DE68916878T2 - Selektiv O-acylierte Glycosaminoglykane. - Google Patents
Selektiv O-acylierte Glycosaminoglykane.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie sie enthaltende pharmazeutische Zubereitungen und deren Verwendung in der Therapie.
- Unter dem Begriff "Glykosaminoglykan" versteht man Substanzen, die aus Ketten aus Uronsäuren (D-Glucuronsäure oder L-Iduronsäure) und Aminozuckern, wobei es sich bei diesen letzteren um Glucosamine und Galactosamine handelt, aufgebaut sind.
- Die Glykosaminoglykane natürlichen Ursprungs bestehen aus mehr oder weniger homogenen Mischungen von Ketten aus Disaccharideinheiten, die aus einer Uron-Untereinheit (Glucuronsäure oder Iduronsäure) und einer Osamin-Untereinheit (Glucosamin oder Galactosamin), die über eine 1→4- oder 1→3-Bindung verbunden sind, aufgebaut sind.
- Bei den Glykosaminoglykanen sind die Hydroxylgruppen unterschiedlich durch funktionelle Gruppen substituiert, insbesondere durch Sulfatgruppen, während die Aminogruppen der Osamine durch Sulfatgruppen und/oder Acetylgruppen substituiert sind.
- Die hier angesprochenen Glykosaminoglykane umfassen 6 Arten von Produkten: Heparin, Heparansulfat, Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat C, Chondroitinsulfat B, das genauer auch als Dermatansulfat bezeichnet wird, und Hyaluronsäure. Sie sind durch die beiden folgenden Disaccharid-Grundstrukturen (A) und (B) gekennzeichnet:
- in der Reine SO&sub3;&supmin;-Gruppe und/oder eine Acetylgruppe darstellt und das Symbol dafür steht, daß die Carboxylgruppe unterhalb der Ringebene (Iduroneinheit) oder oberhalb der Ringebene (Glucuroneinheit) stehen kann, und
- Die Glykosaminoglykane mit der oben angesprochenen Grundstruktur (A) werden all Glykosaminoglykane (oder auch GAG) des Heparin-Typs bezeichnet und umfassen die Heparine und die Heparansulfate, während die Glykosaminoglykane mit der oben angesprochenen Grundstruktur (B) als GAG des Typs Chondroitinsulfat bezeichnet werden und die Chondroitinsulfate A und C und Dermatansulfat umfassen.
- Die Hyaluronsäure besitzt die Grundstruktur (B), worin das Galactosamin durch ein Glucosamin ersetzt ist.
- Wie bereits oben erwähnt, liegt sowohl bei dem GAG des Heparin-Typs als auch dem GAG des Chondroitinsulfat-Typs ein mehr oder weniger hoher Prozentsatz der Hydroxylgruppen der n Disaccharideinheiten in Form der Ester der Schwefelsäure vor.
- So kann Heparin durch die oben angesprochene Grundstruktur (A) wiedergegeben werden, in der n von 1 bis 80 variieren kann, R in der Mehrzahl der Einheiten n eine SO&sub3;&supmin;-Gruppe darstellt und bei den restlichen Einheiten eine Acetylgruppe, die OH-Gruppen in der 6-Stellung des Glucosamins und in der 2-Stellung der Uronsäure in der Mehrzahl der Fälle Sulfateinheiten darstellen, während die OH- Gruppe in der 3-Stellung des Glucosamins nur bei einer Minderheit der Einheiten sulfatiert ist; die OH-Gruppe in der 3-Stellung der Uronsäure ist praktisch nicht sulfatiert, so daß die Uronsäure bei der Mehrzahl der Einheiten eine Iduronsäure ist.
- Die Produkte mit der Grundstruktur (A) umfassen ebenfalls N-desulfatiertes N- acetyliertes Heparin, welches nach der von K. Nagasawa und Y. Inoue beschriebenen Methode (Carbohydrate Chemistry, Academic Press (1980), Vol. 8, S. 291- 294) hergestellt werden kann. Dieses Heparin wird durch die Formel (A) wiedergegeben, in der R eine Acetylgruppe darstellt.
- Das Heparin enthält weiterhin Bestandteile mit der Struktur (A), worin n von 3 bis 15 variiert, und dem gleichen chemischen Profil. Diese Bestandteile können durch Fraktionlerung mit Hilfe bekannter Verfahrensweisen (siehe beispielsweise die US-Patentschrift 4 692 435) isoliert werden und werden als Heparine mit niedrigem Molekulargewicht (nMG) bezeichnet.
- Es wurden bereits durch Fragmentierung von Heparin gemäß den nachfolgend angegebenen Methoden Heparine mit niedrigem Molekulargewicht hergestellt, deren Molekülverteilung und biologische Eigenschaften im wesentlichen identisch sind mit den Heparinen mit niedrigem Molekulargewicht, die man durch Fraktionierung erhält:
- - Methode der Salpetrigsäure-Depolymerisation und Reduktion (siehe beispielsweise die EP 37 319 oder US 4 686 288), gemäß der das Molekül durch Angriff der Glucosamin-N-sulfat-Untereinheiten zerschnitten wird unter Bildung einer 2,5-Anhydromannit-Endgruppe
- die gegebenenfalls an der primären Hydroxylgruppe in der 6-Stellung sulfatiert ist;
- - Methode der enzymatischen Depolymerisation (z. B. EP 244 235 und 244 236) oder der alkalischen Depolymerisation (z. B. EP 40 144), gemäß der das Molekül durch Angriff der Uron-Untereinheiten zerschnitten wird unter Bildung einer α,β-ungesättigten Uronsäure-Endgruppe
- die gegebenenfalls in der 2-Stellung sulfatiert ist;
- - Methode der oxidativen Depolymerisation (z. B. US 4 281 108 und EP 121 067), gemäß der das Molekül durch Oxidation unter Beibehaltung der "natürlichen" Endgruppen zerschnitten wird.
- Andere Heparine mit niedrigem Molekulargewicht, die eine Molekülverteilung besitzen, die von der von natürlichem Heparin verschieden ist und besondere biologische Eigenschaften aufweisen, können durch Periodoxidation von natürlichem Heparin, gefolgt von einer Depolymerisation durch P-Eliminierung oder saure Hydrolyse hergestellt werden. Die Periodoxidation zerschneidet die nichtsulfatierten Uronsäureeinheiten zwischen den Kohlenstoffatomen in den Stellungen 2 und 3. Es ist bekannt, daß solche Einheiten an der Bindungsstelle für Antithrombin III (AT III) vorhanden sind, dem Plasmainhibitor von verschiedenen Serin-proteasen der Koagulation, und dessen Aktivität durch das als Cofaktor wirkende Heparin stark gesteigert wird. Die Periodoxidation ermöglicht daher die Herstellung von Produkten, die frei sind von einer Bindungsstelle für AT III und die damit im wesentlichen frei sind von einer antikoagulierenden Wirkung.
- Die Heparine mit niedrigem Molekulargewicht dieses Typs können insbesondere dadurch erhalten werden, daß man das in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung EP-A-0 287 477 beschriebene Verfahren anwendet, das die folgenden Stufen umfaßt.
- - Milde Oxidation von Heparin durch Umsetzen von Heparin in wäßriger Lösung mit einer Endkonzentration von 0,5 bis 5% (Gew. /Vol.) mit einem Salz der Periodsäure mit einer Endkonzentration von 0,5 bis 4% (Gew./Vol.) bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 6,5, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 5 und bei einer Temperatur von 0 bis 10ºC während einer Zeitdauer von 15 bis 48 Stunden unter Lichtausschluß;
- - Depolymerisation der erhaltenen Heparinketten durch Zugabe einer starken Base, wie Natriumhydroxid, mit einem pH-Wert von mehr als etwa 11, insbesondere zwischen 1 1 und 12 und mit Vorteil von 11,2 bis 11,6 und noch bevorzugter von etwa 11,5;
- - Reduktion der Depolymerisationsfragmente mit Hilfe eines Reduktionsmittels und, gegebenenfalls nach der Entfernung des nicht umgesetzten Reduktionsmittels,
- - Gewinnung der reduzierten Fragmente durch Ausfällen mit Hilfe eines Lösungsmittels, in dem sie unlöslich sind;
- - Isolierung der gewünschten Fragmente durch Fraktionierung mit Hilfe von Alkohol in Gegenwart eines anorganischen Salzes aus einer wäßrigen Lösung, erhalten durch Inlösungbringen des zuvor isolierten Niederschlags in Wasser und Gewinnen des gebildeten Niederschlags.
- Die Heparine mit niedrigem Molekulargewicht entsprechen der nachfolgenden Formel, (C):
- in der n von 6 bis 15 variieren kann, R bei etwa 90% der n Einheiten eine SO&sub3;&supmin;- Gruppe und bei den restlichen Einheiten eine Acetylgruppe darstellt, die in der 3- Stellung des Glucosamins vorliegenden OH-Gruppen sulfatiert sein können und die in der 6-Stellung des Glucosamins vorliegenden OH-Gruppen bei 70% der Bestandteile sulfatiert sind. Darüber hinaus ist bei einer Einheit pro mindestens 2 Ketten dieses Heparins mit niedrigem Molekulargewicht die Iduronsäure durch eine nichtsulfatierte Uronsäureeinheit (D-Glucuronsäure oder L-Iduronsäure), die zwischen den Kohlenstoffatomen in den Stellungen 2 und 3 geöffnet ist, der folgenden Formel ersetzt:
- Solche Heparine mit niedrigem Molekulargewicht können auch durch Gelfiltration unter Anwendung bekannter Verfahrensweisen fraktioniert werden, so daß man Mischungen von Fragmenten erhält, die im Hinblick auf ihr Molekulargewicht homogen sind und frei sind von der Bindungsstelle für AT III.
- Andere Glykosaminoglykane des Heparin-Typs sind aus GAG der Formel (A) oder (C) gebildet, bei denen die von der Uronsäure getragene Carboxylgruppe verestert ist, beispielsweise durch Kondensation mit einem Alkohol in Gegenwart eines Kondensationsmittels des Carbodiimid-Typs, wie es in der französischen Patentschrift 2 159 724 beschrieben ist, oder aber auch durch Alkylierung der Carboxylgruppe mit einem Alkylhalogenid in Gegenwart einer schwachen Base.
- In gleicher Weise sind die Glykosaminoglykane des Chondroitinsulfat-Typs durch Glykosaminoglykane der Formel (B) gebildet, worin die Carboxylgruppen der Uronsäuren verestert sind, beispielsweise durch Alkylierung der Carboxylgruppen mit einem Alkylhalogenid in Gegenwart einer schwachen Base.
- Die Bildung dieser Ester ist für die Hyoluronsäure durch Behandeln der Hyaluronsäure in Form des quartären Ammoniumsalzes mit einem Alkohol in Gegenwart eines Katalysators oder einem Veretherungsmittel in der europäischen Patentschrift Nr. 215 453 beschrieben.
- Heparansulfat wird durch die oben angegebene Formel (A) wiedergegeben, in der n von 1 bis 80 variieren kann, Rinder Mehrzahl der Bestandteile eine Acetylgruppe und in der Minderheit der Bestandteile eine SO&sub3;&supmin;-Gruppe bedeutet. Darüber hinaus sind bei der Mehrzahl der Bestandteile die Hydroxylgruppen in der 6-Stellung des Glucosamins sulfatiert, während die Uronsäure bei der Mehrzahl der Bestandteile die Glucuronsäure ist.
- Die Chondroitinsulfate A und C werden durch die obige Formel (B) wiedergegeben, in der n von 1 bis 80 variieren kann und bei denen die 4-OH- und 6-OH-Gruppen des Glucosamins sulfatiert sind, wobei die Uronsäure bei der Mehrzahl der Bestandteile eine Glucuronsäure ist.
- Dermatansulfat besitzt eine Struktur, die im wesentlichen identisch ist mit der von Chondroitinsulfat A, wobei jedoch die Uronsäure-Untereinheit in der Mehrzahl der Bestandteile eine Iduronsäure ist.
- Dermatansulfat-Fragmente der obigen Formel (B), worin n von 1 bis 20 variieren kann, können durch Periodoxidation, gefolgt von einer Reduktion mit Natriumborhydrid und einer sauren Hydrolyse, erhalten werden, wie es von L. A. FRANS- SON und I. CARLSTEDT beschrieben worden ist (Carbohydr. Res. 36 (1974), 349- 358).
- Die Glykosaminoglykane besitzen eine Vielzahl von biologischen Wirkungen, darunter ihre Wirkung gegenüber Koagulationsfaktoren oder Gerinnungsfaktoren, die über verschiedene Plasmaproteine ausgeübt werden können. Von Heparin ist darüber hinaus aus der Literatur bekannt, daß Heparin oder bestimmte Derivate davon, die gegebenenfalls eine antikoagulierende Wirkung besitzen, eine regulierende Wirkung auf die Vermehrung der Zellen der glatten Muskulatur auf den Gefäßwandungen (GUYTON et al., Circ. Res. 46 (1980), 625-634) oder eine inhibierende Wirkung auf Heparanase ausüben, einem Enzym, das bei den Mechanismen der Metastasenausbreitung auftritt (europäische Patentanmeldung Nr. 254 067). Darüber hinaus stellen die Glykosaminoglykane einen Teil der großen Familie der sulfatierten Polysaccharide dar, von denen gewisse eine antivirale Wirkung in mehr oder weniger starkem Ausmaß gezeigt haben (BABA et al., AntimicrobAgents Chemother. 32 (1981), 1742-1745) und insbesondere eine Anti-HIV- Wirkung (HIV-Virus Human Immunodeficiency Virus) (BABA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85 (1988), 6132-6136).
- Im folgenden wird die Abkürzung GAG zur Bezeichnung von Glykosaminoglykan verwendet, welches entweder eine natürliche Struktur aufweist, wie man sie durch Extraktion, Halbsynthese oder Synthese erhält, oder eine Struktur, die an den funktionellen Carboxylgruppen oder Aminogruppen vor der Acylierungsreaktion chemisch modifiziert worden ist und selektiv O-acylierte GAG ergeben.
- Trotz ihrer pharmakologischen Wirkungen von großen Interesse besitzen die natürlichen GAG den Nachteil, daß sie eine relativ kurze Halblebensdauer besitzen, was eine wiederholte Verabreichung notwendig macht. Dieser Nachteil wurde zum Teil durch die Verabreichung von Heparinderivaten mit niedrigem Molekulargewicht auf subkutanem Wege bei der Vorbeugung und der Behandlung von Venenthrombosen wettgemacht, wodurch es möglich wird, die Verabreichungshäufigkeit auf eine Injektion pro Tag zu verringern.
- Es besteht jedoch ein sehr starkes Bedürfnis, über Derivate mit einer verzögerten Wirkung zu verfügen, die es ermöglichen würden, die Häufigkeit der Verabreichung dieser Produkte durch Steigerung ihrer Wirkungsdauer noch weiter zu verringern.
- Es kann auch von großem Interesse sein, über nicht-antikoagulierende Derivate "mit verzögerter Wirkung" zu verfügen, wie jene des N-desulfatierten und N-acetylierten Heparins, dessen Wirkung als Heparanase-Inhibitor, welches bei den Phänomenen der Metastasenausbreitung auftritt, oben bereits angesprochen worden ist.
- In der Literatur wird eine Vielzahl von Derivaten von Glykosaminoglykanen beschrieben, die zur Verbesserung ihrer pharmakokinetischen Eigenschaften modifiziert worden sind, insbesondere in Form der Ester der Carboxylgruppe der Uronsäuren oder der Hydroxylgruppen.
- So wurde insbesondere die teilweise oder vollständige Veresterung der Carboxylgruppen des Heparins benützt, welches in Form des quartären Ammoniumsalzes in einem inerten Lösungsmittel mit einem Alkohol oder einem Halogenderivat und gegebenenfalls in Gegenwart eines Kondensationsmittels behandelt wird (französisches Patent Nr. 2 159 724 und europäisches Patent Nr. 44228). Die durch Veresterung mit Hilfe von Alkohol in Gegenwart eines Katalysators oder durch Reaktion mit einem Veretherungsmittel erhaltenen Derivate der Hyaluronsäure sind ebenfalls beschrieben worden (europäisches Patent Nr. 216 453).
- Darüber hinaus wurden in der Literatur verschiedene Möglichkeiten beschrieben, die GAG an ihren primären und sekundären Hydroxylgruppen zu verestern.
- So beschreibt die unter der Nr. 2 584 728 veröffentlichte französische Patentanmeldung ein Verfahren zur Sulfatierung von Glykosaminoglykanen oder Fragmenten von Glykosaminoglykanen, wodurch es möglich wird, Schwefelsäureestergruppen anstelle der primären Hydroxylgruppen einzuführen.
- In der Literaturstelle Can. J. Res., 258 (1947), 472-476 ist ein acetyliertes Derivat von Heparin beschrieben, welches einem Mol Acetylgruppen pro vier Saccharideinheiten entspricht. Das Produkt wird durch Behandeln von Heparin mit Keten in Aceton hergestellt. Wenngleich in dieser Veröffentlichung angegeben ist, daß das erhaltene Produkt ein O-acetyliertes Derivat ist, ist es gut bekannt, daß das Keten in Gegenwart von Carboxylgruppen Anhydride ergibt (vgl. J. March, Advanced Organic Chemistry; Reactions, Mechanisms and Structure, J. Willey and Sons Eds. (1985), S. 686-687: "Mit Ketenen ergeben Carbonsäuren Anhydride und Essigsäureanhydrid wird in dieser Weise industriell hergestellt:
- Demzufolge beschreibt diese Veröffentlichung in der Tat ein Heparin, bei dem die O-acetylierten Gruppen mit gemischten Anhydriden zwischen der COO&supmin;-Gruppe der Uronsäure und der Acetylgruppe des Ketens verbunden sind, was ihre Instabilität in Wasser erklärt.
- Das französische Patent 2 100 735 beschreibt hydrolysierbare Teilester aus Heparin und einer nichttoxischen organischen Säure, insbesondere von 4-Chlorphenoxyisobuttersäure, 4-Chlorphenoxyessigsäure, Cholinsäure, Nikotinsäure, Pyridylessigsäure, N-Oxy-pyridylessigsäure oder Linolsäure. Die in dem obigen Patent beschriebene Herstellungsmethode, die gekennzeichnet ist durch die Reaktion eines quartären Salzes des Heparins mit der mit einem Carbodiimid aktivierten Säure ergibt nicht nur das O-acylierte Derivat, sondern auch eine erhebliche Menge eines in Form eines O-Acylisoharnstoffester-Derivats stabilen Nebenprodukts. Darüber hinaus kann diese Art von Reaktion die Bildung von Anhydriden begünstigen und Intramolekulare Reaktionen zwischen den Säuregruppen und den Hydroxylgruppen des Heparins.
- Das japanische Patent 74/048533 beschreibt O-Ester von Chondroitinsulfat mit aromatischen, arylaliphatischen oder heterocyclischen Säuren, die gegebenenfalls eine verlängerte Wirkungsdauer besitzen. Die in diesem Dokument beschriebene Herstellungsmethode, die durch die Reaktion der Chondroitinschwefelsäure mit einem Säurechlorid gekennzeichnet ist, ergibt als Nebenreaktion eine N-Acylierung.
- Die internationale Patentanmeldung WO 83/00150 beschreibt ganz allgemein Arzneimittelvorläufer, die durch Reaktion von verschiedenen Funktionen der GAG, darunter die Hydroxylgruppe, hergestellt worden sind und in spezifischer Weise einen O-Ester des Chondroitinsulfats mit Penicillin V umfassen. Die Herstellung dieses Produkts wird über ein Carbodiimid bewirkt und umfaßt damit die oben angesprochenen Nebenreaktionen.
- Das europäische Patent 0 046 828 und das entsprechende US-Patent 4 331 697 beschreiben O-Ester von Heparin mit ungesättigten Säuren, insbesondere mit Acrylsäure oder Methacrylsäure, welche durch Aufpfropfen auf die biomedizinischen Materialien ihnen eine antithrombotische Wirkung langer Wirkungsdauer verleihen. Dieser Pfropfvorgang wird durch eine kovalente Bindung im Bereich der α,β-ungesättigten Bindungen dieser Ester mit der Oberfläche der Materialien, die mit dem Blut in Kontakt treten, bewirkt. Nach diesem Dokument erhält man die α,β-ungesättigten O-Ester durch Reaktion von Heparin mit einem α,βungesättigten Carbonsäurechlorid oder -anhydrid. Darüber hinaus offenbart die Beschreibung, welche in undifferenzierter Weise die Verwendung von Chloriden oder Anhydriden von α,β-ungesättigten Säuren als Reagenzien anspricht, nicht, welche Arten von O-Estern von Heparin in dieser Weise erhalten werden.
- Das europäische Patent 256 880 beschreibt die Veresterung von Heparin oder Heparin mit niedrigem Molekulargewicht durch Einwirkung von Säurechloriden in Formamid und Pyridin unter Bildung von Derivaten mit einer gesteigerten Transmembran-Permeabilität. Jedoch führt diese Methode zu Derivaten, die eine teilweise Desulfurierung erleiden und die O-, jedoch auch N-acetyliert sind, und bei denen das Sulfat/Carboxyl-Verhältnis verändert ist. Ein analoges Verfahren ist auch in Chemical Abstracts, Vol. 75 (1971), Seite 100, Abstract 7728a beschrieben. Nach diesem Verfahren bewirkt man eine O-Acylierung der Chondroitinsulfate mit Hilfe von Fettsäurechloriden in organischen Lösungsmitteln oder wäßrigem Alkali.
- Die französische Patentschrift 3 066M beschreibt die Acetylierung von N-Monomethylheparinamid durch Einwirkung von Essigsäureanhydrid in Formamid und Pyridin. Das Ausgangsprodukt ist ein Heparinderivat, dessen Carboxylgruppen durch Amidgruppen ersetzt sind.
- Das für die Acetylierung verwendete Verfahren benützt nicht ein in organischem Medium lösliches Salz. Aufgrund dieser Tatsache kann die Acetylierungsreaktion nicht mit Präzision gesteuert werden und ermöglicht lediglich die Erzielung einer geringen Acetylierungsausbeute. Wenn man darüber hinaus das beschriebene Verfahren auf Heparin anwendet, dessen Carboxylgruppen nicht blockiert sind, so erhält man eine starke Bildung von gemischten Anhydriden zwischen den Carboxylgruppen des Heparins und des Essigsäureanhydrids, wobei diese unerwünschten Nebenprodukte nicht aus dem Medium entfernt werden.
- Das japanische Patent 5128602 beschreibt die Acylierung von Heparin durch Einwirkung eines Säureanhydrids in Formamid. Bei dem angewandten Verfahren liegt Heparin nicht in Form eines in dem organischen Medium löslichen Salzes vor, was es nicht ermöglicht, die Acylierungsreaktion genau zu steuern, und hat die Erzielung eines niedrigen Acetylierungsgrads zur Folge. Darüber hinaus ergibt das beschriebene Verfahren die Anwesenheit von gemischten Anhydriden als Reaktionsnebenprodukte in dem Medium.
- Es wäre daher von Interesse, über spezifischere Produkte zu verfügen, deren Herstellungsverfahren eine gute Reproduzierbarkeit besitzt.
- Es hat sich nunmehr gezeigt, daß, wenn man ein in organischem Medium lösliches Salz eines GAG, wie ein tertiäres oder quaternäres Ammoniumsalz, mit dem Anhydrid einer Carbonsäure in einem aprotischen polaren Lösungsmittel umsetzt, man eine selektive Acylierung der freien Hydroxylgruppen erzielt ohne Veränderung der Carboxylgruppen oder Aminogruppen des eingesetzten GAG. Die Verwendung des GAG in Form eines in dem organischen Medium löslichen Salzes ermöglicht es in vorteilhafter Weise, die Acylierungsreaktion mit großer Präzision zu steuern. Darüberhinaus ist der Acylierungsgrad leicht einstellbar und kann, ohne daß hierdurch eine Veränderung des Rests des Moleküls bewirkt wird, erhöht werden. Insbesondere kann man einen Acylierungsgrad von 0,1 bis 3 Acylgruppen pro Disaccharideinheit und insbesondere von 0,5 bis 2 Acylgruppen erreichen.
- Es hat sich weiterhin gezeigt, daß sich kein N-acyliertes Derivat bildet und daß, wenn sich Anhydride im Bereich der Carboxylgruppen ergeben, die Verwendung einer schwachen Base es ohne weiteres ermöglicht, sie wieder in die freie Säure umzuwandeln.
- In vorteilhafter Weise ermöglicht die selektive Acylierung der GAG nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Modulierung ihrer biologischen Wirkung, die in gewissen Fällen stark gesteigert wird.
- Es wurde schließlich gefunden, daß die in dieser Weise erhaltenen O-acylierten GAG eine pharmakologische Wirkung mit längerer Wirkungsdauer entfalten.
- Somit betrifft ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane der folgenden Formel I:
- A-[G-U]n-B (I)
- in der - G eine Gruppe (a) der Formel:
- oder eine Gruppe (a') der Formel:
- oder eine Gruppe (b) der Formel:
- - U eine Gruppe (c) der Formel:
- oder eine Gruppe (d) der Formel:
- oder den Rest der Gruppe (c) oder der Gruppe (d) nach der Periodoxidation gefolgt von einer β-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse;
- - A eine Gruppe R&sub1;, eine Gruppe R&sub1;-(c), eine Gruppe R&sub1;-(d) oder eine Gruppe (e) der Formel:
- oder den Rest der Gruppe (c) oder der Gruppe (d) nach der Periodoxidation gefolgt von einer -Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse;
- - B eine Gruppe O-R&sub1;, eine Gruppe (a)-OR&sub1;, eine Gruppe (a')-OR&sub1;, eine Gruppe
- (b)-OR&sub1; oder eine Gruppe (f) der Formel:
- oder eine Gruppe (g) der Formel:
- oder eine Gruppe (a), eine Gruppe (a') oder eine Gruppe (b), an welche ein Rest von (c) oder von (d) gebunden ist, wie er nach der Periodoxidation gefolgt von einer β- Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse vorliegt;
- - R&sub1; H, SO&sub3;&supmin; oder eine Acylgruppe einer nicht-α,β-ungesättigten Carbonsäure oder Dicarbonsäure ausgewählt aus:
- einer Alkanoylgruppe mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen,
- einer Alkanoylgruppe mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen substituiert mit:
- · einer Cycloalkylgruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen oder
- · einer ungesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppe mit 4 bis 16 Kohlenstoffatomen;
- einer Benzoylgruppe, die gegebenenfalls durch eine oder mehrere Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogenatome oder NO&sub2;- oder OCH&sub3;-Gruppen substituiert ist,
- einer (C&sub3;&submin;&sub7;)-Cycloalkyl-carbonylgruppe;
- - R&sub2; SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acetylgruppe mit der Maßgabe, daß der Anteil von N- Acetylglucosamin höchstens gleich ist demjenigen von Heparin, wenn R&sub1; eine Acetylgruppe darstellt;
- - R&sub3; ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine Phenylalkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation; und
- - n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 80 bedeuten,
- wobei R&sub1; mit der Maßgabe eine Acylgruppe bedeutet, daß mindestens 0, 1 bis 3 Acylgruppen pro Disaccharid-Einheit vorliegen, und deren pharmazeutisch annehmbare Salze,
- erhältlich ausgehend von einem Glykosaminoglykan ausgewählt aus der Gruppe, die gebildet wird durch:
- Heparin, einer Mischung von Heparinfragmenten mit einem Molekulargewicht von weniger als 10.000 Dalton, einer Mischung von Heparinfragmenten mit einem mittleren Molekulargewicht zwischen 2.000 und 7.000 Dalton, einer Mischung von Heparinfragmenten mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 4.500 Dalton, einer Mischung von Heparinfragmenten mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 2.500 Dalton oder einer Mischung von Heparinfragmenten mit gleichem Molekulargewicht, einer Heparinfraktion oder einem Heparinfragment, welches frei ist von Bindungsstellen für Antithrombin III, Dermatansulfat und dessen Fragmente,
- welches man:
- (1) in ein tertiäres Aminsalz oder ein quaternäres Ammoniumsalz des Glykosaminoglykans umwandelt, das in einem aprotischen polaren Lösungsmittel löslich ist;
- (2) dieses Salz mit einem Anhydrid der Formel:
- R&sub1;-O-R&sub1;
- in der R&sub1; eine Acylgruppe, wie sie oben definiert worden ist, bedeutet, in dem aprotischen polaren Lösungsmittel und in Gegenwart von katalytischen Mengen von Pyridin oder eines Dialkylaminopyridins und eines Protonenakzeptors bei einer Temperatur zwischen 0ºC und 100ºC behandelt;
- (3) man das in diese Weise erhaltene Produkt durch Einwirkung einer Lösung von Natriumacetat in Ethanol ausfällt und
- (4) das selektiv O-acylierte Glykosaminoglykan durch Auflösen des in dieser Weise erhaltenen Niederschlags in Wasser und Dialyse isoliert und gegebenenfalls das in dieser Weise erhaltene Natriumsalz des selektiv O-acylierten Glykosaminoglykans in ein anderes pharmazeutisch annehmbares Salz umwandelt.
- Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die ausgewählten Glykosaminoglykane Glykosaminoglykane des Heparin-Typs, d. h. das Heparin von Heparinderlvaten, die man entweder durch Fraktionierung oder durch Halbsynthese oder Synthese erhält, das Heparinsulfat und dessen Derivate, die man durch Fraktionierung. Halbsynthese oder Synthese erhält.
- Die selektiv O-acylierten Glykosaminoglykane dieses Typs der vorliegenden Erfindung entsprechen der folgenden Formel II:
- in der
- - A die oben bezüglich der Formel (I) angegebenen Bedeutungen besitzt;
- - R&sub1; H und/oder SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acylgruppe, wie sie bezüglich der Formel (I) definiert worden ist;
- - R&sub2; SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acetylgruppe mit der Maßgabe, daß der Anteil von N- Acetylglucosamin höchstens gleich ist jenem von Heparin, wenn R&sub1; eine Acetylgruppe darstellt;
- - R&sub3; ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine Phenylalkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation;
- - B (a)-OR&sub1; oder (f), wobei (a) und (f) die oben bezüglich der Formel (I) angegebenen Bedeutungen besitzen, oder OR&sub1; oder eine Gruppe (a), an die ein Rest von (c) oder (d) gebunden ist, wie er nach der Periodoxidation, gefolgt von einer β-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse vorhanden ist; und
- - n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 80 bedeuten.
- Eine bevorzugte Familie IIa der erfindungsgemäßen Verbindungen sind die Verbindungen der Formel II:
- in der
- - A die oben bezüglich der Formel (I) angegebenen Bedeutungen besitzt;
- - R&sub1; H und/oder SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acylgruppe, wie sie bezüglich der Formel (I) definiert worden ist;
- - R&sub2; SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acetylgruppe mit der Maßgabe, daß der Anteil von N- Acetylglucosamin höchstens gleich ist jenem von Heparin, wenn R&sub1; eine Acetylgruppe darstellt;
- - R&sub3; ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine Phenylalkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation;
- - B (a)-OR&sub1; oder (f), wobei (a) und (f) die oben bezüglich der Formel (I) angegebenen Bedeutungen besitzen, oder OR&sub1; oder eine Gruppe (a), an die ein Rest von (c) oder (d) gebunden ist, wie er nach der Periodoxidation, gefolgt von einer β-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse vorhanden ist; und
- - n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 80 mit der Maßgabe bedeuten, daß, wenn AR&sub1;, eine Gruppe R&sub1;-(c) oder eine Gruppe R&sub1;-(d) und BO-R&sub1; darstellen, n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 16 bedeutet.
- Eine weitere bevorzugte Familie IIb der erfindungsgemäßen Verbindungen umfaßt die Verbindungen der Formel II:
- in der
- - A und B die oben bezüglich der Formel (I) angegebenen Bedeutungen besitzen;
- - R&sub1; H und/oder SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acylgruppe einer nicht-α,β-ungesättigten Carbonsäure oder Dicarbonsäure ausgewählt aus:
- einer Alkanoylgruppe mit 4 bis 18 Kohlenstoffatomen,
- einer Alkanoylgruppe mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen substituiert durch:
- · eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen oder
- · eine ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 4 bis 16 Kohlenstoffatomen;
- einer Benzoylgruppe, die gegebenenfalls durch eine oder mehrere Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogenatome oder NO&sub2;- oder OCH&sub3;-Gruppen substituiert ist,
- einer (C&sub3;&submin;&sub7;)-Cycloalkyl-carbonylgruppe;
- - R&sub2; SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acetylgruppe mit der Maßgabe, daß der Anteil von N- Acetylglucosamin höchstens gleich ist jenem von Heparin, wenn R&sub1; eine Acetylgruppe darstellt;
- - R&sub3; ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Phenylalkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation; und
- - n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 80 mit der Maßgabe bedeuten, daß R&sub1; in dem Ausmaß Acyl bedeutet, daß mindestens 0,5 bis 2 Acylgruppen, vorzugsweise eine Acylgruppe, pro Disaccharid-Einheit vorliegen.
- Vorteilhafte erfindungsgemäße Verbindungen sind die Verbindungen, die den Familien (IIa) und (IIb) angehören, worin R&sub3; ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation bedeutet.
- Andere Gruppen von vorteilhaften Verbindungen entsprechen den Verbindungen, die den Familien (IIa) und (IIb) angehören, worin R&sub3; eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder eine substituierte Phenylalkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeutet.
- Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man Mischungen von Heparinfragmenten mit einem Molekulargewicht von weniger als 10.000 Dalton und insbesondere entweder jene mit einem mittleren Molekulargewicht zwischen 2.000 und 7.000 Dalton oder jene mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 4.500 Dalton oder auch jene mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 2.500 Dalton.
- Für ihre Herstellung kann man mit Vorteil ein Depolymerisationsverfahren mit salpetriger Säure anwenden, wie es beispielsweise in dem europäischen Patent 37319 beschrieben ist. Die erfindungsgemäßen selektiv O-acylierten Glykosaminoglykane entsprechen dann der folgenden Formel III:
- in der:
- - A R&sub1; oder R&sub1;-(c) oder R&sub1;-(d) wie sie bezüglich der Formel (I) definiert worden sind;
- - R&sub1; H und/oder SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acylgruppe, wie sie bezüglich der Formel (I) definiert worden ist;
- - R&sub2; -SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acetylgruppe mit der Maßgabe, daß der Anteil von N- Acetylglucosamin höchstens gleich ist dem von Heparin, wenn R&sub1; eine Acetylgruppe darstellt;
- - R&sub3; ein Wasserstoffatom und/oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder eine Phenylalkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation; und
- - n eine ganze Zahl mit einem Wert von 3 bis 12 bedeuten.
- Die bevorzugten Verbindungen der vorliegenden Erfindung entsprechen den Verbindungen der Formel (III), worin R&sub1; eine Alkanoylgruppe mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellt.
- Zur Herstellung der Mischungen aus Heparinfragmenten mit einem Molekulargewicht von weniger als 10.000 Dalton kann man auch ein enzymatisches Depolymerisationsverfahren anwenden, wie es beispielsweise in den europäischen Patenten 244 235 und 244 236 beschrieben ist oder eine alkalische Depolymerisation, beispielsweise die in dem europäischen Patent 40 144 beschriebene.
- In diesem Fall können die erfindungsgemäßen selektiv O-acylierten Glykosaminoglykane durch die folgende Formel IV wiedergegeben werden:
- in der
- - R&sub1; H und/oder SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acylgruppe, wie sie bezüglich der Formel (I) definiert worden ist;
- - R&sub2; SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acetylgruppe mit der Maßgabe, daß der Anteil von N- Acetylglucosamin höchstens gleich ist jenem von Heparin, wenn R&sub1; eine Acetylgruppe darstellt;
- - R&sub3; ein Wasserstoffatom und/oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder eine Phenylalkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen oder ein Alkallmetall- oder ein Erdalkallmetall-Kation;
- - B (a)-OR&sub1;, wie es bezüglich der Formel (I) definiert worden ist, oder OR&sub1;; und
- - n eine ganze Zahl mit einem Wert von 2 bis 20 bedeuten.
- Von den Verbindungen der Formel (IV) sind jene vorteilhaft, bei denen R&sub1; eine Alkanoylgruppe mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellt.
- Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann man eine Mischung von Heparinfragmenten, die im Hinblick auf ihr Molekulargewicht homogen sind, oder ein durch Synthese hergestelltes Heparinfragment, welches im Hinblick auf sein Molekulargewicht und seine Funktionlisierung homogen ist, verwenden.
- Gemäß einem weiteren interessanten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann man als Glykosaminoglykane Heparinfragmente verwenden, die frei sind von einer Bindungsstelle für AntithrombinIII (ATIII), d. h. bei denen die Heparinketten in der Weise fraktioniert worden sind, daß Oligosaccharidketten entfernt worden sind, welche die Bindungsstelle für AT III tragen, indem man beispielsweise eine Affinitätschromatographie über Sepharose-AT III-Harz oder eine Ionenaustauscherchromatographie durchführt, wie es von E. Sache et al. (Thromb. Res. 25 (1982), S. 442-458) beschrieben worden ist, oder bei denen diese Stellen beispielsweise durch Periodat-Depolymerisation, gefolgt von einer β-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse, zerstört worden sind.
- Solche Verbindungen können der folgenden Formel V entsprechen:
- in der
- - A R&sub1;-(c), R&sub1;-(d) oder den Rest von (c) oder von (d) nach einer Periodoxidation, gefolgt von einer β-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse;
- - B (a)-OR&sub1; oder eine Gruppe (a), an der ein Rest (c) oder (d), wie er nach der Periodoxidation, gefolgt von einer β-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse vorhanden ist, gebunden ist;
- - R&sub1; die bezüglich der Formel (I) angegebenen Bedeutungen;
- - R&sub2; SO&sub3;&supmin; oder eine Acetylgruppe, wobei der Anteil von SO&sub3;&supmin; etwa 90% beträgt;
- - R&sub3; ein Wasserstoffatom oder ein Alkallmetall- oder Erdalkalimetall-Kation; und
- - n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 80 bedeuten.
- Besonders vorteilhafte Verbindungen können ausgehend von Verbindungen erhalten werden, die durch ein Verfahren hergestellt worden sind, bei dem eine Periodoxidation, gefolgt von einer alkalischen β-Eliminierung, einer Reduktion und einer Fraktionierung durchgeführt wird, wie es oben bereits beschrieben worden ist. Diese Verbindungen entsprechen der folgenden Formel VI:
- in der:
- - A R&sub1;, R&sub1;-(c), R&sub1;-(d) oder den Rest von (c) oder von (d) nach einer Periodoxidation, gefolgt von einer β-Eliminierung;
- - U eine Gruppe der Formel:
- aus der sich für mindestens zwei Ketten eine geöffnete, nicht-sulfatierte Uronsäure (D-Glucuronsäure oder L-Iduronsäure) zwischen den Kohlenstoffatomen in den Positionen 2 und 3 ergibt, der Formel:
- - B (a)-OR&sub1; oder OR&sub1; oder eine Gruppe (a), an die ein Rest von (c) oder von (d) gebunden ist, wie er nach der Periodoxidation, gefolgt von einer β-Eliminierung vorhanden ist;
- - R&sub1; die bezüglich der Formel (I) angegebenen Bedeutungen;
- - R&sub2; SO&sub3;&supmin; oder eine Acetylgruppe, wobei der Anteil von SO&sub3;&supmin; etwa 90% beträgt;
- - R&sub3; ein Wasserstoffatom oder ein Alkallmetall- oder Erdalkalimetall-Kation;
- und
- - n eine ganze Zahl mit einem Wert von 2 bis 18 bedeuten.
- Vorteilhafte Verbindungen der Formel VI sind jene, worin n eine ganze Zahl mit einem Wert von 7 bis 15 für die Mehrzahl der sie bildenden Bestandteile bedeutet.
- Vorteilhafte Verbindungen der Formeln V und VI und insbesondere der Formel VI, worin n eine ganze Zahl mit einem Wert von 7 bis 15 für die Mehrzahl der Bestandteile darstellt, sind jene, worin R&sub1; eine Alkanoylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 4 bis 10 Kohlenstoffatomen und noch bevorzugter 4 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet.
- Andere bevorzugte Verbindungen der Formel VI sind Mischungen von Verbindungen, die im Hinblick auf ihr Molekulargewicht homogen sind, die man durch Gelfiltration erhält und bei denen n eine ganze Zahl mit einem Wert von 2 bis 12 bedeutet.
- Von den Verbindungen mit Heparinstruktur, die frei sind von einer Bindungsstelle für ABT III und die damit von einer antikoagulierenden Wirkung frei sind, entspricht eine Familie von vorteilhaften Verbindungen den N-desulfatierten, N-acetylierten, selektiv O-acylierten Heparinderivaten der folgenden Formel VII:
- in der:
- - AR&sub1;, R&sub1;-(c) oder R&sub1;-(d), wie sie bezüglich der Formel (I) definiert worden sind;
- - R&sub1; eine Alkanoylgruppe mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen;
- - R&sub3; ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetall- oder Erdalkallmetall-Kation;
- - B (a)-OR&sub1;, wie es bezüglich der Formel (I) definiert worden ist, oder OR&sub1;; und
- - n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 80 bedeuten.
- Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung sind die ausgewählten Glykosaminoglykane solche des Chondroitinsulfat-Typs, d. h. Chondroitin-4- und -6-sulfat, Dermatansulfat und deren Fragmente.
- Die erfindungsgemaßen selektiv O-acylierten Glykosaminoglykane dieses Typs werden durch die folgenden Formel VIII wiedergegeben:
- in der:
- - A die bezüglich der Formel (I) angegebenen Bedeutungen besitzt;
- - R&sub1; H und/oder SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acylgruppe, wie sie bezüglich der Formel (I) definiert worden ist;
- - R&sub3; ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder eine Phenylalkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation;
- - B (b)-OR&sub1; oder (g), wie es bezüglich der Formel (I) definiert worden sind, oder OR&sub1; oder eine Gruppe (b), an die ein Rest von (c) oder von (d) gebunden ist, wie er nach der Periodoxidation, gefolgt von einer β-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse vorhanden ist; und
- - n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 80 bedeuten.
- Von den Verbindungen der Formel (VIII) entspricht eine vorteilhafte Familie den Verbindungen, worin R&sub3; ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation bedeutet.
- Weitere vorteilhafte Verbindungen der Formel (VIII) sind jene, worin R&sub3; eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder eine Phenylalkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeutet.
- Eine weitere vorteilhafte Familie von Verbindungen der Formel (VIII) entspricht den Verbindungen, worin R&sub1; eine Alkanoylgruppe mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellt.
- Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der selektiv O-acylierten Glykosaminoglykane.
- Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man das Glykosaminoglykan in ein in organischem Medium lösliches Salz umwandelt und dieses Salz mit einem Acylierungsmittel behandelt, welches dazu geeignet ist, die primären und sekundären Hydroxylgruppen dieses Glykosaminoglykans selektiv zu acylieren, ohne die vor der Acylierungsreaktion an diesem Glykosaminoglykan funktionellen Gruppen NHR&sub2; oder COOR&sub3; zu verändern, wobei die Reaktion in einem polaren aprotischen Lösungsmittel in Gegenwart eines Katalysators und in Gegenwart einer Base, die dazu geeignet ist, die im Verlaufe der Acylierungfreigesetzte Säure abzufangen, bei einer Temperatur zwischen 0ºC bis 100ºC durchgeführt wird.
- Das Produkt wird dann mit Hilfe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels ausgefällt, wie Methanol, dem man einen Hilfsstoff zusetzen kann, der die Ausfällung begünstigt, wie ein anorganisches Salz. Das O-acylierte Glykosaminoglykan wird durch Auflösen des Niederschlags in Wasser gelöst und mit Vorteil in Gegenwart einer schwachen Base dialysiert.
- Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform wird das erfindungsgemäß e Verfahren gemäß den folgenden Stufen durchgeführt, daß man:
- (1) ein Glykosaminoglykan der Formel IX:
- Aº - [Gº - Uº]n - Bº (IX)
- in der:
- - Gº eine Gruppe (a)º der Formel:
- oder eine Gruppe (a')º der Formel:
- oder eine Gruppe (b)º der Formel:
- - Uº eine Gruppe (c)º der Formel:
- oder eine Gruppe (d)º der Formel:
- oder den Rest der Gruppe (c)º oder der Gruppe (d)º nach der Periodoxidation gefolgt von einer β-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse;
- - Aº eine Gruppe Rº&sub1; oder eine Gruppe Rº&sub1;-(c)º, eine Gruppe Rº&sub1;-(d)º oder eine Gruppe (e)º der Formel:
- oder den Rest der Gruppe (c)º oder der Gruppe (d)º nach der Periodoxidation gefolgt von einer β-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse;
- - Bº eine Gruppe ORº&sub1;, eine Gruppe (a)º-ORº&sub1;, eine Gruppe (a')º-ORº&sub1;, eine Gruppe (b)º-ORº&sub1; oder eine Gruppe (f)º der Formel:
- oder eine Gruppe (g)º der Formel:
- oder Gruppen (a)º, (a')º, (b)º, an die ein Rest von (c)º oder von (d)º gebunden ist, wie er nach der Periodoxidation gefolgt von einer β-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse vorhanden ist;
- - R&sub1;º H oder SO&sub3;&supmin;;
- - R&sub2; SO&sub3;&supmin; oder eine Acetylgruppe mit der Maßgabe, daß der Anteil von N-Acetylglucosamin höchstens gleich ist dem von Heparin, wenn R&sub1; eine Acetylgruppe darstellt;
- - R&sub3; ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatmen, eine Phenylalkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation; und
- - n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 80 bedeuten,
- In ein tertiäres Aminsalz oder ein quaternäres Ammoniumsalz des Glykosaminoglykans umwandelt, welches in einem aprotischen polaren Lösungsmittel löslich ist;
- (2) dieses Salz mit einem Anhydrid der Formel:
- Acyl-O-Acyl
- in der Acyl für eine Acylgruppe steht, wie sie bezüglich der Formel (I) definiert worden ist, in dem polaren aprotischen organischen Lösungsmittel in Gegenwart von katalytischen Mengen von Pyridin oder eines Dialkylaminopyridins und eines Protonenakzeptors behandelt;
- (3) das in dieser Weise erhaltene Produkt durch Einwirkung einer Lösung von Natriumacetat in Ethanol ausfällt und
- (4) das selektiv O-acylierte Glykosaminoglykan durch Auflösen des in dieser Weise erhaltenen Niederschlags in Wasser und Dialyse isoliert und das in dieser Weise erhaltene Natriumsalz des selektiv O-acylierten Glykosaminoglykans gegebenenfalls in ein anderes pharmazeutisch annehmbares Salz umwandelt.
- Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das in der Stufe (1) eingesetzte Glykosaminoglykan aus der Gruppe ausgewählt, die durch Heparin, eine Mischung von Heparinfragmenten mit einem Molekulargewicht von weniger als 10.000 Dalton, einer Mischung von Heparinfragmenten mit einem mittleren Molekulargewicht zwischen 2.000 und 7.000 Dalton, einer Mischung von Heparinfragmenten mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 4.500 Dalton, einer Mischung von Heparinfragmenten mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 2.500 Dalton, einer Mischung von Heparinfragmenten, die im Hinblick auf ihr Molekulargewicht homogen sind, oder einem durch Synthese erhaltenen Heparinfragment, das sowohl im Hinblick auf sein Molekulargewicht als auch auf seine Funktionalisierung homogen ist, gebildet wird.
- Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet man als das in der Stufe (1) eingesetzte Glykosaminoglykan Heparin oder eine Heparinfraktion oder ein Heparinfragment, welches frei von Bindungsstelle für Antithrombin III ist.
- Das in der Stufe (1) des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzte Glykosaminoglykan kann mit Vorteil aus der Gruppe ausgewählt werden, die durch Dermatansulfat und seinen Fragmenten oder Chondroitin-4- und -6-sulfat und dessen Fragmenten gebildet wird.
- Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Stufe (1) des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzten Salz des Glykosaminoglykans um ein tertiäres Aminsalz, insbesondere ein Tributylammoniumsalz oder ein quaternäres Ammoniumsalz, insbesondere ein Tetrabutylammoniumsalz.
- Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet man als Anhydrid in der Stufe (2) das Anhydrid einer Alkansäure mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 4 bis 10 Kohlenstoffatomen und noch bevorzugter 4 oder 6 Kohlenstoffatomen.
- Das aprotische polare Lösungsmittel, in dem die Stufe (2) des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt wird, kann mit Vorteil aus der Gruppe ausgewählt werden, die Dimethylformamid, Hexamethylphosphortriamid, Pyridin oder auch einer Mischung aus diesen Lösungsmitteln untereinander oder mit Dichlormethan gebildet wird, während der Katalysator aus der Gruppe ausgewählt wird, die Amine, wie Pyridin und Dimethylaminopyridin umfaßt.
- Die zur Neutralisierung der freigesetzten Säure verwendete Base kann Pyridin (das gleichzeitig als Lösungsmittel, Katalysator und Base wirkt), Triethylamin oder Tributylamin sein.
- In vorteilhafter Weise erfolgt die Dialyse in der Stufe (4) in Gegenwart einer schwachen Base, wie Natriumbicarbonat, um in dieser Weise eventuelle Nebenprodukte, wie Anhydride, zu beseitigen.
- In vorteilhafter Weise können die Temperatur und die Dauer der Reaktion in Abhängigkeit von dem angestrebten Acylierungsgrad variieren, beispielsweise von 0ºC bis 100ºC, insbesondere OºC bis 50ºC, wobei man mit Vorteil bei Raumtemperatur während beispielsweise 1 bis 24 Stunden arbeitet.
- Die erfindungsgemäßen selektiv O-acylierten Verbindungen besitzen in vivo eine verlängerte Wirkungsdauer. Wenn die Verbindungen Verbindungen des Heparin- Typs sind, die die Bindungsstelle für AT III aufweisen und die damit eine antithrombotische Wirkung ausüben können, ist diese Wirkung beispielsweise zeitlich deutlich länger im Vergleich zu der gleichen Verbindung, die keiner selektiven O-Acylierung unterworfen worden ist.
- Die erfindungsgemäßen selektiv O-acylierten Heparinderivate, ob sie nun die Bindungsstelle für AT III aufweisen oder nicht, wobei die letzten praktisch frei sind von einer antikoagulierenden Wirkung, entfalten weiterhin verschiedene biologische Wirkungen, insbesondere:
- - Die Inhibierung der Wucherung von glatten Muskelzellen, die von großem Interesse ist bei der Vermeidung von Restenosen bei Eingriffen, wie der Angioplastle, Venen- und Arterienbrücken und Bypässe, Organtransplantationen und insbesondere Herztransplantationen,
- - die Inhibierung der Heparanase und der Heparitinase, d. h. Enzymen, die bei der Metastasenverbreitung von Bedeutung sind,
- - antivirale Wirkungen, insbesondere gegenüber Retroviren, namentlich den verschiedenen HIV-Viren (Human Immunodeficiency-Virus), was von großem Interesse ist bei der Behandlung von AIDS,
- - Wirkungen bezüglich der Inhibierung der Leukozytenelastase, der Erhöhung des zirkulierenden Anteils von Elastaseinhibitoren, sowie selektive Inhibierung der Synthese von Kollagen Typ III und von Fibronektin, was ihnen ein großes Interesse verleiht für die Behandlung von Erkrankungen, bei denen das Elastase- Anti-Elastase-System aus dem Gleichgewicht gekommen ist, wie Emphysemen, sowie zur Behandlung von degenerativen Erkrankungen des Bindegewebes, wie der Arteriosklerose und des Diabetes.
- Die erfindungsgemäßen selektiv O-acylierten Glykosaminoglykane können damit der Wirkstoff für Arzneimittel sein, die für eine große Vielzahl von Indikationen von großem Interesse sind.
- Die Erfindung betrifft somit auch pharmazeutische Zubereitungen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie als aktive Substanz eine wirksame Menge mindestens eines erfindungsgemäßen O-acylierten Glykosaminoglykans in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterial enthalten.
- Mit besonderem Vorteil liegt das selektiv O-acylierte Glykosaminoglykan in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes, wie des Natrium-, Magnesium- oder Calciumsalzes vor.
- Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung sind die pharmazeutischen Zubereitungen dadurch gekennzeichnet, daß das pharmazeutische Trägermaterial für die Verabreichung auf oralem Wege geeignet ist und sie in Form von magensaftresistenten Gelkapseln, Kompretten oder Tabletten, Pillen oder aber auch in Form von trinkbaren Lösungen vorliegen, die mit Vorteil 50 mg bis 5 g pro Dosiseinheit, vorzugsweise 100 bis 1000 mg pro Gelkapsel, Tablette oder Pille, und 10 bis 150 mg bei trinkbaren Lösungen, die beispielsweise 1- bis 3-mal täglich verabreicht werden, enthalten; oder daß sie in Form einer sterilen oder sterilisierbaren injizierbaren Lösung für die Verabreichung auf intravenösem, intramuskulärem oder subkutanem Wege geeignet sind, wobei diese Lösungen mit Vorteil 50 bis 200 mg/ml des selektiv O-acylierten Glykosaminoglykans enthalten, wenn sie für die Injektion auf subkutanem Wege bestimmt sind, oder 20 bis 200 mg/ml des selektiv O-acylierten Glykosaminoglykans, wenn sie für die Injektion auf intravenösem Wege oder die Perfusion bestimmt sind.
- Die angegebenen Dosisbereiche stellen nur Hinweise dar, wobei die verabreichten Dosierungen in jedem Fall von dem Kliniker ermittelt werden müssen in Abhängigkeit von dem Zustand des Kranken und seiner persönlichen Reaktivität auf die Arzneimittel.
- Die Erfindung betrifft weiterhin die erfindungsgemäßen selektiv O-acylierten Glykosaminoglykane als biologische Reagenzien, die als Vergleichssubstanzen oder Vergleichssubstanzen bei vergleichenden Untersuchungen der Struktur/ Wirkungs-Abhängigkeit bei verschiedenen physiologischen Systemen verwendet werden können, bei denen Glykosaminoglykane eingreifen können.
- Die Erfindung ist besser verständlich anhand der folgenden Anwendungsbeispiele, die jedoch keine Einschränkung darstellen sollen.
- Man führt das Natriumsalz von Heparin (10 g) in Lösung in Wasser (500 ml) durch eine Kationenaustauschersäule (Dowex 50 W · 4, in der H&spplus;Form). Man neutralisiert die erhaltene Lösung mit Tetrabutylammoniumhydroxid. Nach dem Gefriertrocknen erhält man das Tetrabutylammoniumsalz von Heparin (19,55 g).
- Man löst 1 ,05 g Tetrabutylammoniumheparinat in Lösung in wasserfreiem Dimethylformamid (5 ml). Nach dem Abkühlen auf 0ºC gibt man tropfenweise Essigsäureanhydrid (1 ml; 10,46 mMol) und dann Triethylamin (1,45 ml; 10,46 mMol) und Dimethylaminopyridin (64 mg; 0,5 mMol) zu. Man läßt die Mischung während 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Nach der Zugabe von Wasser (5 ml) dialysiert man die Lösung während 72 Stunden gegen destilliertes Wasser. Das Tetrabutylammoniumsalz wird durch Überführen über das Harz Dowex 50, in der H&spplus;-Form bei 0ºC in das Natriumsalz umgewandelt, gefolgt von einer Neutralisation mit 1N Natriumhydroxid. Nach der Gefriertrocknung erhält man 0,49g selektiv O-acetyliertes Natriumheparinat mit den folgenden Eigenschaften:
- Sulfat/Carboxyl-Verhältnis: 2,28 mÄq/g (Ausgangsprodukt: 2,20 mÄq/g) APTT-Titer: 91 I.E./mg
- ¹³C-NMR-Spektrum (Methanol 51 ,6 ppm, Interner Standard)
- - Signal bei 23,4 ppm; CH&sub3; von CH&sub3;-CO-O-
- - Signal bei 24,5 ppm (schwach); CH&sub3; von CH&sub3;-CO-NH- (identisch mit dem Ausgangsprodukt).
- Das NMR-Spektrum weist auf die Anwesenheit von etwa zwei Acetylgruppen pro Disaccharideinheit hin.
- Man löst das Natriumsalz von Heparin (10 g) in Wasser (500 ml) und führt die Lösung dann über eine Kationenaustauscherharzsäule (Dowex 50 W · 4 in der H&spplus;- Form). Man neutralisiert die Lösung durch Zugabe einer 10%-igen Lösung von Tributylamin in Ethanol. Nach dem Waschen mit Ether und dem Gefriertrocknen erhält man das Tributylammoniumsalz von Heparin (14,77 g).
- Zu einer auf 0ºC abgekühlten Lösung des obigen Salzes (4 g) in wasserfreiem Dimethylformamid (50 ml) gibt man Dimethylaminopyridin (250 mg), Essigsäureanhydrid (3,9 ml) und Tributylamin (9,7 ml). Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur gibt man Wasser (1,5 ml) zu. Anschließend gießt man die Mischung in eine mit Natriumacetat gesättigte Ethanollösung. Nach dem Waschen mit Ethanol löst man den Niederschlag in Wasser und dialysiert ihn gegen 5% Bicarbonat in Wasser und dann gegen Wasser. Man erhält nach dem Gefriertrocknen das O-acetylierte Natriumheparinat (1 ,81 g).
- Das Infrarotspektrum besitzt eine starke Ester-Bande bei 1730cm&supmin;¹.
- Nach dem Verseifen zeigt das Produkt:
- - ein Sulfat/Carboxy-Verhältnis von 2,38 mÄq/g (Ausgangsprodukt: 2,40 mÄq/g)
- - einen APTT-Titer von 85 I.E./mg
- Man löst das Tetrabutylammoniumsalz von Heparn (0,58 g) in einer Mischung (1/1; Vol./Vol.) von Pyridin und Dimethylformamid (10 ml). Dann gibt man Essigsäureanhydrid (0,5 ml) zu und läßt die Mischung dann bei Raumtemperatur stehen. Nach 24 Stunden gibt man eine wäßrige Natriumacetatlösung (1M, 15 ml) zu und gießt die Mischung dann in auf 0ºC gekühltes Ethanol (80 ml). Nach dem Zentrifugieren löst man den Niederschlag in Wasser (10 ml) und gibt dann Ethanol (160 ml) zu, gefolgt von wäßrigem Natriumacetat (1M, 10 ml). Anschließend nimmt man den Niederschlag mit Wasser auf und erhält durch Gefriertrocknen O-acetyliertes Heparin (0,22 g).
- Zu einer auf 0ºC abgekühlten Lösung von Tetrabutylammonium-heparinat (1,85 g), wie man es nach Beispiel 1 erhalten hat, in Dimethylformamid (10 ml) gibt man tropfenweise Propionsäureanhydrid (2,7 ml), dann Triethylamin (2,9 ml) und schließlich Dimethylaminopyridin (128 mg). Nach 1 Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden, 8 Stunden und 24 Stunden entnimmt man einen Teil der Reaktionsmischung, verdünnt mit einem gleich großen Volumen Wasser und dialysiert während 24 Stunden in destilliertem Wasser. Nach dem Überführen über ein Dowex 50-Harz H&spplus; und dem Neutralisieren mit Natriumhydroxld werden die erhaltenen Produkte gefriergetrocknet und zeigen die folgenden Eigenschaften: Reaktionszeit Masse Sulfat/Carboxyl-Verhältnis (mÄq/g) APTT-Titer (I.E./mg) Ausgangsprodukt
- Das Protonen-NMR-Spektrum der Produkte wurde in Wasser mit 3,3,3-Trimethylsilylpropionat (TSP) als internem Standard aufgezeichnet. Es zeigt Signale bei 1,1 ppm und 2,4 ppm, die charakteristisch sind für die CH&sub3;- und CH&sub2;-Gruppen von CH&sub3;-CH&sub2;-CO-O und Signale zwischen 3 und 5 ppm, die für Protonen des Zuckergerüsts charakteristisch sind.
- Ein Vergleich der Intensität der Signale der Propionylgruppe und des Gerüsts zwischen dem während 1 Stunde behandelten und jenem, das 24 Stunden der Reaktion unterworfen worden ist, verdeutlicht den Einfluß der Reaktionsdauer: In der Tat beobachtet man eine Abnahme der Signale der Skelettprotonen, was auf eine Erhöhung des Substitutionsgrads hinweist.
- Das Kohlenstoffspektrum (Methanol 51,6 ppm, interner Standard) zeigt Signale bei 10,8 und 30 ppm, die für die Gruppen CH&sub3; und CH&sub2; der Propionsäureester charakteristisch sind.
- Man gibt zu einer Lösung des Tetrabutylammoniumsalzes von Heparin (0,55 g), das man nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise erhalten hat, in Dimethylformamid (5 ml) bei 0ºC Buttersäureanhydrid und Dimethylaminopyridin. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur gibt man Wasser (5 ml) zu und dialysiert die Reaktionsmischung dann während 72 Stunden gegen destilliertes Wasser. Nach dem Austausch über Dowex 50 H&spplus;, der Neutralisation mit Natriumhydroxid und dem Gefriertrocknen erhält man O-butyryliertes Heparin in Form des Natriumsalzes (0,32 g).
- Sulfat/Carboxyl-Verhältnls: 2,15 mÄq/g (Ausgangsprodukt: 2,20 mÄq/g)
- APTT-Titer: 59 I.E./mg
- Das Protonen-NMR-Spektrum (TSP, interner Standard) zeigt die Anwesenheit von Signalen bei 0,9 ppm; 1,6 ppm und 2,4 ppm, die charakteristisch sind für die CH&sub3;-CH&sub2;-Gruppen von CH&sub3;-CH&sub2;CH&sub2;-CO-O- und Signale zwischen 3 und 6 ppm, die für das Zuckerskelett charakteristisch sind.
- Die Analyse des NMR-Spektrums zeigt die Anwesenheit von etwa einer Butyrylkette pro Disaccharideinheit.
- Zu einer auf 0ºC abgekühlten Lösung von Tributylamin-heparinat (4 g), welches man nach der in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrensweise erhalten hat, in Dimethylformamid (50 ml) gibt man Dimethylaminopyridin (0,25g), Buttersäureanhydrid (6,7 ml) und Tributylamin (9,7 ml). Man läßt die Reaktionsmischung während 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Dann gibt man Wasser (1,5 ml) und dann nach 30 Minuten eine gesättigte Lösung von Natriumacetat in Ethanol (250 ml) zu. Der Niederschlag wird anschließend dreimal mit Ethanol gewaschen und dann gegen eine 5%-ige Bicarbonatlösung und schließlich gegen Wasser dialysiert. Man erhält nach dem Gefriertrocknen das Natriumsalz von O-butyryliertem Heparin (2,1 g).
- APTT-Titer: 29 I.E./mg
- Nach dem Verseifen der Ester durch 0,5M Natriumhydroxid während 2 Stunden bei 0ºC zeigt das erhaltene Produkt ein Sulfat/Carboxyl-Verhältnis von 2,36 mÄq/g (2,40 mÄq/g im Ausgangsprodukt).
- Man gibt zu einer Lösung des Tetrabutylammoniumsalzes von Heparin (0,55 g), das man nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise erhalten hat, in Dimethylformamid (5 ml) bei 0ºC Capronsäureanhydrid (1 ml; 6 mMol), Triethylamin (0,84 ml; 6 mMol) und Dimethylaminopyridin. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur gibt man Wasser (5 ml) zu und dialysiert die Reaktionsmischung dann während 72 Stunden gegen eine 5%-ige Bicarbonatlösung und dann gegen destilliertes Wasser. Nach dem Austausch über Dowex 50 H&spplus;, der Neutralisation mit Natriumhydroxid und dem Gefriertrocknen erhält man O-hexanoyliertes Heparin in Form des Natriumsalzes (0,30 g).
- APTT-Titer: 25 I.E./mg
- Das Protonen-NMR-Spektrum (interner Standard: TSP) zeigt Signale bei 0,8; 1,2; 1,5; und 2,3 ppm, die für die CH&sub3;-CH&sub2;-Gruppe von CH&sub3;-(CH&sub2;)&sub8;-CO-O-charakteristisch sind.
- Zu einer auf 0ºC abgekühlten Lösung von Tributylammoniumheparinat (4g), das man nach der in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrenswelse erhalten hat, in Dimethylformamid (50 ml) gibt man Dimethylaminopyridin (0,25g), Tributylamin (9,7 ml) und Hexansäureanhydrid (10,6ml). Nach 24 Stunden bei 20ºC gibt man Wasser (1,5 ml) zu, gefolgt von einer gesättigten Natriumacetatlösung in Ethanol. Nach dem Waschen mit Ethanol, der Dialyse und dem Gefriertrocknen erhält man O-hexanoyliertes Heparin (2,5 g).
- Zu einer auf 0ºC abgekühlten Lösung von Tributylammonium-heparinat (4 g), das man nach der in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrensweise erhalten hat, in Dimethylformamid (50 ml) gibt man Dimethylaminopyridin (0,25g), Octansäureanhydrid (12,1 ml) und Tributylamin (9,7 ml). Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur gibt man Wasser (1,5 ml) zu und dann nach 30 Minuten eine gesättigte Lösung von Natriumacetat in Ethanol. Nach der Dialyse gegen eine 20%-ige Ethanollösung und dann gegen destilliertes Wasser und der Ultrafiltration unterwirft man das Produkt einem Kationenaustausch durch Überführen über Dowex 50 H&spplus;, gefolgt von einer Neutralisation mit Natriumhydroxid. Nach dem Gefriertrocknen erhält man O-octanoyliertes Heparin (2,5 g).
- Man gibt zu einer Lösung des Tetrabutylammoniumsalzes von Heparin (0,55 g), das man nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise erhalten hat, in Dimethylformamid (5 ml) bei 0ºC Caprinsäureanhydrid (1 ml; 6 mMol), Triethylamin (0,84 ml; 6 mMol) und Dimethylaminopyridin. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur gibt man Wasser (5 ml) zu und dialysiert die Reaktionsmischung dann während 72 Stunden gegen eine 5%-ige Bicarbonatlösung und dann gegen destilliertes Wasser. Nach dem Austausch über Dowex 50 H&spplus;, der Neutralisation mit Natriumhydroxid und dem Gefriertrocknen erhält man O-decanoyliertes Heparin in Form des Natriumsalzes (0,30 g).
- APTT-Titer: 25 I.E./mg
- Das Protonen-NMR-Spektrum (Interner Standarct: TSP) zeigt Signale bei 0,8; 1,2; 1,5; und 2,4 ppm, die charakteristisch sind für CH&sub3; und CH&sub2; von CH&sub3;-(CH&sub2;)&sub8;- CO-O-.
- Zu einer auf 0ºC abgekühlten Lösung von Tributylammoniumheparinat (4 g), das man nach der in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrensweise erhalten hat, in Dimethylformamid (50 ml) gibt man Dimethylaminopyridin (0,25 g), Decansäureanhydrid (13,3 g gelöst in 20 ml Dimethylformamid) und Tributylamin (9,7 ml). Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur gibt man Wasser (1,5 ml) zu und dann eine gesättigte Lösung von Natriumacetat in Ethanol. Man löst den Niederschlag in Dimethylsulfoxid und dialysiert ihn gegen Wasser, Natriumbicarbonat und erneut gegen Wasser.
- Nach dem Gefriertrocknen erhält man O-decanoyliertes Heparin (2,38 g).
- Man löst das Tributylammoniumsalz von Heparin (3 g) und N,N-Dimethylaminopyridin (244 mg) in wasserfreiem Dimethylformamid (50 ml). Nach dem Abkühlen auf 0ºC gibt man tropfenweise Ölsäureanhydrid (21 g), das man gemäß Plusquellec et al. (Tetrahedron, 44(1988), 2471-2476) synthetisiert hat, gelöst in Dichlormethan (20 ml) und dann Tributylamin (9,5 ml) zu. Nach einer Reaktionsdauer von 24 Stunden und dem Abkühlen auf 0ºC gibt man 5%-iges Natriumbicarbonat (10 ml) und dann eine Stunde später eine gesättigte alkoholische Natriumacetatlösung zu. Nach dem Waschen mit absolutem Ethanol, dem Lösen in einer Dimethylsulfoxid/Wasser-Mischung (4/1; Vol./Vol., 750 ml) dialysiert man während 2 Tagen gegen wäßriges 10%-iges Ethanol und dann während 3 Tagen gegen Wasser. Nach dem Gefriertrocknen und dem Ausfällen des erneut in DMF gelösten gefriergetrockneten Materials mit Diethylether isoliert man das Natriumsalz des oleolyierten Heparins (2,77 g). Gehalt an Ölsäure: 1,44 uMol/mg (Bestimmung gemäß W. Ducombe et al., Biochemical Journal, 88 (1963), 7).
- Man benzoyliert das Tetrabutylammoniumsalz von Heparin, das man nach dem Beispiel 2 beschriebenen Verfahrenswelse erhalten hat, mit Benzoesäureanhydrid unter Anwendung der oben bezüglich der Herstellung von o-decanoyliertem Heparin (Beispiel 8) beschriebenen Bedingungen.
- Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum des erhaltenen Produkts zeigt Signale bei 131, 132 und 136 ppm, die charakteristisch sind für die Benzoylgruppen.
- Das Produkt ist in vitro frei von antikoagulierender Wirkung.
- Man bereitet das 3-Cyclopentylpropionsäureanhydrid nach der Verfahrensweise von Plusquellec et al. (Tetrahedron, 44, (1988), 2471-2476). Man erhält es nach der Zugabe der Säure (23 ml, 150 mMol) in Lösung in Dichlormethan (400 ml) zu einer gerührten und auf -10ºC abgekühlten Mischung, die Tetrabutylammoniumbromid (15 mMol), 20%-iges Natriumhydroxid (60 ml) und Dichlormethan (80 ml) enthält, und nach dem Dekantieren, dem Waschen mit 5%-igem Natriumbicarbonat und Wasser und dem Einengen in Form eines Öls (96%).
- Charakteristische Infrarotfrequenzen: 1800, 1745, 1040 cm&supmin;¹.
- Man löst das Tributylammoniumsalz von Heparin (4 g) und N,N-Dimethylaminopyridin (253 mg) In wasserfreiem Dimethylformamid (40 ml). Nach dem Abkühlen auf 0ºC gibt man tropfenweise 3-Cyclopentylpropionsäureanhydrid (11 g) und dann Tributylamin (9,8 ml) zu. Nach 24 Stunden der Reaktion bei Raumtemperatur und dem Abkühlen auf 0ºC gibt man Wasser (1 ml) und dann eine Stunde später eine gesättigte alkoholische Natriumacetatlösung zu. Nach dem Waschen mit absolutem Ethanol dialysiert man den Niederschlag während 24 Stunden gegen 5 %-iges Natriumbicarbonat und dann während 3 Tagen gegen Wasser. Nach dem Gefriertrocknen erhält man O-3-cyclopentylproplonyliertes Heparin in Form des Natriumsalzes (2,64 g).
- Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum in D&sub2;O (Methanol bei 51,6 ppm als internem Standard) zeigt charakteristische Signale bei 27,4 ppm; 33,1 ppm; 34,6 ppm, 35,9 ppm und 41,7 ppm, die für die O-Cyclopentylpropionylgruppe charakteristisch sind.
- Sulfat/Carboxyl-Verhältnis: 2,2
- Dieses Heparin mit niedrigem Molekulargewicht wurde durch teilweise Salpetrigsäure-Depolymerisation und alkoholische Fraktionierung erhalten, wie es in dem europäischen Patent 181 252 beschrieben ist, und wird im folgenden als CY 216 bezeichnet.
- Man wandelt das Natriumsalz von CY 216 (1 g) durch Überführen über eine mit Dowex 50 H&spplus; gefüllte Säule, gefolgt von einer Neutralisation mit Tetrabutylammoniumhydrochlorid in das Tetrabutylammoniumsalz um.
- Das in dieser Weise erhaltene Salz (1,7g) wird im Vakuum während 3 Stunden bei 50ºC getrocknet und dann in wasserfreiem Dimethylformamid (10 ml) gelöst. Nach dem Abkühlen auf 0ºC gibt man tropfenweise Essigsäureanhydrid (1,7 ml), gefolgt von Triethylamin (2,4ml) und Dimethylaminopyridin (102 mg) zu. Nach 20 Stunden Reaktion chromatographiert man das Produkt über eine Sephadex G-25-Säule, die mit Wasser eluiert wird. Man erhält nach dem Umwandeln in das Natriumsalz und dem Gefriertrocknen das O-acetylierte CY 216 (0,89 g).
- Sein Kohlenstoff-NMR-Spektrum (Methanol 51,6 ppm, Interner Standard) zeigt ein Signal bei 23 ppm, das für Acetate charakteristisch ist.
- Das Signal von CH&sub3; der Gruppe CH&sub3;-CO-NH- bei 24,5 ppm ist identisch mit dem des Ausgangsprodukts.
- Das Sulfat/Carboxyl-Verhältnis beträgt 2,09 mÄq/g (Ausgangsprodukt: 2,05 mÄq/g).
- APTT-Titer: 18 I.E./mg
- Anti-Xa-Titer: 205 E/mg (Bestimmung nach Yin et al., J. Lab. Clin. Med., (1973), 298-310).
- Man wandelt das Natriumsalz von CY 216 durch Überführen über eine mit Dowex 50 H&spplus;-Form gefüllten Säule, gefolgt von einer Neutralisation mit Tributylamin, wie es für Heparin beschrieben worden ist, in das Tributylammoniumsalz um. Man erhält das Tributylammoniumsalz von CY 216 nach dem Waschen mit Ether, dem Gefriertrocknen und dem Trocknen im Ofen und im Vakuum.
- Das erhaltene Salz (4 g) und N,N-Dimethylaminopyridin (288 mg) werden in Dimethylformamid gelöst. Nach dem Abkühlen auf 0ºC gibt man Essigsäureanhydrid (4,4 ml) tropfenweise zu, gefolgt von Trlbutylamin (11,2 ml). Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur und dem Abkühlen auf 0ºC gibt man Wasser (1,7 ml) und dann nach 1 Stunde eine gesättigte alkoholische Natriumacetatlösung zu. Man wäscht den Niederschlag mit Ethanol, löst in pyrogenfreiem Wasser, dialysiert während 36 Stunden gegen 5%-iges Bicarbonat und dann während 3 Tagen gegen Wasser. Man erhält nach dem Gefriertrocknen das acetylierte CY 216 in Form des Natriumsalzes (1,4 g).
- Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum in D&sub2;O (Methanol bei 51,6 ppm als internem Standard) zeigt bei 23 ppm das für die Acetylgruppe charakteristische Signal.
- Sulfat/Carboxyl-Verhältnis: 2,07.
- Man löst das nach der in Beispiel 12 beschriebenen Verfahrensweise erhaltene Tributylammoniumsalz von CY 216 (4 g) und N,N-Dimethylaminopyridin (288 g) In wasserfreiem Dimethylformamid (40 ml). Nach dem Abkühlen auf 0ºC gibt man tropfenweise Buttersäureanhydrid (7,68 ml), gefolgt von Tributylamin (11,2 ml) zu. Nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden bei Raumtemperatur und dem Abkühlen auf 0ºC gibt man Wasser (1,7 ml) und dann eine Stunde später eine gesättigte alkoholische Natriumacetatlösung zu. Nach dem Waschen mit Ethanol, dem Lösen in pyrogenfreiem Wasser, der Dialyse gegen 5%-iges Natriumbicarbonat während 36 Stunden und dann während 3 Tagen gegen Wasser isoliert man das O-butyrylierte CY 216 nach dem Gefriertrocknen in Form des Natriumsalzes (2,14g).
- Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum in D&sub2;O (Methanol 51,6 ppm, interner Standard) zeigt bei 15,6 ppm, 20,5 ppm und 39,4 ppm die für die O-Butyrylgruppe charakteristischen Signale.
- Sulfat/Carboxyl-Verhältnis: 2,08.
- Man löst das gemäß der in Beispiel 12 beschriebenen Verfahrensweise erhaltene Tributylammoniumsalz von CY 216 (4 g) und N,N-Dimethylaminopyridin (288 g) in Dimethylformamid (40 ml). Nach dem Abkühlen auf 0ºC gibt man tropfenweise Capronsäureanhydrid (10,8 ml) und Tributylamin (11,2 ml) zu. Nach einer Reaktionsdauer von 24 Stunden bei Raumtemperatur und dem Abkühlen auf 0ºC gibt man Wasser (1,7 ml) und dann eine Stunde später eine gesättigte alkoholische Natriumacetatlösung zu. Nach dem Waschen mit absolutem Ethanol, dem Lösen in pyrogenfreiem Wasser, der Dialyse während 36 Stunden gegen 5%-iges Natriumbicarbonat und dann während 3 Tagen gegen Wasser isoliert man das O-caproylierte CY 216 nach dem Gefriertrocknen in Form des Natriumsalzes (2,5 g).
- Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum in D&sub2;O (Methanol 51,6 ppm, interner Standard) zeigt bei 15,9 ppm, 24,2 ppm, 26,4 ppm, 33,1 ppm und 36,4 ppm die für die Caproylgruppe charakteristischen Signale.
- Sulfat/Carboxyl-Verhältnls: 2,08.
- Man löst das nach der in Beispiel 12 beschriebenen Verfahrensweise erhaltene Tributylammoniumsalz von CY 216 (4 g) und N,N-Dimethylaminopyridin (288 g) In Dimethylformamid (40 ml). Nach dem Abkühlen auf 0ºC gibt man tropfenweise Caprylsäureanhydrid (14 ml) und dann Tributylamin (11,2 ml) zu. Nach einer Reaktionsdauer von 24 Stunden bei Raumtemperatur und dem Abkühlen auf 0ºC gibt man Wasser (1,7 ml) und dann eine Stunde später eine gesättigte alkoholische Lösung von Natriumacetat zu. Nach dem Waschen mit absolutem Ethanol, dem Lösen und pyrogenfreiem Wasser, der Dialyse während 36 Stunden gegen 5 %-iges Natriumbicarbonat und dann während 3 Tagen gegen Wasser erhält man das O-octanoylierte CY 216 nach dem Gefriertrocknen in Form des Natriumsalzes (1,76 g).
- Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum in d&sup6; DMSO (Methanol 51,6 ppm, interner Standard) zeigt bei 16,8 ppm, 25,0 ppm, 27,3 ppm, 30,9 ppm, 31,4, 34,1 und 36,4 ppm die für die Capryloylgruppe charakteristischen Signale.
- Sulfat/Carboxyl-Verhältnis: 2,07.
- Man löst das nach der in Beispiel 12 beschriebenen Verfahrensweise erhaltene Tributylammoniumsalz von CY 216 (4 g) und N,N-Dimethylaminopyridin (288g) in Dimethylformamid (40 ml). Nach dem Abkühlen auf 0ºC gibt man tropfenweise Decansäureanhydrid (15,3 ml) in Lösung in wasserfreiem Dimethylformamid (10 ml) und dann Tributylamin (11,2 ml) zu. Nach einer Reaktionszelt von 24 Stunden bei Raumtemperatur und dem Abkühlen auf 0ºC gibt man Wasser (1,7 ml) zu und dann eine Stunde später eine gesättigte alkoholische Lösung von Natriumacetat. Nach dem Waschen mit absolutem Ethanol und dem erneuten Suspendieren in pyrogenfreiem Wasser dialysiert man während 2 Tagen gegen 5%-iges Natriumbicarbonat, während 2 Tagen gegen 10%-iges NaCl und dann während 5 Tagen gegen Wasser. Das O-decanoylierte CY 216 wird nach dem Gefriertrocknen in Form des Natriumsalzes isoliert (2,76 g).
- Das Kohlenstoff-NMR-Spektrun in D&sub2;O (Methanol 51 ,6 ppm, interner Standard) zeigt für die Decanoylgruppe charakteristische Signale bei 16,4 ppm, 22,3 ppm, 25,1 ppm, 29,2 ppm, 31,9, 34,4 und 36,5 ppm.
- Sulfat/Carboxyl-Verhältnis: 2,13.
- Dieses Heparin niedrigen Molekulargewichts wurde durch teilweise Salpetrigsäure-Depolymerisation nach dem in dem europäischen Patent 37 319 beschriebenen Verfahren hergestellt und wird nachfolgend als CY 222 bezeichnet.
- Man wandelt das Natriumsalz von CY 222 durch Überführen über eine Dowex 50 H&spplus;-Harzsäule, gefolgt von einer Neutralisation mit Tributylamin in das Tributylammoniumsalz um.
- Das nach der Gefriertrocknung erhaltene Salz (1,5 g) wird In Dimethylformamid (5 ml) gelöst und dann gibt man nach dem Abkühlen auf 0ºC Essigsäureanhydrid (1,35 ml) tropfenweise zu, gefolgt von Triethylamin (2 ml) und Dimethylaminopyridin (85 mg). Nach einer Reaktionszelt von 18 Stunden gibt man Wasser (20 ml) zu und dialysiert die Mischung dann während 3 Tagen gegen destilliertes Wasser. Nach der Umwandlung in das Natriumsalz und dem Gefriertrocknen erhält man das O-acetylierte CY 222 (0,86 g).
- Das Produkt besitzt ein Sulfat/Carboxyl-Verhältnis von 1,98 mÄq/g (Ausgangsprodukt: 1,97 mÄq/g).
- Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum (Methanol 51,6 ppm, interner Standard) des Produkts zeigt ein Signal bei 23 ppm, das charakteristisch ist für die O-Acetylgruppe. Der Vergleich der Intensitäten der Signale der N-Acetylgruppen (bei 24,5 ppm) zwischen dem Ausgangsprodukt und dem Endprodukt zeigt, daß die Acetylierung selektiv war.
- - APTT-Titer: 8 I.E./mg iE
- - Anti-Xa-Titer: 191 E/mg (Bestimmung nach Yin et al., J. Lab. Clin. Med. 81 (1973), 298-310).
- Man löst 10 g injizierbares Heparin aus der Schweineschleimhaut in Form des Natriumsalzes mit einem Titer von 157 I.E./mg bei der Codex-Bestimmung und 155 E/mg bei der Anti-Faktor Xa-Bestimmung nach Yin et al., bei 4ºC in 250 ml entmineralisiertem Wasser. Man stellt den pH-Wert der Lösung mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf 5,0 ein. Dann gibt man unter mäßigem Rühren 10 g Natriummetaperiodat (NaIO&sub4;, Molekulargewicht: 213,89) in Lösung in 250 ml entmineralisierten Wassers bei 4ºC zu. Man stellt den pH-Wert der Mischung mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf 5,0 ein. Man läßt die Lösung während 24 Stunden im Dunkeln bei +4ºC im Eisschrank stehen.
- Man verteilt die Reaktionslösung in drei Dialysebehältern NOJAX 40® (Porosität 3 bis 4.000 Da) und bewirkt eine Dialyse während 15 Stunden gegen fließendes entmineralisiertes Wasser.
- Zu 780 ml der nach der Dialyse erhaltenen Lösung gibt man 16 ml 10N Natriumhydroxidlösung und rührt das Ganze während 3 Stunden bei Raumtemperatur (etwa 18-21ºC).
- Man gibt dann 500 mg Natriumborhydrid (NaBH&sub4;, Molekulargewicht: 37,83) zu und rührt die Lösung erneut während 4 Stunden bei Raumtemperatur. Dann bringt man den pH-Wert mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf 4. Nach dem Rühren während 15 Minuten stellt man den pH-Wert mit konzentrierter Natriumhydroxidlösung auf 7 ein.
- Zu 820 ml der in dieser Weise erhaltenen Lösung gibt man 16,4 g NaCl und dann 11270 ml Ethanol. Man läßt das Ganze während 3 Stunden stehen und zentrifugiert dann während 20 Minuten bei 2500 min&supmin;¹. Man gewinnt den Niederschlag, bringt ihn erneut in 200 ml reinem Ethanol in Suspension, verreibt in einem Ultra-Turrax® und gewinnt schließlich das Material durch Filtration über einer Buchner-Fritte. Man trocknet das Material während 5 Stunden im Vakuum bei 40ºC.
- Man gewinnt in dieser Weise 8,9 g des Produkts.
- Man löst diese 8,9 g in etwa 120 ml entmineralisierten Wassers bei Raumtemperatur. Man gibt 1,78 g NaCl zu und senkt den pH-Wert mit Chlorwasserstoffsäure auf 3,5 ab. Man bringt das Volumen der Lösung mit entmineralisiertem Wasser auf 178 ml. Dann gibt man unter Rühren 151 ml reines Ethanol zu. Man setzt das Rühren während 15 Minuten nach Beendigung der Zugabe fort und läßt dann das Ganze während 10 Stunden bei Raumtemperatur stehen.
- Man gewinnt den gebildeten Niederschlag durch Zentrifugieren während 20 Minuten bei 2.500 min&supmin;¹. Man suspendiert das Material erneut in 150 ml reinem Ethanol, verreibt mit einem Ultra-Turrax®, gewinnt durch Filtration über eine Büchner-Fritte, wäscht mit 300 ml reinem Ethanol und trocknet schließlich während 24 Stunden im Vakuum bei 40ºC.
- Man gewinnt in dieser Weise 5 g des Produkts IC 1772 in Form eines weißen Pulvers mit folgenden Eigenschaften:
- - SO&sub3;&supmin; : 3,55 mÄq/g
- - COO&supmin; : 1,54 mÄq/g
- - S + C : 5,09 mÄq/g
- - S/C : 2,31 mÄq/g
- Es ist praktisch frei von N-Acetyl-glucosamin (Abwesenheit eines Signals bei 24,5 ppm bei dem Kohlenstoffspektrum).
- - Codex-Titer: 11 I.E./mg
- - APTT-Titer: 9 I.E./mg
- - Anti-Xa-Titer: 12 I.E./mg
- Man wandelt das in der Stufe A/ erhaltene Produkt durch Überführen über das Harz Dowex 50 H&spplus;, gefolgt von einer Neutralisation mit Tetrabutylammoniumhydroxid in das Tetrabutylammoniumsalz um. Ausgehend von 9,5 g Natriumsalz erhält man 18 g Tetrabutylammoniumsalz.
- Zu einer Lösung von 6 g des in dieser Weise erhaltenen Salzes in Dimethylformamid (55 ml) gibt man nach dem Abkühlen auf 0ºC Essigsäureanhydrid (6,2 ml; 65,6mMol) und dann Triethylamin (9 ml; 65,5 mMol) Dimethylaminopyridin (403 mg; 3,3 mMol) zu. Nach 24 Stunden gibt man eine gesättigte Lösung von Natriumacetat in Ethanol (250 ml) zu. Nach dem Zentrifugieren und dem Waschen des Niederschlags mit Ethanol entsalzt man den Feststoff über Sephadex G-25 und bewirkt dann einen Ionenaustausch durch Überführen über Dowex 50 H&spplus;, gefolgt von einer Neutralisation mit Natriumhydroxid. Nach dem Gefriertrocknen erhält man das Produkt IC 1924 (3 g).
- Dieses Produkt besitzt die folgenden Eigenschaften:
- - Sulfat/Carboxyl-Verhältnis: 2,28 mÄq/g
- Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum (Methanol 51,6 ppm, interner Standard) zeigt klar, daß das Produkt O-acyliert worden Ist. Das charakteristische C&sub2;-Signal von N-Acetyl-glucosamin bei etwa 56 ppm ist ebenso wie bei dem Ausgangsprodukt in dem Spektrum nicht enthalten.
- Man butyryliert 6,5 g des nach der Verfahrensweise des Beispiels 18 erhaltenen Tetrabutylammoniumsalzes von IC 1772 mit Buttersäureanhydrid unter den für die Acetyllerung beschriebenen Bedingungen. Man erhält das Produkt IC 1925 (2,96 g), welches die folgenden Eigenschaften besitzt:
- - Sulfat/Carboxyl-Verhältnis: 2,31 mÄq/g
- Das ¹³C-NMR-Spektrum (Methanol 51,6 ppm, interner Standard) enthält Signale, die für die Butylgruppe charakteristisch sind, bei 15,6, 20,4 und 38,4 ppm.
- Man behandelt 6g des nach der in Beispiel 12 beschriebenen Verfahrensweise erhaltenen Tetrabutylammoniumsalzes von IC 1772 mit Hexansäureanhydrid in gleicher Weise wie für die Acetylierung beschrieben. Man erhält das Produkt IC 1926 (3 g), welches die folgenden Eigenschaften besitzt:
- - Sulfat/Carboxyl-Verhältnis: 2,20 mÄq/g
- Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum (Methanol 51 ,6 ppm als interner Standard) zeigt die charakteristischen Signale für die CH&sub3;- und CH&sub2;-Gruppen der Hexylgruppe bei 15,5, 23,9, 26,2, 32,7 und 36,1 ppm.
- Das Protonen-NMR-Spektrum weist auf die Anwesenheit etwa einer Hexylgruppe pro Disaccharideinheit hin.
- Die Mischung der von einer antikoagulierenden Wirkung freien Fragmente, wie sie in Beispiel 12 beschrieben ist, wird durch Gelfiltration bezüglich der verschiedenen Bestandteile fraktioniert. Man erhält in dieser Weise homogene Fraktionen, deren Molekulargewichte 7700, 6500, 5800, 5300. 4980, 4400, 3900, 3400, 2600, 1860 und 1210 betragen.
- Man wandelt die Fraktion mit einem Molekulargewicht von 2600 (0,20 g) in das Tributylammoniumsalz um, gefriertrocknet und trocknet (0,34 g). Man löst das Produkt anschließend in DMF (2 ml) und gibt dann nach dem Abkühlen auf 0ºC nacheinander Dimethylaminopyridin (18 mg), Buttersäureanhydrid (0,49 ml) und Tributylamin (0,7 ml) zu. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur gibt man Natriumbicarbonat (1 ml einer 5%-igen Lösung) zu und dann chromatographiert man die Mischung 2 Stunden später über eine mit Sephadex G-25 beschickte Säule (1 Liter), wobei man mit 0,2M Natriumchlorid eluiert. Das Produkt wird nach dem Entsalzen gefriergetrocknet, was zu einem hellbeigefarbenen Pulver (0,24 g) führt.
- Die anderen Fraktionen werden in gleicher Weise behandelt und ergeben entsprechende Produkte, deren IR-Analyse die Anwesenheit einer Esterbande bei 1734 cm&supmin;¹ verdeutlicht. Der Sulfatierungsgrad der Produkte (Sulfat/Carboxyl-Verhältnis) bleibt nach der Acylierung unverändert.
- Man bestimmt ihn durch Chromatographie in der Gasphase nach der Butanolyse der Produkte mit einer Butano/Schwefelsäure-Mischung, gefolgt von einer Extraktion der Butylester mit Chloroform und Entfernen des überschüssigen Butanols durch Waschen mit Wasser.
- Zu einer auf 0ºC abgekühlten Lösung des Tetrabutylammoniumsalzes von Dermatansulfat (0,91 g), das man unter den gleichen Bedingungen erhalten hat, die für die Herstellung von Tetrabutylammonium-heparinat in Beispiel 1 angegeben sind, in Dimethylformamid (20 ml) gibt man tropfenweise Essigsäureanhydrid (1,35 ml; 14,2 mMol), dann Triethylamin (1,97 ml; 14,2 mMol) und Dimethylaminpyridin (0,7 mMol). Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur gibt man Wasser (40 ml) zu und dialysiert dann während 72 Stunden. Man erhält das Natriumsalz durch Überführen über eine mit Dowex 50 H&spplus; beschickte Säule bei 0ºC, gefolgt von einer Neutralisation mit Natriumhydroxid. Nach dem Gefriertrocknen erhält man ein beigefarbenes Pulver (0,52 g).
- Das O-acetylierte Dermatansulfat besitzt die folgenden Eigenschaften:
- - Sulfat/Carboxyl-Verhältnis: 0,99 mÄq/g (Ausgangsprodukt: 1,05 mÄq/ g).
- - ¹³C-NMR-Spektrum (Methanol 51,6 ppm, interner Standard)
- · Signal bei 25,2 ppm CH&sub3; von CH&sub3;-CO-NH- (identisch mit dem Ausgangsprodukt)
- · Signal bei 23,0 ppm, CH&sub3; von CH&sub3;-CO-O
- Man löst das Tetrabutylammoniumsalz von Dermatansulfat (1 g) und N,N-Dimethylaminopyridin (110 mg) in wasserfreiem Dimethylformamid. Nach der Zugabe von Bernsteinsäureanhydrid (396 mg) und Tributylamin (0,94 ml) inkubiert man das Medium unter wasserfreien Bedingungen während 2 Stunden bei 60ºC. Nach dem Abkühlen und der Zugabe von Wasser (2 ml) fällt man mit einer eisgekühlten, mit Natriumacetat gesättigten alkoholischen Lösung aus. Man wäscht den Niederschlag mit Ethanol, löst in pyrogenfreiem Wasser und dialysiert während 36 Stunden gegen 5%-iges Natriumbicarbonat und dann während 3 Tagen gegen Wasser. Man erhält nach dem Gefriertrocknen das O-succinylierte Dermatansulfat in Form des Natriumsalzes (0,83 mg).
- Das Infrarotspektrum (KBr) zeigt bei 1730 cm&supmin;¹ und 1420 cm&supmin;¹ für die Carboxylgruppe charakteristische Frequenzen (Wellenzahlen).
- Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum in D&sub2;O (Methanol 51,6 ppm als Interner Standard) zeigt bei 33; 34,5 und 183,6 ppm charakteristische Signale für die Succinylgruppe und bei 25,3 ppm das für die Methylgruppe der Acetamidogruppe charakteristische Signal, das identisch ist mit dem des Ausgangsprodukts.
- Sulfat/ Carboxy-Verhältnis: 0,51.
- Heparin wird nach der von Nagasawa und Inoue beschriebenen Technik (Methods Carbohydr. Chem. Vol. VIII, S. 291-294) N-desulfatiert und dann N-acetyliert.
- Man erhält das Tributylammoniumsalz (1 g) durch Überführen über das Harz Dowex 50 H&spplus;, gefolgt von einer Neutralisation mit Tributylamin in Ethanol.
- Nach dem Gefriertrocknen und dem Trocknen löst man dieses Salz in Dimethylformamid (10 ml) und gibt dann nach dem Abkühlen auf 0ºC Buttersäureanhydrid (2 ml), Tributylamin (2 ml) und Dimethylaminopyridin (65 mg) zu. Nach 24 Stunden gibt man Wasser (5 ml) zu und dialysiert die Mischung dann gegen eine 5 %-ige Natriumbicarbonatlösung und anschließend gegen Wasser. Nach dem Überführen über Dowex 50 H&spplus;, gefolgt von einer Neutralisation mit Natriumhydroxid, erhält man das Natriumsalz des N-acetylierten O-butyrylierten Heparins.
- Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum (Methanol 51,6 ppm, interner Standard) zeigt ein Signal bei 24,6 ppm, das für die N-Acetylgruppe charakteristisch ist, und Signale bei 16, 20 und 38 ppm, die für die Buttersäureester charakteristisch sind.
- Die Untersuchung kann mit einem teilweise N-desulfatierten N-acetylierten Heparin wiederholt werden und führt zu einem teilweise N-desulfatierten, N-acetylierten und O-butyrylierten Produkt.
- Man acetyliert das Tetrabutylammoniumsalz von Dermatansulfat (0,8 g) in Lösung in Dimethylformamid (20 ml) durch Zugabe von Dimethylaminopyridin (76 mg), Essigsäureanhydrid (1,2 ml) und Triethylamin (1,7 ml). Man erhitzt die Mischung während 1 Stunde auf 80ºC.
- Nach der Abkühlung auf Raumtemperatur gibt man Wasser (0,45 ml) zu, gefolgt von einer 0,3M Lösung von Natriumacetat in Ethanol (100 ml). Nach dem Zentrifugieren löst man den Niederschlag in Wasser und dialysiert gegen destilliertes Wasser. Man erhält das Natriumsalz durch Austausch über eine Dowex 50 H&spplus;- Säule, gefolgt von einer Neutralisation mit Natriumhydroxid. Nach dem Gefriertrocknen erhält man das peracetylierte Dermatansulfat (0,51 g).
- Dieses Produkt zeigt ein Sulfat/Carboxyl-Verhältnis von 1 ,07 mÄq/g (Ausgangsprodukt: 1 ,05 mÄq/g) und enthält etwa drei Acetylgruppen pro Disaccharideinheit.
- Zu einer Lösung von Tetrabutylammonium-heparinat (1 g) in Dimethylformamid (10 ml) gibt man Benzylbromid (0,17 ml). Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur gibt man Tetrabutylammoniumacetat (220 mg) zu. Nach 24 Stunden bewirkt man die Acetylierung des gebildeten Benzylesters. Hierzu gibt man Dimethylaminopyridin (57 mg), gefolgt von Triethylamin (1,3 ml) und Essigsäureanhydrid (0,9 ml) zu.
- Nach der Rückkehr zur Raumtemperatur rührt man die Reaktionsmischung während 24 Stunden. Man gibt dann Wasser zu und fällt das Produkt mit einer gesättigten Lösung von Natriumacetat in Ethanol aus. Nach der Dialyse gegen destilliertes Wasser und Überführen über Dowex 50 H&spplus;, der Neutralisation mit Natriumhydroxid und der Gefriertrocknung erhält man das Natriumsalz des O-acetylierten Heparinbenzylesters (0,57 g).
- Das Produkt besitzt ein Sulfat/Carboxyl-Verhältnis von 3,6 mÄq/g (nichtbenzyliertes Ausgangsprodukt: 2,20 mÄq/g).
- Das Kohlenstoffspektrum (Methanol 51,6 ppm, Interner Standard) zeigt Signale bei 23,3 ppm (O-Acetylgruppe) und 131,6 ppm (Benzylgruppe).
- Das Signal für CH&sub3; der CH&sub3;-CO-NH-Gruppe bei 24,5 ppm ist identisch mit dem des Ausgangsprodukts.
- Man löst das Tetrabutylammoniumsalz von Dermatansulfat (1 g) in wasserfreiem Dimethylformamid (15 ml). Zu dieser auf 0ºC abgekühlten Lösung gibt man Benzylbromid (0,25 ml) zu und läßt dann während 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen.
- Dann gibt man Tetrabutylammoniumacetat (0,32g) zu und führt nach 24-stündigem Stehenlassen bei Raumtemperatur die Acetylierung durch.
- Man gibt Essigsäureanhydrid (1,5 ml), gefolgt von Triethylamin (2,2 ml) und Dimethylaminopyridin (96 mg) zu. Nach 24 Stunden gibt man Wasser (0,6 ml) zu und fällt dann das Produkt durch Zugabe einer gesättigten ethanolischen Natriumacetatlösung aus.
- Man dialysiert das Produkt gegen 10%-iges Natriumchlorid und dann gegen Wasser.
- Nach dem Gefriertrocknen erhält man den O-acetylierten Dermatansulfat-benzylester (0,63 g).
- Man löst das Tributylammoniumsalz von Dermatansulfat (2 g), das man unter den gleichen Bedingungen, wie sie für die Herstellung von Tributylammoniumheparinat in Beispiel 2 beschrieben sind, erhalten hat, und N,N-Dimethylaminopyridin (220 mg) inwasserfreiem Dimethylformamid (25 ml). Nach dem Abkühlen auf 0ºC gibt man tropfenweise Buttersäureanhydrid (5,9 ml) und dann Tributylamin (8,6 ml) zu. Nach 24-stündigem Inkubieren und dem Abkühlen auf 0ºC gibt man Wasser (1 ml) zu und fällt mit einer eisgekühlten gesättigten alkoholischen Natriumacetatlösung aus. Man wäscht den Niederschlag mit Ethanol, löst in pyrogenfreiem Wasser und dialysiert während 36 Stunden gegen 5%-iges Natriumbicarbonat und dann während 3 Tagen gegen Wasser. Nach dem Gefriertrocknen erhält man das O-butyrylierte Dermatansulfat in Form des Natriumsalzes (1,3 g).
- Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum in D&sub2;O (Methanol 51,6 ppm als interner Standard) zeigt bei 15,6; 20,5 und 38,4 ppm Signale, die für die Butyrylgruppe charakteristisch sind, und bei 25,2 ppm das für die Methylgruppe der Acetamidogruppe charakteristische Signal, das identisch ist mit dem des Ausgangsprodukts.
- Sulfat/Carboxyl-Verhältnis: 1,05.
- Man löst das Tributylammoniumsalz von Dermatansulfat (2 g) und N,N-Dimethylaminopyridin (220 mg) in wasserfreiem Dimethylformamid (25 ml). Nach dem Abkühlen auf 0ºC gibt man tropfenweise Hexansäureanhydrid (9,4 ml) und dann Tributylamin (8,6 ml) zu. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur und dem Abkühlen auf 0ºC gibt man Wasser (1 ml) zu und bewirkt eine Ausfällung in einer eisgekühlten gesättigten alkoholischen Natriumacetatlösung. Man wäscht den Niederschlag mit absolutem Ethanol, löst in pyrogenfreiem Wasser und dialysiert während 36 Stunden gegen 5%-iges Natriumbicarbonat und dann während 3 Tagen gegen Wasser. Nach dem Gefriertrocknen erhält man das O-hexanoylierte Dermatansulfat in Form des Natriumsalzes (1 g).
- Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum in D&sub2;O (Methanol 15,6 ppm als interner Standard) zeigt bei 15,9; 24,2; 26,5; 33,1 und 36,4 ppm die für die O-Hexanoylgruppe charakteristischen Signale und bei 25,2 ppm das für die Methylgruppe der Acetamidogruppe charakteristische Signal, das identisch ist mit dem des Ausgangsprodukts.
- Sulfat/Carboxyl-Verhältnis: 1,02.
- Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit den Verfahren des französischen Patents 2100735 und des europäischen Patents 245 880 verglichen. Insbesondere wurden die Eigenschaften des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Essigsäureesters von Heparin (IC 1938, Beispiel 1) mit jenen des Essigsäureesters von Heparin verglichen, der durch Anwendung der in dem französischen Patent 2100735 (Produkt A) beschriebenen Bedingungen erhalten worden ist, und den Essigsäureestern von Heparin, die nach den Verfahrensweisen der Beispiele 3 und 4 des europäischen Patents 256 880 (Produkte B und C) erhalten worden sind.
- Zu einer Lösung von Tetrabutylammonium-heparinat (1 g) In Lösung in wasserfreiem Dimethylformamid (10 ml) gibt man Dichlorhexylcarbodiimid (4,2 g) in Lösung in Dimethylformamid (15 ml) und gibt dann tropfenweise im Verlaufe von 45 Minuten bei +4ºC eine Lösung von Essigsäure (1, 16 ml) in Dimethylformamid (25 ml) zu.
- Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur filtriert man die Reaktionsmischung und engt im Vakuum ein. Man suspendiert den Rückstand in Ether. Nach dem Filtrieren und Waschen dialysiert man den Niederschlag gegen destilliertes Wasser. Man erhält das Natriumsalz durch Überführen über eine mit Dowex H&spplus; gefüllte Säule und Neutralisation mit Natriumhydroxid. Man erhält 0,493 g des Produkts A.
- Dieses Verfahren wird auch während 48 Stunden bei +4ºC durchgeführt.
- Man bereitet die Produkte B und C durch Acetylieren von Heparin in einer Mischung aus Formamid und Pyridin mit Acetylchlorid unter Verwendung von 2 ml Acetylchlorid für das Produkt B und 40 ml für das Produkt C unter Anwendung der Bedingungen, die in den Beispielen 3 und 4 des europäischen Patents 256880 beschrieben sind. Der Essigsäureester wird anschließend in Wasser aufgenommen und gegen Natriumchlorid dialysiert.
- Die Eigenschaften der erhaltenen Produkte sind in der Tabelle 1 angegeben. Die Eigenschaften der Ausgangsheparine, die bei jeder Untersuchung verwendet worden sind, sind zum Vergleich ebenfalls angegeben. TABELLE 1 Produkt Sulfat/Carboxyl-Verhältnis (mÄa/g) APTT-Titer* I.E./mg YW-Titer* E/mg Ausgangsheparin * Die APTT- und Yin/Wessler-Titer sind in vitro gemessen worden.
- Die Ergebnisse zeigen, daß, obwohl die APTT- und YW-Titer für sämtliche Produkte gegenüber dem Ausgangsheparin niedriger sind, dies für die Produkte A, B und C wesentlich stärker der Fall ist, lediglich das Produkt IC 1938 zeigt ein Sulfat/ Carboxyl-Verhältnis, das praktisch identisch ist mit dem des Ausgangsheparins.
- Dies ergibt sich aufgrund der Tatsache, daß das erfindungsgemäße Verfahren es ermöglicht, die Hydroxylgruppen selektiv zu acetylieren, ohne die funktionellen Gruppen des Heparins zu verändern, was durch die chemische Analyse der Produkte bestätigt wird.
- Die Produkte IC 1938, A, B und C wurden mit Hilfe des Kohlenstoff-NMR-Spektrums (Methanol 51,6 ppm, interner Standard) analysiert. Die Spektren dieser Produkte sowie das des Ausgangsheparins sind im folgenden angegeben:
- Fig. 1: Ausgangsheparin
- Fig. 2: IC 1938
- Fig. 3: Produkt A nach 24 Stunden der Reaktion
- Fig. 4: Produkt A nach 48 Stunden der Reaktion
- Fig. 5: Produkt B
- Fig. 6: Produkt C
- Die Ergebnisse sind die folgenden:
- - Ein Signal bei 23,4 ppm, was der CH&sub3;-Gruppe des CH&sub3;-CO-O-Rests entspricht,
- - ein Signal bei 24,4 ppm, was der CH&sub3;-Gruppe des CH&sub3;-CO-NH-Rests entspricht,
- die identisch sind mit dem Signal, das in dem Ausgangsheparin vorhanden ist.
- Diese Signale zeigen, daß die Aminogruppen und die Carboxylgruppen beibehalten worden sind und daß eine selektive Acylierung im Bereich der Hydroxylgruppen erfolgt ist.
- daß das erhaltene Produkt überwiegend sowohl nach 24 Stunden als auch nach 48 Stunden (Fig. 3 und 4) ein Isoharnstoffderivat von Heparin ist, dessen Carboxylgruppen aufgrund der Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid durch eine Gruppe der Formel
- substituiert sind. In der Tat beobachtet man starke Signale, die den Kohlenstoffatomen der obigen Gruppe entsprechen, bei 27, 24, 54 und 156 ppm, während das der CH&sub3;-Gruppe des CH&sub3;-CO-O-Rests entsprechende Signal bei 23 ppm sehr schwach ist.
- Das Verfahren ermöglicht es somit nicht, eine selektive O-Acylierung zu bewerkstelligen und führt zu einer Veränderung der Carboxylgruppen, was sich in einer Erhöhung des Sulfat/Carboxyl-Verhältnisses manifestiert.
- - Ein Signal bei 23, 1 ppm, was der CH&sub3;-Gruppe des CH&sub3;-CO-O-Rests entspricht,
- - ein Signal bei 24,8 ppm, was der CH&sub3;-Gruppe des CH&sub3;-CO-NH-Rests entspricht, die wesentlich intensiver sind als die des Ausgangsheparins und die von IC 1938.
- Diese Signale zeigen, daß man nicht nur eine O-Acetylierung beobachtet, sondern auch eine starke N-Acetylierung. Das angewandte nichtselektive Acetylierungsverfahren führt zu einer teilweisen N-Desulfatierung, gefolgt von einer Acetylierung der Aminogruppen, was auch eine Verminderung des Sulfat/Carboxyl-Verhältnisses zur Folge hat.
- - Ein Signal bei 22 ppm, das der CH&sub3;-Gruppe des CH&sub3;-CO-O-Rests entspricht,
- - ein Signal bei 24 ppm, was der CH&sub3;-Gruppe des CH&sub3;-CO-NH-Rests entspricht,
- die wesentlich intensiver sind als die des Ausgangsheparins und die von IC 1938.
- Wie bei dem Produkt B beobachtet man gleichzeitig eine O- und N-Acylierung. Die noch stärkere N-Desulfatierung als beim Produkt B führt zu einer starken Verminderung des Sulfat/Carboxyl-Verhältnisses.
- 1. Bewertung des in vitro-Titers im Vergleich zu einer Eichprobe:
- Diese Messung erfolgt mit Hilfe des Tests der "sensibilisierten Kaolin-Cephalin- Zeit" (Diagnostica Stago. Asnieres, Frankreich) an menschlichem Plasma. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 angegeben.
- Produkt Titer (I.E./mg)
- IC 1940 113
- IC 1941 28
- IC 1943 7
- Heparin 160
- IC 1940 = O-butyryliertes Heparin, hergestellt nach Beispiel 5
- IC 1941 = O-hexanoyliertes Heparin, hergestellt nach Beispiel 6
- IC 1943 = O-decanoyliertes Heparin, hergestellt nach Beispiel 8.
- Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen selektiv O-acylierten Produkte in vitro einen Titer besitzen, der geringer ist als der von Heparin, wobei ihre antikoagulierende Wirkung in Abhängigkeit von der Länge der acylierenden Kette abnimmt.
- 2. Bestimmung der antikoagulierenden Wirkung in vitro der erfindungsgemäßen Produkte an menschlichem Blut:
- Die Untersuchungen erfolgen bei zwei Dosierungen der erfindungsgemäßen Produkte, nämlich 2 ug/ml und 4 ug/ml an 5 ml menschlichem Blut. Man führt für jedes Produkt auch eine Kontrolluntersuchung durch, bei der man das zu untersuchende Produkt durch eine isotonische NaCl-Lösung ersetzt. Nach einer Inkubationsdauer von 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert man das Blut während 20 Minuten bei 3000 min&supmin;¹. Das von Plättchen befreite Plasma wird dekantiert, um die folgenden Tests zu ermöglichen:
- - TCK (Cephalin-Kaolin-Zeit) mit Hilfe des Kits für die "sensibilisierte Cephalin- Kaolin-Zeit" (Diagnostica Stago, Asnieres, Frankreich),
- - Heptest® (Hemachem, St. Louis, USA).
- Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 angegeben. Jedes Ergebnis entspricht dem Mittelwert von drei Untersuchungen. TABELLE 3 Produkt Dosis (ug/ml) TCK (S) HEPTEST (S) Kontrolle
- Die Ergebnisse zeigen bei beiden Methoden eine Verlängerung der Koagulationszeit für die Produkte IC 1940 und IC 1941. Diese Verlängerung ist proportional zur Dosis.
- Andererseits hat bei diesen in vitro-Methoden das Produkt IC 1943 nur eine sehr geringe Wirkung auf die Verlängerung der Koagulationsdauer gezeigt.
- 3. Bestimmung der antikoagulierenden Wirkung in vitro der erfindungsgemäßen Verbindungen durch Thromboelastographie an menschlichem Blut:
- Die erfindungsgemäßen Produkte werden in Dosierungen von 2 ug/ml und 4 ug/ ml mit 5 ml menschlichem Blut in Kontakt gebracht, wie es bei der vorhergehenden Untersuchung beschrieben ist, wobei ein Kontrollversuch für jedes Produkt durchgeführt wird, bei dem das zu untersuchende Produkt durch eine isotonische NaCl-Lösung ersetzt wird.
- Nach einer Inkubationsdauer von 30 Minuten bei Raumtemperatur wird eine Thromboelastographie -Aufzeichnung mit Hilfe eines Thromboelastographen der Firme Heilige an 0,25 ml mit Calcium mit 0,1 ml CaCl&sub2; 0,058M calcifiziertem Blut durchgeführt.
- Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 aufgeführt. TABELLE 4 Produkt Dosis (ug/ml) Kontrolle * r = Reaktionszeit k = Koagulationszeit, die einer Kurvenamplitude von 20 mm entspricht amx = maximale Amplitude IPT = Index des thrombodynamischen Potentials.
- Die Ergebnisse zeigen, daß IC 1940 und IC 1941 zu einer Steigerung des r + k- Werts, einer Verminderung der amx und des IPT führen, was einer gesteigerten Hypokoagulation entspricht. Diese Hypokoagulation nimmt gleichzeitig in Abhängigkeit von der verwendeten Dosis und der Länge der acylierenden Kette zu.
- Bei diesem Test zeigt IC 1943 keine merkliche Modifizierung dieser Parameter.
- 1. Bestimmung der antikoagulierenden Wirkung in vivo der erfindungsgemäßen Produkte am Kaninchen (i.v. Verabreichung):
- Die Untersuchungen erfolgten an männlichen neuseeländischen Kaninchen. Man bewirkt eine Blutentnahme im Bereich der Ohrmittelarterie vor der Injektion des Produkts.
- Anschließend injiziert man an der Randvene des Ohrs eine Lösung des zu untersuchenden Produkts von 25 mg des Produkts in 5 ml einer isotonischen NaCl-Lösung.
- Man führt den TCK-Test und den HEPTEST® durch nach Entnahme des Bluts vor der Injektion der Produkte und am Blut, das 6 h, 24 h, 48 h und 96 h nach der Injektion entnommen worden ist.
- Die Ergebnisse sind in den Fig. 7 und 8 angegeben. Sie zeigen eine deutliche Verlängerung der Zeit der antikoagulierenden Wirkung, wobei diese Verlängerung mit der Länge der acylierenden Kette zunimmt.
- In der Tat ist die antikoagulierende Wirkung des Produkts IC 1940 noch 6 Stunden nach der Injektion deutlich, während sie bei dem Produkt IC 1941 noch 24 Stunden nach der Injektion deutlich ist und sie sich bei dem Produkt IC 1943 auf 96 Stunden verlängert.
- 2. Bestimmung der antikoagulierenden Wirkung in vivo der erfindungsgemäßen Produkte durch Thromboelastographie:
- Die zu untersuchenden Produkte werden auf intravenösem Wege injiziert, wie es bei der vorhergehenden Untersuchung beschrieben worden ist (25 mg in 5 ml isotonischer NaCl-Lösung). Man zeichnet ein Thromboelastogramm mit Hilfe eines Hellige-Thromboelastographen an 0,25 ml Blutproben auf, die 6 h, 24 h, 48 h und 96h nach der Injektion entnommen worden sind, wobei weitere Entnahmen erfolgen, wenn die antikoagulierende Wirkung über die 96 Stunden hinaus vorhanden ist.
- Die Ergebnisse sind in den Tabellen 5, 6 und 7 zusammengestellt. TABELLE 5: Untersuchtes Produkt IC 1940 Vor der Injektion 6 h nach der Injektion TABELLE 6: Untersuchtes Produkt: IC 1941 Vor der Injektion 6 h nach der Injektion TABELLE 7: Untersuchtes Produkt: IC 1943 Vor der Injektion 6 h nach der Injektion
- Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß man bei sämtlichen Produkten eine starke Steigerung von r + k und eine Verminderung des IPT nach der 6. Stunde beobachtet, was auf eine Verlängerung der Hypokoagulierbarkeit hinweist. Dies verdeutlicht sich auch mindestens 24 Stunden nach der Injektion für das Produkt IC 1941 und ist noch 96 Stunden nach der Injektion meßbar bei dem Produkt IC 1943.
- Es ist somit festzuhalten, daß sämtliche Produkte in vivo eine starke antikoagulierende Wirkung entfalten und daß diese Wirkung über die Zelt verlängert wird und daß das Produkt IC 1943, das bei den Untersuchungen in vitro nur wenig oder nicht aktiv ist, sich bei den in vivo-Untersuchungen als sehr aktiv und mit starker verzögerter Wirkung erweist.
- Die antikoagulierende Wirkung der Produkte IC 1945, IC 1957 und IC 1958. die entsprechend den Beispielen 12, 13 und 14 hergestellt worden sind, wurden ebenfalls in vivo am Kaninchen untersucht.
- Die Ergebnisse haben eine verlängerte Pharmakokinetik bei intravenöser Verabreichung und bei subkutaner Verabreichung erkennen lassen.
- Die erfindungsgemäß hergestellten Produkte wurden bei einem Modell der Inhibierung der Viren HIV-1 und HIV-2 in vitro untersucht, wie es von R. Pauwels et al. (J. Virol. Methods, 16 (1987), 171-185) beschrieben worden ist.
- Sämtliche untersuchten Produkte haben sich bei Dosierungen, die von Cytotoxizität vollständig frei sind, als wirksam erwiesen. Insbesondere hat sich gezeigt, daß die Produkte IC 1925 und IC 1926 aktiver sind als das Ausgangsprodukt.
- Syncitia sind Riesenzellen mit mehreren Kernen, die durch Fusion der gesunden Lymphozyten T4 mit infizierten Lymphozyten T4 gebildet werden.
- Die erfindungsgemäß hergestellten Produkte wurden in einem Modell der gleichzeitigen Kultur von Zellen MOLT4 (gesunde Lymphozyten T4) und Zellen HUT-78/ HTLV III B (infizierte Lymphozyten T4 menschlicher Zellinie) untersucht.
- Alle untersuchten Produkte haben sich als bei diesem Modell wirksam erwiesen bei Dosierungen, die völlig frei sind von jeglicher Zytotoxizität. Insbesondere haben sich die Produkte IC 1924, IC 1925 und IC 1926 als wirksamer erwiesen als das Ausgangsprodukt.
- Die Wirkung der nach der Erfindung hergestellten Produkte bezüglich der Inhibierung von verschiedenen Viren, die mit DNA oder RNA umhüllt sind, insbesondere der folgenden Viren:
- - HSV 1 und 2 (Herpes simplex Virus 1 und 2, Virus mit DNA)
- - VSV (Vesicular Stomatitis Virus) Virus mit RNA
- - Sindbis-Virus, Virus mit RNA
- Alle untersuchten Produkte haben sich bei der Inhibierung dieser Viren als wirksam erwiesen bei Dosierungen, die frei sind von Zytotoxizität. Insbesondere haben die Produkte IC 1924, IC 1925 und IC 1926 gegenüber VSV und Sindbis-Virus im Vergleich zu dem Ausgangsprodukt eine stark gesteigerte Wirkung gezeigt.
- Die erfindungsgemäß hergestellten Produkte wurden an einem Modell der Inhibierung der Wucherung von glatten Muskelzellen in vivo an der Ratte (Modell des Ballonkatheters, wie es von A.W. Clowes und M.M. Clowes beschrieben worden ist, Labor. Investig., 52(6) (1985), 612-616) untersucht.
- Die untersuchten Produkte haben sich als wirksam erwiesen. Insbesondere haben die Produkte IC 1924, IC 1925 und IC 1926 eine im Vergleich zu dem Ausgangsprodukt gesteigerte Wirkung gezeigt.
Claims (29)
1. Selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane der folgenden Formel (I):
A-[G-U]n-B (I)
in der
- G eine Gruppe (a) der Formel:
oder eine Gruppe (a') der Formel
oder eine Gruppe (b) der Formel:
- U eine Gruppe (c) der Formel:
oder eine Gruppe (d) der Formel:
oder den Rest der Gruppe (c) oder der Gruppe (d) nach der Periodoxidation gefolgt
von einer β-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse;
- A eine Gruppe R&sub1;, eine Gruppe R&sub1;-(c), eine Gruppe R&sub1;-(d) oder eine Gruppe (e)
der Formel:
oder den Rest der Gruppe (c) oder der Gruppe (d) nach der Periodoxldation gefolgt
von einer β-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse;
- B eine Gruppe O-R&sub1;, eine Gruppe (a)-OR&sub1;, eine Gruppe (a')-OR&sub1;, eine Gruppe
(b)-OR&sub1; oder eine Gruppe (f) der Formel:
oder eine Gruppe (c) der Formel:
oder eine Gruppe (a), eine Gruppe (a') oder eine Gruppe (b), an welche ein Rest von
(c) oder von (d) gebunden ist, wie er nach der Periodoxidation gefolgt von einer β-
Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse vorliegt;
- R&sub1; H, SO&sub3;&supmin; oder eine Acylgruppe einer nicht-α,β-ungesättigten Carbonsäure
oder Dicarbonsäure ausgewählt aus:
einer Alkanoylgruppe mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen,
einer Alkanoylgruppe mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen substituiert mit:
· einer Cycloalkylgruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen oder
· einer ungesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppe mit 4 bis 16
Kohlenstoffatomen;
einer Benzoylgruppe, die gegebenenfalls durch eine oder mehrere Alkylgruppen
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogenatome oder NO&sub2;- oder OCH&sub3;-Gruppen
substituiert ist,
einer (C&sub3;&submin;&sub7;)-Cycloalkyl-carbonylgruppe;
- R&sub2; SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acetylgruppe mit der Maßgabe, daß der Anteil von N-
Acetylglucosamin höchstens gleich ist demjenigen von Heparin, wenn R&sub1; eine
Acetylgruppe darstellt;
- R&sub3; ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine
Phenylalkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen oder einAlkalimetall- oder
Erdalkallmetall-Kation; und
- n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 80 bedeuten,
wobei R&sub1; mit der Maßgabe eine Acylgruppe bedeutet, daß mindestens 0,1 bis 3
Acylgruppen pro Disaccharid-Einheit vorliegen, und deren pharmazeutisch
annehmbare Salze,
erhältlich ausgehend von einem Glykosaminoglykan ausgewählt aus der Gruppe,
die gebildet wird durch:
Heparin, einer Mischung von Heparinfragmenten mit einem Molekulargewicht
von weniger als 10.000 Dalton, einer Mischung von Heparinfragmenten mit einem
mittleren Molekulargewicht zwischen 2.000 und 7.000 Dalton, einer Mischung
von Heparinfragmenten mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 4.500
Dalton, einer Mischung von Heparinfragmenten mit einem mittleren
Molekulargewicht von etwa 2.500 Dalton oder einer Mischung von Heparinfragmenten mit
gleichem Molekulargewicht, einer Heparinfraktion oder einem Heparinfragment,
welches frei ist von Bindungsstellen für Antithrombin III, Dermatansulfat und
dessen Fragmente,
welches man:
(1) in einem aprotischen polaren Lösungsmittel in ein tertiäres Aminsalz oder
ein quaternäres Ammoniumsalz umwandelt;
(2) dieses Salz mit einem Anhydrid der Formel:
R&sub1;-O-R&sub1;
in der R&sub1; eine Acylgruppe, wie sie oben definiert worden ist, bedeutet, in einem
aprotischen polaren Lösungsmittel und in Gegenwart von katalytischen Mengen
von Pyridin oder eines Dialkylaminopyridins und eines Protonenakzeptors bei
einer Temperatur zwischen 0ºC und 100ºC behandelt;
(3) man das in diese Weise erhaltene Produkt durch Einwirkung einer Lösung
von Natriumacetat in Ethanol ausfällt und
(4) das selektiv O-acylierte Glykosaminoglykan durch Auflösen des in dieser
Weise erhaltenen Niederschlags in Wasser und Dialyse isoliert und gegebenenfalls
das in dieser Weise erhaltene Natriumsalz des selektiv O-acylierten
Glykosaminoglykans in ein anderes pharmazeutisch annehmbares Salz umwandelt.
2. Selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß sie der folgenden Formel (II) entsprechen:
in der
- A die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzt
- R&sub1; H und/oder SO&sub3;-und/oder eine Acylgruppe, wie sie bezüglich der Formel (I)
definiert worden ist;
- R&sub2; SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acetylgruppe, mit der Maßgabe, daß der Anteil von N-
Acetylglucosamin höchstens gleich ist jenem von Heparin, wenn R&sub1; eine
Acetylgruppe darstellt;
- R&sub3; ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine
Phenylalkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen oder ein Alkalimetall- oder
Erdalkalimetall-Kation;
- B (a)-OR&sub1; oder (f), wobei (a) und (f) die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen
besitzen, oder OR&sub1; oder eine Gruppe (a), an die ein Rest von (c) oder (d) gebunden
ist, wie er nach der Periodoxidation gefolgt von einer β-Eliminierung oder einer
sauren Hydrolyse vorhanden ist; und
- n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 80 mit der Maßgabe bedeuten, daß,
wenn A R&sub1;, eine Gruppe R&sub1;-(c) oder eine Gruppe R&sub1;-(d) und B O-R&sub1;, eine Gruppe
(a)-OR&sub1; oder eine Gruppe (b)-OR&sub1; darstellen, n eine ganze Zahl mit einem Wert
von 1 bis 16 bedeutet.
3. Selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß sie der allgemeinen Formel (II) entsprechen:
in der:
- A und B die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen;
- R&sub1; H und/oder SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acylgruppe einer nicht-α,β-ungesättigten
Carbonsäure oder Dicarbonsäure ausgewählt aus:
einer Alkanoylgruppe mit 4 bis 18 Kohlenstoffatomen,
einer Alkanoylgruppe mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen substituiert durch:
· eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen oder
· eine ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 4 bis 16
Kohlenstoffatomen;
einer Benzoylgruppe, die gegebenenfalls durch eine oder mehrere Alkylgruppen
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogenatome oder NO&sub2;- oder OCH&sub3;-Gruppen
substituiert ist,
einer (C3-7)-Cycloalkyl-carbonylgruppe;
- R&sub2; SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acetylgruppe mit der Maßgabe, daß der Anteil von N-
Acetylglucosamin höchstens gleich ist jenem von Heparin, wenn R&sub1; eine
Acetylgruppe darstellt;
- R&sub3; ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine
Phenylalkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen oder ein Alkalimetall- oder
Erdalkalimetall-Kation; und
- n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 80 mit der Maßgabe bedeuten, daß
R&sub1; in dem Ausmaß Acyl bedeutet, daß mindestens 0,5 bis 2 Acylgruppen pro
Disaccharid-Einheit vorliegen.
4. Selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane nach den Ansprüchen 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß das Glykosaminoglykan aus der Gruppe
ausgewählt ist, die gebildet wird aus einer Mischung aus Heparinfragmenten mit einem
Molekulargewicht von weniger als 10.000 Dalton, einer Mischung von
Heparinfragmenten mit einem mittleren Molekulargewicht zwischen 2.000 und 7.000
Dalton, einer Mischung von Heparinfragmenten mit einem mittleren
Molekulargewicht von etwa 4.500 Dalton, einer Mischung von Heparinfragmenten mit
einem mittleren Molekulargewicht von etwa 2.500 Dalton und einer Mischung von
Heparinfragmenten mit gleichem Molekulargewicht, wobei die Acylgruppe in
einem Anteil von 0,5 bis 2 Gruppen pro Disaccharid-Einheit vorhanden ist.
5. Selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das Glykosaminoglykan Heparin ist und die Acylgruppe in
einem Anteil von mindestens 0,5 bis 2 Gruppen pro Disaccharid-Einheit vorliegt.
6. Selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane nach Anspruch 5, dadurch
gekennzeichnet, daß die Acylgruppe in einem Anteil von einer Acylgruppe pro
Disaccharid-Einheit vorliegt.
7. Selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane nach einem der Ansprüche 1 bis
4, dadurch gekennzeichnet, daß sie der folgenden Formel (III) entsprechen:
in der
- A R&sub1; oder R&sub1;-(c) oder R&sub1;-(d), wie sie in Anspruch 1 definiert worden sind;
- R&sub1; H und/oder SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acylgruppe, wie sie in Anspruch 1 definiert
worden ist;
- R&sub2; SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acetylgruppe mit der Maßgabe, daß der Anteil von N-
Acetylglucosamin höchstens gleich ist jenem von Heparin, wenn R&sub1; eine
Acetylgruppe darstellt;
- R&sub3; ein Wasserstoffatom und/oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 10
Kohlenstoffatomen, eine Phenylalkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen oder ein
Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation; und
- n eine ganze Zahl mit einem Wert von 3 bis 12 bedeuten.
8. Selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane nach einem der Ansprüche 1 bis
4, dadurch gekennzeichnet, daß sie der folgenden Formel (IV) entsprechen:
in der:
- R&sub1; H und/oder SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acylgruppe, wie sie in Anspruch 1 definiert
worden ist;
- R&sub2; SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acetylgruppe mit der Maßgabe, daß der Anteil von N-
Acetylglucosamin höchstens gleich ist jenem von Heparin, wenn R&sub1; eine
Acetylgruppe darstellt;
- R&sub3; ein Wasserstoffatom und/oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 10
Kohlenstoffatomen, eine Phenylalkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen oder ein
Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation;
- B (a)-OR&sub1;, wie es in Anspruch 1 definiert worden ist, oder OR&sub1;; und
- n eine ganze Zahl mit einem Wert von 2 bis 20 bedeuten.
9. Selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane nach den Ansprüchen 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß das ausgewählte Glykosaminoglykan Heparin
oder eine Heparinfraktion oder ein Heparinfragment, welches frei ist von
Bindungsstellen für Antithrombin III, ist.
10. Selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane nach einem der Ansprüche 1, 2, 3
und 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie der folgenden Formel (V) entsprechen:
in der:
- A R&sub1;-(c), R&sub1;-(d) oder den Rest von (c) oder (d) nach der Periodoxidation gefolgt
von einer β-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse;
- B eine Gruppe (a)-OR&sub1;, eine Gruppe (a), an welche ein Rest von (c) oder von (d)
gebunden ist, wie er nach der Periodoxidation gefolgt von einer β-Eliminierung
oder einer sauren Hydrolyse vorhanden ist;
- R&sub1; die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen;
- R&sub2; SO&sub3;&supmin; oder eine Acetylgruppe, wobei der Anteil von SO&sub3;&supmin; etwa 90% beträgt;
- R&sub3; ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetall- oder ein Erdalkalimetall-Kation;
und
- n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 80 bedeuten.
11. Selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane nach einem der Ansprüche 1, 2, 3
und 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie der folgenden Formel (VI) entsprechen:
in der:
- A R&sub1;, R&sub1;-(c), R&sub1;-(d) oder den Rest von (c) oder von (d) nach der Periodoxidation
gefolgt von einer β-Eliminierung;
- U eine Gruppe der Formel:
aus der sich für mindestens zwei Ketten eine geöffnete nichtsulfatierte Uronsäure
(D-Glucuronsäure oder L-Iduronsäure) zwischen den Kohlenstoffatomen in den
Positionen 2 und 3 ergibt, der Formel:
- B (a)-OR&sub1; oder OR&sub1; oder eine Gruppe (a), an die ein Rest von (c) oder von (d)
gebunden ist, wie er nach der Periodoxidation gefolgt von einer β-Eliminierung
vorhanden ist;
- R&sub1; die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen;
- R&sub2; SO&sub3;&supmin; oder Acetylgruppe, wobei der Anteil von SO&sub3;&supmin; etwa 90% beträgt;
- R&sub3; ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation;
und
- n eine ganze Zahl mit einem Wert von 2 bis 18 bedeuten.
12. Selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane nach einem der Ansprüche 1, 2,3
und 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Formel (VI) entsprechen, in der:
- n für die Mehrheit der vorhandenen Moleküle eine ganze Zahl zwischen 7 bis 15
bedeutet und
- R&sub1; eine Alkanoylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellt.
13. Selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane gemäß den Ansprüchen 11 und
12, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Mischung von Fragmenten mit
gleichem Molekulargewicht gebildet sind, in denen n eine ganze Zahl mit einem
Wert von 2 bis 12 und R&sub1; eine Alkanoylgruppe mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen
bedeuten.
14. Selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane nach einem der Ansprüche 1, 2, 3
und 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie der folgenden Formel (VII)
entsprechen:
in der:
- A R&sub1;, R&sub1;-(c) oder R&sub1;-(d), wie sie bezüglich der Formel (I) definiert worden sind;
- R&sub1; eine Alkanoylgruppe mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen;
- R&sub3; ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation;
- B (a)-OR&sub1;, wie es bezüglich der Formel (I) definiert worden ist, oder OR&sub1;; und
- n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 80 bedeuten.
15. Selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß sie der folgenden Formel (VIII) entsprechen:
in der:
- A die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzt
- R&sub1; H und/oder SO&sub3;&supmin; und/oder eine Acylgruppe, wie sie in Anspruch 1 definiert
worden ist;
- R&sub3; ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine
Phenylalkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen oder ein Alkalimetall- oder
Erdalkalimetall-Kation;
- B (b)-OR&sub1; oder (g), wie sie bezüglich der Formel (I) definiert worden sind, oder
OR&sub1; oder eine Gruppe (b), an die ein Rest von (c) oder von (d) gebunden ist, wie er
nach der Periodoxidation gefolgt von einer β-Eliminierung oder einer sauren
Hydrolyse vorhanden ist; und
- n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 80 bedeuten.
16. Selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane nach den Ansprüchen 1 oder 15,
dadurch gekennzeichnet, daß das Glykosaminoglykan aus der Gruppe
ausgewählt ist, die Dermatansulfat und dessen Fragmente umfaßt, wobei die
Acylgruppe in einem Anteil von mindestens 0,1 bis 3 Gruppen pro Disaccharid-Einheit
vorhanden ist.
17. Selektiv O-acylierte Glykosaminoglykane nach einem der Ansprüche 1 bis
16, worin R&sub1; eine Alkanoylgruppe mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellt.
18. Verfahren zur Herstellung von selektiv O-acylierten Glykosaminoglykanen
nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man:
(1) ein Glykosaminoglykan der Formel IX:
Aº-[Gº-Uº]n-Bº (IX)
in der:
- Gº eine Gruppe (a)º der Formel:
oder eine Gruppe (a')º der Formel:
oder eine Gruppe (b)º der Formel:
- Uº eine Gruppe (c)º der Formel:
oder eine Gruppe (d)º der Formel:
oder den Rest der Gruppe (c)º oder der Gruppe (d)º nach der Periodoxidation
gefolgt von einer β-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse;
- Aº eine Gruppe Rº&sub1; oder eine Gruppe Rº&sub1;-(c)º, eine Gruppe Rº&sub1;-(d)º oder eine
Gruppe (e)º der Formel:
oder den Rest der Gruppe (c)º oder der Gruppe (d)º nach der Periodoxidation
gefolgt von einer β-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse;
- Bº eine Gruppe ORº&sub1;, eine Gruppe (a)º-ORº&sub1;, eine Gruppe (a')º-ORº&sub1;, eine
Gruppe (b)º-ORº&sub1; oder eine Gruppe (f)º der Formel:
oder eine Gruppe (g)º der Formel:
oder Gruppen (a)º, (a')º, (b)º, an die ein Rest von (c)º oder von (d)º gebunden ist, wie
er nach der Periodoxidation gefolgt von einer β-Eliminierung oder einer sauren
Hydrolyse vorhanden ist;
- R&sub1;º H oder SO&sub3;&supmin;;
- R&sub2; SO&sub3;&supmin; oder eine Acetylgruppe mit der Maßgabe, daß der Anteil von
N-Acetylglucosamin höchstens gleich ist dem von Heparin, wenn R&sub1; eine Acetylgruppe
darstellt;
- R&sub3; ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatmen, eine
Phenylalkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen oder ein Alkalimetall- oder
Erdalkalimetall-Kation; und
- n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 80 bedeuten,
in ein tertiäres Aminsalz oder ein quaternäres Ammoniumsalz des
Glykosaminoglykans umwandelt, welches in einem aprotischen polaren Lösungsmittel löslich
ist;
(2) dieses Salz mit einem Anhydrid der Formel:
R&sub1;-O-R&sub1;
in der R&sub1; eine Acylgruppe bedeutet, wie sie in Anspruch 1 definiert worden ist, in
dem polaren aprotischen organischen Lösungsmittel in Gegenwart von
katalytischen Mengen von Pyridin oder eines Dialkylaminopyridins und eines
Protonenakzeptors bei einer Temperatur zwischen 0ºC und 100ºC behandelt;
(3) das in dieser Weise erhaltene Produkt durch Einwirkung einer Lösung von
Natriumacetat in Ethanol ausfällt und
(4) das selektiv O-acylierte Glykosaminoglykan durch Auflösen des in dieser
Weise erhaltenen Niederschlags in Wasser und Dialyse isoliert und das in dieser
Weise erhaltene Natriumsalz des selektiv O-acylierten Glykosaminoglykans
gegebenenfalls in ein anderes pharmazeutisch annehmbares Salz umwandelt.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das in der
Stufe (1) eingesetzte Glykosaminoglykan aus der Gruppe ausgewählt ist, die
durch Heparin, einer Mischung von Heparinfragmenten mit einem
Molekulargewicht von weniger als 10.000 Dalton, einer Mischung von Heparinfragmenten mit
einem mittleren Molekulargewicht zwischen 2.000 und 7.000 Dalton, einer
Mischung von Heparinfragmenten mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa
4.500 Dalton, einer Mischung von Heparinfragmenten mit einem
Molekulargewicht von etwa 2.500 Dalton oder einer Mischung von Heparinfragmenten mit
dem gleichen Molekulargewicht gebildet wird.
20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das in der
Stufe (1) eingesetzte Glykosaminoglykan Heparin oder eine Heparinfraktion oder
ein Heparinfragment ist, welches frei von Bindungsstellen für Antithrombin III
ist.
21. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das in der
Stufe (1) eingesetzte Glykosaminoglykan aus der Gruppe ausgewählt wird, die
durch Dermatansulfat und seinen Fragmenten gebildet wird.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet,
daß das GIykosaminoglykansalz der Stufe (1) ein Tributylaminsalz oder ein
Tetrabutylammoniumsalz ist.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet,
daß das in der Stufe (2) eingesetzte Anhydrid ein Anhydrid einer Alkansäure mit 2
bis 10 Kohlenstoffatomen ist.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet,
daß die Stufe (2) in einem polaren aprotischen Lösungsmittel durchgeführt wird
ausgewählt aus der Gruppe, die durch Dimethylformamid,
Hexamethylphosphortriamid, Pyridin oder einer Mischung dieser Lösungsmittel untereinander
oder mit Dichlormethan gebildet wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Protonenakzeptor in der Stufe (2) eine Base verwendet, die aus der
Gruppe ausgewählt ist, die durch Pyridin, Triethylamin und Tributylamin
gebildet wird.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 25, dadurch gekennzeichnet,
daß die Dialyse der Stufe (4) In Gegenwart einer schwachen Base durchgeführt
wird.
27. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als
Wirkstoff eine wirksame Menge mindestens eines selektiv O-acylierten
Glykosaminoglykans nach einem der Ansprüche 1 bis 17 In Kombination mit einem
pharmazeutischen Trägermaterial umfaßt.
28. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 27 zur Behandlung oder zur
Vorbeugung von durch Hüllviren verursachte Erkrankungen.
29. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 27 zur Behandlung oder zur
Vorbeugung von durch Retroviren verursachten Erkrankungen.
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