RU1831487C - Способ получени о-ацилированных глюкозаминогликанов - Google Patents

Abstract

Использование: в медицине. Сущность изобретени : -о-ацилированные глюкоза- миногликаны получают ацилированием глюкозаминогликанов в виде три- или тет- рабутиламмониевых солей ангидридами карбоновых кислот при комнатной температуре , в пол рном органическом растворителе в присутствии акцептора кислоты с последующей очисткой целевых продуктов. Акцептор кислоты - пиридин, диметилами- нопиридин, триэтиламин и трибутиламин. После ацилировани  продукты осаждают с помощью раствора ацетата натри  в этаноле , осадок раствор ют в воде, и раствор диализуют против воды. Диализ осуществл ют в присутствии слабого основани . 3 з.п,ф-лы, 8 табл., 8 ил.

Description

Изобретение относитс  к получению биологически активных полисахаридов, которые могут быть использованы в медицине .

Под термином глюкозаминргликан понимают вещества, образованные последовательност ми уроновых кислот (D-глюкуро- нова  кислота или L-идуронова  кислота) и аминосахаров, причем эти последние представл ют собой глкжрзэмины или галакта- замины.

Глюкозаминогликаны природного происхождени  образованы более или менее однородными смес ми последовательно соединенных дисахаридных единиц: образованных уроновой субъединицей (глюкоро- нова  кислота или идуронова  кмслота) и озаминной субъединицей (глюкозамин или галактозамин), объединенных св зью 1 или 1 .

В глюкозаминдиканах гидроксильные группы по разному замещены функциональ00

W

00

VJ

Сл

ными группами, в особенности сульфатными группами, причем амино-группы озаминов замещены сульфатными и/или ацетильными группами.

Глюкозаминогликаны, рассматриваемые здесь, включают 6 типов продукта: гепарин, гепарин-сульфат, хондроитинсуль- фат А, хондроитин-сульфат С, хонДроитин- сульфат В, более точно называемый дерматан-сульфат, и гиалуронова  кислота. Они характеризуютс  двум  следующими основными дисахаридными структурами (А) и (В);.

ovy

NHR JH

в которой R обозначает группу 50з и/или ацетильную группу и знак|указывает, что карбоксильна  группа может быть ниже плоскости цикла (идуроновое звено) или выше плоскости цикла (глюкуроновое звено), и

(В)

i3Jn

Глюкозаминликаны, обладающие основной структурой (А), представленной выше , называют глюкоэаминогликанами (или GAGS) гепаринового типа и включают гепа- рины и гепарин-сульфаты, а глюкозами- ногликаны, имеющие структуру основани  (В), представленную выше, называют GAGS типа хондроитин-сульфата и включают хон- дроитин-сульфаты А и С и дерматан-сульфат .

Гиалуронова  кислота имеет основную структуру (В), в которой галактоэамин заменен на глюкозамин.

Как указано выше, как в GAGS гепаринового типа, так и в GAGS типах хондроитин-сульфата , более или менее высокое процентное содержание гидроксильных групп в п диса- харидных единицах находитс  в форме сложных эфиров серной кислоты.

Так, гепарин может быть представлен основной структурой (А), указанной выше, в которой п может измен тьс  от 1 до 80..R в большинстве п единиц обозначает группу 50з. и, в остальных случа х, ацетильную группу; группы ОН в положении 6 глюкоза- мина и в положении 2 уроновой кислоты в большинстве случаев сульфатированы, тогда как группа ОН в положении 3 глюкозами

10

15

на сульфатирована только в меньшинстве случаев; ОН в положении 3 уроновой кислоты практически не сульфатирована, причем вышеуказанна  уронова  кислота в большинстве случаев представл ет собой идуро- новую кислоту.

Продукты, имеющие основную структуру (А), включают также М-десульфатирован- ный N-ацетилированный гепарин. Этот гепарин представлен формулой (А), в которой R обозначает ацетильную группу.

Гепарин также содержит формы, имеющие структуру (А), с п измен ющимс  от 3 до 15, и тот же самый химический профиль. Вышеуказанные формы могут быть выделены фракционно согласно известным методам и называютс  гепаринами низкого молекул рного веса (н.м.в.).

Гепарины н.м.в,, имеющие молекул рное распределение и обладающие биологическими свойствами, по существу идентичны таковым гепаринов н.м.в., получаемыми путем фракционировани , могут быть получены фрагментацией гепарина согласно следующим методам:

-метод азотистокислой деполимеризации и восстановлени  (2, 3), который разрезает молекулу, атаку  субъединицы глюкозамин-М-сульфата, чтобы дать концевой 2,5-ангидромэннитол:

СН2СИ

- о -о-(он(Ь}

Ун

СН7ОН

в известных случа х сульфатированных по первичной гидроксильной группе в положении 6.

-метод ферментативной деполимери- 40 зации (4,5) или щелочной деполимеризации

(6), который разрезает молекулу, атаку  уро- новые субъединицы, чтобы дать окончание в виде а,/3-ненасыщенной уроновой кислоты:С00

О

О- (А)

онв известных случа х 2-сульфатированной;

50 - метод окислительной деполимеризации (7,8), который разрезает молекулу путем окислени , сохран   природные окончани .

Другие гепарины н.м.в., которые имеют

55 молекул рное распределение, отличающеес  от такового природного гепарина, обладают особыми биологическими свойствами, могут быть получены йодным окислением природного гепарина, с последующей депо20

25

30

35

45

лимеризацией, путем / -элимировани  или кислотного гидролиза. Йодное окисление разрезает несульфатированные звень  уро- новой кислоты между углеродами в положении 2 и 3. Известно, что такие звень  присутствуют в участке св зи с антитромбином HI (AT III), плазматическом ингибиторе коагул ции различных серин-протеаз, и активность которых сильно увеличиваетс  за счет гепарина, действующего как кофактор, Йодное окисление, следовательно, позвол ет получать продукты, лишенные участка св зи с AT IH, и, следовательно, по существу лишенные антикоагулирующей активности.

Гепарины н.м.в. этого типа могут быть получены в особенности при осуществлении способа, включающего следующие стадии:

-осторожное окисление гепарина, реализуемое путем введени  в реакцию гепарина , в виде водного раствора с конечной концентрацией 0,5-5% (вес/обьем), с солью йодной кислоты при конечной концентрации 0,5-1% (вес/обьем), при рН. равном 4,5-6,5, предпочтительно при рН 5, при температуре 0-10°С, в течение 15-48-часов, в отсутствие света;

-деполимеризаци  полученных гепариновых цепей путем присоединени  сильного основани , такого как гидроксид натри  при рН выше примерно 11, а именно от 11 до 12, предпочтительно при 11,2-11,6, предпочтительно вблизи 11,5;

-восстановление фрагментов депол ризации с помощью восстановител  и, после удалени , в желательном случае, восстановител , который не прореагировал;

-рекупераци  восстановленных фрагментов гепарина путем осаждени  с помощью растворител , в котором они нерастворимы;

-выделение искомых фрагментов путем фракционировани  с помощью спирта, в присутствии неорганической соли, полученного водного раствора, снова раствор   в воде, выделенный ранее осадок, и рекупериру  образовавшийс  осадок.

Эти гепарины н.м.в. отвечают формуле

(С):

соо чон

о

СН7ОН -Q

он

Оч

(С)

OSOjNHR,Jn

в которой п может измен тьс  от 6 до 15; R по крайней мере в 90% п единиц представл ет собой группу 50з, и, в остальных случа х, ацетильную группу, причем группы ОН в положении 3 глюкозамина могут быть сульфатированы, а группы ОН в положении

б глюкозамина сульфатированы на 70%. Более того, по 1 звену на 2 цепи по крайней мере этого гепарина н.м.в. имеют замену идуроновой кислоты на звено уроновой кислоты (D-глюкуроновой или L-идуроновой), не сульфатированной, раскрытой между углеродами в положени х 2-й 3, следующей формулы:

СОО

-О

:снгон снгон

Такие гепарины н.м.в. могут быть еще фракционированы гель-фильтрацией согласно известным способам, чтобы получить смеси фар фрагментов, однородных с точки зрени  их молекул рной массы, лишенные участка св зи с AT III.

Другие глюкозаминогликаны гепаринового типа образованы GAGS формулы (А) или (С), в которых карбоксильна  функци  уроновой кислоты этерифицирована, например , путем конденсации со спиртом в

присутствии агента конденсации карбоди- мидного типа (9) или путем алкилировани  карбоксила с помощью алкилгалогенида в присутствии слабого основани ,

Точно также, глюкозаминогликаны типа

хондроитин-сульфата образованы глюкоза- мингликанами формулы (В), в которых карбоксильные функции уроновых кислот этерифицированы, например, путем алкилировани  карбоксила с помощью алкилгалоген ид а в присутствии слабого основани .

Такие сложные эфиры дл  гиалуроновой кислоты получают путем обработки гиалуроновой кислоты в форме соли четвертичного аммони  спиртом в присутствии катализатора или этерифицирующего (превращающего в простой эфир) агента (10).

Гепар н-сульфат представлен вышеприведенной формулой (А), в которой п может измен тьс  от 1 до 80, R обозначает в большинстве видов ацетильную группу и в меньшинстве видов группу S )з. Кроме того, в преобладающем большинстве форм, группы ОН в положении 6 глюкозамина сульфатированы , причем уронова  кислота в

большинстве форм представл ет собой глю- куроновую кислоту.

Хондроитин-сульфаты А и С представлены вышеприведенной формулой (В), в которой п измен етс  от 1 до 80, соответственно , группы 4-ОН и б-ОН глюкозамина сульфатированы, причем уронова  кислота в большинстве форм представл ет собой глюкуроновую кислоты.

Дерматан-сульфат имеет структуру, по существу идентичную таковой хондроитинсульфата А, но субъединица уроновой кислоты представл ет собой идуроновую кислоту в большинстве случаев.

Фрагменты дерматан-сульфата, отвечающие вышеприведённой формуле (В), в которой п может измен тьс  от 1 до 20, могут быть получены йодным окислением с последующим восстановлением брргидридом натри  и кислотным гидролизом, как описано у FRAN.

Глюкозаминогликаны обладают многочисленными биологическими активност ми, среди которых можно назвать их активности по отношению к факторам коагул ции, которые могут осуществл тьс  через посредство различных плазматических протеинов. В том, что касаетс  гепарина, также из литературы известно, что гепарин или некоторые из его производных, обладающие или нет антикоагулирующей активностью , могут иметь регул ционную активность пролиферации гладких мышечных клеток сосудистой стенки или еще ингиби- рующую активность гепараназы, фермента, принимающего участие в механизмах мета- стазного распространени . Кроме того, глю- козамингликаны составл ют часть более широкого семейства сульфатированных полисахаридов, причем некоторые в более или менее значительной степени обладают противовирусной активностью и в особенности анти-УМ-Ьактивностью (вирус человеческого иммунодефицита) В ABA и др.

В нижеследующем тексте используетс  термин GAGS дл  обозначени  глюкозами- ногликана. который либо имеет природную структуру, такую, котора  получаетс  экстракцией, полусинтетическую или синтетическую, либо имеет химически модифицированную структуру на функциональных карбоксильных или аминогруппах, сначала по реакции ацилировани , дающей GAGS, селективно 0-ацилированные,

Несмотр  на большой интерес к их фармакологическим активност м, природные GAGS обладают тем недостатком, что имеют относительно короткий период полураспада , что приводит к необходимости повторных введений. Этот недостаток отчасти временно сглаживаетс  за счет использовани , дл  предохранени  и лечени  венозных тромбозов, производных гепарина незначительной молекул рной массы, подкожно, уменьша  таким образом частоту введени  инъекций в день.

Тем не менее, большой интерес представл ет возможность иметь в распор жении производные, обладающие пролонгирующим действием, что позвол ет еще снижать

частоту введени  этих продуктов, увеличива  продолжительность их действи .

Также может представл ть большой интерес располагать пролонгированными, неантикоагулирующими производными, такими, как производные N-десульфатиро- ванного N-ацетилированного гепарина, активность которых как ингибитора гепараназы , фермента, вовлекаемого в метастаз0 ные  влени  распределени , оцениваетс  очень высоко.

Известны многочисленные производные модифицированных глюкозаминогли- канов, чтобы улучшить их фармакокинетику,

5 а именно сложные эфиры с карбоксильной функцией уроновых кислот или с гидро- ксильными функци ми,

В особенности используют частичную или полную этерификэцию карбоксильных

0 функций гепарина, обрабатываемых в форме соли четвертичного аммони , в инертном растворителе, спиртом или галогенирован- ным производным, в присутствии, в известных случа х, агента конденсации .

5 Производные гиалуровой кислоты, полученные этерификацией с помощью спирта в присутствии катализатора или путем реакции с этерифицирующим агентом до получени  простого эфира, также описаны.

0 Кроме того, известны различные способы дл  этерификации GAGS по первичным и вторичным гидроксильным функци м.

Известен способ получени  неполных гидролизуемых эфиров гепарина и неток5 сичной органической кислоты, например, 4- хлорфеноксиизомасл ной, 4-хлорфенокси- уксусной, холиновой, никотиновой, пириди- луксусной и др.

При этом указанные соединени  получа0 ют реакцией четвертичной соли гепарина с кислотой, активированной карбодиимидом. Эта реакци  дает не только о-ацилирован- ное производное, но и вторичный стабильный продукт в виде сложноэфирного

5 о-ацилиэомочевинного производного. Кроме того услови  реакции благопри тны дл  образовани  пангидридов и межмолекул рных реакций между кислотными и гидро- ксильными функци ми гепарина,

0 Наиболее близким к предлагаемому  вл етс  способ этерификации гепарина или низкомолекул рного гепарина воздействием хлорангидрида кислоты в формамиде в присутствии пиридина при температуре

5 40°С, в течение 3-4 ч. Получаемые продукты обладают повышенной трансмембранной проницаемостью.

По окончании реакции добавл етс  вода и осуществл етс  диализ против NaCI и воды, и последующа  миофилиэаци .

Недостатком этого способа  вл етс  то, что получаемые продукты претерпевают ча стичную десульфатацию. Кроме того, они 0- и N-ацилированы. В св зи с этим соотношение групп сульфат/карбоксил в получаемом глюкозаминогликане изменено.

По указанным причинам получить продукты , обладающие нужными и воспроизво- димыми биологическими свойствами, известным способом нельз .

Цель изобретени  - обеспечение селективности 0-ацилировани  и получение продуктов с воспроизводимыми биологическими свойствами.

Указанна  цель достигаетс  тем, что в способе получени  0-ацилированных глю- козаминогликанов, включающем обработку глюкозаминогликанов ацилирующими агентами в присутствии акцептора кислоты, в среде пол рного органического растворите- л , с последующей очисткой целевых продуктов , глюкозаминогликаны используют в виде три- или тетрабутиламмониевых солей, в качестве ацилирующих агентов примен ют ангидриды карбоновых кислот, и обработку осуществл ют при комнатной температуре.

При этом в качестве акцептора кислоты используют одно или несколько соединений , выбранных из группы, включающей пиридин, диметиламинопиридин, триэтила- мин и трибутиламин.

После ацилировани  продукты могут быть осаждены с помощью раствора ацетата натри  в этаноле, осадок растворен в воде, а полученный раствор диализован против воды.

Диализ может быть осуществлен в присутствии слабого основани , В частности, в качестве слабого основани  может быть использован бикарбонат натри .

Введением во взаимодействие растворимой в органической среде соли GAGS, такой , как соль третичного или четвертичного аммони , с ангидридом карбоновой кислоты в апротонном пол рном органическом растворителе, получают селективное ацили- рование свободных гидроксидов, без изменени  функциональных карбоксильных или аминных групп используемого GAGS. Использование GAGS в форме растворимой в органической среде соли позвол ет предпочтительно контролировать реакцию ацилировани  с большой точностью. Более того, степень ацилировани  легко модулируетс  и может быть увеличена, не вызыва  при этом изменени  остальной части молекулы . Особенно можно достигать степени ацилировани  0,1-3-ацмльных групп на ди- сахаридную единицу, в особенности 0,5-2- ацильные группы.

Найдено, что при этом не образуетс  низкое N-ацилированное производное и что, когда ангидриды образуютс  на уровне карбоксильных функций, использование слабого основани  позвол ет легко их снова превратить в свободную кислоту.

Предпочтительно, селективное ацили- рование GAGS согласно способу изобретени  позвол ет осуществл ть модулирование их биологических активностей, которые в некоторых случа х сильно увеличиваютс .

Наконец, найдено,что 0-ацилирован- ные GAGS, полученные таким образом, обладают более пролонгированной фармакологической активностью.

В предпочтительном способе изобретени , выбранные глюкозаминогликаны представл ют собой .глюкозаминогликаны гепаринового типа, а именно гепарин, производные гепарина, полученные либо путем фракционировани , либо полусинтетическим или синтетическим путем, гепарин- сульфат и его производные, полученные путем фракционировани , полусинтетическим или синтетическим путем.

Дл  получени  смесэй фрагментов гепарина , имеющих молекул рную массу ниже 10000 дальтонов, также можно использовать метод ферментативной деполимеризации .

В другом предпочтительном аспекте изобретени , можно использовать смесь фрагментов гепарина, однородных по их молекул рной массе; фрагмент гепарина, получаемый путем синтеза, однородный в том, что касаетс  его молекул рной массы, а также в том, что касаетс  его функционализа- ции.

В другом интересном аспекте изобретени , в качестве глюкозаминогликана можно выбирать производные гепарина, лишенные участков св зи с антитромбином III (AT HI), либо когда гепариновые цепи фракционированы, чтобы удалить олигоса- харидные цепи, включающие участок св зи с AT III, прибега , например, к афинной хроматографии на смоле Сефзроза-АТ III или к ионообменным хроматографи м, либо когда эти участки разрушены, например, деполимеризацией периодатом с последующим / -элиминированием или кислотным гидролизом.

Особенно предпочтительные соединени  могут быть получены из соединений, приготовленных по способу, использующему йодного окисление с последующим щелочным / -элиминированием, восстановлением и фракционированием.

Другими предпочтительными соединени м , отвечающими формуле VI,  вл ютс 

смеси соединений, гомогенных по их молекул рной массе, получаемые путем гель- фильтрации, в которых п обозначает целое число 2-12,

Из соединений с гепариновой структурой, лишенных участка фиксации с AT III, и следовательно , лишенных антикоагулмрующей активности, семейство предпочтительных соединений соответствует N-десульфатиро- ванным М-ацетилированнымселективно 0-. ацилированным производным гепарина.

В другим предпочтительном аспекте изобретени , выбираютс  глюкозамингли- каны типа хондроитин-сульфата, а именно хлондроитин-4 и 6-сульфаты, дерматан- сульфат, и их фрагменты.

Способ насто щего изобретени  отличаетс  тем, что г юкозаминогликаны превращают в растворимую в органической среде соль и эту соль обрабатывают ацили- рующим агентом, способным селективно ацилировать первичные и вторичные гидро- ксилъные группы этого глюкозаминоглика- на, не затрагива  функциональные группы NHRa, или COOR, присутствующие в этом глюкозаминогликане до реакции ацилйро- вани , причем реакци  осуществл етс  в. апротрнном пол рном растворителе в присутствии катализатора и в присутствии основани , способного улавливать выдел ющуюс  во врем  ацилировани  кислоту, при комнатной температуре.

Продукт затем осаждают с помощью смешивающегос  с водой растворител , такого как этанол, к которому можно добавл ть добавку, благопри тствующую осаждению, такую как минеральную соль, 0-Ацилированный глюкозаминогликан выдел ют путем растворени  в воде осадка и предпочтительно диализировани  в присутствии слабого основани .

Предпочтительно, способ изобретени  осуществл етс  согласно следующим стади-  м:. . : . --.. - ;

(1)Глюкозаминогликан предотвращают в соль вышеуказанного глюкозаминоглика- на, растворимую в апротонном пол рном органическом растворителе;

(2)эту соль обрабатывают ангидридом формулы: ацил-О-ацил, в вышеуказанном апротонном пол рном органическом растворителе , в присутствии каталитических количеств пиридина, диметиламинопири- дина, или триэтиламина или трибутилами- на.. . - ;

(3)таким образом полученный продукт осаждают воздействием раствора ацетата натри  в этанола; и

(4)селективно-0-ацилированный глюкозаминогликан выдел ют путем растворени 

в воде таким образом полученного осадка и путем диализа в присутствии слабого основани , и в известных случа х натриевую соль таким образом полученного селективно 0-ацилированного глюкозаминогликака превращают в другую фармацевтическую совместимую соль, :

В предпочтительном аспекте способа изобретени , используемый в стадии (1)

0 глюкозаминогликан выбираетс  в группе, образованной гепарином, смесью фрагментов гепарина, имеющих молекул рную массу ниже 10000 дальтонов, смесью фрагментов гепарина, имеющих среднюю моле5 кул рную массу 2000-7000 дальтонов, Смесью фрагментов гепарина, имеющих среднюю молекул рную массу около 4500 дальтонов, смесью фрагментов гепарина, имеющих среднюю молекул рную массу

0 около 2500 дальтонов, смесью фрагментов гепарина, гомогенных по своей молекул рной массе: фрагментом гепарина, получен- иым путем синтеза, гомогенным в том, что касаетс  его молекул рной массы, и в том,

5 что касаетс .его функционализации.

В другом предпочтительном аспекте способа изобретени , используемым в стадии (1) глюкоэаминогликаном  вл етс  гепарин , фракци  или фрагмент гепарина.

0 лишенные участка св зи с антитромбином III.

Глюкозаминогликан, используемый в стадии (1) способа изобретени , предпочтительно может быть еще выбран в группе,

5 образованной дерматансульфатом и его фрагментами, или 4-и 6-сульфат-хондроити- нами и их фрагментами.

Предпочтительно, соль глюкозаминог- ликана, используема  в стадии (1), способа

0 изобретени , представл ет собой соль третичного амина соль трибутиламмони , или соль четвертичного аммони  соль тетрабу- тиламмони ,

В другом предпочтительном аспекте

5 способа изобретени , используемым в стадии (2) ангидридом  вл етс  ангидрид алка- новой кислоты, содержащей 2-ЮС-атомов, предпочтительно 4-10, особенно 4 или 6 С-атомов.

0 Апротонный пол рный растворитель, в котором осуществл етс  стади  (2) способа изобретени , предпочтительно может быть выбран из группы, включающей диметил5 формамид, гексаметилфрсфортриамид, пиридин , или еще смесь этих растворителей друг с другом или с дихлорметаном, и катализатор выбираетс  в группе, образованной аминами, такими, как пиридин, и диметила- минопиридин.

Предназначенным дл  нейтрализации кислотности основанием может быть пиридин (который может служить одновременно растворителем, катализатором и основанием ), триэтиламин или трибутиламин.

Предпочтительно, диализ, осуществл емый в стадии (4), проводитс  в присутствии слабого основани , такого, как бикарбонат натри , чтобы удалить возможные вторичные продукты, такие, как ангидриды.

Продолжительность реакции может мен тьс  в зависимости от желательной степени ацилировани , например, 1-24 ч.

Соединени  изобретени , селективно 0-ацилированные,обладают ин виво пролонгированной активностью. Например, когда эти соединени  представл ют собой соединени  гепаринового типа, обладающие участком св зи с А Т III, и следовательно, способны про вл ть энтитромботическую активность, то эта активность четко пролонгирована во времени по сравнению с таким же соединением, не подвергнутым селективному 0-ацилированию.

Селективно 0-ацилированные гепариновые производные, согласно изобретению , имеющие или нет участок св зывани  с AT III, примем эти последние практически лишены антикоагулирующей активности, обладают также различными биологическими активност ми, а именно:

-ингибирование пролиферации гладких мышечных клеток, которое представл ет большой интерес дл  избежани  рецидивов стеноза при вмешательствах, таких , как ангиопластика, обходы и сшивка вен и артерий, трансплантаци  органов, в особенности трансплантации сердца:

-ингибирование гепариназы и гепари- тиназы, ферментов, принимающих участие в метастазных диссеминировэни х;

-противовирусные свойства, в особенности по отношению к ретро-вирусу, а именно по отношению к различным НУ (вирус человеческого иммунодефицита), что представл ет большой интерес при лечении СПИДа.

-свойства ингибировани  лейкоцитарной эластазы. повышени  имеющегос  процента ингибиторов эластазы, также как селективного ингибировани  синтеза коллагена типа III и фибронектина, что представл ет большой интерес дл  лечени  заболеваний, в которых наблюдаетс  нарушение равновеси  системы эластазанти- эластаза, таких, как эмфизема, также дл  лечени  дегенеративных заболеваний инъ- юнктивной ткани, таких, как артериосклероз и диабет.

Селективно-0-ацилированные глюкоз- миногликаны изобретени , следовательно,

могут образовывать действующее начало лекарств большого интереса в многочисленных показани х.

Изобретение также позвол ет получить

5 биологические объекты (селективно 0-аци- лированные глкжозаминогликаны), которые могут быть использованы в качестве стандартов или этанолов в сравнительных изучени х дл  исследований отношений

0 структура/активность в различных физиологических системах, в которых могут содержатьс  глюкозаминогликзны.

Изобретение будет лучше пон тно с помощью нижеследующих примеров.

5 Пример 1. Получение О-ацетилиро- ванного гепарина (1C 1938) из тетрабути- ламмониевой соли гепарина.

а)Получение тетрабутиламмониевой соли гепарина

0 Натриевую соль гепарина (10 г) растворенную в воде (500 мл), перколируют через колонну с катйонообменной смолой (Dowex 50 W х 4, в форме Н4), Полученный раствор нейтрализуют гидроксидом тетрабути5 ламмони . После лиофилизации получают тетрабутиламмониевую соль гепарина

(19,55 г).

б)Ацитилирование:

1,05 г Тетрабутиламмонийгепарината

0 раствор ют в безводном диметилформа- миде (5 мл), После охлаждени  до 0°С прикапывают уксусный ангидрид (1 мл: 10:46 ммоль), затем триэтиламин (1,45 мл, 10:46 ммоль) и диметиламинопиридин

5 (64 мг, 0,5 ммоль), Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре. После добавлени  воды (5 мл), раствор диализуют в течение 72 ч против дистиллированной воды . Тетрабутиламмониевую соль превраща0 ют в натриевую соль пропусканием через смолу Dowex 50, Н+, при 0°С, с последующей нейтрализацией 1н.раствором гидроксида натри . После лиофилизации получают 0,49 г гепарината натри , селективно 0-ацетили5 рованного и имеющего следующие характеристики:

соотношение сульфат/карбоксил: 2,28 мэкв/г (исходный продукт 2,20 мэкв/г}. Титр АРТТ: 9.1 nl/мг

0 13С-ЯМР-спектр (метанол, 51,6 м.д., внутренний стандарт):

сигнал при 23,4 м.;д.: СНз от СНзСОО; сигнал при 24,5 м.д.: (слабый): СНз от СНз- CO-NH- (идентичен исходному продукту).

5 ЯМР-сп:ектр указывает на наличие около двух ацетильных групп на дисахаридную единицу.

Пример 2. Получение Оацетилиро- ванного гепарина (1C 1938) из трибутилам- мониевой соли гепарина.

а)Получение трибутиламмониевой соли гепарина:

Натриевую соль гепарина (10 г) раство-1 р ют в воде (500 мл), затем перколируют через колонну с катионообменной смолой (Dowex 50 W х 4, в Н -формё). Раствор нейтрализуют добавлением 10%-ного раствора трибутиламина в этаноле. После промывки и лиофилизации, получают тетрабутиламмо- ниевую соль гепарина (14,77 г),

б)Ацетилирование

К охлажденному до 0°С раствору вышеуказанной соли(4 г) в безводном диме- тилформамиде (50 мл), добавл ют диметиламинолиридин (250 мг), уксусный ангидрид (3,9 мл) и трибутиламин (9,7 мл). После выдерживани  24 ч при комнатной температуре, добавл ют воду (1,5 мл). Смесь затем выливают в насыщенный раствор в этаноле ацетата натри . После промывки этанолом, осадок раствор ют в воде, после чего диализуют против 5%-но.го бикарбоната в воде, затем против воды. После лиофилизации получают гепаринат натри , который 0-ацетилирован (1,81 г),

ЙК-спектр имеет сильную полосу, относимую к сложному эфиру, при 1730см -,

После омылени , продукт имеет:

-соотношение сульфат/карбоксил 2,38 мэкв/г (исходный продукт: 2,40 мэкв/г),

-титр АРТТ: 85 nl/мг,

Пример 3. Получение О-ацетилиро- ванного гепарина (1C 1938), использу  катализ пиридином,

Тетрабутиламмониевую соль гепарина (0,58 г) раствор ют в смеси (1/1 от объема) пиридина и диметилформамида (10 мл). Добавл ют уксусный ангидрид (0,5 мл), затем смесь выдерживают при комнатной температуре . Спуст  24 часа добавл ют водный раствор ацетата натри  (1М, 15 мл), затем смесь выливают в этанол (80 мл) охлажденный до 0°С. После центрифугировани  осадок раствор ют в воде (10 мл), затем добавл ют этанол (160 мл), а после него- водный ацетат натри  (Ш, 10 мл). Осадок затем обрабатывают водной и лиофмлизу- ют, получа  0-ацетилированный гепарин (0,22 г).

П р и мер 4. Получение 6-пропионили- рованного гепарина (1C 1939) с различными степен ми пролионилировани .

К охлажденному до 0°С раствору гепа- рината тетрабути аммони  (1,85 г), полученному как описано в примере 1, в диметилформамиде (10 мл) прикапывают пропионовый ангидрид (2,7 мл), затем триэтиламин (2,9 мл) и диметиламинопири- дин (128 мг). Во врем  1 ч, 2 ч, 4ч, 8 ч и 24 ч отбирают часть реакционной смеси, разбавл ют равным объемом воды и диализуют в течение 24 ч в дистиллированной воде. После пропускани  через смолу Dowex 50, Н. и нейтрализации раствором гидроксида натри , полученные продукты лиофилизуют и они имеют характеристики, представленные в табл.1.

ПМР-спектр продуктов зарегистрирован в воде с 3,3,3-триметилсилилпропио- натрм (ТСП) в качестве внутреннего стандарта. Он имеет сигналы при: 1,1 м.д. и 2,4 м.д., характерные относительно остатков СНз и СН2, СНз-СНг-СО-О, и сигналы 5-5 м.д., характерные дл  протонов озидие- вого скелета.

Сравнение интенсивности сигналов лрипи- олила и скелета между обработанным .в течение 1 часа продуктом и таковым, подвергнутым в течение 24-х часов реакции, иллюстрирует вли ние продолжительности реакции, в самом деле, наблюдают уменьшение сигналов протонов скелета, что указывает на увеличение степени замещени .

С-ЯМР-спектр (метанол, 51,6 м.д., внутренний стандарт), имеет сигналы при 10,8 и 30 м.д.( характерные дл  радикалов СНз и СН2 пропионатов.

П р и м е р 5. Получение 0-бути л и рованного гепарина (1C 1940)

А) Использование тетрабутиламмоние- вой соли гепарина:

К раствору соли тетрабутиламмони  гепарина (0,55 г), полученной как описано в примере 1, в диметилформамиде (5 мл) добавл ют при 0°С масл ный ангидрид и ди- метиламинопиридин. После выдерживани  24 ч при комнатной температуре, добавл ют воду (5 мл), затем реакционную смесь диализуют а течение 72 ч против дистиллированной воды. После пропускани  через ионообмен ник Dowex 50, Н, нейтрализации раствором гидроксида натри  и лиофилизации получают Обутилированный гепарин в форме соли натри  (0,32 г).

Соотношение сульфат/карбоксил: 2,15 мэкв/г (исходный продукт: 2.20 мэкв/г),

Титр АРТТ: 59 nl/мг.

ПМР-спектр (ГСП в качестве внутреннего стандарта) показывает наличие сигналов при 0,9 м.д., 1,6 м.д. и 2,4 м.д., характерные дл  групп СНз-СНг из СНз-СНа-СНа-СО-О-, и сигналы между 3 и 6 м.д., характерные дл  озидиевого скелета.

Анализ ЯМР-спектра указывает на наличие около одной бутирильной цепи на диса- харидную единицу.

Б) Использование трибутиламмоние- вой соли гепарина:

К охлажденному до 0°С раствору трибу- тиламингепарината (4 г), полученного как описано в примере 2, в димётилформамиде (50 мл), добавл ют диметиламинопиридин (0,25 г), масл ный ангидрид (6,7 мл) и трибутиламин (9,7 мл). Оставл ют реакционную смесь на 24 часа при комнатной температуре . Добавл ют воду (1,5 мл), затем, спуст  30 минут, насыщенный раствор ацетата натри  в этаноле (250 мл). Осадок затем промывают три раза этанолом, затем диализуют против 5%-ного раствора бикарбоната , затем против воды. Получают, после лиофилизации, натриевую соль 0-бутилиро- ванного гепарина (2,1 г).

Титр АРТТ: 29 ni/мг

После омылени  сложных эфиров 0,5 М раствором гидроксида натри  в течение 2 часов при 0РС, полученный продукт имеет соотношение сульфат/карбоксил 2,36 мэкв/г (2,40 мэкв/г в исходном продукте).

Пример 6. Получение 0-гексаноили- рованного гепарина 0С 1941).

А) Использование тетрабутиламмоние- вой соли гепарина:

К раствору тетрабутиламмрниевой соли гепарина (0,55 г), полученной как описано в примере 1, в диметилформамиде (5 мл),:До- бавл ют, при 0°С, капроновый ангидрид (1 мл, 6 ммоль), триэтиламин (0,84, мл, 6 ммоль) и диметиламинопиридин. Спуст  24 часа сто ни  при комнатной температуре добавл ют воду (5 мл), затем реакционную смесь диализуют в течение 72 ч против 5%-ного раствора бикарбоната, затем против дистиллированной воды. После ионноОбмена на смоле Sowex 50, Н+, нейтрализации раствором гидроксида натри  и лиофилизации, получают 0-гексаноилированный гепарин в форме натриевой соли (0,30 г).

Титр АРТТ: 25 nl/мг

ПМР-спектр (ГСП, внутренний стандарт ), показывает сигналы при 0,8, 1,2, 1,5 и 2,3 м.д. характерные дл  СНз-СН2 из СНз(СН2)8-СО-0-.

Б) Использование трибути аммониевой соли гепарина:

К охлажденному до 0°С раствору гепа- рината трибутиламмони  (4 г), полученного как описано в примере 2, в диметилформамиде (50 мл), добавл ют диметиламинопиридин (0,25 г), трибутиламин (9,7 мл) и ангидрид гексановой кислоты (10,6 мл). Спуст  24 часа сто ни  при 20°С, добавл ют воду (1,5 мл), затем насыщенный раствор ацетата натри  в этаноле. После промывки этанолом, диализа и лиофилизации, получают 0-гексаноили- зированный гепарин (2,5 г).

Пример 7. Получение 0-октаноили- рованного гепарина (1C 1942).

К охлажденному до 0°С раствору гепа- рйната трибутиламмони  (4 г), полученного как описано в примере 2, в диметилформамиде (50 мл), добавл ют диметиламинопи5 ридин (0,25 г), ангидрид октановой кислоты .(12,1 мл) и трибутиламин (9,7 г). Спуст  24 часа сто ни  при комнатной температуре, добавл ют воду, затем, спуст  30 минут, насыщенный раствор ацетата натри  в этано0 ле. После диализа против 20%-ного раствора ацетата натри  в этаноле, затем против дистиллированной воды, и ультрафильтрации , продукт подвергают катирнно- му обмену путем пропускани  через смолу

5 Dowex 50, Н , с последующей нейтрализацией гидроксидом натри . После лиофилизации получают 0-актаноилированный гепарин (2,5 г).

Пример 8. Получение 0-деканоили0 рованного гепарина (1C 1943).

А) Использование тетрабутиламмоние- вой соли гепарина.

К раствору тетрабутиламмониевой соли гепарина (0,55 г), полученной как описано в

5 примере 1, в диметилформамиде (5 мл), при ОС добавл ют капроновый ангидрид (Т мл, 6 ммоль), триэтиламин (0,84 мл, 6 ммоль) и диметиламинопиридин. После сто ни  24 часа:при комнатной температуре добавл ют

0 воду (5 мл), затем реакционную смесь диализуют в течение часов против 5%-ного раствора бикарбоната, затем против дистиллированной воды. После ионообмена на смоле Dowex 50, Н , нейтрализации раство5 ром гидроксидэ натри  и лиофилизации, получают 0-деканоилированный гепарин в форме натриевой соли (0,30 г).

ЯМР-слектр (ГСП в качестве внутреннего стандарта) имеет два сигнала при 0,8,1,2,

0 1.5 и 2,4 м.д, характерные дл  СНз и СН2 от СНз-(СН2)8-СО-0-.

Б).Использование трибутиламмониевой соли гепарина.

К охлажденному до 0°С раствору трибу5 тиламмонийгепарината {4 г), полученного как описано в примере 2, в диметилформамиде (50 мл), добавл ют диметиламинопиридин (0,25 г), ангидрид декановой кислоты (13,3 г), растворенный в 20 мл диметилфор0 мамида) и трибутиламин (9,7 мл). После сто ни  24 часа при комнатной температуре, добавл ют воду (5 мл), затем насыщенный раствор ацетата натри  в этаноле. Осадок раствор ют в диметилсульфоксиде, затем

5 диализуют против воды, бикарбоната натри  и снова воды. После лиофилизации, получают 0-деканойлированный гепарин (2,38 г).

При мер 9. Получение 0-олеоилиро- ванного гепарина (1C 2013)

Трибутиламмониевую соль гепарина (3 г) и N.N-AHMeTMnaMHHonnpHflMHa (244 г) раствор ют в безводном диметилформамиде (50 мл). После охлаждени  до 0°С, прикапывают олеиновый ангидрид (21 г) в виде рас- твора в дихлорметане (20 мл), затем трибутиламин (9,5 мл). Спуст  24 часа реакции vi охлаждени  при 0°С, ввод т 5%-ный бикарбонат натри  (10 мл), затем, спуст  час, насыщенный спиртовой раствор ацета- та натри . После промывки абсолютным этанолом, растворени  в смеси диметил- сульфоксида с водой (4/1, по объему, 750 мл), диализуют против водного 10%-ного этанола, в течение 2-х дней, затем против воды в течение 3-х дней. Натриевую соль олеоилированного гепарина выдел ют, после лиофилизации и осаждени  в диэтиловом эфире лиофилизата, снова растворенного в ДМФ (2,77 г). Содержание олеиновой кисло- ты: 1,44 мкмоль/мг.

Прим ер 10. Получение СНюнзоили- рованного гепарина (1C 1944).

Тетрабутиламмониевую соль гепарина, полученную как описано в примере 2, бен- зоилируют с помощью бензойного ангидрида в услови х, описанных выше дл  получени  0-декзноилироаанного гепарина (пример 8) ЯМР-13С-спектр полученного продукта имеет сигналы при 131, 132 и 136 м.д., характерные дл  бензоильных групп.

Продукт лишен антикоагулирующей активности ин витро.

П р и м е р 11. Получение 0-3-циклопен- тилпропионилированного гепарина (1C 2014).

Ангидрид 3-циклопентилпропионовой кислоты получают после присоединени  кислоты (23 мл, 150 ммоль), в виде раствора в дихлорметане (400 мл), к перемешиваемой и охлаждаемой до -10°С смеси, содержащей тетрабутиламмонийбромид (15 ммоль), 20%-ный раствор гидроксида натри  (60 мл) и дихлорметан (80 мл), и после декантации , промывок 5%-ным бикарбонатом натри  и водой, и концентрировани  в виде масла (96%). Характеристическа  частота в ПК-спектре: 1800, 1745, 1040 трибути- ламмониевую соль гепарина (4 г) и М,М-ди- метиламинопиридин (253 мг) раствор ют в безводном диметилформамиде (40 мд). После охлаждени  до 0°С прикапывают 3-цик- лопентилпропионовый ангидрид (11 г), затем трибутиламин (9,8 мл). После 24 ч реакции при комнатной температуре, а затем охлаждени  до 0°С добавл ют воду (1 мл), и затем, час спуст , насыщенный спиртовой раствор ацетата натри . После промывки абсолютным этанолом, осадок диализируют 5%-ным бикарбонатом натри  в течение 24

часов, затем водой, в течение 3 дней. После лиофилизации получают 0-3-циклопентил- пропионил-содержащий гепарин в форме его соли натри  (2.64 г).

ЯМ Р-13 С-спектр в РзО (метанол 51,6 м.д., внутренний стандарт), показывает характеристические сигналы при 27,4 м.д.; 31,1 м.д.,34,6м.д.,35,9м.д. и41,7м.д, группы 0-циклопентилпропионил.

Соотношение сульфат/карбоксил: 2,2.

Пример 12. Получение 0-ацетилиро- ванного гепарина с небольшой молекул рной массой (средн   мол.масса 4500 дальтрнов, интервал мол.массы 1800-8000 дальтоновХЮ 1945).

Этот гепарин с небольшой молекул рной массой получают путем частичной деполимеризации с помощью азотистой кислоты и спиртового фракционировани  как описано в европейском патенте 181252 и называют ниже как СУ 216.

А) Использование тетрабутиламмоние- вой соли СУ 216.

Натриевую соль СУ 216(1 г) превращают в тетрабутиламмониевую соль путем пропускани  через колонну со смолой Dowex 50, Н+, с последующей нейтрализацией гидро- ксидом тетрабути   аммони .

Таким образом полученную соль (1:7 г) сушат под вакуумом в течение трех часов при 50°С. затем раствор ют в безводном диметилформамиде (10 мл). После охлаждени  до 0°С, добавл ют уксусный ангидрид (1,7 мл) по капл м, затем триэтиламин (2,4 мл) и диметиламинопиридин (102 мг). Спуст  20 ч протекани  реакции, продукт хроматографируют на колонне с Сефадек- сом-ЧЗ-25, элюиру  водой. Получают, после конверсии в натриевую соль и лиофилизации , СУ 216 О-ацетилированный (0,89 г).

ЯМР-ТЗ С-спектр (метанол, 51,6 м.д., как внутренний стандарт) имеет сигнал при 23 м.д., характерный дл  ацетатов.

Сигнал СНз от СНз-CO-NH-при 24,5 м.д. идентичен таковому исходного продукта.

Соотношение сульфат/карбоксил составл ет 2,09 мэкв/r (исходный продукт: 2,05 мзкв/г)..

-ТитрАРТТ: 18п|/мг

- Титр анти-Ха: 205 n/мг (анализ по Jin и др., J.Lab Clin. Meo) 1973. 81, 298-310).

Б) Использование трибутиламмониевой солиСУ216.

Натриевую соль СУ 216 превышают в Трибутиламмониевую соль путем пропускани  через колонну со смолой Dowex 50, Н, затем нейтрализации трибутиламином, как описано дл  гепарина. Трибутиламмониевую соль СУ 216 получают после промывки

эфиром, лиофилизации и высушивани  в сушильном шкафу под вакуумом.

Вышеуказанную соль (4 г) и М,М-димети- ламинопиридин (288 г) раствор ют в диметилформамиде . После охлаждени  до 0°С, прикапывают уксусный ангидрид (4.4 мл) и затем трибутиламин (11.2 мл). После 24 ч при комнатной температуре и при охлаждении до 0°С добавл ют воду (1,7 мл), затем, спуст  1 час, насыщенный спиртовой рас- твор ацетата натри . Осадок промывают этанолом, раствор ют в воде, диализуют в течение 36 часов против 5%-ного бикарбоната , затем против воды в течение 3 дней. Получают после лиофилизации а.цетили- рованный СУ 216 в форме натриевой соли

(1,4 Г).:

С-ЯМР-спектр в Д2 О (метанол при 51,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта) имеет при 23 м.д. сигнал, характерный дл  ацетилированной группы. Соотношение сульфат/карбоксил: 2,07.

П р и м е р 13. Получение Обутирили- рованного гепарина незначительной молекул рной массы (средн   мол.масса 4500 дальтонов, интервал мол.масс 1800- 8000 дальтонов (1C 1957).

Тетрабутиламмониевую соль СУ 216 (4 г), полученную как описано в примере 12, и М,М-диметиламинопиридин (288 мг) рас- тврр ют в безводном диметилформамиде (40 мл): после охлаждени  до 0°С добавл ют масл ный ангидрид (7,68 мл), по капл м, затем добавл ют трибутиламин (11,2 мл). После протекани  реакции в течение 24-х часов при комнатной температуре, затем охлаждени  до 0°С, добавл ют воду (1,7 мл), затем, спуст  час, насыщенный спиртовой раствор ацетата натри . После промывки этанолом, растворени  в апирогенной воде. диализуют против 5%-ного бикарбоната на- три  в течение 36 часов, затем против воды в течение 3-х дней: 0-бутирилированный СУ 216 выдел ют в форме натриевой соли после лиофилизации (2,14 г).

13С-ЯМр-спектр в ДаО (метанол при 51,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта) имеет при 15..6 м.д., 20,5 м;д. и 39.4 м.д. сигналы, характерные дл  6-бутирилиро- ванной группы. Соотношение сульфат/кар- боксил: 2,08.

Пример 14. Получение 0-гексаноили- рованного гепарина незначительной молекул ирной массы (средн   мол. масса 4500 дальтонов, интервал мол.масс. 1800-80рО дапьтонов) (С 1958).

Трибутиламмониевую соль СУ 216 (4 г), полученную как описано в примере 12, и N.N-диметиламинопиридин (288 мг) раствор ют в диметилформамиде (40 мл). Посдв

охлаждени  до 0°С прикапывают капроновый ангидрид (10,8 мл) и трибутиламин .(11.2. мл). После протекани  реакции в течение 24-х часов при комнатной температуре , затем охлаждени  до 0°С, добавл ют воду (1,7 мл), затем спуст  1 ч насыщенный спиртовой раствор ацетата натри , После промывки абсолютным этанолом, растворени  в апирогенной воде, диализуют против 5%-ного бикарбоната натри  в течение 36 часов, затем против воды в течение 3-х Дней, 0-Капроилированный СУ 216 выдел ют в форме натриевой соли после лиофилизации (2,5 г}.

13С-ЯМР-спектр в ДаО (метанол с 51,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта) имеет при 15,9 м.д., 24,2 м.д.. 26,4 м.д:, 33,1 м.д. и 36,4 м.д. сигналы, характерные дл  капроильной группы.

Соотношение сульфат/карбоксил: 2,08.

Прим ер 15. Получение 0-октаноили- рованного гепарина небольшой молекул рной массы (средн   мол.масса 4500 дальтонов, интервал мол.массы 1800-8000 дальтонов) (1C 1959).

Трибутиламмониевую соль СУ 216 (4 г), полученную как описано в примере 12, и М,М-диметиламинопиридин (288 мг) раствор ют .в диметилформамиде (40 мл). После охлаждени  до 0°С прикапывают ангидрид каприловой кислоты (14 мл), затем трибутиламин (1 1,2 мл). После протекани  реакции в течение 24 ч при комнатной температуре и охлаждени  до 0°С добавл ют воду (1,7 мл), затем, спуст  час, насыщенный спиртовой раствор ацетата натри . После промывки абсолютным этанолом, растворени  в апирогенной воде; диализуют 5%-ным бикарбонатом натри  в течение 36 часов, затем водой в течение 3 дн., получают после лиофилизации , 0-октаноилированный СУ 216 в форме натриевой соли (.1,76 г). С-ЯМР- спектр. в ДМСО-de (метанол при 5:1,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта) имеет сигналы при 16,8 м.д,, 25,0 м.д., 27,3 м.д., 30,9 м.Д., 31,4, 34,1 и 36,4 м.д., характерные дл  каприлоильной группы. Соотношение сульфат/карбоксил: 2,07.

Пример 16. Получение 0-деканои- лированного гепарина небольшой молекул рной массы (средн   мол.масс 4500 дальтонов, интервал мол.масс 1800-8000 дальтонов) (1C 1960),

Трибутиламмониевую соль СУ 216 (4 г), полученную как описано в примере 12, и N.N-диметиламинопиридин (288 мг) раствор ют в диметилформамиде (40 мл). После охлаждени  до 0°С, прикапывают ангидрид декановой кислоты (15,3 мл) в виде раствора в безводном диметилформамиде

(10 мл), ззтем трибутиламин (11,2 мл). После протекани  реакции в течение 24 ч при комнатной температуре, и-охлаждени  до 0°С. добавл ют воду (1,7 мл), затем, спуст  час, насыщенный спиртовой раствор ацетата натри .

После промывки абсолютным этанолом и суспендировани  в апирогенной воде, ди- ализуют 5%-ным бикарбонатом натри  в течение 2-х дней, 10%-ным NaCI в течение 2-х дней, затем водой в течение 5 дней. 0-Деканоилированный СУ 216 выдел ют в форме натриевой соли после лиофилизации (2,76 г).

13С-ЯМР-спектр в Д20 (метанол при 51,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта) имеет сигналы при 16,4 м.д., 22,3 м.д., 25,1 м.д., 29,2 м.д., 31,9, 34,4 и 36,5 м.д., характерные дл  деканоильной группы.

Соотношение сульфат/карбоксил: 2,13. П р и м е р 17. Получение 0-ацетилиро- ванного гепарина незначительной молекул рной массы (средн   мол.масс 2500 дальтонов, интервал мол.масс 1500-8000 дальтоновХ С 1946).

Этот гепарин небольшой молекул рной массы получают путем частичной деполимеризации с помощью азотистой кислоты согласно способу, описанному в европейском патенте 37319, и называют далее СУ 222.

Натриевую соль СУ 222 превращают в трибутиламмониевую соль путем пропускани  через колонну со смолой Dowex 50, Н , затем нейтрализации трибутиламином.

Полученную после лиофилизации соль (1,5 г) раствор ют в диметилформамиде (5 мл), затем, после охлаждени  до 0°С, добавл ют по капл м уксусный ангидрид (1,35 мл), затем триэтиламин (2 мл) и диме- тиламинопиридин (85 мг). После протекани  реакции в течение 18ч, добавл ют воду (20 мл), затем смесь диализуют в течение 3 дн против дистиллированной воды. После конверсии в натриевую соль и лиофилиэа- ции получают СУ 222, 0-ацетилированный (0,86 г).

Продукт имеет соотношение сульфат/карбоксил 1,98 мэкв/г (исходный продукт: 1,97 мэкв/г).

ЯМР13 С-спектр (метанол 51,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта) продукта содержит сигнал при 23 м.д., характерный дл  0-ацетила.

Сравнение интенсивностей сигналов N-эцетила (при 24,5 м.д.) между исходным продуктом и полученным продуктом показывает , что ацетилирование селективное.

-Титр АРТТ: 8ni/Hi- Титр анти-Ха: 19.1 и/мг.

Пример 18. Получение фрагмента гепарина, лишенного сродства к антитромбину III (1C 1772).

1)Разрезание гепариновых цепей с по- мощью йодной кислоты:

10 г гепарина, инъекцируемого в mucus de pore, в форме натриевой соли, с титром 157 nl/мг в дозировке Codex и 155 и/мг в дозировке анти-фактора Ха по Jin и др.,

раствор ют в 250 мл деминерализованной воды при 4°С; рН раствора довод т до 5,0 с помощью концентрированной сол ной кислоты . При умеренном перемешивании добавл ют 10 г метапериодата натри  (Na 164,

5 мол.масса: 213,89) в виде раствора в 250 мл диминерализованной воды при 4°С, рН совокупности довод т до 5,0 с помощью концентрированной сол ной кислоты. Раствор выдерживают 24 часа, в темноте, в холод- 0 ном помещении при+4°С. .

2)Элиминирование остаточного перио- дата:

Затем реакционный раствор размещают в три диализных рукава (пористость 3- 5 4.000 Da) и подвергают его диализу в течение 15 ч против проточной деминерализованной воды.

3)Деполимеризаци  в основной среде: К 780 мл полученного после диализа

0 раствора добавл ют 16 мл 10 н. раствора гидроксида натри , и всю совокупность подвергают перемешиванию в течение 3-х часов при комнатной температуре (пор дка ,18-21°С).

5 4) Восстановление:

500 мг Боргидрида натри  NaBH/j, (мол.масса: 37.83) добавл ют после этого и раствор перемешивают снова 4 ч при комнатной температуре. Его рН затем довод т

0 до 4 с помощью концентрированной сол ной кислоты. После перемешивани  в течение 15 мин рН довод т до 7 с помощью концентрированного раствора гидроксида натри .

5 к 820 мл таким образом полученного раствора добавл ют 16,4 г NaCI, затем 1270 мл этанола. Всю совокупность оставл ют сто ть в течение 3 ч, затем центрифугируют при 2500 об/мин, в течение 20 мин. Осадок

0 собирают, суспендируют снова его в 200 мл чистого этанола, размельчают и окончательно рекупирируют фильтрацией на воронке Бюхнер§. После этого высушивают под вакуумом при 40°С в течение 5 ч. Получают

5 таким образом 8,9 г продукта.

5) Спиртовое фракционирование:

Эти 8,9 г раствор ют примерно в 120 мл

деминерализованной воды при комнатной

температуре. Добавл ют 1.78 г NaCI и рН

раствора снижают до 3.5 с помощью сол ной кислоты. Объем раствора довод т до 178 мл с помощью деминерализованной воды . 151 мл чистого этанола добавл ют при перемешивании. Перемешивание продолжают в течение 15 минут после окончани  добавлени , затем всю совокупность оставл ют сто ть в течение 10 ч при комнатной температуре.

Образовавшийс  осадок получают путем центрифугировани  в течение 20 минут при 2500 об/мин. Снова суспендируют в 150 мл чистого этанола, размельчают, рекуперируют путем фильтрации на воронке Бюхнера, промывают 300 мл чистого этанола , и, наконец, высушивают под вакуумом при 40°С в течение 24 ч.

Таким образом, выдел ют в форме порошка белого цвета 5 г продукта 1C 1772, обладающего следующими характеристиками: .

-50з: 3.55 мэкв/г; 1,54 мэкв/г; S + С: 5,09 мэкв/г; S/C: 2,31 мэкв/г.

Он практически лишен N-ацетил-глюко- замина (отсутствие сигнала при 24,5 м.д. на спектр ЯМР-13 С).

Титр Codex: 11 nl/мг.

-Титрр АРТТ: 9 nl/иг

-Титр анти-Ха: 12 и/.мг.

Б) Получение 0-ацетилированного фрагмента гепарина, лишенного сродства к антитромбину III ОС 1924).

Полученный в стадии А) продукт превращают в тетрабутиламмониевую соль путем пропускани  через смолу Dowex 50. Н , затем нейтрализации с помощью гидрокси- да тетрабутиламмони . Из 9,5 г натриевой соли получают 18 г соли тетрабутиламмони .

К раствору 6 г таким образом полученной соли, в диметилформамиде (55 мл), до- бавл ют, после охлаждени  до 0°С, уксусный ангидрид (6,2 мл, 5,6 ммоль), затем триэтиламин (9 мл, 65,6 ммоль) и диметила- минопиридин (403 мг, 3,3 ммоль). Спуст  24 ч добавл ют насыщенный раствор ацетата натри  в этаноле (250 мл). После центрифугировани  и промывки осадко. этанолом, твердое вещество обессоливают на Сефа- декса-С-25, затем подвергают ионообмену путем пропускани  на Dowex 50, Н+, с последующей нейтрализацией гидроксидом натри . После лиофилизации получают продукт 1C 1924(3 г).

Этот продукт имеет следующие характеристики:

-. соотношение сульфат/карбоксил 2,28 мэкв/г

С-ЯМР-спектр (метанол. 51,6 м.д., как внутренний стандарт)  сно показывает, что продукт 0-ацилирован. Сигнал, характерный дл  С2 N-ацетйл-глюкозамина, около 56 м.д., такой же,-как в исходном продукте, отсутствует в спектре,

Пример 19. Получение 0-бутирили- 5 рованного фрагмента гепарина, лишенного сродства к антитромбину III (IC 1925).

6 г соли тетрабутилэммони  1C 1772, полученной как описано в примере 18. бути- ри лиру ют с помощью масл ного ангидрида 0 в услови х, описанных дл  ацетилировани . Получают продукт 1C 1925 (2,96 г), который имеет следующие характеристики:

-соотношение сульфат/карбоксил: 2,31 мэкв/г

5 Спектр 1 С-ЯМР (метанол. 51,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта) содержит

пы при 15,6, 20,4 и 38,4 м.д.

Пример 20. Получение 0-г1й63ййв1ли0 рованного фрагмента гепарина, лишенного сродства к антитромбину III (1C 1926).

6 г соли тетрабутиламмони  1C 1772, полученной как описано в примере 12, обрабатывают ангидридом гексановой кис5 лоты таким же образом, как дл  ацетилировани . Получают продукт 1C 1326 (3 г), который имеет следующие характеристики: - соотношение сульфат/карбоксил: 2,20 мэкв/г

013С-ЯМР-спектр (метанол, 51,6 м.д,, в

качестве внутреннего стандарта) имеет сигналы, характерные дл  СНз и СНа гек- сильной группы при 15,5, 23,9, 26,2, 32,7 и 36,1 м.д.

5ПМР-спектр указывает на наличие примерно одной гексильной группы на дисаха- ридную единицу.

П р и м е р 21. Получение смеси фрагментов , лишенных сродства к антитромбину

0 III. гомогенных с точки зрени  их молекул рной массы и 0-бутирилированных.

Смесь фрагментов, лишенных антикоа- гулирующей активности, описанных в примере 12,. фракционируют на ее различные

5 составл ющие путем гель-фильтрации. Таким образом получают roi-.огенные по молекул рной массе фракции, массы которых составл ют 7700, 6500, 5800, 5300, 4980, 4400, 3900, 3400, 2600, 1860 и 1210.

0 Пример этерификации фракции:

Фракцию с массой 2600 (0,20 г) превращают в соль трибутиламмони , затем лио- филизируют и высушивают (0,34 г). Этот продукт затем раствор ют а ДМФ (2 мл),

5 затем последовательно добавл ют диэтила- минопиридин (18 мг), масл ный ангидрид (0,49 мл) и трибутиламин (0,7 мл), после охлаждени  до 0°С. После выдерживани  24 часа при комнатной температуре, добавл - ют бикарбонат натри  (1 мл 5%-ного раствоpa ), затем через 2 ч, смесь хроматографиру- ют на колонне с Сефадексом С 25 (1 л), элюиру  0,2 М раствором хлорида натри . Продукт лиофилизмруют после обессолива- ни , получа  порошок светло-бежевого цвета (0,24 г).

Другие фракции обрабатывают таким же образом, получа  .соответствующие продукты ,ИК-анализ которых обнаруживает наличие сложноэфирной полосы при 1734 . Степень сульфатации продуктов (отношение сульфата к карбоксилу, не изменена после ацилировани .

Определение степени ацилировани : . Ее определ ют путем хроматографии в газовой фазе, после бутанолиза продуктов бутано-сернокислотной смесью., затем путем экстракции хлороформом сложных бутиловых эфиров и удалени  избыточного метанола промывкой водой.

Пример 22. Получение 0-ацетилиро- еэнного дерматан-сульфата (1C 1947).

К охлажденному до 0°С раствору тетра- бутиламмониевой соли дерматансульфата (0.9Т г), полученной в тех же услови х, что и таковые, описанные дл  получени  тетрабу- тиламмонийгеларината в примере 1, вдиме- тилформзмиде (20 мл), прикапывают уксусный ангидрид (1,35 мл, 14,2 ммоль), затем триэтиламин (1,97 мл, 14,2 ммоль) и диметиламинопиридин (0,7 ммопь). Спуст  24 часа выдерживани  при комнатной температуре , добавл ют воду (40 мл), затем ди- ализуют в течение 72 ч, Натриевую соль получают путем пропускани  через колонну С Dowex 50., Н+, при ОеС, е последующей нейтрализацией гидроксидом натри . Получают , после лиофилизацим. порошок бежевого цвета (0,62 г).

0-Ацеталированный демантан-сульфат имеет следующие характеристики:

-соотношение сульфат/карбоксил: 0,99 мэкв/r (исходный продукт: 1,05 мэкв/г)

-13С-ЯМР-спектр (метанола 51,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта), сигнал при 25,2 м.д. СНзот СНз-COH-NH-(идентичный исходному продукту).

Сигнал при 23,0 м.д. СНз от СНз-СО-0, Пример 23. Получение 0-сукцинили- рованного дерматан-сульфата (1C 2020).

Тетрэбутиламмониевую соль дерматан- сульфата (1 г) и N.N-диметилзминопмрйдин (110 мг) раствор ют в безводном диметил- формамиде. После добавлени   нтарного ангидрида (396 мг) и трибутиламина (0,94 мл), среду инкубируют а безводных услови х в течение 2 ч при 60°С, После охлаждени  и добавлени  воды (2 мл) осуществл ют осаждение в охлажденном льдом спиртовом растворе, насыщенном ацетатом

натри . Осадок промывают этанолом, раствор ют в пирргенной воде, затем диализу- ют против 5%-ного бикарбоната натри  в . течение 36 часов, затем против воды в течение 3 дн. Получают, после лиофилизации, 0-сукцинилированный дермант-сульфат в форме натриевой соли (0,83 мг).

ИК-спектр (KB) имеет при 1730 и 1420 частоты, характерные (волновое

0 число) дл  карбоксильной группы,

1 С-ЯМР-спектр в ДгО (метанол 51,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта) имеет сигналы при 33, 34,5 и Ф83.6 м.д.. характерные дл  СуКЦИНИЛЬ:НОЙ ГруППЫ, И При

5 .25,3 м.д. сигнал, характерный дл  метила ацетамидной группы, идентичный исходному продукту.

, Соотношение сульфат/карбоксил: 0,51. П р и м е р 24. Получение О-бутирили0 рованного гепарина, предварительно N-де- .сульфатированного и 4-aцeтилиpoвaннoгo (ГС 1948).

Гепарин N-десульфатируют, затем N- ацетилируют.

5 Трибутиламмониевую соль (1 г) получают путем пропускани  через смолу Dowex 50, Н, затем нейтрализации с помощью раствора трибутиламина в этаноле,

После лиофилизации и высушивани ,

0 эту соль раствор ют в диметилформамйде (10 мл); затем, после охлаждени  до 0°С, добавл ют масл ный ангидрид (2 мл), трибу- тиламин (2 мл) и диметиламинопиридин (65 мг). Спуст  24 ч добавл ют воду (5 мл),

5 затем смесь диализуют против 5%-ного раствора бикарбоната натри , после чего -против воды. После пропускани  через Dowex 50, Н4 с последующей нейтрализацией гидроксидом натри , получают натриевую соль

0 0-бутирилированного N-ацетилированного гепарина.

Спектр ЯМР-23 С (метанол 51.6 м.д. в качестве внутреннего стандарта) имеет сигнал при 24,6 м. д., характерный дл  М-ацетилз,

5 и.сигналы при 16, 20 и 38 м.д..характерные дл  сложных масл ных эфиров.

Эксперимент может быть повторен с частично N-десульфатированным М-ацетилиро- ванным гепарином и проводить к частично

0 N-десульфатированному N-ацетилированно- му и 0-бутирилированному продукту.

Пример 25. Получение парацетили- рованного дерматан-сульфата (1C 1950). Тетрабутиламмониевую соль дерма5 тан-сульфата (0,8 г), растворенную в диме- тилформамиде (20 мл), ацетилируют воздействием диметиламинопиридмна (76 мг), уксусного ангидрида (1,2 мл) и триэтилами- на (1,7 мл). Смесь нагревают при 80°С в течение 1ч.

После возвращени  к комнатной температуре , добавл ют воду (0,45 мл), затем 0,3 М раствор ацетата натри  в этаноле (100 мл). После центрифугировани , осадок раствор ют в воде, затем диализуют против дис- тиллированной воды. Натриевую соль получают путем обмена на колонке с Dowex 50, Н+, затем путем нейтрализации гидро- ксидом натри . Получают, после лиофилиза- ции, перацетилированный дерматан- сульфат (0,51 г).

Этот продукт имеет соотношение сульфат/карбоксил 1,07 мэкв/г (исходный продукт: 1,05 мэкв/г) и содержит около трех ацетильных групп на дисахаридную едини-

цу.

При м е р 26. Получение О-ацетилиро- ванного гепарин-бензилового сложного эфира (1C 1949).

К раствору тетрабутиламмонийгепари- ната (1 г) в диметилформамиде (10 мл) добавл ют бензилбромид (0,17 мл). Спуст  24 часа выдерживани  при комнатной температуре , добавл ют тетрабутиламмонийаце- тат (220 мг). Спуст  24 ч, осуществл ют ацетилирование образовавшегос  сложного бензилового эфира. Дл  этого, ввод т диметиламинопиридин (57 мг), затем триэтиламин (1,3 мл) и уксусный ангидрид (0,9мл).

После возвращени  к комнатной температуре реакционную смесь перемешивают в течение 24 ч. Тогда добавл ют воду, затем продукт осаждают насыщенным раствором ацетата натри  в этаноле. После диализа против дистиллированной воды, пропускание через Dowex 50, Н. нейтрализации гидроксидом натри  и лиофилизации, получают натриевую соль 0-ацетилирован- ного сложного бензилового эфира гепарина (0,57 г).

Продукт имеет соотношение сульфат/карбоксил 3,6 мэкв/г (исходный продукт , не бензилированный: 2.20 мэкв/г),

С-ЯМР-спектр(метанол,51,6м.д.,вка- честве внутреннего стандарта) имеет сигналы при 23,3 м.д. (0-ацетил) и при 131,6 м.д. (бензил).

Сигнал СНз от СНз-CO-NH при 24,5 м.д. идентичен таковому исходного продукта.

П р и м е р 27. Получение 0-ацетилиро- ванного бемзилового эфира дерматансуль- фэта(1С 1953).

Тетрабутиламмониевую соль дерматан- сульфата (1 г) раствор ют в безводном диметилформамиде (15 мл). К этому раствору, охлажденному до 0°С, добавл ют бензил- бромид (0,25 мл), затем оставл ют сто ть в течение 24 ч при комнатной температуре.

Тетрабутиламмонийацетат(0,32 г) затем добавл ют, после чего, спуст  24 часа при комнатной температуре, осуществл ют аце- тилировэние.

Ввод т уксусный ангидрид (1,5 мл), затем триэтиламин (2,2 мл) и диметиламинопиридин (96 мг). Спуст  24 ч добавл ют воду (0,6 мл), затем продукт осаждают добавлением насыщенного этанольного раствора ацетата натри .

Продукт диализуют против 10%-ного хлорида натри , затем против волы.

Получают, после лиофилизации, сложный бензиловый эфир 0-ацетилированного дерматан-сульфата (0,63 г).

П р и м е р 28. Получение 0-бутирили- рованного дерманат-сульфата (1C 2018).

Трибутиламмониевую соль дерматан- сульфата (2 г), полученную в тех же услови х, что и таковые, описанные дл  получени  трибутиламмонийгепарината в примере 2, и N.N-диметиламинопиридин (220 мг) раствор ют в безводном диметилформамиде (25 мл). После охлаждени  до 0°С прикапывают масл ный ангидрид (5,9 мл), затем три- бутиламин (8,6 мл), После инкубации в течение 24-х часов, и охлаждени  до 0°С добавл ют воду (1 мл); осаждение провод т в спиртовом, охлажденном льдом, растворе , насыщенном ацетатом натри . Осадок промывают этанолом, раствор ют в апирогенной воде и диализуют против 5%- ного бикарбоната натри  в течение 36 часов , затем против воды в течение 3-х дней. Получают, после лиофилизации, 0-бутири- лированный дерматан-сульфат в виде натриевой соли (1,3 г).

3С-ЯМР-спектр в Д20 (метанол при 51,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта) имеет при 15,6; 20,5 и 38,4 м.д. сигналы, характерные дл  бутирильной группы, и при 25,2 м,д. сигнал, характерный дл  метила ацетамидо-группы идентичный исходному продукту.

Соотношение сульфат/карбоксил: 1,05.

Пример 29. Получе. ие 0-гексаноили- рованного дерматан-сульфата (1C 2019).

Трибутиламмониевую соль дерматан- сульфата (2 г) и М,1М-диметиламинопиридин (220 мг) раствор ют в безводном диметилформамиде (25 мл). После охлаждени  до 0°С, прикапывают ангидрид гексановой кислоты (9,4 мл), затем трибутиламин (8,6 мл). После выдерживани  24 ч при комнатной температуре и охлаждени  до 0°С, добавлени  воды (1 мл), осуществл ют осаждение в лед ном спиртовом растворе, насыщенном ацетатом натри . Осадок промывают абсолютным этанолом, раствор ют в апирогенной воде и диализуют против 5%ного бикарбоната натри  в течение 36 часов, затем против воды в течение 3 дн. Получают после лиофилизации 0-гексаноилирован- ный дерматан-сульфат в виде натриевой соли (1 г).

13С-ЯМР-спектр в ДаО (метанола при 51,6 м.д, в качестве внутреннего стандарта) имеет при 15,9, 24,2, 26,5, 33,1 и 36,4 м.д., сигналы, характерные дл  0-гексаноилиро- вэнной группы, а при 25,2 м.д. сигнал, харак- терный дл  метила ацетамйдной группы, идентичный исходному продукту.

Соотношение сульфат/карбоксил: 1,02. . При м е р 30. Осуществление селективного 0-ацетилировани  по способу иэобре- тени  и сравнени  с другими способами ацетилировани .

Способ насто щего изобретени  сравниваетс  со способами патента Франции № 2100735 и европейского патента 256880. В особенности, характеристики сложного уксусного эфира гепарина, полученного по способу изобретени  1C 1938, пример 1, сравниваютс  с таковыми сложного уксусного эфира гепарина, полученного при при- менении условий работы, описанных в патенте Франции 2100735 (продукт А), и сложными уксусными эфирами гепарина, полученными по способам работы примеров 3 и 4 европейского патент 256880 (про- дукты В и С).

(а)Получение продукта А

В раствор тетрабутиламмонийгепари- ната (1 г), растворенного в безводном диме- тилформамиде (10 мл), ввод т дициклогекси- лкарбодиимид(4,2 г), растворенный в диме- тилформамиде (15 мл); затем уксусную кислоту (1,16 мл), растворенную в диметил- формамиде (25 мл) прикапывают в течение 45 мин при+4°С.

После выдерживани  24 часа при комнатной температуре, реакционную смесь фильтруют и концентрируют под вакуумом. Остаток снова суспендируют в эфире. После фильтрации и промывки, осадок диалиэуют против дистиллированной воды. Натриевую соль получают путем пропускани  через колонну со смолой Dowex Н. затем нейтрализации гидроксидом натри . Получают 0,493 г продукта А.

Это приготовление также реализуют в течение 48 ч при +4°С.

(б)Получение продуктов В и С. Продукты В и С получают путем ацети-

лировани  гепарина в смеси формамида с пиридином с помощью ацетилхлорида, использу  2 мл ацетилхлорида дл  продукта В и 40 мл дл  продукта С в услови х, описанных в примерах 3 и 4 европейского патента

256880, Уксусный эфир затем раствор ют в воде и диализуют против хлорида натри .

(в) Результаты

Характеристики продуктов даны в табл.2. .Характеристика исходного гепарина , используемого в каждом опыте, дана в качестве ссылки.

Результаты показывают, что, хот  титры АРТТ и JW ниже дл  всех продуктов, чем таковые исходного гепарина, и это более сильно выражено дл  продуктов А, В и С, только один продукт 1C 1938 сохран ет соотношение сульфат/карбоксил практически идентичным таковому исходного гепарина. Это указывает на то, что способ изобретени  позвол ет селективно ацилировать гид- роксильные функции без затрагивани  функциональных групп гепарина, что подтверждаетс  химическим анализом продуктов .

Продукты t C 1938, А, В и С проанализированы с помощью С-ЯМР (метанола с 51,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта). Спектры этих продуктов, также, как таковой исходного гепарина, даны в следующем виде: ...- ; /

Фиг. 1: исходный гепарин

Фиг. 2: 1C 1938

Фиг. 3: продукт А после реакции в течение 24 ч

Фиг. 4: продукт А после реакции в течение 48 ч

Фиг. 5: продукт В

Фиг. 6: продукт С.

Результаты следующие:

1,Продукт 1C 1938 имеет в спектре углерода (фиг.2): сигнал при 23,4 м.д., соответствующий СНз из СНз СО-0 сигнал при 24,4 м.д., соответствующий СНз из СНз-СО-МН, идентичный сигналу, имеющемус  в исходном гепарина..

Эти сигналы показывают, что аминные и карбоксильные группы не затрагиваютс  и что происходит селективное ацетилирова- ние на уровне гидроксильных групп.

2.Анализ продукта А 13С-ЯМР-спектро- скопией показывает, что полученный в большинстве продукт, также хорошо спуст  14 часа, как и после 48 ч(фиг.З и 4) представл ет собой изомочевинное производное гепарина , карбоксильные функции которого замещены группой:

O-NH-C N-Q

вследствие использовани  дициклогексил- карбодиимида, В самом деле, наблюдают значительные сигналы, соответствующие атомам углерода вышеуказанной группы jnpH 28, 34, 54 и 156 м.д., тогда как сигнал,

соответствующий СНз из СНз-СО-0 при 23 м.д, очень слабый.

Следовательно, способ не позвол ет получать селективное 0-ацилирование карбоксильных функций, что отражает увеличение соотношени  сульфат/карбоксил.

3.Продукт В имеет в углеродном спектре (фиг.З):

-сигнал при 23,1 м.д., соответствующий СНз из СНз-СО-0

-сигнал при 24,8 м.д., соответствующий СНз из СНз-CO-NH, четко более интенсивные чем таковые исходного гепарина и 1C 1938.

Эти сигналы показывают, что наблюдают не только 0-ацетилирование, но и также сильное N-ацетилирование. Используемый способ ацилировани , который не селективный , вызывает частичную П-десульфа- тацию, с последующим ацетилированием аминов, что также вызывает уменьшение соотношени  сульфат/карбоксил, что также вызывает уменьшение соотношени  сульфат/карбоксил .

4.Продукт С имеет в углеродном спектре: .

-сигнал при 22 м.д., соответствующий СНз из СНз-СО-0

-сигнал при 24 м.д., соответствующий СНз из СНз-CO-NH, четко более интенсивные , чем таковые исходного гепарина и 1C 1938.

Как и дл  продукта В, наблюдают сразу О- и N-ацетилирование, N-десульфатаци , более значительна ; чем дл  продукта В, вызывает сильное уменьшение соотношени  сульфат/карбоксил.

Фармакологическа  активность продуктов изобретени 

А) Антикоагулирующа  активность ин витро:

1.Оценка титра ин витро по отношению к gamme-эталону:

Это измерение осуществл ют с помощью теста врем  цефалина, сенсибилизированного каолином (Франци ), на человеческой плазме. Результаты даны в табл.3.

Полученные результаты показывают, что селективно 0-ацилировэнные продукты изобретени  имеют титр ин витро ниже такого гепарина, их антикоагулирующа  ак: тивность уменьшаетс , когда возрастает длина ацилирующей цепи.

2.Измерение антикоагулирующей активности инвитров продуктов изобретени  на человеческой крови:

Опыты осуществл ютс  с двум  дозами продуктов изобретени : 2 мкт/мл и 4 мкг/мл, на 5 мл человеческой крови, Контрольный

опыт также осуществл етс  дл  каждого продукта, замен   испытуемый продукт изотоническим раствором NaCI. После инкубации 30 мин при комнатной температуре, 5 кровь центрифугируют в течение 20 мин при 3000 об/мин. Л пшенную тромбоцитов плазму декан-тиру ют, чтобы реализовать следующие тесты:

- ТСК (врем  Цефалин-Каолина)

0 - Гегттестк

Результаты даны в табл.4. Каждый результаты соответствует среднему из трех опытов.

Результаты показывают в обоих мето5 дахудлинение времени коагул ции дл  продуктов 1C 1940 и 1C 1941. Это удлинение пропорционально дозе.

Взамен, в этих методах ин витро, продукт 1C 1943 показывает только очень не0 значительное воздействие на удлинение времени коагул ции.

3... Измерение антикоагулирующей активности ин витро продуктов изобретени  путем тромбоэластографии на человеческой

5 крови:

Продукты изобретени , при дозах 2 мкг/мл и 4 мкг/мл, испытывают на 5 мл человеческой крови, как описано в предыдущем испытании, причем контроль реализуют

0 дл  каждого продукта, замен   испытуемый продукт на изотонический раствор NaCI.

После инкубации 30 мин при комнатной температуре, тромбоэластографический отпечаток реализуют с помощью тромбоэла5 стогрэфии Helllge на 0,25 мл крови, рекаль- цифированной с помощью 0,1 мл 0,058 М CaCl2. Результаты даны в табл.5.

Результаты показывают, что 1C 1940 и 1C 1941 вызывают увеличение 1с.

0 уменьшение amx и IPT, что соответствует увеличению гипокоагул ции. Эта гипокоагу- л ци  возрастает сразу в зависимости от используемой дозы и длины ацилирующей цепи.

5 1C 1943, в этом тесте, не вызывает заметной модификации параметров.

Б) .Антикоагулирующа  активность ин виво:

0 1) Измерение антикоагулирующей активности ин вивов продуктов изобретени  у кролика (внутривенно):

Опыты осуществл ютс  на самцах новозеландских кроликов. Отбор крови осущест- 5 ел   ют на уровне медиальной артерии уха перед инъекцией продукта.

Затем, в краевую вену уха ввод т путем инъекции раствор испытуемого продукта в количестве 25 мг продукта в 5 мл изотонического раствора NaCI.

Тест ТСК и HEPTEST реализуютс  на рови, отобранной перед инъекцией проукта , и отборах крови, осуществленных пуст  6, 24, 48 и 96 ч после инъекции.

Результаты даны на фиг.7 и 8. Они покаывают чистое удлинение во времени анти- оагулирующей активности, причем это длинение увеличиваетс  с длиной ацили- ующейцепи. В самом деле, антикоагулирующа  активность продукта 1C 1940 еще тчетлива  плюс 6ч после инъекции, тогда как она еще отчетлива  спуст  24 ч после инъекции дл  продукта 1C 1941 и она проонгируетс  вплоть До 96 ч дл  продукта 1C 1943.

2.Измерение а нти коагулирующей акивности ин виво продуктов изобретени  путем тромбоэластографии:

Испытуемые продукты ввод т путем инъекции внутривенно как описано в предыдущем опыте (25 мг в 5 мл изотонического раствора NaCI). Тромбоэластографический отпечаток реализуют с помощью тромбоэла- стографа Helllge на 0,25 мл образцов крови, отобранных перед инъекцией, и спуст  6,24, 48 и 96 ч после инъекции, причем дополнительные отборы осуществл ютс , когда ан- тикоагулирующа  активность длитс  сверх 96 ч. Результаты даны в табл. 6,7 и 8.

Полученные результаты показывают, что дл  всех продуктов отмечаетс  сильное увеличение г + k и уменьшение IPT на б-ом часу, что указывает на удлинение гипо- коагул емости, Она пролонгируетс  вплоть до по крайней мере 24 ч после инъекции дл  продукта 1C 1941 и еще измерима 96 ч спуст  после инъекции дл  продукта 1C 1943.

Следовательно, констатируют, что все продукты имеют сильную антикоагулирую- щую активность ин виво, что эта активность пролонгирована во времени и что 1C 1943, который только мало или вообще неактивен в опытах ин витро, оказываетс  очень активным и сильно пролонгирован в опытах ин виво.

3.Антикоагулирующа  активность продуктов 1C 1945, 1C 1957 и 1C 1958. полученных соответственно примерам 12, 13 и 14, испытываетс  йн виво у кролика.

Результаты показывают удлинение фар- макокинетики при введении продуктов внутривенно и подкожно, в отношении продуктов 1C 1957 и 1C 1958.

В) Активность на модели ин витро инги- бировани  вирусов HIV-1 и-2:

Продукты, полученные согласно изобретению , испытываютс  на модели инги- бировани  вирусов HIV-1 и HIV-2 ин витро.

Все испытуемые продукты станов тс  активными при дозах, полностью лишенных

цитотоксичности. В особенности, констатируют , что продукты 1C 1925 и 1C 1926 более активны, чем исходный продукт.

Г) Активность на модели ин витро инги- бировани  образовани  Syncltla

Syncltla представл ет собой гигантские клетки, с многими  драми, образуемые путем сли ни  здоровых лимфоцитов Т 4 и инфицированными лимфоцитами Т4. 0 Продукты, полученные согласно изобретению , испытываютс  на модели ко- культуры клетки MOLT 4 (здоровые лимфоциты Т4) и клеток HUT-78/HT V III В (-инфицированные лимфоциты Т 4 челове- 5 ческой линии).

Все испытуемые продукты оказываютс  активными в этой модели, при дозах, полностью лишенных цитотоксичности. В частности , продукты 1C 1924, 1C 1925 и 1C 1926 0 найдены более активными, чем исходный продукт.

Д) Активность в модели ин витро инги- бировани  различных покровных вирусов

Активность продуктов, полученных со5 гласно изобретению, по отношению к ингибированию различных покровных вирусов с

ADN или ARN, в особенности следующих

вирусов:

-HSY 1 и 2 (Herpes Simp Lex virus 1 и 2, 0 вирус к ADN)

-YSY (Vaslcular Stomatitis Virus) вирус с ARN .

...- Slndbis -вирус

Все испытуемые продукты оказались ак- 5 тивными при ингибировании этих вирусов, при дозах, лишенных цитотоксичности. В особенности, продукты 1C 1924,1C 1925 и 1C 1926 обладают сильно увеличенной активностью по отношению к YSY и Slndbis виру- 0 су, вирус с ARN по сравнению с исходным продуктом.

Е) Активность в модели ин виво ингиби- ровани  пролиферации гладких мышечных клеток,

5 Продукты, полученные согласно изобретению , испытываютс  на модели инги- бировани  пролиферации гладких мышечных клеток ин виво у крысы (модель катетер- ного баллона).

0 Испытуемые продукты оказались активными . В особенности, продукты 1C 1924, 1C 1925 и 1C 1926 обладают возросшей активностью по сравнению с исходным продуктом . 5

Claims (4)

1. Формула изобретени  1. Способ получени  0-ацилированных глюкозаминогликанов, включающий обработку глюкозаминогликанов ацилирующи- ми агентами в присутствии акцептора

   кислоты, в среде пол рного органического растворител  с последующей очисткой целевых продуктов, отличаю щи и с   тем, что, с целью обеспечени  селективности О-ацилировани  и получени  продуктов с воспроизводимыми биологическими свойствами , глюкозаминогликаны используют в виде три- или тетрабутиламмониевых солей, в качестве ацилирующих агентов примен ют ангидриды карбоновых кислот и обработку осуществл ют при комнатной температуре.
2. 2. Способ по п.1, отличающийс  тем, что в качестве акцептора кислоты ис

   пользуют одно или несколько соединений выбранных из группы, включающей пиридин , диметиламинопиридин, триэти амин и трибутиламин,
3. 3.Способ по п. 1,отличающийс  тем, что после ацилиррвани  продукты осаждают с помощью раствора ацетата натри  в этаноле, осадок раствор ют в воде, полученный раствор диализируют против воды.е
4. 4.Способ по п.З, отличающийс  тем, что диализ осуществл ют в присутствии слабого основани .

   Титры АРТТ и Лп и Wessler измерены ин витро.

   Т а б л и ц а 1

   Т а б л и ц а 2

   1C 1940: 0-бутилированный гепарин, полученный как описано в примере 5. 1C 1941: 0-гексанрилированныЙ гепарин, полученный как описано в примере 6. 1C 1943: О-деканоилированный гепарин, полученный как описано в примере 8.

   г: врем  реакции; врем  коагул ции, соответствующее амплитуде отпечатка 20 мм. атх: максимальна  амплитуда. IPT: показатель тромбодинэмического потенциала.

   Таблица 3

   Т а б л и ц а 4

   Таблица 5

   Испытуемый продукт 1C 1940

   Испытуемый продукт 1C 1941

   Испытуемый продукт 1C 1943

   Таблица 6

   Т а б л и ц а 7

   Таблица 8

    

   tAM «Ои

   1Ц|. Н|||| |11|||Ц|Ц||111111|||1111Ч11|Ч111И1Ь1 1|||11111|11||1111111Г||||.111И|1111|1|11||1|И|11|| И ЦЙ1|1 Ч|ii|miiiiii Jl l liil|tilil illvVJ| 1 1

   180.0 160.0, ШО 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 МО 0.0

   Фиг.1

   т.о то та ко.о 100.0 то

   ®иг.2.

   то 12й.о юо.о BOM бо.о 4о.о то ао

   фцг.З

   .ышМ

   I

   .iVt/Vvtr d

   40.0 го.о о.о

   д-гЛф 0у о г 0ff# оаэ 009 о oot оог вам о & ош.

   .....,..1.|И..|..ЧiJ......II....lllll.ll4l.lllll.mllllll4l.l.irilllllllll.llll.lll.M.I,.nil.III..IlLuiH.lll.II,,II,,I,UU.M,S Wd

   ffЈругqw -Q ffff-.ffffff owt оог ош 0т от

   VWwVytv,

   ,№&.,.

   ov оог oto 009 и off ош оог ami а ош 0ш

   „I,..,..„....„L,,.....,.........ti,.,,.|Iniimirimiiiiil IIni .....HIbin.null1.1.и.-Мнит..i

   .

   r

   ,№&.,.

   ош

   .

   Фиг.7

   24 48 7296 f$8f9Z