JP6980018B2 - 内因系テンナーゼ複合体を阻害するオリゴ糖、その製造方法と用途 - Google Patents
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化合物A1、A2、A3、A4及びA5の製造:L−2,4−ジ硫酸フコシル基−(α1→3)−L−4−デオキシ−スレオ−ヘクス−4−エノピラノシルウロン酸基−(α1→3)−{−D−N−アセチル−2−デオキシ−2−アミノ−4,6−ジ硫酸ガラクトシル基−(β1→4)−[L−2,4−ジ硫酸フコシル基−(α1→3)]−D−グルクロン酸基−(β1→3)}(n+1)−D−N−アセチル−2−デオキシ−2−アミノ−4,6−ジ硫酸化ガラクチトール(nがそれぞれ0、1〜4の自然数であるヘキササッカリド、ノナサッカリド、ドデカサッカリド、ペンタデカサッカリド及びオクタデカサッカリドである。)
SvFGは、Stichopus Variegatusに由来の天然FGであり(ナトリウム塩)、文献の方法を用いて製造され(Zhao LY et al.,PNAS,2015,112:8284〜8289)、純度が98%であり(HPGPC、面積百分率法)、重均分子量Mwが約70kDaであった。塩化ベンゼトニウム、塩化ベンジル、DMF、水酸化ナトリウム、塩化ナトリウム及びエタノールなどは、何れも市販の分析用試薬であった。Sephadex G10,Medium(50〜100μm)は、GE Healthcare社製であり、Bio−Gel P−6/P−2 gel,fine(45−90μm)は、Bio−Rad社製であり、Bio−Gel P−10gel,Medium(90−180μm)は、Bio−Rad社製であり、HPLCクロマトグラフは、Agilent 1200/1260系のクロマトグラフであった。
1)SvFG第四級アンモニウム塩への変換:2.0gのSvFGを脱イオン水30mLで溶解し、塩化ベンゼトニウム5.0gを脱イオン水80mLで溶解した。撹拌しながら塩化ベンゼトニウム溶液をSvFG溶液に滴下して白色の沈降物を得て、沈降物を脱イオン水55mLで3回洗浄し、減圧乾燥してSvFGの第四級アンモニウム塩5.34gを得た。
1)前記方法を利用して化合物A1を35mg、A2を45mg、A3を55mg、A4を35mg、A5を20mgそれぞれ取得し、HPGPCで測定したところ、純度がいずれも約99%であった。オリゴ糖A1〜A5のHPGPCクロマトグラムを、図1に示す。
注:表3においてrA、rU及びRFは、それぞれ還元性末端のGalNAc−ol、還元性末端に隣接するD−GlcA及びL−Fuc糖基を表し、dU、dA及びdFは、それぞれΔUA、ΔUAに結合するD−GalNAc、及びΔUAに結合するL−Fucを表す。
化合物B1、B2、B3、B4及びB5の製造:L−3,4−ジ硫酸フコシル基−(α1,3)−L−4−デオキシ−スレオ−ヘクス−4−エノピラノシルウロン酸基−(α1,3)−{D−N−アセチル−2−デオキシ−2−アミノ−4,6−ジ硫酸ガラクトシル基−(β1,4)−[L−3,4−ジ硫酸化フコシル基−(α1,3)−]D−グルクロン酸基−(β1,3)}n−D−N−アセチル−2−デオキシ−2−アミノ−4,6−ジ硫酸化ガラクトース−[L−3,4−ジ硫酸化フコシル基−(α1,3)−]−D−グルクロン酸オール(nがそれぞれ0、1、2、3及び4であるペンタサッカリド、オクタサッカリド、ウンデカサッカリド、テトラデカサッカリド及びヘプタデカサッカリドである。)
HsFGは、Holothuria fuscopunctata(リュウキュウフジナマコ)に由来の天然FGであり(ナトリウム塩)、文献の方法(Zhao LY et al.,PNAS,2015,112:8284〜8289)に従って製造され、純度が98%であり(HPGPC法)、重均分子量Mwが約50kDaであった。塩化ベンゼトニウム、塩化ベンジル、DMF、水酸化ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、塩化ナトリウム及びエタノールなどは、何れも市販の分析用試薬であった。Sephadex G10/G25,medium(50〜100μm)は、GE Healthcare社製であり、Bio−Gel P−12 gel,fine(45〜90μm)は、Bio−Rad社製であり、Bio−Gel P−10gel,medium(90〜180μm)は、Bio−Rad社製であり、HPLCクロマトグラフは、Agilent 1200/1260系HPLCクロマトグラフであった。
1)HsFGの第四級アンモニウム塩への変換:HsFGを3.5g取って、実施例1の1.2の1)と同様にしてHsFGの第四級アンモニウム塩を10.3g得た。
1)前記方法に従って化合物B1を54mg、化合物B2を177mg、化合物B3を154mg、化合物B4を86mg、化合物B5を57mgそれぞれ得て、HPGPCを用いて測定したところ、純度が何れも99%を超えた。
注:表4においてrU、dUは、それぞれ還元性末端のD−GlcA−ol及び非還元性末端のΔUAを表し、rF、dFは、それぞれ還元性末端D−GlcA−ol、ΔUAに結合するL−Fuc糖基を表し、Aは、D−GalNAcを表す。
注:表5において、rAは、還元性末端に隣接するGalNAcを表し、rU、dUは、それぞれ還元性末端のD−GlcA−ol、非還元性末端のΔUAを表し、rF、dFは、それぞれ還元性末端D−GlcA−ol、ΔUAに結合するL−Fuc糖基を表す。
化合物B6、B7、B8の製造:L−3,4−ジ硫酸フコシル基−(α1,3)−L−4−デオキシ−スレオ−ヘクス−4−エノピラノシルウロン酸基−(α1,3)−{D−N−アセチル−2−デオキシ−2−アミノ−4,6−ジ硫酸ガラクトシル基−(β1,4)−[L−3,4−ジ硫酸化フコシル基−(α1,3)−]D−グルクロン酸基−(β1,3)}n−D−N−アセチル−2−デオキシ−2−アミノ−4,6−ジ硫酸化ガラクトース−(β1,4)−[L−3,4−ジ硫酸化フコシル基−(α1,3)−]−D−グルクロン酸(そのうち、nが0、1及び2である)
HsFGは、実施例2の2.1と同じく、Holothuria fuscopunctata(リュウキュウフジナマコ)に由来のFGナトリウム塩であった。塩化ベンゼトニウム、塩化ベンジル、DMF、水酸化ナトリウム、塩化ナトリウム及びエタノールなどは、何れも市販の分析用試薬であった。
1)HsFG第四級アンモニウム塩への変換:実施例2の2.2の1)と同様にして、HsFG3.5gを用いてHsFGの第四級アンモニウム塩9.55gを得た。
1)上記3.2のステップに従って処理することにより、化合物B6を47mg、化合物B7を55mg、化合物B8を35mgそれぞれ得て、HPGPCで測定し、面積百分率法で算出したところ、純度がいずれも99%を超えた。
化合物A6、A7及びA8の製造:L−Fuc2S4S−(α1,3)−[6−メチル−ΔUA−(α1,3)]−{D−Gal−NAc4S6S−(β1,4)−[L−Fuc2S4S−(α1,3)−]−D−6−メチル−GlcA−(β1,4)}2−D−GalNAc4S6S−ol、L−Fuc2S4S−(α1,3)−L−ΔUA−(α1,3)−{D−GalNS4S6S−(β1,4)−[L−Fuc2S4S−(α1,3)−]−D−GlcA−(β1,3)}2−D−GalNS4S6S−ol、及びL−Fuc2S4S−(α1,3)−[6−メチル−ΔUA−(α1,3)]−{D−GalNAc4S6S−(β1,4)−[L−Fuc2S4S−(α1,3)−]−D−6−メチル−GlcA−(β1,3)}2−D−1−メチル−GalNAc4S6S−ol
化合物A2は、実施例1で製造したものであり、硫酸ヒドラジン、水加ヒドラジン、Et3N.SO3([Et3N−SO3H]Cl、N,N−ジエチル−N−スルホエタンアンモニウムクロライド)などは、何れも市販の分析用試薬であった。
1)化合物A6の製造:化合物A2を10mg取って水0.5mLで溶かし、Dowex 50X8水素型陽イオン交換カラムでH+型に変換し、溶出液を水酸化テトラメチルアンモニウムで中和してから凍結乾燥することにより、化合物A2のテトラブチルアンモニウム塩19mgを得た。化合物A2のテトラブチルアンモニウム塩をジメチルスルホキシド(DMSO)1mLで溶かし、2Mのトリメチルシリルジアゾメタン(TMSD)を15μL加えて室温、60分間反応させた後、酢酸15μLを加えて残りのTMSDを除去した。その後、4℃で無水エタノール4mLを加えて4000rpm、30分間遠心し、沈降物に水1mLを加えて溶解させ、Dowex/r50w×8 50−100(Na+型)イオン交換カラムでナトリウム型に変換した。得られた産物をSephadex G−10カラムで脱塩して凍結乾燥することにより、化合物A6を8.35mg得た。そして、実施例1の1.2の6)と同様に1H−/13C−NMR、2D−NMRを測定した結果、化合物A6(ΔUAのカルボメトキシ基の信号が3.70ppmに現れる)がL−Fuc2S4S−(α1,3)−[6−メチル−ΔUA−(α1,3)]−{D−GalNAc4S6S−(β1,4)−[L−Fuc2S4S−(α1,3)−]−D−6−メチル−GlcA−(β1,4)}2−D−GalNAc4S6S−olであると確認でき、構造式は、以下のとおりであった。
化合物B9、B10及びB11の製造:L−Fuc2S4S−(α1,3)−L−ΔUA−(α1,3)−D−GalNAc4S6S−(β1,4)−[L−Fuc2S4S−(α1,3)]−D−GlcA−(β1,3)−D−GalNAc4S6S−(β1,4)−[L−Fuc2S4S−(α1,3)]−D−β1−ベンジル−GlcA、L−Fuc2S4S−(α1,3)−L−6−メチル−ΔUA−(α1,3)−D−GalNAc4S6S−(β1,4)−[L−Fuc2S4S−(α1,3)]−D−6−メチル−ΔUA−GlcA−(β1,3)−D−GalNAc4S6S−(β1,4)−[L−Fuc2S4S−(α1,3)]−D−β1−ベンジル−6−メチル−GlcA、及びL−Fuc2S4S−(α1,3)−L−ΔUA−(α1,3)−{D−GalNAc4S6S−(β1,4)−[L−Fuc2S4S−(α1,3)]−D−GlcA−(β1,3)}2−D−GalNAc4S6S−(β1,4)−[L−Fuc2S4S−(α1,3)]−D−1−デオキシ−1−アミノ−GlcA−ol−N−4−安息香酸エチルエステル
SvFGを原料とし、実施例2と同様にしてウンデカサッカリド(B3’)を製造し、実施例3と同様にしてオクタサッカリド(B7’)を製造した。4−アミノ安息香酸エチルエステル、水酸化テトラメチルアンモニウム、ジクロロメタン、ピリジン、無水酢酸、ベンジルアルコール、三フッ化ホウ素エーテラートなどは、何れも市販の分析用試薬であった。
1)化合物B9の製造:40mgの化合物B7’を取って水4mLで溶解し、Dowex 50X8水素型陽イオン交換カラムでH+型に変換し、溶出液を水酸化テトラメチルアンモニウムで中和し、凍結乾燥して化合物B7’のテトラブチルアンモニウム塩を80mg得た。化合物B7’のテトラブチルアンモニウム塩に、ピリジン8mL及び無水酢酸8mLを加え、100℃て撹拌しながら30分間反応させた。室温で窒素ガスを噴き込むことで液体成分を飛ばし、残留物をジクロロメタン4mLで溶かした後、ベンジルアルコールを128μL加え、0℃で三フッ化ホウ素エーテラート(BF3OEt2)を20μL滴下してから36時間かけて加熱還流を行い、水を加えて反応を停止させた。反応液を十分振り回してから静置し、CH2Cl2相を回収し、CH2Cl2を減圧蒸留によって除去した。室温で残留物に0.02Mのメタノールナトリウムを含むメタノール溶液を4mL加え、撹拌しながら10分間反応させることによりアセチル基を離脱させ、メタノールを減圧蒸留によって除去した。Dowex 50X8水素型陽イオン交換カラムでH+型に変換し、溶出液を水酸化ナトリウムで中和してからBio−gel P6で分離、精製し、糖類を含む試料を回収して濃縮し、Sephadex G−10カラムで脱塩し、凍結乾燥して化合物B9を24mg得た。
6.1 材料
SvFGは、実施例1と同様のものであった。塩化ベンゼトニウム、塩化ベンジル、DMF、水酸化ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、塩化ナトリウム及びエタノールなどは、何れも市販の分析用試薬であった。Sephadex G−50(medium,50−100μm)は、GE Healthcare社製であった。
1)SvFG第四級アンモニウム塩への変換:70gのSvFGを水1Lで溶解し、また、塩化ベンゼトニウム175gを水2.8Lで溶解した。塩化ベンゼトニウム溶液に、撹拌しながらSvFG溶液を滴下し、滴下が終わると遠心し、沈降物を脱イオン水で3回洗浄し、減圧乾燥してSvFGの第四級アンモニウム塩を210g得た。
1)前記方法に従ってオリゴ糖混合物C1を35g得て、収率が50%であった。
7.1 材料
HsFGは、実施例2と同様のものであった。塩化ベンゼトニウム、塩化ベンジル、DMF、DMSO、TMSD、水酸化ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、塩化ナトリウム及びエタノールなどは、何れも市販の分析用試薬であった。分画分子量がそれぞれ30kDa、10kDa、3kDaである限外ろ過カセット(0.5m2)は、Merk Millipore社製であった。
1)HsFG第四級アンモニウム塩への変換:HsFGを330g取って水4.9Lで溶解した。一方、塩化ベンゼトニウム825gを水13.2Lで溶解し、撹拌しながら前記HsFG溶液に加え、4000rpm、10分間遠心した。沈降物を脱イオン水9Lで3回洗浄し、減圧乾燥してHsFGの第四級アンモニウム塩を804g得た。
1)オリゴ糖混合物D1の収率と化学組成
前記方法に従ってオリゴ糖混合物D1を98.7g得て、収率が約30%であった。HPGPCの解析結果から(図12)、オリゴ糖混合物D1にペンタサッカリド、オクタサッカリド、ウンデカサッカリド、テトラデカサッカリド、ヘプタデカサッカリド及びエイコササッカリドを含み、これら多糖体の含有量がそれぞれ4.3%、17.1%、18.0%、16.3%、14.1%及び11.1%であり、ペンタサッカリド〜ノナコササッカリドが合計で約96.0%であると確認できた。
前記方法に従ってオリゴ糖混合物D2を16.3g得て、収率が約80%であった。HPGPC解析結果から、オリゴ糖混合物D2にペンタサッカリド、オクタサッカリド、ウンデカサッカリド、テトラデカサッカリド、ヘプタデカサッカリド、エイコササッカリドを含み、これら多糖体の含有量がそれぞれ3.34%、16.71%、17.03%、17.25%、13.78%及び12.25%であると確認できた。
8.1 材料
オリゴ糖A1〜A8、オリゴ糖B1〜B11、オリゴ糖混合物C1、D1、D2は、実施例1〜7で製造したものであった。対照物として、エノキサパリンナトリウム注射液(LMWHは、Mwが3500〜5500Daであり、サノフィ・アベンティス社製である)を用いた。人コントロール血漿(047B−D024A)、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)測定キット、プロトロンビン時間(PT)測定キットは、いずれもドイツTECO GmbH社製であり、第VIII因子測定キット、ヘパリンコファクターII(HCII)、AT依存的な第IIa因子阻害活性測定キット、AT依存的な第Xa因子阻害活性測定キット、トロンビン(すなわち第IIa因子)、トロンビン基質CS01(38)、KK基質CS31(02)は、いずれもフランスHYPHEN BioMed社製であり、第VIII因子は、ドイツBayer Healthcare LLC社製であり、ADPは、米国Chronolog社製であり、クエン酸ナトリウム、抱水クロラール、生理食塩水は、いずれも市販のものであった。
1)試料溶液の調製:Tris−HCl緩衝液を用いてオリゴ糖A1〜A8、オリゴ糖B1〜B11、及びオリゴ糖混合物C1、D1、D2を溶解し、一連の濃度に希釈した。
B=(IC50)n/{(IC50)n+[I]n}
1)抗凝固及び凝固因子阻害活性については、結果を下記表6に示す。本発明に係るオリゴ糖及びその混合物は、APTT活性を亢進することができるが、PT、TTに対して影響を示さないことから、内因系凝固機構を阻害することで抗凝固活性を示し、外因系凝固に対しては顕著な影響を示さないことが確認できた。また、本発明に係るオリゴ糖及びその混合物は、テンナーゼに対して優れた阻害活性を示すが、IIa、Xa、XIIaなどの凝固因子に対してはアンチトロンビン(AT)の存在・非存在とは関係なく顕著な影響を示さず、その一方でヘパリンコファクターII(HC−II)依存的なIIa阻害活性を示すことが確認できた。
9.1 材料
実施例1と同様にしてA2を製造し、実施例7と同様にしてD1を製造した。対照物として、低分子ヘパリン(LMWH)は、フランスのサノフィ・アベンティス社製であり、ロット番号が4SH69であった。抱水クロラール(トリクロロアセトアルデヒド一水和物)は、国薬グループ化学試薬有限会社製であり、生理食塩水は、昆明南疆製薬有限会社製であった。実験動物として、オスのSDラットは、体重が250〜350gであり、湖南SJA実験動物有限会社により提供され、許可証番号がSCXK(湘)2011−0003であった。ニュージーランドウサギは、昆明医科大学により提供され、許可証番号がSCXK(Dian)2011−0004であり、ウサギ脳粉末浸出液を調製するために用いられる。
9.2.1 静脈血栓形成の評価
組分けと投与:ラットを、ランダムに1)生理食塩水(NS)対照組、2)LMWH 4.0mg/kg組、3)A2 2.5mg/kg組、4)A2組 5.0mg/kg、5)A2 10mg/kg組、6)D1 2.5mg/kg組、7)D1 5.0mg/kg組、及び8)D1 10mg/kg組で構成される8組に分け、各組に8匹ずつであった。各組のラットに対して背中の皮下注射(sc.)によって投与を行い、投与量がいずれも1mL/kgであった。投与から1時間後にモデル構築実験を遂行した。
組分けと投与:マウスを、ランダムに1)生理食塩水(NS)対照組、2)LMWH 4.0mg/kg組、2)LMWH 20mg/kg組、3)LMWH 100mg/kg組、4)A2 5mg/kg組、5)A2 25mg/kg組、6)A2 125mg/kg組、7)D1 5mg/kg組、8)D1 25mg/kg組、10)D1 125mg/kg組で構成される10組に分け、各組に8匹ずつであった。各組のマウスに対して、背中の皮下注射(sc.)によって投与を行い、投与量がいずれも10mL/kgであった。
1)図14に、抗血栓活性の測定結果を示す。図14に示すように、上記実験の投与量で投与を行った場合、A2及びD1はいずれも抗血栓活性を示し、特に、投与量が5mg/kg〜10mg/kgの範囲において血栓形成阻害率が70%以上に達した。
10.1 材料
化合物A3は、精製ドデカサッカリドであり、実施例1と同様にして製造した。塩化ナトリウムは、薬用レベルのものであり、滅菌注射用水、2mL容量のホウケイ酸ガラス製注射用バイアル、Millipore Pellicon 2限外ろ過カセット(Merk Millipore社製)及びVirTis Ultra 35 EL冷凍結乾燥装置は、いずれも市販ルートから入手できるものであった。
下記表7に示す組成、配合量に従ってA3薬物組成物を調製した。
1)表7に示す用量の2倍量となるように40gのA3、8gのNaClを秤量し、注射用水1.0Lを加えた後に撹拌して完全に溶解させ、Millipore社製の限外ろ過装置を用いて分画分子量が10kDaの限外ろ過カセットで熱源物質を取り除いた。滅菌条件下で0.22μmの膜でろ過して除菌し、溶液を2mL規格のペニシリンボトルに分注し、各ボトルに0.5mLずつであった。分注に際しては注入量を監視しつつ、ゴム栓を半分程度に押し付けた後、パイロットテスト型の冷凍乾燥装置(米国VirTis社製)の乾燥室に入れ、指定の凍結乾燥曲線に従って凍結乾燥を行った。その後、ゴム栓を全部押し付けて凍結乾燥機から取り出し、キャップで押し付けて密封し、合格品を検定した。
上記方法に従って調製したA3凍結乾燥製剤は、合格品として1960バイアルが得られ、合格率が約98%であった。得られた凍結乾燥品は、見た目で画一的であり、滅菌状況、熱源物質及び不溶性微粒子などは、いずれも合格以上であった。水分率を測定したところ、水分含有率がいずれも約3%未満であり、また、分注量を測定したところ、いずれも指定分注量の95〜115%の範囲内であると確認できた。
11.1 材料
実施例7と同様にしてオリゴ糖混合物D1を製造した。塩化ナトリウムは、薬用レベルのものであり、滅菌注射用水、2mL容量のホウケイ酸ガラス制注射用バイアル、Millipore Pellicon 2限外ろ過カセット(Merk Millipore社製)、凍結乾燥装置(LYO−20m2、上海Tofflon有限会社製)は、いずれも市販ルートから入手できるものであった。
下記表8に示す組成、配合量に従ってD1薬物組成物を調製した。
1)表8に示す用量の20倍量となるように1000gのD1、180gのNaClを秤量し、注射用水20Lを加えた後に撹拌して完全に溶解させ、Millipore社製の限外ろ過装置を用いて分画分子量が10kDaの限外ろ過カセットで熱源物質を取り除いた。滅菌条件下で0.22μmの膜でろ過して除菌した後、溶液を2mL規格のペニシリンボトルに分注し、各ボトルに0.5mLずつであった。分注に際しては注入量を監視しつつ、ゴム栓を半分程度に押し付けた後、製造型の冷凍乾燥装置(LYO−20m2、上海Tofflon有限会社製)の乾燥室に入れ、指定の凍結乾燥曲線に従って凍結乾燥した。その後、ゴム栓を全部押し付けて凍結乾燥機から取り出し、キャップで押し付けて密封し、合格品を検定した。
上記方法に従って調製したD1凍結乾燥製剤は、合格品として17,600バイアルが得られ、合格率が約88%であった。合格品は、見た目や性状からして白色の粗粉であった。分注状況については、重量法を利用して測定し、いずれも合格であることが確認できた。滅菌状況については、適量の合格品を取って「中国薬局方、2015年版、第4部1101」に従って測定した結果、いずれも注射剤の品質要求を満たすことを確認した。また、熱源物質については、上記合格品を取って濃度が3.5mg/1mLのD1溶液を調製し、「中国薬局方、2015年版、第4部1142」に従って測定した結果、いずれも注射剤の熱源物質要求を満たすことが確認した。
Claims (16)
- 抗血栓活性を示し、下記一般式(I)で表される構造を有するオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩。
- 前記一般式(I)、(V)、(VI)、及び(VII)で表される構造において、nは、1、2、3、又は4である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩。
- 前記薬学的に許容可能な塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩又は有機アンモニウム塩である、請求項1に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩。
- 前記薬学的に許容可能な塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、又はカルシウム塩である、請求項6に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩。
- 請求項1に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩からなる抗血栓活性を示すオリゴ糖混合物であって、
前記オリゴ糖混合物において、R 8 が一般式(II)で表される置換基である、一般式(I)で示されるオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩が占める比率は、モル比で95%以上であり、
又は前記オリゴ糖混合物において、R 8 が一般式(III)で表される置換基である、一般式(I)で示されるオリゴ又はその薬学的に許容可能な塩が占める比率は、モル比で95%以上であり、
又は前記オリゴ糖混合物において、R 8 が一般式(IV)で表される置換基である、一般式(I)で示されるオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩が占める比率は、モル比で95%以上である、オリゴ糖混合物。 - 請求項1に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩を製造する方法であって、
1)天然フコシル化グリコサミノグリカンのカルボン酸をエステル化し、
2)有機溶媒において、強アルカリ及び還元剤の存在下でフコシル化グリコサミノグリカンを「β−脱離反応」によって解重合し、さらに末端基を還元することでオリゴ糖の混合物を取得し、又は有機溶媒において、強アルカリの存在下でフコシル化グリコサミノグリカンを「β−脱離反応」によって解重合し、さらに末端基をピーリング処理してオリゴ糖の混合物を取得し、
3)分離、精製を行い、置換基によって構造を適宜修飾することで所期の精製オリゴ糖を取得することを含む、オリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。 - 前記オリゴ糖は、請求項1に記載の一般式(I)で表される構造を有し、前記R8が請求項1に記載の一般式(II)で表される置換基であり、前記製造方法は、
a)フコシル化グリコサミノグリカンを第四級アンモニウム塩の形態に変換し、有機溶媒において、フコシル化グリコサミノグリカン第四級アンモニウム塩のヘキスロン酸残基におけるカルボキシ基を、全部又は部分的にカルボン酸エステルに変換し、
b)還元剤を含む無水有機溶媒において、上記ステップa)で得られるフコシル化グリコサミノグリカンカルボン酸エステルを強アルカリで処理することでβ−脱離解重合し、及び末端基を還元し、還元性末端がD−アセチルアミノガラクチトールであるオリゴ糖の混合物を取得し、
c)上記ステップb)で得られるオリゴ糖の混合物をアルカリ金属塩に変換し、さらに水溶液においてカルボン酸エステルをアルカリ加水分解することにより、遊離カルボキシ基を含むオリゴ糖の混合物を取得し、
d)クロマトグラフィーを用いて上記ステップc)で得られるオリゴ糖混合物を分離することにより、精製オリゴ糖を取得し、
e)上記ステップd)で得られる精製オリゴ糖に対して、適宜に置換基による構造修飾を施すことを含む、請求項9に記載の製造方法。 - 前記ステップa)において、前記フコシル化グリコサミノグリカンの第四級アンモニウム塩は、ベンゼトニウム塩(N,N−ジメチル−N−[2−[2−[4(1,1,3,3−テトラメチルブチル)フェノキシ]エトキシ]エチル]ベンザルコニウム塩)であり、前記有機溶媒は、ジメチルホルムアミド(以下「DMF」と称する)、又はDMFとエタノールの混合物であり、前記カルボン酸エステルは、ベンジルエステルであり、前記「全部又は部分的にカルボン酸エステルに変換する」とは、フコシル化グリコサミノグリカンのカルボキシ基エステル化度が30%〜100%の範囲であることを意味し、
前記ステップb)において、前記有機溶媒は、DMF、又はDMFとエタノールの混合物であり、前記還元剤は、水素化ホウ素ナトリウムであり、前記強アルカリは、ナトリウムエトキシドであり、
前記ステップc)において、前記オリゴ糖混合物をアルカリ金属塩に変換するとき、反応液に塩化ナトリウムの飽和水溶液を加えてオリゴ糖混合物をナトリウム塩の形態に変換し、前記アルカリ加水分解とは、濃度が0.25M〜1MのNaOH水溶液においてオリゴ糖のカルボン酸エステル基を加水分解することを意味し、
前記ステップd)において、前記クロマトグラフィーは、ゲルクロマトグラフィー及び/又はイオン交換クロマトグラフィーであり、
前記ステップe)において、置換基による構造修飾は、オリゴ糖のD−グルクロン酸基及び不飽和ヘキスロン酸基におけるカルボキシ基をエステル化し、又はN−アセチル−D−ガラクトサミン基を脱アセチル化した後、適宜に再アシル化又は再硫酸化し、又は還元性末端−D−GalNAc−olのC1位ヒドロキシ基をアルキル化することで遂行される、請求項10に記載の製造方法。 - 前記オリゴ糖は、請求項1に記載の一般式(I)で表される構造を有し、前記R8が請求項1に記載の一般式(III)、又は一般式(IV)で表される置換基であり、前記製造方法は、
a)フコシル化グリコサミノグリカンを第四級アンモニウム塩に変換し、さらに有機溶媒においてフコシル化グリコサミノグリカン第四級アンモニウム塩のヘキスロン酸残基におけるカルボキシ基を、全部又は部分的にカルボン酸エステルに変換し、
b)無水有機溶媒において、上記ステップa)で得られるフコシル化グリコサミノグリカンのカルボン酸エステルを強アルカリで処理することでβ−脱離解重合し、さらに少量の強アルカリ水溶液を加えて解重合物をピーリング処理することにより、還元性末端の糖基−D−GalNAcを除去して還元性末端の糖基が−D−GlcAであるオリゴ糖の混合物を取得し、
c)上記ステップb)で得られるオリゴ糖の混合物をアルカリ金属塩に変換し、水溶液においてオリゴ糖のカルボン酸エステルをアルカリ加水分解することにより、遊離カルボキシ基を含むオリゴ糖の混合物を取得し、
d)クロマトグラフィーを用いて上記ステップc)で得られるオリゴ糖混合物からオリゴ糖を分離、精製し、
e)上記ステップd)で得られる精製オリゴ糖に対して、適宜に置換基による構造修飾を施すことを含む、請求項9に記載の製造方法。 - 前記ステップa)において、前記第四級アンモニウム塩は、ベンゼトニウム塩であり、前記有機溶媒は、DMF、又はDMFとエタノールの混合物であり、前記カルボン酸エステルは、ベンジルエステルであり、前記「全部又は部分的にカルボン酸エステルに変換する」とは、フコシル化グリコサミノグリカンのカルボキシ基エステル化度が30%〜100%の範囲であることを意味し、
前記ステップb)において、前記有機溶媒は、DMF、又はDMFとエタノールの混合物であり、前記強アルカリは、ナトリウムエトキシドであり、前記少量の強アルカリ水溶液とは、反応液全体に対して体積比で1/5〜1/10である1M〜2MのNaOH水溶液を指し、
前記ステップc)において、前記オリゴ糖混合物をアルカリ金属塩に変換するとき、反応液に塩化ナトリウムの飽和水溶液を加えることによりオリゴ糖混合物をナトリウム塩の形態に変換し、前記アルカリ加水分解とは、濃度が0.05M〜1MのNaOH水溶液においてオリゴ糖のカルボン酸エステル基を加水分解することを意味し、
前記ステップd)において、前記クロマトグラフィーは、ゲルクロマトグラフィー及び/又はイオン交換クロマトグラフィーであり、
前記ステップe)において、前記置換基による構造修飾は、オリゴ糖のD−GlcA及びΔUAにおけるカルボキシ基をエステル化し、又はD−GalNAcを脱アセチル化し、さらに再アシル化又は再硫酸化し、又は還元性末端−D−GlcAのC1位ヘミアセタールをアルキル化、還元、還元アミノ化又は還元アルキル化することで遂行される、請求項12に記載の製造方法。 - 抗血栓活性を示す薬物組成物であって、
抗血栓効果を示す有効量の活性成分と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなり、
前記活性成分は、請求項1に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩、又は請求項8に記載のオリゴ糖混合物である、薬物組成物。 - 前記薬物組成物の製剤形態は、注射用水溶液又は注射用凍結乾燥粉体であり、
単位製剤形態に、20mg〜100mgの前記活性成分を含む、請求項14に記載の薬物組成物。 - 請求項1に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩の、又は請求項8に記載のオリゴ糖混合物の、血栓塞栓性疾患を治療及び/又は予防する薬物の製造における使用であって、
前記血栓塞栓性疾患は、静脈血栓塞栓、動脈血栓塞栓、及び/又は虚血性心疾患又は虚血性脳血管障害である、薬物の製造における使用。
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