HU206222B

HU206222B - Process for producing selectively o-acylated glycosaminoglycans and pharmaceutical compositions comprising same

Info

Publication number: HU206222B
Application number: HU893708A
Authority: HU
Inventors: Maurice Petitou; Jean-Claude Lormeau; Jean Choay
Original assignee: Sanofi Sa
Priority date: 1988-07-21
Filing date: 1989-07-21
Publication date: 1992-09-28
Also published as: DE68916878D1; DK362789D0; DD285606A5; AU620632B2; IE892367L; AU3885689A; MA21602A1; EP0356275A1; ATE108804T1; RU1831487C; IL91058A0; FI893518A0; OA09125A; FR2634485B1; YU172789A; DK362789A; NZ230041A; FI893518A; NO892986L; ES2056239T3

Description

A találmány tárgya eljárás szelektíven O-acilezett glikózaminok-glikánok, valamint ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására. A „glikózamino-glikán” kifejezés alatt uronsavak (D-glikuronsav vagy L-iduronsav) és amino-cukrok (az utóbbiak glikózaminok vagy galaktózaminok) ismétlődő egységeiből felépülő anyagokat értünk.

A természetes eredetű glikózamino-glikánok 1-+4 vagy 1—\3 kötésen át kapcsolódó uronsav alegységből (glikuronsav vagy iduronsav) és glikózamin alegységből (glikózamin vagy galaktózamin) képzett diszacharid-egységek ismétlődő szekvenciáiból álló, többé vagy kevésbé homogén elegyek.

A glikózamino-glikánokban a hidroxilcsoportokat különböző módon funkciós csoportok, közelebbről szulfátcsoportok helyettesítik, míg a glikózaminok aminocsoportjait szulfát- és/vagy acetilesöpörtök helyettesítik.

Az itt tárgyalt glikózamino-glikánokhoz 4-féle típusú termék tartozik: heparin és bizonyos származékai, heparán-szulfát, kondroitin-szulfát A, kondroitin-szulfát B (ezt a terméket közelebbről dermatán-szulfátnak nevezik) és kondroitin-szulfát C.

A kondroitin-szulfátok egymással analóg szerkezetét Casu, Benito az „Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry” c. könyvsorozat 43. kötetében (megjelent 1985-ben az Academic Press Inc. kiadó gondozásában) ismerteti. Ezeket a vegyületeket az (A) és (B) általános képletnek megfelelő bázikus diszacharid-szerkezetek jellemzik. Ezekben a képletekben R jelentése szulfátcsoport (SOjesoport) és/vagy acetilcsoport és a karboxilcsoporthoz vezető hullámos vonal arra utal, hogy a karboxilcsoport a gyűrű síkja alatt van (iduronsav-egység) vagy a gyűrű síkja fölött van (glikonsav-egység).

Az (A) képlettel jellemezhető alapszerkeztű glikózamino-glikánokat heparin típusú glikózamino-glikánoknak (vagy rövidítve: GAG) nevezzük. Ezek közé a vegyületek közé tartoznak a heparinok és a heparán-szulfátok. A (B) képlettel jellemezhető alapszerkezetű glikózamino-glikánokat kondroitin-szulfát típusú GAG-oknak nevezzük, és ezek közé tartozik a kondroitin-szulfát A, kondroitin-szulfát C és a dermatán-szulfát.

Miként korábban említettük, mind a heparin típusú, mind a kondroitin-szulfát típusú GAG-vegyületek esetében az n számú diszacharid-egységek hidroxilcsoportjainak kisebb vagy nagyobb százaléka kénsavval alkotott észterek formájában van jelen.

így tehát a heparin az (A) képlettel jellemezhető alapszerkezetű és ebben a képletben n értéke 1 és 80 között változhat, mimellett az n-egységek többségében R jelentése szulfátcsoport, míg a többi esetben acetilcsoport, a glikózamin 6-helyzetében lévő hidroxilcsoportok és az uronsav 2-helyzetében lévő hidroxilcsoportok többsége szulfatált, míg a glikózamin 3-helyzetében lévő hidroxilcsoport csak az esetek kisebb részében szulfatált, ugyanalkor az uronsav 3-helyzetében lévő hidroxilcsoport gyakorlatilag nem szulfatált, mimellett az említett uronsav a legtöbb esetben iduronsav,

Az (A) képlettel jellemzett alapszerkezetű vegyületek közé tartoznak az N-deszulfatált N-acetilezett heparinok, amelyek előállíthatók Nagasawa, K. és Inoue, Y. által a Methods in Carbohydrate Chemistry, 8. 291294 (megjelent 1980-ban az Academic Press kiadó gondozásában) szakirodalmi helyen ismertetett módon. Ez a heparin-féleség olyan (A) képletnek felel meg, amelyben R jelentése acetilcsoport.

A heparin tartalmaz olyan (A) képletnek megfelelő szerkezetű specieszt, amelyben n értéke 3 és 15 között változott, ugyanakkor azonos kémiai profilú. Ez a speciesz ismert módszerekkel, például a 4692 435 számú amerikai egyesült államokban szabadalmi leírásban ismertetett ffakcionálással különíthető el. Az ilyen típusú vegyületeket alacsony molekulatömegű heparinoknak nevezik.

A frakcionálással nyert alacsony molekulatömegű heparin molekulatömeg-eloszlásával és biológiai tulajdonságával lényegében azonos tulajdonságokkal bíró, alacsony molekulatömegű heparinok előállíthatók heparinnak a következőkben ismertetett módszerekkel végzett fragmentálása útján.

Az egyik ilyen módszer például a 37 319 számú európai vagy a 4 686 288 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban kerül ismertetésre, és lényege salétromossavval végzett depóiimerizálás és redukálás. Ennek során a glikózamin-N-szulfát alegységeknél történő támadás következtében a molekula felhasad és az (A’) képletű 2,5-anhidro-mannit-végcsoport alakul ki, amelynek 6-helyzetű primer hidroxilcsoportja adott esetben szulfatált lehet.

A 244235 és a 244 236 számú európai szabadalmi leírásokból enzimatikus depóiimerizálási módszer, míg a 40 144 számú európai szabadalmi leírásból bázikus depolimerizálási módszer vált ismertté. Ezek a módszerek a molekulát az uronsav alegységet megtámadva hasítják fel, az (A”) képletű, alfa-béta telítetlen uronsav-végcsoportot - amely adott esetben a 2-helyzetben szulfatált lehet - kialakítva.

A 4 281 108 számú amerikai egyesült államokbeli és a 121 067 számú európai szabadalmi leírásból olyan oxídativ depolimerizálási módszer vált ismertté, amely a molekulát felhasítja oxidálás útján, megőrizve a - természetes - végcsoportokat.

A természetes heparinétól eltérő molekulatömeg-eloszlású és megkülönböztethető biológiai tulajdonságokkal rendelkező más alacsony molekulatömegű heparinok állíthatók elő természetes heparin szakaszos oxidálása, majd ezt követően béta-eliminálással vagy savas hidrolízissel végrehajtott depolimerizálás útján. A szakaszos oxidálás a nem-szulfatált uronsav-maradékokat hasítja a 2- és 3-helyzetű szénatomok között. Ismeretes, hogy ilyen maradékok vannak jelen az olyan kötőhelyeken, amelyek képesek az antitrombin III jelzésű anyag (rövidítve: AT III), azaz a koagulálást okozó különböző szerin-proteázok vonatkozásában vérplazma-inhibitorként hatóanyag megkötésére. (Az AT III aktivitását nagy mértékben növeli a ko-faktorként ható heparin.) A szakaszos oxidálás így tehát lehetővé teszi olyan termékek előállítását, amelyeknek nincs az

HU 206 222 Β

AT III vonatkozásában kötőhelyük és így nincs antikoaguláns aktivitásuk.

Az ilyen típusú alacsony molekulatömegű heparinok előállíthatók közelebbről a következő lépésekből álló eljárást alkalmazva

- a heparin korlátozott oxidálása úgy, hogy a heparint 0,5-5 vegyes%-os végső koncentrációban vizes oldatban 0,5-1 vegyes%-os végső koncentrációban vett perjódsav-sóval reagáltatjuk 4,5 és 6,5 közötti, előnyösen 5 pH-értéken 0 °C és 10 °C közötti hőmérsékleten 15-48 órás reakcióidővel, fénytől elzárva;

- a kapott heparin-láncok depolimerizálása egy erős bázis, így például nátrium-hidroxid adagolása útján 11-nél nagyobb, közelebbről 11 és 12 közötti, előnyösen 11,2 és 11,6 közötti, különösen előnyösen 11,5 körüli pH-értéken;

- a depolimerizációs fragmensek redukálása egy redukálószer segítségével, majd ezt követően szükséges esetben a reakcióba nem lépett redukálószer eltávolítása;

- a redukált heparin fragmenseinek elkülönítése olyan oldószemei végzett kicsapás útján, amelyben ezek a fragmensek oldhatatlanok;

- a kívánt fragmensek izolálása frakcionálással úgy, hogy a kapott csapadék vízben feloldásra kerül, majd ez a vizes oldat kerül frakcionálásra alkohollal egy ásványi só jelenlétében és végül a kicsapódott anyag elkülönítésre kerül.

Az ilyen módon nyert alacsony molekulatömegű heparinok a (C) képletnek megfelelő szerkezetűek. Ebben a képletben n értéke 6 és 15 között változhat, R jelentése az n számú egységek legalább 90%-ában szulfátcsoport és a maradék esetben acetil-csoport, a glikózamin 3-helyzetű hidroxilcsoportjai szulfatáltak lehetnek, míg a glikózamin 6-helyzetű hidroxilcsoportjai az egységek 70%-ában szulfatáltak. Továbbá ezeknek az alacsony molekulatömegű heparinoknak 2 láncára vonatkoztatva egy maradék mértékében az iduronsavat egy nem-szulfatált uronsav-maradék (D-glikuronsav vagy L-iduronsav) helyettesíti, mely maradék a 2- és 3-helyzetű szénatomok között nyitott, azaz a (D) képlettel jellemezhető. Az ilyen alacsony molekulatömegű heparinok frakcionálhatók továbbá ismert módon végrehajtott gélfiltrálással úgy, hogy molekulatömegük vonatkozásában homogén, ugyanakkor AT III kötőhelyet nem tartalmazó fragmensek elegye képződik.

Más heparin típusú glikózamino-glikánok azok az (A) vagy (C) képletű GAG-ok, amelyeknek az uronsavból származó karboxilcsoportja észterezve van, például a 2 159 724 számú francia szabadalmi leírásban ismertetett módon egy alkohollal egy karbodiimid típusú kondenzálószer jelenlétében végrehajtott kondenzálás útján, vagy pedig egy alkil-halogeniddel egy gyenge bázis jelenlétében végrehajtott alkilezés útján.

Hasonló módon a kondroitin-szulfát típusú glikózamino-glikánok közé tartoznak azok a (B) képlettel jellemezhető alapszerkezetű glikózamino-glikánok, amelyeknél az uronsavak karboxilcsoportja észterezve van, például úgy, hogy a karboxilcsoportot egy alkilhalogeniddel alkilezik gyenge bázis jelenlétében.

Az (A) képlettel jellemezhető heparán-szulfát esetében n értéke 1 és 80 között változik, R az egységek többségében acetilcsoportot és kisebbségében szulfátcsoportot jelent. Továbbá az egységek nagyobb részében a glikózamin 6-helyzetű hidroxilcsoportjai szulfátéivá vannak, illetve az uronsav-egység glikuronsav.

A (B) képlettel jellemezhetű alapszerkezetű kondroitin-szulfát A és C esetében n értéke 1 és 80 között változik, a glikózamin 4- és 6-helyzetű hidroxilcsoportjai szulfatáltak, míg az egységek nagyobb részében az uronsav glikuronsav. A dermatán-szulfát szerkezete lényegében azonos a kondroitin-szulfát A szerkezetével, azonban az uronsav alegység az egységek nagyobb részében iduronsav.

A glikózamino-glikánoknak különböző biológiai aktivitásuk van, mely aktivitások közül a koagulációs faktorokkal szembeni aktivitásuk emelhető ki. Ezt az aktivitásukat különböző vérplazma-fehérjéken mint közvetítőkön át fejtik ki. Ami a heparint illeti, az is ismeretes a szakirodalomból, hogy a heparin vagy bizonyos származékai - amelyeknek adott esetben antikoaguláns aktivitásuk is lehet - a sejtfal simaizomzatú sejtjeinek szaporodására szabályozó hatást fejtenek ki /Guyton és munkatársai: Circ., Rés. 46. 625-634 (1980)/, vagy pedig a heparin vagy bizonyos származékai gátló hatásúak a heparanáz nevezetű enzimre, mely enzim résztvesz a metasztázisos disszemináció, azaz a metasztázisoknak a szervezetben való szétszóródása mechanizmusában (254077 számú európai közrebocsátási irat). Továbbá a glikózamino-glikánok részét képezik a szulfátéit poliszacharidok nagy családjának, amelyek közül egyesek különböző mértékű antivirális hatást /BABA és munkatársai: Antimicrob. Agents Chemother., 32. 337-339 (1988)/ és közelebbről antiHIV aktivitást (humán immunhiányos vírus) mutatnak /BABA és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., 35. 6132-6136 (1988)/.

A leírásban a továbbiakban a „GAG” rövidítéssel fogjuk jelölni egyrészt az olyan glikózamino-glikánokat, amelyeknek természetes szerkezetük van, és például extrahálással, szemiszintézissel vagy szintézissel kerülnek előállításra, továbbá az olyan vegyületeket, amelyek az acilezési reakciót megelőzően kémiailag módosítva vannak a karboxil- és amino-funkciós csoportok vonatkozásában, miáltal szelektíven O-acilezett GAG-vegyületekké alakíthatók át.

Rendkívül értékes gyógyhatásúk ellenére a természetes GAG-vegyületek hátránya, hogy viszonylag rövid a felezési idejük, miáltal beadásukat többször meg kell ismételni. Ezt a hátrányt részben azáltal küszöbölték ki, hogy az alacsony molekulatömegű heparin-származékoknak véna-trombózis megelőzésére és kezelésére való felhasználásakor szubkután beadást alkalmaztak, miáltal a beadás gyakorisága napi egy injekcióra volt korlátozható.

Mindazonáltal nagy érdeklődésre tartanának számot olyan származékok, amelyeknek nyújtott hatása van és

HU 206 222 Β így lehetővé válna a beadás gyakoriságának még további csökkentése a hatástartam növelése útján.

Ugyancsak nagy érdeklődésre tartana számot olyan, antikoaguláns hatástól mentes, ugyanakkor nyújtott hatású származék, például N-deszulfatált N-acetilezett heparin származékai, amely, illetve amelyek egyidejűleg gátló hatásúak a heparanáz enzim vonatkozásában, mely enzim - miként erre a korábbiakban utaltunk - résztvesz a metasztázisok disszeminációjának jelenségében.

A szakirodalomból a glikózamino-glikánoknak számos olyan származéka vált ismertté, amelyek a farmakokinetikai tulajdonságok javítása céljából modifikálva vannak, elsősorban az uronsav-rész karboxil-funkcióján vagy a hidroxil-funkciókon képzett észtereket említhetjük.

Előállították mára heparin karboxil-funkcióján részben vagy teljesen észterezett származékokat úgy, hogy a heparint kvatemer ammóniumsója formájában közömbös oldószerben alkohollal reagáltatták vagy pedig kondenzálószer jelenlétében egy halogénezett-származékkal reagáltatták (2 159 724 számú francia és 44 228 számú európai szabadalmi leírások). A 216453 számú európai szabadalmi leírásból a hialuronsav olyan származékai váltak ismertté, amelyeket egy alkohollal katalizátor jelenlétében végzett észterezéssel vagy egy éterképző reagenssel végzett reagáltatással állítottak elő.

Ugyanakkor a szakirodalomból különböző olyan ágensek váltak ismertté, amelyek alkalmasak a GAGvegyületek primer és szekunder hidroxilcsoportjainak észterezésére.

így például a Can. J. Rés., 25B. 472-476 (1947) szakirodalmi helyen ismertetik a heparin olyan acetilezett származékát, amely négy szacharid egységre vonatkoztatva egy mól acetilcsoportot tartalmaz. Ezt a terméket úgy állítják elő, hogy heparint keténnel reagáltatnak acetonban. Bár ebben a publikációban azt hangoztatják, hogy a kapott termék egy O-acetilezett származék, jól ismert, hogy a ketének karboxilcsoportok jelenlétében anhidrideket adnak. Ilyen vonatkozásban utalunk Marcii, J. által az „Advanced Organic Chemistry; Reactions, Mechanisms and Stnicture” című könyv (megjelent 1985-ben a J. Wiley and Sons kiadó gondozásában) 686-687. oldalán állítottakra: „Keténekkel a karbonsavak anhidrideket adnak, így az ecetsav-anhidridet iparilag elő lehet állítani az A reakciővázlatban bemutatott módon.” Következésképpen az említett kanadai publikáció olyan heparint ismertet, amelyben az O-acetilcsoportokkal az uronsav COO“ csoportjai és a keténből leszármaztatható acetilcsoport közötti vegyes anhidridek vannak társítva, és ez magyarázatot ad ezeknek a vegyületeknek vízben mutatott bomlékonyságára.

A 2100735 számú francia szabadalmi leírásból a heparinnak hidrolizálható részleges észterei váltak ismertté. Az észterezéshez nem mérgező szerves savakat, közelebbről 4-klór-fenoxi-izovajsavat, 4-klór-fenoxiecetsavat, kolsavat, nikotinsavat, N-oxi-nikotinsavat, piridil-ecetsavat, N-oxi-piridil-ecetsavat vagy linolein4 . f savat használnak. Az ebben a szabadalmi leírásban ismertetett előállítási eljárás során a heparin valamelyik kvatemer sóját egy karbodiimiddel aktivált savval reagáltatják. Ennek során nem csak az O-acilezett származék, hanem jelentős mennyiségben egy melléktermék (O-acil-izokarbamid-észter-származék) képződik, mely melléktermék stabil vegyület. Továbbá ez a reakciótípus hajlamos az anhidridek képződését, illetve a heparin savcsoportjai és hidroxilcsoportjai közötti intramolekuláris reakciókat elősegíteni.

A 74/048533 számú japán közrebocsátási iratból ismertté váltak a kondroitin-szulfát adott esetben helyettesített aromás, aril-alifás vagy heterociklusos savakkal képzett O-észterei, mely vegyületek nyújtott hatásúak. E leírás szerint ezeket a vegyületeket úgy állítják elő, hogy a kondroitin-kénsavat egy sav-kloriddal reagáltatják. Ennek során mellékreakcióként N-acileződés megy végbe.

A WO 83/00150 számú PCT-közrebocsátási iratból ismertté váltak általában a GAG-vegyületek különböző funkciós csoportjain, beleértve a hidroxilcsoportot, képzett, gyógyászatilag hatékony vegyületek előállításában hasznosított köztitermékei, közelebbről például a kondroitin-szulfát penicillin V vegyülettel képzett O-észtere. Az utóbbi vegyület előállítását karbodiimid felhasználásával hajtják végre, így végbemennek a korábban említett mellékreakciók.

A 46 628 számú európai szabadalmi leírásban heparinnak telítetlen savakkal, közelebbről akrilsavval vagy metakrilsavval képzett O-észterei ismeretesek. Ezek a vegyületek biológiailag aktív gyógyhatású anyagokhoz kapcsolva azoknak hosszú hatástartamú antitrombotikus aktivitást biztosítanak. Ezt a kapcsolási reakciót ezeknek az észtereknek az alfa-béta telítetlen kötéseinek az említett anyagok felületéhez való kovalens megkötése útján hajtják végre, a kapcsolási reakció után juttatják ezeket az anyagokat a vérbe. A leírás nem specifikál ja, hogy a heparinnak milyen típusú O-észtereit állítják elő, ugyanakkor az alfa-béta-telítetlen savak kloridjainak vagy anhidridjeinek tetszőleges használatára utalnak.

A 256 880 számú európai szabadalmi leírásból alacsony molekulatömegű heparin észterezése vált ismertté. Ezt úgy hajtják végre, hogy a heparint savkloridokkal reagáltatják formamid és piridin elegyében olyan származékokat kapva, amelyeknek megnövelt az úgynevezett transzmembrán-permeabilitásuk, azaz könynyebben hatolnak át a sejtmembránon. E módszer olyan származékokat ad, amely részleges deszulfatálódáson megy át, továbbá nem csak O-acetileződés, hanem N-acetileződés is végbemegy, miáltal a szulfát/karboxil arány módosul.

A 3066M számú francia gyógyszerszabadalmi leírásban az N-monometil-heparinamid acetilezését ismertetik, ecetsavanhidriddel formamid és piridin elegyében. A kiindulási anyag olyan heparin-származék, amelynek karboxilcsoportjait amidcsoportokkal helyettesítették.

Az acetilezéshez alkalmazott módszer során nem hasznosítanak szerves közegben oldható sót. Követke1

HU 206 222 Β zésképpen az acetilezési reakciót nem lehet pontosan szabályozni, így az csak alacsony acetilezési hozamot biztosít. Továbbá ha ezt az eljárást olyan heparinra alkalmazzák, amelynek karboxilcsoportjai nincsenek megvédve, akkor jelentős mennyiségben képződik vegyes anhidrid a heparin karboxilcsoportjai és az ecetsavanhidrid között, amely olyan nem kívánatos melléktermék, amely nem távolítható el a reakcióelegyből.

Az 5T28602 számú japán szabadalmi leírásban a heparin acilezését ismertetik, egy savanhidriddel formamidban. Ennek az eljárásnak az értelmében a heparint nem szerves közegben oldható só formájában alkalmazzák, így nincs lehetőség az acilezési reakció pontos szabályozására, aminek következménye az alacsony acilezési fok. Továbbá ennél az eljárásnál is melléktermékként vegyes anhidridek képződhetnek.

Célul tűztük ki tehát olyan, nagymértékben reprodukálható eljárás kidolgozását, amellyel pontosan szabályozott összetételű termékek állíthatók elő.

Felismertük, hogy ha a GAG-vegyületek közül heparin, heparin-fragmensek, heparán-szulfát, N-deszulfatáltN-acetil-heparin, kondroitin-szulfát A, kondroitin-szulfát B vagy kondroitin-szulfát C szerves közegben oldódó sóját, így például tercier vagy kvatemer ammóniumsóját egy karbonsav-anhidriddel egy poláris aprotikus szerves oldószerben reagáltatjuk, akkor a szabad hidroxilcsoportok szelektív acileződése megy végbe anélkül, hogy a felhasznált GAG-vegyületek karboxilcsoportja vagy aminocsoportja módosulna. A GAG-vegyület szerves közegben oldható só formájában való felhasználása lehetővé teszi az acilezési reakció nagy pontossággal történő szabályozását, illetve az acilezés mértékének könnyű beállítását és fokozását anélkül, hogy a molekula többi része módosulna. Közelebbről lehetőség nyílik az acilezés mértékét úgy szabályozni, hogy diszacharidegységre vonatkoztatva az acilcsoportok száma 0,1 és 3, közelebbről 0,5 és 2 között legyen.

Felismertük továbbá, hogy nem képződik N-acilezett származék és - ha a karboxilcsoportokon anhidridek alakulnak ki - gyenge bázis felhasználása lehetővé teszi ezeknek a csoportoknak a visszaalakítását szabad karbox ilcsoportokká.

Előnyösen a GAG-vegyületeknek a találmány szerinti eljárással végrehajtott szelektív acilezése lehetővé teszi biológiai tulajdonságaik módosítását, sőt egyes esetekben ezek lényeges megjavítását.

Végül azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti eljárással előállított O-acilezett GAG-vegyületek farmakológiai aktivitása megnövelt időtartamú.

így a találmán tárgya eljárás heparin, heparin fragmensek, heparán-szulfát, N-deszulfatált-N-acetil-heparin, kondroitin-szulfát A, kondroitin-szulfát B és kondroitin-szulfát C vagy ezek in vivő hidrolizálható észterei olyan új O-acilezett származékainak, illetve ezek gyógyászatilag elfogadható sóinak előállítására, amelyek O-acilcsoportként benzoilcsoportot, 14-18 szénatomos, nem alfa,béta telítetlen alkenoilcsoportot vagy adott esetben 3-7 szénatomos cikloalkilcsoporttal vagy karboxilcsoporttal helyettesített, 2-12 szénatomos alkanoilcsoportot tartalmaznak. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a fentiekben említett glikózaminoglikánok valamelyikét szerves közegben oldható tercier vagy kvatemer ammóniumsóvá alakítjuk, majd ezt a sót a glikózamino-glikán primer és szekunder hidroxilcsoportjait szelektíven acilezni képes, ugyanakkor az O-acilezési reakciót megelőzően a glikózamino-glikánban jelenlévő acetamido- vagy szulfamido- és karboxilcsoportban mint funkciós csoportokban változtatást végre nem hajtó acilezőszerrel, azaz acil-O-acil általános képletű acilezőszerrel - a képletben acil jelentése a korábban megadott acilcsoportok valamelyikének felel meg - reagáltatjuk, az így kapott terméket nátrium-acetát etanolos oldatával kicsapjuk és a szelektíven O-acilezett glikózamino-glikánt elkülönítjük.

Különösen előnyösek azok a találmány szerinti vegyületek, amelyeknél a karbox ilcsoport szabad vagy egy alkálifém- vagy alkáliföldfém-kationnal sókötésben van.

Különösen előnyösek továbbá azok a vegyületek, amelyeknél az in vivő hidrolizálható észterezőcsoport 1-10 szénatomos, a leginkább előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy helyettesített 7-12 szénatomos alkilcsoport.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási módja értelmében kiindulási anyagként 10000 daltonnái alacsonyabb, közelebbről vagy 2000 és 7000 dalton között változó átlagos molekulatömegű, vagy közel 4500 dalton átlagos molekulatömegű vagy pedig közel 2500 dalton átlagos molekulatömegű heparinfragmensek keverékét használjuk.

Az említett elegyek előállítására előnyösen felhasználhatjuk a 37 319 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett eljárást, amelynek lényege salétromossavval végzett depolimerizálás.

A 10000 daltonnál kisebb molekulatömegű heparinfragmensekből álló elegyek előállítására felhasználható enzimatikus depolimerizálási módszer például a 244235 és 244236 számú európai szabadalmi leírásokban ismertetett módszer valamint bázikus depolimerizálási módszer például a 40 144 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett módszer.

A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös megvalósítási módja értelmében előnyös molekulatömegük vonatkozásában homogén heparin-fragmensek elegyeinek használata. Ilyen heparin-fragmensek szintézissel állíthatók elő, és homogének mind molekulatömegüket, mind funkciós csoportjukat illetően.

A találmány szerinti eljárás egy további előnyös megvalósítási módja értelmében ki lehet választani azokat a glikózamino-glikán-származékokat, amelyek mentesek az antitrombin III (AT III) vonatkozásában kötőhelyektől azért, mert egyrészt a heparin-láncok úgy kerültek frakcionálásra, hogy el lettek távolítva az AT III vonatkozásában kötőhelyeket tartalmazó oligoszacharid láncok a Sache, E és munkatársai által a Thromb. Rés., 25.443-458 (1982) szakirodalmi helyen ismertetett módon Sepharose-AT III gyantán végrehajtott affinitásos kromatográfia vagy ioncserés kromatográfia útján, vagy pedig úgy, hogy ezek a kötőhelyek

HU 206 222 Β elpusztításra kerülnek például perjodáttal végzett depolimerizálás, majd az ezt követő béta-eliminálás vagy savas hidrolízis útján.

Különösen előnyös vegyietekhez juthatunk úgy, ha olyan anyagokból indulunk ki, amelyeket a korábbiakban ismertetett módon végrehajtott perjodátos oxidálás, majd az ezt követő, bázikus körülmények között végrehajtott béta-eliminálás, redukálás és frakcionálás útján kaptunk.

A heparin-szerkezetű, AT III vonatkozásában kötőhellyel és így antikoaguláns aktivitással nem rendelkező vegyületek közül előnyös vegyületcsoportot alkotnak a szelektíven O-acilezett, N-acetilezett, N-deszulfatált heparin-származékok.

A találmány szerinti eljárás egy további előnyös megvalósítási módja értelmében kondroitin-szulfát típusú, közelebbről kondroitin-4- és -6-szulfát típusú és dermatán-szulfát típusú glikózamino-glikánokat állítjuk elő.

Az ilyen típusú glikózamino-glikánok előnyös csoportját alkotják azok, amelyekben a karboxilcsoport szabad vagy egy alkálifém- vagy alkáliföldfém-kationnal sót alkot.

A találmány szerinti eljárás megvalósítása során tehát úgy járunk el, hogy a glikózamino-glikánt szerves közegben oldható tercier- vagy kvatemer ammóniumsóvá alakítjuk, majd ezt a sót a glikózamino-glikán primer és szekunder hidroxilcsoportjait szelektíven acilezni képes, ugyanakkor az acilezési reakciót megelőzően a glikózamino-glikánban jelenlévő acetamidovagy szuifamido-, és karboxilcsoportban mint funkciós csoportokban változtatást végre nem hajtó acilezőszerrel reagáltatjuk poláris aprotikus oldószerben katalizátor jelenlétében vagy az acilezés során felszabaduló savat megkötni képes bázis jelenlétében, 0 °C és 100 °C közötti hőmérsékleten.

Ezt követően a képződött terméket vízzel elegyedő oldószerrel, például etanollal kicsaphatjuk, mely oldószerhez a kicsapást elősegítő adalékanyagot, például egy ásványi sót adhatunk. Az O-acilezett glikózaminoglikánt végül úgy különítjük el, hogy a csapadékot vízben oldjuk és előnyösen egy gyenge bázis jelenlétében dialízisnek vetjük alá.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási módja értelmében a következő lépések sorozatát hajtjuk végre:

(1) glikózamino-glikánt poláris aprotikus szerves oldószerben oldódó tercier vagy kvatemer ammónium, sóvá alakítjuk, (2) ezt a sót valamely acil-O-acil általános képletű anhidriddel - a képletben acil jelentése a korábban megadott - reagáltatjuk az említett poláris aprotikus szerves oldószerben katalitikus mennyiségű piridin vagy dialkil-amino-piridin és egy protonmegkötő anyag jelenlétében, (3) az így kapott terméket nátrium-acetát etanolos oldatával kicsapjuk, és (4) a szelektíven O-acilezett glikózamino-glikánt elkülönítjük úgy, hogy a kapott csapadékot vízben feloldjuk és a vizes oldatot egy gyenge bázis jelenlétében dialízisnek vetjük alá, végül kívánt esetben a szelektíven O-acilezett glikózamino-glikán így kapott nátriumsóját egy másik gyógyászatilag elfogadható sóvá alakítjuk.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási módja értelmében az (1) lépésben használt glikózamino-glikánként heparint; 10000-nél kisebb dalion molekulatömegű heparin-fragmensek keverékét, 2000 és 7000 dalton között váltakozó átlagos molekulatömegű heparin-fragmensek keverékét; közel 4500 dalton átlagos molekulatömegű heparin-fragmensek keverékét; közel 2500 dalton átlagos molekulatömegű heparin-fragmensek keverékét; molekulatömeg vonatkozásában homogén heparin-fragmensek keverékét; illetve mind molekulatömege, mind funkciós csoportjai vonatkozásában homogén, szintézis útján kapott heparinfragmensí használunk.

A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös megvalósítási módja értelmében az (1) lépésben antitrombin III vonatkozásában kötőhelyet nem tartalmazó heparint vagy heparin-frakciót vagy heparin-fragmenst használunk.

A találmány szerinti eljárás (1) lépésében glikózamino-glikánként használhatunk továbbá előnyösen dermatán-szulfátot, illetve kondroitin-4- és -6-szulfátot.

Előnyösen a találmány szerinti eljárás (1) lépésében tercier aminnal alkotott sóként tributil-ammónium-sót, vagy pedig kvatemer ammóniumsóként tetrabutil-ammónium-sót alkalmazunk.

A találmány szerinti eljárás egy további előnyös megvalósítási módja értelmében a (2) lépésben anhidridként 2-10 szénatomot tartalmazó, előnyösen 4-10 szénatomot tartalmazó és különösen előnyösen 4 vagy 6 szénatomot tartalmazó alkán-karbonsavból leszármaztatható anhidridet használunk.

A találmány szerinti eljárás (2) lépésében poláris aprotikus oldószerként előnyösen dimetil-formamidot, hexametil-foszforsav-triamidot vagy piridint vagy ezek - adott esetben diklór-metánt is tartalmazó - elegyét hasznosítjuk, katalizátorként pedig aminokat, így például piridint vagy dimetil-amino-piridint használunk.

A savasság semlegesítésére alkalmazott bázis lehet például piridin (amely egyidejűleg oldószerként, katalizátorként és bázisként szolgál), trietil-amin vagy tributil-amin.

Előnyösen a (4) lépésben végrehajtott dialízist egy gyenge bázis, így például nátrium-hidrogén-karbonát jelenlétében végezzük az esetlegesen képződő melléktermékek, így például anhidridek eliminálása céljából.

Előnyösen 0 °C és 100 °C, különösen 0 °C és 50 °C közötti hőmérsékleten dolgozunk, a leginkább célszerűen szobahőmérsékleten, a kívánt acilezés mértékétől függően 1-24 órás reakcióidővel.

A találmány szerinti eljárással előállított, szelektíven 0-acilezett vegyületek in vivő nyújtott hatásúak. így például ha a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek az AT III vonatkozásában kötőhelyet tartalmazó, heparin típusú vegyületek, és így képesek anti6

HU 206 222 Β trombotikus hatást kifejteni, akkor ez a hatás jelentősen hosszabb időtartamú, mint ugyanaz a vegyület, amely nem esett át szelektív O-acilezésen.

A találmány szerinti eljárással előállított, az AT III vonatkozásában kötőhelyeket adott esetben tartalmazó, szelektíven O-acilezett heparin-származékok (amelyek közül az említett kötőhelyeket nem tartalmazóak mentesek antikoaguláns aktivitástól) különböző biológiai hatásokat fejtenek ki, közelebbről például a következő hatásuk van:

- gátolják a simaizom-sejtek szaporodását, aminek komoly jelentősége van a sebészeti beavatkozások, például érplasztika, bypass-műtétek, vénás és artériás erek átültetései, szervátültetések, különösen a szívátültetések esetében fellépő szűkületek megelőzésében,

- a metasztázisos szétszóródásban szerepet játszó heparanáz és heparitináz enzimek gátlása,

- antivirális hatások, különösen retrovírusok, elsősorban különböző humán immunhiányt okozó vírusok ellen, ami nagy súllyal jelentkezik az AIDS kezelésében,

- gátló hatások a leukocita-elasztáz vonatkozásában, a keringésben résztvevő elasztáz-inhibitorok koncentrációjának növelése, valamint az úgynevezett III. típusú kollagén és fibronektin szintézisének gátlása, mely tulajdonságok fontos szerepet játszanak az elasztáz-antielasztáz rendszer egyensúlyzavaraiból adódó megbetegedések, így például a kötőszöveti gázgyülem kezelésében, valamint a kötőszövetek degeneratív megbetegedései, így például az arterioszklerózis és a diabétesz kezelésében.

A találmány szerinti eljárással előállított, szelektíven O-acilezett glikózamino-glikánok tehát felhasználhatók számos különböző gyógyászati célra hasznosított gyógyszerkészítmények előállításában hatóanyagként.

így tehát a találmány tárgya eljárás olyan gyógyászati készítmények előállítására is, amelyek hatóanyagként gyógyászatilag hatásos mennyiségben legalább egy találmány szerinti, szelektíven O-acilezett glikózamino-glikánt tartalmaznak a gyógyszergyártásban szokásosan használt hordozó és/vagy egyéb segédanyagokkal kombinációban.

Előnyösen a találmány szerinti eljárással előállított, szelektíven O-acilezett glikózamino-glikánokat gyógyászatilag elfogadható sóik, így például nátriumsóik, magnéziumsóik vagy kalciumsóik formájában használjuk.

A találmány szerinti eljárással előállítható gyógyászati készítmények előnyösen orális beadásra alkalmas formában, így például gasztrorezisztens kapszulák, tabletták vagy gyógycukrok, pirulák formájában, vagy pedig orálisan beadott oldatok formájában kerülnek előállításra, dózisegységenként célszerűen 50 mg és 5 g közötti mennyiségű hatóanyagot tartalmazva. A kapszulák, gyógycukrok vagy pirulák esetében ez a mennyiség különösen előnyösen 100-1000 mg, míg az orálisan beveendő oldatok esetében 10-150 mg, például naponta egyszeri, kétszeri vagy háromszori beadással. Előállíthatók továbbá a találmány szerinti gyógyászati készítmények injektálható, steril vagy sterilizálható oldatok formájában intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután beadásra. Az ilyen oldatok előnyösen a találmány szerinti, szelektíven O-acilezett glikózamino-glikánból 50-200 mg-ot tartalmaznak ml-ként, ha a kívánt beadási mód szubkután injektálás, illetve 20-200 mg/ml hatóanyagot tartalmaznak, ha a kívánt beadási mód intravénásán történő injektálás vagy perfúzió.

Szakember számára érthető, hogy ezeket a hatóanyag-mennyiségeket csupán tájékoztató jelleggel említettük, hiszen minden egyes esetben a gyakorló orvosnak kell eldönteni a beadandó dózist számos tényezőtől, többek között a beteg állapotától és gyógyszerekkel szemben mutatott egyéni reakciójától függően.

A találmány szerinti eljárással előállítható, szelektíven O-acilezett glúikózamino-glikánok felhasználhatók biológiai reagensekként mint referenciavegyületek vagy kalibrációs standardok olyan komparatív vizsgálatoknál, amelyek különböző, glikózamino-glikánokat magukba foglaló fiziológiai rendszerek szerkezet/aktivitás viszonyainak tanulmányozására szolgálnak.

A találmány szerinti eljárást a következő példákkal kívánjuk közelebbről megvilágítani.

/. példa

O-Acetilezett heparin (Cl 1938) előállítása heparintetrabutil-ammónium-sóból kiindul va

a) Heparin-tetrabutil-ammónium-só előállítása g heparin-nátrium-sót feloldunk 500 ml vízben, majd az így kapott oldatot H⁺-formájú „Dowex 50 W x 4” márkanevű kationcserélő gyantával töltött oszlopon át perkolálódni hagyjuk. Az így kapott oldatot tetrabutil-ammónium-hidroxiddal semlegesítjük. Liofilizálás után 19,55 g mennyiségben a lépés címadó vegyületét kapjuk.

b) Acetilezés ml vízmentes dimetil-formamidban feloldunk 1,05 g heparin-tetrabutil-ammónium-sót, majd a kapott oldatot 0°C-ra lehűtjük és cseppenként hozzáadunk 1 ml (10,46 mmól) ecetsavanhidridet, ezt követően pedig

1,45 ml (10,46 mmól) trietil-amint és 64 mg (0,5 mmól) dimetil-amino-piridint. A reakcióelegyet ezután szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk, majd 5 ml vizet adunk hozzá és 72 órán át desztillált vízzel szemben dializáljuk. A tetrabutil-ammónium-sót nátrium-sóvá alakítjuk 0 °C-on H⁺-formájú Dowex 50 gyantán való átbocsátása, majd In nátrium-hidroxid-oldattal végzett semlegesítés útján. Liofilizálást követően 0,49 g mennyiségben szelektíven O-acetilezett heparin-nátrium-sót kapunk a következő tulajdonságokkal:

szulfát/karboxil arány: 2,28 meq/g (kiindulási anyag: 2,20 meq/g)

APTT-titer: 91 nemzetközi egység/mg (ezt a továbbiakban IU/mg rövidítéssel jelöljük) ¹³C NMR-spektrum (belső standard: metanol 51,6 ppm-nél):

- jel 23,4 ppm-nél: CH₃-CO-O-CH₃-része

- jel 24,5 ppm-nél (gyenge): CH₃-CO-NH-CH₃-része (azonos a kiindulási anyagéval).

HU 206 222 Β

Az NMR-spektrum diszacharid-egységenként kb. két acetilcsoport jelenlétét mutatja.

2. példa

O-Acetilezetl heparin (Cl 1938) előállítása heparintribulil-ammónium-sóből kiindulva

a) Heparin-tribulil-ammónium-só előállítása g heparin-nátrium-sót feloldunk 500 ml vízben, majd az így kapott oldatot H⁺-formájú „Dowex 50 W x 4” márkanevű kationcserélő gyantából álló oszlopon perkolálódni hagyjuk. Az oszlopot ezután 10%-os etanolos tríbutil-amín-oldattal semlegesítjük. Dietil-éterrel végzett mosás és liofilizálás után 14,77 g mennyiségben heparin-tributil-ammónium-sót kapunk

b) Acetilezés

Az előző bekezdés szerint előállított sóból 4 g 50 ml vízmentes dimetil-formamiddal készült, 0 °C-ra lehűtött oldatához hozzáadunk 250 mg dimetil-amino-piridint, 3,9 ml ecetsavanhidridet és 9,7 ml tributil-amint. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk, majd 1,5 ml vizet adunk hozzá. Ezt követően a reakcióelegyet nátrium-acetáttal telített etanolhoz adjuk. Etanollal végzett mosás után a képződött csapadékot vízben feloldjuk, majd először 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal majd azután vízzel szemben dializáljuk. Liofilizálást követően 1,81 g mennyiségben O-acetilezett heparin-nátrium-sót kapunk.

Infravörös spektrumában erős észter-sáv található 1630 cm_^l hullámszámon.

Elszappanosítás után a tennék jellemzői a következők:

- szulfát/karboxil arány: 2,38 meq/g (kiindulási anyag: 2,40 meq/g),

- APTT-titer: 85 IU/mg.

3. példa

O-Acetilezetl heparin (Cl 1938) előállítása piridin mint katalizátor jelenlétében

0,58 g heparin-tetrabutil-ammónium-sót feloldunk piridin és dimetil-formamid 1: 1 térfogatarányú elegyéből 10 ml-ben, majd a kapott oldathoz 0,5 ml ecetsavanhidridet adunk. Az így kapott reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk, majd hozzáadunk 15 ml 1 mólos vizes nátrium-acetát-oldatot. Ezt követően a reakcióelegyet 80 ml 0 °C-ra lehűtött etanolba öntjük. Centrifugálást követően a csapadékot 10 ml vízben újraoldjuk, majd a kapott oldathoz először 160 ml etanolt, ezután pedig 10 ml 1 mólos vizes nátrium-acetát-oldatot adunk. A képződött csapadékot vízzel felvesszük, majd liofilizáljuk. így 0,22 g menynyiségben O-acetilezett heparint kapunk.

4. példa

Különböző mértékben O-propionilezett heparin (Cl

1939) előállítása

1,85 g, az 1. példában ismertetett módon előállított heparin-tetrabutil-ammónium-só 10 ml dimetil-formamiddal készült, 0 °C-ra lehűtött oldatához cseppenként hozzáadunk 2,7 ml propionsav-anhidridet, majd · ·. .

2,9 ml trietil-amint és 128 mg dimetil-amino-piridint. A reakcióelegyből mintát veszünk 1 óra, 2 óra, 4 óra, 8 óra és 24 óra elteltével, majd a mintákat azonos térfogatú vízzel hígítjuk és 24 órán át desztillált vízzel szemben dializáljuk. H⁺-formájú Dowex 50 gyantán való átbocsátás, majd nátrium-hidroxiddal végzett semlegesítés után a kapott termékeket liofilizáljuk. Tulajdonságaik a következők:

Reakcióidő	Tömeg	Szulfát/karboxil milliekvivalcns	APTT (IU/mg)
24 óra	496 mg	2,31	⁸⁰
8 óra	138 mg	2,35	88
4 óra	122 mg	2,33	94
2 óra	120 mg	2,42	109
1 óra	120 mg	2,33	120
(kiindulási anyag)		2,40	150

A termékek proton-NMR-spektrumát vízben felvesszük, belső standardként 3,3,3-trimeril-szilil-propionátot (TSP) használva. 1,1 körüli ppm-értéknél, illetve 2,4 ppm körüli értéknél jeleket észlelünk, melyek jellemzőek a CH₃-CH₂-CO-O csoport CH₃-, illetve CH₂-részeire, illetve 3 és 5 ppm körüli értékeknél jeleket észlelünk, amelyek a szénhidrát-váz protonjaira jellemzők.

Ha összehasonlítjuk az 1 órán át és a 24 órán át kezelt termékek propionil-részére és vázára jellemző jelek intenzitását, akkor megállapítható, hogy a vázra jellemző protonok jelei gyengülnek, ami a helyettesítés mértékének fokozódását jelzi.

A ^l3C-spektrumban (belső standard: metanol

51,6 ppm-nél) 10,8 és 30 ppm körül észlelhetők jelek, amelyek a propionát-észterek CH₃-, illetve CH₂-részeire jellemzők.

5. példa

O-Butirilezetf heparin (Cl 1940) előállítása

A) Heparin-tetrabutil-ammónium-só alkalmazása

0,55 g, az 1. példában ismertetett módon előállított heparin-tetrabutil-ammónium-só 5 ml dimetil-formamiddal készült, O °C-ra lehűtött oldatához vajsav-anhidridet és dimetil-amino-piridint adunk, majd az így kapott reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk. Ezt követően 5 ml vizet adunk a reakcióelegyhez, majd 72 órán át desztillált vízzel szemben dializáljuk. H⁺-formájú Dowex 50 ioncserélő gyantán való átbocsátás, nátrium-hidroxiddal végzett semlegesítés és liofilizálás után 0,32 g mennyiségben O-butirilezett heparint kapunk nátrium-sója formájában. Szulfát/karboxil arány: 2,15 milliekvivalens/g (kiindulási anyag: 2,20 milliekvivalens/g)

APTT-titer: 59 IU/mg

Belső standardként TSP-t használva felvett proton1

HU 206 222 Β

NMR-spektrumban 0,9, 1,6 és 2,4 ppm-nél észlelhetők jelek, amelyek a butirilcsoport CH₃- és CH₂-részeire jellemzők, továbbá 3 és 6 ppm-nél észlelhetők jelek, amelyek a szénhidrát-vázra jellemzők

Az NNR-spektrum elemzése azt mutatja, hogy diszaccharid-egységenként mintegy egy butirillánc van jelen.

B) Heparin-tributil-ammóniurn-só alkalmazása g, a 2. példában ismertetett módon előállított heparin-tributil-ammónium-só 50 ml dimetil-formamiddal készült, 0 °C-ra lehűtött oldatához hozzáadunk 0,25 g dimetil-amino-piridint, 6,7 ml vajsav-anhidridet és

9,7 ml tributil-amint, majd az így kapott reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk. Ezt követően a reakcióelegyhez 1,5 ml vizet, majd 30 perc elteltével 250 ml telített etanolos nátrium-acetát-oldatot adunk. A kivált csapadékot etanollal háromszor mossuk, majd először 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, ezután pedig vízzel szemben dializáljuk. Liofilizálás után 2,1 g mennyiségben O-butirilezett heparint kapunk nátrium-só formájában. APTT-titer: 29 IU/mg.

Az észtereknek 0,5 mólos nátrium-hidroxid-oldattal 2 órán át 0 °C-on végzett elszappanosítását követően a kapott termék szulfát/karboxil aránya 2,36 milliekvivalens/g (a kiindulási anyagé 2,40 milliekvivalens/g).

6. példa

O-Hexanollezett heparin (Cl 1941) előállítása

A) Heparin-tetrabutil-ammónium-só alkalmazása

0,55 g, az 1. példában ismertetett módon előállított heparin-tetrabutil-ammóniuin-só 5 ml dimetil-formamiddal készült, 0 °C-ra lehűtött oldatához hozzáadunk 1 ml (6 mmól) hexánkarbonsav-anhidridet, 0,84 ml (6 mmól) trietil-amint és dimetil-amino-piridint. Az így kapott reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk, majd 5 ml vizet adunk hozzá. Ezt követően a reakcióelegyet 72 órán át 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal szemben, majd desztillált vízzel szemben dializáljuk. H⁺-formájú Dowex 50 ioncserélő gyantán való átbocsátás, nátriumhidroxiddal végzett semlegesítés és liofilizálás után 0,30 g mennyiségben O-hexanoilezett heparint kapunk nátrium-sója formájában.

APTT-titer: 25 IU/mg.

TSP-t belső standardként használva felvett protonNMR-spektrumban 0,8,1,2,1,5 és 2,3 ppm-nél észlelhetők jelek, amelyek a hexanoilcsoport CH₃-CH₂-részére jellemzők.

B) Heparin-tributil-ammónlum-só alkalmazása g, a 2. példában ismertetett módon előállított heparin-tributil-ammónium-só 50 ml dimetil-formamiddal készült, 0 °C-ra lehűtött oldatához hozzáadunk 0,25 g dimetil-amino-piridint, 9,7 ml tributil-amint és 10,6 ml hexánkarbonsav-anhidridet, majd az így kapott reakcióelegyet 20 °C-on 24 órán át állni hagyjuk. Ezután 1,5 ml vizet, majd telített etanolos nátrium-acetát-oldatot adunk hozzá. Etanollal végzett mosás, dialízis és liofilizálás után 2,5 g mennyiségben O-hexanoilezett heparint kapunk.

7. példa

O-Oktanoilezett heparin (Cl 1942) előállítása g, a 2. példában ismertetett módon előállított heparin-tributil-ammónium-só 50 ml dimetil-formamiddal készült, 0 °C-ra lehűtött oldatához hozzáadunk 0,25 g dimetil-amino-piridint, 12,1 ml oktánkarbonsav-anhidridet és 9,7 ml tributil-amint, majd az így kapott reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk. Ezután a reakcióelegyhez 1,5 ml vizet, majd 30 perc elteltével telített etanolos nátrium-acetátoldatot adunk. Ezt követően először 20%-os vizes etanollal, majd desztillált vízzel szemben dialízist végzünk, majd ultraszűrést végzünk, és a terméket átbocsátjuk H⁺-formájú Dowex 50 kationcserélő gyantán. Végül nátrium-hidroxiddal semlegesítést és liofílizálást végzünk. így 2,5 g mennyiségben O-oktanoilezett heparint kapunk.

8. példa

O-Dekanoilezett heparin (Cl 1943) előállítása

A) Heparin-tetrabutil-ammónium-só alkalmazása

0,55 g, az 1. példában ismertetett módon előállított heparin-tetrabutil-ammónium-só 5 ml dimetil-formamiddal készült, 0 °C-ra lehűtött oldatához hozzáadunk 1 ml (6 mmól) dekánkarbonsav-anhidridet, 0,84 ml (6 mmól) trietil-amint és dimetil-amino-piridint. A reakcióelegyet 24 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd 5 ml vizet adunk hozzá és ezután először 72 órán át 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldat, majd desztillált víz ellenében dializáljuk. H⁺-formájú Dowex 50 ioncserélő gyantán való átbocsátás, nátrium-hidroxiddal végzett semlegesítés és liofilizálás után 0,30 g mennyiségben O-dekanoilezett heparint kapunk nátrium-sója formájában.

TSP-t használva belső standardként a proton-NMRspektrumban 0,8, 1,2, 1,5 és 2,4 ppm-nél észlelhetők jelek, amelyek a dekanoilesöpört CH₃- és CH2-részére jellemzők.

B) Heparin-tributil-ammónlum-só alkalmazása g, a 2. példában ismertetett módon előállított heparin-tributil-ammónium-só 50 ml dimetil-formamiddal készült, 0 °C-ra lehűtött oldatához hozzáadunk 0,25 g dimetil-amino-piridint, 13,3 g dekánkarbonsav-anhidrid 20 ml dimetil-formamiddal készült oldatát és 9,7 ml tributil-amint, majd az így kapott reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk. Ezután a reakcióelegyhez 1,5 ml vizet, majd telített etanolos nátrium-acetát-oldatot adunk. A képződött csapadékot dimetil-szulfoxidban feloldjuk, majd vízzel, nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és ismét vízzel szemben dializáljuk. Liofilizálás után 2,38 g mennyiségben O-dekanoilezett heparint kapunk.

9. példa

O-Oleoilezett heparin (Cl 2013) előállítása ml vízmentes dimetil-formamidban feloldunk 3 g heparin-tributil-ammónium-sót és 244 mg N,N-dimetil-amino-piridint, majd az így kapott oldatot 0 °Cra lehűtjük és ezután hozzáadjuk 21 g, Plusquellec és munkatársai által a Tetrahedron, 44. 2471-2476 (1988)

HU 206 222 Β szakirodalmi helyen ismertetett módon előállított oleinsav-anhídrid 20 ml diklór-metánnal készült oldatát cseppenként. Ezt követően a reakcióelegyhez 9,5 ml tributil-amint adunk, majd 24 órán át állni hagyjuk. Ezután a reakcióelegyet lehűtjük 0 °C-ra, majd hozzáadunk 10 ml 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonátoldatot, 1 óra elteltével pedig telített etanolos nátriumacetát-oldatot. Vízmentes etanollal végzett mosás, majd dimetil-szulfoxid és víz 4: 1 térfogatarányú elegyéből 750 ml-ben végzett feloldás után a kapott oldatot 2 napon át 10%-os vizes etanollal szemben majd 3 napon át vízzel szemben dializáljuk. Az oleoilezett heparin nátrium-sóját liofilizálás, majd a dimetil-formamidban újraoldott liofilizátum dietil-éterrel végzett kicsapása útján különítjük el 2,77 g mennyiségben. Ducombe, W, és munkatársai által a Biochemical Journal 88. 7 (1963) szakirodalmi helyen ismertetett módszerrel meghatározva az oleinsav-tartalom 1,44 mikromól/mg.

10. példa

O-Benzoilezelt heparin (Cl 1944) előállítása

A 2. példában ismertetett módon előállított heparintetrabutil-arnmónium-sót benzoilezzük benzoesav-anhidriddel a 8. példában az O-dekanoilezett heparin előállítására ismertetett körülmények között.

A termék ¹³C-NMR-spektrumában a benzoilcsoportra jellemző jelek észlelhetők 131, 132 és 136 ppmnél. A termék in vitro nem fejt ki antikoaguláns aktivitást.

11. példa

Ο-3-CikÍopentil-propionilezett heparin (Cl 2014) előállítása

Plusquellec és munkatársai által a Tetrahedron 44. 2471-2476 (1988) szakirodalmi helyen ismertetett módszerrel 3-ciklopentil-propionsav-anhidridet állítunk elő úgy, hogy 15 mmól tetrabutil-ammónium-bromid, 60 ml 20%-os vizes nátrium-hidroxid-oldat és 80 ml diklór-metán elegyéhez -10 °C-on keverés közben hozzáadjuk a megfelelő savból 23 ml (150 mmól) 400 ml diklór-metánnal készült oldatát, majd dekantálást, 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és vízzel mosást, végül pedig koncentrálást végzünk, így 96%-os hozammal olajat kapunk, amelynek IRspekírumában a jellegzetes csúcsok 1800, 1745 és 1040 cm'¹ hullámszámnál találhatók.

ml vízmentes dimetil-formamidban feloldunk 4 g heparin-tributil-ammónium-sót és 253 mg N,N-dimetil-amino-piridint, majd az így kapott oldatot 0 °Cra lehűtjük és cseppenként hozzáadunk először 11 g 3-ciklopentil-propionsav-anhidridet, majd 9,8 ml tributil-amint. Az így kapott reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk, majd 0 °C-ra lehűtjük, először 1 ml vizet, majd 1 órával később telített etanolos nátrium-acetát-oldatot adunk hozzá. Vízmentes etanollal végzett mosás után a kapott csapadékot először 24 órán át 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd 3 napon át vízzel szemben dializáljuk. Liofilizálást követően 2,64 g mennyiségben Ο-3-ciklopentil-propionilezett heparint kapunk nátrium-sója formájában.

DjO-ban felvett ^l3C-NMR-spektrumban (belső standard: metanol 51,6 ppm-nél) jellegzetes csúcsok találhatók 27,4, 33,1, 34,6, 35,9 és 41,7 ppm-nél, mely jelek az O-ciklopentil-propionilcsoportra jellemzők. Szulfát/karboxil arány: 2,2,

12. példa

Alacsony molekulatömegü (átlagos molekulatömeg

4500 dalton körüli molekulatömeg-intervallum

1800 és 8000 dalton közötti) O-acetilezett heparin (Cl 1945) előállítása

Ezt az alacsony molekulatömegű heparint a 181252 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett, salétromossavval végzett részleges depolimerizálás és etanolos frakcionálás útján kaptuk. Jelzése a következőkben CY216.

A) A CY 216 tetrabutil-ammónium-sójának hasznosítása

A CY 216 nátrium-sójából 1 g-ot tetrabutil-ammónium-sóvá alakítunk H⁺-formájú Dowex 50 gyantából álló oszlopon való átbocsátás, majd tetrabutil-ammónium-hidroxiddal végzett semlegesítés útján. Az így kapott 1,7 g mennyiségű sót vákuumban 50 °C-on 3 órán át szárítjuk, majd feloldjuk 10 ml vízmentes dimetilformamidban. 0 °C-ra való lehűtése után az oldathoz cseppenként 1,7 ml ecetsavanhidridet. majd 2,4 ml trietil-amint és 102 mg dimetil-amino-piridint adunk. 20 óra elteltével a terméket Sephadex G-25 márkanevű gyantával töltött oszlopon kromatográfiás tisztításnak vetjük alá. eluálószerként vizet használva. Nátrium-sóvá való átalakítás, majd liofilizálás után 0,89 g mennyiségben O-acetilezett CY 216-ot kapunk.

'•’C-NMR-spektrumában (belső standard: metanol

51,6 ppm-nél) 23 ppm-nél az acetátokra jellemző jel észlelhető. Ugyanakkor a 24,5 ppm körüli jel a CH₃-CO-NH-csoport metil-részére jellemző és azonos a kiindulási anyagéval.

Szulfát/karboxil arány: 2,09 milliekvivalens/g (kiindulási anyag: 2,05 milliekvivalens/g)

APTT-titer: 18IU/mg

Anti-Xa titer: 205 U/mg /meghatározását

Yin és munkatársai ismertetik aJ. Láb. Clin. Med., 81.

298-310 (1973) szakirodalmi helyen/.

B) A CY 216 tributil-ammónium-sójának hasznosítása

A CY 216 nátrium-sóját tributil-ammónium-sóvá alakítjuk H⁺-formájú „Dowex 50” márkanevű gyantával töltött oszlopon való átbocsátás, majd tributil-aminnal végzett semlegesítés útján, miként ezt a heparin vonatkozásában ismertettük. A CY 216 tributil-ammónium-sóját dietil-éterrel végzett mosás, liofilizálás és vákuumkemencében végzett szárítás után kapjuk.

Ebből a sóból 4 g-ot és 288 mg N,N-dimetil-aminopiridint feloldunk dimetil-formamidban, majd a kapott oldatot 0 °C-ra lehűtjük és cseppenként hozzáadunk

4,4 ml ecetsavanhidridet, majd 11,2 ml tributil-amint.

HU 206 222 Β

A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk, majd 0 °C-ra lehűtjük és hozzáadunk először

1,7 ml vizet, majd 1 óra elteltével telített etanolos nátrium-acetát-oldatot. A kivált csapadékot etanollal mossuk, majd pirogénektől mentes vízben feloldjuk. A kapott oldatot először 36 órán át 5%-os vizes nátriumhidrogén-karbonát-oldattal, majd 3 napon át vízzel szemben dializáljuk. Liofilizálást követően acetilezett CY 216-ot kapunk 1,4 g mennyiségben nátrium-sója formájában.

D₂O-ban felvett ¹³C-NMR-spektrumában (belső standard: metanol 51,6 ppm-nél) az acetilcsoportra jellegzetes jel észlelhető 23 ppm-nél.

Szulfát/karboxil arány: 2,07.

13. példa

Alacsony molekulatömegü (átlagos molekulatömeg közel 4500 dalion, molekulatömeg-intervallum 1800 és 8000 dalton közötti), O-butirilezett heparin (Cl 1957) előállítása ml vízmentes dimetil-formamidban feloldunk 4 g, a 12. példában ismertetett módon előállított CY 216-tributil-ammónium-sót és 288 mg N,N-dimetilamino-piridint, majd az így kapott oldatot 0 °C-ra lehűtjük és cseppenként hozzáadunk 7,68 mg vajsav-anhidridet, majd 11,2 ml tributil-amint. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk, majd 0 °C-ra lehűtjük és hozzáadunk 1,7 ml vizet, 1 óra elteltével pedig telített etanolos nátrium-acetát-oldatot. Etanollal végzett mosás után a csapadékot pirogénektől mentes vízben feloldjuk, majd a kapott oldatot először 36 órán át 5%-os vizes nátrium-hidrogén -karbonát-oldattal, majd 3 napon át vízzel szemben dializáljuk. Liofilizálás után az O-butirilezett CY 216-ot 2,14 g mennyiségben nátrium-sója formájában különítjük el.

D₂O-ban felvett ¹³C-NMR-spektrumában (belső standard: metanol 51,6 ppm-nél) az O-butirilcsoportra jellemző jel észlelhető 15,6 ppm-nél, 20,5 ppm-nél és

39,4 ppm-nél. Szulfát/karboxil arány: 2,08.

14. példa

Alacsony molekulatömegü (átlagos molekulatömeg

4500 dalton körül, molekulatömeg-intervallum.

1800 és 8000 dalton között), O-hexanoilezett heparin (Cl 1958) előállítása ml vízmentes dimetil-formamidban feloldunk 4 g, a 12. példában ismertetett módon előállított CY 216-tributil-ammónium-sót és 288 mg N,N-dimetilamino-piridint, majd az így kapott oldatot 0 °C-ra lehűtjük és cseppenként hozzáadunk 10,8 ml hexánkarbonsav-anhidridet, ezt követően pedig 11,2 ml tributilamint. Az így kapott reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk, majd 0 °C-ra lehűtjük,

1,7 ml vizet, 1 óra elteltével pedig telített etanolos nátrium-acetát-oldatot adva hozzá. Vízmentes etanollal végzett mosást követően a kapott csapadékot pirogénektől mentes vízben feloldjuk, majd az így kapott oldatot először 36 órán át 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd 3 napon át vízzel szemben dializáljuk. Liofilizálást követően 2,5 g mennyiségben

O-hexanoilezett CY 216 különíthető el nátrium-sója formájában.

D₂O-ban felvett ^l3C-NMR-spektrumban (belső standard: metanol 51,6 ppm-nél) a hexanoilcsoportra (más néven: kaproilcsoportra) jellemző jelek észlelhetők 15,9,24,2,26,4,33,1 és 36,4 ppm-nél.

Szulfát/karboxil arány: 2,08.

15. példa

Alacsony molekulatömegű (átlagos molekulatömeg

4500 dalton körüli, molekulatömeg-intervallum

1800 és 8000 dalton közötti), O-oktanoilezett heparin (Cl 1959) előállítása ml vízmentes dimetil-formamidban feloldunk 4 g, a 12. példában ismertetett módon előállított CY 216-tributil-ammónium-sót és 288 mg N,N-dimetilamino-piridint, majd az így kapott oldathoz 0 °C-on cseppenként 14 ml oktánkarbonsav-anhidridet, ezt követően pedig 11,2 ml tributil-amint aduk. Az így kapott reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk, majd 0 °C-ra lehűtjük, és először 1,7 ml vizet, majd 1 órával később telített etanolos nátrium-acetátoldatot adunk hozzá. Vízmentes etanollal végzett mosás után a kapott csapadékot feloldjuk pirogénektől mentes vízben, majd az így kapott oldatot először 36 órán át 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd 3 napon át vízzel szemben dializáljuk. így

I, 76 g mennyiségben nátrium-sója formájában kapjuk az O-oktanoilezett CY 216-ot liofilizálást követően.

D⁶-DMSO-ban felvett ^l3C-NMR-spektrumban (belső standard: metanol 51,6 ppm-nél) az oktanoilcsoportra (más néven: kapri lesöpört) jellemző jelek észlelhetők 16,8,25,0,27,3,30,9,31,4,34,1 és 36,4 ppm-nél.

Szulfát/karboxil arány: 2,07.

16. példa

Alacsony molekulatömegü (átlagos molekulatömeg

4500 dalton körüli, molekulatömeg-intervallum

1800 és 8000 dalton közötti), O-dekanoilezett heparin (Cl 1960) előállítása ml dimetil-formamidban feloldunk 4 g, a 12. példában ismertetett módon előállított CY 216-tributilammónium-sót és 288 mg N,N-dimetil-amino-piridint, majd a kapott oldatot 0 °C-ra lehűtjük és cseppenként hozzáadjuk 15,3 ml dekánkarbonsav-anhidrid 10 ml vízmentes dimetil-formamiddal készült oldatát.

II, 2 ml tributil-amin adagolását követően a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk, majd 0 °C-ra lehűtjük és ezután először 1,7 ml vizet, majd 1 óra elteltével telített etanolos nátrium-acetát-oldatot adunk hozzá. Vízmentes etanollal végzett mosás, majd pirogénektől mentes vízben végzett újraszuszpendálás után a reakcióelegyet először 2 napon át 5%os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd 2 napon át 10%-os vizes nátrium-klorid-oldattal és végül 5 napon át vízzel szemben dializáljuk. Liofilizálást követően 2,76 g mennyiségben O-dekanoilezett CY 216-ot kapunk nátrium-sója formájában.

D₂O-ban felvett ^I3C-NMR-spektrumban (belső standard: metanol 51,6 ppm-nél) a dekanoilcsoportra jel11

HU 206 222 Β legzetes jelek észlelhetők 16,4, 22,3, 25,1, 29,2, 31,9,

34,4 és 36,5 ppm-nél.

Szulfát/karboxil arány: 2,13.

17. példa

Alacsony molekulatömegü (átlagos molekulatömeg

2500 dalion körüli, molekulatömeg-intervallum

1500 és 8000 dalton közötti), O-acetilezett heparin (Cl 1946) előállítása ..

Ezt az alacsony molekulatömegü heparint a 37 319 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett, salétromossavat alkalmazó részleges depolimerizálási eljárással állítjuk elő és a továbbiakban CY 222 kódnév alatt említjük.

A CY 222 nátrium-sóját tributil-ammónium-sóvá alakítjuk át H⁺-fonnájú Dowex 50 gyantával töltött oszlopon való átbocsátás, majd tributil-aminnal végzett semlegesítés útján.

A liofilizálással kapott sóból 1,5 g-ot feloldunk 5 ml dimetií-formamidban, majd a kapott oldatot 0 °C-ra lehűtjük és cseppenként hozzáadunk 1,35 ml ecetsavanhidridet, ezt követően pedig 2 ml trietil-amint és 85 mg dimetil-amino-piridint. A reakcióelegyet ezután szobahőmérsékleten 18 órán át állni hagyjuk, majd 20 ml vizet adunk hozzá. Az így kapott vizes elegyet desztillált vízzel szemben 3 napon át dializáljuk, majd nátrium-sót képzünk és liofilizálunk. így 0,86 g menynyiségben O-acetilezett CY 222-t kapunk nátrium-só formájában.

A termék esetében a szulfát/karboxil arány 1,98 milliekvivalens/g (kiindulási anyag: 1,97 milliekvivalens/g).

A termék ¹³C-NMR-spektrumában (belső standard: metanol 51,6 ppm-nél) az O-acetilcsoportra jellemző jel észlelhető 23 ppm-nél. A kiindulási anyag és a végtermék spektrumában az N-acetilcsoportra jellemző jelek (24,5 ppm körül) intenzitásának összehasonlítása azt mutatja, hogy az acetilezés szelektív.

APTT-titer: 8 IU/mg

Anti-Xa-titer: 191 U/mg.

/ 8. példa

A) Az antitrombin 111 vonatkozásában affinitástól mentes heparin-fragmens (Cl 1772.) előállítása

1. A heparin-láncok hasítása perjódsavval

4°C-on 250 ml ionmentes vízben feloldunk 10 g, nátrium-só formájú, sertés nyálkából elkülönített, injektálható heparint, amelynek a Codex-meghatározás szerinti titer-értéke 157 IU/mg és a Yin és munkatársai által már korábban említett módszerrel meghatározott anti-Xa-faktora 155 U/mg. Az így kapott oldat pH-értékét ezután 5,0-ra beállítjuk tömény sósavoldattal. Ezt követően 4 °C-on lassú keverés közben beadagoljuk 10 g nátrium-metaperjodát (NaIO₄, molekulatömeg: 213,89) 250 ml ionmentesített vízzel készült oldatát. Az így kapott reakcióelegy pH-értékét 5,0-ra beállítjuk tömény sósavoldattal, majd 24 órán át sötétben 4 °C-on hideg helyiségben állni hagyjuk.

2. A reakcióba nem lépett perjodát eltávolítása

A reakcióelegyet ezután eloszjuk három „NOJAX 40” márkanevű dialíziscső (porozitás 3-4000 Da) között, majd 15 órán át folyamatosan áramoltatott ionmentesített vízzel szemben dializálást végzünk.

3. Depolimerizálás bázikus közegben

A dialízissel kapott oldatból 780 ml-hez hozzáadunk 16 ml 10η nátrium-hidroxid-oldatot, majd az így kapott elegyet szobahőmérsékleten (18-21 °C) 3 órán át keverjük.

4. Redukálás

A reakcióelegyhez 500 mg nátrium-bór-hidridet (NaBH₄, molekulatömeg: 37,83) adunk, majd szobahőmérsékleten további 4 órán át keverést végzünk. Ezután a reakcióelegy pH-értékét 4-re beállítjuk tömény sósavoldattal. 15 perc keverést követően a pH-értékét 7-re beállítjuk tömény vizes nátrium-hidroxid-oldattal.

Az így kapott 820 ml térfogatú oldathoz hozzáadunk

16,4 g nátrium-kloridot, majd 1270 ml etanolt. A reakcióelegyet ezután 3 órán át állni hagyjuk, majd 20 percen át 2500 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. Az elkülönített csapadékot 200 ml tiszta etanolban újraszuszpendáljuk, Ultra-Turrax márkanevű őrlőberendezésen őröljük és végül frittelt Buchner-tölcséren végzett szűréssel elkülönítjük. Ezután vákuumban 40 °Con 5 órán át szárítjuk. így 8,9 g terméket kapunk.

5. Etanolos frakcionálás

A 8,9 g terméket feloldjuk szobahőmérsékleten 120 ml ionmentesített vízben, majd az oldathoz 1,78 g nátrium-kloridot adunk és ezután a pH-értékét 3,5-re beállítjuk sósavval. Az oldat térfogatát ionmentesített vízzel 178 ml-re beállítjuk, majd keverés közben 151 ml tiszta etanolt adagolunk. A keverést a beadagolás befejezését követően 15 percen át fenntartjuk, majd az elegyet szobahőmérsékleten 10 órán át állni hagyjuk.

A képződött csapadékot elkülönítjük 2500 fordulat/perc sebességgel tartó centrifugálással. Ezután a csapadékot 150 ml tiszta etanolban szuszpendáljuk, a szuszpenziót Ultra-Turrax márkanevű berendezésen őrlésnek vetjük alá, végül frittelt Buchner-tölcséren kiszűrjük, 300 ml tiszta etanollal mossuk és 40 °C-on vákuumban 24 órán át szárítjuk.

így 5 g mennyiségben a Cl 1772 kódnevű terméket kapjuk olyan fehér por formájában, amelynek tulajdonságai a következők:

SO-. : 3,55 milliekvivalens/g COO' : 1,54 milliekvivalens/g X + C : 5,09 milliekvivalens/g X/C : 2,31 milliekvivalens/g

A termék lényegében mentes N-acetil-glikózamintól (^l3C-spektrumában 24,5 ppm körül nincs jel). Codex-titer: 11 IU/mg

APTT-titer: 9 IU/mg

Anti-Xa-titer: 12 IU/mg.

B) Az antitrombin Hl vonatkozásában affinitástól mentes, 0-acetiíez.eti heparin-fragmens (Cl 1924) előállítása

Az A) részben ismertetett módon előállított terméket tetrabutil-ammónium-sóvá alakítjuk át úgy, hogy átbocsátjuk H⁺-formájú Dowex 50 gyantából álló oszlopon, majd tetrabutil-ammónium-hidroxiddal semlegesítést végzünk. 9,5 g nátrium-sóból kiindulva 18 g tetrabutilammónium-sót kapunk.

HU 206 222 Β

Ebből a sóból 6 g 55 ml dimetil-formamiddal készült, 0 °C-ra lehűtött oldatához hozzáadunk 6,2 ml (65,6 mmól) ecetsavanhidridet, majd 9 ml (65,5 mmól) trietil-amint és 403 mg (3,3 mmól) dimetil-amino-piridint. 24 óra elteltével a reakcióelegyhez hozzáadunk 250 ml telített etanolos nátrium-acetát-oldatot, majd centrifugálást végzünk. A kapott csapadékot etanollal mossuk, majd Sephadex G-25 márkanevű gyantával töltött oszlopon sómentesítjük, ezután pedig H⁺-formájú Dowex 50 gyantából álló oszlopon átbocsátva ionmentesítjük. Nátrium-hidroxiddal végzett semlegesítés és liofilizálás után 3 g mennyiségben az előállítani kívánt Cl 1924 kódnevű terméket kapjuk.

A termék esetében a szulfát/karboxil arány 2,28 milliekvivalens/g. ¹³C-NMR-spektrumában (belső standard: metanol 51,6 ppm-nél) világosan látható, hogy a termék O-acilezett. Az N-acetil-glikózamin jellegzetes C₂-jele 56 ppm körül hiányzik a spektrumból.

19. példa

Az antitrombin III vonatkozásában affinitástól mentes, O-butirilezett heparin-fragmens (Cl 1925) előállítása g, a 12. példában ismertetett módon előállított Cl 1772-tetrabutil-ammónium-sót ugyanúgy reagáltatunk vajsav-anhidriddel, mint az acetilezésnél. így 2,96 g mennyiségben a kívánt terméket kapjuk, amelynél a szulfát/karboxil arány 2,31 milliekvivalens/g.

A termék ¹³C-NMR-spektrumában (belső standard: metanol 51,6 ppm-nél) a butilcsoportra jellemző jelek észlelhetők 15,6,20,4 és 38,4 ppm-nél.

20. példa

Az antitrombin III vonatkozásában affinitástól mentes, O-hexanoilezett heparin-fraqmens (Cl 1926) előállítása g, a 12. példában ismertetett módon előállított Cl 1772-tetrabutil-ammónium-sót ugyanúgy reagáltatunk hexánkarbonsav-anhidriddel, mint az acetilezésnél. így 3 g mennyiségben a kívánt terméket kapjuk, amelynél a szulfát/karboxil arány 2,20 milliekvivalens/ g.

A termék ¹³C-NMR-spektrumában (belső standard: metanol 51,6 ppm-nél) a hexilcsoport CH₃- és CH₂-részére jellemző jelek észlelhetők 15,5, 23,9, 26,2, 32,7 és 36,1 ppm-nél.

A proton-NMR-spektrum alapján megállapítható, hogy diszaccharid-egységenként közel egy hexilcsoport van jelen.

21. példa

Az antitrombin III vonatkozásában affinitástól mentes, molekulatömeg vonatkozásában homogén és Obutirilezett fragmensek keverékének előállítása A 12. példában Ismertetett, antikoaguláns aktivitástól mentes fragmensek keverékét frakcionáljuk különböző alkotóira gélszűréssel. így molekulatömegük vonatkozásában homogén frakciókat kapunk, éspedig 7700,6500,5800,5300,4980,4400,3900,3400,2600, 1860 és 1210 molekulatömegű frakciókat.

Egy frakció észterezésére a következő példát adjuk:

A 2600 molekulatömegű frakcióból 0,20 g-ot tributil-ammónium-sóvá alakítunk, majd liofilizálunk és megszárítunk. Az ekkor kapott 0,34 g terméket feloldjuk 2 ml dimetil-formamidban, majd a kapott oldatot 0°C-ra lehűtjük és egymás után hozzáadunk 18 mg dimetil-amino-piridint, 0,49 ml vajsav-anhidridet és 0,70 ml tributil-amint. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk, majd hozzáadunk 1 ml 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldatot és 2 órával később 1 liter Sephadex G-25 márkanevű gyantával töltött oszlopon kromatografálást végzünk, eluálószerként 0,2 mólos vizes nátrium-klorid-oldatot használva. A terméket sómentesítés után liofilizáljuk, amikor 0,24 g mennyiségben halvány beige színű port kapunk.

A többi frakciót ugyanilyen módon kezeljük, a megfelelő termékeket kapva, amelyek IR-spektrumában 1734 cm^-1 hullámszámnál észternek megfelelő sáv található. Az acilezést követően a termékek szulfatálásának mértéke (a szulfát/karboxil arány) változatlan.

Az acilezés mértékének meghatározása:

Ezt a meghatározást gázkromatográfiásán végezzük azt követően, hogy a termékeket butanolízisnek vetettük alá butanol és kénsav elegyével, majd ezt követően a butil-észtereket kloroformmal extraháltuk és a fölös butanolt vizes mosással eltávolítottuk.

22. példa

O-Acetilezett dermatán-szulfát (Cl 1947) előállítása

Az 1. példában a heparin-tetrabutil-ammónium-só előállítására ismertetett körülményekkel azonos körülmények között előállított dermatán-szulfát-tetrabutilammónium-sóból 0,91 g 20 ml dimetil-formamiddal készült, 0 °C-ra lehűtött oldatához cseppenként hozzáadunk 1,35 ml (14,2 mmól) ecetsavat, majd 1,97 ml (14,2 mmól) trietil-amint és 0,7 mmól dimetil-aminopiridint. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk, majd 40 ml vizet adunk hozzá és 72 órán át dializáljuk. Ezt követően nátrium-sót állítunk elő H⁺-formájú Dowex 50 gyantával töltött oszlopon 0 °C-on való átbocsátás, majd az ezt követő, nátrium-hidroxiddal végzett semlegesítés útján. Liofilizálást követően 0,52 g mennyiségben beige színű port kapunk.

Az O-acetilezett dermatán-szulfátnak a következők a tulajdonságai:

szulfát/karboxil arány: 0,99 milliekvivalens/g (kiindulási anyag: 1,05 milliekvivalens/g) ¹³C-NMR-spektrum (belső standard: metanol

51,6 ppm-nél) jel 25,2 ppm-nél (a CH₃-CO-NH-csoport CH₃-részének felel meg - azonos a kiindulási anyagban is) és 23,0 ppm-nél (a CH₃-CO-O-csoport CH₃-részének felel meg).

23. példa

O-Szukcinilezett dermatán-szulfát (Cl 2020) előállítása

Vízmentes dimetil-formamidban feloldunk 1 g dermatán-szulfát-tetrabutil-ammónium-sót és 110 mg N,N-dimetil-amino-piridint, majd az így kapott oldat13

HU 206 222 Β hoz hozzáadunk 396 mg borostyánkősav-anhidridet és 0,94 ml tributil-amint. Az így kapott reakcióelegyet vízmentes körülmények között 60 °C-on 2 órán át inkubáljuk, majd lehűtjük és 2 ml vizet adunk hozzá. Ezt követően hideg telített etanolos nátrium-acetát-oldat adagolása útján kicsapást végzünk, majd a kapott csapadékot etanollal mossuk, és feloldjuk lázkeltőktől mentes vízben. Az oldatot ezt követően 36 órán át 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal szemben, majd 3 napon át vízzel szemben dializáljuk. Liofilizálás után a cím szerinti terméket kapjuk nátrium-sója formájában 0,83 mg mennyiségben.

Kálium-bromidban felvett infravörös spektrumában a karbonsav-csoportra jellemző csúcsok találhatók 1730 cm'¹ és 1420 cm'¹ hullámszámoknál.

D₂O-ban felvett ^l3C-NMR-spektrumában (belső standard: metanol 51,6 ppm-nél) a szukcinilcsoportra jellemző jelek találhatók 33, 34,5 és 183,6 ppm-nél, illetve az acetamidocsoport metil-részére jellemző jel észlelhető 25,3 ppm-nél, amely egyébként azonos a kiindulási anyag megfelelő jelével.

Szulfát/karboxil arány: 0,51.

24. példa

Előzetes N-deszulfatálást és N-acetilezést követően

O-butirilezett heparin (Cl 1948) előállítása

Nagasawa és Inoue által a Methods Carbohydr. Chem., Vili. kötet, 291-294. oldalakon ismertetett módszenei heparint N-deszulfatálunk, majd N-acetilezünk.

Ezt követően tributil-ammónium-sót állítunk elő úgy, hogy a heparint átbocsátjuk H⁺-formájú Dowex 50 gyantából álló oszlopon, majd tributil-amin etanollal készült oldatával semlegesítést végzünk.

Liofilizálás és szárítás után az így kapott sóból 1 got feloldunk 10 ml dimetil-formamidban, majd a kapott oldatot 0 °C-ra lehűtjük és hozzáadunk 2 ml vajsav-anhidridet, 2 ml tributil-amint és 65 mg dimetil-aminopiridint. 24 óra elteltével 5 ml vizet adagolunk, majd a reakcióelegyet 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, ezt követően pedig vízzel szemben dializáljuk. H⁺-formájú Dowex 50 gyantából álló oszlopon való átbocsátás, majd nátrium-hidroxiddal végzett semlegesítés után az N-acetilezett O-butirilezett heparint kapjuk nátrium-só formájában.

^,3C-NMR-spektrumában (belső standard: metanol

51,6 ppm-nél) 24,6 ppm-nél az N-acetilcsoportra jellemzőjel, míg 16,20 és 38 ppm-nél a butiril-észterekre jellemző jelek észlelhetők.

A kísérlet megismételhető részlegesen N-deszulfatált N-acetilezett heparinnal, amikor részlegesen N-deszulfatált, N-acetilezett és O-butirilezett terméket kapunk.

25. példa

Peracetilezett dermatán-szulfát (Cl 1950) előállítása

0,8 g dermatán-szulfát-tetrabutil-ammónium-só 20 ml dimetil-formamiddal készült oldatát acetilezzük 76 mg dimetil-amino-piridin, 1,2 ml ecetsav-anhidrid és 1,7 ml trietil-amin adagolása, majd 80 °C-on 1 órán át végzett melegítés útján.

Miután szobahőmérsékletre visszahűlni hagytuk, a reakcióelegyhez 0,45 ml vizet, majd 100 ml, etanollal készült 0,3 mólos nátrium-acetát-oldatot adunk. Centrifugálást követően a kapott csapadékot vízben feloldjuk, majd desztillált vízzel szemben az oldatot dializáljuk. A nátriumsót úgy kapjuk, hogy az oldatot átbocsátjuk H⁺-fonnájú Dowex 50 márkanevű gyantából álló oszlopon, ezt követően pedig nátrium-hidroxiddal semlegesítést végzünk. Liofílizálást követően 0,51 g mennyiségben peracetilezett dermatán-szulfátot kapunk.

Ebben a termékben a szulfát/karboxil arány 1,07 milliekvivalens/g (kiindulási anyag: 1,05 milliekvivalens/g), illetve a termék diszaccharid-egységenként közel három acetilcsopotot tartalmaz.

26. példa

O-Acetilezett heparin-benzil-észter (Cl 1949) előállítása g heparin-tetrabutil-ammónium-só 10 ml dimetilformamiddal készült oldatához hozzáadunk 0,17 ml benzil-bromidot. A kapott elegyet 24 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd hozzáadunk 220 mg tetrabutil-ammónium-acetátot. 24 óra elteltével a képződött benzil-észtert acetilezésnek vetjük alá úgy, hogy hozzáadunk 57 mg dimetil-amino-piridint, 1,3 ml trietil-amint és 0,9 ml ecetsav-anhidridet, majd az ekkor kapott reakcióelegyet szobahőmérsékletre lehűtjük és 24 órán át keverjük. Ezt követően vizet adagolunk, majd a terméket telített etanolos nátrium-acetát-oldattal kicsapjuk. A csapadékot feloldjuk, desztillált vízzel szemben dializáljuk, H⁺-formájú Dowex 50 gyantából álló oszlopon átbocsátjuk, nátrium-hidroxiddal semlegesítjük és 1 iofolizáljuk. így 0,57 g mennyiségben a cím szerinti vegyületet kapjuk nátrium-sója formájában.

A termékben a szulfát/karboxil arány 3,6 milliekvivalens/g (nem-benzilezett kiindulási anyag: 2,20 milliekvivalens/ g).

'•’C-NMR-spektrumában (belső standard: metanol

51.6 ppm-nél) 23,3 ppm-nél (O-acetil) és

131.6 ppm-nél (benzil) észlelhetők jelek. A CH₃CO-NH-csoport CH₃-részére jellemző, 24,5 ppm körül jelentkező jel azonos a kiindulási anyagéval.

27. példa

O-Acetilezett dermatán-szulfát-benzil-észter (Cl

1953) előállítása g dermatán-szulfát-tetrabutil-ammónium-só 15 ml vízmentes dimetil-formamiddal készült oldatához hozzáadunk 0 °C-on 0,25 ml benzil-bromidot, majd az így kapott reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk. Ezután 0,35 g tetrabutil-ammónium-acetátot adunk hozzá, majd újabb 24 órán át állni hagyjuk. Ezt követően acetilezést hajtunk végre úgy, hogy először 1,5 ml ecetsav-anhidridet, majd 2,2 ml trietilamint és 96 mg trimetil-amino-piridint adagolunk. 24 óra elteltével 0,6 ml vizet adagolunk, majd a termé1

HU 206 222 Β két kicsapjuk telített etanolos nátrium-acetát-oldat adagolása útján. A terméket először 10%-os vizes nátriumklorid-oldattal szemben, majd vízzel szemben dializáljuk. Liofilizálás után 0,63 g mennyiségben a cím szerinti vegyületet kapjuk.

28. példa

O-Butirilezett dermatán-szulfát (Cl 2018) előállítása

A 2. példában a heparin-tributil-ammónium-só előállítására ismertetett körülményekkel azonos körülmények között előállított dermatán-szulfát-tributil-ammónium-sóból 2 g-ot és 220 mg N,N-dimetil-amino-piridint feloldunk 25 ml vízmentes dimemtil-formamidban, majd az így kapott oldatot 0 °C-ra lehűtjük és cseppenként hozzáadunk 5,9 ml vajsav-anhidridet, majd 8,6 ml tributil-amint. A reakcióelegyet 24 órán át állni hagyjuk, majd 0 °C-ra lehűtjük és 1 ml vizet adunk hozzá. Ezután a terméket hideg telített etanolos nátrium-acetát-oldat adagolásával kicsapjuk, majd a csapadékot etanollal mossuk és pirogénektől mentes vízben újraoldjuk. A kapott oldatot 36 órán át 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd 3 napon át vízzel szemben dializáljuk és végül liofilizáljuk. így 1,3 g mennyiségben a cím szerinti vegyületet kapjuk nátrium-só formájában.

D₂O-ban felvett ¹³C-NMR-spektrumában (belső standard: metanol 51,6 ppm-nél) a butirilcsoportra jellemző jelek észlelhetők 15,6, 20,5 és 38,4 ppm-nél, míg az acetamidocsoport metil-részére jellemző, 25,2 ppm-nél jelentkező jel azonos a kiindulási anyagéval.

Szulfát/karboxil arány: 1,05.

29. példa

O-Hexanoilezett dermatán-szulfát (Cl 2019) előállítása ml vízmentes dimetil-formamidban feloldunk 2 g dermatán-szulfát-tributil-ammónium-sót és 220 mg Ν,Ν-dimetil-amino-piridint, majd az így kapott oldatot 0 °C-ra lehűtjük és cseppenként hozzáadunk 9,4 ml hexánkarbonsav-anhidridet, majd

8,6 ml tributil-amint. Az így kapott reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk, majd 0 °C-ra lehűtjük, hozzáadunk 1 ml vizet és ezután kicsapást végzünk híg telített etanolos nátrium-acetát-oldat adagolása útján. A csapadékot vízmentes etanollal mossuk, majd lázkeltőktől mentes vízben feloldjuk. A kapott oldatott 36 órán át 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldat, majd 3 napon át víz ellenében dializáljuk. Liofilizálás után a cím szerinti vegyületet kapjuk 1 g menynyiségben nátriumsó formájában.

D₂O-ban felvett ^l3C-NMR-spektrumában (belső standard: metanol 51,6 ppm-nél) a O-hexanoilezett csoportra jellemző jelek észlelhetők 15,9, 24,2, 26,5, 33,1 és 36,4 ppm-nél, míg az acetamido-csoport metilrészére jellemző, 25,2 ppm-nél található jel azonos a kiindulási anyagéval.

Szulfát/karboxil arány: 1,02.

30. példa

A találmány szerinti eljárás szelektív O-acilező jellegének bizonyítása más acilezési módszerekhez képest

A találmány szerinti eljárást összehasonlítottuk a 2 100 735 számú francia szabadalmi leírásban és a 256 880 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett eljárásokkal. Közelebbről úgy jártunk el, hogy a találmány szerinti eljárással, pontosabban az 1. példa szerinti eljárással előállított, O-acetilezett heparin (Cl 1938) tulajdonságait összehasonlítottuk a 2100735 számú francia szabadalmi leírásban ismertetett eljárás körülményei között előállított O-acetilezett heparin (A termék), illetve a 256880 számú európai szabadalmi leírás 3. és 4. példáiban ismertetett eljárással előállított O-acetilezett észterek (B és C termékek) tulajdonságaival.

(a) Az A termék előállítása g heparin-tetrabutil-ammónium-só 10 ml vízmentes dimetil-formamiddal készült oldatához hozzáadjuk 4,2 g diciklohexil-karbodiimid 15 ml dimetil-formamiddal készült oldatát, majd 4 °C-on 45 perc leforgása alatt cseppenként beadagoljuk 1,16 ml ecetsav 25 ml dimetil-formamiddal készült oldatát.

A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk, majd szűrjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot dietil-éterben újraszuszpendáljuk. A szuszpenziót szűrjük, majd a kiszűrt csapadékot mossuk és desztillált vízzel szemben dializáljuk. A nátriumsót úgy kapjuk, hogy a terméket H⁺-formájú Dowex 50 gyantával töltött oszlopon átbocsátjuk, majd nátrium-hidroxiddal semlegesítést végzünk. így 0,493 g mennyiségben kapjuk az A terméket.

Ezt az előállítást megismételtük úgy, hogy +4 °C-on tartottuk 48 órán át a reakcióelegyet.

(b) A B és C termékek előállítása

A B és C termékeket úgy állítjuk elő, hogy heparint formamid és piridin elegyében acetil-kloriddal acetilezünk, a B termék esetében 2 ml acetil-kloridot, és a C tennék esetében 40 ml acetil-kloridot használva a 256 880 számú európai szabadalmi leírás 3., illetve 4. példájábán ismertetett reakciókörülmények között. Az így kapott termékeket azután vízzel felvesszük, majd nátrium-klorid-oldattal szemben dializáljuk.

(c) Eredmények

A termékek tulajdonságait az 1. táblázatban ismertetjük. A kiindulási heparin tulajdonságait minden egyes kísérletnél megadjuk összehasonlítási célokból.

/. táblázat

Termék	Szulfát/karboxil arány (milliekvivalens/g)	APTT-titer’ (IU/mg)	YW-titer’ (U/mg)
Cl 1938	2,28	91	70
kiindulási heparin	2,20	160	160
A	3,40	42	41

HU 206 222 Β

Termék	Szulfát/karboxil arány (milliekvi- valens/g)	APTT-titer' (IU/mg)	YW-titer’ (U/mg)
kiindulási heparin	2,40	160	160
B	2,10	57	39
C	1,15	2	0.6
kiindulási heparin	2,40	160	160

’ ezeket a titcrekct in vitro mérjük

Az eredmények azt mutatják, hogy bár az APTT- és YW-titerek minden egyes terméknél alacsonyabbak a kiindulási heparin megfelelő titerjeinél, és ez még inkább igaz az A, B és C termékeknél, csak a Cl 1938 terméknél azonos csaknem teljesen a szulfát/karboxil arány a kiindulási heparin megfelelő arányával. Ez abból a tényből adódik, hogy a találmány szerinti eljárás lehetővé teszi a hidroxil-funkciók szelektív acilezését anélkül, hogy a heparin többi funkciós csoportját módosítaná, és ezt a tényt a termékek kémiai analízise megerősíti.

A Cl 1938, A, B és C termékeket ^l3C-NMR-elemzésnek is alávetettük, belső standardként 51,6 ppm-nél jelet adó metanolt használva. A termékek spektrumait, valamint a kiindulási heparin spektrumát ábrázoltuk, éspedig a következőképpen:

1. ábra: kiindulási heparin

2. ábra: Cl 1938

3. ábra: A tennék 24 órás reakcióidő után

4. ábra: A tennék 48 órás reakcióidő után

5. ábra: B tennék

6. ábra: C tennék

Az eredmények a következők:

1. A Cl 1938 termék esetében a ’³C-NMR-spektrumban (lásd a 2. ábrát) a 23,4 ppm-nél jelentkező jel megfelel a CH₃-CO-0-csoport CH₃-részének, míg a CH₃-CO-NH-csoport CH₃-részének megfelelő,

24,4 ppm-nél jelentkező jel azonos a kiindulási heparinban jelenlévő jellel.

Ezek a jelek azt mutatják, hogy az amin- és karboxilcsoportok érintetlenül maradtak, vagyis valóban a hidroxilcsoportok szelektív acetileződése ment végire.

2. Az A termék ^l3C-NMR-spektroszkópiás elemzése azt mutatja, hogy mind a 24 órás reakcióidővel, mind a 48 órás reakcióidővel kapott termékekben (lásd a 3. és 4. ábrát) a fő termék a heparin egy izokarbamid-származéka, amelynek karboxilcsoportjait a (XII) képletű csoport helyettesíti annak következtében, hogy diciklokarbodiimid került felhasználásra. Valóban a fenti csoport szénatomjának megfelelő erős jelek voltak észlelhetők 28, 34, 54 és 156 ppm-nél, míg a CH₃-CO-Ocsoport CH₃-részének megfelelő jel 23 ppm-nél igen gyenge.

Ez az eljárás így lehetővé teszi a szelektív O-acilezést és a karboxil-csoportok modifikációjához vezet, ami a szulfát/karboxil arány megnövekedésében tükröződik.

3. A B tennék ¹³C-NMR-spektrumában (lásd az 5. ábrát) a CH₃-CO-O-csoport CH₃-részének megfelelő jel található 23,1 ppm-nél, a CH₃-CO-NH-csoport CH₃-részének megfelelő jel található 24,8 ppm-nél, és az utóbbi jóval erősebb, mint a kiindulási heparinnál és a Cl 1938 terméknél.

Ezek a jelek azt mutatják, hogy nemcsak O-acetileződés, hanem jelentős mértékű N-acetileződés is végbemegy. Az alkalmazott acilezési módszer tehát nem szelektív, és részleges N-deszulfatálódáshoz vezet, amit az aminok acetileződése követ, miáltal csökken a szulfát/karboxil arány.

4, A C termék ^l3C-NMR-spektrumában a CH₃-COO-csoport CH₃-részének megfelelő jel észlelhető 22 ppm-nél, illetve a CH₃-CO-NH-csoport CH₃-részének megfelelő jel észlelhető 24 ppm-nél jóval intenzívebben, mint a kiindulási heparinnál és a Cl 1938 terméknél.

Miként a B terméknél, itt is végbemegy egyaránt O- és N-acetileződés. A B tennék eseténél lényegesen erősebb N-deszulfatálódás következtében a szulfát/karboxil arány lényegesebben csökken.

A találmány szerinti eljárással előállított termékek farmakológiai aktivitását a következő kísérleti módszerekkel vizsgálhatjuk.

A) ín vitro mért antikoaguláns aktivitás

1. In vitro titer kiértékelése kalibrációs sorozattal összehasonlításban.

Ezt a mérést a Diagnostica Stago (Asnieres, Franciaország) cég által szállított „kaolin-aktivált részleges tromboplasztin” elnevezésű teszt-kitt segítségével emberi vérplazmában hajtjuk végre. A kapott eredményeket a 2. táblázatban mutatjuk be.

2. táblázat

Termék	Titer (IU/mg)
Cl 1940	113
Cl 1941	28
Cl 1943	7
heparin	160

Cl 1940 = az 5. példában ismertetett módon előállított O-butirilezett heparin

Cl 1941 =a 6. példában ismertetett módon előállított O-hexanoilezett heparin

Cl 1943 = a 8. példában ismertetett módon előállított O-dekanoilezett heparin

A kapott eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított, szelektíven O-acilezett termékeknek az in vitro titerje kisebb, mint a hepariné, antikoaguláns aktivitásuk pedig csökken azzal arányban, ahogy az acilezőlánc hossza nő.

2. Antikoaguláns aktivitás in vitro mérése a találmány szerinti eljárással előállított vegyületekkel emberi vérben.

A vizsgálatokat 5 ml emberi vérben a találmány szerinti termékeket kétféle dózisban, azaz 2 gg/ml és 4 gg/ml dózisban használva végezzük. Kontroll kísérletet is végzünk minden egyes termék esetében úgy,

HU 206 222 Β hogy a vizsgálandó terméket nátrium-klorid izotóniás oldatával helyettesítjük. Szobahőmérsékleten 30 percen át végzett inkubálást követően a vért 20 percen át 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A vérlemezkéktől mentes vérplazmát dekantáljuk úgy, hogy a következő kísérletek legyenek végrehajthatók:

- TCK (kaolin-cefal in-idő) az úgynevezett „szenzibilizált-kaolin-cefal in-idő” segítségével (ez a kitt az 1. pontban említett cégtől származik);

- Heptest (Hemachem, St. Louis, amerikai egyesült államokbeli cég).

A kapott eredményeket a 3. táblázatban adjuk meg. Mindegyik eredmény megfelel három kísérlet átlagának.

3. táblázat

Termék	Dózis (pg/ml)	PTT(S)	Heptest (S)
kontroll		48,00	21,50
	±2,70	±1,73
Cl 1940	2	208,75	61,00
	±45,54	±8,52
Cl 1940	4	428,00	101,00
	±103,43	28,36
kontroll		45,00	23,66
	±5,00	±2,08
Cl 1941	2	53,00	40,33
	±5,19	±7,63
Cl 1941	4	84,66	61,33
	±15,01	±11,01
kontroll		49,66	23,00
	±8,50	±4,35
Cl 1943		50,00	23,00
	±9,54	4,58
Cl 1943		56,00	24,00
	±10,00	5,29

Az eredmények azt mutatják, hogy a koagulációs idő meghosszabbodik mindkét kísérleti módszer esetén a Cl 1940 és Cl 1941 termékek esetében. Ez a meghosszabbodás arányos a dózissal.

Viszont ezekben az in vitro módszerekben a Cl 1943 termék csak igen gyenge hatást fejt ki a koagulációs idő meghosszabbítására.

3. Az antikoagulációs aktivitás in vitro mérése a találmány szerinti termékekkel tromboelasztográfia útján emberi vérben:

A találmány szerinti termékeket 2 pg/ml, illetve 4 pg/ml dózisban felhasználjuk az előzőekben ismertetett kísérleti rendszerekben 5 mg emberi vér jelenlétében, minden egyes termékhez egy kontroll kémcsövet is hasznosítva, amelynél a vizsgálandó terméket nátrium-klorid izotóniás oldatával helyettesítjük.

Szobahőmérsékleten 30 percen át végzett inkubálást követően Hellige-típusú tromboelasztográffal tromboelasztográfikus rögzítést végzünk 0,25 ml vérmintán, amelyet 0,1 ml 0,058 mólos vizes kalcium-klorid-oldat adagolásával kalciumban dúsítottunk.

A kapott eredményeket a 4. táblázatban adjuk meg.

4. táblázat

Termék	Dózis (pg/ml)	Γ*	k’	r+k	amx*	ITP'
kontroll		13,00	8,25	21,25	48,00	11,25
	±0,81	±1,25	±1,50	±2,44	±2,36
Cl 1940	2	33,50	22,25	55,75	35,50	2,57
	±2,88	±4,03	±5,85	±3,69	±0,77
Cl 1940	4	78,75	44,00	122,75	27,00	0,82
	±17,34	±8,68	±13,02	±16	±0,27
kontroll		10,50	4,50	15,00	57,00	37,00
	±0,70	±2,12	±2,82	±8,48	±28
Cl 1941	2	14,00	10,33	24,33	51,66	21,33
	±3,00	±6,50	±6,00	±10,96	±19,85
Cl 1941	4	20,33	15,00	35,33	40,33	4,66
	±3,51	±4,58	±5,03	±2,51	±2,08
kontroll		13,33	9,00	22,33	47,00	10,33
	±2,30	±2,64	±4,93	±4,58	±4,03
Cl 1943	2	12,66	8,00	20,66	47,00	12,00
	a;2,08	±2,64	±4,72	±5,29	±5,29
Cl 1943	4	12,66	9,83	22,50	45,66	9,33
	±2,08	±3,01	±5,07	±5,77	±4,04

*r - reakcióidő k - 20 mm-es rögzítési amplitúdónak megfelelő koagulációs idő amx - maximális amplitúdó

1TP - a trombodinamikus potenciál indexe

Az eredmények azt mutatják, hogy a Cl 1940 és Cl 1941 az r + k érték növekedéséhez, az amx és az ITP csökkenéséhez vezet, azaz ez megfelel megnövelt hipokoagulációnak. Ez a hipokoaguláció növekszik az alkalmazott dózis és az acilezőlánc hossza függvényében.

A Cl 1943 nem mutat értékelhető változást ennek a tesztnek a paramétereiben.

B) In vivő antikoagulációs aktivitás

1. In vivő antikoaguláns aktivitás mérése a találmány szerinti termékeknél nyúlon (intravénás beadás)

A kísérleteket új-zélandi hím nyulakon végeztük. Vérmintát vettünk a fül középső artériájából a termék injektálását megelőzően.

A vizsgálni kívánt termékből 25 mg 5 ml izotóniás nátrium-klorid-oldattal készült oldatát injektáljuk ezután a fül szélső vénájába.

A TCK-tesztet és a HEPTEST-et elvégezzük a termékek injektálását megelőzően vett vérmintából, valamint az injektálást követő 6., 24., 48. és 96. órákban vett vérmintákban.

A kapott eredményeket a 7. és 8. ábrákon ábrázoljuk. Ezek az ábrák az antikoaguláns aktivitás idejének

HU 206 222 Β jól érzékelhető megnyúlását mutatják, ez a megnyúlás az acilezőlánc hosszával nő.

Ténylegesen a Cl 1940 termék antikoaguláns aktivitása az injektálás utáni 6. órában lényegesen nagyobb, a Cl 1941 aktivitása az injektálás utáni 24. órában lényegesen nagyobb, és a Cl 1943 aktivitása az injektálás utáni 96. órában is még nagyobb.

2, Az antikoaguláns aktivitás in vivő mérése a találmány szerinti termékekkel tromboelasztográfiás úton

A vizsgálni kívánt termékeket intravénásán injektáljuk az előző tesztnél ismertetett módon, azaz 25 mg terméket 5 ml izotóniás nátrium-klorid-oldatban feloldva. A tromboelasztográfiás rögzítést Hellige-típusú íromboelasztográffal végezzük 0,25 ml-es vérmintákban, amelyeket az injektálást megelőzően, illetve az injektálást követő 6 24., 48. és 96. órákban vettünk. Ha az antikoaguláns aktivitás 96. óránál hosszabb időn át is jelentkezik, akkor további mintákat veszünk.

A kapott eredményeket az 5., 6. és 7. táblázatokban foglaljuk össze.

5. táblázat

Vizsgált termék: Cl 1940

	Γ	k	r + k	amx	IPT
injektálás előtt	13	6	19	67	33
injektálás után 6 órával	91	60	151	56	2,1
injektálás után 24 órával	12	5	17	67	-10
injektálás után 96 órával	8	3	11	70	77

6. táblázat

Vizsgált termék: Cl 1941

	r	k	r + k	amx	IPT
injektálás előtt	13	5	18	67	40
injektálás után 6 órával	135	31	166	45	2.6
injektálás után 24 órával	19	12	31	58	11,5
injektálás után 96 órával	22	10	32	72	25

7. táblázat

Vizsgált termék: Cl 1943

	r	k	r + k	amx	IPT
injektálás elő tt	12	4	16	69	55
injektálás után 6 órával	40	27	67	40	-
injektálás után 24 órával	13	7	20	72	36
injektálás után 48 órával	53	34	87	54,5	4.7

	r	k	r + k	amx	IPT
injektálás után 72 órával	112	185	297	38	-
injektálás után 96 órával	82	45	127	62	3,6
injektálás után 168 órával	19	9	38	68	23
injektálás után 192 órával	17	5	22	70	46

A kapott eredmények az r + k értékben jelentős növekedést, illetve az IPT értékében csökkenést mutatnak 6 óra elteltével minden egyes termék esetén, ami a hipokoagulabilitás meghosszabbodására utal. Ez az utóbbi kiterjed az injektálás után legalább 24 órán át a Cl 1941 termék esetében és még mérhető az injektálás után 96 óra elteltével a Cl 1943 esetében.

Látható tehát, hogy az összes vizsgált terméknek igen jelentős antikoaguláns aktivitása van in vivő, hogy ez az aktivitás időben elnyújtott és hogy a Cl 1943-nak, amelynek csak csekély aktivitása van vagy nincs is aktivitása in vitro vizsgálatokban, igen jelentős és kifejezetten elnyújtott aktivitása van in vivő kísérletekben.

3. A 12., 13., illetve 14. példákban ismertetett módon előállított Cl 1945, Cl 1957 és Cl 1958 kódnevű termékek antikoaguláns aktivitását is vizsgáltuk in vivő nyulakon.

Az eredmények azt mutatják, hogy a Cl 1957 és Cl 1958 termékek esetében intravénás és szubkután beadásnál a farmakokinetikai tulajdonságok javulnak.

C) Aktivitás a HTV-1 és -2 vírusok in vitro gátlásának modellkísérletében

A találmány szerinti eljárással előállított termékeket vizsgáltuk a HIV-1 és H1V-2 vírusok in vitro gátlásának olyan modellkísérletében, amelyet Pauwels, R. és munkatársai a J. Virol. Methods, 16. 171-185 (1987) szakirodalmi helyen ismertettek.

Mindegyik termék aktívnak bizonyult olyan dózisokban, amelyek esetében citotoxicitás egyáltalán nem jelentkezik. Közelebbről megfigyelhető volt, hogy a Cl 1925 és Cl 1926 termékek aktívabbak, mint a kiindulási anyag.

D) Syncytiumok képződésének in vitro gátlásában kifejtett aktivitás

A Syncytiumok hatalmas, többmagú sejtek, amelyek az egészséges T4-limfociták és fertőzött T4-limfociták fúziója útján képződnek.

A találmány szerinti eljárással előállított termékeket megvizsgáltuk olyan modellkísérletben, amelyben MOLT4-sejtek (egészséges T4-limfociták) és HUT78/HTLV IIIB sejtek (fertőzött T4-limfociták emberi sejtvonala) együtt vannak tenyésztve.

Mindegyik vizsgált termék aktívnak bizonyult ebben a modellben, olyan dózisokban, amelyeknél citotoxicitás egyáltalán nem lép fel. Közelebbről, a Cl 1924, Cl 1925 és Cl 1926 termékek aktívabbaknak bizonyultak a kiindulási anyagnál.

HU 206 222 Β

E) Különböző kifejlődött vírusok in vitro gátlásában kifejtett aktivitás

A találmány szerinti eljárással előállított termékeknek megvizsgáltuk különböző kifejlődött DNAés RNA vírusok gátlásában kifejtett aktivitását, éspedig a következő vírusoknál:

- HSV-1 és -2 (herpes szimplex vírus 1 és 2, DNA vírusok)

- VSV (vezikuláris sztomatitisz vírus, RNA vírus)

- Sindbis-vírus

Az összes vizsgált termék aktívnak viszonyult, különösen a Cl 1924, Cl 1925 és Cl 1926 termékek fejtettek ki lényegesen megnövekedett aktivitást a VSV- és Sindbis-vírusokkal szemben a kiindulási anyaghoz képest.

F) Simaizom-sejtek szaporodásának in vivő gátlásában kifejtett aktivitás

A találmány szerinti eljárással előállított termékeket megvizsgáltuk in vivő patkányokon a simaizom-sejtek szaporodásában kifejtett gátlás vonatkozásában, kísérleti modellként Clowes, A.W. és Clowes, Μ. M. által a Labor. Investig., 52(6). 612-616 (1985) szakirodalmi helyen ismertetett ballon-katéteres módszemel.

A vizsgált termékek aktívnak bizonyultak, különösen a Cl 1924, Cl 1925 és Cl 1926 termékek mutattak megnövelt aktivitást a kiindulási anyaghoz képest.

Claims

1. Eljárás heparin, heparin-fragmensek, heparánszulfát, N-deszulfatált-N-acetil-heparin, kondroitinszulfát A, kondroitinszulfát B és kondroitin-szulfát C vagy ezek in vivő hidrolizálható észterei olyan új O-acilezett származékainak, illetve ezek gyógyászatilag elfogadható sóinak előállítására, amelyek O-acilcsoportként benzoilcsoportot, 14-18 szénatomos, nem alfa,béta telítetlen alkenoilcsoportot vagy adott esetben 3-7 szénatomos cikloalkilcsoporttal vagy karboxilcsoporttal helyettesített, 2-12 szénatomos alkanoilcsoportot tartalmaznak, azzal jellemezve, hogy (1) a tárgyi körben megnevezett glikózamino-glikánok valamelyikét poláris aprotikus szerves oldószerben oldódó tercier vagy kvaterner ammóniumsóvá alakítjuk, (2) ezt a sót valamely acil-O-acil általános képletű anhidriddel - a képletben acil jelentése valamely az 1. igénypontban megadott acilcsoport - reagáltatjuk az említett poláris aprotikus szerves oldószerben katalitikus mennyiségű piridin vagy dialkil-amino-piridin és egy protonmegkötő anyag jelenlétében, (3) az így kapott terméket nátrium-acetát etanolos oldatával kicsapjuk, és (4) a szelektíven O-acilezett glikózamino-glikánt elkülönítjük úgy, hogy a kapott csapadékot vízben feloldjuk és a vizes oldatot egy gyenge bázis jelenlétében dialízisnek vetjük alá, végül kívánt esetben a szelektíven O-acilezett glikózamino-glikán így kapott nátriumsóját egy másik gyógyászatilag elfogadható sóvá alakítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (1) lépésben használt glikózamino-glikánként heparint; 1000-nél kisebb dalton molekulatömegű heparin-fragmensek keverékét, 2000 és 7000 dalton között változó átlagos molekulatömegű heparin-fragmensek keverékét; közel 4500 dalton átlagos molekulatömegű heparin-fragmensek keverékét; közel 2500 dalton átlagos molekulatömegű heparin-fragmensek keverékét; molekulatömeg vonatkozásában homogén heparin-fragmensek'keverékét; illetve mind molekulatömege, mind funkciós csoportjai vonatkozásában homogén, szintézis útján kapott heparin-fragmenst használunk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (1) lépésben antitrombin ΙΠ vonatkozásában kötőhelyet nem tartalmazó heparint vagy heparin-frakciót vagy heparin-fragmenst használunk.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (1) lépésben glikózamino-glikánként kondroitin szulfát A-t, kondroitin-szulfát B-t vagy kondroitinszulfát C-t használunk.

5 15. A 11-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás betokozódott vírusok által okozott megbetegedések kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelő kiindulási anyagokat használunk.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ( 1) lépésben glikózamino-glikán-sóként tributil-aminnal alkotott sót vagy tetrabutilammónium-sót használunk.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (2) lépésben anhidridként 2-10 szénatomot tartalmazó, előnyösen 4-10 szénatomot tartalmazó és különösen előnyösen 4 vagy 6 szénatomot tartalmazó alkán-karbonsavból leszármaztatható anhidridet használunk.

7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (2) lépésben poláris aprotikus oldószerként dimetil-formamidot, hexametilfoszforsav-triamidot vagy piridint vagy ezek - adott esetben diklór-metánt is tartalmazó - elegyét használjuk.

8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (2) lépésben protonmegkötő anyagként egy bázist, éspedig piridint, trietil-amint vagy tributil-amint használunk.

9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (4) lépésben a dialízist egy gyenge bázis jelenlétében hajtjuk végre.

10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (2) lépésben 0 °C és 100 °C, különösen előnyösen 50 °C és 100 °C közötti hőmérsékleten dolgozunk.

11. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-10. igénypontok bármelyikével előállított O-acilezett glikózamino-glikán-származékot a gyógyszergyártásban szokásosan használt hordozó és/vagy egyéb segédanyaggal összekeverjük és gyógyászati készítménnyé alakítjuk.

12. All. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az O-acilezett glikózamino-glikán-származékot gyógyászatilag elfogadható sója, előnyösen nátrium-, magnézium- vagy kalcium-sója formájában alkalmazzuk.

13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy orális beadásra alkalmas gyógyászati

HU 206 222 Β készítmények, előnyösen gasztrorezisztens kapszulák, tabletták, gyógycukrok vagy pilulák, vagy pedig orálisan beadható oldatok, a szilárd készítmények esetében 15 mg és 5 g, előnyösen 100 mg és 1000 mg mennyiségű hatóanyagot, illetve a folyékony készítmények esetében 0 mg és 150 mg közötti mennyiségű hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására alkalmas gyógyszergyártási hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokat használunk.

14. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután beadásra alkalmas, steril vagy sterilizálható injektálható oldatok, előnyösen szubkután beadás esetén 50-200 mg/ml koncentrációjú hatóanyagot, illetve intravénás beadás vagy perfúziós beadás esetén 20200 mg/ml mennyiségben hatóanyagot tartalmazó oldatok előállítására alkalmas gyógyszergyártási hordozóés/vagy egyéb segédanyagot használunk.

10 16. A 11. igénypont szerinti eljárás retrovírusok által okozott megbetegedések, különösen az AIDS kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelő kiindulási anyagokat használunk.