CN102329397B - 一种岩藻糖化糖胺聚糖衍生物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗凝血活性的岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯(Carboxylic ester of Fucosylated Glycosaminoglycans，CEFG)及其药学上可接受的盐、及其制备方法、含有CEFG或其盐的药物组合物、以及它们在制备抗凝血药物中的用途。所述的CEFG的组成单糖包括D-葡萄糖醛酸或其酯(D-GlcU)、D-2-脱氧-2-乙酰氨基半乳糖硫酸酯(D-GalNAcS)、L-岩藻糖硫酸酯(L-FucS)，以摩尔比计，D-GlcU∶D-GalNAc∶L-Fuc∶-OSO₃ ^-的比例范围为1∶(1±0.3)∶(1±0.3)∶(3.5±0.5)。其中，D-GlcU的酯化程度不低于20％；所述CEFG重均分子量为3000～20000Da。所述糖基化硫酸软骨素酯化衍生物具有强效的抗凝血活性，可用于制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物。

Description

一种岩藻糖化糖胺聚糖衍生物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有抗凝活性的岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯(Carboxylic esterof the Fucosylated Glycosaminoglycans,CEFG)及其制备方法，以及含有该CEFG或其药学上可接受的盐的药物组合物。

背景技术

心脑血管疾病是最主要的人类致死性病因，每年夺走1200万人的生命，接近世界总死亡人数的1/4。血栓形成是心脑血管疾病的主要病因之一，包括抗凝药物在内的抗血栓药物是临床应用极为广泛和重要的心脑血管疾病治疗药物，在国内国际医药市场上占有重要地位。包括香豆素类（口服VitK依赖的蛋白酶抑制剂）以及肝素类（凝血酶及因子X抑制剂）的主要抗凝血药物的临床应用已经长达60余年，这些药物具有相对明确的药效以及药理学作用机制，但也存在明显的临床应用缺陷：肝素类药物主要作用靶点是因子IIa和Xa(f.IIa,f.Xa)，其位于凝血瀑布的共同途径，此类药物的应用缺陷包括靶点相关的严重出血倾向、血小板减少症、骨骼及脂质代谢影响等；香豆素类抗凝药物的缺陷包括其抑制系列凝血因子合成所致的严重出血倾向、起效慢、个体差异大等。因此，临床上对于具有优势药理药效作用特点的新型抗凝药存在迫切需要。

岩藻糖化糖胺聚糖(Fucosylated Glycosaminoglycans,FGAG)是一种存在岩藻糖侧链取代的糖胺聚糖类似物，其多糖主链类似硫酸软骨素，由己糖醛酸、氨基己糖构成的二糖结构单元顺次连接形成，主链及侧链糖羟基均可存在硫酸酯化基团。天然FGAG主要来源于棘皮动物海参的体壁或内脏，其具有[→4)D-GlcUA(β1→3)D-GalNAc(1→]的主链结构单元，其侧链硫酸岩藻糖则以(α1→3)糖苷键连接于D-GlcUA（J Biol Chem,1988,263(34):18176-18183和JBiol Chem,1991,266(21):13530-13536）。天然FGAG具有显著抗凝血活性，其特点是具有强效抑制内源性因子X酶(f.Xase)活性，并存在显著的HCII依赖的抗凝血酶(f.IIa)活性（Blood,1995,85(6):1527-1534;Blood,2009,114:3092-3100）。

与原型天然肝素类似，原型FGAG存在广泛而矛盾的非选择性药理作用，包括血小板诱导聚集以及其它凝血因子影响等（中国药理学报,1985,6(2):107-109;Thromb Haemost,1997,65(4):369-373；Thromb Research,1996,83(3):253-264）。作为糖胺聚糖衍生物，FGAG结构中，由葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖组成的聚糖主链上存在多种特定官能团及取代基，如羟基、羧基及其取代硫酸酯基、乙酰基、岩藻糖基等，对这些官能团和取代基以及主链聚合度等进行结构修饰，对创制新靶点新机制抗凝抗血栓药物具有重要意义。如中国专利公开CN101735336A和CN101724086A公开了制备低聚岩藻糖化糖胺聚糖的方法，通过在水相介质中用第四周期过渡金属离子催化的过氧化物解聚法解聚岩藻糖化糖胺聚糖制备得到了低聚产物，该产物是内源性因子X酶的强效抑制剂，具有良好的抗凝抗血栓活性，可用于预防和/或治疗血栓性疾病。

等对来源于海参Ludwigothurea grisea的岩藻糖化糖胺聚糖的羧基经过NaBH₄还原修饰得到了一个新的化合物，对该化合物体内抗静脉和动脉血栓实验研究发现，其抗动脉血栓活性优于静脉血栓（Blood Coagulation and Fibrinolysis,2004,15:45-54）。目前，未见有岩藻糖化糖胺聚糖的羧基进行酯化修饰以及对其生物学活性研究的公开报道。

本发明人首次对棘皮动物海参来源的岩藻糖化糖胺聚糖的葡萄糖醛酸羧基进行了酯化反应结构修饰，制备得到了羧基酯化衍生物，对这些衍生物进行抗凝活性研究发现该系列产物具有良好的抗凝血活性。抗凝机制研究惊奇发现，与对应FGAG相比，适当的羧基酯化产物可以提高f.Xase抑制活性与HC-II依赖的抗凝血酶活性的比值，理论上具有更好的抗血栓应用价值，具有重要的临床治疗和/或预防血栓性疾病的潜在应用价值。

发明内容

本发明目的首先是提供一种岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯（Carboxylic Ester ofFucosylated Glycosaminoglycans,CEFG）及其药学上可接受的盐，所述CEFG是具有式(I)结构的同系糖胺聚糖衍生物或其混合物，

式(I)中：

n是均值约为3～22的整数；

-D-GlcUAEs-β1-，为-β-D-葡萄糖醛酸酯-1-基；

-D-GalNAc-β1-，为-β-D-N-乙酰氨基半乳糖-1-基；

L-Fuc-α1-，为α-L-岩藻糖-1-基；

R₁为-H或D-GalNAcS-β1-；

R₂是-H、-4-[(L-FucS-α1-O-)-D-GlcU]；

R’相互独立地为-OH或-OSO₃ ^－；

R是H，或C1-C6直连或支链的烷基、烯基、烷氧烷基、羟基；C6-C12的取代芳基、取代环烃基、取代的杂环基；其中，以摩尔分数计，R为非氢基团的比例(即酯化程度)不低于20%。

本发明优选的R基团是乙基或苄基。

所述CEFG的重均分子量范围为3000～20000Da。

本发明之CEFG的分子量可采用高效凝胶色谱法(HPGPC)检测。以重均分子量计，本发明选择的CEFG的分子量范围为约3,000～20,000Da(即式(I)所示同系物的n的均值约3～22)，优选分子量范围为约6,000～15,000Da(式(I)所示同系物的n的均值约3～16)。

本发明之CEFG的多分散指数(PDI,重均/数均分子量之比，Mw/Mn)一般介于1.0至1.8之间；优选的CEFG的PDI介于1.1至1.5之间。

本发明之CEFG可以是其药学上可接受的碱金属、碱土金属等的盐，类似地，所述CEFG也可以是使其与碱性有机基团的形成的酯。本发明优选的CEFG的药学上可接受的盐为CEFG的钠盐、钾盐或钙盐。

本发明所述CEFG是棘皮动物门海参纲动物体壁和/或内脏提取的岩藻糖化糖胺聚糖(Fucosylated Glycosaminoglycans，FGAG)解聚产物的羧基酯化衍生物和/或者是所述FGAG羧基酯化后的再解聚产物。

本发明研究发现，所述CEFG具有确切强效的抗凝活性，其延长人质控血浆2倍活化部分凝血活酶时间（APTT）所需药物浓度小于9μg/ml。

本发明惊奇发现：所述CEFG与对应的同分子量的FGAG相比，其抗f.Xase活性与HC-II依赖的抗凝血酶活性效价比显著提高，这提高了药物作用的选择性，具有降低出血倾向的应用潜力。

本发明的进一步的目的是提供一种对岩藻糖化糖胺聚糖的葡萄糖醛酸羧基进行酯化反应制备酯化衍生物（CEFG）的方法。所述CEFG的制备方法包括：

(1)以棘皮动物体壁和/或内脏来源的FGAG为原料，通过糖醛酸羧基酯化反应获得FGAG的羧基酯化产物，所得羧基酯化产物通过解聚反应获得所需分子量范围的CEFG产物；或

(2)以棘皮动物体壁和/或内脏来源的FGAG解聚产物为原料，通过糖醛酸羧基酯化反应获得羧基酯化的所需分子量范围的CEFG产物。

所述酯化反应可包括但不限于以下步骤，其中，方法(1)包括如下步骤：

步骤1，制备岩藻糖化糖胺聚糖(FGAG)的铵盐。该步骤中，可选择将FGAG经强酸型阳离子交换树脂(氢型)转化成氢型，在电导率仪和/或pH计监测下与有机胺或有机氢氧化氨中和反应形成FGAG季铵盐；或者，直接将化学计量的FGAG与有机季铵在水溶液中进行中和反应获得FGAG季铵盐。所得FGAG季铵盐经干燥处理后用于进一步的化学反应。

步骤2：FGAG羧基酯化产物的制备。步骤1所得FGAG季铵与化学计量的卤代烃在非质子化溶剂中反应，反应产物经分离纯化获得FGAG的羧基酯化产物。

步骤3：CEFG产物的制备。步骤2所得FGAG羧基酯化产物溶解成水溶液，过氧化物法将其解聚为所需分子量范围的解聚产物，反应产物经分离纯化即为所需的CEFG。

方法(2)包括如下步骤：步骤1是制备FGAG解聚产物的季铵盐，步骤2是制备解聚FGAG的羧基酯化产物。所述步骤以FGAG解聚产物为反应起始物，其步骤同方法(1)之步骤1和步骤2。

方法(1)和(2)所述步骤2中的卤代烃反应物是与所需酯化产物CEFG的酯基相对应的卤代物，其可以为卤代烷、卤代烯烃、卤代芳烃或杂环类的烃。

方法(1)和(2)所述步骤2中的溶剂可以但不限于是二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜（DMSO）、CH₂Cl₂、CHCl₃等非质子化溶剂。

所述酯化步骤FGAG在反应体系中的质量分数约为0.05%～15%，卤代烃在反应体系中的质量分数约为0.5%～30%。

所述酯化反应过程的常规工艺参数为：反应温度范围应根据所选溶剂的沸点来确定，一般地为10～140℃；反应时间为4～36h；反应可以在常压或加压条件下进行；反应可以选择氮气、惰性气体保护下进行，也可以在常压条件下与大气环境相通进行。

方法(1)所得FGAG羧基酯化产物的解聚方法：将FGAG羧基酯化产物配成质量分数为0.05%～10%的水溶液，向所得水溶液中加入过氧化物FGAG至质量分数0.05%～5%，加入用作催化剂的过渡金属离子盐FGAG或原型酯化衍生物至质量分数0.01%～1%，在20～60℃下反应至FGAG或原型酯化衍生物被解聚到所需分子量范围，分离纯化解聚产物，并转化为所需的药学上可接受的盐的形式。

反应产物CEFG可以通过本技术领域已知方法纯化（CN101735336A），例如通过透析法或超滤法去除小分子盐等杂质，或通过凝胶层析或DEAE离子交换层析进一步纯化等。

所述透析去杂处理过程中，可根据目标CEFG分子量大小的要求选择适宜截留分子量的透析膜或超滤膜包，优选截留分子量为3000Da。透析时间需根据特定处理条件确定，通常不少于6小时。

所得CEFG产物还可以通过阳离子交换以制备成单盐形式，如钠盐、钾盐或钙盐等。

CEFG产物的成盐过程可以采用先把样品交换成氢型，然后用相应的碱进行中和得到CEFG对应的盐；亦可优选动态离子交换成盐法直接在柱上交换成盐，其中可选择采用强酸性阳离子交换树脂。树脂柱预处理、样品上样与洗脱均可按常规方法进行。本发明方法中优选的样品上样质量分数为约2%～5%。

本发明所述FGAG是来源于棘皮动物海参纲的岩藻糖化糖胺聚糖，其结构特征是存在约1:1±0.3摩尔比的GlcUA和GalNAc(硫酸酯)以及不同摩尔比的岩藻糖(硫酸酯)。海参品种及其组织来源不同或提取方法的差异可导致FGAG的单糖组成比例、侧链存在形式以及多糖硫酸化程度等方面的不同，但这些差异均不涉及FGAG存在羧基的结构特征，因此不影响本发明所述酯化方法的实施和应用。本发明所述FGAG的来源棘皮动物可选自但不局限于梅花参（Thelenota ananas Jaeger）、巨梅花参（Thelenota anax H.L.Clark）、刺参（Apostichopus japonicus Selenaka）、格皮氏海参（Pearsonothuria graeffeiSemper）、玉足海参（Holothuria leucospilota Brandt）、黑乳参（Holothuria nobilisSelenka)、蛇目白尼参（Bohadschia argus Jaeger）、绿刺参（Stichopus chloronotusBrandt）、红腹海参（Holothuria edulis Lesson）、中华海参（Holothuria sinica Liao）、海地瓜（Acaudina molpadioides Semper）和糙海参（Holothuria scabra Jaeger）等。显然，本领域技术人员可以理解，对于产于世界各地的其它品种海参，其来源的符合上述结构特征的岩藻糖化糖胺聚糖均可以采用本发明所述方法酯化以获得所需的酯化FGAG衍生物，因此，本发明方法不受特定海参品种的限制。

本发明所得CEFG产物的酯化程度可通过NMR法检测，也可应用化学分析方法检测，如芳香族酯化产物还可以采取皂化水解后紫外分光光度法来确定酯化程度。一般地，以本发明方法制备的FGAG的羧基酯化产物中，根据产物NMR检测谱图计算，以摩尔百分比计，CEFG羧基酯化程度可为20%～100%。

本发明所述CEFG具有确切的抗凝血活性，因此具有明确的药用价值。CEFG具有良好的水溶性，因此易于制备成溶液型制剂或其冻干制品。作为多糖类成分，其口服生物利用有限，因此优选制备成胃肠外给药剂型，其制剂制备可以按照本领域内熟知的技术方法进行。

因此，本发明的又一目的是提供一种药用组合物，所述药用组合物包括本发明所述CEFG以及药学上可接受的辅料。本发明所述CEFG具有强效的抗凝血活性，因此可以用于不同程度的血栓性疾病的预防和治疗，例如血栓形成性心血管疾病、血栓性脑血管病，肺静脉血栓、周围静脉血栓、深静脉血栓、周围性动脉血栓等。因此，本发明可提供所述组合物在治疗和预防心血管疾病的药物制备中的应用。

附图说明

图1为梅花参FGAG及其低聚乙酯化衍生物CEFG-1的HPGPC图谱；

图2A为梅花参乙酯化衍生物CEFG-1¹H NMR谱图；

图2B为梅花参乙酯化衍生物CEFG-1DEPT135¹³C NMR谱图；

图3A为梅花参苄酯化衍生物CEFG-2¹H NMR谱图；

图3B为梅花参苄酯化衍生物CEFG-2¹³C NMR谱图；

图4为梅花参乙酯化衍生物CEFG-A5抗f.Xase活性数据。

具体实施方式

以下实施例是对本发明内容的详细说明，所述实施例不构成对本发明范围的限制。

【实施例1】FGAG羧基乙酯化产物的制备

1.1材料

梅花参（Thelenata ananas Jaeger），市售品，去内脏干燥体壁；

H₂O₂,CH₃COONa·3H₂O，NaCl，NaOH，Cu(CH₃COO)₂·H₂O,四丁基氢氧化铵、溴乙烷、N,N-二甲基甲酰胺、氢氧化钠、氯化钠和乙醇等所用试剂均为市售分析纯试剂。

1.2方法

（1）岩藻糖化糖胺聚糖(FGAG)提取制备：取棘皮动物梅花参干燥体壁，按文献方法(J Biol Chem,1991,266(21):13530-6)制备获得FGAG，得率0.75%，纯度98%（HPGPC,面积归一化法），重均分子量(Mw)，65,960。

（2）低分子岩藻糖化糖胺聚糖（FGAG）制备：取步骤(1)所得FGAG5.0g按照专利CN201110114860.4方法进行制备，得到解聚样品FGAG约4.12g，得率为82%，重均分子量（Mw）为11,580。

（3）FGAG季铵盐的制备：取步骤(2)所得FGAG100mg置于小烧杯中，加5ml去离子水使之溶解，经Dowex/r50w×850-100（H）交换树脂(35×2.5cm)转化成氢型，共收集洗脱液75ml，在电导率仪和pH计监测下，用0.4M四丁基氢氧化铵滴定，溶液终pH为9.40，经冷冻干燥24h后即得FGAG铵盐193.7mg。

（4）FGAG-羧基乙酯化产物的制备：取步骤（3）所得的FGAG季铵盐175.9mg（17.8mg留样检测）置于反应试管中，加1.5ml DMF溶解，加反应物溴乙烷0.5ml，在N₂保护下，避光，25℃搅拌反应24h。反应结束后，向反应溶液中加入0.5mol/LNaCl2ml，加无水乙醇20ml，有白色沉淀析出，4℃离心30min（4000rpm），倾出上清液，保留沉淀。将沉淀加3ml去离子水溶解，经Dowex/r50w×850-100（H）交换树脂(35×2.5cm)转化成氢型，用0.1mol/L的NaOH调pH为7.31，截留分子量为3500的透析袋去离子水透析24h，经冷冻干燥，即得FGAG-羧基乙酯化钠型产物（CEFG-1）约81.4mg。

（5）梅花参来源的FGAG及其乙酯化产物CEFG-1的理化参数、单糖组成及结构分析用波谱检测：高效凝胶色谱法(HPGPC)检测分子量及分布；电导法检测-OSO₃ ^-/-COO^-摩尔比；旋光度按照中国药典(2010版)二部附录VI E方法进行测定；特性黏数按照中国药典(2010版)二部附录VI G方法应用乌式粘度计测定。

Elson-Morgon法检测乙酰氨基半乳糖(D-GalNAc)含量，咔唑法检测葡萄糖醛酸(D-GlcUA)含量（酯化后也可以据此计算）（张惟杰，糖复合物生化研究技术(第二版)，浙江：浙江大学出版社，1999,19-20）；瑞士Bruker公司AVANCE AV500超导核磁共振¹H NMR甲基峰积分面积计算未乙酯化前样品的D-GalNAc/L-Fuc摩尔比，乙酯化后样品的酯化程度依据¹H NMR甲基峰积分面积扣除原料的积分面积计算。核磁共振谱仪(500MHz)检测NMR谱图(检测条件，溶剂D₂O，99.9Atom%D(Norell公司)；内标，trimethylsilyl-propionic acid(TSP-d4)；温度300K)。

1.3结果

FGAG及其CEFG-1的HPGPC检测谱图见附图1，理化性质参数、单糖组成检测结果见表1；¹H/¹³C NMR见附图2A和2B。

表1检测结果显示，与FGAG相比，CEFG-1分子量和特性粘度显著降低，而单糖组成保持稳定(约1:1:1:3.5)。电导率法测定检测-OSO₃ ^-/-COO^-摩尔比时发现，酯化反应产物只有一个拐点，这说明产物化学结构中不再存在游离的羧基，酯化程度完全。

附图2A¹H NMR谱图数据显示，CEFG-1化学结构中的葡萄糖醛酸乙酯中的亚甲基的化学位移约4.2ppm和甲基化学位移约1.20ppm，后者和结构中D-GalNAc的甲基的化学位移基本重合；附图2B所示DEPT135¹³C NMR谱图数据显示，CEFG-1化学结构中的葡萄糖醛酸乙酯中的亚甲基的C化学位移约63.7ppm和甲基化学位移约13.7ppm。根据乙酯化前后样品的¹H NMR甲基峰积分面积计算，乙酯化程度约为100%（附图2A）。

表1.梅花参来源的FGAG及CEFG-1的理化参数、单糖组成检测结果

【实施例2】FGAG-羧基烯丙基酯化产物的制备

2.1材料

海地瓜（Acaudina molpadioides Sepmper）市售品，去内脏干燥体壁；溴丙烯，为市售分析纯试剂，其余试剂同【实施例1】。

2.2方法

（1）FGAG季铵盐的制备

按照【实施例1】方法中的步骤（1）～（3）的制备，得到铵盐253.1mg。（2）FGAG-羧基烯丙酯化产物的制备

取步骤（1）所得的季铵盐253.1mg置于反应试管中，加3ml DMF溶解，加反应物溴丙烯120μl，在N₂保护，避光，30℃搅拌（450r/min）下反应24h。反应结束后，向反应溶液中加入0.5M NaCl3ml，加无水乙醇15ml，有白色沉淀析出，4℃离心30min（4000rpm），倾出上清液，得到沉淀。将沉淀加2ml去离子水溶解，经Dowex/r50w×850-100（H）交换树脂(35×2.5cm)转化成氢型，用0.1M的NaOH调pH为7.13，浓缩经G25除盐，经HPLC检测，洗脱液经冷冻干燥，即得羧基烯丙基酯化钠型产物56.2mg，酯化程度经¹H NMR确认为50%。

【实施例3】FGAG-羧基正丁基酯化产物的制备

3.1材料

刺参（Apostichopus japonicus Selenka,1867），市售品，去内脏干燥体壁；溴代正丁烷，三丁胺，均为为市售分析纯试剂，其余试剂同【实施例1】。

3.2方法

（1）FGAG季铵盐的制备

按照【实施例1】步骤（1）～（3）的方法应用三丁胺制备，得到铵盐166.6mg。

（2）FGAG-羧基正丁酯产物的制备

取步骤（1）所得的季铵盐166.6mg置于反应试管中，加2ml DMSO溶解，加反应物溴代正丁烷150μl，在N₂保护，30℃下反应20h。反应结束后，向反应溶液中加入0.5M NaCl2ml，加无水乙醇20ml，有白色沉淀析出，离心30min，倾出上清液，得到沉淀。将沉淀加3ml去离子水溶解，经Dowex/r50w×850-100（H）交换树脂(35×2.5cm)转化成氢型，用0.1M NaOH调pH为7.20，使用截留分子量为3500的透析袋去离子水透析18h，透析液经冷冻干燥，即得羧基正丁基酯化钠型产物62.6mg，得率87%，产物经¹H NMR确认其酯化程度为90%。

【实施例4】羧基1-烯丁基酯化产物的制备

4.1材料

玉足海参（Holothuria leucospilota Brandt），市售品，去内脏干燥体壁；4-溴-1-丁烯，为市售分析纯试剂，其余试剂同【实施例1】。

4.2方法

（1）FGAG季铵盐的制备

按照【实施例1】步骤（1）～（3）的方法制备，得到铵盐171.4mg。

（2）羧基1-烯丁基酯化产物的制备

取步骤（1）所得的季铵盐150.3mg置于反应试管中，加1.5ml DMF溶解，加反应物4-溴-1-丁烯150μl，在N₂保护，30℃搅拌（450r/min）下反应36h。反应结束后，向反应溶液中加入0.5M NaCl2ml，加无水乙醇20ml，有白色沉淀析出，离心30min，倾出上清液，保留沉淀。将沉淀加3ml去离子水溶解，经Dowex/r50w×850-100（H）交换树脂(35×2.5cm)转化成氢型，用0.1mol/L的NaOH调pH为7.78，使用截留分子量为3500的透析袋去离子水透析24h，透析液经冷冻干燥，即得羧基1-烯丁基酯化钠型产物64.1mg，产物经¹H NMR确认其酯化程度为90%。

【实施例5】羧基苄酯化产物的制备

5.1材料

梅花参（Thelenata ananas Jaeger），市售品，去内脏干燥体壁；苄索氯铵，氯化苄等所用试剂均为市售分析纯试剂，其余试剂同【实施例1】。

5.2方法

（1）低分子岩藻糖化糖胺聚糖制备：

按照【实施例1】步骤（1）～（2）的方法制备得到低分子量岩藻糖化糖胺聚糖FGAG-2约500mg，其重均分子量(Mw)，13,920。

（2）FGAG-2季铵盐的制备：

取步骤（1）所得FGAG-260.6mg置于离心管中，加0.72ml去离子水使之溶解，在漩涡振荡器震荡下滴加苄索氯铵溶液（182.7mg溶于900μl水中），则立即有白色沉淀析出，离心5min得到沉淀，沉淀加1ml水洗涤离心2次后，经常温真空干燥，得到FGAG-2季铵盐171.0mg。

（3）FGAG-2羧基苄基酯化产物的制备

取步骤（2）所得的FGAG-2季铵盐170mg置于反应试管中，加2.5ml DMSO溶解，加反应物氯化苄160μl，封管30℃下反应24h。反应结束后，向反应溶液中加入0.5M NaCl2.5ml，加无水乙醇25ml，有白色沉淀析出，离心30min得到沉淀。沉淀加2ml去离子水溶解,经Dowex/r50w×850-100（Na）离子交换树脂（35×2.5cm）动态法交换成钠盐，收集合并洗脱液。洗脱液经浓缩后过G-25凝胶柱除盐，收集合并无盐洗脱液，冷冻干燥后，即得FGAG-2羧基苄基酯化钠盐产物51.5mg。

（4）产物苄酯化程度的确定：按照文献US20050049222A1和美国药典（2008，Enoxaparin Sodium）提供的皂化方法进行测定苄酯化程度，同时根据¹H NMR进一步确认。

5.3结果

附图3A和3B所示¹H/¹³C NMR谱图数据显示，FGAG-2羧基苄基酯化衍生物化学结构中的苯环中的氢的化学位移约7.1-7.7ppm，苯环中C2-5的化学位移约为130ppm，苯环中C1约为136ppm，而苄基的亚甲基C的化学位移约为72ppm；这些化学位移数据说明本发明所述FGAG苄酯化方法可行可靠。

皂化方法分析和¹H NMR均确认，苄酯化程度为81.4%。

【实施例6】系列低分子量FGAG-羧基乙酯化产物的制备

6.1材料

梅花参（Thelenata ananas Jaeger），市售品，去内脏干燥体壁；其他试剂同【实施例1】。

6.2方法

（1）岩藻糖化硫酸软骨素制备：

按照【实施例1】方法中的步骤（1）制备获得FGAG，纯度98%（HPGPC,面积归一化法），重均分子量(Mw)，65,960。

（2）FGAG季铵盐的制备：

按照【实施例1】方法中的步骤（2）制备获得FGAG的季铵盐约10g。

（3）FGAG羧基乙酯化产物的制备：

取步骤（2）所得的8g季铵盐置于反应器中溶解于150ml DMF后，加入反应物溴乙烷15ml，在N₂保护下，25℃搅拌反应27h。反应结束后，向反应溶液中加入0.5M NaCl溶液150ml，加无水乙醇1.5L，有白色沉淀析出，离心30min得到沉淀。将沉淀加200ml去离子水溶解，经Dowex/r50w×850-100（Na）离子交换树脂（100×8.5cm）动态法交换成钠盐，收集合并洗脱液。洗脱液使用截留分子量为1000的透析袋去离子水透析24h，透析液经冷冻干燥，即得FGAG羧基乙酯化钠盐产物，其质量为3.67g，经¹H NMR确认乙酯化程度为97%。

（4）系列低分子量FGAG羧基乙酯化产物的制备：

取步骤（3）中制备的FGAG羧基乙酯化产物3.5g，按照专利CN201110114860.4方法进行解聚反应，通过控制反应条件（如控制反应时间）得到不同分子量的系列乙酯化产物共11个（编号为CEFG-A1～A11）。

（5）产物检测：按照实施例1中的方法分析产物的单糖组成，HPGPC法检测分子量及分布；经¹H NMR再次确认其酯化程度。

6.3结果

系列分子量FGAG-羧基乙酯化产物制备的实验结果见表2。表2中数据显示，原型FGAG乙酯化后再解聚获得的系列样品的酯化程度略有差异，但均大于95%，这说明先酯化后解聚的方法可靠。产物的分子量及其分布和单糖组成数据显示，产物分布均一，单糖的化学组成没有发生显著变化。

表2系列分子量FGAG-羧基乙酯化产物制备的实验结果

【实施例7】系列分子量FGAG-羧基苄酯化产物的制备

7.1材料

梅花参（Thelenata ananas Jaeger），市售品，去内脏干燥体壁；其他试剂同【实施例1】。

7.2方法

（1）系列分子量岩藻糖化糖胺聚糖制备：按照【实施例1】方法中的步骤（1）和（2）制备得到不同分子量的解聚岩藻糖化糖胺聚糖9个系列。

（2）系列分子量季铵盐的制备：

取步骤(1)所得系列分子量各约60mg置于反应管中，加0.72ml去离子水溶解，在漩涡振荡器震荡下滴加20%苄索氯铵溶液1ml，有白色沉淀生成，过滤得到滤饼，滤饼用2ml水洗涤两次后，经常温真空干燥，得到相应的季铵盐。（3）系列分子量羧基苄酯化产物的制备

取步骤（2）所得的季铵盐分别置于反应试管中，加2.0ml二氯甲烷溶解，加反应物氯化苄1ml，35℃搅拌下反应30h。反应结束后，向反应溶液中依次加入饱和NaCl0.5ml和无水乙醇1ml，有白色沉淀析出，4℃离心8min得沉淀，沉淀用饱和氯化钠溶液0.5ml洗涤离心，固体用无水乙醇洗涤三次。沉淀加10ml去离子水溶解，使用截留分子量为1000的透析袋去离子水透析48h，透析液经冷冻干燥，即得相应的羧基苄基酯化产物（CEFG-B1～B9），计算产物得率并检测产物的酯化程度。

7.3实验结果

实验结果见表3。

表3中数据显示，苄酯化产物的得率均大于20%，相应的苄酯化程度一般均大于60%，说明本发明提供的苄酯化方法不受原料样品分子量大小的影响。据此，本发明证实亦可以采用先解聚后酯化的方法制备得到相应分子量的酯化产物。产物分子量及其分布的数据显示，酯化产物的分子量分布较为均一（分散指数小于1.5），同时提示酯化过程中基本没有发生再次解聚现象。

表3系列分子量FGAG-羧基苄酯化产物制备的实验结果

【实施例8】羧基酯化衍生物的抗凝血活性

8.1材料

待测样品:按实施例6和7制备得到的不同分子量的系列乙酯化和苄酯化样品；这些样品的理化性质等信息见表2和3。

试剂：凝血质控血浆，活化部分凝血活酶时间（APTT）测定试剂盒，凝血酶时间（TT）测定试剂盒，凝血酶原时间测定试剂盒（PT-干粉），均为德国TECOGmbH公司生产；其他所有试剂为市售分析纯。

仪器：MC-4000血凝仪（德国美创公司）。

8.2方法

依据样品的实际情况用去离子水溶解配制成系列浓度，分别按照APTT、PT、TT凝血三项试剂盒说明书中提供的方法在MC-4000血凝仪上进行测试，以考察系列FGAG-羧基酯化衍生物的抗凝血活性。

8.3结果

实验结果如表4和5所示。

表4和5中的结果显示，梅花参来源的FGAG的乙酯化和苄酯化样品均可以显著延长人血浆APTT，延长2倍APTT的药物浓度均在9μg/ml以下，表明这些衍生物均能够有效抑制内源性凝血。这些衍生物的PT和TT的数据显示，FGAG的酯化衍生物基本不影响外源性凝血过程。比较这些衍生物的分子量和相应延长2倍APTT的药物浓度发现，分子量越大抗凝血活性越强，分子量是影响其抗凝血活性的主要因素之一。根据这一规律性结果，从保留FGAG血液学活性考虑，以重均分子量计，本发明优选的CEFG的分子量不低于6,000Da。

表4不同分子量系列乙酯化衍生物的抗凝血活性检测结果

^a PT为药物终浓度达到25μg/ml时的凝血酶原时间，其空白的PT为14.4±0.2s；

^b TT为药物终浓度达到12.5μg/ml时的凝血酶时间，其空白的TT为16.0±0.3s。

表5不同分子量系列苄酯化衍生物的抗凝血活性检测结果

^a PT为药物终浓度达到25μg/ml时的凝血酶原时间，其空白的PT为14.4±0.2s；

^b TT为药物终浓度达到12.5μg/ml时的凝血酶时间，其空白的TT为16.0±0.3s。

【实施例9】抗凝血活性靶点的选择性

9.1材料

待测样品:FGAG-3为按照本发明提供的解聚方法直接解聚、CEFG-A5为按照实施例6和CEFG-B4为按照实施例7的方法制备得到。

试剂：凝血酶（IIa），100NIH U/mg，HYPHEN BioMed（法国）；凝血酶检测生色底物（CS-0138），25mg/vial，HYPHEN BioMed（法国）；肝素辅因子II（HC-II），100μg/vial，HYPHEN BioMed（法国）；因子VIII（f.VIII），200IU/支，上海莱士血液制品有限公司产品；f.VIII检测试剂盒，试剂包括Reagents:R1:Human Factor X;R2:Activation Reagent,human Factor IXa,containing humanthrombin,calcium and synthetic phospholipids;R3:SXa-11,Chomogenic substrate,specific for Factor Xa;R4:Tris-BSA Buffer；HYPHEN BioMed（法国）。

仪器：Bio Tek-ELx808型酶标仪(美国)。

9.2方法

（1）抑制内源性因子X酶（抗f.Xase,Tenase）活性检测：采用f.VIII检测试剂盒结合f.VIII试剂建立的检测方法。系列浓度的FGAG-3、CEFG-A5和CEFG-B4溶液或空白对照溶液（Tris-BSA缓冲液R₄）30μl与2.0IU/ml因子VIII（30μl）混合后，顺次加入试剂盒试剂R₂（30μl）、R₁（30μl），37℃孵育2min后，加R₃（30μl），37℃精确孵育2min，以20%乙酸（30μl）中止反应并检测OD_405nm。根据空白对照（R₄）计算ΔOD，按文献（Sheehan J.P.&Walke E.K.,Blood,2006,107:3876-3882）中提供的公式计算各样品抑制f.Xase的IC₅₀值。

（2）HC-II依赖的抗凝血酶活性（抗IIa）检测：系列浓度的FGAG-3、CEFG-A5和CEFG-B4溶液或空白对照溶液（Tris-HCl缓冲液）30μl加入96孔酶标板后，加入30μl1μM的HC-II，混合，37℃孵育1min，然后加入30μl10U/ml的IIa，37℃孵育1min，加入30μl4.5mM的CS-0138，混合，37℃精确孵育2min，以20%乙酸（30μl）中止反应并检测OD_405nm。根据空白对照（Tris-HCl）计算ΔOD，按文献（Sheehan J.P.&Walke E.K.,Blood,2006,107:3876-3882）中提供的公式计算各样品抑制IIa的IC₅₀值。

9.3结果

见表6和附图4。

表6羧基酯化衍生物选择性作用于f.Xase

^[1]抗f.Xase-抗IIa效价比：抗IIa IC₅₀(μg/ml)/抗f.Xase IC₅₀(μg/ml)

附图4数据显示，羧基乙酯化衍生物的IC₅₀为19.4ng/ml，具有强效抗f.Xase活性。表6数据显示，与对应的FGAG相比，羧基酯化衍生物抗f.Xase活性[IC₅₀]与HC-II依赖的抗凝血酶活性[IC₅₀]的比值显著提高，理论上，羧基酯化修饰后产物的抗血栓活性近似而出血倾向呈降低趋势。

【实施例10】低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的冻干制品

10.1材料

实施例6所得梅花参来源的低分子量岩藻糖化糖胺聚糖乙酯化衍生物（CEFG-A5），其重均分子量15080Da。

10.2处方

原辅料名称	用量
		CEFG-A5	50g
注射用水	500ml
		共制成	1000支

10.3制备工艺

称取处方量的低分子量岩藻糖化糖胺聚糖乙酯化衍生物加注射用水至全量，搅拌使溶解完全，间歇式热压法灭菌。加入0.6％的药用活性炭，搅拌20min；使用布氏漏斗及3.0μm微孔滤膜脱炭过滤除去热源。测中间体含量。合格后用0.22μm的微孔滤膜过滤；灌装于管制西林瓶中，每瓶0.5ml，灌装过程监测装量，半压塞，置冷冻干燥箱内，按设定的冻干曲线进行冻干，压塞，出箱，轧盖，目检合格，得成品。

冻干过程：将样品进箱，降隔板温至-40℃，保持3h；冷阱降至-50℃，开始抽真空至300μbar。开始升华：1h匀速升温至-30℃，保持2h；2h匀速升温至-20℃，保持8h，真空保持200～300μbar；再进行干燥：2h升温至-5℃，保持2h，真空保持150～200μbar；0.5h升温至10℃，保持2h，真空保持80～100μbar；0.5h升温至40℃，保持4h，真空抽至最低。

Claims (16)

1.一种岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯及其药学上可接受的盐，其中：所述岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯的单糖组成包括D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖醛酸羧酸酯、D-2-脱氧-2-乙酰氨基半乳糖或其硫酸酯、L-岩藻糖或其硫酸酯；以摩尔比计，四种组成单糖及其与所含-OSO₃ ^－基，即D-葡萄糖醛酸以及D-葡萄糖醛酸羧基酯:D-2-脱氧-2-乙酰氨基半乳糖硫酸酯:L-岩藻糖硫酸酯:-OSO₃ ^－的比例范围为1:(1±0.3):(1±0.3):(3.5±0.5)；并且，以摩尔比计，D-葡萄糖醛酸羧酯在D-葡萄糖醛酸与D-葡萄糖醛酸羧酯总量中的比例，即D-葡萄糖醛酸的羧基酯化程度不低于20%；

所述岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯的重均分子量范围为3000～20000Da；

所述岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯的多分散指数介于1.0至1.8之间。

2.如权利要求1中所述的岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯是具有式(I)结构的同系糖胺聚糖衍生物的混合物，

式(I)中：

n是均值为3～22的整数；

-D-GlcUAEs-β1-，为-β-D-葡萄糖醛酸或其羧酸酯-1-基；

-D-GalNAc-β1-，为-β-D-N-乙酰氨基半乳糖-1-基；

-L-Fuc-α1-，为α-L-岩藻糖-1-基；

R₁为-H或-β-D-N-乙酰氨基半乳糖硫酸酯-1-基；

R₂是-H、-4-[(L-FucS-α1-O)-D-GlcUAEs]；

-4-[(L-FucS-α1-O)-D-GlcUAEs]，为-4-[(L-硫酸酯化岩藻糖-α1-O)-D-葡萄糖醛酸酯]；

R’相互独立地为-H或-OSO₃ ^－；

R是H，或C1-C6直连或支链的饱和的烷基和烯基；C6-C12的取代芳基；其中，以摩尔分数计，R为非氢基团的比例不低于20%。

3.如权利要求1或2所述的岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯中的酯化程度不低于80%；所述岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯的重均分子量范围为6000～15000Da；所述岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯的多分散指数值介于1.1至1.5之间。

4.如权利要求3所述的岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯是棘皮动物门海参纲动物体壁和/或内脏提取获得的岩藻糖化糖胺聚糖及其解聚产物的羧基酯化衍生物。

5.如权利要求4所述的岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述岩藻糖化糖胺聚糖的来源动物是棘皮动物门海参纲动物体壁和/或内脏，所述棘皮动物门海参纲动物为梅花参、巨梅花参、刺参、格皮氏海参、黑乳参、蛇目白尼参、绿刺参、红腹海参、中华海参、海地瓜和糙海参。

6.如权利要求2所述的岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯药学上可接受的盐，其特征在于，所述的R为烷烃基或芳香基；所述的烷烃基为甲基、乙基、烯丙基、烯丁基；所述的芳香基为苄基。

7.如权利要求1或2所述中的岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯药学上可接受的盐，其特征在于，所述药学上可接受的盐是岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯的碱金属、碱土金属盐及有机铵盐。

8.如权利要求7所述的岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯药学上可接受的盐，其特征在于，所述药学上可接受的盐是岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯的钠盐、钾盐或钙盐。

9.如权利要求1所述的岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯及其药学上可接受的盐的制备方法，所述的岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯的制备方法是：

方法(1)以棘皮动物体壁和/或内脏来源的岩藻糖化糖胺聚糖为原料，通过糖醛酸羧基酯化反应获得岩藻糖化糖胺聚糖的羧基酯化产物，所得羧基酯化产物通过解聚反应获得所需分子量范围的岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯产物；或

方法(2)以棘皮动物体壁和/或内脏来源的岩藻糖化糖胺聚糖之解聚产物为原料，通过糖醛酸羧基酯化反应获得羧基酯化的所需分子量范围的岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯产物。

10.如权利要求9所述的岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述方法(1)包括如下步骤：

步骤1，制备岩藻糖化糖胺聚糖的铵盐；该步骤中，将岩藻糖化糖胺聚糖经酸型阳离子交换树脂转化成氢型，在电导率仪和/或pH计监测下与有机胺中和反应形成岩藻糖化糖胺聚糖季铵盐；或者，直接将化学计量的岩藻糖化糖胺聚糖与有机季铵在水溶液中进行中和反应获得岩藻糖化糖胺聚糖季铵盐；所得岩藻糖化糖胺聚糖季铵盐经干燥处理后用于进一步的化学反应；

步骤2：岩藻糖化糖胺聚糖羧基酯化产物的制备；步骤1所得岩藻糖化糖胺聚糖季铵与化学计量的卤代烃在非极性溶剂中反应，反应产物经分离纯化获得岩藻糖化糖胺聚糖的羧基酯化产物；

步骤3：岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯产物的制备；步骤2所得岩藻糖化糖胺聚糖羧基酯化产物溶解成水溶液，过氧化物法将其解聚为所需分子量范围的解聚产物，反应产物经分离纯化即为所需的岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯。

11.如权利要求9所述岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述方法(2)包括如下步骤：制备岩藻糖化糖胺聚糖解聚产物的季铵盐，以及制备解聚岩藻糖化糖胺聚糖的羧基酯化产物；所述步骤以岩藻糖化糖胺聚糖解聚产物为反应起始物，其步骤方法同权利要求10之步骤1和步骤2。

12.如权利要求10或11所述岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯制备方法，其特征在于：所述卤代烃反应物是与所需酯化产物岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯的酯基相对应的卤代物；所述溶剂可以但不限于是二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、CH₂Cl₂、CHCl₃非质子化溶剂。

13.如权利要求10所述岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯的制备方法，其特征在于，其步骤3所述过氧化解聚方法是：将岩藻糖化糖胺聚糖羧基酯化产物配成质量分数为0.05%～10%的水溶液，向所得水溶液中加入过氧化物至质量分数0.05%～5%，加入用作催化剂的过渡金属离子盐质量分数0.01%～1%，在20～60℃下反应至岩藻糖化糖胺聚糖或岩藻糖化糖胺聚糖羧基酯化衍生物被解聚到所需分子量范围，分离纯化解聚产物，并转化为所需的药学上可接受的盐的形式。

14.如权利要求1至8任一项所述岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯或其药学上可接受的盐的药物组合物，所述药物组合物含有有效抗抗凝血剂量的岩藻糖化糖胺聚糖羧酸酯或其药学上可接受的盐，以及药用赋形剂。

15.如权利要求14所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为注射用水溶液或注射用冻干粉针剂。

16.如权利要求14或15所述药物组合物在制备血栓性疾病的治疗和/或预防药物中的用途。

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