DE69908298T2

DE69908298T2 - Pentasaccharide, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische zubereitungen die sie enthalten

Info

Publication number: DE69908298T2
Application number: DE69908298T
Authority: DE
Inventors: Maurice Petitou
Original assignee: Sanofi Synthelabo SA; Akzo Nobel NV
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1998-01-19
Filing date: 1999-01-13
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2019-01-14
Also published as: CN1172948C; FR2773801B1; AU744137B2; UA61124C2; TR200002077T2; CA2318326A1; BR9907100A; CO4970823A1; EE04194B1; ZA99357B; SK10792000A3; SK284176B6; IL137240A; KR20010034205A; PL341874A1; CA2318326C; KR100533565B1; IL137240A0; HUP0102042A1; NO316894B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Pentasaccharide, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zubereitungen.
Heparin ist ein Polysaccharid der Familie der Glykosaminoglykane, welches für seine antikoagulierenden Wirkungen bekannt ist. Es ist bekannt (I. Björk und U. Lindahl, Molecular and Cellular Biochemistry (1982), Dr. W. Junk Publishers-Niederlande), daß die Blutkoagulation bzw. Blutgerinnung ein komplexes physiologisches Phänomen darstellt. Gewisse Reize, wie die Kontaktaktivierung und der Gewebefaktor, lösen die sukzessive Aktivierung einer Reihe von Koagulationsfaktoren aus, die im Blutplasma vorhanden sind. In der Auslösung sind die letzten Stufen identisch, der aktivierte Faktor X (Xa) aktiviert den Faktor II (der auch als Prothrombin bezeichnet wird) und der in seiner aktivierten Form (Faktor IIa, der auch als Thrombin bezeichnet wird) die teilweise Proteolyse des löslichen Fibrinogens verursacht unter Freisetzung von unlöslichem Fibrin, einem der wesentlichen Bestandteile des Blutpfropfens.
Bei normalen physiologischen Bedingungen wird die Aktivität der Koagulationsfaktoren durch Proteine, wie Antithrombin III (ATIII) und den Cofaktor II des Heparins (HC II) reguliert, die ebenfalls in dem Plasma vorhanden sind. AT III übt eine inhibierende Wirkung auf eine bestimmte Zahl von Koagulationsfaktoren und insbesondere auf die Faktoren Xa und IIa aus.
Die Inhibierung des Faktors Xa oder des Faktors IIa stellt somit das herausragende Mittel dar zur Erzielung einer antikoagulierenden und antithrombotischen Wirkung, da diese beiden Faktoren in den beiden letzten Stufen der Koagulation eine Rolle spielen, die von dem auslösenden Stimulus unabhängig sind.
Ein Pentasaccharid, wie es von P. Sinay et al., Carbohydrate Research (1984), 132 C5 beschrieben worden ist, stellt die minimale Sequenz des Heparins dar, die für die Bindung an AT III erforderlich ist. Diese Verbindung wurde vor etwa fünfzehn Jahren durch chemische Totalsynthese hergestellt.
Seitdem wurde eine gewisse Zahl von synthetischen Oligosacchariden, die durch chemische Totalsynthese erhalten worden sind und die antithrombotische und antikoagulierende Wirkungen aufweisen, in der Literatur beschrieben.
Das Patent EP 0 084 999 beschreibt Derivate, die aus Monosaccharid einheiten von Uronsäuren (Glucuronsäure oder Iduronsäure) und Glucosamin gebildet sind und die interessante antithrombotische Wirkungen besitzen. Neben Substituenten, die durch Hydroxygruppen gestellt werden, enthalten diese Verbindungen N-Sulfatgruppen, N-Acetylgruppen und in gewissen Fällen sind die anomeren Hydroxygruppen durch Methoxygruppen ersetzt.
Die Anmeldung EP 0 165134 beschreibt ebenfalls synthetische Oligosaccharide mit antithrombotischer Wirkung. Diese Verbindungen, die aus Monosaccharideinheiten von Uronsäure und Glucosamin gebildet sind und die in der 3-Stellung der Glucosamineinheit eine O-Sulfatgruppe aufweisen, sind ebenfalls in der Anmeldung EP 0 301 618 beschrieben. Diese Verbindungen besitzen starke antithrombotische und antikoagulierende Wirkungen. Das Patent EP 0 454 220 beschreibt Derivate der Uronsäure und der Glucose, die als Substituenten O-Alkyl- oder O-Sulfatgruppen aufweisen. Diese letzteren Verbindungen besitzen ebenfalls antithrombotische und antikoagulierende Wirkungen. Sulfatierte Glykosaminoglykanoid-Derivate, bei denen die funktionellen N-Sulfatgruppen, N-Acetatgruppen oder Hydroxygruppen durch Alkoxy-, Aryloxy-, Aralkyloxy- oder O-Sulfatgruppen ersetzt sind, sind ebenfalls in dem Patent EP 0 529 175 beschrieben. Diese Verbindungen besitzen interessante antithrombotische Wirkungen. Diese letzteren sind ebenfalls Inhibitoren der Vermehrung von Zellen der glatten Muskeln.
Oligosaccharide und insbesondere Pentasaccharide, die analog sind zu der minimalen Sequenz des Heparins, die für die Bindung an AT-III erforderlich sind, sind in Angew. Chem., Int. Ausg. Engl., 32, 3 (1993), 434–436 beschrieben. Diese Verbindungen enthalten Glucuronsäure- oder Glucose-Einheiten, deren Hydroxyfunktionen durch O-Sulfat- oder O-Methylgruppen ersetzt sind. Seitdem wurde eine Vielzahl von Untersuchungen an den Pentasacchariden durchgeführt und es wurde in der Literatur angegeben, daß die Konformation der L-Iduronsäure G eine wichtige Rolle spielt für die Aktivität dieser Produkte. Für die Einheit G wurden mehrere konformationsmäßige Zustände beschrieben (⁴C₁, ¹C₄, ²S₀) und es wurde angenommen, daß diese konformationsmäßige Flexibilität wesentlich ist für die biologische Aktivität der Produkte, die L-Iduronsäure enthalten (B. Casu, M. Petitou, A. Provasoli und P. Sinay, Conformational flexibility: a new concept for explaining binding and biological properties of iduronic acid-containing glycosaminoglycans. Trends Biochem. Sci., 13 (1988), 221–225). Das Dokument Chem. Eur. J., 2,8 (1996), 1007–1013 offenbart Pentasaccharide, bei denen die L-Iduroneinheit G in einer gehinderten Konformation ¹C₄ vorliegt, die auch als «verriegelt» bezeichnet wird durch eine Alkylengruppe zwischen der Hydroxylgruppe in der 3-Stellung und den Kohlenstoff in der 5-Stellung, was zu einer 3-O-5-C-Alky len-2-O(R)-α-L-idopyranururonat-Einheit führt. Nach diesem Dokument besitzen die Verbindungen, bei denen die L-Iduroneinheit G in einer gehinderten Konformation ¹C₄ vorliegt, eine sehr starke Antifaktor-Xa-Aktivität und demzufolge keine Affinität für AT III. Dies zeigt, daß die konformationsmäßige Flexibilität der Einheit G essentiell ist für die biologische Aktivität.
Es wurde nunmehr überraschenderweise gefunden, daß, wenn man eine der O-Alkylgruppen durch eine Alkylenbrücke ersetzt und damit die Konformation der L-Iduronsäure verriegelt, man Oligosaccharide erhält mit interessanten biologischen Wirkungen, die jedoch frei sind von konformationsmäßiger Flexibilität. In der Tat unterscheiden sich die Verbindungen der vorliegenden Erfindung von anderen in der Literatur beschriebenen synthetischen Heparinoiden durch ihre einzigartigen Strukturen und ihre starken und unerwarteten biologischen Wirkungen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind Pentasaccharide, deren L-Iduroneinheit G in der Konformation ²S₀ vorliegt, die als "verriegelt" bezeichnet wird, womit deren D-Glucuronsäure-Einheit E gegebenenfalls in der 5-Stellung eine Ethylgruppe aufweist. Diese Verbindungen besitzen eine sehr starke Anti-Faktor Xa-Wirkung und eine starke Affinität für AT III.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Pentasaccharid in Form der Säure und seine pharmazeutisch annehmbaren Salze mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Kationen, deren anionische Form der folgenden Formel (I) entspricht:
in der:
– R Wasserstoff, eine Gruppe -SO₃ ^–, (C₁-C₃)-Alkyl oder (C₂-C₃)-Acyl;
– T Wasserstoff oder eine Ethylgruppe; und
– n 1 oder 2 bedeuten.
Die Erfindung betrifft die Pentasaccharide in Form der Säure oder in Form der pharmazeutisch annehmbaren Salze. In der Säureform liegen die Funktionen -COO- und -SO₃ ^– in der Form -COOH bzw. -SO₃H vor.
Man versteht unter pharmazeutisch annehmbaren Salzen der erfindungsgemäßen Pentasaccharide die Pentasaccharide, bei denen eine oder mehrere der Funktionen -COO^– und/oder -SO₃ ^– in ionischer Weise an ein pharmazeu tisch annehmbares Metallkation gebunden sind.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen Salze sind jene, bei denen das Kation aus den Alkalimetallkationen ausgewählt ist, und sind vorzugsweise jene, bei denen das Kation Na⁺ oder K⁺ ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Pentasaccharide, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Vorläufer der Einheit G herstellt und man diesen mit einem Vorläufer der Einheit H kuppelt zur Bildung eines Vorläufers von GH, wobei man das Pentasaccharid letztendlich dadurch erhält, daß man entweder einen Vorläufer von GH mit einem Vorläufer von DEF kuppelt oder einen Vorläufer von GH mit einem Vorläufer von EF kuppelt und dann D anfügt.
Man kann irgendeinen Vorläufer von G, von H, von EF oder von DEF verwenden. Dies bedeutet, daß man in Abhängigkeit von den Verfahren jede Familie von Pentasacchariden herstellen kann, denen eine Einheit G in verriegelter Konfiguration gemeinsam ist.
Das oben beschriebene Verfahren ist das erfindungsgemäß bevorzugte. Man kann jedoch die erfindungsgemäßen Pentasaccharide auch mit Hilfe anderer bekannter Methoden der Zuckerchemie herstellen, insbesondere durch Umsetzen eines Monosaccharids, welches Schutzgruppen an den Hydroxygruppen und gegebenenfalls an den vorhandenen Carboxygruppen aufweist, wie es von T. W. Green in: Protective Groups in Organic Synthesis (Wiley, N. Y., 1981) mit einem anderen geschützten Monosaccharid zur Bildung eines Disaccharids, welches man anschließend mit einem weiteren geschützten Monosaccharid umsetzt zur Bildung eines geschützten Trisaccharids, ausgehend von welchem man ein geschütztes Tetrasaccharid und dann ein geschütztes Pentasaccharid herstellen kann.
Die geschützten Pentasaccharide werden anschließend von ihren Schutzgruppen befreit und gegebenenfalls sulfatiert oder zunächst teilweise von ihren Schutzgruppen befreit, dann sulfatiert und anschließend von den Schutzgruppen befreit zur Bildung der erfindungsgemäßen Verbindungen.
Solche Verfahren sind in der Zuckerchemie bekannt und sind beschrieben worden insbesondere von G. Jaurand et al., in: Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2, 9 (1992), 897–900, von J. Basten et al., in: Bioorganic Medicinal Chemistry Letters, 2, 9 (1992), 905–910 und von M. Petitou und C. A. A. van Boeckel, in: "Chemical synthesis of heparin fragment and analogues", 203-210 – Progress in the chemistry of organic natural products, Hrgb. Springer Verlag Wien – N. Y. (1992).
Das oben beschriebene Verfahren ermöglicht die Herstellung der erfin dungsgemäßen Verbindungen in Form der Salze. Zur Herstellung der entsprechenden Säuren bringt man die erfindungsgemäßen Verbindungen in Form der Salze mit einem Kationenaustauscherharz in der Säureform in Kontakt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen in Form der Säuren können anschließend mit einer Base neutralisiert werden zur Bildung eines gewünschten Salzes.
Zu diesem Zweck kann man irgendeine anorganische oder organische Base verwenden, die zu pharmazeutisch annehmbaren Salzen führt.
Man verwendet vorzugsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid oder Magnesiumhydroxid. Die Natrium- und Calciumsalze der erfindungsgemäßen Pentasaccharide sind die bevorzugten Salze.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen interessante pharmakologische und biochemische Wirkungen. Sie besitzen insbesondere eine starke Anti-Faktor Xa-Wirkung und eine starke Affinität für AT III.
Wie es bereits oben erwähnt worden ist, aktiviert der Faktor Xa in der Koagulationskaskade Prothrombin zu Thrombin, welches das lösliche Fibrinogen proteolysiert unter Freisetzung des unlöslichen Fibrins, dem wesentlichen Bestandteil des Blutgerinnsels oder Blutklumpens.
Die Inhibierung des Faktors Xa stellt somit ein bevorzugtes Mittel dar zur Erzielung einer antikoagulierenden und antithrombotischen Wirkung. Die Anti-Faktor Xa-Aktivität der erfindungsgemäßen Produkte wurde bei einem pH-Wert von 7 nach der von A. N. Teien und M. Lie, in: Thrombosis Research, 10 (1977), 399–410 beschriebenen Methode bewertet und es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Produkte eine Anti-Xa-Aktivität aufweisen, die gleich oder größer ist als die der bereits bekannten synthetischen Heparinoide.
Die Affinität der erfindungsgemäßen Pentasaccharide, deren Anion der Formel (I) entspricht, für AT III wurde durch Spektrofluorometrie bei den von D. Atha et al., in: Biochemistry, 26 (1987), 6454–6461 beschriebenen Bedingungen bestimmt. Die Versuchsergebnisse haben gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen eine sehr starke Affinität für AT III aufweisen.
Weiterhin wurde die globale antithrombotische Wirkung dieser Verbindungen an der Ratte mit Hilfe eines Modells der Venenstasis und Induktion durch Thromboplastin nach der von J. Reyers et al, in: Thrombosis Research, 18 (1980), 669–674 beschriebenen Methode bewertet.
Die DE₅₀ der erfindungsgemäßen Verbindungen ist mindestens in der gleichen Größenordnung oder niedriger als die anderer bereits bekannter synthetischer Heparinoide. Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen somit eine Wirkungsspezifität und eine interessante antikoagulierende antithrombotische Wirkung.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind nützlich für die Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen, die auf parenteralem Wege verabreicht werden können.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind sehr wenig toxisch; ihre Toxizität ist vollständig verträglich mit ihrer Verwendung als Arzneimittel.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind sehr stabil und somit besonders geeignet als Wirkstoff für Arzneimittel.
Die Erfindung erstreckt sich daher auch auf pharmazeutische Zubereitungen, die als Wirkstoff eine erfindungsgemäße Verbindung oder eines ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze gegebenenfalls in Kombination mit einem oder mehreren inerten und geeigneten Trägermaterialien enthalten.
In jeder Dosiseinheit ist der Wirkstoff in Mengen vorhanden, die an die angestrebten täglichen Dosierungen angepaßt sind. Jede Dosiseinheit enthält 0,1 bis 100 mg des Wirkstoffs, vorzugsweise 0,5 bis 50 mg.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in Kombination mit einem oder mehreren anderen Wirkstoffen, die nützlich sind für die angestrebte Therapie, verwendet werden, beispielsweise mit antithrombotischen Mitteln, Antikoagulantien, Plättchenaggregationsmitteln, wie beispielsweise Dipyridamol, Aspirin, Ticlopidin, Clopidogrel oder Antagonisten des Glykoprotein-Komplexes IIb/IIIa.
Die pharmazeutischen Zubereitungen werden für die Verabreichung an Säuger, einschließlich Menschen, zur Behandlung der oben genannten Erkrankungen formuliert.
Die in dieser Weise erhaltenen pharmazeutischen Zubereitungen werden mit Vorteil in unterschiedlichen Formen präsentiert, wie beispielsweise injizierbaren oder trinkbaren Lösungen, Dragees, Tabletten oder Gelkapseln. Die injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten pharmazeutischen Formulierungen. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen sind besonders nützlich für die vorbeugende oder heilende Behandlung von Störungen der Gefäßwandungen, wie der Atherosklerose, von Hyperkoagulabilitäts-Zuständen, die man beispielsweise als Folge von chirurgischen Operationen der Entwicklung von Tumoren oder bei Störungen der Koagulation, die durch bakterielle, virale oder enzymatische Aktivatoren ausgelöst werden, beobachtet.
Ganz allgemein sind die erfindungsgemäßen Pentasaccharide nützlich bei der Behandlung von pathologischen Zuständen, die abhängig sind von einer Dysfunktion der Koagulation oder Blutgerinnung.
Die Dosierung kann in starkem Maße in Abhängigkeit von dem Alter, dem Gewicht und dem Gesundheitszustand des Patienten, der Art und der Schwere der Erkrankung sowie dem Verabreichungsweg variieren. Diese Dosierung umfaßt die Verabreichung einer oder mehrerer Dosierungen von etwa 0,5 mg bis 1000 mg täglich, vorzugsweise etwa 1 bis 100 mg täglich und noch besser etwa 0,5 bis 50 mg täglich, beispielsweise etwa 20 mg pro Tag bei intramuskulärer Verabreichung oder auf subkutanem Wege, bei diskontinuierlichen Verabreichungen oder in regelmäßigen Intervallen oder eine tägliche Dosis im Bereich von 200 mg bis 1000 mg täglich bei oraler Verabreichung.
Diese Dosierungen können natürlich für jeden Patienten in Abhängigkeit von den beobachteten Ergebnissen und den zuvor durchgeführten Blutanalysen angepaßt werden.
Die subkutane Verabreichung ist der bevorzugte Verabreichungsweg.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch pharmazeutische Zubereitungen, die als Wirkstoff eine der oben beschriebenen Verbindungen gegebenenfalls in Kombination mit einem weiteren Wirkstoff enthalten. Diese Zubereitungen werden in der Weise formuliert, daß sie über den Verdauungstrakt oder parenteral verabreicht werden können.
Bei den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen für die orale, sublinguale, subkutane, intramuskuläre, intravenöse, transdermale, transmuköse, lokale oder rektale Verabreichung kann der Wirkstoff in Einheits-Verabreichungsformen in Mischung mit klassischen pharmazeutischen Trägermaterialien an Tiere und Menschen verabreicht werden. Die geeigneten Einheits-Verabreichungsformen umfassen Formen für die orale Verabreichung, wie Tabletten, Gelkapseln, Pulver, Granulate und oral zu verabreichende Lösungen oder Suspensionen, auf sublingualem oder bukkalem Wege zu verabreichende Formen, subkutan, intramuskulär, intravenös, intranasal oder intraokular zu verabreichende Präparate und rektal zu verabreichende Formulierungen.
Wenn man eine feste Zubereitung in Form von Tabletten herstellt, vermischt man den Hauptwirkstoff mit einem pharmazeutischen Trägermaterial, wie Gelatine, Stärke, Lactose, Magnesiumstearat, Talkum, Gummi arabicum oder analogen Verbindungen dieser Art. Man kann die Tabletten mit Saccharose oder anderen geeigneten Materialien umhüllen oder man kann sie in der Weise behandeln, daß sie eine verlängerte oder verzögerte Wirkung aufweisen und eine vorbestimmte Menge des Wirkstoffs in kontinuierlicher Weise freisetzen.
Man erhält ein Präparat in Gelkapseln durch Vermischen des Wirkstoffs mit einem Verdünnungsmittel und Einbringen der erhaltenen Mischung in weiche oder harte Gelkapseln.
Die in Wasser dispergierbaren Pulver oder Granulate können den Wirk stoff in Mischung mit Dispergiermitteln oder Netzmitteln oder Suspendiermitteln, wie Polyvinylpyrrolidon, mit Süßungsmitteln oder Geschmacksverbesserungsmitteln enthalten.
Für die rektale Verabreichung greift man auf Suppositorien zurück, die man mit bei der Rektaltemperatur schmelzenden Bindemitteln, wie beispielsweise Kakaobutter oder Polyethylenglykolen, herstellt.
Für die parenterale, intranasale oder intraokulare Verabreichung verwendet man wäßrige Suspensionen, isotonische Salzlösungen oder sterile und injizierbare Lösungen, welche pharmakologisch verträgliche Dispergiermittel und/ oder Netzmittel, beispielsweise Propylenglykol oder Butylenglykol, enthalten.
Für die Verabreichung über die Schleimhaut kann der Wirkstoff in Gegenwart eines Promotors, wie ein Gallensäuresalz, ein hydrophiles Polymer, wie beispielsweise Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Ethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylpyrrolidon, Pektinen, Stärken, Gelatine, Casein, Acrylsäuren, Acrylestern und deren Copolymere, Polymere oder Copolymere- von Vinyl, Vinylalkoholen, Alkoxypolymere, Polyethylenoxidpolymere, Polyether oder Mischungen davon formuliert werden.
Der Wirkstoff kann auch in Form von Mikrokapseln gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren Trägermaterialien oder Hilfsstoffen formuliert werden.
Der Wirkstoff kann auch in Form eines Komplexes mit einem Cyclodextrin, beispielsweise α-, β- oder γ-Cyclodextrin, 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin oder Methyl-β-cyclodextrin formuliert werden.
Der Wirkstoff kann auch von einem ihn enthaltenden Ballon oder einem endovaskulären Implantat, welches in die Blutgefäße eingeführt wird, freigesetzt werden. Die pharmakologische Wirksamkeit des Wirkstoffs wird in dieser Weise nicht beeinträchtigt.
Die subkutane Verabreichung ist der bevorzugte Verabreichungsweg.
Die folgenden Methoden, Herstellungsverfahren und Schemata verdeutlichen die Synthese der verschiedenen Zwischenprodukte für die Herstellung der erfindungsgemäßen Pentasaccharide.
Hierbei werden die folgenden Abkürzungen verwendet: TBDMS: tert.-Butyldimethylsilyl; Lev: Lävulinyl; Bn: Benzyl; Bz: Benzoyl; CCM: Dünnschichtchromatographie; Olm: Trichloracetimidyl; LSIMS: englische Abkürzung für Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry; ESIMS: englische Abkürzung für Electron Spray Ionisation Mass Spectrometry; TMS: Trimethylsilyl; TSP: Natrium-trimethylsilyltetradeuteriopropionat; Tf: Triflat (Trifluormethylsulfonat); MS: Molekularsieb; All: Allyl; PMB: p-Methoxybenzyl; SE: Trimethylsilylethyl. Dowex®, Sephadex^®, Chelex^® und Toyopearl^® sind eingetragene Marken.
Bei den nachfolgend beschriebenen Methoden, Herstellungen und Beispielen können die allgemeinen Verfahrensweisen, die die katalytische Kupplung der Imidate, die Spaltung der Lävulinsäureester, die katalytische Kupplung der Thioglykoside, die Verseifung, die Methylierung, die selektive Abspaltung der p-Methoxybenzyl-Schutzgruppe, die Schutzgruppenabspaltung und die Sulfatierung der Oligo- und Polysaccharide durch Hydrogenolyse der Ester oder der Benzylester, die Verseifung der Ester oder schließlich die Sulfatierungen unter Anwendung der nachfolgenden allgemeinen Methoden an geeignete Zwischenprodukte durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden mit Hilfe der nachfolgend beschriebenen Herstellungen synthetisiert.
HERSTELLUNG 1
6-O-tert.-Butyidimethylsilyl-l,2-O-isopropyliden-3-O-methyl-α-D-glucofuranose (2)
Man nimmt das Diol 1 (10 g, 42,7 mMol) in wasserfreiem Dichlormethan (100 ml) auf und gibt tert.-Butyldimethylsilylchlorid (7,1 g, 47,3 mMol) und Imidazol (5,8 g, 85,3 mMol) zu. Man rührt die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur. Nach 2 Stunden verdünnt man die Mischung mit Dichlormethan und wäscht mit Wasser. Man trocknet die organische Phase über Magnesiumsulfat, engt ein und reinigt den Rückstand säulenchromatographisch über Kieselgel (Ethylacetat/Cyclohexan 1/9 V/V) unter Erhalt des gewünschten Produkts 2 (11,9 g, 80%) in Form eines Sirups.
[α]_D –34°C (c 1,9, CHCl₃).
HERSTELLUNG 2
6-O-tert.-Butyldimethyisilyl-1,2-O-isopropyliden-3-O-methyl-5-C-vinyl-α-D-glucofuranose (4)
Man gibt bei –78°C Oxalylchlorid (3,2 ml, 36,8 mMol) und Dimethylsulfoxid (5,2 ml, 73,4 mMol) zu wasserfreiem Dichlormethan (40 ml) und rührt während 30 Minuten. Anschließend gibt man die Verbindung 2 (6,4 g, 18,4 mMol) zu und rührt die Mischung während einer weiteren Stunde. Dann gibt man Triethylamin (15,3 ml, 110,0 mMol) zu und verdünnt die Reaktionsmischung nach 30 Minuten mit Dichlormethan. Durch klassische Behandlung erhält man die 5-Ulose-Verbindung (3), die direkt für die folgende Reaktion verwendet wird. Man nimmt das rohe Keton 3 in wasserfreiem Tetrahydrofuran (100 ml) auf und gibt eine 1 M Lösung von Vinylmagnesiumbromid in Tetrahydrofuran (28 ml, 27,6 mMol) bei 0°C zu. Nach 1 Stunde verdünnt man die Reaktionsmischung mit Ammoniumchlorid und wäscht mit Wasser.
Man trocknet die organische Phase über Magnesiumsulfat, engt ein und reinigt den Rückstand säulenchromatographisch über Kieselgel (Ethylacetat/Cyclohexan 1/9 V/V unter Erhalt der gewünschten Verbindung 4 (70%, 4,8 g) in Form eines Sirups.
[α]_D –40°C (c 1,3, CHCl₃).
Analyse berechnet: C, 57,72, H, 9,15. Gefunden: C, 57,77, H, 9,23.
HERSTELLUNG 3
1,2,3,4-Tetra-O-acetyl-3-O-methyl-5-C-vinyl-β-D-glucopyranose (6)
Man nimmt die Verbindung 4 (3,5 g, 9,4 mMol) in Wasser (50 ml) auf und gibt das Harz IR-120 (1 g) zu und Erhitzt während 6 Stunden auf 80°C. Man filtriert das Harz ab und engt das Filtrat ein. Man acetyliert das rohe Produkt 5 unter Verwendung von Essigsäureanhydrid (12 ml) und Pyridin (13 ml). Man zerstört das überschüssige Essigsäureanhydrid mit Methanol und engt die Lösungsmittel ein. Man extrahiert den Rückstand mit Wasser und Dichlormethan. Man trocknet die organische Phase über Magnesiumsulfat, engt ein und erhält nach der säulenchromatographischen Reinigung über Kieselgel (Ethylacetat/Cyclohexan 3/2 V/V) die Tetraacetat-Verbindung 6 in Form eines Feststoffs (75%, 2,7 g). Schmelzpunkt 50°C.
[α]_D –84°C (c 1,6, CHCl₃).
Analyse berechnet: C, 52,47, H 6,19. Gefunden: C, 52,51, H, 6,19. Cl-MS: 406 (M + NH₄), 389 (M + 1).
HERSTELLUNG 4
Methyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-O-(2,4,6-tri-O-acetyl-3-O-methyl-5-C-vinyl-β-D-glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosid (8)
Man löst die Verbindung 6 (1,6 g, 4,1 mMol) und die Verbindung 7 (2,1 g, 4,5 mMol) (P. J. Garegg und H. Hultberg, Carbohydr. Res., 93 (1981), C10) in wasserfreiem Dichlormethan (50 ml) und gibt ein Molekularsieb (4,0 g) zu. Man rührt die Reaktionsmischung während einer Stunde bei Raumtemperatur und gibt dann TMSOTf (0,95 ml, 5,2 mMol) bei –78°C zu. Man läßt die Reaktionsmischung sich dann langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Nach 2 Stunden neutralisiert man die Reaktionsmischung mit Triethylamin, filtriert über Celit und wäscht das Filtrat mit Wasser. Man trocknet die organische Phase über Magnesiumsulfat, engt ein und reinigt den Rückstand Chromtographie über Kieselgel (Ethylacetat/Cyclohexan 4/1 V/V) unter Erhalt der gewünschten Verbindung 8 (2,77 g, 85%) in Form eines Feststoffs. Schmelzpunkt 47°C.
[α]_D –6°C (c 0,6, CHCl₃).
Analyse berechnet: C, 65,14, H, 6,61. Gefunden: C, 65,09, H, 6, 70.
HERSTELLUNG 5
Methyl-2,3,6-O-tri-O-benzyl-4-O-(4,6-O-isopropyliden-3-O-methyl-5-C-vinyl-β-D-glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosid (10)
Man löst die Verbindung 8 (2,7 g, 3,4 mMol) in Methanol (40 ml). Man gibt bei 0°C Natrium (katalytische Menge) zu und rührt während 3 Stunden bei Raumtemperatur. Man verdampft das Lösungsmittel und nimmt den Rückstand 9 mit wasserfreiem Aceton (40 ml) auf und gibt 2,2-Dimethoxypropan (2 ml) und p-Toluolsulfonsäure (katalytische Menge) zu. Man rührt die Reaktionsmischung über Nacht bei Raumtemperatur, verdampft dann das Lösungsmittel, nimmt den Rückstand mit Chloroform auf und wäscht mit Wasser. Man trocknet die organische Phase über Magnesiumsulfat, engt ein und reinigt den Rückstand säulenchromatographisch über Siliciumdioxid (Ethylacetat/Cyclohexan 1/1 V/V) unter Erhalt des 4',6'-Isopropyliden-O-10-Derivats (1,7 g, 70%) in Form eines Feststoffs. Schmelzpunkt 55°C.
[α]_D +13°C (c 0,8, CHCl₃).
Analyse berechnet: C, 67,97, H, 7,13. Gefunden: C, 67,87, H, 7,16 Cl-MS: 707 (M + 1), 724 (M + NH₄).
HERSTELLUNG 6
Methyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-O-(4,6-O-isopropyliden-3-O-methyl-5-C-vinyl-β-D-mannopyranosyl)-α-D-glucopyranosid (12)
Man rührt Oxalylchlorid (0,35 ml, 4,0 mMol) und wasserfreie DMSO (0,57 ml, 8,0 mMol) in wasserfreiem Dichlormethan( (10 ml) während 30 Minuten bei –78°C. Dann gibt man die Verbindung 10 (1,4 g, 2,0 mMol) in wasserfreiem Dichlormethan (10 ml) zu und rührt während weiterer 45 Minuten. Man neutralisiert die Reaktionsmischung durch Zugabe von wasserfreiem Triethylamin (1, 7 ml, 12,0 mMol) und verdünnt dann mit Dichlormethan. Nach dem Waschen mit Wasser trocknet man die organische Phase über Magnesiumsulfat, engt ein und verwendet den Rückstand 11 direkt ohne weitere Reinigung für die nächste Reaktion. Man nimmt das Keton 11 mit wasserfreiem Tetrahydrofuran (15 ml) auf und gibt eine 1 N Lösung von Superhydrid in Tetrahydrofuran (4 ml, 4,0 mMol) bei –78°C zu. Man rührt die Reaktionsmischung während 1 Stunde bei Raumtemperatur und gibt anschließend 5%-iges Natriumhydroxid (2 ml) und Wasserstoffperoxid (1 ml) zu. Man verdampft das Lösungsmittel und nimmt den Rückstand mit Ethylacetat auf und wäscht ihn mit Wasser. Man trocknet die organische Phase über Magnesiumsulfat, engt ein und reinigt den Rückstand Chromtographie (Ethylacetat/Cyclohexan 2/1 V/V) unter Erhalt der Verbindung 12 (1,0 g, 70%) .
[α]_D –11°C (c 0,5, CHCl₃).
Cl-MS: 724 (M + 18), 707 (M + 1).
HERSTELLUNG 7
Methyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-O-(2-O-acetyl-3-O-methyl-5-C-vinyl-β-D-mannopyranosyl)-α-D-glucopyranosid (14)
Man löst die Verbindung 12 (940 mg, 1,3 mMol) in Pyridin (3 ml) und gibt Essigsäureanhydrid (0,3 ml) zu. Man rührt die Reaktionsmischung während 3 Stunden bei Raumtemperatur. Dann entfernt man das überschüssige Pyridin und Essigsäureanhydrid und verwendet den Rückstand 13 direkt für die Abspaltung der Isopropyliden-Schutzgruppe unter Verwendung von 80%-iger Essigsäure (5 ml) während 2 Stunden bei 60°C. Man verdampft die überschüssige Essigsäure und reinigt den Rückstand säulenchromatographisch über Kieselgel (Ethylacetat/Cyclohexan 4/1 V/V) unter Erhalt des Diols 14 (660 mg, 70%) in Form eines Feststoffs. Schmelzpunkt 53°C.
[α]_D –10°C (c 0,8, CHCl₃).
Cl-MS: 709 (M + 1), 726 (M + 18).
HERSTELLUNG 8
Methyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-O-(2-O-acetyl-3-O-methyl-6-O-tosyl-5-C-vinyl-β-D-mannopyranosyl)-α-D-glucopyranose (15)
Man löst die Verbindung 14 (600 mg, 0,9 mMol) in Pyridin (3 ml) und gibt Tosylchlorid (240 mg, 1,3 mMol) zu. Man rührt die Reaktionsmischung während 3 Stunden bei Raumtemperatur, verdampft das Lösungsmittel und verdünnt den Rückstand mit Chloroform und wäscht ihn mit Wasser. Man trocknet die organische Phase über Magnesiumsulfat, engt ein und reinigt den Rückstand säulenchromatographisch über Kieselgel (Ethylacetat/Cyclohexan 1/1 V/V) unter Erhalt der Tosylverbindung 15 (297 mg, 80%) in Form eines Sirups.
[α]_D –26°C (c 0,8, CHCl₃).
HERSTELLUNG 9
Methyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-O-(2,6-anhydro-3-O-methyl-5-C-vinyl-β-D-mannopyranosyl)-α-D-glucopyranosid (16)
Man nimmt die Verbindung 15 (550 mg, 0,6 mMol) in Ethanol (3 ml) auf und gibt anschließend eine 0,1 N Lösung von ethanolischem Natriumhydroxid (5 ml) zu. Man erhitzt die Reaktionsmischung während 3 Stunden auf 70°C und neutralisiert dann mit einem IR-120-Harz (H⁺-Form) und filtriert über Celit. Man reinigt den Rückstand nach dem Einengen säulenchromatographisch über Kieselgel (Ethylacetat/Cyclohexan 1/1 V/V) unter Erhalt der Verbindung 16 (292 mg, 70%) in Form eines Sirups.
[α]_D +13°C (c 0,5, CHCl₃).
Cl-MS: 666 (M + 18)
HERSTELLUNG 10
Methyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-O-(benzyl-3-O-methyl-2-O-5-C-methyliden-α-L-idopyranuronat)-α-D-glucopyranosid (17)
Man löst die Verbindung 16 (260 mg, 0,4 mMol) in Dichlormethan (20 ml), rührt die Lösung bei –78°C und leitet während 30 Sekunden Ozon ein, wobei sich die Lösung hellgelb verfärbt. Man gibt Dimethylsulfid zu der Lösung und wäscht die Reaktionsmischung mit Wasser. Man trocknet die organische Phase über Magnesiumsulfat, engt ein und verwendet das Produkt direkt ohne weitere zusätzliche Reinigung in der nächsten Reaktion. Man nimmt den rohen Aldehyd mit tert.-Butanol (16 ml) auf und gibt 2-Methyl-2-buten (5 ml) und Wasser (16 ml) zu. Man gibt anschließend nacheinander NaH₂PO₄ (700 mg) und NaClO₂ (700 mg) zu der Mischung. Man rührt die Suspension heftig über Nacht bei Raumtemperatur, verdünnt mit Wasser und extrahiert mit Ethylacetat. Man trocknet die organische Phase über Magnesiumsulfat, engt ein und setzt das Produkt direkt in der nächsten Reaktion ein. Man nimmt die rohe Säure mit Dimethylformamid (25 ml) auf und gibt Tetrabutylammoniumiodid (0,7 g, 2,0 mMol), Kaliumbicarbonat (0,25 g, 2,5 mMol) und Benzylbromid (0,250 ml, 2,1 mMol) zu. Man rührt die Reaktionsmischung während 5 Stunden bei Raumtemperatur, extrahiert die Reaktionsmischung mit Wasser und Diethylether, trocknet die Etherphase über Magnesiumsulfat, engt ein und reinigt den Rückstand säulenchromatographisch über Kieselgel (Ethylacetat/Cyclohexan 2/1 V/V) unter Erhalt des Derivats 17 (236 mg, 80%) in Form eines Sirups. Cl-MS: 774 (M + 18).
HERSTELLUNG 11
Methyl-O-(6-O-acetyl-2,3,4-tri-O-methyl-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(benzyl-2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronat)-(1 → 4)-O-(3,6-di-O-acetyl-2-O-benzyl-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,6-anhydro-5-C-benzyloxycarbonyl-3-O-methyl-β-D-mannopyranosyl)-(1→4)-2,3,6-tri-O-benzyl-α-D-glucopyranosid (19)
Man rührt das Imidat 18 (Van der Heijden et al., Abstr. 9^th Eur. Carbohydr. Symp., Utrecht, 6.–11 Juli (1997); A74, S. 154) (81 mg, 78,2 μMol), den Akzeptor 17 (65 mg, 86,0 μMol) und ein feines Molekularsieb (70 mg, 4Å) unter inerter Atmosphäre in einer Dichlormethan/Diethylether-Mischung (1/2, V/V) (2,4 ml).
Man rührt die Reaktionsmischung während 30 Minuten und gibt dann NaHCO₃ bis zur Neutralität zu. Nach dem Filtrieren und dem Einengen reinigt man den Rückstand säulenchromatographisch über einer Säule von Sephadex^® LH-20-Gel (Dichlormethan/Ethanol 1/1 V/V) und dann über einer mit Kieselgel beschickten Säule (Ethylacetat/Cyclohexan 1/1 (V/V)) unter Erhalt der Verbindung 19 (86 mg, 67%).
[α]_D +66°C (c 1,0, CH₂CH₂).
Das ¹H-NMR-Spektrum ist in der nachfolgenden TABELLE 1 wiedergegeben.
HERSTELLUNG 12
Methyl-O-(2,3,4-tri-O-methyl-α-D-glucopyranosyl)-(1 → 4)-O-(2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronsäure)-(1→4)-O-(α-D-glucopyranosyl)-(1 → 4)-O-(2,6-anhydro-5-C-carboxy-3-O-methyl-β-D-mannopyranosyl)-(1 → 4)-α-D-glucopyranosid (20)
Man arbeitet nach M. PETITOU und C. A. A. van BOECKEL, Progress in the Chemistry of Organic Natural Products, Hrgb. W. Herz et al., Wein, Springer-Verlag, New York (1992), 143–210.
Man rührt eine Lösung der Verbindung 19 (49 mg, 30,0 μMol) in Essigsäure (3 ml) in Gegenwart von 5% Palladium-auf-Kohlenstoff (73 mg, 35 b) während 12 Stunden bei 40°C unter Wasserstoff (3,5 MPa). Man filtriert über Celit, engt ein und führt eine Wasserdampfdestillation (4 × 5 ml) durch. Man löst den Rückstand in einer wäßrigen 1 M NaOH-Lösung (3 ml) und erhitzt während 3 Stunden auf 55°C. Man kühlt ab und führt die Lösung über eine mit Sephadex^® 625 F (170 ml) beschickten Säule und eluiert mit Wasser. Man führt die Fraktionen, die die Verbindung 20 enthalten, über eine Säule mit dem Harz Dowex H⁺. Man engt ein und isoliert die Verbindung 20 (25 mg, 86%).
[α]_D +105°C (c 1,0, H₂O).
Das ¹H-NMR-Spektrum ist in der nachfolgenden TABELLE 1 angegeben.
TABELLE 1
HERSTELLUNG 13
Methyl-O-(4,6-O-isopropyliden-2,3-di-O-methyl-5-C-vinyl-b-D-glucopyranosyl)-(1→4)-2,3,6-tri-O-benzyl-α-D-glucopyranosid (22)
Man gibt Natriumhydrid (0,31 g, 13,0 mMol) bei 0°C zu einer Lösung von Methyl-O-(4,6-O-isopropyliden-3-O-methyl-5-C-vinyl-β-D-glucopyranosyl)-(1 → 4)-2,3,6-tri-O-benzyl-α-D-glucopyranosid (10) (6,11 g, 8,65 mMol) und Methyliodid (0,80 ml, 13,0 mMol) in N,N-Dimethylformamid (9,00 ml). Man rührt während 2 Stunden (CCM), gibt Methanol zu und gießt die Reaktionsmischung in Wasser. Man extrahiert mit Ethylacetat, wäscht mit Wasser, trocknet und engt ein. Man reinigt über einer mit Siliciumdioxid beschickten Säule (Cyclohexan/ Diethylether 3/2 (V/V)) und erhält 22 (5,92 g, 88%). CCM R_f = 0,28 (Cyclohexan/Diethylether 3/2 (V/V)).
HERSTELLUNG 14
Methyl-O-(4,6-O-isopropyliden-2,3-di-O-methyl-5-C-ethyl-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-2,3,6-tri-O-benzyl-α-D-glucopyranosid (23)
Man gibt Platinoxid (160 mg) zu einer Lösung von 22 (5,80 g, 8,04 mMol) in Ethylacetat (400 ml). Man leitet Wasserstoff ein und rührt während 30 Minuten (CCM), filtriert, dampft ein und erhält 23. CCM R_f = 0,60 (Toluol/Ethylacetat 4/1 (V/V)).
HERSTELLUNG 15
Methyl-O-(2,3-di-O-methyl-5-C-ethyl-β-D-glucopyranosyl)-(1 → 4)-2,3,6-tri-O-benzyl-α-D-glucopyranosid (24)
Man löst die rohe Verbindung 23 in 70%-iger Essigsäure (60 ml) und rührt während 2 Stunden bei 80°C. Man engt die Mischung im Vakuum ein und verdampft dann mit Wasser unter Erhalt von 24. CCM Rf = 0,52 (Dichlormethan/ Methanol 4/1 (V/V)).
HERSTELLUNG 16
Methyl-O-(benzyl-2,3-di-O-methyl-5-C-ethyl-β-D-glucopyranosyluronat)-(1 → 4)-2,3,6-tri-O-benzyl-α-D-glucopyranosid (25)
Man gibt zu einer Lösung der Verbindung 24 (5,75 g) in Tetrahydrofuran (28 ml) 2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinyloxy (17,5 mg), eine Lösung von Natriumhydrogencarbonat (17,5 ml), Kaliumbromid (87 mg) und Tetrabutylammoniumchlorid (115,5 mg). Man kühlt die Mischung auf 0°C ab und gibt im Verlaufe von 15 Minuten eine Mischung aus einer gesättigten Natriumchloridlösung (17 ml), einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung (8,70 ml) und Natriumhypochlorit (1,3 M, 20 ml) zu. Nach dem Rühren während 1 Stunde verdünnt man die Mischung mit Wasser und extrahiert (3-mal) mit Dichlormethan. Man wäscht die organische Phase mit einer wäßrigen Natriumchloridlösung, trocknet über Magnesiumsulfat, filtriert, dampft zur Trockne ein und erhält das rohe Säurederivat.
Unter einer Stickstoffatmosphäre löst man das Säurederivat in N,N-Dimethylformamid (107 ml). Man gibt Kaliumhydrogencarbonat (4,10 g) und Benzylbromid (9,70 ml) zu und rührt die Mischung während 16 Stunden. Man gibt Ethylacetat und Wasser zu und engt die organische Phase nach der Extraktion ein. Durch säulenchromatographische Reinigung über Kieselgel erhält man 3,81 g der Verbindung 25 (60% Ausbeute ausgehend von der Verbindung 23).
[α]_D + 24 (c = 0,15, Dichlormethan).
HERSTELLUNG 17
Methyl-O-(benzyl-5-C-ethyl-4-O-lävulinyl-2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronat)-(1→4)-2,3,6-tri-O-benzyl-α-D-glucopyranosid (26)
Man löst die Verbindung 25 (3,51 g, 4,46 mMol) in wasserfreiem Dioxan (45 ml). Man gibt Lävulinsäure (1,00 g, 8,93 mMol), 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (1,70 g, 8,93 mMol) und 4-Dimethylaminopyridin (0,11 g, 8,93 mMol) zu. Man rührt während 16 Stunden, extrahiert mit Ethylacetat, wäscht nacheinander mit einer wäßrigen 5%-igen Kaliumhydrogensulfatlösung, mit Wasser, mit einer wäßrigen gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und mit Wasser, trocknet und engt ein.
Man reinigt über einer mit Siliciumdioxid beschickten Säule (Cyclohexan/Ethylacetat 2/1, dann 3/2 (V/V)) und erhält reines 26 (3,64 g, 85%).
[α]_D + 26 (c = 0,9, Dichlormethan).
HERSTELLUNG 18
O-(Benzyl-5-C-ethyl-4-O-lävulinyl-2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronat)-(1→4)-1,3,6-tri-O-acetyl-2-O-benzyl-D-glucopyranose (27)
Man löst die Verbindung 26 (3,35 g, 3,78 mMol) in Essigsäureanhydrid (22 ml), kühlt auf –20°C ab und gibt 22 ml einer kalten Lösung von Schwefelsäure in Essigsäureanhydrid (1 ml Schwefelsäure in 10 ml Essigsäureanhydrid) zu.
Man verdünnt mit Ethylacetat, wäscht mit einer wäßrigen gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und mit Wasser, trocknet und engt ein. Man reinigt über einer mit Siliciumdioxid beschickten Säule (Cyclohexan/Ethylacetat 1/1 (V/V)) unter Erhalt von 27 (2,20 g, 65,5%). CCM Rf = 0,24 (Cyclohexan/ Ethylacetat 1/1 (V/V)) .
HERSTELLUNG 19
O-(Benzyl-5-C-ethyl-4-O-lävulinyl-2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronat)-(1→4)-3,6-di-O-acetyl-2-O-benzyl-D-glucopyranose (28)
Man gibt Benzylamin (11 ml, 101,4 mMol) einer Lösung der Verbindung 27 (2,18 g, 2,67 mMol) in Tetrahydrofuran (50 ml). Man rührt während 4 Stun den, extrahiert mit Ethylacetat, wäscht mit einer wäßrigen 1 M Chlorwasserstoffsäurelösung (102 ml), mit Wasser, trocknet und engt ein. Man reinigt über einer mit Siliciumdioxid beschickten Säule (Toluol/Ethylacetat 1/1 (V/V)) unter Erhalt einer Mischung (α/β = 50/50) der Verbindung 28 (1,33 g, 65%).
CCM Rf = 0,22 (Toluol/Ethylacetat 1/1 (V/V)).
HERSTELLUNG 20
O-(Benzyl-5-C-ethyl-4-O-lävulinyl-2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronat)-(1→4)-3,6-di-O-acetyl-2-O-benzyl-D-glucopyranosyl-trichloracetimidat (29).
Man löst die Verbindung 28 (1,32 g, 1,71 mMol) in Dichlormethan (34 ml) und gibt unter Argon Trichloracetonitril (0,87 ml, 8,50 mMol) und Cäsiumcarbonat (0,90 g, 2,73 mMol) zu. Man rührt während 2 Stunden (CCM) und filtriert. Man reinigt über einer mit Siliciumdioxid beschickten Säule (Cyclohexan/ Ethylacetat 3/2 (V/V)) unter Erhalt einer Mischung (α/β = 85/15) der Imidate 29 (1,20 g, 77%). CCM R_f= 0,36 (Cyclohexan/Ethylacetat 1/2 (V/V).
HERSTELLUNG 21
Methyl-O-(benzyl-5-C-ethyl-4-O-lävulinyl-2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronat)-(1→4)-O-(3,6-di-O-acetyl-2-O-benzyl-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,6-anhydro-5-C-benzyloxycarbonyl-3-O-methyl-β-D-mannopyranosyl)-(1→4)-2,3,6-tri-O-benzyl-α-D-glucopyranosid (30).
Man gibt eine Lösung von tert.-Butyldimethylsilyl-triflat in Dichlormethan (1 M, 0,19 ml) unter Argon bei –20°C zu einer Lösung des Imidats 29 (1,19 g, 1,29 mMol) und Methyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-(benzyl-3-O-methyl-2-O-5-C-methyliden-α-L-idopyranuronat)-α-D-glucopyranosid 17 (1,02 g, 1,35 mMol) in Toluol (40 ml) in Gegenwart eines Molekularsiebs 4Å (1,93 g). Nach 30 Minuten (CCM) gibt man erneut eine Lösung von tert.-Butyldimethylsilyl-triflat in Dichlormethan zu (1 M, 0,19 ml). Nach 30 Minuten (CCM) gibt man festes Natriumhydrogencarbonat zu, filtriert die Lösung, wäscht mit Wasser, trocknet und dampft zur Trockne ein. Man reinigt über einer Chromatographiesäule Sephadex^© LH20 und dann über einer mit Siliciumdioxid beschickten Säule (Toluol/Ethylacetat 2/1 (V/V)) unter Erhalt des reinen Tetrasaccharids 30-α (1,14 g, 58%). [α]_D + 47 (c = 0,21, Dichlormethan).
HERSTELLUNG 22
Methyl-O-(benzyl-5-C-ethyl-2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronat)-(1 → 4)-O-(3,6-di-O-acetyl-2-O-benzyl-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,6-anhydro-5-C-benzyloxycarbonyl-3-O-methyl-β-D-mannopyranosyl)-(1→4)-2,3,6-tri-O-benzyl-α-D-glucopyranosid (31).
Man löst die Verbindung 30 (1,13 g, 0,75 mMol) in einer Ethanol/To- luol-Mischung 2/1 (V/V) (150 ml) und gibt Hydrazinacetat (0,35 g, 3,73 mMol) zu. Man rührt während 1 Stunde (CCM) und engt ein. Man reinigt über einer mit Siliciumdioxid beschickten Säule (Toluol/Ethylacetat 3/1 (V/V)) und erhält 31 (0,816 g, 83%).
[α]_D + 35 (c = 1,01, Dichlormethan).
HERSTELLUNG 23
Methyl-O-(6-O-acetyl-2,3,4-tri-O-methyl-α-D-glucopyranosyl)-(1 → 4)-O-(benzyl-5-C-ethyl-2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronat)-(1 → 4)-O-(3,6-di-O-acetyl-2-O-benzyl-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,6-anhydro-5-C-benzyloxycarbonyl-3-O-methyl-β-D-mannopyranosyl)-(1→4)-2,3,6-tri-O-benzyl-α-D-glucopyranosid (33).
Man behandelt das Trichloracetimidat von 6-O-Acetyl-2,3,4-tri-O-methyl-D-glucopyranose 32 (3,47 mg, 0,0245 mMol) (P. Westerduin et al., BioOrg. Med. Chem., 2 (1994), 1267) und den Glykosylakzeptor 31 (80 mg, 0,056 mMol) nach der HERSTELLUNG 21. Man reinigt die Verbindung über einer Chromatographiesäule Sephadex^® LH-20 (Dichlormethan/Ethanol 1/1 (V/V)) und dann über einer mit Siliciumdioxid beschickten Säule (Diisopropylether/Ethylacetat 3/ 1 (V/V)) unter Erhalt des Derivats 33 (54,6 mg, 58%).
[α]_D + 55 (c = 1, Dichlormethan).
HERSTELLUNG 24
Methyl-O-(6-O-acetyl-2,3,4-tri-O-methyl-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(5-Cethyl-2,3-di-O-methyl-β-D-glucoyranosyluronsäure)-(1→4)-O-(3,6-di-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,6-anhydro-5-C-carboxy-3-O-methyl--D-mannopyranosyl)-(1→4)-α-D-glucopyranosid (34).
Man rührt eine Lösung der Verbindung 33 (40 mg, 0,024 mMol) in Essigsäure (2 ml) in Gegenwart von 10% Palladium-auf-Kohlenstoff (80 mg) während 16 Stunden unter einer Wasserstoffatmosphäre und filtriert. Man engt das Filtrat ein unter Erhalt der Verbindung 34.
HERSTELLUNG 25
Methyl-O-(2,3,4-tri-O-methyl-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(5-C-ethyl-2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronsäure)-(1→4)-O-(α-D-glucopyranosyl)-(1 → 4)-O-(2,6-anhydro-5-C-carboxy-3-O-methyl-β-D-mannopyranosyl)-(1→4)-α-D-glucopyranosid (35).
Man gibt eine wäßrige 5 M Natriumhydroxidlösung (216 μl) zu einer Lösung der rohen Verbindung 34 in Methanol (866 μl). Nach 25 Stunden gibt man Wasser zu und führt die Reaktionsmischung über eine Sephadex^© G-25-Gel-Säule (2 × 38 cm) und eluiert mit Wasser. Man engt ein, führt über einer mit Dowex^© 50 H⁺-Säule (2 ml) und gefriertrocknet. In diesem Stadium prüft man durch ¹H- NMR-Spektrum, ob sämtliche Schutzgruppen entfernt worden sind.
BEISPIEL 1
Methyl-O-(2,3,4-tri-O-methyl-6-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1 → 4)-O-(2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronsäure)-(1→4)-O-(2,3,4-tri-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,6-anhydro-5-C-carboxy-3-O-methyl-β-D-mannopyranosyl)-(1 →4)-2,3,6-tri-O-sulfo-α-D-glucopyranosid, Natriumsalz (21).
Man arbeitet nach C. A. A. van BOECKEL und M. PETITOU, Angew. Chem., Int. Ausg. Engl., 32 (1993), 1671–1690.
Man erhitzt eine Lösung der Verbindung 20 (20 mg, 20,7 μMol) und des Triethylamin/Schwefeltrioxid-Komplexes (164 mg, 0,90 μMol) in Dimethylformamid (2 ml) unter Lichtabschluß während 18 Stunden und 30 Minuten auf 55°C. Man kühlt die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur ab und verdünnt dann mit einer wäßrigen 0,2 M NaCl-Lösung. Man bringt dann auf eine Sephadex^© G25F-Säule (170 ml) auf und eluiert mit einer wäßrigen 0,2 M NaCl-Lösung. [0091] Man engt die das Pentasaccharid enthaltenden Fraktionen ein und entsalzt sie unter Verwendung der gleichen Säule, die mit Wasser eluiert wird. Nach der Gefriertrocknung erhält man die Verbindung 21 (30,5 mg, 85%).
[α]_D +49°C (c, 0,63, H₂O).
Das ¹H-NMR-Spektrum ist in der nachfolgenden TABELLE 2 wiedergegeben.
TABELLE 2
BEISPIEL 2
Methyl-O-(2,3,4-tri-O-methyl-6-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(5-C-ethyl-2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronsäure)-(1 → 4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1 → 4)-O-(2,6-anhydro-5-C-carboxy-3-O-methyl-β-D-mannopyranosyl)-(1 → 4)-2,3,6-tri-O-sulfo-α-D-glucopyranosid, Natriumsalz (36).
Man gibt den Triethylamin/Schwefeltrioxid-Komplex (91 mg) zu einer Lösung der rohen Verbindung 35 in Dimethylformamid (1,3 ml). Nach 20 Stunden bei 55°C trägt man die Lösung auf eine Sephadex^® G-25-Säule auf (2 × 38 cm) und eluiert mit 0,2 M Natriumchlorid. Man engt die das Produkt enthaltenden Fraktionen ein und entsalzt sie unter Anwendung der gleichen Säule, die jedoch mit Wasser eluiert wird. Man erhält nach der Gefriertrocknung die Verbin dung 36 (21,9 mg, 52% ausgehend von der Verbindung 33).
Das ¹H-NMR-Spektrum ist in der nachfolgenden TABELLE 3 wiedergegeben.
TABELLE 3
Nach der Verfahrensweise der obigen Beispiele 1 und 2 bereitet man die Verbindungen 37 bis 40 der folgenden Beispiele 3 bis 6. Die für diese Verbindungen erhaltenen ¹H-NMR-Spektren stehen im Einklang mit den nachfolgend angegebenen Konfigurationen.
BEISPIEL 3
Methyl-O-(2,3,4-tri-O-methyl-6-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronsäure)-(1→4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,6-anhydro-5-C-carboxy-3-O-methyl-β-D-mannopyranosyl)-(1→4)-2-O-sulfo-3,6-di-O-methyl-α-D-glucopyranosid, Natriumsalz (37).
[α]_D +51° (c 0,48, Wasser).
BEISPIEL 4
Methyl-O-(2,3,4-tri-O-methyl-6-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranospluronsäure)-(1→4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,6-anhydro-5-C-carboxy-3-O-methyl-β-D-mannopyranosyl)-(1→4)-2,3-di-O-sulfo-6-O-methyl-α-D-glucopyranosid, Natriumsalz (38).
(α]_D +57° (c 0,28, Wasser).
BEISPIEL 5
Methyl-O-(2,3,4-tri-O-methyl-6-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1 → 4)-O-(2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronsäure)-( 1→4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,6-anhydro-5-C-carboxy-3-O-methyl-β-D-mannopyranosyl)-(1→4)-2,6-di-O-sulfo-3-O-methyl-α-D-glucopyranosid, Natriumsalz (39).
[α]_D +53° (c 0,3, Wasser).
BEISPIEL 6
Methyl-O-(2,3,4-tri-O-methyl-6-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronsäure)-(1→4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,7-anhydro-5-C-carboxy-6-desoxy-3-O-methyl-β-D-mannoheptopyranosyl)-(1→4)-2,3,6-tri-O-sulfo-α-D-glucopyranosid, Natriumsalz (40).
[α]_D 49° (c 0,25, Wasser).

Claims

Pentasaccharid in Form der Säure und seiner pharmazeutisch annehmbaren Salze, deren anionische Form die folgende Formel besitzt:
in der: – R Wasserstoff, eine Gruppe -SO₃ ^-, (C₁-C₃)-Alkyl oder (C₂-C₃)-Acyl; – T Wasserstoff oder eine Ethylgruppe; und – n 1 oder 2 bedeuten.
Pentasaccharid nach Anspruch 1 in Form des Natrium- oder Kaliumsalzes.
Pentasaccharid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 2, ausgewählt aus: – Methyl-O-(2,3,4-tri-O-methyl-6-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronsäure)-(1→4)-O-(2,3,4-tri-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,6-anhydro-5-C-carboxy-3-O-methyl-β-D-mannopyranosyl)-(1→4)-2,3,6-tri-O-sulfo-α-D-glucopyranosid-Natriumsalz; –Methyl-O-(2,3,4-tri-O-methyl-6-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(5-C-ethyl-2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronsäure)-(1→4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,6-anhydro-5-C-carboxy-3-O-methyl-β-Dmannopyranosyl)-(1→4)-2,3,6-tri-O-sulfo-α-D-glucopyranosid-Natriumsalz; –Methyl-O-(2,3,4-tri-O-methyl-6-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O(2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronsäure)-(1→4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-α-Dglucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,6-anhydro-5-C-carboxy-3-O-methyl-β-D-mannopyranosyl)-(1→4)-2-O-sulfo-3,6-di-O-methyl-α-D-glucopyranosid-Natriumsalz; – Methyl-O-(2,3,4-tri-O-methyl-6-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronsäure)-(1→4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-α-Dglucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,6-anhydro-5-C-carboxy-3-O-methyl-β-D-mannopyranosyl)-(1→4)-2,3-di-O-sulfo-6-O-methyl-α-D-glucopyranosid-Natriumsalz; – Methyl-O-(2,3,4-tri-O-methyl-6-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronsäure)-(1→4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-α-Dglucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,6-anhydro-5-C-carboxy-3-O-methyl-β-D-mannopyra nosyl)-(1→4)-2,6-di-O-sulfo-3-O-methyl-α-D-glucopyranosid-Natriumsalz; – Methyl-O-(2,3,4-tri-O-methyl-6-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O(2,3-di-O-methyl-β-D-glucopyranosyluronsäure)-(1→4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-α-Dglucopyranosyl)-(1→4)-O-(2,7-anhydro-5-C-carboxy-6-desoxy-3-O-methyl-β-Dmannoheptopyranosyl)-(1→4)-2,3,6-tri-O-sulfo-α-D-glucopyranosid-Natriumsalz.
Pharmazeutische Zubereitungen enthaltend als Wirkstoff ein Pentasaccharid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 in Form des Salzes mit einer pharmazeutisch annehmbaren Base oder in Form der Säure, in Kombination oder in Mischung mit einem inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterial.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 4 in Form von Dosiseinheiten, in denen der Wirkstoff mit mindestens einem pharmazeutischen Trägermaterial vermischt ist.
Zubereitung nach Anspruch 5, worin jede Dosiseinheit 0,1 bis 100 mg des Wirkstoffs enthält.
Zubereitung nach Anspruch 6, worin jede Dosiseinheit 0,5 bis 50 mg des Wirkstoffs enthält.
Verwendung des Polysaccharids nach den Ansprüchen 1 bis 3 für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von pathologischen Zuständen, die von einer Dysfunktion der Blutgerinnung abhängen.