KR0155166B1 - 헤파린상 구조를 지닌 물질 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Description

헤파린상 구조를 지닌 물질 및 이의 제조방법

제1도는 본 발명에 따른 최종 생성물의 NMR 스펙트럼을 도시한 것이다.

제2도 및 제3도는 제1도를 비교하기 위한 스펙트럼을 도시한 것이다.

제4도 내지 제7도는 본 발명에 따른 생성물을 분석 평가한 그래프이다.

제9도는 본 발명에 따른 최종 생성물의 NMR 스펙트럼을 도시한 것이다.

제8도 및 제10도 내지 제12도는 종래 기술에 따른 최종 생성물의 NMR 스펙트럼을 도시한 것이다.

본 발명은 헤파란상 (heparin-like) 구조를 지닌 물질 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

추출에 의해 수득된 천연 글루코스아미노글리칸, (GAG)(예: 헤파란 설페이트(HS))를 분리시키고 특정화시킨다[문헌 참조; 죠르프스, 제이. (Jorpes, J.)-Gardell, S. JBC 176, 267-276]. 이의 구조는 헤파린과 유사하며 N-아세틸화 정도에 따라 기본적으로 다양하다: 헤파린에서, 글루코스아민의 -NH 그룹은 바람직하게는 HS에서 N-아세틸화 되지 않고 황산화된다.

상기 구조식 차이의 결과로서, HS는 헤파린과는 다른 독특한 생리적 특성을 나타낸다:

1) 이것은 시험관내에서 시험된 낮은 항응혈 작용을 지닌다(APTT, 안티(anti)-X).

2) 이것은 인체 또는 실험실용 동물에 사용될 경우. 전섬유소 작용 (플라스미노겐 조직 활성화제의 방출)을 나타낸다.

3) 이것은 헤파린의 경우보다 우수한 생유용성(bio-availability)을 나타낸다.

따라서, 상기 물질은 특히 심장혈관 의학, 주로는 미소혈전의 형성을 방지하며, 뿐만 아니라 이의 용해에 기여하는 장기-지속 요법에 관련된다. 이것은 출혈을 일으킬 위험이 거의 없고 부작용이 감소되어 성취될 수 있다.

명백하게, 상기 천연 무코폴리사카라이드는 유기조직체중에서 이의 낮은 농도로 인해 대규모 추출될 수 없다. 이것은 치료학적 분야에서 이의 광범위한 용도를 매우 제한할 수 있다.

이제, 본 발명에 따르면 원료 물질로서 헤파린으로부터 출발하고, 우수한 수율의 헤파린 상 구조를 지닌 순수한 N-아세틸화된 화합물을 수득할 수 있는 방법이 개발되었다.

본 발명의 방법은 해중합 반응없이 N-탈황산화로 헤파린을 조절 가수분해시키고, 아세트산 무수물을 사용한 반응에 의해 아세틸 그룹을 특정한 아민 N 위치에 도입시킴을 기본으로 한다.

헤파린 탈황산화하는 그룹 0-셀페이트를 가수분해시키지 않으며 글리코사이드 결합의 가수분해 또는 기타 기생 반응을 생성하지 않고서 특정하게 수득된다. 이것은 이미 이노우에 (Inoue) 및 나가사와 (Nagasawa)에 의해 기술되었다(1975)[문헌 참조; 이노우에, 와이(Y)-나가사와, 케이(K), Carbohyd, Res, 46, 87-95(1976)]. 그러나 이 방법은 수성 또는 메탄올성 디메틸 설폭사이드에 용해된 헤파린-피리딘성 착물이 연결된 문제(예: 반응 용매로부터 착물의 분리, 피리딘의 정량적 제거, 고가 용매 회수 등)를 지니기 때문에 대규모로 용이학 수행될 수 없다.

대조적으로 대이온 크기로 인해, 구조적 개질을 초래하거나 매질 분자량에 영향을 미치지 않고서 칼슘 헤파린으로부터 출발하여 산 수성 매질중에서 선택적인 N-탈황산화가 성취될 수 있다.

특히, 생성물의 황변 및 0-설페이트 그룹의 가수분해가 방지된다.

그다음 부분적으로 N-탈황산화된 헤파린(중간체A)을 아세틸화 반응에 적용시킨다.

헤파린 아세틸화는 다니쉐프스키(Danishefsky) 및 나가사와에 의해 기술되었다[문헌참조; 다니쉐프스키, N. Meth. Carb. Chem. 5, (85), 11); 이노우에, 와이-나가사와, 케이. Carbohyd, Res. 46, 87-95(1976)]. 이들은 둘다 상당한 양의 아세트산 무수물, pH 6.5 내지 7.0 및 넓은 온도 범위로 수행된다.

상기 조건, 및 저온 (0 내지 5 ℃) 수행에서 이당류 단위의 유리 -OH에서 기생성 0-아세틸화 반응이 발생한다

본 발명자는 아세트산 무수물의 실제적인 화학양론적 양(적정곡선 및 pH 9.3 내지 9.5(아세트산 무수물 가수분해와 양립성인 최대 한계치)에 따라 이미 정량된, 유리 아미노 N 1-1, 1몰 (CH,CO)=0/Mol)을 사용할 경우, 25 내지 30℃에서 N-아세틸화 반응이 독점적으로 발생함을 발견하였으며, 이것이 본 발명의 목적이다.

이 온도에서, 반응은 신속하며 15분내에 완결된다. 반응을 그 이상 지속시킬 경우에도 부 반응은 발생하지 않는다.

수득한 생성물 (최종 생성물 B)은 매우 일정한 조성을 지니며 하기 표 및 도면에서 정의되는 바와 같은 정밀한 분석 기술에 의해 화학적으로 양호하게 특성화된 분자로 나타내어진다.

본 발명의 생성물을 더욱 잘 확인하기 위해 본 발명자는 생성물의¹³C-NMR 특성화를 하기에 기술하였다.

최종 생성물 B의 NMR 스펙트럼(제1도)는 브룩커(Brucker) Mod. CxP-300 분광광도계를 사용하여 75 MHz에서 D₂O 용액중에서 결정한다. 비교를 위해 또한 표준 헤파린의 스펙트럼 (제2도) 및 헤파란설페이트의 스펙트럼(HS, 제3도)을 함께 제공한다: 상기 스펙트럼은 문헌(비. 카스(B. Casu)등, Arzneim-Forsch. (Drug Research) 33, 135-142, 1983]에서 공지된 것과 상응한다.

제1도에서, 90내지 95ppm 영역(c-1 아노머 탄소에 의함) 및 53내지 61ppm 영역(아미노 당 단위의 C-2에 의함)에서의 피이크는 상이한 우론산 단위를 확인하고, 상기 단위의 양을 측정하고 우론산 및 헥소스아민 단위에서 설페이트 그룹을 정량하는데 특히 적합하다.

본 발명에서 하기 약어를 채택한다:

L-이드우로닐-2-설페이트 = Ido A2SO₃

D-글루크우톤산 = G1cA

글루코스아민 N-설페이트 = G1cNSO₃

N-아세틸 글루코스아민 = G1cAc

치환되지 않은 아민 그룹을 갖는 글루코스아민 = G1cNH2

r=주로 헥소스아민 단위에 대한 환원 말단 그룹

하기의 상대적 백분율은 상이한 그룹의 특성 피이크하에 면적을 고려함으로써 계산된다: 전체 우론산에 대해 IdoA2SO₃= 68.2%; G1cA=31.8%; G1cNSO₃=37.8%; IdoA2SO₃에 결합된 G1cNAc=37.8%; G1cA에 결합된 G1cNAc=11.0%; 전체 헥소스아민에 대해 G1cN 환원=13.4%(C-1 피크 평가)

C-2 및 CH₃(N-아세틸) 피이크하에 면적으로부터 G1cNSO₃그룹 %는 36.2이며, 전체 G1cNAc 단위의 %는 53%이다.

생성물은 헤파린 (헤파린중에서 전체 우론산의 71-91%인 높은 IdoA2SO₃단위함량에 의함) 및 헤파란설페이트(전체 글루코스아민 헤파란설페이트의 58% 함량인 높은 N-아세틸 그룹에 의함)와 유사하다; 그러나 상기의 두 GAG에서 소량으로 존재하는 우세한 G1cNAc→IdoA2SO₃연쇄로 인해 상기의 글리코스아미노글리카에와 상다한 정도로 차이가 있다.

하기의 실시예는 칼슘 헤파린으로부터 수득된 헤파린상 N-아세틸화된 화합물(최종 생성물 B)의 제조를 위한 독창적인 방법을 기술하고 있다. 실험실용 모델을 기본으로 이들 화합물은 섬유소용해작용 및 안티트룸빈 활성화 작용을 나타내며 항응집 작용은 부족하다. 따라서, 출혈위함은 낮다. 베크마이어(Bekemeyer)법에 따라 래트의 꼬리에서 모델을 사용하여 안티트룸빈 활성화 작용을 시험한다[문헌참조: 베크마이어 에이치(H).-히르쉘만(Hirschelmann), Agents and Actions. Vol. 16 pag. 446(1985)].

뵈링거 다이아노스티가 키트(Bohringer Diagnostica Kit)를 사용하여 FDP (피브린 해중합 펩티드)를 평가함으로써 생성물을 주사한 래빗의 혈장에서 체외 섬유소 용해 작용을 시험한다.

제조방법, 뿐만아니라 수득한 착물 및 혈전증의 섬유소 용해제 및 보호제로 이의 용도가 본 발명에 해당한다.

스콧트에 의해 기술된 바와 같이 암모늄 사가염 및 식염액중의 에탄올을 사용하여 하기의 일반적인 방법에 따라 최종생성물 B 및 중간체 A의 정체를 수행한다[문헌참조; 스콧트, 제이(J). Meth. Bioch. Analysis VIII 145-197(1960)].

[실시예]

1) 칼슘 헤파린의 제조:

헤파린 나트륨 150IU/mg 100g을 용액 1ℓ(10%)에 충분한 양의 증류수에 용해시킨다. 이것을 50 에서 교반하면서 가열하고 증류수 1ℓ에 용해시킨 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드 (CTAB) 120g을 서서히 가한다.

침전물을 상기 온도에서 1시간동안 계속 유지시키고 원심 분리로 분리시킨다. 이것을 수중의 CTAB 1% 용액 각 100ml 씩으로 2회 세척하고, 최종적으로 수득한 고체 물질을 수중의 2M CaCl₂용액 1ℓ에 용해시킨다. 그다음 에탄올 96° 1용적을 가하여 폴리사카라이드를 침전시킨다. 이것을 밤새 안정시키고, 상층액을 따라내고 수득한 고체 물질을 수용액중의 2M CaCl₂1ℓ에 재용해시킨다.

투명한 용액을 에탄올 96°용적을 사용하여 재침전시킨다. 고체 물질을 안정화시키고 2M CaCl₂1ℓ에 두 번째로 재용해시킨다. 스콧트(Scott)[문험참조; 스콧트, 제이. Meth. Bioch. Analysis VIII, 145-197(1960)]에 따른 벤토나이트를 가하여 CTAB 잔사를 제거한다. 여과하여 벤토나이트를 제거하고 투명한 액체를 에탄올 1 용적을 사용하여 마지막으로 침전시킨다.

고체 물질을 에탄올로 무수화시키고 진공건조쳄버에서 건조시킨다.

그다음, 0.1% 이하의 나트륨 수준으로 칼슘 헤파린 90g을 수득한다.

2) 중간체 A의 제조:

칼슘 폴리사카라이드 90g을 10% 용액을 수득하기에 충분한 양의 0.25M HCI중에서 80℃에서 가열하면서 역류로 용해시킨다. 2시간 후, N-탈황산화 반응은 실질적으로 완결되며, 이것은 반응중 액체의 항응혈 작용의 부재 및 강한 황산칼슘 침전물의 생성에 의해 입증된다.

목적하는 작용이 완결되면, 10M NaOH 용액을 가하여 pH를 7로 조절하면서 반응을 중지한다.

충분한 양의 10% W/V Na₂CO₃용액을 가하여 CaCO₃침전을 완결시키고, 수득한 침전물을 여과하여 제거한다.

에탄올 1용적을 가하여 액체로부터 N-타로항산화된 폴리사카라이드를 분리시키고 이것을 밤새 안정화시킨다. 해파라민성 물질을 무수화시키고 진공건조솥에서 건조시킨다.

아미노 비함유 그룹 (중간체 A) 50%를 함유하는 물질 60g을 수득한다.

3) 최종 생성물 B의 제조:

중간체 A 50g을 용액 1ℓ(5% W/V)에 충분한 양의 증류수에 용해시키고 10M NaOH 용액을 사용하여 pH를 9.5로 조절한다. 25내지 28℃로 승온시키고, 교반하에 NaOH 용액을 사용하여 pH를 9.3내지 9.5로 유지시키면서 아세트산 무수물 5ml를 적가한다. 약 5부후 아세트산 무수물이 응집되며 교반하에 30분동안 반응시킨후 NaCl10g을 가한다. 그다음 액체 전량을 에탄올 1용적에 침전시키고 밤새 안정화시킨다.

이것을 침전 및 안정화시킨 후, 페이스트를 살균수 500ml에 용해시키고 NaCL 5g을 가하고, 6M HCI을 사용하여 pH를 6.0℃으로 조절하고 감열판 (depyrogenic plates) 및 0.8 내지 0.22U 살균막을 사용하여 여과한다. 에탄올 1용액을 사용하여 여액을 침전시키고, 무수화시키고 60℃에서 진공 건조솥에서 12시간동안 건조시킨다.

그다음, 유리 아미노그룹을 함유하지 않지만, 대체적으로 천연 HS의 경우와 유사한 화학적 조성, 분석특성 및 생물학적 및 약물학적 특성을 지닌 N-아세틸화된 생성물 55g을 수득한다(적정곡선 참조).

최초의 헤파린, 중간체 A 착물 및 최종 생성물 B의 분석 전형을 하기에 나타내었다.

제1도 내지 제3도는 하기 화합물의 C-NMR 스펙트럼이다: 제1도: 최종생성물 B; 제2도; 헤파린; 제3도;헤파린 설페이트.

제4도 내지 제7도는 각각 하기에서 설명하는 평가를 나타낸다:

제 4, 6, 7도: B-A=카복실성 우론산그룹

A=설페이트 그룹

제5도 : B-A=카복실성 우론산 그룹

C-(B-A)=설페이트 그룹

C-B=유리 아미노 그룹

추가의 특징화 및 비교 시험을 하기 기술한 바와 같이 수행한다.

[필수적으로 O-아세틸화된 헤파린의 제조]

이 생성물은 DMF 100ml, 피리딘 10ml 및 증류수 5ml 중에서 착물 헤파린-CTA(CTA : 세틸-트리메틸-암모늄브로마이드)를 현탁시킴에 의해 제조된다. 그런 다음, 반응 혼합물을 교반하면서 50℃까지 가열하고 아세트산 무수물 10ml를 30분 동안 적가한다.

물로 냉각시킨후, 2% NaHCO1.6ℓ를 가한다. 형성된 침전을 수집하여, 3M NaCl 200ml에 용해시키고, 에탄올 2용적으로 침전시킨다. 그런 다음, 수득된 생성물을 탈수시키고 진공 오븐에서 건조한다.

제8도에서 함유된 상응하는 NMR 스펙트럼은 분명히 O-아세틸 신호(23ppm)가 존재하며 N-아세틸 신호(24.4 내지 24.7 ppm)가 덜 존재하는 것을 입증한다.

[본 발명에 따른 N-아세틸화된 헤파린의 합성]

이 생성물은 본 발명에서 기술된 방법, 즉 pH 9.3 내지 9.5, 25 내지 30℃에서 20분 동안 화학양론적 양의 아세트산 무수물 (부분적으로 탈황산화된 헤파린 0.1ml/g)을 사용하여 제조된다.

출발 N-탈황산화된 헤파린은 5% w/v 수용액의 형태로 사용된다.

제9도에 기술된 이러한 특정 생성물과 관련된 스펙트럼은 그룹 NH-COCH에 상응하는 24.9ppm에서 신호가 존재함을 나타낸다.

또한, 이러한 생성물의 스펙트럼은 O-아세틸화된 헤파린의 상응하는 NMR 스펙트럼에서 존재하는 23ppm에 신호를 나타내지는 않는다.

그러므로, 이것은 본 발명에 기술된 방법에서 수득된 아세틸화된 헤파린은 독점적으로 N-아세틸화되며 O-아세틸 그룹을 함유하지 않는다.

[다니쉐프스키에 따른 아세틸화된 헤파린의 합성(참조: Nagasawa et al, Avotte-Perlin)]

다니쉐프스키 등(참조: Arch. Bioch. Bioph. 90, 114-121(1960)에 따라서, 나트륨 헤파린을 0.04M HCI에서 이것을 가열함에 의해 N-탈황산화된다. 부분적으로 N-탈황산화된 생성물을 pH 6.5 내지 7.0으로 유지시키기 위해 메탄올 10% 및 CO- 형태의 음이온성 수지를 함유하는 물에 용해시킨다. 그런 다음, 아세트산 무수물을 폴리사카라이드와 동일한 중량으로 가한다 (아세트산 무수물 1ml/N-탈황산화된 헤파린 1g). 그런 다음, 반응 혼합물을 방치하여 4℃에서 2시간 동안 방응시킨다.

상기 방법에 따라서 사용되는 아세트산 무수물은 이론적양에 대해 10배인 반면, 본 발명에 기술된 방법에서 사용되는 아세트산 무수물은 화학양론적 양, 즉 폴리사카라이드 10중량%이다. 수득된 생성물을 C NMR(50MHz) 분광광도계를 사용하여 분석한다.

제10도의 스펙트럼에서 23ppm의 OCOCH그룹에 상응하는 뚜렷한 신호가 관찰된다. 이러한 신호는 제8도 스펙트럼에서 나타나는 것과 일치한다. 이러한 신호의 존재는 다니쉐프스키의 방법을 따름에 의해 O-아세틸화 부 반응을 피할 수 없음을 입증한다. 본 발명에 기술된 방법으로 제조된 생성물에서와는 반대로 23ppm에서 신호는 없었다.

그러므로, 다니쉐프스키의 방법 및 결과적으로 본 발명에 청구된 방법과 완전히 상이한 조작 조건을 갖는 나가사와 및 아요테-펠린(Ayotte-Perlin) 방법이 O-아세틸화의 부 반응을 일으키는 것으로 결론지을 수 있다.

[이리무라(Irimura) 등의 방법에 따른 아세틸화된 헤파린의 합성]

이리무라에 의해 기술된 N-아세틸화 반응을 반복한다. 그러므로, 부분적으로 탈황산화된 헤파린 50mg을 아세트산나트륨 및 메탄올로 이루어진 매질에서 아세트산 무수물 5ml로 아세틸화시킨다.

제11도에 기술된 생성물에 상응하는 스펙트럼은 NHCOCH그룹에 상응하는 24.9ppm에 신호(상술한 O-아세틸-헤파린에서 상응하는 신호와 일치)를 나타내며, 그러므로 이는 또한 본 발명에서 사용되는 탈황산화된 헤파린 0.1ml/g에 대해 매우 많은 양의 아세트산 무수물(탈황산화된 헤파린 100ml/g)의 사용을 포함하는 이리무라법은 O-아세틸화 부반응을 피할 수 없다는 것을 나타낸다.

[후크(Hook)등에 따라 수득된 아세틸화된 헤파린의 합성(참조: M. Mook, J. Riesenfeld, U. Lindhal-Anal. Biochem. 119, 236-245(1982)).]

이러한 특정한 선행 기술에 따라서, 부분적으로 N-탈황산화된 헤파린을 Na2CO3ℓ당 0.05mol을 함유하는 물/메탄올 혼합물에 용해시키고, 순수한 아세트산 무수물의 상당한 과량 (화악양론적 양의 36배)으로 pH 7 내지 7.5에서 2시간 동안 반응시킨다.

그러므로, 후크(Hook)에 의해 기술된 작동 조건은 하기 표로부터 분명하게 나타나는 바와 같이 본 발명에 기술된 조건과 상이하다.

이러한 생성물(제12도)에 따라서 수득된 생성물에 관한 NMR 스펙트럼은 O-아세틸 그룹에 상응하며 제8도에 나타낸 생성물 O-아세틸화된 헤파린의 스펙트럼의 상응하는 신호와 일치하는 23ppm에 신호가 존재함을 나타낸다.

따라서, 본 출원의 특성을 구체적으로 기술하고 한정하였으며 상으하는 방법은 동일한 효과를 초래하고, 이에 의해 특징적인 권리 및 소유권을 청구한다.

Claims (4)

1. (a) 가수분해 단계로서 0.25M HCl 의 산성 수용액 중 약 80℃에서 헤파린을 이의 칼슘 염 형태로 가열하여, O-셀페이트화된 그룹의 가수분해 없이 N-설페이트 아미노 그룹을 부분적으로 탈황산화시키고 제1반응 혼합물을 형성시키고; (b) 제1반응 혼합물에 NaOH를 가하여, pH를 7까지 조정한 다음, 여기에 Na₂CO₃용액을 가하여 CaCO₃로서 칼슘을 침전시키고 제2반응 혼합물을 형성시키며; (c) 제2반응 혼합물로부터 불용성 칼슘, 황산염 및 탄산염을 여과에 의해 분리하여 제3반응 혼합물을 형성시키고; (d) 제3반응 혼합물을 물에 용해시킴에 의해 제3반응 혼합물에 존재하는 유리 아미노 그룹을 아세틸화시키고, NaOH 용액으로 pH 9.5까지 조정하고, 온도를 25내지 30℃ 및 NaOH를 가하여 pH 9.3 내지 9.5로 유지시키면서, 유리 아미노 그룹 1몰당 1내지 1.1몰에 상응하는 양으로 아세트산 무수물을 가하여 수용액중 제4반응 혼합물을 형성시키며; (e) 에탄올을 가함에 의해 제4반응 혼합물의 수용액으로부터 N-아세틸화된 유도체 최종 생성물을 침전시키고 여과에 의해 최종 생성물을 정제시키는 단계를 포함하는, 헤파린의 N-아세틸화된 유도체의 제조방법.
2. O-아세틸화된 그룹의 부재; 항응혈작용 (APTT 안티-X): 10 IU/mG 미만 N-아세틸화 수준 40 내지 90%에 상응하는 N-아세틸 함량(CH₃CO-로서 표기) 3 내지 7중량%; 우론산 함량 31중량% ± 1중량%; 헥소스아민 함량 32중량%± 1중량%; 유기 설페이트(S) 함량 8중량% ± 1중량%; 우론산/헥소스아민/S/아세틸의 몰비 1/1/1.5-1/7/0.4-0.9; 및 공유 광회전도 +35° 초과의 특성을 갖는 헤파린의 N-아세틸화된 유도체.
3. 안티트롬빈성 및 섬유소용해 특성, 낮은 항응혈 작용을 지닌 유효량의 제2항에서 정의한 생성물과 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제의 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물.
4. 제2항에 있어서, N-아세틸 함량(CH₃CO-로서 표기) 4.3중량%; 우론산 함량 31중량%; 헥소스아민 함량 32중량%; 우론산/헥소스아민/S/아세틸의 몰비 1/1/1.7/0.

   5; 및 고유 광회전도 40°의 특성을 갖는 헤파린의 N-아세틸화된 유도체.

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