DE69016127T2

DE69016127T2 - Substanzen mit heparinähnlicher Struktur und Verfahren zu deren Herstellung.

Info

Publication number: DE69016127T2
Application number: DE69016127T
Authority: DE
Inventors: Victor Diaz; Ricardo Domanico; Esteban Fuentes; Fernando Fussi
Original assignee: Ajorca SA
Current assignee: Ajorca SA
Priority date: 1989-08-18
Filing date: 1990-08-08
Publication date: 1995-05-18
Anticipated expiration: 2010-08-09
Also published as: DE413248T1; EP0413248A1; KR910004668A; DE69016127D1; ES2053415T3; ATE117321T1; JPH03185001A; KR0155166B1; AR245455A1; ES2053415T1; EP0413248B1

Description

Natürliche, durch Extraktion erhaltene Glycosaminoglycane (GAG) wie Heparansulfat (HS) wurden isoliert und charakterisiert (Jorpes, J. - Gardell, S. JBC 176, 267 - 276). Ihre Struktur ist ähnlich der von Heparin, wobei sie fundamental im N-Acetylierungsgrad variiert: im Heparin ist die -NH&sub2;-Gruppe des Glucosamins vornehmlich sulfatiert; stattdessen ist sie im HS N-acetyliert.
Als Folge dieses Strukturunterschieds zeigt das HS besondere biologische Charakteristika, die verschieden von denen von Heparin sind:
1) Es hat eine niedrige Antigerinnungsaktivität bei einem in vitro Test (APTT, anti-X).
2) Es zeigt eine profibrinolytische Aktivität (Freisetzung des Gewebe-Plasminogen-Aktivators), wenn es in Menschen oder in Labortieren verwendet wird.
3) Es zeigt eine bessere Bioverfügbarkeit als Heparin.
Daher sind diese Substanzen besonders relevant für kardiovaskuläre Arzneimittel, hauptsächlich bei langandauernden Therapien, die die Bildung von Mikrothromben verhindern sollen und zu ihrer Auflösung beitragen sollen. Dies kann mit einem geringen Risiko von Hämorrhagien und mit verringerten Nebenwirkungen erreicht werden.
Offensichtlich können diese natürlichen Mucopolysaccharide aufgrund ihrer niedrigen Konzentration in der Gewebemasse nicht in großem Maßstab extrahiert werden. Dies kann ihre extensive Verwendung im therapeutischen Bereich signifikant einschränken.
Nun wurde gemäß der vorliegenden Patentanmeldung ein Verfahren entwickelt, das es gestattet, eine reine, N- acetylierte Verbindung mit einer heparinartigen Struktur mit guter Ausbeute zu erhalten, wobei man von Heparin als Ausgangsmaterial ausgeht.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf einer kontrollierten Hydrolyse von Heparin mit einer teilweisen oder vollständigen N-Desulfatierung ohne Depolymerisation, gefolgt von Einführung der Acetyl-Gruppe in die spezifische Position des aminischen N durch eine Reaktion, bei der Essigsäureanhydrid verwendet wird.
Die Heparin-Desulfatierung wird spezifisch an der Amino- Gruppe erzielt, ohne die O-Sulfat-Gruppe zu hydrolysieren und ohne eine Hydrolyse der glycosidischen Bindung oder andere parasitäre Reaktionen hervorzurufen. Dies wurde bereits beschrieben von Inoue und Nagasawa (1975); Inoue, Y. - Nagasawa, K. Carbohyd, Res. 46, 87 - 95 (1976). Dieses Verfahren kann jedoch nicht leicht in großem Maßstab ausgeführt werden, da es mit einem Heparin-Pyridin-Komplex, der in wäßrigem oder methanolischem Dimethylsulfoxid gelöst ist, mit den damit verbundenen Problemen ausgeführt wird, beispielsweise: der Abtrennung des Komplexes aus dem Reaktionslösungsmittel, der quantitativen Entfernung des Pyridins, der Wiedergewinnung teuerer Lösungsmittel etc.
Im Gegensatz dazu kann ausgehend von Calcium-Heparin aufgrund der Größe des Gegen-Ions eine selektive N-Desulfatierung in einem wäßrig-sauren Medium erreicht werden, ohne strukturelle Anderungen zu verursachen und ohne das mittlere Molekulargewicht zu beeinflussen.
Insbesondere werden das Braunwerden des Produkts und die Hydrolyse der O-Sulfat-Gruppe vermieden.
Dann wird das teilweise oder vollständig N-desulfatierte Heparin (Zwischenprodukt A) der Acetylierungs-Reaktion unterworfen. Die Heparin-Acetylierung wurde von Danishefsky (Danishefsky, N. Meth. Carb. Chem. 5, (85), 11) und ebenso Nagasawa (Inoue, Y. - Nagasawa, K. Carbohyd, Res. 46, 87-95 (1976)) und durch EP-A-O 165 569 beschrieben. Alle diese Verfahren des Standes der Technik arbeiten mit großen Mengen Essigsäureanhydrid, bei pH 6,5 - 7,0 und im allgemeinen bei niedrigen Temperaturen. Unter diesen Bedingungen und bei niedrigen Temperaturen (0 - 5ºC), wird eine parasitäre O- Acetylierung der freien -OH-Gruppe der Disaccharid-Einheit herbeigeführt.
Es wurde entdeckt und ist der Gegenstand dieser Erfindung, daß wenn eine praktisch stöchiometrische Menge Essigsäureanhydrid (1 - 1,1 Mol (CH&sub3;CO)&sub2;=O/Mol freies Amino N, das zuvor durch die Titrations-Kurve) bestimmt wurde und ein pH von 9,3 bis 9,5 (maximale Obergrenze, die kompatibel mit der Essigsäureanhydrid-Hydrolyse ist) eingesetzt wird, ausschließlich die N-Acetylierung erzeugt wird, wenn man bei 25 - 30ºC arbeitet.
Bei dieser Temperatur ist die Reaktion schnell und innerhalb von 15 min vollständig. Selbst wenn die Reaktion längere Zeit andauert, erzeugt sie keine sekundäre Reaktionen.
Das erhaltene Produkt (Endprodukt B) hat eine äußerst konstante Zusammensetzung und wird durch ein chemisch wohlcharakterisiertes Molekül mit einer präzisen analytischen Beschreibung dargestellt, wie sie in der folgenden Tabelle und den Figuren definiert ist.
Um das Zielprodukt der vorliegenden Erfindung besser zu identifizieren, wird die ¹³C-NMR-Charakterisierung des Produkts hiermit beschrieben.
Das NMR-Spektrum des Endprodukts B (Fig. 1) wurde in D&sub2;O- Lösung bei 75 MHz mittels eines Bruker-Modell-CxP-300- Spektrometers bestimmt. Zu Vergleichszwecken sind auch die Spektren eines Standard-Heparins (Fig. 2) und von Heparansulfat (HS, Fig. 3) beigefügt; diese Spektren korrespondieren mit Spektren, die in der Literatur bekannt sind (B. Casu et al., Arzneim-Forsch. (Drug Research) 33, 135 - 142, 1983).
In Figur 1 sind die Peaks in der Region von 90 - 95 ppm (aufgrund des C-1 anomeren Kohlenstoffs) und in der Region 53 - 61 ppm (aufgrund des C-2 der Aminozuckereinheiten) besonders geeignet, um die verschiedenen Uron-Einheiten zu identifizieren, die Menge dieser Einheiten zu messen, und die Sulfat-Gruppenverteilung auf die Uron- und Hexosamin- Einheiten zu bestimmen.
In diesem Text werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
L-Iduronyl-2-sulfat = Ido A&sub2;SO&sub3;
D-Glucuronsäure = GlcA
Glucosamin-N-sulfat = GlcNSO&sub3;
N-Acetylglucosamin = GlcAc
Glucosamin ohne substituierte Amin-Gruppe = GlcNH&sub2;
r = reduzierte Endgruppen, hauptsächlich bezeichnet als Hexosamin-Einheiten.
Die folgenden relativen Prozentsätze wurden durch Auswertung der Flächen unter den charakteristischen Peaks verschiedener Gruppen berechnet:
IdoA2SO&sub3; = 68,2 %; GlcA = 31,8 %, bezogen auf die Gesamturonsäuren; GlcNSO&sub3; = 37,8 %; GlcNAc, gebunden an IdoA2SO&sub3; = 37,8 %; GlcNAc, gebunden an GlcA = 11,0 %; reduziertes GlcN = 13,4 % bezüglich der gesamten Hexosamine (Auswertung der C-1 Peaks).
Aus der Fläche unter den C-2 und CH&sub3; (N-Acetyl)-Peaks ergab sich der Prozentsatz der GlcNSO&sub3;-Gruppen zu 36,2 % und der Prozentsatz der Gesamt-GlcNAc-Einheiten zu 53 %.
Das Produkt ist analog zu Heparin (aufgrund des hohen Gehalts an IdoA2SO&sub3;-Einheiten, der 71 - 91 % der Gesamturonsäuren im Heparin ausmacht) und zu Heparansulfat (aufgrund seines hohen N-Acetyl-Gruppengehalts von 58 % der gesamten Glucosamine von Heparansulfat); unterscheidet sich aber in beträchtlichem Maß von den oben erwähnten Glycosaminoglycanen durch die vorherrschenden GlcNAc-> IdoA2SO&sub3;-Sequenzen, die in beiden obengenannten GAG in geringen Mengen vorliegen.
Das N-acetylierte Heparin-Derivat gemäß der Erfindung hat die folgenden Charakteristika:
- keine O-acetylierten Gruppen;
- Antikoagulations-Wirkung (APTT Anti-X) von nicht mehr als 10 IU/mg;
- N-Acetyl-Gehalt (ausgedrückt als CH&sub3;CO-) von 3 bis 7 Gew.%, entsprechend einem N-Acetylierungsgrad von 40 % bis 90 %;
- Uronsäuren-Gehalt von 31 ± 1 Gew.%;
- Hexosamin-Gehalt von 32 ± 1 Gew.%;
- organischer Sulfat-Gehalt (als S) von 8 ± 1 Gew.%;
- Molverhältnis von Uron/Hexosamin/S/Acetyl von 1/1/1,5 - 1,7/0,4 - 0,9; und
- eine spezifische optische Drehung von mehr als +35º.
Das folgende Beispiel beschreibt das Originalverfahren zur Herstellung der aus Calcium-Heparin erhaltenen heparinartigen N-acetylierten Verbindung (Endprodukt B). Auf Grundlage von Labormodellen zeigt diese Verbindung fibrinolytische und antithrombotische Wirksamkeit, und ihr fehlt eine Antigerinnungswirkung. Daher ist das Risiko von Hamorrhagien (Blutsturz) niedrig. Die antithrombotische Wirkung wurde unter Verwendung eines Modells bei einem Rattenschwanz nach Bekemeyer getestet (Bekemeyer H. - Hirschelmann, "Agents und Actions", Band 16, Seite 446 (1985)).
Die in vivo-fibrinolytische Aktivität wurde an einem Kaninchenplasma, in das das Produkt injiziert wurde, durch Auswertung der FDP (Fibrin-Depolymerisations-Peptide) unter Verwendung des Boehringer Diagnostika Kits getestet.
Das Herstellungsverfahren ebenso wie die erhaltenen Komplex und ihre Verwendung als fibrinolytische Mittel und Schutzmittel gegen Thrombose sind ein Teil dieser Erfindung. Die Reinigung des Endprodukts B und des Zwischenprodukts A wird nach allgemeinen Techniken unter Verwendung von quaternären Ammoniumsalzen und Ethanol in Kochsalzlösung ausgeführt, wie von Scott beschrieben wurde (Scott, J. Meth. Bioch. Analysis VIII, l45 - 197 (1960)).

Beispiel

1) Herstellung des Calcium-Heparins:

100 g Natriumheparin 150 IU/mg werden in destilliertem Wasser in einer Menge gelöst, die für einen Liter Lösung (10 %) ausreicht. Es wird auf 50ºC erhitzt, und unter Rühren werden 120 g Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), gelöst in 1 l destilliertem Wasser, langsam zugegeben.
Der Niederschlag wird 1 h bei dieser Temperatur stehengelassen und dann durch Zentrifugation abgetrennt. Er wird zweimal mit jedesmal 100 ml einer 1 %igen CTAB-Lösung in Wasser gewaschen, und schließlich wird die erhaltene Festsubstanz in 1 l 2 M CaCl&sub2;-Lösung in Wasser gelöst. Dann wird das Polysaccharid durch Zugabe von 1 Volumen 96 %igem Ethanol ausgefällt. Es setzt sich während der Nacht ab, der Überstand wird verworfen und die erhaltene Festsubstanz in 1 l 2 M CaCl&sub2; in wäßriger Lösung wieder aufgelöst.
Die klare Lösung wird wieder mit einem Volumen 96 %igem Ethanol ausgefällt. Die Festsubstanz läßt man absetzen und löst sie ein weiteres mal in 1 l 2 M CaCl&sub2; wieder auf. Die CTAB-Reste werden durch Zugabe von Bentonit nach Scott (Scott, J. Meth. Bioch. Analysis VIII, 145 - 197 (1960)) entfernt. Der Bentonit wird durch Filtration entfernt und die klare Flüssigkeit zum letzten Mal mit 1 Volumen Ethanol ausgefällt.
Die Festsubstanz wird mit Ethanol wasserfrei gemacht und in einer Vakuumtrockenkammer getrocknet. Dann werden 90 g Calcium-Heparin mit einem Natrium-Gehalt von weniger als 0,1 % erhalten.

2) Herstellung des Zwischenprodukts A:

Die 90 g Calciumpolysaccharid werden durch Rückfluß in einer hinreichenden Menge 0,25 M HCl, um eine 10 %ige Lösung zu erhalten, aufgelöst und auf 80ºC erhitzt. Nach 2 h ist die N- Desulfatierungs-Reaktion praktisch vollständig, wie durch die Abwesenheit einer Antigerinnungswirkung der Flüssigkeit in Reaktion und dem Auftreten eines kräftigen Calciumsulfat- Niederschlags nachgewiesen wird.
Wenn die gewünschte Wirkung erreicht ist, wird die Reaktion unter Einstellung des pH auf 7 durch Zugabe einer 10 M NaOH- Lösung abgebrochen. Eine hinreichende Menge 10 % G/V CO&sub3;Na&sub2;Lösung wird zur vollständigen Ausfällung des CO&sub3;Ca zugegeben und der erhaltene Niederschlag durch Filtration entfernt. Das N-desulfatisierte Polysaccharid wird aus der Flüssigkeit unter Zugabe von 1 Volumen Ethanol isoliert, und man läßt es während der ganzen Nacht absetzen. Das heparaminische Material wird dehydratisiert und in Vakuumtrockenschränken getrocknet.
So werden 60 g Material erhalten, die 50 % freie Amino- Gruppen an den Gesamt-N-Gruppen enthalten (Zwischenprodukt A).

3) Herstellung des Endprodukts B:

50 g Zwischenprodukt A werden in destilliertem Wasser, und zwar einer hinreichenden Menge für 1 l Lösung (5 % G/V), gelöst und der pH mit 10 M NaOH-Lösung auf 9,5 eingestellt. Die Temperatur wird auf 25 bis 28ºC erhöht, und unter Rühren werden 5 ml Essigsäureanhydrid Tropfen für Tropfen zugegeben, wobei der pH bei 9,3 bis 9,5 mit einer NaOH-Lösung gehalten wird. Das Essigsäureanhydrid-Aggregat benötigt etwa 5 min und die Reaktionszeit unter Rühren beträgt 30 min, wonach 10 g NaCl zugegeben werden. Danach wird die gesamte Flüssigkeit in 1 Vol.% Ethanol ausgefällt und während der ganzen Nacht zum Absetzen stehengelassen.
Nachdem es ausgefällt und zum Absetzen gebracht wurde, wird die Paste in 500 ml sterilen Wasser gelöst, 5 g NaCl werden zugegeben, der pH wird auf 6,0 mit 6 M HCl eingestellt und die Filtration wird unter Verwendung von entpyrogenisierten Platten und Sterilisationsmembranen von 0,8 - 0,22 U begonnen. Die filtrierte Flüssigkeit wird mit 1 Vol. Ethanol ausgefällt, filtriert, dehydratisiert und in Vakuumtrockenschränken bei 60ºC während 12 h getrocknet.
55 g N-acetyliertes Produkt werden erhalten, ohne freie Amino-Gruppen, doch mit einer chemischen Zusammensetzung (siehe Titrations-Kuve), analytischen Charakteristika und biologischen und pharmakologischen Eigenschaften, die insgesamt ähnlich sind wie die von natürlichem HS.
Die analytischen Bestimmungen des ursprünglichen Heparins, des Zwischenprodukts A-Komplexes und des Endprodukts B werden nachstehend angegeben. Analytische Bestimmung Natriumheparin Zwischenprodukt A Endprodukt B APPT-Aktivität Anti-X-Aktivität N-Acetyl Uronsäure Hexosamine Organisches Sulfat% (als S) Spezifische Drehung Molverhältnis Uronsäure/Hexosamin/S/Acetyl NH&sub2;/Gesamt-N
Die Figuren 1 bis 3 sind die ¹³C-NMR-Spektra der folgenden Verbindungen:
Fig. 1: Endprodukt B; Fig. 2: Heparin; Fig. 3: Heparansulfat. Die Fig. 4 bis 7 stellen Auswertungen für die folgenden Details dar:
Fig. 4, 6, 7: B-A = Carboxyluronsäure-Gruppe A = Sulfat-Gruppen
Fig. 5 : B-A = Carboxyluronsäure-Gruppen C-(B-A) = Sulfat-Gruppen C-B = freie Amino-Gruppen

Claims

1. Verfahren zur Synthese einer N-acetylierten Verbindung, ausgehend von teilweise oder vollständig N- desulfatierten Heparinen, dadurch gekennzeichnet, daß pro Mol freie Amino-Gruppen, wie bestimmt durch Titration, von 1 bis 1,1 Mole Essigsäureanhydrid bei einem pH zwischen 9,3 und 9,5 und bei einer Temperatur zwischen 25 und 30ºC zugegeben werden.

2. N-acetyliertes Heparin-Derivat mit den folgenden Charakteristika:

- Abwesenheit von O-acetylierten Gruppen;

- Antigerinnungsaktivität (APTT Anti-X) von nicht mehr als 10 IU/mg;

- N-Acetyl-Gehalt (ausgedrückt als CH&sub3;CO-) von 3 bis 7 Gew.%, entsprechend einem N-Acetylierungs-Grad von 40 bis 90 %;

- Uronsäuren-Gehalt von 31 ± 1 Gew.%;

- Hexosamine-Gehalt von 32 ± 1 Gew.%;

- organischer Sulfat-Gehalt (als S) von 8 ± 1 Gew.%;

- Molverhältnis von Uronsäure/Hexosamine/S/Acetyl von 1/1/1,5 - 1,7/0,4 - 0,9; und

- spezifische optische Drehung von mehr als +35ºC.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge des Produkts von Anspruch 2 mit antithrombotischen und fibrinolytischen Eigenschaften und einer niedrigen Antigerinnungsaktivität.

4. N-acetyliertes Heparin-Derivat gemäß Anspruch 2, worin:

- der N-Acetyl-Gehalt (ausgedrückt als CH&sub3;-CO-) 4,3 Gew.% beträgt;

- der Uronsäuren-Gehalt 31,0 Gew.% beträgt;

- der Hexosamine-Gehalt 32,0 Gew.-% beträgt;

- die Antigerinnungsaktivität: APTT Anti-X-Wert 10 IU/mg beträgt;

- der organische Sulfat-Gehalt (als S) 7,8 Gew.% beträgt;

- das Molverhältnis von Uronsäuren/Hexosamine/S/Acetyl 1/1/1,7/0,5 beträgt;

- die spezifische optische Drehung 40º beträgt.