PT91249B - Processo para a preparacao de glicosaminoglicanos selectivamente o-acilados - Google Patents

Description

MEMORIA descritiva presente invento refere-se ao processo de preparação de glicosaminoglicanos selectivamente 0-acilados, assim como ao processo de preparação de composiçães farmacêuticas que os contenham e à sua utilização na terapêutica.

Pelo termo glicosaminoglicanos compreende-se as substári cias constituídas por encadeamentos de ácidos urónicos (ácido D-glucorónico ou ácido L-idurónico) e de açúcares aminados, sendo, estes últimos, glucosaminas ou galactosaminas.

Ds glicosaminoglicanos de origem natural são constituídos por misturas mais ou menos homogéneas de cadeias de unidades dissacáridas, formadas por uma subunidade urónica (ácido glucorónico ou ácido idurónico) e por uma subunidade osamina (glucosamina ou galactosamina), unidas por uma ligação 1 —*4 ou 1 —^>3.

Nos glicosaminoglicanos, os grupos hidroxilo estão diversamente substituídos por grupos funcionais, em particular por grjj pos sulfato, estando os grupos aminados das osaminas substituídos por grupos sulfato e/ou acetilo.

Os glicosaminoglicanos aqui considerados compreendem 6 ti pos de produto: heparina, heparano-sulfato, condroitina-sulfato A, condroitina-sulfato C, condroitina-sulfato B, mais precisamente denominada dermatana-sulfato, e ácido hialurónico. São caracte rizados pelas duas estruturas dissacáridas de base (A) θ (θ) seguintes:

n

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-4em que R é um grupo SO^- e/ou um grupo acetilo, e o sinal j indi ca que o grupo carboxílico se pode encontrar abaixo do plano do ciclo (unidade idurónica) ou acima do plano do ciclo (unidade gl_u corónica), e

(B)

Os glicosaminoglicanos tendo a estrutura de base (A), ac_i ma, são denominados glicosaminoglicanos (GAGs) do tipo heparínico, e compreendem as heparinas e os heparano-sulfatos, e os glicosami. noglicanos tendo a estrutura de base (θ), acima, são denominados GAGs do tipo condroitina-sulfato, e compreendem as condroitinas-sulfatos A e C e a dermatana-sulfato.

D ácido hialurónico tem a estrutura de base (B), na qual a galactosamina é substituída por uma glucosamina.

Tal como mencionado acima, quer nos GAGs do tipo heparínico quer nos GAGs do tipo condroitina-sulfato, uma percentagem mais ou menos elevada dos grupos hidroxilo das n unidades dissacá ridas está presente sob a forma de ésteres do ácido sulfúrico.

Deste modo, a heparina pode ser representada pela estrutu ra de base (A), acima, na qual n pode variar de 1 a 80, sendo R, na maioria das n unidades, um grupo SQ^ e, no resto dos casos, um grupo acetilo; os grupos OH na posição 6 da glucosamina e na posição 2 do ácido urónico são, na maioria das espécies, sulfatados, enquanto que o grupo OH na posição 3 da glucosamina não é sulfatado senão numa minoria das espécies; o OH na posição 3 do ácido urónico ô praticamente não sulfatado, sendo o referido ácido

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urónico, na maioria das espécies, um ácido idurónico.

Os produtos tendo a estrutura de base (A) compreendem igualmente a heparina N-des-sulfatada N-acetilada, que pode ser preparada como descrito em Nagasau/a, K. e Inoue, Y. , Methods in Carbohydrate Chemistry, Academic Press, 1980, vol, 8, págs. 291-294. Esta heparina é representada pela fórmula (A), na qual R é um grupo acetilo.

A heparina compreende igualmente espécies tendo a estrutjj ra (A), com n variável de 3 a 15, e o mesmo perfil químico. As referidas espécies podem ser isoladas por fraccionamento segundo métodos conhecidos (por exemplo, US 4 692 435), e s3o denominadas heparinas de baixo peso molecular (b.p.m.).

Heparinas b.p.m., apresentando distribuição molecular e propriedades biológicas essencialmente idênticas às das heparinas b.p.m. obtidas por f raccionamento, foram preparadas por fragmentjj ção da heparina segundo os métodos seguintes:

- método de despolimerização nitrosa e redução (por exemplo, EP 37 319 ou US 4 686 288), que corta a molécula atacando as subunidades de N-sulfato de glucosamina para originar uma termina ção 2,5-anidromanitol ch₂oh

(A') eventualmente sulfatada no hidroxilo primário na posição 6;

- método de despolimerização enzimática (por exemplo, EP 244 235 e 244 236) ou alcalina (por exemplo, EP 40 144), que corta a molécula atacando as subunidades urónicas para originar uma terminação de ácido urónico <X - β insaturado

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eventualmente sulfatada em 2;

- método de despolimerização oxidativa (por exemplo, US 4 281 108 e EP 121 067), que corta a molécula por oxidação, conservando as terminaçães naturais”.

Outras heparinas b.p.m., que apresentam uma distribuição molecular diferente daquela da heparina natural e propriedades biológicas particulares, podem ser preparadas por oxidação periódica da heparina natural, seguida de despolimerização por p -eliminação ou hidrólise ácida. A oxidação periódica corta os motivos de ácido urónico não sulfatados entre os carbonos nas posiçóes 2 e 3. Sabe-se que esses motivos estão presentes no sítio de com binação à antitrombina III (AT III), inibidor plasmático de dive^ sas proteases séricas da coagulação, e cuja actividade é fortemeri te aumentada pela heparina agindo como co-factor. A oxidação periódica permite, portanto, obter produtos desprovidos do sítio de ligação à AT III e, por conseguinte, essencialmente desprovidos de actividade anticoagulante.

As heparinas b.p.m. deste tipo podem ser obtidas, particu larmente, aplicando o processo que compreende as etapas seguintes:

- a oxidação conseguida da heparina, realizada por reacção da heparina, em solução aquosa numa concentração final de 0,5 a 5% (p/v), com um sal do ácido periódico, numa concentração final de 0,5 a 1% (p/v), a um pH situado entre 4,5 e 6,5, de preferência a um pH de 5, a uma temperatura de 0 a ÍOSO, durante cerca de 15 a 48 horas, ao abrigo da luz;

- a despolimerização das cadeias de heparina obtidas, por adição de uma base forte, tal como soda, a um pH superior a cerca

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-7de 11, particularmente compreendido entre 11 e 12, vantajosamente de 11,2 a 11,6, de preferência na proximidade de 11,5;

- a reduç3o dos fragmentos de despolimerização, com o auxílio dum agente redutor e após eliminação, sendo caso disso, do agente redutor que não reagiu;

- a recuperaç3o dos fragmentos de heparina reduzidos, por precipitação por meio de um solvente no qual eles são insolúveis;

- o isolamento dos fragmentos desejados por fraccionamento por meio de álcool, em presença de um sal mineral, de uma sol_u ção aquosa obtida ao colocar em solução em água o precipitado anteriormente isolado e ao recuperar o precipitado formado.

Estas heparinas b.p.m. correspondem à fórmula (C), abaixo:

(C) em que n pode variar de 6 a 15, R é em cerca de, pelo menos, 90% das n unidades, um grupo S0^ e, no resto dos casos, um grupo acetilo, os grupos OH na posição 3 da glucosamina podem ser sulfatados e os grupos OH na posição 6 da glucosamina são sulfatados em 70% das espécies. Alám disso, na proporção de 1 motivo para 2 ca deias, pelo menos, desta heparina b.p.m., o ácido idurónico está substituído por um motivo de ácido urónico (D-glucorónico ou L-idurónico) não sulfatado aberto entre os carbonos nas posiçães 2 e 3, da fórmula seguinte:

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0397 W •y

CH₂0H

Estas heparinas b.p.m. podem ainda ser fraccionadas por filtração em gel, de acordo com técnicas conhecidas, a fim de obter misturas de fragmentos homogéneos em relação às suas massas moleculares, desprovidos do sítio de ligação à AT III.

Outros glicosaminoglicanos do tipo heparínico são constituídos por GAGs de fórmula (A) ou (C), nos quais a função carbox_í lica suportada pelo ácido urónico está esterificada, por exemplo, por condensação de um álcool em presença de um agente de condensa ção do tipo carbodiimida, como descrito na patente FR nS.

159 724, ou ainda, por alquilação do carboxilo por meio de um haleto de alquilo em presença de uma base fraca.

Da mesma forma, os glicosaminoglicanos do tipo condroitina -sulfato são constituídos por glicosaminoglicanos de fórmula (8) nos quais as funções carboxílicas dos ácidos urónicos estão esterificadas, por exemplo, por alquilação do carboxilo por meio de um haleto de alquilo em presença de uma base fraca.

A obtenção dos referidos ésteres para o ácido hialurónico está descrita na patente EP n9. 215 453, por tratamento do ácido hialurónico, sob a forma de sal de amónio quaternário, por um álcool em presença de um catalisador ou por um agente de eterificação.

heparano-sulfato está representado pela fórmula (A), acima, na qual n pode variar de 1 a 80, R representa, na maioria das espécies, um grupo acetilo e, numa minoria das espécies, S0^~. Além disso, na grande maioria das espécies, os grupos OH na posição 6 da glucosamina são sulfatados, sendo o ácido urónico, na maioria das espécies, um ácido glucorónico.

As condroitinas-sulfatos A e C estão representadas pela

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-9fórmula (θ), acima, na qual n pode variar de 1 a 80 e, respectiva mente, os grupos 4-OH e 6-OH da glucosamina são sulfatados, sendo o ácido urónico, na maioria das espécies, um ácido glucorónico.

A dermatana-sulfato tem uma estrutura substancialmente idêntica à da condroitina-sulfato A, mas a subunidade de ácido urónico é, na maioria das espécies, um ácido idurónico.

Fragmentos de dermatana-sulfato, correspondendo à fórmula (B), acima, na qual n pode variar de 1 a 20, podem ser obtidos por oxidação periódica seguida de uma redução com boro-hidreto de sódio e de uma hidrólise ácida, tal como descrito em FRANSSON, L. A. θ CARLSTEDT, I., Carbohydr. Res., J6 (1974), 349-358.

Os glicosaminoglicanos possuem numerosas actividades biológicas, entre as quais se podem citar as suas actividades em face dos factores da coagulação, que podem exercer-se por intermédio de diversas proteínas plasmáticas. No que se refere à hepar_i na, é igualmente conhecido na literatura que a heparina ou alguns dos seus derivados, possuindo ou não uma actividade anticoagulante, podem ter uma actividade reguladora da proliferação das células musculares lisas da parede vascular (CUYTON e colab., Circ. Res. , 46. (1980) , 625-634) , ou ainda uma actividade inibitória da heparanase, enzima implicado nos mecanismos de disseminação metas tática (Pedido EP n9. 254 067). Por outro lado, os glicosa^ minoglicanos fazem parte da família mais vasta dos polissacáridos sulfatados, alguns tendo demonstrado, em graus mais ou menos importantes, uma actividade anti-viral (BABA e colab., Antimicrob Agents Chemother, 32 (1988) 337-339) e, em particular, uma activ_i dade anti-HIV (vírus da imunodeficiência humana) (BABA e colab., Proc. Natl. Acad. Sei., 85, (1988) 6132-6136).

No seguimento do texto, utilizar-se-á o termo GAG para designar um glicosaminoglicano, tendo este quer uma estrutura natural tal como obtida por extracção, hBmi-sintese ou síntese, quer uma estrutura quimicamente modificada nos grupos funcionais carboxilo ou aminados, previamente à reacção de acilaçâo origina_n do os GAGs selectivamente 0-acilados.

Apesar das suas actividades farmacológicas de grande in69 648 □ 397 W , .....

-ίο- ' ·:=·teresse, os GAGs naturais apresentam o inconveniente de terem uma semi-vida relativamente curta, obrigando a administrações repetidas. Este inconveniente foi, em parte, ultrapassado pela utiliza^ ção, na prevenção e no tratamento das tromboses venosas, de derivados da heparina de baixa massa molecular, por via sub-cutânea, diminuindo assim a frequência de administração a uma injecção por dia.

Não obstante, é de grande interesse poder dispêr de derivados possuindo uma acção retardada (retard), o que permitiria diminuir ainda a frequência de administração destes produtos, aumentando a sua duração de acção.

Pode, igualmente, ter grande interesse dispêr de derivados retard não anti-coagulantes, tais como os da heparina N-des. -sulfatada N-acetilada, cuja actividade como inibidor da heparana se, enzima implicada nos fenómenos de disseminação metastática, é recordada mais acima.

A literatura descreve numerosos derivados de glicosaminoglicanos modificados de forma a melhorar a sua farmacocinética, particularmente ésteres da função carboxílica dos ácidos urónicos ou das funções hidroxilo.

Utilizou-se, em particular, a esterificaçâo parcial ou to tal das funções carboxilo da heparina, tratada sob a forma de sal de amónio quaternário, num solvente inerte, por um álcool ou um derivado halogenado, em presença, eventual mente, de um agente de condensação (Patentes FR ηδ. N2 159 724 e EP n8. 44 228). Foram igualmente descritos derivados do ácido hialurónico obtidos por esterificaçâo por meio de álcool em presença de um catalisador ou por reacção com um agente de eterificação (Patente EP n9. 216 453)

Por outro lado, foram descritos, na literatura, diferentes meios com vista a esterificar os GAGs nas funções hidroxilo primárias e secundárias.

A publicação Can. □. Res. 25B (1947), 472-476, descreve um derivado acetilado da heparina correspondente a uma mole de grupo acetilo para quatro unidades sacáridas. 0 produto é prepa69 648

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-11- ^r' n ~ rado por acção do ceteno sobro a heparina na acetona. Ainda que nessa publicação esteja especificado que o produto obtido é um d_e riuado 0-acetilado, sabe-se bem que o ceteno em presença de grupos carboxílicos origina anidridos. (cf. 0. March, Advanced 0rganic Chemistry; Reactions, Mechanisms and Structure, 0. Willey & Sons Eds. 1985, págs. 686-687: With ketenes, carboxylic acids give anhydrides and acetics anhydride is prepared industrially in this manner:

CH„ = 0=0+ CH, - COOH -> CH, - C = 0 ^{2 3 3} I

- C0CH₃)

Consequentemente, essa publicação descreve, na realidade, uma heparina na qual os grupos 0-acetilo estão associados a anidridos mistos entre o grupo COO— do ácido urónico e o grupo acet_i lo proveniente do ceteno, o que pode explicar a sua instabilidade na água.

A patente FR 2 100 735 descreve éstBres parciais hidrolisáveis da heparina e de um ácido orgânico não tóxico, nomeadamente o ácido 4-clorofenoxiisobutlrico, o ácido 4-clorofenoxiacético, o ácido eólico, o ácido nicotínico, o ácido piridilacético, o áci do N-oxi-piridilacético ou o ácido linoleico. 0 mótodo de preparação descrito na patente acima, que é caracterizado pela reacção de um sal quaternário da heparina com o ácido activado por uma carbodiimida, origina não apenas o derivado 0-acilado, mas igualmente numa quantidade importante um produto secundário estável sob a forma de um derivado do éster de O-acil-iso-ureia. Por outro lado, um tal tipo de reacção é susceptível de favorecer a obtenção de anidridos e reacçães intramoleculares entre as funçães ácidas e as funçães hidroxilo da heparina.

A patente JP 74/048533 descreve 0-ósteres de condroitina-sulfato com ácidos aromáticos, arilalifáticos ou heterociclicos, eventualmente substituídos, dotados de actividade prolongada. 0 método de preparação descrito neste documento, que é caracterizado pela reacção do ácido condroitino-sulfúrico com um cloreto de ácido, origina, como reacção secundária, uma N-acilação.

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-12A patente W0 83/00150 descreve, de forma geral, pródrogas de medicamentos preparados utilizando as diferentes funções dos GAGs, como o hidroxilo e, de forma especifica, um O-éster da condroitina-sulfato com a penicilina V. A preparação deste produto é efectuada por meio da carbodiimida e compreende, por conseguinte, as reacções secundárias mencionadas acima.

A patente EP 46 828 descreve O-ésteres da heparina com ácidos insaturados, nomeadamente o ácido acrílico ou metacrllico, que, introduzidos em materiais biomédicos, lhes conferem uma act_i vidade antitrombótica de longa duração. Esta introdução é efectua da por ligação covalente ao nível das ligações <X _ p insaturadas destes ésteres com a superfície dos referidos materiais que entram em contacto com o sangue. De acordo com este documento, os 0-ésteres alfa, beta-insaturados são preparados por reacção da he parina com o cloreto ou o anidrido de um ácido carboxilico alfa, beta-insaturado. Além disso, a descrição que indica, indiferent_e mente, a utilização de cloretos ou anidridos dos ácidos alfa, beta-insaturados como reagentes, não especifica quais os tipos de 0-ôsteres da heparina que são obtidos deste modo.

A patente EP 256 880 descreve a esterificação da heparina ou da heparina de baixo peso molecular, por acção de cloretos de ácido em formamida e piridina, a fim de originar derivados com permeabilidade transmembrana aumentada. Ora, este método conduz a derivados que sofrem uma des-sulfatização parcial e são 0- mas igualmente N-acetilados, e nos quais a relação sulfato/carboxilo está alterada.

A patente FR 3 066M descreve a acetilação da N-monometil-heparinamida por acção do anidrido acético em formamida e pirid_i na. 0 produto de partida ô um derivado da heparina cujas funções carboxilo estão substituídas pelas funções amida.

processo utilizado para a acetilação não utiliza um sal solúvel em meio orgânico. Deste modo, a reacção de acetilação não pode ser controlada com precisão e não permite a obtenção senão de um fraco rendimento de acetilação. Além disso, se se apl_i ca o processo descrito à heparina cujas funções carboxilo não es69 648

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-13tão bloqueadas, obtém-se uma formação importante de anidridos mis tos entre os grupos carboxilo da heparina e o anidrido acético, não sendo estes produtos secundários indesejáveis eliminados do meio.

A patente OP 5 128 602 descreve a acilação da heparina por acção de um anidrido de ácido em formamida. No processo utilizado, a heparina não se encontra sob a forma de um sal solúvel em meio orgânico, o que não permite controlar a reacção de acilação com precisão e leva à obtenção de uma taxa de acetilação fraca. Além disso, o processo descrito tem como consequência a presença no meio de anidridos mistos, produtos secundários da reacção.

Seria então interessante dispõr de produtos mais especl f_i cos cujo processo para a obtenção permitisse uma boa reproductib_i lidade.

Descobriu-se agora que fazendo reagir um sal solúvel em meio orgânico de um GAG, tal como um sal de amónio terciário ou quaternário, com um anidrido de um ácido carboxílico, num solvente orgânico aprótico polar, se obtém uma acilação selectiva dos hidroxilos livres, sem alterar os grupos funcionais carboxílicos ou aminados do GAG utilizado. 0 emprego do GAG sob a forma de um sal solúvel em meio orgânico permite, vantajosamente, controlar a reacção de acilação com uma grande precisão. Além disso, a taxa de acilação é facilmente modulada e pode ser elevada sem que isso conduza à alteração do resto da molécula. Particularmente, pode-se obter uma taxa de acilação de 0,1 a 3 grupos acilo por unidade dissacárida e, em particular, de 0,5 a 2 grupos acilo.

Descobriu-se, igualmente, que nenhum derivado N-acilado se forma e que, quando os anidridos se formam ao nível das funções carboxί1icas, a utilização duma base fraca permite facilmente retransformá-los num ácido livre.

De forma vantajosa, a acilação selectiva dos GAGs de acojr do com o processo do invento permite uma modulação das suas actividades biológicas que, em alguns casos, se encontram fortemente aumentadas.

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-14Descobriu-se, finalmente, que os GAGs O-acilados obtidos deste modo tÊm uma actiuidade farmacológica de duração mais longa.

Deste modo, o presente invento tem como objectivo, de acor do com um dos aspectos, glicosaminoglicanos selectivamente O-acilados, correspondendo à fórmula I seguinte:

(I) em que

- G representa um grupo (a) de fórmula:

ou um grupo (a¹) de fórmula:

ou um grupo (b) de fórmula

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-15U representa um grupo (c) de fórmula:

ou um grupo (d) de fórmula:

(d)

ou o resíduo do grupo (c) ou do grupo (d) após oxidação periódica seguida por uma -eliminação ou por uma hidrólise ácida;

- A representa um grupo R·^ , um grupo R^-(c) ou um grupo R^-(d), ou um grupo (e) de fórmula:

ou o residuo do grupo (c) ou do grupo (d) após oxidação periódica seguida por uma p -eliminação ou por uma hidrólise ácida;

- B representa um grupo 0-R^, um grupo (a)-OR^, um grupo (aO-OR^, um grupo (tO-OR^, um grupo (f) de fórmula

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0397 W ou um grupo (f)

(g) da fórmula:

(g)

ou representa um grupo (a), um grupo (a·), ou um grupo (b), aos quais permanece ligado um resíduo de (c) ou de (d) tal como presente após oxidação periódica seguida por uma β -eliminação ou por uma hidrólise ácida;

- representa H, S0^ ou acilo, sendo acilo o residuo de um ácido carboxílico ou dicarboxílico não <X - p> insaturado es colhido entre:

. um grupo alcanoilo de 1 a 18 átomos de carbono;

. um grupo alcanoilo de 2 a 3 átomos de carbono, substituído por

- um grupo cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono,

- um grupo fenilo eventualmente substituído por um ou vários radicais alquilo de 1 a 14 átomos de carbono, átomos de halogénio ou grupos NO2 ou QCH-j,

- um radical hidrocarboneto alifático insaturado de 4 a 16 átomos de carbono;

. um grupo benzoílo eventual mente substituído por um ou vários radicais alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, átomos de halogénio

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-17Cm ou grupos N0₂ ou OCH^;

. um grupo oioloalquilo (C-j γ) carbonilo;

- R₂ representa SO^^- e/ou um radical acetilo, sob a reserva que a proporção de N-acetil glucosamina seja no máximo igual à da heparina quando representa um radical acetilo;

- Rrepresenta um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, de preferência de 1 a 4 átomos de carbono, ou um radical fenil-alquilo de 7 a 12 átomos de carb_o no, ou um catião de metal alcalino ou alcalino-terroso;

- n é um número inteiro de 1 a 80, sendo R^ acilo numa proporção de, pelo menos, 0,1 a 3 grupos acilo por unidade dissacárida, de preferência de 0,5 a 2 grupos acilo e os seus sais fa_r maceuticamente aceitáveis.

Numa concretização preferida do invento, os glicosaminoglicanos escolhidos são glicosaminoglicanos do tipo heparinico, a saber a heparina e os derivados da heparina obtidos quer por fraq cionamento quer por hemi-síntese ou síntese, o heparano-sulfato e os seus derivados obtidos por f raccionamento, hemi-slntese ou siri tese.

□s glicosaminoglicanos deste tipo, selectivamente 0-acilados de acordo com o presente invento, correspondem à fórmula II seguinte:

(n)

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-10em que:

A tem os significados dados mais acima na fórmula (i);

- R^ representa H e/ou SO^ e/ou um grupo acilo tal como definido na fórmula (i);

R₂ representa S0^~ e/ou um radical acetilo, sob a reserva que a proporção de N-acetil glucosamina seja no máximo igual à da heparina quando R^ representa um radical acetilo;

R^ representa um átomo de hidrogénio, um radical alqui_ lo de 1 a 10 átomos de carbono, de preferência de 1 a 4 átomos de carbono, um radical alquilo substituído de 7 a 12 átomos de carbo no, ou um catião de metal alcalino ou alcalino-terroso;

B representa (a)-OR^ ou (f), sendo (a) e (f) tal como definidos na fórmula (i), ou DR^, ou um grupo (a) ao qual permane ce ligado um resíduo de (c) ou de (d) tal como presente após oxidação periódica seguida por uma [3 -eliminação ou por uma hidrólise ácida;

n é um número inteiro de 1 a B0.

Uma família preferida lia de compostos de acordo com o iri vento são compostos de fórmula II:

em que:

- A tem os significados dados mais acima na fórmula I ;

Rj. representa H e/ou SD^ e/ou um grupo acilo tal como definido na fórmula (i);

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-19R₂ representa S0^~ e/ou um radical acetilo, sob a reserva que a proporção de N-acetilglucosamina seja no máximo igual à da heparina quando Rj representa um radical acetilo;

R^ representa um átomo de hidrogénio, um radical alqui lo de 1 a 10 átomos de carbono, de preferência de 1 a 4 átomos de carbono, um radical alquilo substituído de 7 a 12 átomos de carbo no, ou um catião de metal alcalino ou alcalino-terroso;

B representa (a)-OR^ ou (f), sendo (a) e (f) tal como definidos na fórmula (i), ou DR^, ou um grupo (a) ao qual permane ce ligado um resíduo de (c) ou de (d) tal como presente após oxidação periódica seguida por uma β -eliminação ou por uma hidrólise ácida;

n é um número inteiro de 1 a 80, sob a reserva que, quando A representa R^, um grupo R^-(c) ou um grupo R^-(d) e B representa 0-R^, n seja um número inteiro de 1 a 16.

Uma outra família preferida Ilb de compostos de acordo com o invento corresponde a compostos de fórmula II:

(II) em que:

A tem os significados dados mais acima na fórmula I;

R^ representa H e/ou SO^ e/ou um grupo acilo, sendo acilo o resíduo de um ácido carboxílico ou dicarboxílico não o( -/3 insaturado escolhido entre:

. um grupo alcanoilo de 4 a 18 átomos de carbono,

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-2 0. um grupo alcanoilo de 2 ou 3 átomos de carbono, substituído por:

- um grupo cicloalquilo dB 3 a 7 átomos de carbono, um grupo fenilo euentualmente substituído por um ou uários radicais alquilo de 1 a 14 átomos de carbono, átomos de halogénio ou grupos NC^ ou OCH^, um radical hidrocarboneto alifático insaturado de 4 a 16 átomos de carbono, . um grupo benzoílo eventualmente substituído por um ou vários radicais alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, átomos de halogénio ou grupos N0₂ ou OCH^, . um grupo cicloalquilo (C 3-7) carbonilo;

R^ representa S0^ e/ou um radical acetilo, sob a reserva que a proporção de N-acetilglucosamina seja no máximo igual à da heparina quando R^ representa um radical acetilo;

R-j representa um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, de preferência de 1 a 4 átomos de carbono, ou um radical fenil-alquilo de 7 a 12 átomos de carbo no, ou um catião de metal alcalino ou alcalino-terroso;

n é um número inteiro de 1 a 80, sendo R^ acilo numa proporção de, pelo menos, 0,5 a 2 grupos acilo por unidade dissacárida, de preferência 1 grupo acilo.

Compostos vantajosos de acordo com o invento são compostos pertencentes às famílias (lia) e (ilb), nas quais R-j representa um átomo de hidrogénio ou um catiâo de metal alcalino ou alcalino-terroso.

Outros grupos de compostos vantajosos correspondem aos compostos pertencentes às famílias (lia) e (ilb), nas quais R-j re presenta um radical alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, de prefe rência de 1 a 4 átomos de carbono, ou um radical alquilo substituí^ do de 7 a 12 átomos de carbono.

Num aspecto preferido do invento, utilizam-se misturas de fragmentos de heparina tendo uma massa molecular inferior a 10 000 daltons, em particular, quer aqueles tendo uma massa molecular m_é

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-21dia situando-se entre 2 000 e 7 000 daltons, quer aqueles tendo uma massa molecular média de cerca de 4 500 daltons, quer ainda aqueles tendo uma massa molecular média de cerca de 2 500 daltons.

Pode, vantajosamente, utilizar-se para os obter um proces. so de despolimerização com ácido nitroso, tal como descrito, por exemplo, na patente EP 37319. Os glicosaminoglicanos selectivamente 0-acilados de acordo com o invento são, nesse caso, representados pela fórmula III seguinte:

(III) em que:

A representa R^ , ou R^-(c) ou R^-(d), tal como definidos na fórmula (i);

- R^ representa H, e/ou SO^ e/ou um grupo acilo tal como definido na fórmula (i);

- R₂ representa -SO^ , e/ou um radical acetilo, sob a r.e serva que a proporção de N-acetilglucosamina seja no máximo igual à da heparina quando representa um radical acetilo;

R^ representa um átomo de hidrogénio, e/ou um radical alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, de preferência de 1 a 4 átomos de carbono, ou um radical fenil-alquilo de 7 a 12 átomos de carbono, ou um catião de metal alcalino ou alcalino-terroso;

n é um número inteiro de 3 a 12.

0s compostos preferidos de acordo com o invento correspon dem aos compostos de fórmula (III) nos quais é um radical alca

648

0397 W

-22- ' , noilo de 4 a 10 átomos de carbono.

Para obter misturas de fragmentos de heparina tendo uma massa molecular inferior a 10 000 daltons, pode igualmente utilizar-se um método de despolimerização enzimática, por exemplo, tal como descrita nas patentes EP 244235 e 244236, ou de despolimerização alcalina, por exemplo, tal como descrita na patente EP 40144.

Neste caso, os glicosaminoglicanos selectivamente 0-acil.a dos de acordo com o invento são representados pela fórmula IV seguinte:

em que:

representa H, e/ou S0^ , e/ou um grupo acilo tal co mo definido na fórmula (i);

R2 representa S0^ , e/ou um radical acetilo, sob a reserva que a proporção de N-acetilglucosamina seja no máximo igual à da heparina quando R^ representa um radical acetilo;

Rj representa um átomo de hidrogénio, e/ou um radical alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, de preferência de 1 a 4 átomos de carbono, ou um radical fenil-alquilo de 7 a 12 átomos de carbono, ou um catião de metal alcalino ou alcalino-terroso;

representa (a)-OR^, tal como definido na fórmula (I ) , ou ORj- ;

n é um número inteiro de 2 a 20.

Entre os compostos de fórmula (IV), os compostos vantajo69 648

0397 W

-2 3sos são aqueles nos quais R^ é um radical alcanoilo de 4 a 10 áto mos de carbono.

Num outro aspecto vantajoso do invento, pode utilizar-se uma mistura de fragmentos de heparina homogéneos em relação à sua massa molecular, um fragmento de heparina obtido por síntese, homogéneo tanto no que se refere à sua massa molecular como no que se refere à sua funcionalização.

Num outro aspecto interessante do invento, pode escolher-se como glicosaminoglicano derivados da heparina desprovidos de sitio de ligaç3o à antitrombina III (AT III ) , quer por as cadeias de heparina terem sido fraccionadas de forma a eliminar as cadeias oiigossacáridas que comportam o sítio de ligação à AT III recorrendo, por exemplo, a uma cromatografia de afinidade sobre resina Sépharose-AT III ou a cromatografias de permuta de iães, tal como foi descrito em Sache, E. e colab. , Thromb. Res., 25 (1982), págs. 442-458, quer por esses sítios terem sido destruídos, por exemplo, por despolimerização com periodato seguida por uma β -eliminação ou por uma hidrólise ácida.

Os referidos compostos podem corresponder à fórmula V seguinte:

em que:

- A representa R^-(c), R^-(d) ou o resíduo de (c) ou de (d) após oxidação periódica seguida por uma β -eliminação ou por uma hidrólise ácida;

B representa (a)-OR^, ou um grupo (a) ao qual permanece ligado um resíduo de (c) ou de (d) tal como presente após oxida

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0397 W

-24ção periódica seguida por uma β —eliminação ou por uma hidrólise ácida;

R^ tem os significados dados na fórmula (i);

R2 representa SO^ , ou um radical acetilo, sendo a prjg porção de SO de cerca de 90%;

R₃ representa um átomo de hidrogénio ou um catião de metal alcalino ou alcalino-terroso;

n é um número inteiro de 1 a 80.

Compostos particularmente vantajosos podem ser obtidos a partir de compostos preparados pelo processo que utiliza uma oxidação periódica seguida por J>)-eliminação alcalina, por uma redução e por um fraccionamento tal como descrito mais acima. Estes compostos correspondem à fórmula VI seguinte:

(Ί) em que:

- A representa R_x, Rj-íc), R_x-(d) ou o resíduo de (c) ou de (d) após oxidação periódica seguida por uma β -eliminação;

U representa

648

0397 W

ou, na proporção de um motivo para, pelo menos, duas cadeias, um ácido urónico (D-glucorónico ou L-idurónico) não sulfatado aberto entre os carbonos nas posições 2 e 3, de fórmula:

ch₂oh ch₂oh

B representa (a)-OR^, ou OR^, ou um grupo (a) ao qual permanece ligado um resíduo de (c) ou de (d) tal como presente após oxidação periódica seguida por uma (3 -eliminação;

R^ tem os significados dados na fórmula (i);

R₂ representa S 0^ , ou um radical acetilo, sendo a pro porção de SO^' de cerca de, pelo menos, 90%;

R.j representa um átomo de hidrogénio ou um catião de metal alcalino ou alcalino-terroso;

n é um número inteiro de 2 a 18.

Os compostos vantajosos correspondentes à fórmula UI são aqueles nos quais n é um número inteiro de 7 a 15 para as espécies maioritárias que os constituem.

Os compostos vantajosos correspondentes às fórmulas U e UI, e, em particular, aqueles que correspondem à fórmula UI nos quais n é um número inteiro de 7 a 15 para as espécies maioritárias, são aqueles nos quais R^ é um radical alcanoilo de 2 a 10 átomos de carbono, vantajosamente de 4 a 10, de preferência 4 ou 6 átomos de carbono.

Outros compostos preferidos correspondentes à fórmula UI são misturas de compostos homogéneos em relação à sua massa molecular, obtidos por filtração em gel, nos quais n é um número inteiro de 2 a 12.

Entre os compostos de estrutura heparínica desprovidos de

648

0397 W

-26sítio de fixação à AT III e, portanto, desprovidos de actividade anticoagulante, uma família de compostos vantajosos correspondem a derivados da heparina N-des-sulfatada N-acetilada selectivamente 0-acilados correspondentes à fórmula VII seguinte:

(VII) em que:

A representa R^, R^-(c), ou R^-(d), tal como definidos na fórmula (I);

R^ representa um radical alcanoilo de 2 a 18 átomos de carbono;

R^ representa um átomo de hidrogénio ou um catião de metal alcalino ou alcalino-terroso;

B representa (a)-OR^, tal como definido na fórmula (i) ou 0R^ ;

n é um número inteiro de 1 a 80.

Num outro aspecto vantajoso do invento, os gl icosaminogl_i canos escolhidos são do tipo condroitina-sulfato, a saber as condroitinas-4- e -6-sulfato, a dermatana-sulfato e seus fragmentos.

Os glicosaminoglicanos deste tipo, selectivamente 0-acil_a dos de acordo com o invento são representados pela fórmula VIII seguinte:

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0397 W

(VIII) □o acilo tal como em que:

A tem os significados da fórmula (i);

R^ representa H e/ou S0^ e/ou um gru definido na fórmula (i);

Rj representa um átomo de hidrogénio, um radical alqu_i lo de 1 a 10 átomos de carbono, de preferência de 1 a 4 átomos de carbono ou um radical fenil-alquilo de 7 a 12 átomos de carbono ou um catião de metal alcalino ou alcalino-terroso;

B representa (b)-OR^ ou (g), tal como definidos na fó_r mula (I) ou OR , ou um grupo (b) ao qual permanece ligado um res_I duo de (c) ou de (d) tal como presente após oxidação periódica s_e guida por uma (3 -eliminação ou por uma hidrólise ácida;

n é um número inteiro de 1 a 80.

Entre os compostos de fórmula (l/IIl) , uma família vantajçi sa corresponde aos compostos nos quais R^ representa um átomo de hidrogénio ou um catião de metal alcalino ou alcalino-terroso.

Outros compostos vantajosos de fórmula (VIII) são aqueles nos quais R^ representa um radical alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, de preferência de 1 a 4 átomos de carbono, ou um radical fenil-alquilo de 7 a 12 átomos de carbono.

Uma outra família vantajosa de compostos de fórmula (VIII) corresponde aos compostos nos quais R^ é um radical alcanoilo de 4 a 10 átomos de carbono.

648

0397 W —

-28- TZ ' τ invento tem igualmente por objectivo um processo de pre paração dos glicosaminoglicanos selectivamente 0-acilados.

processo de acordo com o presente invento é caracteriza do por se transformar o glicosaminoglicano num sal solúvel em meio orgânico e por se tratar este sal com um agente de acilação capaz de acilar selectivamente os grupos hidroxilo primários e s^ cundários deste glicosaminoglicano, sem alterar os grupos funcionais NHR^ ou COOR^ presentes neste glicosaminoglicano antes da reacção de acilação, efectuando-se a reacção num solvente apróti* -«*- co polar em presença de um catalisador e em presença de uma base susceptlvel dB captar 0 ácido libertada por ocasião da acilação, a uma temperatura de OSC a 100SC.

produto é, em seguida, precipitado com o auxilio de um solvente imisclvel com a água, tal como o etanol, ao qual se pode juntar um adjuvante que favoreça a precipitação, tal como um sal mineral. 0 glicosaminoglicano 0-acilado é isolado por dissolução em água do precipitado e vantajosamente dialisado em presença duma base fraca.

Duma forma vantajosa, o processo do invento é realizado de acordo com as etapas seguintes;

(l) transforma-se um glicosaminoglicano de fórmula IX, seguinte:

(IX) em que:

representa um grupo (a)⁰ de fórmula:

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0397 W

-29—

...

ou um grupo (a’)° de (a')° fórmula:

ou um grupo (b)° de (b)° fórmula:

U° representa um grupo (c)° de fórmula:

ou um grupo (d)° de fórmula:

(d)°

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0397 W

-30ou o resíduo do grupo (c)° ou do grupo (d)° após oxidação periódi. ca seguida por uma (5 -eliminação ou por uma hidrólise ácida;

A° representa um grupo R^°, ^um 9^ruP° Rj°^(c)°» ^um grupo R₁°-(d)°, ou um grupo (e)° de fórmula:

ou o resíduo do grupo (c)° ou do grupo (d)° após oxidação periódj. ca seguida por uma (i -eliminação ou por uma hidrólise ácida;

B° representa um grupo 0R^°, um grupo (a)°-0R^°, um grupo (a')^D-ORjL°» ^um grupo (b)°-0R^°, ou um grupo (f)° de fórmula

ou um grupo (g)° de fórmula:

(g)°

ou representa os grupos (a)°, ligado um resíduo de (c)° ou (a')° ou (b)°, aos quais de (d)° tal como presente permanece após oxidsi

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397 W : / '

-31ção periódica seguida por uma ft)-eliminação ou por uma hidrólise ácida ;

R^⁰ representa H ou S0^ ;

R₂ representa SOy , ou um radical acetilo, sob a reserva que a proporção de N-acetil glucosamina seja no máximo igual à da heparina quando R^ representa um radical acetilo;

R^ representa um átomo de hidrogénio, ou um radical alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, ou um radical fenil-alquilo de 7 a 12 átomos de carbono ou um catião de metal alcalino ou alcalino-terroso;

n é um número inteiro de 1 a 80, num sal do referido glicosaminoglicano solúvel num solvente orgânico aprótico polar;

(2) trata-se este sal com um anidrido de fórmula:

Acilo - 0 - Acilo em que Acilo é tal como definido na fórmula (i), no referido solvente orgânico aprótico polar, em presença de quantidades catalíticas de piridina ou de uma dialquilaminopiridina e de um aceitador de protães;

(3) precipita-se 0 produto assim obtido por acção de uma solução de acetato de sódio em etanol; e (4) isola-se o glicosaminoglicano selectivamente 0-acilado por dissolução em água do precipitado assim obtido e por diálise em presença de uma base fraca, e transforma-se, eventualmente, o sal de sódio do glicosaminoglicano selectivamente 0-acilado assim obtido num outro sal farmaceuticamente aceitável.

Num aspecto vantajoso do processo de acordo com o invento, 0 glicosaminoglicano utilizado na etapa (l) é escolhido entre 0 grupo constituído pela heparina, uma mistura de fragmentos de heparina tendo uma massa molecular inferior a 10 000 daltons, uma mistura de fragmentos de hBparina tendo uma massa molecular média situando-se entre 2 000 e 7 000 daltons, uma mistura de fragmentos

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0397 W

-32- .,···_: a* de heparina tendo uma massa molecular média de cerca de 4 500 dal_ tons, uma mistura de fragmentos de heparina tendo uma massa molecular média de cerca de 2 500 daltons, uma mistura de fragmentos de heparina homogéneos em relação à sua massa molecular, um fragmento de heparina obtido por síntese, homogéneo tanto no que se refere à sua massa molecular como no que se refere à sua funciona lização.

Num outro aspecto vantajoso do processo de acordo com o invento, o glicosaminoglicano utilizado na etapa (l) é a heparina uma fracção ou um fragmento de heparina desprovidos de sítio de ligação à antitrombina III.

glicosaminoglicano utilizado na etapa (l) do processo de acordo com o invento pode ainda ser vantajosamente escolhido entre o grupo constituído pela dermatana-sulfato e os seus fragmentos ou as condroitinas-4-e -6-sulfato e os seus fragmentos.

Duma forma vantajosa, o sal do glicosaminoglicano utilizja do na etapa (l) do processo de acordo com o invento ô um sal de amina terciária, em particular um sal de tributilamónio, ou um sal de amónio quaternário, em particular um sal de tetrabutilamóni o.

Num outro aspecto vantajoso do processo de acordo com o invento, o anidrido utilizado na etapa (2) é o anidrido de um ácido alcanóico contendo de 2 a 10 átomos de carbono, vantajosamente de 4 a 10, de preferência 4 ou 6 átomos de carbono.

solvente aprótico polar no qual é conduzida a etapa (2) do processo de acordo com o invento pode ser vantajosamente escolhido entre 0 grupo constituído pela dimetil f ormamida, a hex.a metilfosforotriamida, a piridina, ou ainda uma mistura destes sol ventas entre eles ou com diclorometano, e 0 catalisador entre o grupo constituído por aminas tais como a piridina, e a dimetilarrã piridina.

A base destinada a neutralizar a acidez pode ser a piridi. na (que pode servir simultaneamente de solvente, de catalisador e de base), a trietilamina ou a tributilamina.

648

0397 W

-33De forma vantajosa, a diálise efectuada na etapa (4) efectua-se em presença de uma base fraca, tal como o bicarbonato de sódio, a fim de eliminar eventuais produtos secundários tais como os anidridos.

De forma vantajosa, a temperatura e a duração da reacçSo podem variar, em função da taxa de acilação desejada, respectivamente de 090 a 100SC, em particular de OSC a 50SC, e vanta j osameri te à temperatura ambiente, durante 1 a 24 horas, por exemplo.

Os compostos de acordo com o invento, selectivamente 0-acilados, apresentam in vivo uma actividade prolongada. Por exemplo, quando estes compostos são compostos do tipo heparinico possuindo 0 sítio de ligação à AT III, e são, portanto, susceptíveis de exercer uma actividade antitrombótica, esta actividade é nitidamente prolongada no tempo em relação ao mesmo composto que não sofreu uma 0-acilação selectiva.

Os derivados heparinicos selectivamente 0-acilados de acor do com o invento, possuindo ou não o sitio de ligação à AT III, estes últimos estando praticamente desprovidos de actividade anVi coagulante, apresentam igualmente diversas actividades biológicas, nome adame nte:

a inibição da proliferação das células musculares lisas, que apresenta um grande interesse para evitar as re-estenoses nas intervençães, tais como a angioplastia, as pontes e enxer tos venosos e arteriais, os transplantes de órgãos em particular os transplantes cardíacos;

a inibição da heparanase e da heparitinase, enzimas implicados nas disseminaçães metastáticas;

propriedades anti-virais, em particular em face dos re trovírus, nomeadamente em face dos diferentes HIU (vírus da imuno deficiência humana), 0 que apresenta um grande interesse no trata mento do SIDA, propriedades de inibição da elastase leucocitá ria, de aumento das taxas circulantes dos inibidores da elastase, assim como de inibição selectiva da síntese do colagéneo do tipo III e

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-34da fibronectina, □ que lhes confere um grande interesse para o tratamento de doenças nas quais está implicado um desiquilíbrio do sistema elastase-anti-elastase, tal como o enfisema, assim como para o tratamento das doenças degenerativas do tecido conjunt_i vo, tais como a arterosclerose e os diabetes.

Os glicosaminoglicanos selectivamente 0-acilados de acordo com o invento podem, portanto, constituir o princípio activo de medicamentos com grande interesse em numerosas indicações.

invento tem também como objectivo o processo de prepara ção de preparação de composições farmacêuticas caracterizadas por compreenderem, a título de substância activa, uma quantidade eficaz de, pelo menos, um glicosaminoglicano 0-acilado de acordo com o invento, em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

De forma vantajosa, o glicosaminoglicano selectivamente 0-acilado encontra-se sob a forma de um sal farmaceuticamente aceitável, tal como um sal de sódio, de magnésio ou de cálcio.

Numa concretização vantajosa do invento, as composições farmacêuticas são caracterizadas por o veículo ser apropriado para a administração por via oral, e por elas se apresentarem sob a forma de geles gastro-resistentes, de comprimidos ou pastilhas, de pílulas ou ainda sob a forma de soluções bebíveis, contendo vantajosamente de 50 mg a 5 g por unidade de toma, de preferência de 100 a 1 000 mg para os geles, comprimidos ou pílulas e de 10 a 150 mg para as soluções bebíveis, por exemplo uma a três vezes por dia; ou ainda por estas composições se apresentarem sob a forma de solução injectável, estéril ou esterilizável, para administração por via intravenosa, intramuscular ou subcutânea, contendo es tas soluções vantajosamente de 50 a 200 mg/ml de glicosaminoglica no selectivamente 0-acilado quando são destinadas à injecção por via subcutânea, ou de 20 a 200 mg/ml de glicosaminoglicano selectivamente 0-acilado quando são destinadas à injecção por via intravenosa ou por perfusão.

Estes intervalos de doses não têm senão um valor indicat_i vo, devendo as doses administradas, em cada caso, ser avaliadas

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-35pelo clínico, tendo em conta o estado do doente e a reactividade pessoal relativamente aos medicamentos.

invento refere-se igualmente, a título de reagente biológico, aos glicosaminoglicanos selectivamente 0-acilados de aco_r do com o invento, que podem ser utilizados como referências ou p.a drQes em estudos comparativos para estudos de relaçQes estrutura/ /actividade em diferentes sistemas fisiológicos nos quais os glicosaminoglicanos podem estar implicados.

presente invento será melhor compreendido com o auxilio dos exemplos de aplicação que se seguem, e que não possuem qualquer carácter limitativo.

EXEMPLO 1: Preparação de heparina 0-acetilada (IC 1938) a partir do sal de tetrabutilamónio da heparina

a) Preparação do sal de tetrabutilamónio da heparina:

sal de sódio da heparina (10 g) dissolvido em água (500 ml) é filtrado através duma coluna de resina permutadora de catiQes (Domex 50 W x 4, sob a forma H⁺). A solução obtida é neutralizada pelo hidróxido de tetrabutilamónio. Após liofilização obtém-se o sal de tetrabutilamónio da heparina (19,55 g).

b) Acetilação:

1,05 g de heparinato de tetrabutilamónio são dissolvidos em dimetilformamida anidra (5 ml). Após arrefecimento até 020, adiciona-se, gota a gota, anidrido acético (l ml; 10,46 mmoles), seguido de trietilamina (l,45 ml; 10,46 mmoles) e di me til aminop_i ridina (64 mg; 0,5 mmole). A mistura é deixada 24 horas à temp_e ratura ambiente. Após adição de água (5 ml), a solução é dialis_a da durante 72 horas, contra água destilada. 0 sal de tetrabutilamónio é convertido em sal de sódio por passagem sobre uma resina Domex 50 H⁺, a OSC, seguida por neutralização com soda IN. Após liofilização, obtêm-se 0,49 g de heparinato de sódio selectivamen te 0-acetilado, apresentando as seguintes características:

Relação sulfato/carboxilo:2,28 meq/g (produto de partida: :2,20 meq/g)

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-36Título de APTT: 91 ui/mg

Espectro de ^^C-RMN (metanol a 51,6 ppm, padrão interno)

- sinal a 23,4 ppm: CH^ de CH^-CO-O- sinal a 24,5 ppm (fraco): CH^ de CH^-CO-NH- (idêntico ao produto de partida) espectro de RMN indica a presença de cerca de dois grupos acetilo por unidade dissacárida.

EXEMPLO 2: Preparação de heparina 0-acetilada (IC 1938) a partir do sal de tributilamónio da heparina

a) Preparação do sal de tributilamónio da heparina:

sal de sódio da heparina (10 g) é dissolvido em água (500 ml), em seguida filtrado através de uma coluna de resina pe_r mutadora de catiões (Domex 50 W x 4, sob a forma H⁺). A solução é neutralizada pela adição de uma solução de tributilamina a 10% em etanol. Após lavagem com éter e liofilização, obtém-se o sal de tributilamónio da heparina (14,77 g).

b) Açetilação:

A uma solução arrefecida até OSC do sal acima (4 g) em di. me tilformamida anidra (50 ml), adiciona-se dimetilaminopiridina (250 mg), anidrido acético (3,9 ml) e tributilamina (9,7 ml).

Apés 24 horas à temperatura ambiente, é adicionada água (l,5 ml). A mistura é, em seguida, vertida numa solução de etanol saturada em acetato de sódio. Após lavagem com etanol, o precipitado é dissolvido em água, em seguida dialisado contra bicarbonato a 5% em água, depois contra água. Obtém-se, após liofilização, o hepa^ rinato de sódio 0-acetilado (l,81 g).

espectro infra-vermelho apresenta uma forte banda éster a 1730 cm^_1.

Após saponificação, o produto apresenta:

- uma relação sulfato/carboxilo de 2,38 meq/g (produto de partida: 2,40 meq/g) um título de APTT de: 85 ui/mg

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0397 W

EXEMPLO 3; Preparação de heparina 0-acetilada (IC 1938) utilizando a catálise pela piridina sal de tetrabutilamónio da heparina (0,58 g) é dissolvi, do numa mistura (l/l; v/v) de piridina e dimetilformamida (10 ml) E adicionado anidrido acético (0,5 ml), sendo, em seguida, a mistura deixada à temperatura ambiente. Após 24 horas, adiciona-se uma solução aquosa de acetato de sódio (lM, 15 ml), vertendo-se, em seguida, a mistura em etanol (80 ml) arrefecido até OSC. Após centrifugação, o precipitado á redissolvido em água (10 ml), sendo, em seguida, adicionado etanol (l60 ml), seguido de acetato de sódio aquoso (lM, 10 ml). 0 precipitado ô, em seguida, retomado com água e liofilizado, originando a heparina 0-acetilada (0,22 g)

EXEMPLO 4: Preparação de heparina 0-propionilada (IC 1939) em diversos graus

A uma solução, arrefecida até 020, de heparinato de tetrai butilamónio (l,85 g) , obtido tal como descrito no Exemplo 1, em dimetilformamida (10 ml), adiciona-se, gota a gota, anidrido propiónico (2,7 ml), seguido de trietilamina (2,9 ml) e dimetilamino piridina (128 mg). Nos tempos 1 h, 2 h, 4 h, 8 h e 24 h, é retirada uma parte da mistura reaccional, diluída num volume igual de água e dialisada durante 24 horas contra água destilada. Após passagem sobre uma resina Doiuex 50 H⁺ e neutralização pela soda, os produtos obtidos são liofilizados e apresentam as característj^ cas seguintes:

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Tempo de reacção	Massa	Sulfato/Carboxilo meq/ g	APTT (ui/mg)
24 h	496 mg	2,31	80
8 h	138 mg	2,35	88
4 h	122 mg	2,33	94
2 h	12 0 mg	2 ,42	109
1 h	120 mg	2,33	120
(produto de partida)		2,40	150

espectro de RMN do protão dos produtos foi registado em água com o 3,3,3-trimetilsililpropionato (TSP) como padrão interno. Apresenta sinais a ~1,1 ppm e ~2,4 ppm caracteristicos, respectivamente, dos resíduos CH^ e CH₂ de CH^-Ct^-CO-O e sinais entre ~3 e -5 ppm caracteristicos dos protães do esqueleto osídico.

A comparação da intensidade dos sinais do propionilo e do esqueleto entre o produto tratado durante 1 hora e aquele s ubme t_i do a 24 horas de reacção ilustra a influência da duração da reacção: com efeito, observa-se um decréscimo dos sinais dos protães do esqueleto, o que indica um aumento da taxa de substituição.

espectro do carbono (metanol a 51,6 ppm, padrão interno) dos sinais a -10,8 e ~30 ppm, apresenta características dos radicais CH^ θ CH2 dos ésteres propionato.

EXEMPLO 5: Preparação de heparina 0-butirilada (IC 1940)

a) Utilização do sal de tetrabutilaménio da heparina

A uma solução do sal de tetrabutilaménio da heparina (0,55 g) , obtido tal como descrito no Exemplo 1, em dimetilformamida (5 ml), adiciona-se, a 09C, anidrido butirico e dimetilaminopiridina. Após 24 horas à temperatura ambiente, é adicionada água (5 ml), sendo, em seguida, a mistura reaccional dialisada durante 72 horas contra água destilada. Após permuta sobre Domex 50 H⁺, neutralização pela soda e liofilização, obtém-se a heparina 0-butiri

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0397 W

-39lada sob a forma de sal de sódio (0,32 g).

Relação sulfato/carboxilo: 2,15 meq/g (produto de partida: 2,20 meq/g)

Titulo de APTT: 59 ui/mg espectro de RMN do protão (TSP, padrão interno) mostra a presença de sinais a 0,9 ppm; 1,6 ppm e 2,4 ppm, característicos dos grupos CH-j-CH^ de CH^-Ct^-C^-CO-O- e sinais entre 3 e 6 ppm, característicos do esqueleto osldico.

A análise do espectro de RMN indica a presença de cerca de uma cadeia butirilo por unidade dissacárida. b) Utilização do sal de tributilamónio da heparina:

A uma solução, arrefecida até OeC, de heparinato de tributilamina (4 g), obtido como descrito no Exemplo 2, em dimetil formamida (50 ml), adiciona-se dimetilaminopiridina (0,25 g), ani drido butírico (6,7 ml) e tributilamina (9,7 ml). Deixa-se a mis tura reaccional à temperatura ambiente durante 24 horas. Adiciona-se água (l,5 ml) seguida, após 30 minutos, de uma solução satjj rada de acetato de sódio em etanol (250 ml). 0 precipitado é, em seguida, lavado, três vezes, com etanol, em seguida dialisado con tra uma solução de bicarbonato a 5%, depois contra água. Obtém-se, após 1iofilização, o sal de sódio da heparina 0-butirilada (2,1 g).

Título de APTT: 29 ui/mg

Após saponificação dos ésteres pela soda 0,5M durante 2 horas a OaC, o produto obtido apresenta uma relação sulfato/carbo xilo de 2,36 meq/g (2,40 meq/g no produto de partida).

EXEMPLO 6: Preparação de heparina Q-hexanoilada (IC 194l)

a) Utilização do sal de tetrabutilamónio da heparina:

A uma solução do sal de tetrabutilamónio da heparina (0,55 g), obtido como descrito no Exemplo 1, em dimetilformamida (5 ml), adiciona-se, a OSC, anidrido capróico (l ml; 6 mmoles), trietilamina (0,84 ml; 6 mmoles), e dimetilaminopiridina. Após

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0397 W y' / ':V*

-4024 horas à temperatura ambiente, é adicionada água (5 ml), sendo, em seguida, a mistura reaccional dialisada durante 72 horas contra uma solução de bicarbonato a 5%, depois contra água destilada. Após permuta sobre Domex 50 H⁺, neutralização pela soda e liofilização, obtém-se a heparina Q-hexanoilada sob a forma de sal de sódio (0,30 g).

Título de APTT: 25 ui/mg espectro de RMN do protão (TSP, padrão interno) apresen ta sinais a 0,8; 1,2; 1,5; 2,3 ppm, característicos dos CH^-CH₂ de CH₃-(CH₂)₀-CO-O-.

b) Utilização do sal de tributilamónio da heparina:

A uma solução, arrefecida até OSC, de heparinato de tributilamónio (4 g) , obtido como descrito no Exemplo 2, em dimetilformamida (50 ml), adiciona-se dimetilaminopiridina (0,25 g), tri butilamina (9,7 ml) e anidrido hexanóico (10,6 ml). Após 24 horas a 20SC, é adicionada água (l,5 ml), seguida duma solução satjj rada de acetato de sódio em etanol. Após lavagem com etanol, diá lise e liofilização, obtém-se a heparina 0-hexanoilada (2,5 g).

EXEMPL 0 7: Preparação de heparina 0-octanoilada (IC 1942)

A uma solução, arrefecida até OSC, de heparinato de tribjj tilamónio (4 g) , obtido como descrito no Exemplo 2, em dimetilfo_r mamida (50 ml), adiciona-se dimetilaminopiridina (0,25 g), anidri do octanoico (12,1 ml) e tributilamina (0,7 ml). Após 24 horas à temperatura ambiente, é adicionada água (1,5 ml), seguida, após 30 minutos, de uma solução saturada de acetato de sódio em etanol Após diálise contra uma solução de etanol a 20%, depois contra água destilada e ultracentrifugação, o produto é submetido a uma permuta de catiães por passagem sobre Domex 50 Η , seguida de neu tralização pela soda. Após 1iofilizaçâo, obtém-se a heparina 0-octanoilada (2,5 g).

648

0397 W

-41EXEMPLO 8: Preparação de heparina 0-decanoilada (IC 1943)

a) Utilização do sal de tetrabutilamónio da heparina

A uma solução do sal de tetrabutilamónio da heparina (0,55 g), obtido como descrito no Exemplo 1, em dimetilformamida (5 ml), adiciona-se, a OSC, anidrido cáprico (l ml; 6 mmoles), trietilamina (0,84 ml, 6 mmoles) e dimetilaminopiridina. Após 24 horas à temperatura ambiente, é adicionada água (5 ml), sendo, em seguida, a mistura reaccional dialisada durante 72 horas contra uma solução de bicarbonato a 5%, depois contra água destilada. Após permuta sobre Domex 50 H⁺, neutralização pela soda e liofili. zação, obtém-se a heparina 0-decanoilada sob a forma do sal de s_ó dio (0,30 g).

espectro de RMN do protão (TSP, padrão interno) apreseri ta sinais a 0,8; 1,2; 1,5 e 2,4 ppm, caracterís ticos dos CH-j e

CH₂ de CH₃-(CH₂)₈-C0-0-.

b) Utilização do sal de tributilamónio da heparina

A uma solução, arrefecida até OSC, de heparinato de tribjj tilamónio (4 g) , obtido como descrito no Exemplo 2, em dimetilfoj? mamida (50 ml), adiciona-se dimetilaminopiridina (0,25 g) , anidrj. do decanóico (13,3 g dissolvidos em 20 ml de dime tilformamida), e tributilamina (9,7 ml). Após 24 horas à temperatura ambiente, ó adicionada água (l,5 ml), seguida duma solução saturada de acetato de sódio em etanol. 0 precipitado é dissolvido em dimetilsulfóxido, em seguida é dialisado contra água, bicarbonato de sódio e, de novo, água.

Após liofilização, obtém-se a heparina 0-decanoilada (2,38 g).

EXEMPLO 9: Preparação de heparina 0-oleoilada (IC 2013) sal de tributilamónio da heparina (3 g) e a Ν,Ν-dimetil. aminopiridina (244 mg) são dissolvidos em dimetilformamida anidra (50 ml). Após arrefecimento até OSC, adiciona-se, gota a gota, anidrido oleico (21 g) , sintetizado segundo Plusquellec e colab., Tetrahedron, 44 (1988), 2471-2476, em solução em diclorometano (20 ml), em seguida tributilamina (9,5 ml). Após 24 horas de

648

0397 W

-42reacção e arrefecimento até OSC, introduz-se bicarbonato de sódio a 5% (10 ml) seguido, uma hora depois, de uma solução alcoólica saturada de acetato de sódio. Após lavagem com etanol absoluto, solubilizaçâo numa mistura de dimetilsulfóxido-água (4/lj v/v,

750 ml), dialisa-se contra o etanol aquoso a 10% durante 2 dias, depois contra água durante 3 dias. 0 sal de sódio da heparina oleoilada é isolado, após liofilização e precipitação em éter etí lico do liofilizado re-solubilizado na DMF (2,77 g) . Teor em ác_i do oleico: 1,44 yi<mole/mg (dosagem de acordo com Ducombe, W. e colab., Biochemical Journal, 88 (1963), 7).

EXEMPLO 10: Preparação de heparina 0-benzoilada (IC 1944) sal de tetrabutilamónio da heparina, obtido como descr_i to no Exemplo 2, ê benzoilado pelo anidrido benzóico nas condições descritas anteriormente para a preparação da heparina 0-decanoila^ da (Exemplo 8) .

espectro de RMN do carbono do produto obtido apresenta sinais a 131, 132 e 136 ppm, característicos dos grupos benzoílo.

produto é desprovido de actividade anticoagulante in vitro .

EXEMPLO 11: Preparação de heparina 0-3-ciclopentilpropionilada (IC 2014) anidrido 3-ciclopentilpropiónico é preparado de acordo com o método de Plusquellec e colab., Tetrahedron, 44 , 1988, 2471z

-2476. E obtido após adição do ácido (23 ml, 150 mmoles), em solução em diclorometano (400 ml), à mistura, agitada e arrefecida até -10SC, contendo brometo de tetrabutilamónio (15 mmoles), soda a 20% (60 ml) e diclorometano (80 ml), e isto após decantação, l.a vagens com bicarbonato de sódio a 5% e água e concentração num óleo (96%). Frequências características em infra-vermelho: 1800, 1745, 1040 cm^-1.

sal de tributilamónio da heparina (4 g) e a Ν,Ν-dimetil. aminopiridina (253 mg) são dissolvidos em dimetilformamida anidra (40 ml). Após arrefecimento até 02C, adiciona-se, gota a gota, o

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0397 W

-4 3- ·' anidrido 3-ciclopentilpropiónico (ll g) , seguido de tributilamina (9,8 ml). Após 24 horas de reacção â temperatura ambiente, segu_i da de arrefecimento até OsC, é adicionada água (l ml), seguida, uma hora depois, de uma solução alcoólica saturada de acetato de sódio. Após lavagem com etanol absoluto, o precipitado é dialis£ do contra bicarbonato de sódio a 5% durante 24 horas, depois contra água durante 3 dias. Após liofilização, obtém-se a heparina 0-3-ciclopentilpropionilada sob a forma do seu sal de sódio (2,64 9) · espectro de RMN do carbono em D£0 (metanol a 51,6 ppm, padrão interno) apresenta os sinais característicos a 27,4 ppm; 33,1 ppm; 34,6 ppm; 35,9 ppm e 41,7 ppm do grupo 0-ciclopentilpropionilo.

Relação sulfato/carboxilo:2,2.

EXEMPLO 12: Preparação de uma heparina de baixa massa molecular (PM médio -4500 daltons, intervalo de PM -1800-8000 daltons) 0-acetilada (IC 1945)

Esta heparina de baixa massa molecular foi obtida por des. polimerização nitrosa parcial e fraccionamento alcoólico, tal como descrito na patente EP 181 252, e é denominada daqui em diante CY 216.

a) Utilização do sal de tetrabutilamónio do 0Y 216 sal de sódio do CY 216 (l g) é convertido em sal de tetrabutilamónio por passagem através de uma coluna de resina Doiuex 50 H⁺ , seguida por neutralização pelo hidróxido de tetrabutilamónio.

sal assim obtido (l,7 g) é seco, sob vácuo, durante 3 horas a 5OSC, sendo, em seguida, dissolvido em dimetilformamida anidra (10 ml). Após arrefecimento até OSC, é adicionado anidrido acético (l,7 ml), gota a gota, seguido de trietilamina (2,4 ml) e de dimetilaminopiridina (102 mg). Após 20 horas de reacção, o produto é submetido a cromatografia sobre uma coluna de Séphadex G-25 eluida com água. Obtém-se, após conversão em sal de sódio e liofilização, o CY 216 0-acetilado (0,89 g).

64Θ

0397 W

-44- ' seu espectro de RMN do carbono (metanol a 51,6 ppm, padrão interno) apresenta um sinal, a 23 ppm, característico dos acetatos.

sinal do CH^ de CR^-CO-NH-, a -24,5 ppm, é idêntico ao do produto de partida.

A relação sulfato/carboxilo é de 2,09 meq/g (produto de partida: 2,05 meq/g).

Título de APTT: 1Θ ui/mg

Título de anti-Xa: 205 u/mg (dosagem de Yin e colab., 0, Lab, Clin. Med., 81 (1973), 298-310). b) Utilização do sal de tributilamónio do CY 216 sal de sódio do CY 216 é convertido em sal de tributilamónio por passagem através de uma coluna de resina Domex 50 H~, seguida de neutralização pela tributilamina, como descrito para a heparina. 0 sal de tributilamónio do CY 216 é obtido após lavagem com éter, liofilização e secagem em estufa sob vácuo.

sal acima (4 g) e a N,N-dimetilaminopiridina (288 mg) são dissolvidos em dimetilformamida. Após arrefecimento até OSC, é adicionado anidrido acético (4,4 ml), gota a gota, seguido de tributilamina (ll,2 ml). Após 24 horas à temperatura ambiente e arrefecimento até OQC, é adicionada água (l,7 ml) seguida, após 1 hora, de uma solução alcoólica saturada de acetato de sódio. 0 precipitado é lavado com etanol, solubílizado em água apirogénica, dialisado contra bicarbonato a 5% durante 36 horas, depois contra água durante 3 dias. Obtém-se, após liofilização, o CY 216 acet_i lado sob a forma de sal de sódio (l,4 g).

espectro de RMN do carbono em D₂0 (metanol a 51,6 ppm como padrão interno) apresenta a 23 ppm o sinal característico do grupo acetilado.

Relação sulfato/carboxilo:2,07.

643

0397 W .-,, _____ d <f'

-45E XE MPL 0 13: Preparação de uma heparina de baixa massa molecular (PM médio -4500 daltons, intervalo de PM -1800-8000 daltons) 0-butirilada (IC 1957) sal ds tributilamónio do CY 216 (4 g) , obtido como descrito no Exemplo 12, e a Ν,Ν-dimetilaminopiridina (288 mg) são dissolvidos em dimetilformamida anidra (40 ml); após arrefecimeri to até OQC, é adicionado anidrido butírico (7,68 ml), gota a gota, seguido de tributilamina (ll,2 ml). Após 24 horas de reacção à temperatura ambiente, seguida de arrefecimento até OSC, é adicionada água (l,7 ml) seguida, uma hora depois, de uma solução alcoól_i ca saturada de acetato de sódio. Após lavagem com etanol, solubjL lização em água apirogénica, diálise contra bicarbonato de sódio a 5% durante 36 horas, depois contra água durante 3 dias, é isolado o CY 216 Q-butirilado sob a forma de sal de sódio, após liofilizja ção (2,14 g).

espectro de RMN do carbono em D^O (metanol a 51,6 ppm, padrão interno) apresenta a 15,6 ppm; 20,5 ppm e 39,4 ppm, os s_i nais característicos do grupo 0-butirilo.

Relação sulfato/carboxilo:2,08.

EXEMPLO 14: Preparação de uma heparina de baixa massa molecular (PM médio -4500 daltons, intervalo de PM -1800-8000 daltons) 0-hexanoilada (IC 1958) sal de tributilamónio do CY 216 (4 g), obtido como descrito no Exemplo 12, e a N,N-dimetilaminopiridina (288 mg) são dissolvidos em dimetilformamida (40 ml). Após arrefecimento até OSC, adiciona-se, gota a gota, anidrido capróico (10,8 ml) e tributilamina (ll,2 ml). Após 24 horas de reacção à temperatura ambiente, seguida de arrefecimento até DSC, é adicionada água (1,7 ml) seguida, uma hora depois, de uma solução alcoólica saturada de acetato de sódio. Após lavagem com etanol absoluto, solubilizaçâo em água apirogénica, diálise contra bicarbonato de sódio a 5% durante 36 horas, depois contra água durante 3 dias, é isolado o CY 216 0-caproilado sob a forma de sal de sódio, após liofilização (2,5 g).

648

0397 W

-46- ,;

espectro de RMN do carbono em D^O (metanol a 51,6 ppm, padrão interno) apresenta a 15,9 pp, 24,2 ppm, 26,4 ppm, 33,1 ppm e 36,4 ppm, os sinais característicos do grupo caproíla.

Relação sulfato/carboxilo:2,08.

EXEMPLO 15: Preparação de uma heparina de baixa massa molecular (PM médio -4500 daltons, intervalo de PM -1800-8000 daltons) 0-octanoilada (10 1959) sal de tributilamónio do CY 216 (4 g), obtido como descrito no Exemplo 12 e a N,N-dimetilaminopiridina (288 mg) são dis^ solvidos em dimetilformamida (40 ml). Após arrefecimento até OSC, adiciona-se, gota a gota, anidrido caprílico (14 ml), seguido de tributilamina (ll,2 ml). Após 24 horas de reacção à temperatura ambiente e arrefecimento até OSC, é adicionada água (l,7 ml) segu_i da, uma hora depois, de uma solução alcoólica saturada de acetato de sódio. Após lavagem com etanol absoluto, solubilização em água apirogénica, diálise contra bicarbonato de sódio a 5% durante 36 horas, depois contra água durante 3 dias, obtém-se, após liofi. lização, o CY 216 0-octanoilado sob a forma de sal de sódio (l,76 9) 0 espectro de RMN do carbono em OMSO (metanol a 51,6 ppm, padrão interno) apresenta os sinais característicos a 16,8 ppm; 25,0 ppm; 27,3 ppm; 30,9 ppm; 31,4, 34,1 e 36,4 ppm, do grupo capriloilo.

Relação sulfato/carboxilo:2,07.

EXEMPLO 16: Preparação de uma heparina de baixa massa molecular (PM médio -4500 daltons, intervalo de PM -1800-8000 daltons) 0-decanoilada (IC 1960) sal de tributilamónio do CY 216 (4 g), obtido como descrito no Exemplo 12, e a N,N-dimetilaminopiridina (288 mg) são dissolvidos em dimetilformamida (40 ml). Após arrefecimento até OSC, adiciona-se, gota a gota, anidrido decanóico (15,3 ml) em s_o lução em dimetilformamida anidra (10 ml), seguida de tributilamina (ll,2 ml). Após 24 horas de reacção à temperatura ambiente e arrefecimento até OSC, é adicionada água (l,7 ml) seguida, uma hora

648

0397 W

-47depois, de uma solução alcoólica saturada de acetato de sódio.

Após lavagem com etanol absoluto e reposição em suspensão em água apirogénica, dialisa-se contra bicarbonato de sódio a 5% durante 2 dias, contra NaCl a 10% durante 2 dias, depois contra água durante 5 dias. 0 CY 216 0-decanoilado é isolado sob a forma de sal de sódio após liofilização (2,76 g).

espectro de RMN do carbono em D₂0 (metanol a 51,6 ppm, padrão interna) apresenta sinais caracteristicos a 16,4 ppm; 22,3 ppm; 25,1 ppm; 29,2 ppm; 31,9, 34,4 e 36,5 ppm do grupo decanoilo.

Relação sulfato/carboxilo:2,13.

EXEMPLO 17: Preparação de uma heparina de baixa massa molecular (PM médio -2500 daltons, intervalo de PM -1500-8000 daltons) 0-acetilado (IC 1946)

Esta heparina de baixa massa molecular foi obtida por de£ polimerização nitrosa parcial de acordo com o processo descrito na patente EP 37319 e ó denominada, daqui em diante, CY 222.

sal de sódio do CY 222 é convertido em sal de tributilamónio por passagem através de uma coluna de resina Dowex 50 H⁺, seguido por neutralização pela tributilamina.

sal obtido após liofilização (l,5 g) é dissolvido em d_i me tilformamida (5 ml) sendo, em seguida, após arrefecimento até 020, adicionado anidrido acético (l,35 ml), gota a gota, seguido de trietilamina (2 ml) e de dimetilaminopiridina (85 mg). Após 18 horas de reacção, é adicionada água (20 ml), sendo, em seguida, a mistura dialisada, durante 3 dias, contra água destilada. Após conversão em sal de sódio e liofilização, obtém-se o CY 222 0-ace tilado (0,86 g).

produto apresenta uma relação sulfato/carboxilo de 1,98 meq/g (produto de partida:l,97 meq/g).

espectro de RMN do carbono (metanol a 51,6 ppm, padrão interno) do produto contém um sinal a 23 ppm caracteristico dos 0-acetilo. A comparação das intensidades dos sinais dos N-acetilo (a -24,5 ppm) entre o produto de partida e o produto de chega69 648

0397 W da, demonstra que a acetilação foi selectiua.

- Título de APTT:8 ui/mg

Título de anti-Xa:191 u/mg (Dosagem de Yin e colab. ,

0. Lab. Clin. Med., 8_1 (1973), 298-310).

EXEMPLO 18: A) Preparação de um fragmento de heparina desprovido de afinidade para a antitrombina III (IC 1772)

1. Corte das cadeias de heparina por meio do ácido periodico:

g de heparina injectável de muco de porco, sob a forma de sal de sódio, com a titulação de 157 ui/mg na dosagem de Codex e de 155 u/mg na dosagem do anti-factor Xa de Yin e colab. , são colocados em solução em 250 ml de água desmineralizada a 4SC. 0 pH da solução é ajustado até 5,0 com ácido clorídrico concentrado. 10 g metaperiodato de sódio (NalO^, PM:213,89) em solução em 250 ml de água desmineralizada, a 42C, são adicionados sob agitação moderada. 0 pH do conjunto é ajustado até 5,0 com ácido clorídr_i co concentrado. A solução é deixada durante 24 horas, na obscurj. dade, em câmara fria a +42C.

2. Eliminação do periodato residual:

Em seguida, divide-se a solução reaccional por três tubos de diálise NOOAX 40 (porosidade de 3 a 4000 Da), e submete-se a uma diálise, durante 15 horas, contra água desmineralizada corrente .

3. Despolimerização em meio básico:

Aos 780 ml da solução obtida após diálise, são adicionados 16 ml de soda 10N, e o conjunto é submetido a agitação durante 3 horas à temperatura ambiente (na ordem de 18-212C).

4. Redução:

Em seguida são adicionados 500 mg de boro-hidreto de sódio (NaBH^, PM:37,83), e a solução é novamente agitada 4 horas à temperatura ambiente. 0 seu pH é, seguidamente, levado até 4, por meio de ácido clorídrico concentrado. Após 15 minutos de agitação, o pH é ajustado até 7 com o auxílio de soda concentrada.

648

0397 W

-49- Aos 820 ml de solução assim obtidos são adicionados 16,4 g de NaCl, seguidos 1270 ml de etanol. 0 conjunto é deixado em repouso durante 3 horas, em seguida é centrifugado a 2500 r/min durante 20 minutos. 0 precipitado é recolhido, reposto em suspen R são em 200 ml de etanol puro, triturada com o Ultra-Turrax e, z

finalmente, recuperado por filtração sobre buchner fritado. E, em seguida, seco sob vácuo, a 4090 durante 5 horas.

Recuperam-se, deste modo, 8,9 g de produto.

5. Fraccionamento alcoólico:

Estes 8,9 g são dissolvidos em cerca de 120 ml de água desmineralizada, à temperatura ambiente. Adicionam-se 1,78 g de NaCl, e o pH da solução é diminuído até 3,5 por meio de ácido cl_o ridrico. 0 volume da solução é ajustado até 178 ml com água desmineralizada. São adicionados, sob agitação, 151 ml de etanol pu. ro. A agitação é mantida 15 minutos após o fim da adição, sendo, em seguida, o conjunto deixado em repouso durante 10 horas, à temi peratura ambiente.

precipitado formado ô recolhido por centrifugação durari z

te 20 minutos a 2500 r/min. E reposto em suspensão em 150 ml de etanol puro, triturado com o Ultra-Turrax , recuperado por filtra^ ção sobre buchner fritado, lavado com300 ml de etanol puro e, finalmente, seco sob vácuo a 409C durante 24 horas.

Recuperam-se, deste modo, sob a forma de pó branco, 5 gra mas do produto IC 1772, tendo as características seguintes:

- SO-j : 3,55 meq/g

- COO : 1,54 meq/g

- S + C : 5,09 meq/g

- S/C : 2,31 meq/g z

E praticamente desprovido de N-acetil glucosamina (ausên-

cia de sinal a -	24,	5 ppm sobre	o espectro do carbono)
Título	de	Codex : 11	ui/mg
Titulo	de	APTT i 9	ui/mg
Titulo	de	anti-Xa :	12 ui/mg

9 646

0397 W

-5 0- ,· '

B) Preparação de um fragmento de heparina desprovido de afinidade para a antitrombina III 0-acstilado (IC 1924) produto obtido na etapa A) é convertido em sal de tetra hutilamónio por passagem sobre uma resina Domex 50 H⁺, seguida de neutralização por meio de hidróxido de tetrabutilamónio. A partir de 9,5 g de sal de sódio obtám-se 1Θ g de sal de tetrabutilamónio.

A uma solução de 6 g do sal assim obtido em dimetilformamida (55 ml), adiciona-se, após arrefecimento ató Osc, anidrido acético (6,2 ml; 65,6 mmoles), seguido de trietilamina (9 ml;

65,5 mmoles) e dimetilaminopiridina (403 mg; 3,3 mmoles). Após 24 horas, é adicionada uma solução saturada de acetato de sódio, em etanol (250 ml). Após centrifugação e lavagem do precipitado com etanol, o sólido é dessalgado sobre Séphadex G-25, em seguida submetido a uma permuta de iões por passagem sobre Dowex 50 H⁺, s_e guida de neutralização pela soda. Após liofilização, obtém-se o produto IC 1924 (3 g).

produto apresenta as características seguintes:

relação sulfato/carboxilo : 2,28 meq/g espectro de RMN do carbono (metanol a 51,6 ppm, padrão interno) mostra claramente que o produto foi 0-acilado. 0 sinal característico do C? 5a N-acetil glucosamina, a aproximadamente 56 ppm, é todo como no produto de partida, ausente do espectro.

EXEMPLO 19: Preparação de um fragmento de heparina desprovido de afinidade para a antitrombina III O-butirilado (IC

1925) g do sal de tetrabutilamónio de IC 1772, obtido como descrito no Exemplo 18, são butirilados com anidrido butírico nas condições descritas para a acetilação. Obtém-se o produto IC 1925 (2,96 g) que apresenta as características seguintes:

relação sulfato/carboxilo : 2,31 meq/g.

espectro de ^C-RMN (metanol a 51,6 ppm, padrão interno) contém os sinais característicos do grupo butilo a 15,6, 20,4 e 38,4 ppm.

648 0 39 7 W

-51EXEMPLO 20: Preparação de um fragmento de heparina desprovido de afinidade para a antitrombina-III 0-hexanoilado (IC 1926) g do sal de tetrabutilamónio de IC 1772, obtido como descrito no Exemplo 12, são tratados com anidrido hexanóico, da mesma forma que para a acetilação. Obtám-se o produto IC 1926 (3 g), que apresenta as seguintes características:

relação sulfato/carboxilo : 2,0 meq/g.

espectro de RMN do carbono (metanol a 51,6 ppm, padrão interno) apresenta os sinais caracteristicos dos CH^ e CH₂ do gru. po hexilo a 15,5, 23,9, 26,2, 32,7 e 36,1 ppm.

espectro de RMN do protão indica a presença de cerca de um grupo hexilo por unidade dissacárida.

EXEMPLO 21: Preparação de mistura de fragmentos desprovidos de afinidade para a antitrombina-III, homogéneos em relação à sua massa molecular e 0-butirilos

A mistura de fragmentos desprovidos de actividade antico_a gulante descrita no Exemplo 12 é fraccionada, nos seus diferentes constituintes, por filtração em gel. Obtém-se, deste modo, fracçães homogéneas em relação à massa molecular cujas massas são de 7700, 6500, 5800, 5300, 4980, 4400, 3900, 3400, 2600, 1860 e 1210.

Exemplo de esterificação de uma fracção:

A fracção de massa 2600 (0,20 g) é transformada em sal de tributilamónio, em seguida liofilizada e seca (0,34 g). Este pr_o duto é, em seguida, dissolvido em DMF (2 ml), sendo então adicionados sucessivamente, após arrefecimento até 09C, dimetilaminopiridina (18 mg), anidrido butlrico (0,49 ml) e tributilamina (0,7 ml). Após 24 horas à temperatura ambiente, adiciona-se bicarbona to de sódio (l ml de uma solução a 5%), sendo, 2 horas mais tarde, a mistura submetida a cromatografia numa coluna de Sephadex G-25 (l litro) eluida com cloreto de sódio 0,2 M. 0 produto é liofilj. zado, após ser dessalgado, originando um pó beige claro (0,24 g).

As outras fracçães são tratadas da mesma forma, originando

640

0397 W

Ζ’

-52os produtos correspondentes cuja análise IV revela a presença de uma banda éster a 1734 cm \ A taxa de sulfatização dos produtos (relação do sulfato para o carboxilo) não está modificada após a acilação.

Determinação da taxa de acilação:

Esta é determinada por cromatografia de fase gasosa, após butanôlise dos produtos por uma mistura de butano-ácido sulfúrico, seguida de extracção com clorofórmio dos ésteres butllicos e eliminação do butanol em excesso por lavagem com água.

EXEMPLO 22: Preparação de dermatana-sulfato 0-acetilado (IC 1947)

A uma solução arrefecida até OSC, do sal de tetrabutilamó nio de dermatana-sulfato (0,91 g), obtido nas mesmas condições das descritas para a obtenção do heparinato de tetrabutilamónio no Exemplo 1, em dimetilformamida (20 ml), adiciona-se, gota a qo ta, anidrido acético (l,35 ml; 14,2 mmoles), seguido de trietilamina (l,97 ml; 14,2 mmoles) e de dimetilaminopiridina (0,7 mmole). Após 24 horas à temperatura ambiente, adiciona-se água (40 ml), seguida de diálise durante 72 horas. 0 sal de sódio é obtido por passagem através de uma coluna Domex 50 H⁺, a OSC, seguido de neutralização pela soda. Obtém-se, após liofilização, um pó beige (0,52 g).

A dermatana-sulfato 0-acetilado apresenta as seguintes ca racterís ticas:

relação sulfato/carboxilo : 0,99 meq/g (produto de partida:l,05 meq/g) espectro de ^^C-RMN (metanol a 51,6 ppm, padrão interno) . sinal a 25,2 ppm CH^ de CH-j-CO-NH- (idêntico ao produto de partida) . sinal a 23,0 ppm CH^ de CH^-CO-O

648

0397 W

-5 3- ' EXEMPLO 23: Preparação de dermatana-sulfato 0-succinilado (10 2020) sal de tetrabutilamónio da dermatana-sulfato (l g) e a N,Ν-dimetilaminopiridina (110 mg) são dissolvidos em dimetilformamida anidra. Após adição de anidrido succinico (396 mg) e tributilamina (0,94 ml), o meio é incubado em condições anidras durante 2 horas a 609C. Após arrefecimento e adição de água (2 ml), efectua-se uma precipitação numa solução alcoólica gelada saturada em acetato de sódio. 0 precipitado é lavado com etanol, solubilizado em água apirogénica, em seguida dialisado contra bicarbonato de sódio a 5% durante 36 horas, seguidamente contra água durante 3 dias. Obtém-se, após 1iofilização, a dermatana-sulfato 0-succinilado, sob a forma de sal de sódio (0,83 mg).

espectro infra-vermelho (KBr) apresenta, a 1730 cm~^ e a 1420 cm as frequências características (número de onda) do grupo carboxílico.

espectro de RMN do carbono em D₂0 (metanol a 51,6 ppm como padrão interno) apresenta a 33; 34,5 e 183,6 ppm os sinais característicos do grupo succinilo, e a 25,3 ppm o sinal característico do metilo do grupo acetamido, idêntico ao produto de partida.

Relação sulfato/carboxilo : 0,51.

EXEMPLO 24: Preparação de heparina 0-butirilado previamente N-des-sulfatada e N-acetilada (IC 1948)

A heparina é N-des-sulfatada e, em seguida, N-acetilada de acordo com a técnica descrita por Nagasau/a e Inoue (Methods Carbohydr. Chem. Vol. VIII, p.291-294).

sal de tributilamónio (l g) é obtido por passagem sobre uma resina Dou/ex 50 H⁺, seguida de neutralização por uma solução de tributilamina em etanol.

Após liofilização e secagem, este sal é dissolvido em dimetilformamida (10 ml), sendo, em seguida, após arrefecimento até OSC, adicionados anidrido butírico (2 ml), tributilamina (2 ml) e dimetilaminopiridina (65 mg). Após 24 horas, é adicionada água

648

0397 W

-54(5 ml), sendo, em seguida, a mistura dialisada contra uma solução de bicarbonato de sódio a 5%, depois contra água. Após passagem sobre Domex 50 H⁺, seguida de neutralização pela soda, obtém-se o sal de sódio da heparina N-acetilada 0-butirilada.

espectro de RMN do carbono (metanol a 51,6 ppm, padrão interno) apresenta um sinal a 24,6 ppm característico do N-acetilo, e sinais a 16, 20 e 38 ppm característicos dos ésteres butíri cos.

A experiência pode ser repetida com uma heparina parcialmente N-des-sulfatada N-acetilada e conduzir a um produto parciaX mente N-des-sulfatado N-acetilado e 0-butirilado.

EXEMPLO 25: Preparação da dermatana-sulfato peracetilada (IC 1950) sal de tetrabutilamónio da dermatano-sulfato (0,8 g) dissolvido em dimetilformamida (20 ml), é acetilado por adição de dimetilaminopiridina (76 mg), anidrido acético (l,2 ml) e trietilamina (l,7 ml). A mistura é aquecida até 8020 durante 1 hora.

Após retorno à temperatura ambiente, é adicionada água (0,45 ml), seguida de uma solução 0,3M de acetato de sódio em eta nol (100 ml). Após centrifugação, o precipitado é dissolvido em água, sendo seguidamente dialisado contra água destilada. 0 sal de sódio é obtido por permuta sobre uma coluna de Domex 50 H⁺, s_e guida de neutralização pela soda. Obtém-se, após liofilização a dermatana-sulfato peracetilado (0,51 g).

Este produto apresenta uma relação sulfato/carboxilo de 1,07 meq/g (produto de partida : 1,05 meq/g) e contém cerca de três grupos acetilo por unidade dissacárida.

EXEMPLO 26: Preparação do éster benzílico da heparina 0-acetilada (IC 1949)

A uma solução do heparinato de tetrabutilamónio (l g) em dimetilformamida (10 ml), adiciona-se brometo de benzilo (0,17 ml). Após 24 horas à temperatura ambiente, adiciona-se acetato de tetrabutilamónio (220 mg). Após 24 horas, procede-se à aceti69 648

0397 W

-55lação do éster de benzilo formado. Para isto, é introduzida dimetilaminopiridina (57 mg), seguida de trietilamina (l,3 ml) e anidrido acético (0,9 ml).

Após retorno à temperatura ambiente, a mistura reaccional z

é agitada durante 24 horas. E então adicionada água, sendo, em seguida, o produto precipitado por uma solução saturada de acetato de sódio em etanol. Após diálise contra água destilada, pass_a gem sobre Domex 50 H⁺, neutralização pela soda e liofilização, obtém-se o sal de sódio do éster benzílico da heparina 0-acetilada (0,57 g).

produto apresenta uma relação sulfato/carboxilo de 3,6 meq/g (produto de partida não benzilado : 2,20 meq/g).

espectro do carbono (metanol a 51,6 ppm, padrão interno) apresenta sinais a 23,3 ppm (θ-acetilo) e a 131,6 ppm (benzilo).

sinal do CH-j de CHj-CO-NH, a -24,5 ppm, é idêntico ao do produto de partida.

EXEMPLO 27: Preparação do éster benzílico da dermatana-sulfato 0-acetilado (IC 1953) sal de tetrabutilamónio da dermatana-sulfato (l g) é dissolvido em dimetilformamida anidra (15 ml). A esta solução, arrefecida até 020, adiciona-se brometo de benzilo (0,25 ml), dei. xando-se depois durante 24 horas à temperatura ambiente.

E então adicionado o acetato de tetrabutilamónio (0,32 g) procedendo-se, após 24 horas à temperatura ambiente, à acetilação z

E introduzido anidrido acético (l,5 ml), seguido de trietilamina (2,2 ml) e de dimetilaminopiridina (96 mg). Após 24 ho ras, é adicionada água (0,6 ml), sendo, em seguida, o produto pre^ cipitado por adição de uma solução etanólica saturada de acetato de sódio.

produto é dialisado contra cloreto de sódio a 10%, seguido de água.

Obtém-se, após liofilização, o éster benzílico da dermata

649

0397 W .,.--ντπ·%£»

-56ηε-sulfato 0-acetilado (0,63 g).

EXEMPLO 28; Preparação da dermatana-sulfato 0-butirilads (IC 2 018) sal de tributilamónio da dermatana-sulfato (2 g), obtido nas mesmas condições das descritas para a obtenção do heparinja to de tributilamónio no Exemplo 2, e a N , N-dimetilaminopiridina (220 mg) são dissolvidos em dimetilformamida anidra (25 ml). Após arrefecimento até OSC, adiciona-se, gota a gota, anidrido butirico (5,9 ml), seguido de tributilamina (8,6 ml). Após 24 horas de incubação, e arrefecimento até OSC, é adicionada água (l ml); pre cipitação numa solução alcoólica gelada, saturada em acetato de sódio. 0 precipitado é lavado com etanol, solubilizado em água apirogénea e dialisado contra bicarbonato de sódio a 5% durante 36 horas, depois contra água durante 3 dias. Obtém-se, após liofilização, o sal de sódio da dermatana-sulfato 0-butirilado (l,3 9) · espectro de RMN do carbono em D₂0 (metanol a 51,6 ppm como padrão interno) apresenta a 15,6; 20,5 e 38,4 ppm os sinais característicos do grupo butirilo e a 25,2 ppm o sinal caracterh tico do metilo do grupo acetamido, idêntico ao produto de partida

Relação sulfato/carboxilo : 1,05.

EXEMPLO 29: Preparação da dermatana-sulfato 0-hexanoi1ada (IC 2019) sal de tributilamónio da dermatana-sulfato (2 g) e a N,N-dimetilaminopiridina (220 mg) são dissolvidos em dimetilforma mida anidra (25 ml). Após arrefecimento até 09C, adiciona-se, qo ta a gota, anidrido hexanóico (9,4 ml), seguido de tributilamina (8,6 ml). Após 24 horas à temperatura ambiente e arrefecimento até OSC, adiciona-se água (l ml) e efectua-se uma precipitação nu ma solução alcoólica gelada, saturada em acetato de sódio. 0 pre cipitado é lavado com etanol absoluto, solubilizado em água apiro génica e dialisado contra bicarbonato de sódio a 5/o durante 36 horas, depois contra água durante 3 dias. Obtém-se, após liofiliza. ção, 0 sal de sódio da dermatana-sulfato 0-hexanoilado (l g).

648

0397 W

-570 espectro de RMN do carbono em D₂0 (metanol a 15,6 ppm como padrão interno) apresenta a 15,9; 24,2; 26,5; 33,1 e 36,4 ppm os sinais caracteristicos do grupo 0-hexanoilado, e a 25,2 ppm o sinal característico do metilo do grupo acetamido, idêntico ao produto de partida.

Relação sulfato/carboxilo : 1,02.

EXEMPLO 30: Colocação em evidência da 0-acetilação selectiva pelo processo de acordo com o invento e comparação com outros processos de acilação processo de acordo com o presente invento foi comparado com os processos das patentes FR 2100735 e EP 256880. Em particLi lar, as características do éster acético da heparina preparado de acordo com o processa do invento (IC 1938, Exemplo l) foram compa^ radas com as do éster acético da heparina obtido aplicando as con diçães operatórias descritas na patente FR 2100735 (produto A) e as dos ésteres acéticos da heparina obtidos de acordo com os processos operatórios dos Exemplos 3 e 4 da patente EP 256880 (prod.u tos B e C) .

a) Preparação do produto A

Numa solução de heparinato de tetrabutilaménio (l g) dissolvida em dimetilformamida anidra (10 ml), introduz-se diciclo-hexilcarbodiimida (4,2 g) dissolvida em dimetilformamida (15 ml) sendo, em seguida, adicionado, gota a gota, em 45 minutos a + 420, ácido acético (l,16 ml) dissolvido em dimetilformamida (25 ml).

Após 24 horas, à temperatura ambiente, a mistura reaccional é filtrada e concentrada sob vácuo. □ resíduo é reposto em suspensão em éter. Após filtração e lavagem, o precipitado é dia lisado contra água destilada. 0 sal de sódio é obtido por passagem sobre uma coluna de resina Dou/ex H⁺ , seguida de neutralização pela soda. Dbtêm-se 0,493 g de produto A.

Esta preparação foi igualmente realizada durante 48 horas a +4SC.

b) Preparação dos produtos B e C

0s produtos B e C foram preparados por acetilação da hepa

648

0397 W

-58rina, numa mistura de formamida e piridina, pelo cloreto de acet_i lo, utilizando 2 ml de cloreto de acetilo para o produto B e 40 ml para o produto C, nas condições descritas nos Exemplos 3 e 4 da patente EP 256880. 0 éster acético é, em seguida, retomado em água e dialisado contra cloreto de sódio.

c) Resultados

As características dos produtos são fornecidas na Tabela

1. As características da heparina de partida utilizada em cada ensaio são dadas a titulo de referência.

TABELA 1

Produto	Relação Sulfato/Carboxilo (meq/g)	Titulo de APTT* ui/mg	Titulo de YW* u/ mg
IC 1938	2,28	91	70
Heparina de	2,20	160	160
partida
A	3,40	42	41
Heparina de	2,40	160	160
partida
B	2,10	57	39
C	1,15	< 2	0,6
Heparina de	2,40	160	160
partida

X

Os títulos de APTT e de Yin e Wessler são medidos in vitro

Os resultados mostram que, ainda que os títulos de APTT e de YW sejam inferiores para todos os produtos aos da heparina de partida, e isto mais fortemente para os produtos A, B e 0, apenas o produto IC 1938 conserva uma relação sulfato/carboxilo praticamente idêntica à da heparina de partida. Isto resulta do facto do processo de acordo com o invento permitir acilar selectivamen69 648

0397 W

-59te as funções hidroxilo, sem alterar os grupos funcionais da hep_a rina, o que é confirmado pela análise química dos produtos.

Os produtos IC 1938, A, B e C, foram analisados em RMN do carbono (metanol a 51,6 ppm, padrão interno). Os espectros destes produtos, assim como o da heparina de partida são dados como se segue:

Figura 1: heparina de partida

Figura 2: IC 1938 „

Figura 3: produto A após 24 horas de reacção

Figura 4: produto A após 48 horas de reacção

Figura 5: produto B

Figura 6: produto C

Os resultados são os seguintes:

1. 0 produto IC 1938 apresenta no espectro do carbono (figura 2):

um sinal a 23,4 ppm correspondente ao CH^ do CH^-CO-O, um sinal a 24,4 ppm correspondente ao CH^ do CH^-CQ-NH, idêntico ao sinal presente na heparina de partida.

^Lstes sinais mostram que os grupos aminados e carboxilo foram respeitados e que houve, na realidade, acetilação selectiva ao nível dos grupos hidroxilo.

2. A análise do produto A em espectroscopia de RMN do carbono mostra que o produto obtido em maioria, quer após 24 horas quer após 48 horas (figuras 3 e 4), é um derivado de iso-ureia da hepa^ rina, cujas funçães carboxilo estão substituídas por um grupo

NH - C devido à utilização da diciclo-hexilcarbodiimida. De facto, obser vam-se sinais importantes correspondentes aos átomos de carbono do grupo acima, a 28, 34, 54 e 156 ppm, enquanto que o sinal correspondente ao CH^ do CH^-CO-O a 23 ppm é muito fraco.

processo não permite, no entanto, obter uma o-acilação selectiva e conduz a uma alteração das funções carboxilo, que reflecte o aumento da relação sulfato/carboxilo.

9 6 4 θ 0397 W

-6 0- ·'

3. 0 produto Β apresenta no espectro do carbono (figura 3):

um sinal a 23,1 ppm correspondente ao CH^ do CH^-CO-O, um sinal a 24,B ppm correspondente ao CH^ do CH^-CO-NH, claramente mais intenso que os da heparina de partida e do IC 193Θ .

^Lstes sinais mostram que se observa não apenas uma 0-acetilação, mas igualmente uma forte l\l-acetilação. 0 processo de acilação utilizado, não selectivo, conduz a uma N-des-sulfatização parcial, seguida de uma acetilação das aminas, o que conduz, igualmente, a uma diminuição da relação sulfato/carboxilo.

4. 0 produto C apresenta no espectro do carbono:

um sinal	a 22	ppm correspondente	ao CH^	do	ch3-co-o,
um sinal	a 24	ppm,correspondente	ao CH^	do	CH-CO-NH, 3 ’
nitidamente	mais	intenso que os da	heparina	de	partida e o do

193B.

Como para o produto B, observa-se simultaneamente uma 0e uma N-acetilação. A N-des-sulfatização, mais importante do que para o produto B, conduz a uma forte diminuição da relação sulfato/ carboxilo.

Actividade farmacológica dos produtos de acordo com o invento

A/ Actividade anti-coaqulante in vitro:

1. Avaliação do titulo in vitro relativamente a uma escala-padrão

Esta medição foi efectuada com o auxilio do teste do ten; po de cefalina caulino sensibilizado (Diagnostica Stago, Asniòres França), em plasma humano. Os resultados são fornecidos na Tabela

2.

648

0397 W

-61TABELA 2

Produto	Titulo (ui/mg)
IC 1940	113
IC 1941	28
IC 1943	7
Heparina	160

IC 1940 = pio 5	heparina	0-butirilada	preparada	como	descrito	no Exem-
IC 1941 = pio 6	hepari na	0-hexanoilada	prepara da	como	descrito	π ο Ε x e jn
IC 1943 = pio 8	heparina	0-decanoilada	preparada	como	descrito	no Exem-

Os resultados obtidos mostram que os produtos selectivamente 0-acilados de acordo com o invento têm um título in vitro inferior ao da heparina, decrescendo a sua actividade anticoagulante à medida que a cadeia acilante aumenta.

2. Medição da actividade anticoaqulante in vitro dos produtos do invento no sangue humano:

Os ensaios são efectuados a duas doses dos produtos de acordo com o invento, 2 ^ug/ml e 4 y*g/ml em 5 ml de sangue humano. Um ensaio testemunha é igualmente efectuado para cada produto substituindo o produto a testar por soluto isotónico de NaCl.

Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, o sangue é centrifugado durante 20 minutos a 3000 rotaçães/minuto. 0 plasma sem plaquetas é decantado para permitir a realização dos seguintes testes:

TCK (tempo de cefalina caulino), com o auxilio do equipamento (kit) tempo de cefalina caulino sensibilizado (Diagnostica Stago, Asnieres, França),

R

Heptest (Hemachem, St. Louis, EUA).

648

0397 W

-62Os resultados são fornecidos na Tabela 3. Cada resultado corresponde à média de três ensaios.

TABELA 3

Produto	Dose (^*g/ml)	TCK (s)	HEPTEST (S)
Testemunha			48,00		21,50
		+	2,70	+	1,73
IC 1940	2		208,75		61,00
			45,54	+	8,52
IC 1940	4		428,00		101,00
		+	103,43	+	28,36
T es temunha			45,00		23,66
		+	5,00	+	2,08
IC 1941	2		53,00		40,33
		+	5,19	+	7,63
IC 1941	4		84,66		61,33
		+	15,01	+	11,01
Tes temunha			49,66		23,00
			8,50	+	4,35
IC 1943	2		50,00		23,00
		+	9,54	+	4,58
IC 1943	4		56,00		24,00
		+	10,00	+	5,29

Os resultados mostram, nos dois métodos, um alongamento do tempo de coagulação para os produtos IC 1940 e IC 1941. E_ste alongamento é proporcional à dose.

Em compensação, nestes métodos in vitro, o produto IC 1943 não mostrou senão uma acção fraca sobre o alongamento do tempo de coagulação.

648

0397 W

-6 33. Medição da actividade anticoaqulante in vitro dos produtos de acordo com o invento por tromboelastoqrafia no sangue humano:

Os produtos de acordo com o invento, nas doses de 2 yug/ml e 4 ^ug/ml, são colocadas em presença de 5 ml de sangue humano, c£ mo descrito no ensaio precedente, sendo realizado um tubo testemunha para cada produto substituindo o produto a testar por soluto isotónico de NaCl.

Após os 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, é realizado um traçado tromboelastográfico com o auxílio de um trom boelastógrafo Hellige em 0,25 ml de sangue recalcificado com 0,1 ml de CaCl₂ 0,058M.

Os resultados são fornecidos na Tabela 4.

TABELA 4

Produto	Dose (^*g/ml)	X Γ	k*	, * r + k	X amx	IPT*
Tes temunha			13,00		8,25		21,25		48,00		11,25
		+	0,81	+	1,25	+	1,50	+	2,44		2,36
IC 1940	2		33,50		22,25		55,75		35,50		2,57
		+	2,88	+	4,03	+	5,85	+	3,69	+	0,77
IC 1940	4		78,75		44,00		122,75		27,00		0,82
		+	17,34	+	8,68	+	13,02	+	16	+	0,27
T estemunha			10,50		4,50		15,00		57,00		37,00
		+	0,70	+	2,12	+	2,82	+	8,48	+	28,28
IC 1941	2		14,00		10,33		24,33		51,66		21,33
		+	3,00	+	6,50	+	6,00	+	10,96	+	19,85
IC 1941	4		20,33		15,00		35,33		40,33		4,66
		+	3,51	+	4,58	+	5,03	+	2,51	+	2,08

(continua)

648

0397 W

-64TABELA 4 (continuaç3o)

Tes temunha		13,33		9,00		22,33		47,00		10,33
		2,30	+	2,64	+	4,93	+	4,58	+	4,04
IC 1943	2	12,66		8,00		20,66		47,00		12,00
		+. 2,08	+	2,64	+	4,72	+	5,29	+	5,29
IC 1943	4	12,66		9,83		22,50		45,66		9,33
		+.2,08	+	3,01	+	5,07	+	5,77	+	4,04

x r = tempo de reacção k = tempo de coagulação correspondente a uma amplitude do traçado de 20 mm amx = amplitude máxima

IPT = índice de potencial trombodinãmico

Os resultados mostram que o IC 1940 e o IC 1941 conduzem a um aumento do r + k, uma diminuição da amx e do IPT, o que corresponde a uma hipocoagulação acrescida. Esta hipocoagulação aumenta simultaneamente em função da dose utilizada e do comprimento da cadeia acilante.

IC 1943, neste teste, não provoca modificação sensível dos parâmetros.

B/ Actividade anticoagulante in vivo:

1. Medição da actividade anticoagulante in vivo dos produtos de acordo com o invento no coelho (via i.v.):

Ds ensaios foram realizados em coelhos neozelandeses machos. Uma colheita sanguínea é efectuada ao nível da artéria med_i ana da orelha antes da injecção do produto.

Em seguida, injecta-se, na veia marginal da orelha, uma solução do produto a testar, de 25 mg do produto em 5 ml de soluto isotónico de NaCl.

R teste do TCK e o HEPTEST são realizados na colheita san

9 64 8 □ 397 W

-65guínea efectuada antes da injecção dos produtos, e nas colheitas efectuadas 6 h, 24 h, 48 h e 96 h após a injecção.

Os resultados são fornecidos nas figuras 7 e 8. Eles mos tram um alongamento nítido no tempo da actividade anticoagulante, aumentando este alongamento com o comprimento da cadeia acilante.

Com efeito, a actividade anticoagulante do produto IC 1940 é ainda nítida mais de 6 horas após a injecção, enquanto que ela é ainda nitida 24 horas após a injecção para o produto IC 1941 e que ela se prolonga até às 96 horas para o produto IC 1943.

2. Medição da actividade anticoagulante in vivo dos produtos de acordo com o invento por tromboelastoqrafia:

Os produtos a testar são injectados por via i.v., como descrito no ensaio precedente (25 mg em 5 ml de soluto isotónico z

de NaCl). E realizado um traçado tromboelastográfico com o auxílio de um tromboelastógrafo Hellige em 0,25 ml das amostras de sangue colhidas antes da injecção e 6 h, 24 h, 48 h e 96 h após a injecção, sendo efectuadas colheitas suplementares quando a actividade anticoagulante persiste para além das 96 horas.

Os resultados são fornecidos nas Tabelas 5, 6 e 7.

TABELA 5 : PRODUTO TESTADO : IC 1940

	r	k	r + k	amx	IPT
Antes da injecção	13	6	19	67	33
6 h após a injecção	91	60	151	56	2,1
24 h após a injecção	12	5	17	67	40
96 h após a injecção	8	3	11	70	77

648

0397 W

-66TABELA 6 : PRODUTO TESTADO : IC 1941

	r	k	r + k	amx	IPT
Antes da i nj ecção	13	5	18	67	40
6 h após a inj ecção	135	31	166	45	2,6
24 h após a injecção	19	12	31	58	11,5
48 h após a injecção	22	10	32	72	25

TABELA 7 : PRODUTO TESTADO : IC 1943

	r	k	r + k	amx	IPT
Antes da injecção	12	4	16	69	55
6 h após a injecção	40	27	67	>40	-
24 h após a injecção	13	7	20	72	36
48 h após a injecção	53	34	87	54,5	4,7
72 h após a injecção	112	185	297	>38	-
96 h após a injecção	82	45	127	62	3,6
168 h após a injecção	19	9	28	68	23
192 h após a injecção	17	5	22	70	46

648

0397 W

-67Os resultados obtidos mostram que para todos os produtos se nota um forte aumento do r + k e uma diminuição do IPT à 6^§. hora, o que indica um alongamento da hipocoagulabilidade. Isto prolonga-se até, pelo menos, 24 horas após a injecção para o produto IC 1941 e é ainda mensurável 96 horas após a injecção para o produto IC 1943.

Constata-se, portanto, que todos os produtos têm uma forte actividade anticoagulante in vivo, que esta actividade está prolongada no tempo, e que o IC 1943, que não se apresentava senão pouco ou nada activo nos ensaios in vitro, se verificou muito activo e fortemente prolongado (retard) nos ensaios in vivo.

3. fl actividade anticoagulante dos produtos IC 1945, IC 1957 e

IC 1958, preparados respectivamente de acordo com os Exemplos 12, e 14, foi igualmente testada in vivo no coelho.

Os resultados mostraram uma farmacocinética alongada por via intravenosa e por via subcutânea para os produtos IC 1957 e IC 1958.

C/ Actividade num modelo in vitro de inibição dos vírus HIV-1 e

A2:

Ds produtos preparados de acordo com o invento foram testados num modelo de inibição dos vírus HIV —1 e HIV-2 in vitro, tal como descrito em Pauujels, R e colab. , D. Virol. Methods, 16 (1987), 171-185.

Todos os produtos testados se verificaram ser muito activos em doses totalmente desprovidas de citotoxicidade. Em particular, constatou-se que os produtos IC 1925 e IC 1926 eram mais activos que o produto de partida.

D/ Actividade num modelo in vitro de inibição da formação de sincício

Os sincícios são células gigantes, de núcleos múltiplos, formadas pela fusão de linfócitos T4 sãos com os linfócitos T4 infectados.

Os produtos preparados de acordo com o invento foram tes69 648

0397 W

/.

-68- tados num modelo de co-cultura de células M0LT4 (linfócitos T4 sãos) e de células HUT-78/HTLV III B (linfócitos T4 infectados de linha humana).

Todos os produtos testados se verificaram ser activos nes te modelo, em doses totalmente desprovidas de citotoxicidade. Em particular, os produtos IC 1924, IC 1925 e IC 1926 apresentaram-se mais activos que o produto de partida.

E/ Actividade num modelo in vitro de inibição de diferentes vírus com envólucro

A actividade dos produtos preparados de acordo com o invento em relação à inibição de diferentes vírus a ADN ou a ARN com envólucro, em particular os virus seguintes:

HSV 1 e 2 (vírus do Herpes Simplex 1 e 2, vírus a ADN)

VSV (vírus da estomatite vesicular (vasicular stomatitis), vírus a ARN) vírus Sindbis (vírus a ARN)

Todos os produtos testados se mostraram activos na inibição destes vírus, em doses desprovidas de citotoxicidade. Em pa_r ticuiar, os produtos IC 1924, IC 1925 e IC 1926, apresentaram uma actividade fortemente aumentada em relação ao VSV e ao vírus S ind bis, em comparação com o produto de partida.

F/ Actividade num modelo in vivo de inibição da proliferação das células musculares lisas

Os produtos preparados de acordo com o invento foram testados num modelo de inibição da proliferação das células musculares lisas in vivo no rato (modelo do catéter de balão, tal como descrito em Clouies, A. W. e Cloues, Μ. M. , Labor. Investig., 5_2 (6) (1985), 612-616.

Os produtos testados mostraram-se activos. Em particular, os produtos IC 1924, IC 1925 e IC 1926 apresentaram uma actividade aumentada em relação ao produto de partida.

Claims (3)

1. reivindicaçOes

   1 - Processo de preparação de glicosaminoglicanos selectjL vamente 0-acilados correspondendo à fórmula (i), seguinte:

   (I) na qual:

   G representa um grupo (a) de fórmula:

   (a)

   OR ou um grupo (a¹) de fórmula:

   ou um grupo (b) de fórmula:

   (b)

   69 648

   0397 W

   -70U representa um grupo (c) de fórmula:

   ou o resíduo do grupo (c) ou do grupo (d) após oxidação periódica seguida de uma |3 -eliminação ou de uma hidrólise ácida;

   A representa um grupo R^, um grupo R^-(c), um grupo R^-(d), ou um grupo (e) de fórmula:

   ou o resíduo do grupo (c) ou do grupo (d) após oxidação periódica seguida de uma β -eliminação ou de uma hidrólise ácida;

   B representa um grupo 0-R^, um grupo (a)-OR^, um grupo (a')-DR^, um grupo (b)-OR^, um grupo (f) de fórmula:

   69 648

   0397 W ou um grupo si /, (g) de fórmula:

   ou representa um grupo (a), um grupo (a¹), ou um grupo (b) aos quais permanece ligado um residuo de (c) ou de (d) tal como presente após oxidação periódica seguida de uma ^3 -eliminação ou de uma hidrólise ácida;

   R^ representa H, SO^ ou acilo, sendo acilo o residuo de um ácido carboxílico ou dicarboxílico não o< - ^,-insaturado, es colhido entre:

   . um grupo alcanoilo de 1 a 18 átomos de carbono;

   . um grupo alcanoilo de 2 a 3 átomos de carbono substituído por:

   - um grupo cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono, um grupo fenilo facultativamente substituído por um ou vários radicais alquilo de 1 a 14 átomos de carbono, átomos de h_a logéneo ou grupo NO^ ou OCH^, um radical hidrocarboneto alifático insaturado de 4 a 16 átomos de carbono;

   69 648

   0397 W

   -72. um grupo benzoílo facultativamente substituído por um ou vários radicais alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, ãtomos de halogéneo ou grupo NO2 ou QCH^;

   . um grupo cicloalquilo (3-7 C) carbonilo;

   R2 representa SO-j e/ou um radical acetilo, sob a condição de a proporção de N-acetilglucosamina ser, no máximo, igual à da heparina quando R^ representa um radical acetilo;

   R-j representa um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, de preferência de 1 a 4 átomos de carbono, ou um radical fenil-alquilo de 7 a 12 átomos de carbo no, ou um catião metálico alcalino ou alcalino-terroso;

   n é um número inteiro de 1 a 80, estando R^ acilado numa proporção de, pelo menos, 0,1 a 3 grupos acilo por unidade dissacaridica, de preferência de 0,5 a 2 grupos acilo e dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por (l) se transformar um gl icosaminogl icano de f 6r_ mula (IX) seguinte:

   G — U^l (IX) na qual:

   G° representa um grupo (a)° de fórmula:

   ou um grupo (a’)° de fórmula:

   69 648

   0397 W ou um grupo (b)° de fórmula:

   (b)°

   L)° representa um grupo (c)° de fórmula: goor₃ /- D (c)° / ou o resíduo do grupo (c)° ou do grupo (d)° após oxidação periô dica seguida de uma /3-eliminação ou de uma hidrólise ácida;

   69 648

   0397 W *X

   A° representa um grupo R^°, ^um grupo R^°-(c)°, um gru-74po Rj^ °-(d)°, ou um grupo (e)° de fórmula:

   ou o resíduo do grupo (c)° ou do grupo (d)° após oxidação periódi. ca seguida de uma p -eliminação ou de uma hidrólise ácida;

   B° representa um grupo 0R^°, um grupo (a)°-0R^^D, um grupo (a')-0R °, um grupo (b)°-0R^°, ou um grupo (f)° de fórmula:

   ou representa os grupos (a)°, (a')° ou (b)° aos quais permanece ligado um resíduo de (c)° ou de (d)° tal como presente após oxid_a ção periódica seguida de uma p-eliminação ou de uma hidrólise ácida;

   69 648

   0397 W

   -75R^⁰ representa H ou S0^ ;

   R₂ representa SO^^-, ou um radical acetilo, com a condi ção de a proporção de N-acetilglucosamina ser no máximo igual à da heparina quando R^ representa um radical acetilo;

   R^ representa um átomo de hidrogénio, ou um radical a_l quilo de 1 a 10 átomos de carbono ou um radical fenil-alquilo de 7 a 12 átomos de carbono ou um catião metálico alcalino ou alcal_i no-terroso;

   n é um número inteiro de 1 a 80, num sal do referido glicosaminoglicano solúvel num solvente orgânico aprótico polar;
2. (2) se tratar este sal com um anidrido de fórmula:

   Acilo — 0 — Acilo na qual Acilo é definido tal como anteriormente, no referido solvente orgânico aprótico polar, em presença de quantidades catalíticas de piridina ou de uma dialquilaminopiridina e dum aceitador de protães ;
3. (3) se precipitar o produto assim obtido por acção de uma solução de acetato de sódio em etanol; e (4) se isolar o glicosaminoglicano selectivamente 0-acilado por dissolução, em água, do precipitado assim obtido e por diálise, e se transformar, facultativamente, o sal de sódio do glicosaminoglicano selectivamente 0-acilado assim obtido num outro sal farmaceuticamente aceitável.

   2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por o glicosaminoglicano utilizado na etapa (l) ser escolhido a partir do grupo constituído pela heparina, uma mistura de fragmentos de heparina tendo uma massa molecular inferior a 10 000 dalton, uma mistura de fragmentos de heparina tendo uma massa molecular média situada entre 2000 e 7000 dalton, uma mistura de fragmentos de heparina tendo uma massa molecular média de cerca de 4 500 dalton, uma mistura de fragmentos de heparina tendo uma massa molecular média de cerca de 2 500 dalton, uma mistura de

   6 9 6 46 0397 W

   -76fragmentos de heparina homogéneos em relação à sua massa molecular, um fragmento de heparina obtido por síntese, homogéneo tanto no que se refere ã sua massa molecular como no que se refere à sua funcionalização.

   3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza. do por o glicosaminoglicano utilizado na etapa (l) ser a heparina ou uma fracção ou um fragmento de heparina desprovidos de sítio de fixação à antitrombina III.

   4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por o glicosaminoglicano utilizado na etapa (l) ser escolhido de entre o grupo constituído pelo dermatana-sulfato e seus fragmentos ou as candroitinas-4- e -6-sulfato e seus fragmentos.

   5 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o glicosaminoglicano da etapa (l) ser um sal de amina terciária, em particular um sal de tributilamina, ou um sal de amónio quaternário, em particular um sal de tetrabutilamónio.

   6 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o anidrido utilizado na etapa (2) ser o anidrido de um ácido alcanóico contendo 2 a 10 átomos de carbono, vantajosamente de 4 a 10, de preferência 4 ou 6 átomos de carbono.

   7 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por a etapa (2) ser conduzida num solvente aprótico polar escolhido de entre o grupo constituído pela dimetilformamida, a hexametilfosforotriamida, a piridina, ou uma mistura destes solventes entre eles ou com o diclorometano.

   8 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por se utilizar, como aceitador de protões, no decurso da etapa (2), uma base escolhida de entre o grupo constituído pela piridina, a trietilamina e a tributilamina.

   9 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por a diàlise da etapa (4) ser efectuada em presença de uma base fraca.

   69 643

   0397 W

   -7710 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por a etapa (2) ser efectuada a uma temperatura situada entre OSC e 10030, mais particularmente entre 50SC e 1003C.

   11 - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se associar, como substância activa, uma quantidade eficaz de, pelo menos, um glicosaminoglicano seleç. tivamente 0-acilado, preparado de acordo com qualquer uma das re.i vindicações anteriores, com um veiculo farmacêutico.

   12 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracteri zado por o glicosaminoglicano selectivamente 0-acilado se encontrar sob a forma de um sal farmaceuticamente aceitável tal como um sal de sódio, de magnésio ou de cálcio.

   13 - Processo de acordo com as reivindicações 11 e 12, cs racterizado por o veiculo farmacêutico ser apropriado para a admi nistração por via oral, e por a composição farmacêutica se apresentar sob a forma de gélulas gastro-resistentes, de comprimidos ou pastilhas, de pílulas, ou ainda sob a forma de soluções bebíveis, contendo vantajosamente de 50 mg a 5 g por unidude de dosagem, de preferência de 100 a 1000 mg para as gélulas, pastilhas ou pílulas, e de 10 a 150 mg para os solutos bebíveis.

   14 - Processo de acordo com as reivindicações 11 e 12, cq racterizado por a composição farmacêutica se apresentar sob a for. ma de solução injectável, esterilizada ou esterilizãvel, para a administração por via intravenosa, intramuscular ou sub-cutânea, contendo essas soluções vantajosamente de 50 a 200 mg/ml de glicç saminoglicano selectivamente 0-acilado quando é destinada à injecção por via sub-cutânea, ou de 20 a 200 mg/ml de glicosaminoglicano selectivamente 0-acilado quando é destinada à injecção por via intravenosa ou por perfusão.

   15 - Processo de acordo com a reivindicação 1, de prepara ção de glicosaminoglicanos selectivamente 0-acilados com a fórmula II seguinte:

   69 648

   0397 W na qual:

   A tem os significados da reivindicação 1;

   R^ representa H e/ou S0^ e/ou um grupo acilo tal como definido na reivindicação 1;

   R^ representa S0^^- e/ou um radical acetilo, com a condição de a proporção de N-acetil glicosamina ser, no máximo, igual à da heparina quando R^ representa um radical acetilo;

   R-j representa um átomo de hidrogénio, um radical alqu_i lo de 1 a 10 átomos de carbono, de preferência de 1 a 4 átomos de carbono, um radical fenil-alquilo de 7 a 12 átomos de carbono, ou um catião metálico alcalino ou alcalino-terroso 5

   B representa (a)-0R_b ou (f), sendo (a) e (f) tal como definidos na reivindicação 1, ou 0R^, ou um grupo (a) ao qual per manece ligado um resíduo de (c) ou de (d) tal como presente após oxidação periódica seguida de uma β -eliminação ou de uma hidról_i se ácida;

   n é um número inteiro de 1 a 80, com a condição de, quando A representar R^ , um grupo R^-(c) ou um grupo R^-(d) e B representar 0-R^, um grupo (a)-OR^ ou um grupo (b)-OR^, n ser um número inteiro de 1 a 16, caracterizado por o glicosaminoglicano utilizado na etapa (l) ter a fórmula IX seguinte:

   (IX)

   69 648

   0397 W

   -79na qual

   G° representa um grupo (a)° tal como definido na reivindicação 1 ;

   - U° representa um grupo (c)° tal como definido na reivindicação 1 ;

   ou um grupo (d)° tal como definido na reivindicação 1 ou o resíduo do grupo (c)° ou do grupo (d)° após oxidação periód.i ca seguida de uma p -eliminação ou de uma hidrólise ácida;

   A° representa um grupo R^° um grupo Rj°-(c)°, um grupo R₃°-(d)° ou um grupo (e) definido como na reivindicação 1 ou o resíduo do grupo (c)° ou do grupo (d)° após oxidação periódi. ca seguida de uma β -eliminação ou de uma hidrólise ácida;

   B° representa um grupo 0R^°, um grupo (a)°-0R^°, ou um grupo (f)° definido como na reivindicação 1 ou representa os grupos (a)° ou (a)° ao qual permanece ligado um resíduo de (c)° ou de (d)° tal como presente após oxidação periódica seguida de uma -eliminação ou de uma hidrólise ácida;

   R^°, R2° e R-j° têm os significados da reivindicação 1;

   n é um número inteiro de 1 a 80, com a condição de, quando A representar R^, um grupo R^-(c) ou um grupo R^-(d) e B representar 0-R^ , um grupo (a)-0R₃ ou um grupo (b)-OR^, n ser um número inteiro de 1 a 16.

   16 - Processo de acordo com a reivindicação 1, de prepara ção de glicosaminoglicanos selectivamente 0-acilados com a fórmula (II) seguinte:

   69 648

   0397 W

   ... - —

   ..---3 na qual:

   A tem os significados da reivindicação 1,

   R^ representa H e/ou S0^ e/ou um grupo acilo, sendo acilo o resíduo de um ácido carboxilico ou dicarboxílico não £<-/3 insaturado escolhido de entre:

   . um grupo alcanoilo de 4 a 18 átomos de carbono, . um grupo alcanoilo de 2 ou 3 átomos de carbono, subst_i tuldo por:

   um grupo cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono, um grupo fenilo facultativamente substituído por um ou vários radicais alquilo de 1 a 14 átomos de carbono, átomos de ha^ logéneo ou grupo NQ₂ ou OCH^, um radical hidrocarboneto alifático insaturado de 4 a 16 átomos de carbono, . um grupo benzoílo facultativamente substituído por um ou vários radicais alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, átomos de halogéneo ou grupo N0₂ ou OCH^, . um grupo cicloalquilo (3-70) carbonilo;

   F?₂ representa 50^ e/ou um radical acetilo, com a condi ção de a proporção de N-acetilglicosamina ser, no máximo, igual à da heparina, quando R^ representa um radical acetilo;

   R^ representa um átomo de hidrogénio ou um radical al69 648

   0397 W

   5**

   -81quilo de 1 a 10 átomos de carbono, de preferência de 1 a 4 átomos de carbono, ou um radical fenil-alquilo de 7 a 12 átomos de carbo no, ou um catião metálico alcalino ou alcalino-terroso;

   - n é um número inteiro de 1 a 80, estando R^ acilado numa proporção de, pelo menos, 0,5 a 2 grupos acilo por unidade dissacaridica, de preferência 1 grupo acilo, caracterizado por o glicosaminoglicano utilizado na etapa (l) ter a fórmula IX seguinte:

   (IX) na qual:

   G° representa um grupo (a)° tal como definido na reivindicação 1;

   U° representa um grupo (c)° tal como definido na reivindicação 1 ;

   ou um grupo (d)° tal como definido na reivindicação 1 ou o residuo do grupo (c)° ou do grupo (d)° após oxidação periódi ca seguida de uma ^-eliminação ou de uma hidrólise ácida;

   A° representa um grupo R^⁰ um grupo R₃°-(c)°, um grupo R₁°-(d)° ou um grupo (e)° definido como na reivindicação 1 ou o residuo do grupo (c)° ou do grupo (d)° após oxidação periódi. ca seguida de uma β -eliminação ou de uma hidrólise ácida;

   B° representa um grupo OR^⁰, um grupo (a)°-0R₃°, ou um grupo (f)° definido como na reivindicação 1 ou representa os grupos (a)° ou (a)° ao qual permanece ligado um resíduo de (c)° ou de (d)° tal como presente após oxidação periódica seguida de uma (3 -eliminação ou de uma hidrólise ácida;

   Rj°> R2° ^e Hj⁰ têm os significados da reivindicação 1 n é um número inteiro de 1 a 80.

   69 648

   0397 W

   -8217 - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a pre paração de glicosaminoglicanos selectivamente 0-acilados com a fórmula ( III) seguinte:

   na qual;

   A representa R^ , ou R^-(c) ou R^-íd), tal como definidos na reivindicação 1;

   R^ representa H e/ou SO^ e/ou um grupo acilo tal como definido na reivindicação 1;

   R₂ representa SO^ e/ou um radical acetilo, com a condi ção de a proporção de N-acetilglucosamina ser, no máximo, igual à da heparina quando R^ representa um radical acetilo;

   R^ representa um átomo de hidrogénio e/ou um radical alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, de preferência de 1 a 4 átomos de carbono, ou um radical fenil-alquilo de 7 a 12 átomos de carbono, ou um catião metálico alcalino ou alcalino-terroso;

   n é um número inteiro de 3 a 12, caracterizado por o glicosaminoglicano utilizado na etapa (l) ter a fórmula IX seguin te:

   (IX) na qual representa um grupo (a)° tal como definido na rei v i_n

   69 648

   0397 W

   AT

   -83dicação 1;

   - U° representa um grupo (c)° tal como definido na reivindicação 1;

   ou um grupo (d)° tal como definido na reivindicação 1,

   A ⁰ representa um grupo R^° um grupo R^°-(c)° um grupo

   R_i°-(d)°

   - B° representa um grupo (f)° definido como na reivindicação 1 ;

   R^°, R₂° e R-j° têm os significados da reivindicação 1;

   n é um número inteiro de 3 a 12.

   18 - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a pre^ paração de glicosaminoglicanos selectivamente 0-aciladas com a fórmula (IV) seguinte:

   na qual:

   Ri representa H e/ou SO^ e/ou um grupo acilo tal como definido na reivindicação 1;

   R₂ representa SO^ e/ou um radical acetilo, com a condição de a proporção de N-acetil glucosamina ser, no máximo, igual à da heparina, quando R^ representa um radical acetilo;

   R^ representa um átomo de hidrogénio e/ou um radical a_l quilo de 1 a 10 átomos de carbono, de preferência de 1 a 4 átomos de carbono, ou um radical fenil-alquilo de 7 a 12 átomos de carbo no, ou um catião metálico alcalino ou alcalino-terroso;

   69 64Β

   0397 W

   -84o resíduo do grupo (c)° ou do grupo (d)° após oxidação periódica seguida de uma β -eliminação ou de uma hidrólise ácida, tal como definido na reivindicação 1,

   B° representa (b)°-0R^°, ou (g)°, ou 0R^° ou um grupo (b)° ao qual permanece ligado um resíduo de (c)° ou de (D)° tal como presente após oxidação periódica seguida de uma beta eliminação ou de uma hidrólise ácida;

   B representa (a)-OR^, tal como definido na reivindicação 1, ou OR;

   n é um número inteiro de 2 a 20, caracterizado por o glicosaminoglicano utilizado na etapa 1 ter a fórmula IX seguinte:

   — B° (IX) n

   G° representa um grupo (a)° tal como definido na reivi_n dicação 1 ;

   U° representa um grupo (c)° tal como definido na reivindicação 1 ;

   ou um grupo (d)° tal como definido na reivindicação 1;

   A° representa um grupo (e)° definido como na reivindicação 1;

   B° representa (a)°-0R^° ou 0R^°;

   R^°, R₂° e Rj° tem os significados da reivindicação 1;

   n é um número inteiro de 2 a 20.

   19 - Processo de preparação de acordo com a reivindicação 1, de glicosaminoglicanos selectivamente 0-acilados com a fó_r mula (u) seguinte:

   69 648

   0397 W (V) na qual:

   A representa R^-(c), R -(d) ou o resíduo de (c) ou de (d) após oxidação periódica seguida de uma p -eliminação ou de uma hidrólise ácida;

   B representa (a)-DR^, ou um grupo (a) ao qual permanece ligado um resíduo de (c) ou de (d) tal como presente após oxidação periódica seguida de uma β -eliminação ou de uma hidrólise ácida ;

   R^ tem os significados dados na reivindicação 1;

   R₂ representa S0^ , ou um radical acetilo, sendo a pro porção de SD^^- de cerca de 90/o;

   R representa um átomo de hidrogénio ou um catião me tá lico alcalino ou alcalino-terroso;

   n é um número inteiro de 1 a 80, caracterizado por o glicosaminoglicano utilizado na etapa (l) ter a fórmula IX seguin te:

   A° — G° - - U° — B° n (IX) na qual - G° representa um grupo (a)° tal como definido na rei- v i ndicação 1; - U° representa um grupo (d)° tal como definido na rei-

   vindicação 1;

   69 646

   0397 W

   -86- <

   - A° representa R^°-(c)°, R^°-(d)° ou o resíduo de (c)° ou do (d)° após oxidação periódica seguida de uma β -eliminação ou de uma hidrólise ácida, sendo (c)° e (d)° definidos como na reivindicação 1;

   B° representa (a)°-0R^°, ou um grupo (a)° ao qual permanece ligado um resíduo de (c)° ou de (d) tal como presente após oxidação periódica seguida de uma β-eliminação ou de uma h_i drólise ácida; sendo (a)°, (c)° e (d)° definidos como na reivindicação 1,

   - R^° tem os significados dados na reivindicação 1;

   - R2° representa SO^^- ou um radical acetilo, sendo a pro porção de S0₃ ^_ de cerca de 90%;

   R^⁰ representa um átomo de hidrogénio ou um catião metálico alcalino ou alcalino-terroso;

   n é um número inteiro de 1 a BO.

   20 - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a pre paração de glicosaminoglicanos selectivamente O-acilados com a fórmula (Vil) seguinte:

   (VII) na qual:

   A representa R^, R^-(c), ou R^-(d), tal como definidos na reivindicação 1;

   R^ representa um radical alcanoílo de 2 a 18 átomos de carbono;

   R ₃ representa um átomo de hidrogénio ou um catião meW

   69 648

   0397 W

   -87- - lico alcalino ou alcalino-terroso;

   B representa (a)-OR^, tal como definido na reivindicação 1, ou OR;

   n é um número inteiro de 1 a 80, caracterizado por o glicosaminoglicano utilizado na etapa (l) ter a fórmula IX

   A°

   G° — u° — 8° n (IX) na qual

   G° representa (a)° tal como definido na reivindicação

   U° representa (c)° ou (d)° tal como definidos na reivindicação 1, R₂° representa um radical acetilo;

   A° representa R^°, R^°-(c)° ou R^°-(d)° tal como definidos na reivindicação 1;

   - B° representa (a)°-0R^° ou 0R^° tal como definidos na reivindicação 1;

   R^° representa H ou S0^ e R-j° representa H ou um catião metálico alcalino ou alcalino-terroso;

   n é um número inteiro de 1 a 80.

   21 - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a pre paração de glicosaminoglicanos selectivamente 0-acilados com a fórmula (VIII) seguinte:

   (VIII)

   69 649

   0397 W

   -88na qual:

   A tem os significados da reivindicação 1;

   R representa H e/ou SO^^- e/ou um grupo acilo tal como definido na reivindicação 15

   R^ representa um átomo de hidrogénio, um radical alqui_ lo de 1 a 10 átomos de carbono, de preferência de 1 a 4 átomos de carbono, ou um radical fenil-alquilo de 7 a 12 átomos de carbono, ou um catião metálico alcalino ou alcalino-terroso;

   B representa (b)-OR^ ou (g), tal como definidos na re_i vindicação 1, ou 0R^, ou um grupo (b) ao qual permanece ligado um resíduo de (c) ou de (d) tal como presente após oxidação periódica seguida de uma {5 -eliminação ou de uma hidrólise ácida;

   n é um número inteiro de 1 a 80, caracterizado por o glicosaminoglicano utilizado na etapa (l) ter a fórmula IX seguiri te:

   ft° — G° — U° n - B° (IX) na qual - G° representa um grupo (b)° tal como definido na rei- vindicação i; - u° representa um grupo (c)° ou um grupo (d)° tal como

   definidos na reivindicação 1;

   A° representa um grupo R^° um grupo R^°-(c)°, um grupo R^°-(d)° ou um grupo (e)° ou o resíduo do grupo (c)° ou do grupo (d)° após oxidação periódica seguida de uma β -eliminação cu de uma hidrólise ácida, tal como definidos na reivindicação 1;

   B° representa (b)°-DR^°, ou (g)° ou DR^° ou um grupo (b)° ao qual permanece ligado um resíduo de (c) ou de (d) tal como presente após oxidação periódica seguida de uma -eliminação ou de uma hidrólise ácida;

   69 648

   0397 W

   -89Rj_° e R-j° tèm os significados da reivindicação 1; n é um número inteiro de 1 a 80.