (zh) | 2018-11-13 | 2020-06-05 | 格莱科米拉治疗公司 | 用电离辐射加强癌症治疗的方法 |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB904112A (en) * | 1958-12-19 | 1962-08-22 | Roussel Uclaf | Improvements in or relating to heparine and derivatives thereof |
NL123338C (ja) * | 1961-12-08 | |||
US3211616A (en) * | 1961-12-17 | 1965-10-12 | Yosizawa Zensakn | N, o-sulfated neutral-mucopolysaccharide |
US4021544A (en) * | 1976-07-12 | 1977-05-03 | American Cyanamid Company | Complement inhibitors |
FR2374910A1 (fr) * | 1976-10-23 | 1978-07-21 | Choay Sa | Preparation a base d'heparine, comprenant des liposomes, procede pour l'obtenir et medicaments contenant de telles preparations |
IT1083903B (it) * | 1977-08-09 | 1985-05-25 | Lobo Srl | Oligo-eteropolisaccaridi con attivita' eparinosimili,procedimento per il loro ottenimento e relative composizioni terapeutiche |
DD136572B1 (de) * | 1977-10-06 | 1980-12-24 | Horst Toepfer | Verfahren zur herstellung eines therapeutisch wirksamen mukopolysaccaridpolyschwefelsaeureesters aus rinder-trachea |
SE7811306L (sv) * | 1978-11-01 | 1980-05-02 | Rothman Gunnvor | Antikoagulationsmedel samt sett for dess framstellning |
US4500519A (en) * | 1978-11-06 | 1985-02-19 | Choay S.A. | Mucopolysaccharides having biological properties, preparation and method of use |
US4692435A (en) * | 1978-11-06 | 1987-09-08 | Choay, S.A. | Mucopolysaccharide composition having a regulatory action on coagulation, medicament containing same and process of preparation |
US4281108A (en) * | 1980-01-28 | 1981-07-28 | Hepar Industries, Inc. | Process for obtaining low molecular weight heparins endowed with elevated pharmacological properties, and product so obtained |
FR2482611B1 (fr) * | 1980-05-14 | 1986-03-07 | Pharmindustrie | Nouveaux polysaccharides sulfates, procedes pour leur preparation et leur utilisation comme medicaments |
DE3020220A1 (de) * | 1980-05-28 | 1981-12-03 | Theodor Prof. Dr. 4400 Münster Eckert | Organische salze des heparin, der heparinoide, ihre herstellung und sie enthaltende arzneimittel |
DE3049445A1 (de) * | 1980-12-30 | 1982-07-29 | Theodor Prof. Dr. 4400 Münster Eckert | "organische salze des heparin, der heparinoide, ihre herstellung und sie enthaltende arzneimittel" |
FR2504928A1 (fr) * | 1981-04-29 | 1982-11-05 | Choay Sa | Oligosaccharides a chaines courtes possedant des proprietes biologiques, leur preparation et leurs applications en tant que medicaments |
SU981322A1 (ru) * | 1981-05-08 | 1982-12-15 | Московский Ордена Трудового Красного Знамени Текстильный Институт Им.А.Н.Косыгина | Способ получени водорастворимого линейного полисахарида |
FR2555993B1 (fr) * | 1983-12-06 | 1986-11-07 | Anic Spa | Chitosanes 6-sulfates et procede pour leur preparation |
FR2538404B1 (ja) * | 1982-12-28 | 1985-08-23 | Anic Spa | |
IL70511A (en) * | 1982-12-28 | 1990-01-18 | Anic Spa | Process for the concurrent depolymerization and sulfation of polysaccharides at hydroxyl groups |
US4710493A (en) * | 1984-08-14 | 1987-12-01 | Albert Landsberger | Therapeutic agent for the use in cancer treatment |
-
1985
- 1985-07-12 FR FR8510787A patent/FR2584728B1/fr not_active Expired
-
1986
- 1986-07-11 GR GR861811A patent/GR861811B/el unknown
- 1986-07-11 EP EP86401563A patent/EP0214879B1/fr not_active Expired - Lifetime
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- 1986-07-11 PT PT82974A patent/PT82974B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-07-11 AU AU60099/86A patent/AU607395B2/en not_active Ceased
- 1986-07-11 DE DE8686401563T patent/DE3675717D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-11 DK DK329886A patent/DK329886A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-07-12 ES ES8601185A patent/ES2001542A6/es not_active Expired
- 1986-07-14 ZA ZA865240A patent/ZA865240B/xx unknown
- 1986-07-14 NZ NZ216835A patent/NZ216835A/xx unknown
Cited By (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6236394A (ja) * | 1985-08-01 | 1987-02-17 | ユニリ−バ−・ナ−ムロ−ゼ・ベンノ−トシヤ−プ | オリゴ糖 |
JPH05506431A (ja) * | 1990-02-14 | 1993-09-22 | アメリカ合衆国 | リューマチ疾患治療のためのスラミンの使用 |
JP2007262426A (ja) * | 1994-03-23 | 2007-10-11 | Fidia Farmaceutici Spa | 新規なヘパリン様硫酸化多糖類 |
JP2005504067A (ja) * | 2001-08-31 | 2005-02-10 | イヴァックス リサーチ インコーポレイテッド | サッカライド硫酸化方法 |
JP2012051926A (ja) * | 2002-10-10 | 2012-03-15 | Aventis Pharma Sa | ヘパリン誘導多糖類混合物、その製造およびそれを含有する医薬組成物 |
JP2006517185A (ja) * | 2002-10-10 | 2006-07-20 | アベンティス・ファーマ・ソシエテ・アノニム | ヘパリン誘導多糖類混合物、その製造およびそれを含有する医薬組成物 |
JP4607575B2 (ja) * | 2004-02-04 | 2011-01-05 | シンテックス ソシエダ アノニマ | 局所的送達の治療用抗血栓剤として有用なトリエタノールアミンを伴う低分子量ヘパリン塩、それらの調製方法、ヘパリン塩の吸湿性を除去するためのプロセス、抗血栓療法における局所的使用のための薬学組成物及びそれにおける使用 |
JP2005220347A (ja) * | 2004-02-04 | 2005-08-18 | Syntex Sa | 局所的送達の治療用抗血栓剤として有用なトリエタノールアミンを伴う低分子量ヘパリン塩、それらの調製方法、ヘパリン塩の吸湿性を除去するためのプロセス、抗血栓療法における局所的使用のための薬学組成物及びそれにおける使用 |
JP2005344073A (ja) * | 2004-06-07 | 2005-12-15 | Maruho Co Ltd | 多硫酸化コンドロイチン硫酸の製造方法 |
JP4636818B2 (ja) * | 2004-06-07 | 2011-02-23 | マルホ株式会社 | 多硫酸化コンドロイチン硫酸の製造方法 |
WO2016159296A1 (ja) * | 2015-03-31 | 2016-10-06 | 生化学工業株式会社 | グリコサミノグリカンの硫酸化方法 |
JP6063103B1 (ja) * | 2015-03-31 | 2017-01-18 | 生化学工業株式会社 | グリコサミノグリカンの硫酸化方法 |
JP2017048404A (ja) * | 2015-03-31 | 2017-03-09 | 生化学工業株式会社 | グリコサミノグリカンの硫酸化方法 |
US10259889B2 (en) | 2015-03-31 | 2019-04-16 | Seikagaku Corporation | Method for sulfating glycosaminoglycan |
JP2017165681A (ja) * | 2016-03-16 | 2017-09-21 | 地方独立行政法人青森県産業技術センター | 多硫酸化プロテオグリカン |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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