CN103214591B - 一种含末端2,5-脱水塔罗糖或其衍生物的低分子量糖胺聚糖衍生物 - Google Patents

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Abstract

一种含有2,5-脱水塔罗糖、其糖醇、糖胺或N取代的糖胺单糖组分的低分子量岩藻糖化的糖胺聚糖(aTFG)，其制备方法，含所述aTFG的药用组合物及其在预防和/或治疗血栓性疾病中的应用。所述aTFG具有强效抗凝血活性，其作用于内源性凝血因子X酶，抑制血栓形成，因此可用于预防和/或治疗心脑血管疾病药物。

Description

一种含末端2,5-脱水塔罗糖或其衍生物的低分子量糖胺聚糖衍生物
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种含末端2,5-脱水塔罗糖或其衍生物的低分子量糖胺聚糖衍生物(2,5-anhydrated Talose terminal Low-molecular-weight Fucosylated Glycos-aminoglycan,aTFG)，其制备方法，含所述aTFG的药用组合物及其在制备预防和/或治疗心脑血管疾病的药物中的应用。
背景技术
心脑血管疾病的发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高和并发症多，严重危害人类的健康和生活质量。血栓形成是心脑血管疾病的主要病因之一，包括抗凝药物在内的抗血栓药物是心血管疾病治疗的临床一线用药，在医药市场上占有重要地位。抗凝血药物主要包括香豆素类和肝素类抗凝药物等，这些药物具有明确的药效以及药理学作用机制，但也存在明显的临床应用缺陷：香豆素类抗凝药物的缺陷包括其抑制系列凝血因子合成所致的严重出血倾向、起效慢、个体差异大等；肝素类药物主要作用靶点因子IIa和Xa(f.IIa,f.Xa)位于凝血瀑布的共同途径，此类药物的应用缺陷主要是与靶点相关的严重出血危险和血小板减少症等。因此，临床需要具有优势药理药效作用特点的新型抗凝药物。新型抗凝血药研发的核心是有效避免出血倾向，而低出血倾向的创新药物研究尚未取得突破性进展。
棘皮动物来源的岩藻糖化糖胺聚糖(Fucosylated Glycosaminoglycan,FGAG)是一类具有岩藻糖侧链取代的糖胺聚糖类衍生物，其具有葡萄糖醛酸(GlcUA)和乙酰氨基半乳糖(GalNAc)构成的类似硫酸软骨素的主链，又具有以α-1,3糖苷键连接于主链葡萄糖醛酸基的岩藻糖(L-Fuc)侧链，主链及侧链糖羟基均存在不同程度的硫酸酯化(J.Biol.Chem.,1996,271:23973–23984;Mar.Drugs,2013,11:399–417)。天然来源的FGAG具有很强的抗凝血活性(Thromb.Haemost.,2008,100:420–428;J.Biol.Chem.,1996,271:23973–23984)。
然而，天然FGAG仍存在广泛而矛盾的药理作用，包括诱导血小板聚集、产生出血倾向和激活XII等(Thromb.Haemost.,1988,59:432–434；Thromb.Haemost.,1997,65(4):369–373；Thromb.Haemost.,2010,103:994–1004)。适当解聚的低聚FGAG可保留天然FGAG的抗凝活性而降低其血小板激活活性(Thromb.Haemost.,1991,65:369–373)。中国授权专利CN101724086B和CN101735336B公开了制备低聚FGAG的方法，采用过氧化氢解聚法解聚FGAG得到了低聚产物，所得产物的出血倾向显著降低。
由于FGAG为分子量较大、结构复杂的糖胺聚糖衍生物，在降低其副作用而保留药理学活性的前提下，实现工艺有效可控的解聚以获得具有特征末端结构的低分子量衍生物，技术上有很大难度。鉴于过氧化氢解聚法缺乏糖苷键选择性并且过程控制较复杂，本发明建立了一种新的FGAG解聚方法---脱酰脱氨基解聚法，该方法首先通过肼解脱乙酰基反应使FGAG所含的D-2-(N-乙酰基)氨基-2-脱氧半乳糖(D-GalNAc)发生部分脱乙酰化反应，获得含D-2-氨基-2-脱氧半乳糖基(D-GalNH2)的FGAG部分脱乙酰化产物，继而采用亚硝酸处理使之发生脱氨基解聚反应，由此获得含有末端2,5-脱水塔罗糖基或其还原衍生物的FGAG解聚产物。现有技术中尚无FGAG脱酰脱氨基解聚法的报道，也没有具有末端2,5-脱水塔罗糖或其还原衍生物的低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的报道。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种低分子量糖胺聚糖衍生物及其药学上可接受的盐，所述低分子量糖胺聚糖衍生物是具末端2,5-脱水塔罗糖或其还原衍生物的低分子量岩藻糖化糖胺聚糖(2,5-anhydrated Talose or its reduced derivative terminal Low-molecular-weight Fucosylated Glycosaminoglycan，aTFG)，其制备方法，含所述aTFG的药用组合物及其在制备预防和/或治疗心脑血管疾病的药物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种低分子量糖胺聚糖衍生物及其药学上可接受的盐，所述低分子量糖胺聚糖衍生物的组成单糖包括己糖醛酸、氨基己糖、脱氧己糖及2,5-脱水塔罗糖或其还原衍生物；其中，己糖醛酸为D-β-葡萄糖醛酸，氨基己糖为2-N-乙酰基氨基-2-脱氧-D-β-半乳糖或2-氨基-2-脱氧-D-β-半乳糖或-β-D-2-硫酸氨基-2-脱氧半乳糖，脱氧己糖为L-α-岩藻糖，2,5-脱水塔罗糖还原衍生物为2,5-脱水塔罗糖醇、2,5-脱水塔罗糖氨、N-取代的2,5-脱水塔罗糖氨；
以摩尔比计，所述aTFG的组成单糖含量比例范围是，己糖醛酸:氨基己糖:脱氧己糖=1:(1±0.35):(1±0.3)；以摩尔比计，2,5-脱水塔罗糖和/或其还原衍生物在全部组成单糖中所占比例不低于3.0%。
本发明所述aTFG的重均分子量Mw范围为2.5kD～20kD；
本发明所述aTFG的多分散指数(Mn/Mw)介于1.0至1.8之间。
本发明所述aTFG是具有式(I)结构的同系糖胺聚糖衍生物的混合物，
式(I)中：
n是均值为3～21的整数；
-D-GlcUA-β1-，为-β-D-葡萄糖醛酸-1-基；
-D-GalN-β1-，为-β-D-2-乙酰氨基-2-脱氧半乳糖-1-基或-β-D-2-氨基-2-脱氧半乳糖或-β-D-2-硫酸氨基-2-脱氧半乳糖；
L-Fuc-α1-，为α-L-岩藻糖-1-基；
R’相互独立地为-OH或-OSO3 －；
R3为–H、-SO3 －或乙酰基； 
R1为-H或β-D-2-乙酰氨基-2-脱氧半乳糖硫酸酯-1-基；
R2为-H或-β-D-葡萄糖醛酸-1-基，或式(II)所示基团：
式中，-D-GlcUA-β1-，L-Fuc-α1-，R’同上文定义；
anTal为2,5-脱水塔罗糖、其糖醇、糖胺或N-取代糖胺，
m为1或2；
R4任选为=O、-O、-NH2、-NHR5，其中R5为C1-C6直链或支链烷基，C7-C12芳基；
并且，所述式(I)结构同系糖胺聚糖衍生物的混合物中，以摩尔比计，R2为式(II)基团 的化合物与R2为-H或-β-D-葡萄糖醛酸-1-基的化合物的比例不低于2:1。
本发明之aTFG的分子量可采用高效凝胶色谱法(HPGPC)检测。以重均分子量计，本发明选择的aTFG的分子量范围为约2,500～20,000Da，即，式(I)所示同系物的n的均值约3～21，优选分子量范围为约5,000～12,000Da，即，式(I)所示同系物的n的均值约5～15。
本发明之aTFG的多分散指数(PDI，重均/数均分子量之比，Mw/Mn)一般介于1.0至1.8之间；优选的aTFG的PDI介于1.1至1.5之间。
本发明之aTFG可以是其药学上可接受的碱金属、碱土金属等的盐，类似地，所述aTFG也可以是使其与碱性有机基团形成的酯。
本发明所述aTFG的药学上可接受的盐优选为aTFG的钠盐、钾盐或钙盐。
本发明所述aTFG是棘皮动物门海参纲动物体壁和/或内脏来源的岩藻糖化糖胺聚糖(Fucosylated Glycosaminoglycan，FGAG)的脱氨基解聚产物，或者是所述解聚产物的还原性末端的还原衍生化产物，为此，本发明又一目的是进一步提供一种以FGAG为原料制备本发明aTFG的方法，所述aTFG的制备方法包括如下步骤：
步骤一、肼处理棘皮动物来源的岩藻糖化糖胺聚糖(FGAG)，使之所含的氨基己糖(GalNAc)发生部分脱乙酰化反应，获得FGAG的部分脱乙酰化产物；获得的脱乙酰化产物可进行磺化反应使游离氨基磺化为硫酸化氨基衍生物。
步骤二、亚硝酸处理步骤一所得FGAG的部分脱乙酰化产物，使之发生脱氨基反应并解聚，获得还原性末端为2,5-脱水塔罗糖基的低分子量岩藻糖化糖胺聚糖，所得低分子量岩藻糖化糖胺聚糖任选进行还原性末端的还原反应，包括将2,5-脱水塔罗糖端基还原成糖醇、糖胺或N取代的糖胺，所述具有末端2,5-脱水塔罗糖基或其糖醇、糖胺、N取代糖胺的低分子量岩藻糖化糖胺聚糖即为本发明所述的aTFG。
本发明所述aTFG制备方法中，其步骤一所述肼处理脱乙酰化反应的方法是：将棘皮动物来源的岩藻糖化糖胺聚糖加入无水肼或水合肼溶液中，在有或无催化剂存在下，搅拌中于75℃-125℃的温度下反应2-14h。
步骤一所述脱乙酰化反应优选在催化剂存在下进行，所述催化剂可选择采用硫酸肼、盐酸肼等，亦可向反应溶剂中加入少量硫酸和/或盐酸等强酸作为催化剂，所加入的硫酸和/或盐酸可以与溶剂肼或水合肼反应生成硫酸肼和/或盐酸肼，后者可起到催化反应的作用。在本发明优选的实施方案中，所述反应溶液中的催化剂的浓度为0.5%～2.5%。
步骤一所述脱乙酰化反应结束后，反应溶液可减压蒸干，亦可选择采用醇沉法，如加入等体积80%乙醇，以沉淀所得产物。醇沉过程中加适量饱和氯化钠溶液，可使沉淀更为完全。反应所得FGAG部分脱乙酰化产物可选择直接干燥并用于步骤二的脱氨基解聚反应，或者选 择采用碘酸氧化反应除去过量的肼和酰肼衍生物之后，选择采用适当方法纯化后，再干燥并用于步骤二的脱氨基解聚反应。
步骤一所得FGAG部分脱乙酰化产物可以采用核磁波谱(NMR)检测技术进行确定脱乙酰化程度，具体地说，脱乙酰化程度检测是比较原料化合物和产物中的D-GalNAc和L-Fuc所含甲基质子峰的面积的比例，通过所述甲基峰的积分比可计算反应产物的脱乙酰化程度。
由于步骤二的脱氨基解聚是快速和可化学计量的反应，因此步骤一所得FGAG部分脱乙酰化产物的脱乙酰化程度可决定脱氨基解聚终产物aTFG的分子量。本发明人研究发现，当步骤一所得FGAG部分脱乙酰化产物的脱乙酰化程度约为5%-35%时，其脱氨基解聚终产物aTFG的分子量范围可在约4000Da-20000Da范围内。
本发明所述aTFG制备方法的步骤二中，所述亚硝酸处理的脱氨基解聚法的具体步骤一般选择为：在冰浴或室温条件下，将步骤一所得FGAG部分脱乙酰化产物用pH(1.5～4.5)的亚硝酸溶液(4～6)mol/L处理5min～60min后，用碱性溶液如NaOH等调pH8或以上以终止反应。然后任选进行：
(1)向反应溶液中加入3-5倍体积的乙醇，静置，离心得沉淀，超滤或层析纯化所得产物；
(2)采用硼氢化钠或氰基硼氢化钠，将反应产物的还原性末端2,5-脱水塔罗糖(anTal)还原成糖醇(anTalOH)，然后按(1)所述步骤纯化所得产物；
(3)通过还原氨基化反应将反应产物的还原性末端2,5-脱水塔罗糖还原成糖胺或N-取代的糖胺，然后按(1)所述步骤纯化所得产物。
步骤二之(2)所述端基还原反应，一般是在氢氧化钠调pH(8～9)终止脱氨基解聚反应后，加入硼氢化钠和/或氰基硼氢化钠浓度达(0.05～0.5)mol/L，50℃下搅拌20min～60min使anTal充分反应转化为anTalOH。将反应液冷却至室温后，用酸调节pH(3～4)除去过量的硼氢化钠和/或氰基硼氢化钠，再碱性溶液如NaOH中和，然后按(1)所述步骤纯化所得产物。
步骤二之(3)是在碳酸氢铵或有机胺及还原剂存在下将末端anTal还原氨基化，即铵盐或有机胺与anTal醛基反应生成席夫碱，后者在还原剂如氰基硼氢化钠存在下被还原成次级胺。
本发明所得aTFG产物的可通过NMR法检测。一般地，根据产物NMR检测谱图计算，以摩尔比计，本发明所述aTFG产物中，具有末端2,5-脱水塔罗糖或其还原衍生物的化合物可占全部解聚产物的60%～97%。
本发明所述方法之D-GalNAc脱乙酰基、D-GalNAc脱氨基及anTal羰基还原与还原氨基化反应路线如“反应过程路线图”所示。该路线中，各化合物(1)～(5)中的R’、R5均同前文定义。对于本领域技术人员而言，采用还原氨基化反应，当R5为H、C1-C6直链或支链烷基、 C7-C12芳基时，路线图中的化合物(5)所示的反应终产物均可容易地获得。
(反应过程路线)
原型天然产物FGAG具有复杂的主侧链结构，有效实现其选择性的脱乙酰反应是一项关键的技术难点，而侧链L-Fuc容易发生酸水解，使得HNO2脱氨基解聚反应条件的控制尤为 重要。本发明所述的技术路线及其主要技术参数可以保证这些反应的顺利进行。
本发明所述方法中，所述aTFG反应终产物可以通过本技术领域已知方法纯化(CN101735336A)，例如通过透析法或超滤法去除小分子盐等杂质，或通过凝胶层析或DEAE离子交换层析进一步纯化等。
本发明方法中，所述透析去杂处理过程中，可根据目标分子量大小的要求选择适宜截留分子量的透析膜或超滤膜包，优选截留分子量为1000Da透析膜或超滤膜包透析去除小分子物质，透析时间需根据特定处理条件确定，通常不少于6小时。透析法亦可选择用于去除其它大分子杂质以及未解聚的FGAG或超过分子量范围aTFG。
本发明方法所得aTFG终产物还可以通过阳离子交换以制备成单盐形式，如钠盐、钾盐或钙盐等。本发明所述之aTFG产物的成盐过程可以采用离子交换法将所述aTFG交换成氢型，然后采用相应的碱进行中和得到aTFG对应的盐；亦可优选动态离子交换成盐法直接在柱上交换成盐。树脂柱预处理、样品上样与洗脱均可按常规方法进行。
本发明所述aTFG制备方法中，其“步骤一”所述起始原料为棘皮动物来源的岩藻糖化糖胺聚糖(fucosylated glycosaminoglycan,FGAG)。所述FGAG具有类似的硫酸软骨素主链，一般来说，该主链由葡萄糖醛酸(D-GlcUA)和2-(N-乙酰基)氨基-2-脱氧半乳糖(D-GalNAc)构成，两种组成单糖分别以–4)-D-GlcUA-(β-1-和-3)-D-GalNAc-(β-1-的糖苷键形式顺次连接；FGAG还具有岩藻糖(L-Fuc)侧链，一般地，L-Fuc侧链以α-1,3糖苷键连接于主链上的D-GlcUA；此外，FGAG主链中的D-GalNAc及侧链糖L-Fuc上的羟基均可能存在不同程度的硫酸酯化(J.Biol.Chem.,1996,271:23973–23984;Mar.Drugs,2013,11:399–417)。
用于制备本发明所述aTFG及其药学上可接受的盐的FGAG可来源于可选自但不局限于以下海参品种：花刺参(Stichopus variegates Semper)、糙海参(Holothuria scabra Jaeger)、玉足海参(Holothuria leucospilota Brandt)、红腹海参(Holothuria edulis Lesson)、蛇目白尼参(Bohadschia argus Jaeger)、绿刺参(Stichopus chloronotus Brandt)、中华海参(Holothuria sinica Liao)、梅花参(Thelenota ananas Jaeger)、海地瓜(Acaudina molpadioides Semper)、格皮氏海参(Pearsonothuria graeffei Semper)和黑乳参(Holothuria nobilis Selenka)。对于产于世界各地的其它品种海参，其来源的符合上述结构特征的FGAG均可以采用本发明所述方法脱氨基解聚获得所需终产物，因此，本发明方法不受特定海参品种的限制。
本发明人的研究显示，海参品种及其组织来源不同或提取方法的差异可导致FGAG的单糖组成比例、侧链存在形式以及多糖硫酸化程度等方面的不同。本领域技术人员容易理解，由于这些差异不涉及FGAG存在的乙酰氨基的结构特征，因此不影响本发明所述脱酰脱氨基解聚方法的实施和应用。
本发明研究发现，所述aTFG具有强效的抗凝活性，其倍增人质控血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)所需的药物浓度不高于12μg/mL。本发研究还确认，所述aTFG具有强效的抑制内源性因子X酶的活性，其EC50约为5～50ng/mL。由于因子X酶是内源性凝血途径中的最后一个酶学位点，是多种因素激发的凝血过程的限速位点，因此其抑制剂可具有显著的抗血栓活性而对生理性止血的影响较小(Blood,2010,116(22),4390–4391;Blood,2009,114,3092–3100)。
本发明所述aTFG及其药学上可接受的盐具有确切的抗凝血活性，因此具有明确的潜在药用价值。aTFG具有良好的水溶性，因此易于制备成溶液型制剂或冻干制品。作为多糖类成分，其口服生物利用有限，因此其药物组合物优选制备成胃肠外给药剂型，其制剂制备可以按照本领域内熟知的技术方法进行。
因此，本发明还提供了含有有效抗凝血剂量的上述的低分子量糖胺聚糖衍生物及其药学上可接受的盐，以及药用赋形剂的药物组合物，所述的药物组合物的剂型可以是注射用水溶液或注射用冻干粉针剂。
本发明所述aTFG具有强效的抗凝血活性，因此可以用于不同程度的血栓性疾病的预防和治疗，例如血栓形成性心血管疾病、血栓性脑血管病，肺静脉血栓、周围静脉血栓、深静脉血栓、周围性动脉血栓等。因此，本发明还提供所述低分子量糖胺聚糖衍生物(aTFG)、其药学上可接受的盐以及含有aTFG或其盐的药物组合物在制备防治血栓性疾病的药物中的应用，所述血栓性疾病为静脉血栓形成或动脉血栓形成或缺血性心脏病或缺血性脑血管病。
与现有技术相比，本发明所具备的优益性在于：
目前，见于报道的FGAG解聚方法主要由过氧化氢解聚法，该解聚方法缺乏糖苷键选择性并且过程控制复杂。本发明建立了一种新的FGAG解聚方法---脱酰脱氨基解聚法，该方法首先通过肼解脱乙酰基反应使FGAG所含的D-2-(N-乙酰基)氨基-2-脱氧半乳糖(D-GalNAc)发生部分脱乙酰化反应，获得含D-2-氨基-2-脱氧半乳糖基(D-GalNH2)的FGAG部分脱乙酰化产物，继而采用亚硝酸处理使之发生脱氨基解聚反应，由此获得含有末端2,5-脱水塔罗糖基或其还原衍生物的FGAG解聚产物。本领域技术人员容易理解，鉴于FGAG的复杂化学结构，特别大量的岩藻糖(Fuc)侧链取代基的存在，使得选择性脱除FGAG所含GalNAc上的氨基存在明显的技术困难；而Fuc侧链在酸性条件下容易裂解，因此，部分脱乙酰化FGAG的酸性条件下脱氨基反应同样存在技术挑战。本发明首次公开了获得具有特征末端结构衍生物的复杂结构FGAG脱氨基解聚方法，并且首次公开了含有末端2,5-脱水塔罗糖基或其还原衍生物的FGAG解聚产物。
本发明方法及其所得产物的优势特征在于，(1)FGAG脱酰脱氨基解聚反应具有糖苷键选择性，即选择性断裂D-GalNH2(β1-)糖苷键，而不裂解L-Fuc(α1-)及D-GlcUA(β1-)糖苷键，因此所得解聚产物具有更好的结构均一性；(2)FGAG脱酰脱氨基解聚反应产物可具有特征性的2,5-脱水塔罗糖(2,5-anhydrated Talose，anTal)或其还原衍生物末端，特征性末端的存在有利于解聚产物化学结构分析以及解聚产物的质量控制，而末端还原衍生化处理可使之容易地用于药代动力学及药理机制分析等；(3)部分脱乙酰化的FGAG可经HNO2处理发生可化学计量的脱氨基解聚反应，因此，通过脱乙酰化程度控制，可以较好地控制解聚产物的分子量范围，有效提高FGAG解聚产物的制备工艺的可控性。
附图说明
图1为FGAG及其脱乙酰化产物dAFG-1和dAFG-2的1H NMR谱；
图2为FGAG及其脱乙酰化产物dAFG-1和dAFG-2的13C NMR谱；
图3为FGAG及其脱酰脱氨基解聚产物aTFG-a、aTFG-b和aTFG-c的1H NMR谱；
图4为FGAG及其脱酰脱氨基解聚产物aTFG-a、aTFG-b和aTFG-c的13C NMR谱；
图5为FGAG及其脱酰脱氨基解聚产物aTFG-a、aTFG-b的COSY(A)、NOESY(B)、TOCSY(C)谱图叠加(局部)图；
图6为FGAG(A)及其脱酰脱氨基解聚产物aTFG-b(B)的1H COSY谱图比较；
图7为aTFG的抗内源性因子X酶活性；
具体实施方式
以下具体实施例是对本发明内容的详细说明，所述实施方案不限制本发明的权利范围。
【实施例1】FGAG脱乙酰化产物(dAFG)的制备
1.1材料
FGAG：Thelenota ananas体壁来源的岩藻糖化糖胺聚糖，按文献方法(Marine Drugs,2013,11,399–417)提取纯化制备得到，分子量69930Da。水合肼、硫酸肼、盐酸肼、盐酸、氯化钠、无水乙醇、碘酸、氢碘酸、氢氧化钠等试剂均为市售分析纯试剂。
1.2方法
脱乙酰化反应：准确称量FGAG原料60mg，置于反应管，加入14.5mg催化剂硫酸肼或盐酸肼12.2mg或2.304mol/L盐酸0.1mL或不加催化剂条件下，然后加入水合肼或无水肼1.45mL，氮气氛围下，250rpm转速下搅拌，75～105℃下加热反应2～14h。反应结束后，反应液在经80%乙醇沉淀，离心得沉淀，然后减压真空干燥，得到脱乙酰化中间产物样品， 该样品可直接用于亚硝酸解聚，或进一步处理得到较纯的中间体，其中处理方法为：蒸干样品置冰浴冷却，逐滴加入0.25mol/L碘酸溶液；继续滴加，直至沉淀不溶解呈黑色悬液。滴加约5ml45%氢碘酸，再加入3mol/L氢氧化钠，沉淀溶解，继续滴加，直至溶液变为澄清透明或淡黄色溶液。将该溶液调pH至中性，用截留分子量为1000Da透析袋透析，冻干。
脱乙酰化程度的测定：精确称取上述脱乙酰化产物约5mg溶于约600mL重水(含TSP内标)中，使用BUCKER DRX-500核磁共振波谱仪对样品进行检测。脱乙酰化程度(degree of deacetylation,DD)通过1H NMR图谱中两种甲基质子峰(乙酰氨基半乳糖乙酰氨基上的甲基和侧链硫酸岩藻糖甲基)积分面积比值来计算。
产物分子量的测定：采用高效液相排阻法(HPGPC)确定产物的分子量。Agilent technologies 1200series高效液相色谱仪，Shodex Ohpak SB-804HQ(7.8mm×300mm)柱，温度35℃，检测器为示差折光检测器(G1362A)。精密称取样品适量，加0.1mol/L氯化钠溶液溶解，并稀释至10mL量瓶中，摇匀，过40μm滤膜，取滤液作为供试溶液。
标准品及对照品溶液制备：取已知分子量的右旋糖酐系列对照品，精密称定，用0.1ml/L氯化钠溶液分别溶解并稀释制成10mg/mL的溶液，作为窄标的校正溶液。精密称取已知分子量的FGAG对照品，用0.1mol/L氯化钠溶液分别溶解并稀释制成10mg/mL的溶液，作为宽标校正溶液。分别将样品、标准品、对照品溶液各25μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。数据采用GPC专用软件处理。
化学组成检测：单糖组成乙酰氨基半乳糖、葡萄糖醛酸和岩藻糖分别采用Elson-Morgon法、间羟联苯法和半胱氨酸苯酚法进行测定(张惟杰，糖复合物生化研究技术(第二版)，浙江：浙江大学出版社，1999)，硫酸羧酸摩尔比采用电导法测定(张惟杰，糖复合物生化技术研究(第二版)，浙江：浙江大学出版社，1999，409-410)。
1.3结果
反应条件变化对脱乙酰化产物(deacelyted FGAG,dAFG)脱乙酰化程度的影响见表1。结果显示，加入催化剂可以加快反应进程，产物脱乙酰化程度更高；控制反应时间、反应温度和肼的质量浓度可以获得不同脱乙酰化程度的产物。
表1.不同条件下脱乙酰化反应的实验结果
图1和图2给出了按照本实施例方法制备的2个不同脱乙酰程度样品dAFG-1和dAFG-2的1H、13C-NMR谱图。根据NMR谱图计算它们的脱乙酰化程度分别是48%和88%。谱图数据还提示，脱乙酰化前后，除了部分D-GalNAc被脱去乙酰氨基生成D-GalNH2外，其基本结构未见显著变化。对脱乙酰化前后样品的单糖组成分析，其组成单糖(D-GlcUA):(D-GalNAc+D-GalNH2):(L-Fuc)的摩尔比均约为1:(1±0.3):(1±0.3)，这个结果进一步提示，D-GalNAc发生部分脱乙酰化反应外，多糖的基本结构保持稳定。
【实施例2】脱氨基解聚dAFG制备aTFG
2.1材料
dAFG，即FGAG部分脱乙酰化产物，按照实施例1所述方法制备获得；亚硝酸钠、浓硫酸、硼氢化钠、碳酸钠、氢氧化钠、无水乙醇等试剂均为市售分析纯试剂。
2.2方法
产物制备：精确称取脱乙酰化中间产物约20mg于反应器中，加1mL水溶解，在冰浴或室温条件下，加入5.5mol/L的亚硝酸溶液(pH4)2mL，解聚2～30min，反应后加1mol/L的碳酸钠溶液调pH8～9终止反应，用含0.25mol/L硼氢化钠的0.1mol/L氢氧化钠溶液1mL将亚硝酸解聚产物的醛基还原，50℃加热40min，反应后冷却至室温，0.5mol/L的硫酸除去过量的硼氢化钠，最后用0.5mol/L的氢氧化钠溶液中和，1000Da透析袋透析，收集透析袋 内透析液，冻干。
产物检测：BUCKER DRX-500核磁共振波谱仪对解聚样品进行检测；凝胶排阻色谱法确定解聚样品的分子量；电导法测定解聚样品硫酸羧酸摩尔比。
2.3结果
脱氨基解聚终产物的收率大于90%，样品纯度大于95%。
理论上，只有游离的氨基才能被亚硝酸消去从而使糖苷键断裂，因此，根据亚硝酸解聚前样品脱乙酰化程度计算游离的氨基数量，进而理论计算解聚产物可能的分子量。实验结果如表2所示，不同分子量的原料脱乙酰化后亚硝酸解聚获得的产物的分子量与理论计算值基本一致。这说明，根据脱乙酰化程度的不同可以获得理论计算分子量的解聚终产物。
表2.脱乙酰化程度与产物分子量关系的实验结果
按照本实施例制备的3个产物aTFG-a、aTFG-b和aTFG-c的NMR核磁图谱见附图3至6。比较原料FGAG、中间产物dAFG的核磁波谱，根据1H NMR、13C NMR及1H同核相关谱COSY、TOCSY、NOESY及1H-13C异核相关谱HQSC、HMBC，对不同脱乙酰化程度的(15%,48%,88%)亚硝酸解聚产物aTFG-a、aTFG-b和aTFG-c的谱图信号进行归属，其NMR信号数据见表3。
表3.FGAG及其脱氨基解聚产物aTFG-b的1H/13C NMR信号归属
由表3和附图3～6数据可知，FGAG脱氨基解聚产物aTFG的1H NMR谱图与原型FGAG谱图基本近似，而存在于脱乙酰化FGAG的约3.1～3.2ppm的D-β-氨基半乳糖(D-β-GalNH2)的2位氢信号消失，表明存在游离氨基的氨基己糖均已反应，而约5.0～5.1ppm处出现的新的信号峰则来自新的还原性末端的2,5-脱水塔罗糖(anTal,端基及4位氢)。与脱乙酰化产物相比，脱氨基解聚产物的1H NMR信号更接近于原型FGAG。
【实施例3】不同海参来源FGAG的亚硝酸解聚产物制备
3.1材料
仿刺参Apostichopus japonicus、红腹海参Holothuria edulis、巴西参Ludwigothurea grisea、玉足海参Holothuria leucospilota、黑乳海参Holothuria nobilis，均为市售干燥体壁。
3.2方法
(1)仿刺参、红腹海参、巴西参、玉足海参、黑乳海参干燥体壁粉碎，分别取粉碎物300g，同实施例1方法(1)所述提取其所含FGAG，分别称之为AJG、HEG、LGG、HLG和HNG。
(2)分别取AJG、HEG、LGG、HLG和HNG约1g，按照实施例1和2所述方法制备其脱氨基解聚产物aTFG，分别称之为aAJG、aHEG、aLGG、aHLG和aHNG。
3.3结果
从仿刺参、红腹海参、巴西参、玉足海参、黑乳海参干燥体壁分离纯化AJG、HEG、LGG、HLG和HNG的得率分别为约1.4%、0.9%、0.8%和1.1%，其重均分子量均在约50kD～80kD之间。通过1H NMR谱图确定AJG、HEG、LGG、HLG和HNG作为FGAG类化合物的基本特征：α-L-Fuc、β-D-GalNAc以及β-D-GlcUA上的端基及相关的特征质子信号清晰明确。
由AJG、HEG、LGG、HLG和HNG制备aAJG(8.0kD)、aHEG(10.5kD)、aLGG(7.3kD)、HLG(10.2kD)和aHNG(8.7kD)的得率在约40%～70%范围内。通过1H NMR谱图分别确定 了解聚形成的anTal相关的特征信号。
【实施例4】末端还原氨基化产物制备
4.1材料
aTFG：实施例1和2制备。酪胺、氰基硼氢化钠等试剂均为市售分析纯。
4.2方法
(1)末端还原氨基化：实施例2所得aTFG0.1g溶解于3.5mL0.2mM磷酸缓冲液(pH8.0)中，搅拌中分别加入过量的80mg酪胺和30mg氰基硼氢化钠，35°C恒温水浴中反应约72h。反应完毕后，加95%乙醇10mL，离心得沉淀，所得沉淀以95%乙醇30mL洗涤两遍后，以35mL0.1%NaCl复溶所得沉淀，离心去不溶物，上清液置于1KD的透析袋中，去离子水透析24h，经冷冻干燥后获得dLFG-2A82mg。
(2)产物理化及波谱检测：HPGPC检测分子量及分布；电导法检测-OSO3 -/-COO-摩尔比；Elson-Morgon法检测乙酰氨基半乳糖(D-GalNAc)含量，咔唑法检测葡萄糖醛酸(D-GlcUA)含量，1HNMR甲基峰积分面积计算D-GalNAc/L-Fuc摩尔比(同实施例1)。瑞士Bruker公司AVANCE AV500超导核磁共振仪(500MHz)检测NMR谱图。
4.3结果
以投料计产物得率约72%；产物组分检测结果显示，D-GalNAc:D-GlcUA:L-Fuc:-OSO3 －为约1.00:0.98:1.10:3.60，Mw约9,969，PDI约1.32。
1HNMR(D2O,δ[ppm]):7.25(2’,6’H);6.83(3’,5’H);5.65,5.36,5.28(L-Fucα1H);3.38(8’H);2.82(7’H);2.02(D-GalNAc,CH3)；1.30～1.32(L-Fuc,CH3)。苯环氢与L-Fuc之H1的积分表明所得产物还原性末端均被还原酪氨化。
【实施例5】氨基硫酸化 
5.1材料
氯磺酸、四丁基氢氧化胺、二甲基甲酰胺、吡啶和碳酸钠等试剂均为市售分析纯。
脱乙酰化样品dAFG-1为按照实施例1制备的花刺参来源的，脱乙酰化程度为35%。
5.2方法
准确称取dAFG-10.10g，10ml去离子水溶解，调pH7.0。40℃水浴反应，一次性加入0.16gNa2CO3，在4h内加入0.20g吡啶-氯磺酸，加完后接着反应1h，反应完后静置冷却至室温，调pH7.5-8.0，超滤除盐，冷冻干燥。电导法测定样品的硫酸羧酸摩尔比。
5.3结果
称重计算反应产物的得率为约87%，电导法测定硫酸羧酸摩尔比的结果显示，产物的硫酸羧酸摩尔比为4.3，与反应原型天然产物比较可知，脱乙酰化后的游离氨基基本完全硫酸化。
【实施例6】aTFG抗凝血活性研究
6.1材料
aTFG样品：按实施例2和3所述方法制备得到的不同分子量的系列aTFG样品；这些样品的理化性质等信息见表4。
试剂及仪器：凝血质控血浆、活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒、CaCl2均为德国TECO GmbH公司生产；其他试剂均为市售分析纯。MC-4000血凝仪(德国美创公司)。
表4.系列分子量aTFG样品及其理化性质
6.2方法45μL凝血质控血浆中加入5μL溶于Tris-HCl缓冲液的待测样品作为检测样本，使用活化部分凝血时间(APTT)试剂盒进行凝血时间测试。
6.3结果（见表5）。
表5.不同分子量aTFG的APTT数据
表5中的结果显示，FGAG的脱氨基解聚产物aTFG均可以显著延长人血浆APTT，其倍增APTT的药物浓度均在12μg/ml以下，表明这些衍生物均能够有效抑制内源性凝血。比较这些衍生物的分子量和相应的倍增APTT的药物浓度发现，分子量越大抗凝血活性越强，分子量是影响其抗凝血活性的主要因素之一。根据这一规律性结果，从保留FGAG血液学活性考虑，以重均分子量计，本发明优选的aTFG的分子量不低于5,000Da。
【实施例7】抑制内源性因子X酶活性
7.1材料
aTFG样品：为按照实施例2的方法制备得到，分子量8777Da。
试剂及仪器：因子VIII(f.VIII)，200IU/支，上海莱士血液制品有限公司产品；f.VIII检测试剂盒，试剂包括Reagents:R1:Human Factor X;R2:Activation Reagent,human Factor IXa,containing human thrombin,calcium and synthetic phospholipids;R3:SXa-11,Chomogenic substrate,specific for Factor Xa;R4:Tris-BSA Buffer；为HYPHEN BioMed(法国)产品。Bio Tek-ELx808型酶标仪(美国)。
7.2方法
抑制内源性因子X酶(抗f.Xase)活性检测：采用f.VIII检测试剂盒结合f.VIII试剂建立的检测方法。系列浓度的待测溶液或空白对照溶液(Tris-BSA缓冲液R4)30μl与2.0IU/ml因子VIII(30μl)混合后，顺次加入试剂盒试剂R2(30μl)、R1(30μl)，37℃孵育2min后，加R3(30μl)，37℃精确孵育2min，以20%乙酸(30μl)中止反应并检测OD405nm。根据空白对照(R4)计算ΔOD，按文献(Sheehan J.P.&Walke E.K.,Blood,2006,107:3876-3882)中提供的公式计算各样品抑制f.Xase的EC50值。
7.3结果
见图7。数据显示，aTFG的EC50为22ng/mL，具有强效抗f.Xase活性。由于因子X酶是内源性凝血途径中的最后一个酶学位点，是多种因素激发的凝血过程的限速位点，因此，作用于该位点的药物对生理性凝血与止血的影响最小(Blood,2010,116(22),4390–4391;Blood,2009,114,3092–3100)。
【实施例8】冻干制品 
8.1材料
按照实施例1和2对糙海参来源的FGAG进行反应制备的aTFG，其重均分子量9476Da。
8.2处方：
8.3制备工艺
工艺过程：称取处方量的aTFG加注射用水至全量，搅拌使溶解完全，间歇式热压法灭菌。加入0.6％的药用活性炭，搅拌20min；使用布氏漏斗及3.0μm微孔滤膜脱炭过滤除去热源。测中间体含量。合格后用0.22μm的微孔滤膜过滤；灌装于管制西林瓶中，每瓶0.5ml，灌装过程监测装量，半压塞，置冷冻干燥箱内，按设定的冻干曲线进行冻干，压塞，出箱，轧盖，经检验合格，得成品。
冻干过程：将样品进箱，降隔板温至-40℃，保持3h；冷阱降至-50℃，开始抽真空至300μbar。开始升华：1h匀速升温至-30℃，保持2h；2h匀速升温至-20℃，保持8h，真空保持200～300μbar；再进行干燥：2h升温至-5℃，保持2h，真空保持150～200μbar；0.5h升温至10℃，保持2h，真空保持80～100μbar；0.5h升温至40℃，保持4h，真空抽至最低。

Claims (15)

1.一种低分子量糖胺聚糖衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于：
所述低分子量糖胺聚糖衍生物的组成单糖包括己糖醛酸、氨基己糖、脱氧己糖及2,5-脱水塔罗糖或其还原衍生物；所述己糖醛酸为D-β-葡萄糖醛酸，氨基己糖为2-N-乙酰基氨基-2-脱氧-D-β-半乳糖或2-氨基-2-脱氧-D-β-半乳糖或-β-D-2-硫酸氨基-2-脱氧半乳糖，脱氧己糖为L-α-岩藻糖，2,5-脱水塔罗糖还原衍生物为2,5-脱水塔罗糖醇或2,5-脱水塔罗糖氨或N-取代的2,5-脱水塔罗糖氨；
以摩尔比计，所述低分子量糖胺聚糖衍生物组成单糖含量比例范围是，己糖醛酸:氨基己糖:脱氧己糖＝1:(1±0.35):(1±0.3)；以摩尔比计，2,5-脱水塔罗糖和/或其还原衍生物在全部组成单糖中所占比例不低于3.0％；
所述低分子量糖胺聚糖衍生物的重均分子量Mw范围为2.5kD～20kD；
所述低分子量糖胺聚糖衍生物的多分散指数介于1.0至1.8之间。
2.如权利要求1所述的低分子量糖胺聚糖衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述低分子量糖胺聚糖衍生物是具有式(I)结构的同系糖胺聚糖衍生物的混合物，
式(I)中：
n是均值为3～21的整数；
-D-GlcUA-β1-，为-β-D-葡萄糖醛酸-1-基；
-D-GalN-β1-，为-β-D-2-乙酰氨基-2-脱氧半乳糖-1-基或-β-D-2-氨基-2-脱氧半乳糖或-β-D-2-硫酸氨基-2-脱氧半乳糖；
L-Fuc-α1-，为α-L-岩藻糖-1-基；
R1为-H或β-D-2-乙酰氨基-2-脱氧半乳糖硫酸酯-1-基；
R’相互独立地为-OH或-OSO3 －；
R3为-H、-SO3 －或乙酰基；
R2为-H或-β-D-葡萄糖醛酸-1-基，或式(II)所示基团：
式(II)中，-D-GlcUA-β1-，L-Fuc-α1-，R’同前文定义；
anTal为2,5-脱水塔罗糖，其糖醇、糖胺或N-取代糖胺；
m为1或2；
R4任选为＝O、-O、-NH2、-NHR5，其中R5为C1-C6直链或支链烷基，C7-C12芳基；
并且，所述式(I)结构同系糖胺聚糖衍生物的混合物中，以摩尔比计，R2为式(II)基团的化合物与R2为-H或-β-D-葡萄糖醛酸-1-基的化合物的比例不低于2:1。
3.如权利要求1所述的低分子量糖胺聚糖衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的低分子量糖胺聚糖衍生物的重均分子量范围为5kD～12kD；所述的低分子量糖胺聚糖衍生物的多分散指数值介于1.1至1.5之间。
4.如权利要求1或2所述的低分子量糖胺聚糖衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的药学上可接受的盐是低分子量岩藻糖化糖胺聚糖衍生物的碱金属盐或碱土金属盐或有机铵盐。
5.如权利要求4所述的低分子量糖胺聚糖衍生物的药学上可接受的盐，其特征在于，所述的药学上可接受的盐是低分子量糖胺聚糖衍生物的钠盐或钾盐或钙盐。
6.如权利要求1或2所述的低分子量糖胺聚糖衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的低分子量糖胺聚糖衍生物是棘皮动物门海参纲动物体壁和/或内脏来源的岩藻糖化糖胺聚糖的脱氨基解聚产物，或者是所述解聚产物的还原性末端的还原衍生化产物。
7.权利要求1或2所述的低分子量糖胺聚糖及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
步骤一：肼处理棘皮动物来源的岩藻糖化糖胺聚糖，使之所含的氨基己糖发生部分脱乙酰化反应，获得岩藻糖化糖胺聚糖的部分脱乙酰化产物；
步骤二：亚硝酸处理“步骤一”所得岩藻糖化糖胺聚糖的部分脱乙酰化产物，使之发生脱氨基反应和解聚，获得还原性末端为2,5-脱水塔罗糖基的低分子量岩藻糖化糖胺聚糖；所得低分子量岩藻糖化糖胺聚糖任选进行还原性末端的还原反应，包括将2,5-脱水塔罗糖端基还原成糖醇、糖胺或N取代的糖胺。
8.如权利要求7所述的低分子量糖胺聚糖及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，其“步骤一”所述棘皮动物来源的岩藻糖化糖胺聚糖是指从棘皮动物门海参纲动物体壁和/或内脏提取纯化的岩藻糖化糖胺聚糖天然产物；所述岩藻糖化糖胺聚糖的单糖组成包括D-葡萄糖醛酸、D-N-乙酰氨基-2-脱氧半乳糖及L-岩藻糖；所述的棘皮动物门海参纲动物为梅花参Thelenota ananas Jaeger、花刺参Stichopus variegates Semper、糙海参Holothuria scabra Jaeger、玉足海参Holothuria leucospilota Brandt、红腹海参Holothuria edulis Lesson、蛇目白尼参Bohadschia argus Jaeger、绿刺参Stichopus chloronotus Brandt、中华海参Holothuriasinica Liao、海地瓜Acaudina molpadioides Semper、格皮氏海参Pearsonothuriagraeffei Semper和黑乳参Holothuria nobilis Selenka。
9.如权利要求7所述的低分子量糖胺聚糖及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，其“步骤一”所述肼处理脱乙酰化反应的方法是向棘皮动物来源的岩藻糖化糖胺聚糖加入无水肼或水合肼溶液中，在有或无催化剂存在下，搅拌中在75℃-125℃的温度下反应2-14h。
10.如权利要求9所述的低分子量糖胺聚糖及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，其“步骤一”所述肼处理脱乙酰化反应是在有催化剂存在的条件下进行的，所述催化剂任选硫酸肼、盐酸肼、盐酸或硫酸，且所述反应溶液中的催化剂的浓度为0.5％～2.5％。
11.如权利要求7所述的低分子量糖胺聚糖及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，其“步骤二”所述亚硝酸处理脱氨基解聚的方法是：在冰浴或室温条件下，将“步骤一”所得岩藻糖化糖胺聚糖部分脱乙酰化产物加入pH 1至pH 5亚硝酸溶液4～6mol/L中反应5min～60min后，碱溶液调pH8或以上终止反应；然后任选进行：
(1)向反应溶液中加入3-5倍体积的乙醇，静置，离心得沉淀，超滤或层析纯化所得产物；
(2)采用硼氢化钠或氰基硼氢化钠，将反应产物的还原性末端2,5-脱水塔罗糖还原成糖醇，然后按(1)所述步骤纯化所得产物；
(3)通过还原氨基化反应将反应产物的还原性末端2,5-脱水塔罗糖还原成糖胺或N-取代的糖胺，然后按(1)所述步骤纯化所得产物。
12.药物组合物，其含有有效抗凝血剂量的权利要求1或2或4所述的低分子量糖胺聚糖衍生物及其药学上可接受的盐，以及药用赋形剂。
13.如权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为注射用水溶液或注射用冻干粉针剂。
14.权利要求1或2或4所述的低分子量糖胺聚糖衍生物及其药学上可接受的盐在制备防治血栓性疾病的药物中的应用，所述血栓性疾病为静脉血栓形成或动脉血栓形成或缺血性心脏病或缺血性脑血管病。
15.权利要求12所述的药物组合物在制备防治血栓性疾病的药物中的应用，所述血栓性疾病为静脉血栓形成或动脉血栓形成或缺血性心脏病或缺血性脑血管病。
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