JP6248179B2 - 末端2,5−脱水タロース又はその誘導体を含んでなる低分子量グリコサミノグリカン誘導体 - Google Patents
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Description
[式(I)中、nは、平均値が3〜21の整数であり、
−D−GlcUA−β1−は、−β−D−グルクロン酸−1−イルであり、
−D−GalN−β1−は、−β−D−2−アセチルアミノ−2−デオキシガラクトース−1−イル、−β−D−2−アミノ−2−デオキシガラクトース、又は−β−D−2−硫酸アミノ−2−デオキシガラクトースであり、
L−Fuc−α1−は、α−L−フコース−1−イルであり、
R’は、各々独立して−OH、又は−OSO3 −であり、
R3は、−H、−OS3 −、又はアセチルであり、
R1は、−H、又はβ−D−2−アセチルアミノ−2−デオキシガラクトース硫酸エステル−1−イルであり、
R2は、−H、又は−β−D−グルクロン酸−1−イル、又は下記式(II)で表される官能基である。
式(II)中、−D−GlcUA−β1−、L−Fuc−α1−、R’は、上記と同じであり、
anTalは、2,5−脱水タロース、その糖アルコール、糖アミン又はN−置換の糖アミンであり、
mは、1又は2であり、
R4は、=O、−O、−NH2、−NHR5から随意に選ばれ、そのうち、R5は、C1〜C6の直鎖状又は分岐状アルキル、C7〜C12アリールである。
また、前記式(I)の構造を有する同族グリコサミノグリカン誘導体の混合物において、R2が式(II)で表される官能基である化合物とR2が−H又は−β−D−グルクロン酸−1−イルである化合物との比がモル比で2:1以上である。]
1.1 材料
FGAGは、バイカナマコ(Thelenota ananas)の体壁から抽出したフコシル化グリコサミノグリカンであり、Marine Drugs,2013,11,399〜417)に記載の方法に従って抽出、精製し、分子量が69,930Daであった。ヒドラジン水和物、硫酸ヒドラジン、塩酸ヒドラジン、塩酸、塩化ナトリウム、無水エタノール、ヨウ素酸、ヨウ化水素酸及び水酸化ナトリウム等の試薬は、何れも市販の分析用試薬であった。
脱アセチル化反応: 60mgのFGAG原料を精確に秤量して反応チューブに入れ、触媒として硫酸ヒドラジン14.5mg又は塩酸ヒドラジン12.2mg又は2.304mol/Lの塩酸0.1mLを添加し、或いは触媒無添加の条件下において、ヒドラジン水和物又は無水ヒドラジン1.45mLを加え、窒素雰囲気、250rpmの回転速度で攪拌しながら75〜105℃で2〜14時間加熱して反応させた。反応終了後、反応液に80%エタノールを加えて沈降処理を行い、遠心して沈降物を得た。次に、減圧下で真空乾燥し、脱アセチル化した中間体サンプルを得た。該サンプルをそのまま亜硝酸で処理して解重合することができ、或いは更に精製して純度の比較的高い中間体を得ることができる。その際の処理方法として、溶液を完全に留去したサンプルを氷浴で冷却させた後、0.25mol/Lのヨウ素酸溶液を滴下し、沈降物が溶解せずに黒い懸濁液となるまでに滴下を続けた。45%のヨウ化水素酸約5mLを滴下した後、更に3mol/Lの水酸化ナトリウムを加えて沈降物を溶解させ、溶液が透明又は淡黄色の溶液となるまで滴下し続けた。該溶液のpHを中性に調整し、分画分子量が1,000Dの透析バッグで透析し、凍結乾燥した。
反応条件の変化による脱アセチル化産物(deacelyted FGAG,dAFG)の脱アセチル化度への影響は、下記表1に示される通りである。表1の結果から、触媒を添加することにより反応が加速化し、産物の脱アセチル化度が更に向上することが確認でき、また、反応時間、反応温度及びヒドラジンの質量濃度を制御することにより、脱アセチル化度が異なる産物を得ることのできることが確認できた。
2.1 材料
FGAGの部分的脱アセチル化産物dAFGは、実施例1と同様にして製造した。亜硝酸ナトリウム、濃硫酸、水素化ホウ素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム及び無水エタノール等の試薬は、何れも市販の分析用試薬であった。
産物の製造:脱アセチル化済みの中間体約20mgを精確に秤量して反応容器に入れ、1mL水を加えて溶解し、氷浴又は室温条件において、5.5mol/Lの亜硝酸溶液(pH4)2mLを加えて2〜30分間解重合した。反応が十分に進行した後、1mol/Lの炭酸ナトリウム溶液でpH8〜9に調整して反応を中止させ、0.25mol/Lの水素化ホウ素ナトリウムを含む0.1mol/Lの水酸化ナトリウム溶液1mLを用いて亜硝酸処理で得られた解重合産物のアルデヒド基を還元させた。その後、50℃で40分間保持してから室温に冷却し、0.5mol/Lの硫酸で余分の水素化ホウ素ナトリウムを取り除いた後、0.5mol/Lの水酸化ナトリウム溶液で中和した。分画分子量が1,000Daの透析バッグで透析し、透析バッグ内の透析液を回収して凍結乾燥した。
脱アミノ化解重合産物の収率は90%を超え、サンプルの純度は95%を超えた。
3.1 材料
マナマコ(Apostichopus japonicus)、アカミシキリ(Holothuria edulis)、ブラジルナマコ(Ludwigothurea grisea)、ニセクロナマコ(Holothuria leucospilota)、及びイシナマコ(Holothuria nobilis)は何れも市販のものであり、体壁を取って乾燥した。
1)マナマコ、アカミシキリ、ブラジルナマコ、ニセクロナマコ及びイシナマコの乾燥体壁を細かに粉砕し、粉砕物をそれぞれ300g取って実施例1の方法(1)に従ってFGAGを抽出し、それぞれAJG、HEG、LGG、HLG及びHNGと表記した。
マナマコ、アカミシキリ、ブラジルナマコ、ニセクロナマコ及びイシナマコの乾燥体壁からAJG、HEG、LGG、HLG及びHNGを分離、精製する場合、収率がそれぞれ1.4%、0.9%、0.8%及び1.1%であり、重量平均分子量が何れも約50kD〜80kDの範囲であった。AJG、HEG、LGG、HLG及びHNGの1H NMRスペクトルから、FGAG系化合物の基本特徴としてa−L−Fuc、β−D−GalNAc、及びβ−D−GlcUAにおける末端基及び関連の特徴的プロトン信号が確認できた。
4.1 材料
aTFGは、実施例1及び2で製造したものであり、チラミン、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の試薬は、何れも市販の分析用試薬であった。
1)末端の還元的アミノ化:実施例2で得られたaTFGを0.1g取って3.5mLの0.2mMリン酸緩衝液(pH8.0)に溶かし、攪拌しながらそれぞれ過量の80mgチラミン及び30mgシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、35℃の恒温水槽において約72時間反応させた。反応が終了すると、95%のエタノール10mLを加え、遠心して沈降物を得た。該沈降物を95%のエタノール30mLで2回洗浄した後、35mLの0.1%NaClで再び沈降物を溶解し、遠心して不溶物を除去した。上清を分画分子量が1KDの透析バッグに入れ、脱イオン水で24時間透析し、凍結乾燥してdLFG−2Aを82mg得た。
原料投入量により算出した産物の収率が約72%であった。産物の組成について測定を行った結果、D−GalNAc:D−GlcUA:L−Fuc:−OSO3 −が約1.00:0.98:1.10:3.60であり、Mwが9,969、PDIが約1.32であると確認できた。
5.1 材料
クロロスルホン酸、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド、ジメチルホルムアミド、ピリジン及び炭酸ナトリウム等の試薬は、何れも市販の分析用試薬であった。脱アセチル化サンプルとしてタマナマコに由来のdAFG−1は、実施例1と同様に製造され、脱アセチル化度が35%であった。
0.10gのdAFG−1を精確に秤量して10mL脱イオン水で溶解し、pH7.0に調整した。40℃の水浴において保持しつつNa2CO3を0.16g加え、更に4時間かけて0.20gのピリジン−クロロスルホン酸を加えた後、引続き1時間反応させた。反応終了後、静置して室温まで冷却させ、pH7.5〜8.0に調整した。その後、限外濾過により塩を除去し、凍結乾燥した。サンプルにおける硫酸とカルボン酸とのモル比については、電気伝導測定法を用いて測定した。
反応産物を秤量して収率を算出したところ、約87%であった。電気伝導測定法を用いて測定した硫酸とカルボン酸とのモル比の結果から、産物中における硫酸とカルボン酸とのモル比が4.3であると確認できた。また、プロトタイプの天然産物と比較した場合、脱アセチル化後の遊離アミノ基がほぼ完全に硫酸化されているのが確認できた。
6.1 材料
aTFGサンプルとして、実施例2及び3に記載の方法に従って分子量が異なる一連のaTFGサンプルを製造した。これらのサンプルの理化学的特性等を表4に示す。
コントロール血漿45μLに、Tris−HCl緩衝液に溶解した測定用サンプル5μLを加え、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)測定キットを用いて凝固時間を測定した。
測定結果を表5に示す。
7.1 材料
aTFGサンプルは、実施例2の方法に従って製造し、分子量が8777Daであった。
第X因子活性化複合体(f.Xase)阻害活性については、第VIII因子測定用キットと第VIII因子を用いて測定方法を確立し、以下の通りにして測定した。すなわち、一連の濃度を有する測定用溶液又はコントロール溶液(Tris−BSA緩衝液、試薬R4)30μLを、2.0IU/mLの第VIII因子(30μL)と混ぜ合わせた後、順にキットの試薬R2(30μL)、R1(30μL)を加えて37℃で2分間保持し、その後、R3(30μL)を加えて37℃で引続き2分間保持した後、20%酢酸(30μL)で反応を中止させてOD405を測定した。Sheehan J.P.& Walke E.K.,Blood,2006,107:3876〜3882に記載の方法に従い、第X因子活性化複合体に対する各サンプルのEC50値を算出した。
測定結果を図7に示す。図7に示されるように、aTFGのEC50が22ng/mLであり、第X因子活性化複合体に対して強い阻害活性を示すことが確認できた。第X因子活性化複合体が血液凝固系において内因系凝固カスケードの最下流に位置する標的であり、様々な要因が凝固反応を誘発する際において律速因子として機能するため、該標的サイトに特異的に作用する薬物は、生理的な凝固と止血に対して殆ど影響がないのが実証された(Blood,2010,116(22),4390〜4391.Blood,2009,114,3092〜3100)。
8.1 材料
ハネジナマコに由来のFGAGを用い、実施例1及び2と同様にしてaTFGを製造し、aTFGの重量平均分子量が9476Daであった。
aTFGの注射用水溶液を、下記表6に示す割合で配合した。
配合方法としては、次の通りである。すなわち、配合量に従ってaTFGを秤量し、注射用水を全量で添加した後に攪拌しながら完全に溶解させ、バッチ式の加熱加圧法で滅菌処理を施した。0.6%の薬用活性炭を添加して20分間攪拌した後、ブフナー漏斗及び3.0μm精密濾過膜を用いて濾過して活性炭を取り除き、熱源物質を除去した。中間体の含有量を測定し、合格となったもののみを0.22μmの精密濾過膜で濾過した。次に、バイアルごとに0.5mLとなるように管状バイアルに分注し、バイアルに分注する際、注入量を監視しつつ開口にブチルゴム栓を半分程度に押し付けて密封した。凍結乾燥機に投入し、所定の凍結乾燥曲線に従って凍結乾燥した後、ゴム栓を完全に押し付けて凍結乾燥機から取り出した。アルミ製キャップで堅固に密封し、目視で合格したか否かを判断し、合格となったものを包装して最終製品とした。
Claims (13)
- 低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩であって
前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体の構成単糖として、ヘキスロン酸、ヘキソサミン、デオキシヘキソース、及び2,5−脱水タロース又はその還元誘導体を含むものであり、
前記ヘキスロン酸は、D−β−グルクロン酸であり、
ヘキソサミンは、2−N−アセチルアミノ−2−デオキシ−D−β−ガラクトース、2−アミノ−2−デオキシ−D−β−ガラクトース又は−β−D−2−硫酸アミノ−2−デオキシガラクトースであり、
デオキシヘキソースは、L−α−フコースであり、
2,5−脱水タロースの還元誘導体は、2,5−脱水タリトール、2,5−脱水タロサミン又はΝ−置換の2,5−脱水タロサミンであり、
前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体の構成単糖の含有量比は、モル比でヘキスロン酸:ヘキソサミン:デオキシヘキソース=1:1±0.35:1±0.3の範囲であり、
2,5−脱水タロース及び/又はその還元誘導体は、モル比で構成単糖総量において3.0%以上を占め、
前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体は、重量平均分子量Mwが2.5kD〜20kDの範囲で、且つ、多分散指数が1.0〜1.8の範囲にあり、
前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体は、下記式(I)に示す構造を有する同族グリコサミノグリカン誘導体の混合物である、低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩。
−D−GlcUA−β1−は、−β−D−グルクロン酸−1−イルであり、
−D−GalN−β1−は、−β−D−2−アセチルアミノ−2−デオキシガラクトース−1−イル、−β−D−2−アミノ−2−デオキシガラクトース、又は−β−D−2−硫酸アミノ−2−デオキシガラクトースであり、
L−Fuc−α1−は、α−L−フコース−1−イルであり、
R 1 は、−H、又はβ−D−2−アセチルアミノ−2−デオキシガラクトース硫酸エステル−1−イルであり、
R’は、各々独立して−OH、又は−OSO 3 − であり、
R 3 は、−H、−OS 3 − 、又はアセチルであり、
R 2 は、−H、又は−β−D−グルクロン酸−1−イル、又は下記式(II)で表される官能基である。
anTalは、2,5−脱水タロース、その糖アルコール、糖アミン又はN−置換の糖アミンであり、
mは、1又は2であり、
R 4 は、=O、−O、−NH 2 、−NHR 5 から随意に選ばれ、そのうち、R 5 は、C1〜C6の直鎖状又は分岐状アルキル、C7〜C12アリールである。
また、前記式(I)の構造を有する同族グリコサミノグリカン誘導体の混合物において、R 2 が式(II)で表される官能基である化合物と、R 2 が−H又は−β−D−グルクロン酸−1−イルである化合物との比がモル比で2:1以上である。] - 前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体の重量平均分子量が、5kD〜12kDの範囲であり、前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体の多分散指数が、1.1〜1.5の範囲にある、請求項1に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩。
- 前記薬学的に許容可能な塩は、低分子量グリコサミノグリカン誘導体のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、又は有機アンモニウム塩である、請求項1に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩。
- 前記薬学的に許容可能な塩は、低分子量グリコサミノグリカン誘導体のナトリウム塩、カリウム塩、又はカルシウム塩である、請求項3に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩。
- 請求項1又は3に記載の低分子量グリコサミノグリカン又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法であって、
棘皮動物に由来のフコシル化グリコサミノグリカンをヒドラジンで処理し、そこに含まれるヘキソサミンを部分的に脱アセチル化することにより、フコシル化グリコサミノグリカンの部分的脱アセチル化産物を得るステップ1と、
ステップ1で得られたフコシル化グリコサミノグリカンの部分的脱アセチル化産物を亜硝酸で処理し、脱アミノ化反応を起こさせて解重合し、還元性末端が2,5−脱水タロース残基である低分子量フコシル化グリコサミノグリカンを取得し、更に、得られた低分子量フコシル化グリコサミノグリカンについて、任意に2,5−脱水タロース末端基を糖アルコール、糖アミン又はN−置換の糖アミンに還元する還元性末端の還元処理を施すステップ2と、
を含んでなる、低分子量グリコサミノグリカン又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。 - 前記ステップ1において、棘皮動物に由来のフコシル化グリコサミノグリカンは、棘皮動物門ナマコ綱動物の体壁及び/又は内臓から抽出、精製したフコシル化グリコサミノグリカンの天然産物であり、
前記フコシル化グリコサミノグリカンの単糖構成として、D−グルクロン酸、D−N−アセチルアミノ−2−デオキシガラクトース及びL−フコースを含み、
前記棘皮動物門ナマコ綱動物として、バイカナマコ(Thelenota ananas Jaeger)、タマナマコ(Stichopus variegates Semper)、ハネジナマコ(Holothuria scabra Jaeger)、ニセクロナマコ(Holothuria leucospilota Brandt)、アカミシキリ(Holothuria edulis Lesson)、ジャノメナマコ(Bohadschia argus Jaeger)、シカクナマコ(Stichopus chloronotus Brandt)、チュウカナマコ(Holothuria sinica Liao)、イモナマコモドキ(Acaudina molpadioides Semper)、クロエリナマコ(Pearsonothuria graeffei Semper)、イシナマコ(Holothuria nobilis Selenka)を用いる、請求項5に記載の低分子量グリコサミノグリカン又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。 - 前記ステップ1において、前記ヒドラジン処理による脱アセチル化反応は、棘皮動物に由来のフコシル化グリコサミノグリカンを、無水ヒドラジン又はヒドラジン水和物溶液に入れ、触媒の存在下又は非存在下において、攪拌しながら75℃〜125℃の温度範囲で2〜14時間反応することにより行われる、請求項5に記載の低分子量グリコサミノグリカン又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
- 前記ステップ1において、前記ヒドラジン処理による脱アセチル化反応は、触媒存在下で行われ、前記触媒は、硫酸ヒドラジン、塩酸ヒドラジン、塩酸及び硫酸から任意に選ばれ、且つ前記反応溶液における触媒の濃度は、0.5%〜2.5%の範囲である、請求項7に記載の低分子量グリコサミノグリカン又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
- 前記ステップ2において、前記亜硝酸処理による脱アミノ化解重合は、氷浴又は室温の条件下において、ステップ1で得られたフコシル化グリコサミノグリカンの部分的脱アセチル化産物を、4〜6mol/L且つpH1〜5の亜硝酸溶液で5分間〜60分間処理した後、アルカリ性溶液でpH8又はそれ以上に調整して反応を中止させ、その後、随意に下記1〜3の何れか1種の処理を施すことにより行われる、請求項5に記載の低分子量グリコサミノグリカン又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
処理1:反応溶液に3〜5倍体積のエタノールを加え、静置、遠心して沈降物を得た後、産物を限外濾過又はクロマトグラフィーで精製する。
処理2:水素化ホウ素ナトリウム又はシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いて、反応産物の還元性末端2,5−脱水タロースを糖アルコールに還元し、その後、上記処理1のステップに従って産物を精製する。
処理3:還元的アミノ化反応により反応産物の還元性末端2,5−脱水タロースを糖アミン又はN−置換の糖アミンに還元し、その後、上記処理1のステップに従って産物を精製する。 - 抗凝固効果を示す有効量で請求項1又は3に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩と、賦形剤とを含んでなる、薬物組成物。
- 前記薬物組成物の形態は、注射用水溶液又は注射用凍結乾燥粉体である、請求項10に記載の薬物組成物。
- 請求項1に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の、静脈血栓塞栓、動脈血栓塞栓、虚血性心疾患又は虚血性脳血管障害を予防、治療するための薬物の製造における使用。
- 請求項10に記載の薬物組成物の、静脈血栓塞栓、動脈血栓塞栓、虚血性心疾患又は虚血性脳血管障害を予防、治療するための薬物の製造における使用。
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