DK173818B1 - Heparinderivat - Google Patents

Description

1 DK 173818 B1

HEPARINDERIVAT

Opfindelsen angår nye heparinderivater med antitrombotisk aktivitet, og som tillige har reduceret blødnings- og antikoaguleringsvirkning, hvilke heparinderivater er 5 frembragt ved behandling af hepariner af forskellig oprindelse i et basisk miljø, i tilstedeværelse af alkalimetalsalte og eventuelt et reducerende reagens.

Det er kendt, at heparinlignende strukturer kan modificeres på forskellig måde ved at behandle dem i et basisk medium.

10 I det europæiske offentliggørelsesskrift EP 0 133 078 depolymeriserer J. S. Mar-diguian heparinet i oligosaccaridfraktioner, der indeholder fra 4 til 20 sacchariden-heder, ved behandling af heparinets benzylester med en organisk eller uorganisk base ved en koncentration på mellem 0,1 og 0,6 molar og en temperatur på mel-15 lem 20°C og 80°C. En sådan depolymerisation er ledsaget af dannelse af en dobbeltbinding i uronsyrens positioner 4 og 5, der kan detekteres ved UV-absorption ved 230 nm.

S. Hirano et al., Conn. Tissue Res., 3, 73-79, 1975, depolymeriserer heparinet og 20 andre glycosaminoglycaner i et stærkt basisk medium ved anvendelse af koncentrationer på fra 2 til 10 molar af natrium- eller bariumhydroxid ved temperaturer over 80°C. På denne måde opnås en stærk depolymerisering, der følger kløvningen af glucosidbindingen mellem giucosaminenhedemes position 1 og position 4 i de nabostillede uronenheder. Endvidere ledsages en sådan depolymerisering af 25 dannelse af en dobbeltbinding i uronsyren i positionerne 4 og 5, hvilken dobbeltbinding kan detekteres ved hjælp af en absorption ved 225 - 230 nm i UV-spektret.

P. Sampson og K. Meyer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 68, 2329 - 2331, 1971, 30 frembragte en strukturel modifikation i glucosaminenheden med dannelse af 3,6-anhydroglucosamin ved behandling af heparin med 1 N natriumhydroxid i tiiste- 2 DK 173818 B1 deværelse af natriumborhydrid ved 80°C i 7 timer.

Opfindelsens heparinderivater adskiller sig totalt fra de i den kendte teknologi beskrevne. De har ikke de fysisk- kemiske egenskaber, som er fundet for de stoffer, 5 der fremstilles af J. S. Mardiguian eller af S. Hirano et al., som det ses af den gen nemsnitlige molekylvægt, der forbliver i hovedsagen uændret, således at depoly-merisering er påvist ikke at forekomme, ved mangel på absorption ved 225 - 230 nm i UV-båndet og af spidser, der svarer til resonans i dobbeltbindingen i 13C-NMR indeksene, og ved mangel af dobbeltbindinger i positionerne 4 og 5 i uronsy-10 ren. De udviser end ikke de fysisk-kemiske egenskaber for de stoffer, som er iso leret af P. Sampson og K. Meyer, idet 13C- NMR-spektret for de stoffer, som frembringes ifølge opfindelsen, har uændret beliggenhed og intensitet for signalet fra kulstofatomet i position 6 i glucosaminen og viser uændret intensitetsforhold mellem det 6-sulfaterede kulstofatom og det 6-desulfaterede kulstofatom, der skulle 15 ændres i tilfælde af dannelse af 3,6-anhydroglucosamin, som følge af det 6-sulfa-terede kulstofatoms deltagelse i dannelse af anhydroderivatet.

Opfindelsen angår nye heparinderivater, der kan anvendes til behandling af trom-botiske sygdomme og fremstilles ved hjælp af en kemisk modifikation, der udføres 20 i et basisk, vandigt medium, i tilstedeværelse af salte og eventuelt et reducerende reagens, idet modifikationen udføres på hepariner med forskellig oprindelse såsom handelsvarer eller rensede ved hjælp af egnede behandlinger eller depolyme-riserede.

25 De nye stoffer med en modificeret heparinstruktur har særlige fysisk-kemiske egenskaber såsom speciel drejningsstyrke og 13C-NMR-spidser, der er forskellige fra udgangsstoffernes, og endvidere en afvigende biologisk aktivitet, eftersom de udviser en bedre specialvirkning, idet de beholder praktisk uændrede antitrombo-tiske egenskaber, medens blødningseffektens og antikoaguleringsvirkningens 30 styrker er nedsatte. Især er de ejendommelige ved, at de viser to nye signaler i 13C-NMR-spektret ved omkring 53 og 54 ppm og en forøgelse af den specifikke 3 DK 173818 B1 drejningsstyrke i forhold til udgangsheparinerne med værdier mellem omkring +50° og omkring +90° i vandig opløsning.

Den kemiske modifikation af heparinstrukturen frembringes i et vandigt medium 5 ved pH-værdier, der er større end neutralitet i tilstedeværelse af en base, fordelagtigt af et alkalimetal- eller et jordalkalimetalhydroxid, eventuelt i tilstedeværelse af et aikalimetal- eller et jordalkalimetalsalt og et reducerende reagens, fordelagtigt natriumborhydrid.

10 Reaktionen gennemføres i løbet af en tidsperiode på mellem 0,5 og 24 timer ved en temperatur på mellem omkring 35°C og omkring 70°C i basekoncentrationer på mellem omkring 0,01 N og omkring 1 N og saltkoncentrationer på mellem 0 og omkring 1 N, eventuelt i tilstedeværelse af et reducerende reagens som for eksempel natriumborhydrid.

15

Alkalimetal- og jordalkalimetalbaser og -salte anvendes fordelagtigt, i hovedsagen de der er baseret på natrium, kalium, calcium, magnesium og barium.

De baser, der fordelagtigt kan anvendes, er natriums, kaliums og bariums hydro-20 xider.

De salte, der med fordel kan anvendes, er acetaterne og chlorideme af natrium, kalium, barium, calcium og magnesium samt sulfaterne af natrium, kalium og magnesium.

25

Fremgangsmåden til modifikation af heparinstrukturen er ejendommelig ved , at det udviser signaler ved 53 ppm og 54 ppm ved 13C-NMR-spektroskopi udført i D20 med natrium-3-trimethylsilylpropansulfonat som intern reference, en specifik drejningsværdi [<x]20d mellem +50° og +90° i 1% vandig opløsning, et svovlind-r 30 hold mellem 8% og 11% og et sulfat/carbonyl forhold mellem 1,50 og 2,20 begge dele ved potentiometrisk bestemmelse, samt at det kan fremstilles ved, at man 4 DK 173818 B1 behandler en vandig opløsning af heparin med en base af et alkalimetal eller et jordalkalimetal med en koncentration på mellem 0,01 N og 1 Ni tilstedeværelse af et alkalimetal- eller jordalkalimetalsalt eventuelt i yderligere tilstedeværelse af en katalytisk mængde af et reducerende reagens i 0,5 til 24 timer ved en tempe-5 ratur mellem 35°C og 70°C og om nødvendigt efterfølgende renser reaktionsblandingen gennem en ionbytter eller ved dialyse og udskiller det ønskede derivat ved tilsætning af mellem 2 og 4 volumenmængder alkohol med fra 1 til 3 kulstofatomer ved en pH-værdi omkring 7.

10 Ved reaktionens afslutning afkøles opløsningen, bringes til neutralt pH og renses eventuelt, for eksempel ved hjælp af en jonbytter eller ved dialyse, og til sidst udskilles det modificerede heparinderivat ved tilsætning af fra omkring 2 til omkring 4 rumfang, fordelagtigt 2,5 rumfang alkohol med fra 1 til 3 kulstofatomer, såsom for eksempel ethylalkohol.

15

De modificerede hepariner, der frembringes med denne fremgangsmåde, har nogle særlige fysisk-kemiske egenskaber, der er helt forskellige fra de, der frembringes ved hjælp af behandlinger med alkali ifølge tidligere kendt teknik.

20 Dette skyldes reaktionsbetingelserne, der benyttes, hvor parametrenes størrelser er tydeligt forskellige fra de tidligere anvendte, især med hensyn til basekoncentration, temperatur og den eventuelle tilstedeværelse af et salt.

De nye heparinderivaters strukturelle ændringer er principielt eftervist ved belig- 25 genheden og den relative intensitet af resonanserne i 13C-NMR-spektret, ved de elektrophoretiske egenskaber, ved forøgelsen af størrelsen af den specifikke drejestyrke og ved reduktionen i svovlindholdet og forholdet sulfater/carbonyler, medens carbonylindholdet er uændret.

30 De mere karakteristiske ændringer i de nye hepariners struktur kan kontrolleres ved studiet af de gennemgribende ændringer i 13C-NMR-spektret. Disse variationer 5 DK 173818 B1 har oprindelse i særlige zoner i spektret og omfatter såvel fremkomsten af nye spidser og modifikation af andre spidser. Af bemærkelsesværdig betydning er fremkomsten af to nye signaler ved omkring 53 og omkring 54 ppm og skiftene for de spidser, som svarer til iduron- og glucosaminenhedemes kulstofatom 1 i zonen 5 mellem 92 ppm og 102 ppm. Den sammenlignende afkontroilering af 13C-NMR-spektrene for de nye stoffer og for udgangsstofferne gør det muligt at konstatere, at nogle zoner i spektret er uændrede, og at nogfe dele af heparinstrukturen følgelig overhovedet ikke er modificeret. Især er de signaler, der stammer fra den sulfate-rede eller desulfaterede glucosaminenheds position 6, ikke blevet modificerede.

10 Helt uændrede er endvidere de spidser, der stammer fra glucosaminenhedemes position 2, suifaterede eller acetylerede, fra iduronsyrenehedemes carboxygrupper og fra glucuronsyreenhederne, der i heparinet udgør gennemsnitligt 20% af uoron-syreresten.

15 De nye heparinderivaters fysisk-kemiske egenskaber fremstår mere modificerede jo mere drastiske er reaktionsvilkårerne, således som det kan ses af de ikke begrænsende eksempler, der er beskrevet. Derfor muliggør modulation af reaktions-parametrene frembringelse af stoffer, der i deres struktur er mere eller mindre dybt modificeret.

20

Størrelsen af den kemiske modifikation kan beregnes ved at beregne forholdet mellem summen af integralerne for spidserne ved omkring 53 og omkring 54 ppm og summen af integralerne af spidserne for kulstofatomet i position 6 i glucosami-nenheden ved omkring 62,5 og omkring 69 ppm, idet disse sidstnævnte er valgte 25 som arbitrære referencer, fordi deres intensitet forbliver stabil, og fordi de ligger i en spekterzone, som ikke indeholder andre spidser. Parallelt med forøgelsen af resonansen omkring 53 og omkring 54 ppm forekommer der en forøgelse af drejningsstyrken omkring 589 nm (natriums D-linie), og derfor kan måling af den specifikke drejningsstyrke anvendes direkte til bedømmelse af graden af kemisk mo- 30 difikation, som er foregået i heparinstrukturen. Da der ikke anvendes optisk aktive reagenser i reaktionsmediet, kan måling af rotationsstyrken anvendes direkte til 6 DK 173818 B1 kontrol af reaktionens forløb.

Både forholdet for integralerne af spidserne af 13C-NMR- spektret og forøgelsen i den specifikke drejningsstyrke i forhold til udgangsstoffet er anført i nedenstående 5 tabel 1.

TABEL 1

Arealer af spidser Forskel mellem den ved 53 og 54 ppm specifikke drejningsstyrke 10 Eksempel for den modificerede og

Arealer af spidser for udgangsheparineme ved 62,5 og 69 ppm (cOd20 5 0,15 + 5° 15 6 0,25 + 7° 7 0,30 + 7° 4 0,45 +10° 1 0,55 +18° 2 0,75 + 22° 20 3 1,20 +29°

Disse modificerede hepariner er endvidere ejendommelige ved, at de udviser elektroforesekarakteristika forskellige fra udgangsstofferne karakteriseret ved en større mobilitet i 0,1 M bariumacetatbuffer ved pH 5,8 (P. Oreste, G. Torri, J.

25 Chrom. 195, 398, 1980), og ved at de har et svovlindhold på mellem omkring 8% og omkring 11%, et sulfat/carbonylforhold på mellem omkring 1,50 og omkring 2,20 og en specifik drejningsstyrke (a)D20 mellem omkring + 50° og omkring + 90° således som det fremgår af nedenstående tabel 2, hvor værdierne for de tilsvarende udgangsstoffer er vist i parentes.

30 7 DK 173818 B1 TABEL 2

Eksempel % sulfater sulfat/carbonyl (a)D20 forhold 5 5 10,31 (11,40) 2,17 (2,27) + 50° (+ 45°) 6 10,69(11,60) 2,15(2,32) +54° (+47°) 7 9,70(11,00) 1,90(2,00) +51° (+44°) 4 9,65(10,65) 2,03(2,20) +57° (+47°) 10 1 8,95(10,56) 1,94(2,20) +65° (+47°) 2 8,42(10,09) 1,64(2,13) +65° (+43°) 3 8,12(10,09) 1,56(2,13) +72° (+43°)

De nye heparinderivater ifølge opfindelsen har udpræget antitrombisk virkning i 15 kombination med lavere antikoaguleringseffekt i sammenligning med udgangshe-parineme. Deres biologiske virkning blev vurderet ved mange typiske prøver for hepariner; især prøverne for APTT anti-Xa-faktoren, blødningstiden og beskyttelsen mod forsøgstromboser blev gennemført. APTT-aktiviteten blev bestemt ifølge M. J. Larrieu og G. Wielands fremgangsmåde, Rev. Hematol., 12, 199, 1957, 20 medens anti-Xa-aktiviteten blev bestemt ifølge E. T. Yin og S. Wesslers fremgangsmåde, Biochem. Biophys. Acta, 201,387,1970.

Alle undersøgte stoffer blev opløst i plasma fra fastende rotter, derefter blev der fremstillet proportionale fortyndinger til at opnå de koncentrationer, der foreskrives 25 til fremgangsmåden. Der blev udført ti bestemmelser for begge aktiviteter for hvert stof, og den mængde, der medfører en meget tydelig ændring i den pågældende prøve, blev beregnet i mcg/ml. Specielt blev hvert stofs aktivitet udtrykt som koncentrationen i mcg/ml, der henholdsvis fordobler APTT-tiden og forøger anti-Xa-værdien med 30%. De værdier, der blev fundet i de to prøver (se tabel 3), be-30 kræfter, at de nye stoffer udviser formindsket antikoaguleringsstyrke.

8 DK 173818 B1

Blødningstiden blev bestemt for rotter ifølge den af E. Dejana et al. beskrevne fremgangsmåde, Thromb. Haemost., 48, 108, 1982, og resultaterne blev udtrykt ved beregning af den procentvise tidsforlængelse for blødning i rotter, der var behandlet med de nye hepariner i sammenligning med blødningstidsforlængelsen i 5 rotter, der var behandlet med de tilsvarende udgangshepariner, og hvis blødnings tid blev sat til 100%. Alle de nye derivater med modificeret heparinstruktur ifølge opfindelsen udviste en formindsket, ofte en markant formindskelse, af blødningstiden i sammenligning med de tilsvarende udgangshepariner.

10 Størrelsen af den antitrombotiske aktivitet blev bestemt ved prøven for stillestående venøs blodprop (stase venøs trombose), der er beskrevet af S. Reyers et al.,

Tromb. Res., 18, 669-74, 1980. Den beskyttende virkning fremkaldt af de nye stoffer blev beregnet i procent, idet den antitrombotiske virkning af de tilsvarende udgangshepariner blev sat til 100.

15

De opnåede resultater viste en betydelig lighed mellem de to serier af hepariner med hensyn til denne prøve på antitrombotisk aktivitet.

Værdierne fra de ovenfor beskrevne biologiske prøver er opsummerede i neden-20 stående tabel 3, hvor anti-Xa- og APTT- værdierne for de tilsvarende hepariner er anførte i parentes.

25 30 g DK 173818 B1 TABEL 3

Anti-Xa Blødnings aktivitet APTT-aktivitet tid Antitrombotisk 5 Ek- Stofmængde Stofmængde % forlængelse- beskyttelse % sempel der forøger der fordobler sammenlignet sammenlignet anti-Xa-værdi APTT-tiden med udg.- med udgangs- 30 % (mcg/ml) heparinet heparinet 10 1 30,2(20,6) 4,2 (1,7) 22 100 2 33,7(18,6) 8,9 (1,9) 83 117 3 43,5(18,6) 16,3 (1,9) 11 53 4 18,1 (20,6) 4,8 (1,7) 60 75 5 21,0(16,5) 11,5(10,8) 9 113 15 6 44,0(40,6) 8,8 (8,5) 30 113 7 19,6 (18,2) 2,6 (2,0) 30 88 I betragtning af de ovenfor anførte pharmakologiske egenskaber er disse nye he-parinderivater anvendelige til behandling af trombosesygdomme. Den foretrukne 20 indgivningsmåde er parenteral og subcutan indgivning i form af sterile, vandige opløsninger, der eventuelt også kan indeholde nogle salte for at gøre opløsningen isotonisk samt preserveringsreagenser.

Doseringsområdet afhænger af de anvendte pharmaceutiske blandinger og af pa-25 tientens tilstand. På foretrukken måde indgives en mængde heparinderivat ifølge opfindelsen, der er ækvivalent med mellem 500 og 20000 enheder anti-Xa-faktor (U.A.Xa) en eller flere gange daglig.

Som udgangsmaterialer kan der anvendes heparinmaterialer af forskellig oprind-30 else. For eksempel er heparin i handelskvalitet og hepariner, der er rensede ved behandling af handelsvarer samt hepariner med lav molekylvægt, der er opnået 10 DK 173818 B1 ved depolymerisation ifølge kendt teknologi, blevet anvendt for at frembringe de modificerede hepariner ifølge opfindelsen. Nedenfor beskrives prepareringen af udgangsheparinmaterialeme, der anvendes ifølge opfindelsen.

5 Natriumheparin ALFA 87-78 25 g natriumheparin af handelskvalitet opløses i 2000 ml vand og hældes i løbet af omkring 30 minutter i en opløsning, der indeholder 111,2 g calciumacetatmono-hydrat i 2000 ml vand, 57 ml eddikesyre og 600 ml ethylalkohol, medens tempe-10 raturen holdes ved omkring 8 - 10’C. Den fremkomne suspension filtreres efter 15 timer ved 5°C, og filtratet tilsættes 1000 ml ethylalkohol, og efter 3 timer ved 5°C frafiltreres det opståede bundfald. Bundfaldet opløses så i 200 ml vand, opløsningen bringes så til pH 7,0 ved hjælp af 1 N natriumhydroxid, og så behandles den med 100 ml af jonbyttermaterialet Dowex 50W X8 på natriumform og med 70 ml 15 vand i 20 minutter. Opløsning og jonbytter overføres til chromatograferingssøjle (0 * 1,6 cm, h = 10 cm) indeholdende 80 ml af samme jonbyttermateriale. Efter at opløsningen er percoleret og elueret med destilleret vand til et samlet opløsnings-rumfang på 400 ml tilsættes der til opløsningen 12 g natriumacetattrihydrat og 1000 ml ethylalkohol. Bundfaldet filtreres og tørres under vakuum under indvinding 20 af 19,2 g renset natriumheparin med betegnelsen ALFA 87-78, der har nedenfor anførte fysisk- kemiske egenskaber: S = 10,09%, sulfat/carbonylforholdet = 2,13, (a)D20 = + 43° (C = 1% i H20) 13C-NMR-spektrum (ppm): 177,3; 104,7; 102,0; 99,4; 80,0; 78,6; 72,3; 71,9; 69,0; 25 62,5; 60,6.

Natriumheparin ALFA 87-81

Dette stof blev syntetiseret med samme fremgangsmåde som anvendt til raffine-30 ringen af ALFA 87-78, idet man gik ud fra 50 g af samme heparin af handelskva litet.

1 DK 173818 B1 36,5 g raffineret heparin blev indvundet med nedennævnte fysiske egenskaber: S = 10,56%, sulfat/carbonylforholdet = 2,20, (ajo20 = + 47° (C = 1 % i H2O) 13C-NMR-spektrum (ppm): 177,3; 104,7; 102,0; 99,5; 80,1; 78,6; 72,4; 72,0; 69,1; 5 62,7; 60,7.

Natriumheparin. handelsvare

Stoffet har nedenstående fysisk-kemiske egenskaber: 10 S = 11,0%, sulfat/carbonylforholdet = 2.

(a)D20 = + 44° (C = 1 % i H20) 13C-NMR-spektrum (ppm): 177,4; 104,6; 101,9; 99,8; 79,9; 78,6; 72,2; 71,8; 69,0; 62,6; 60,6.

15 Natriumheparin med lav molekylvægt LMW ALFA 86-02

Natriumheparin med lav molekylvægt LMW ALFA 86-02 blev fremstillet ved de-polymerisering med hydrogenperoxid i tilstedeværelse af cuprijoner ifølge den i det internationale offentliggørelsesskrift WO 86/06729 beskrevne fremgangsmåde.

20 Dette stof har følgende fysisk-kemiske egenskaber: gennemsnitlig molekylvægt: 4200 dalton, S = 11,40%, sulfat/carbonylforholdet = 2,27.

(0)020 “ + 45° (C = 1% i H20) 13C-NMR-spektrum (ppm): 177,4; 104,6; 101,9; 99,8; 79,9; 78,6; 72,6; 72,2; 71,9; 25 69,1; 62,7; 60,7.

Natriumheparin med lav molekylvægt LMW ALFA 87-198

Natriumheparin med lav molekylvægt LMW ALFA 87-198 blev fremstillet ved de-30 polymerisering ifølge den fremgangsmåde, der blev anvendt til LMW 86-02.

12 DK 173818 B1

Det har følgende fysisk-kemiske egenskaber: S = 11,60%, sulfat/carbonylforholdet = 2,32.

(a)o20 = + 47° (C = 1% i H20) 13C-NMR-spektrum (ppm): 177,7; 104,8; 102,0; 99,6; 80,2; 78,6; 72,4; 71,9; 69,2; 5 62,7; 60,6.

Bestemmelsen af den specifikke drejningsværdis (a)D20 størrelse blev foretaget i et vandigt medium ved en koncentration på 1 %.

10 Bestemmelsen af sulfat/carbonylforholdet blev udført ved potentiometrisk fremgangsmåde.

Bestemmelsen af sulfatprocenten blev udført såvel ved potentiometrisk fremgangsmåde som med Schoenigermåden.

15 13C-NMR-spektret blev bestemt ved 75,47 MHz med et Varian CFT-75 spectrometer med anvendelse af D20 som opløsningsmiddel og natrium-3-trimethylsi-lylpropansulfonat som Intern standard.

Efterfølgende eksempler skal betragtes som illustration af opfindelsen.

20

Eksempel 1 1,8 g heparin ALFA 87-78 tilsættes til 45 ml vandig opløsning indeholdende 0,4 g natriumhydroxid (0,225 N), 2,3 g natriumacetat (0,625 N) og 10 mg natriumbor-25 hydrid. Den fremkomne opløsning holdes konstant ved 60 °C i 3,5 time, hvorefter den afkøles til stuetemperatur, bringes til neutralitet med iseddike og tilføres 2,5 volumenmængder ethanol. Precipitatet filtreres, vaskes på filteret med 6:1 etha-nol/vand-blanding og tørres. Der indvindes 1,7 g produkt med et 13C-NMR-spek-trum, som viser karakteristiske signaler ved følgende δ (udtrykt som ppm): 177,3; 30 104,3; 101,9; 99,4; 98,4; 97,2; 96,8; 79,7; 79,1; 78,5; 72,1; 71,8; 71,2; 68,8; 62,4; 60,6; 60,3; 54,1; 53,1.

13 DK 173818 B1

Eksempel 2 1.8 g heparin ALFA 87-78 tilsættes til 45 ml vandig opløsning indeholdende 0,4 g (0,225) N) natriumhydroxid), 2,3 g natriumacetat (0,625 N) og 10 mg natriumbor- 5 hydrid. Opløsningen holdes konstant ved 60°C i 15 timer og bringes efter afkøling til neutralitet med eddikesyre, hvorefter den perkuleres gennem en søjle (0 = 1,2 cm, h = 8 cm) indeholdende anjonisk jonbyttermateriale type Dowex 1 x 2 på chloridform. Perkulatet og udvaskningen opsamles samlet og tilsættes 2,5 volumenmængder ethanol. Precipitatet filtreres, vaskes på filteret med en 6:1 etha-10 nol/vand-blanding og tørres. Der indvindes 1,65 g produkt med et 13C-NMR- spek trum, som udviser karakteristiske signaler ved følgende δ (udtrykt som ppm): 177,4; 104,6; 101,8; 98,6; 97,2; 96,8; 79,6; 79,1; 78,9; 72,2; 71,5; 71,2; 68,8; 62,5; 60,3; 54,1; 53,1.

15 Eksempel 3 1.8 g heparin ALFA 87-78 tilsættes til 120 ml vandig opløsning indeholdende 4,8 g (1 N) natriumhydroxid. Opløsningen holdes konstant ved 60°C i 3,5 timer, bringes til neutralitet med eddikesyre og dialyseres en nat med rindende vand og i 6 timer 20 med destilleret vand. Opløsningen tilsættes derefter 3,5 g natriumacetat, bringes til neutralitet med eddikesyre og tilføres 2,5 volumenmængder ethanol. Precipitatet filtreres, vaskes med en 6:1 ethanol/vand-blanding og tørres. Der indvindes 1,7 g produkt med et 13C-NMR-spektrum, der har karakteristiske spidser ved følgende δ (udtrykt som ppm): 177,4; 104,6; 101,7; 98,6; 98,4; 97,2; 96,8; 79,7; 79,1; 78,6; 25 73,5; 72,5; 72,3; 72,1; 71,5; 68,8; 62,6; 60,4; 60,2; 54,0; 53,1.

Eksempel 4 4 g heparin ALFA 87-81 tilsættes til 120 ml vandig opløsning indeholdende 4,8 g 30 (1 N) natriumhydroxid, 6,2 g (0,625 N) natriumacetat og 25 mg natriumborhydrid.

Reaktionsblandingen holdes ved 60°C i 3,5 timer, hvorefter den neutraliseres med 14 DK 173818 B1 eddikesyre, dialyseres i 24 timer med rindende vand og perkuleres gennem et Dowex 1X4 anjonisk jonbyttermateriale på chloridform (0 = 1,6 cm, h = 15 cm). Perkulatet og udvaskningen tilsættes 4 g natriumacetat og 2 volumenmængder ethanol. Precipitatet filtreres og vaskes på filteret med en 6:1 ethanol/vand-blan-5 ding og tørres. Der indvindes 3,55 g produkt med et 13C-NMR-spektrum, som har karakteristiske spidser ved følgende δ (udtrykt som ppm): 177,4; 104,5; 101,8; 99,4; 98,7; 97,1; 79,5; 78,6; 73,5; 71,8; 68,8; 62,4; 60,3; 54,0; 53,1.

Eksempel 5 10 1,8 g heparin LMW ALFA 86-02 tilsættes til 50 ml vandig opløsning indeholdende 0,08 g (0,04 N) natriumhydroxid, 2,6 g (0,625 N) natriumacetat og 10 mg natrium-borhydrid. Reaktionsblandingen holdes ved 60°C i 210 minutter, hvorefter den afkøles til stuetemperatur og perkuleres først på en søjle med Dowex 1X4 anjonisk 15 jonbyttermateriale på OH-form (0 = 1,2 cm, h = 10 cm) og så på en søjle med en katjonbytter Dowex 50 WX8 på f-f-form (0 = 1,2 cm, h = 10 cm). Perkulatet og udvaskningen bringes til neutralitet ved hjælp af en 2 N vandig opløsning af natriumhydroxid, hvorefter der tilsættes 4 g natriumacetat og 2,5 volumenmængder ethanol. Det indvundne precipitat vaskes med en 6:1 ethanol/vand-blanding og 20 tørres. Der indvindes 1,4 g produkt med et 13C-NMR-spektrum, som har karakteristiske spidser ved følgende δ (udtrykt som ppm): 177,4; 104,6; 101,9; 99,4; 98,6; 98,4; 97,2; 96,8; 79,9; 78,6; 72,3; 71,9; 68,8; 62,6; 60,3; 54,1; 53,1.

Eksempel 6 25 10 g heparin LMW ALFA 87-198 tilsættes til 300 ml vandig opløsning indeholdende 2,7 g (0,225 N) natriumhydroxid, 15 g (0,625 N) natriumacetat og 60 mg na-triumborhydrid. Opløsningen holdes ved 60°C i 50 minutter, afkøles til stuetemperatur, fortyndes til 500 ml med destilleret vand og perkuleres først på en anjonisk 30 jonbytter Dowex 1 X 2 på OH'-form (0 = 2 cm, h = 15 cm) og derefter på en katjonbytter Dowex 50 WX8 på H+-form (0 = 2 cm, h = 15 cm). Perkulatet og ud- 15 DK 173818 B1 vaskningen bringes til neutralitet ved hjælp af en 4 N vandig opløsning af natriumhydroxid, hvorefter der tilsættes 20 g natriumacetat og 2,5 volumenmængder ethanol. Det indvundne precipitat vaskes med en 6:1 ethanol/vand-blanding og tørres. Der indvindes 9,1 g pro dukt med et 13C-NMR-spektrum, som har karakte-5 ristiske spidser ved følgende δ (udtrykt som ppm): 177,4; 104,6; 101,9; 99,8; 98,6; 98,4; 97,2; 96,8; 79,8; 78,6; 72,2; 71,8; 68,9; 62,5; 60,3; 54,1; 53,1.

Eksempel 7 10 15 g natriumheparin af handelskvalitet tilsættes til 600 ml vandig opløsning inde holdende 5,4 g (0,225 N) natriumhydroxid, 30 g (0,625 N) natriumacetat og 120 mg natriumborhydrid. Opløsningen holdes konstant ved 42°C i 4 timer, afkøles ved stuetemperatur, og neutraliseres med eddikesyre. Opløsningen dialyseres natten over med rindende vand og perkuleres derefter gennem et Dowex 1 X 2 anjonisk 15 jonbyttermateriale på chloridform (0 = 2,8 cm, h = 15 cm). Perkulatet og udvaskningen tilsættes 10 g natriumacetat, bringes til pH ved hjælp af en 2 N vandig opløsning af natriumhydroxid og tilsættes 2,5 volumenmængder ethanol. Det indvundne precipitat vaskes med en 6:1 ethanol/vand-blanding og tørres. Der indvindes 13,9 g produkt med et 13C- NMR-spektrum, som har karakteristiske spidser 20 ved følgende δ (udtrykt som ppm): 177,3; 104,6; 101,9; 99,8; 98,6; 98,4; 97,2; 96,8; 79,9; 78,6; 72,2; 71,8; 69,0; 62,5; 60,3; 54,1; 53,1.

Eksempel 8 25 Et medicinglas til parenteral (ikke via tarmkanalen) anvendelse indeholder heparin modificeret ifølge eksempel 1 10.000 U.A.Xa F.U. natriumchlorid F.U. 5 mg B.P Benzylalkohol 8 mg dobbeltdestilleret, sterilt vand 1 ml - 30

Claims (5)

16 DK 173818 B1

1. Heparinderivat, kendetegnet ved, at det udviser signaler ved 53 ppm og 54 ppm ved 13C-NMR-spektroskopi udført i D20 med natrium-3-trimethylsilylpro- 5 pansulfonat som intern reference, en specifik drejningsværdi [cc]20d mellem +50° og +90° i 1% vandig opløsning, et svovlindhold mellem 8% og 11% og et sul-fat/carbonyl forhold mellem 1,50 og 2,20 begge dele ved potentiometrisk bestemmelse, samt at det kan fremstilles ved, at man behandler en vandig opløsning af heparin med en base af et aikalimetal eller et jordalkalimetal med en kon-10 centration på mellem 0,01 N og 1 N i tilstedeværelse af et alkalimetal- eller jord- alkalimetalsalt eventuelt i yderligere tilstedeværelse af en katalytisk mængde af et reducerende reagens i 0,5 til 24 timer ved en temperatur mellem 35°C og 70°C og om nødvendigt efterfølgende renser reaktionsblandingen gennem en ionbytter eller ved dialyse og udskiller det ønskede derivat ved tilsætning af mel-15 lem 2 og 4 volumenmængder alkohol med fra 1 til 3 kulstofatomer ved en pH- værdi omkring 7.

2. Heparinderivat ifølge krav 1,kendetegnet ved, at basen er udvalgt af gruppen bestående af natrium-, kalium- og bariumhydroxid. 20

3. Heparinderivat ifølge krav 1,kendetegnet ved, at saltet er udvalgt fra gruppen bestående af natrium-, kalium-, barium, calcium og magnesiumchlorid og -acetat samt natrium-, kalium- og magnesiumsulfat.

4. Heparinderivat ifølge krav 1,kendetegnet ved, at det reducerende rea gens er borhydrid.

5. Heparinderivat ifølge krav 1, k e n d e t e g n e t ved, at det ønskede derivat udskilles ved tilsætning af omkring 2,5 volumenmængder ethylalkohol. 30 j