SK10792000A3

SK10792000A3 - Pentasacharidy, spôsob ich prípravy, farmaceutické kompozície, ktoré ich obsahujú a ich použitie

Info

Publication number: SK10792000A3
Application number: SK1079-2000A
Authority: SK
Inventors: Maurice Petitou
Original assignee: Sanofi-Synthelabo; Akzo Nobel N. V.
Priority date: 1998-01-19
Filing date: 1999-01-13
Publication date: 2001-01-18
Also published as: AU1974699A; CO4970823A1; SI1049706T1; NZ505614A; GT199900006A; EP1049706B1; CA2318326A1; EE200000421A1; CA2318326C; IL137240A0; SK284176B6; ES2200494T3; AU744137B2; PT1049706E; US6670338B1; PL341874A1; DK1049706T3; JP4695756B2; TW550267B; EE200000421A

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka pentasacharidov, spôsobov ich prípravy a farmaceutických prostriedkov, ktoré ich obsahujú.

Doterajší stav techniky

Heparín je polysacharid zo skupiny glykozaminoglykánov, ktorá je známa svojimi antikoagulačnými vlastnosťami (účinky proti zrážaniu krvi). Je známe (I. Bjôrk a U. Lindahl, Molecular and Celí Biochemistry, Dr. W. Junk Publishers, Holandsko, 1982), že zrážanie krvi je komplexný fyziologický jav. Určité podnety ako kontaktná aktivácia a tkanivový faktor spustia postupnú aktiváciu radu zrážacích faktorov prítomných v krvnej plazme. Bez ohľadu na charakter stimulu sú konečné kroky rovnaké: akrivovar.ý faktor X (Xa) aktivuje faktor II (známy aj ako protrombín), ktorý vo dvojej aktivovanej forme (faktor lla známy aj ako trombín) vyvolá čiastočnú proteolýzu rozpustného fibrinogénu, pričom sa uvoľní nerozpustný fibrín, čo je jedna z hlavných zložiek krvnej zrazeniny.

V normálnych fyziologických podmienkach je aktivita zrážacích faktorov regulovaná proteínmi ako je antritrombín III (AT III) a heparínový faktor II (HC II), ktoré sú takisto prítomné v plazme. Proteín AT III sa vyznačuje inhibičnou aktivitou na určitý počet zrážacích faktorov a najmä na faktory Xa a lla.

Inhibícia faktora Xa alebo faktora Ha je tak výhodným prostriedkom na dosiahnutie antikoagulačnej a antitrombotickej aktivity, pretože tieto dva faktory sa zúčastňujú konečných dvoch krokov zrážania, ktoré sú nezávislé od spúšťacieho stimulu.

Pentasacharid (ako látka opísaná autormi P. Sinayom a ďalšími, Carbohydrate Research, C5, 132 (1984)) reprezentuje mini2 málnu heparínovú sekvenciu potrebnú na väzbu s AT III. Táto zlúčenina sa získala pred 15 rokmi totálnou chemickou syntézou.

Od toho času sa v literatúre opísal rad syntetických oligosacharidov získaných totálnou chemickou syntézou, ktoré majú antitrombotické a antikoagulačné účinky.

Patent EP 0,084,999 opisuje deriváty tvorené kyselinou urónovou (kyselinou glukurónovou alebo indurónovou), monosacharidovými jednotkami a glukózamínom, ktoré majú výhodné antitrombotické vlastnosti. Okrem hydroxylových substituentov obsahujú tieto zlúčeniny N-sulfátové skupiny, N-acetylové skupiny a v niektorých prípadoch sú anomérne hydroxylové skupiny nahradené metoxys kupinami.

Aj patentová prihláška EP 0,165,134 opisuje syntetické oligosacharidy s antitrombotickou aktivitou. Tieto zlúčeniny sú tvorené kyselinou urónovou, monosacharidovými jednotkami a glukózamínom, a v polohe 3 glukózamínové jednotky obsahujú O-sulfátové skupiny. Opisujú sa aj v patentovej prihláške EP 0,301,618. Tieto zlúčeniny majú silné antitrombotické a antikcagulačné vlastnosti. Patent EP 0,454,220 opisuje deriváty kyseliny urónovej a deriváty glukózy, ktoré obsahujú ako substituenty O-alkylové alebo O-sulfátové skupiny. Aj tieto zlúčeniny majú antitrombotické a antikoagulačné vlastnosti.

Aj v patente EP 0,529,175 sa opisujú sulfatované glykózaminoglykanoidové deriváty, v ktorých sú N-sulfátové, N-acetátové alebo hydroxylové skupiny nahradené alkoxyskupinou, aryloxyskupinou, arylalkyloxyskupinou alebo O-sulfátovou skupinou. Tieto zlúčeniny majú výhodné antitrombotické vlastnosti a sú inhibítormi proliferácie buniek hladkej svaloviny.

V Angew., Chem., Int. Ed. Engl., 32(3), 434-436 (1993) sa opisujú oligosacharidy, najmä pentasacharidy, ktoré sú analogické s minimálnou heparínovou sekvenciou potrebnou na väzbu s AT III. Tieto zlúčeniny obsahujú jednotky kyseliny glukurónovej alebc glukózy, ktorých hydroxylové skupiny sú nahradené O-sulfátovými alebo O-metylovými skupinami.

Na pentasacharidoch sa uskutočnil rad štúdií a v literatúre sa uviedlo, že pre aktivitu produktov má veľký význam konformácia kyseliny L-idurónovej G. Pre jednotku G sa opísalo niekoľko kcnformačnýcn stavov (⁴Ci, ¹C₄, ²So) a uviedlo sa, že pre biologickú aktivitu produktov obsahujúcich kyselinu L-idurónovú má zásadný význam práve uvedená konformačná flexibilita (B. Času, M. Petitou, A. Provasoli a P. Sinay, Conformation flexibility: a new concept for explaining binding and biological properties of iduronic acid-containing glycosaminoglycans, Trends Biochem. Sci., 13, 221-225 (1988)).

Podstata vynálezu

Teraz sa prekvapivo objavilo, že náhrada jednej z O-alkylových skupín alkylénovým mostíkom a tým i zafixovanie konformácie kyseliny L-idurónovej, poskytne oligosacharidy, ktoré majú výhodné biologické vlastnosti, hoci sa nevyznačujú konformačnou flexibilitou. Z tohto dôvodu sa zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu líšia od ostatných syntetických heparinoidov opísaných v literatúre účinnosťou svojej novej štruktúry a svojimi silnými a neočakávanými biologickými vlastnosťami. Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sú pentasacharidy, v ktorých je L-idurónová kyselinová jednotka G v tzv. „uzamknutej ²S₀ konformácii a v ktorých má D-glukurónová kyselinová jednotka E prípadne v polohe 5 etylovú skupinu. Tieto zlúčeniny majú výbornú aktivitu proti faktoru Xa a veľkú afinitu k AT III.

Predmetom predkladaného vynálezu je presnejšie pentasacharid v kyslej forme a jeho farmaceutický prijateľné soli s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými katiónmi, ktorých aničnová forma má vzorec I:

RC

RO

C

E

G

H r

i.

v ktorom

R' je alkylová skupina obsahujúca 1 až 3 atómy uhlíka;

R je atóm vodíka alebo skupina SOj, alkylová skupina obsahujúca 1 až 3 atómy uhlíka alebo acylová skupina obsahujúca 2 až 3 atómy uhlíka;

ľ je atóm vodíka alebo etylová skupina;

n je číslo 1 alebo 2.

Vynález zahŕňa centasacharidy v ich kyslej forme alebo vo forme akejkoľvek ich farmaceutický prijateľnej scli. 7 kyslej forme sú skupiny -CCC a -SO/ prítomné ako skupiny -COOH a -SC₃H.

Výraz „farmaceutický prijateľná soľ polysacharicu pcdľa predkladaného vynálezu” sa týka pentasacharidu, v ktorom je jedna alebo niekoľko skupín -CCC a/alebo -SO3“ ióncvo viazaná na farmaceutický prijateľný katión kcvu.

Výhodné soli podľa predkladaného vynálezu sú tie, kde je katión vybraný z katiónov alkalických kovov, výhodnejšie tie, kde je katiónom Na alebo K⁺.

Predkladaný vynález sa týka aj spôsobu prípravy pentasacharidov podľa predkladaného vynálezu tak, že sa pripraví prekurzor jednotky G, ktorý sa spojí s prekurzorom jednotky K, čím sa získa prekurzor GH. Pentasacharid sa nakoniec získa buď spojením crekurzora GH s prekurzorom DEF alebo spojením prekurzora GH s prekurzorom EF a následnou adíciou D.

Dajú sa použiť akékoľvek prekurzory G, H, EF alebo DEF. To znamená, že vo všeobecnosti sa dá týmto spôsobom pripraviť celá skupina pentasacharidov s uzamknutou konfiguráciou jednotky G.

Uvedený postup je výhodným postupom podľa predkladaného vynálezu. Ale pentasacharidy podľa predkladaného vynálezu sa dajú pripraviť aj inými známymi metódami z chémie cukrov a najmä reakciou monosacharidu obsahujúceho ochranné skupiny (ako sa opisuje v knihe T. W. Green, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, New York, 1981) na hydroxylových a prípadne karboxylových zvyškoch, ak sú prítomné, s ďalším chráneným monosacharidom, pričom vznikne disacharid, ktorý potom reaguje s ďalším chráneným monosacharidom, pričom vznikne chránený trisacharid, z ktorého sa dá získať chránený tetrasacharid a potom chránený pentasacharid.

Z chránených pentasacharidov sa potom s cielom získať zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu odstránia ochranné skupiny a prípadne sa sulfatujú, alebo sa z nich čiastočne odstránia ochranné skupiny, potom sa sulfatujú a potom sa odstránia ochranné skupiny.

Tieto postupy sú v chémii sacharidov známe a opisujú sa najmä v práci G. Jaura a ďalší, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2(9), 897-900 (1992); J. Basten a ďalší, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2(9), 905-910 (1992) a M. Petitou a C. A. A. van Boeckel „Chemical synthesis of heparir* fragment and analcgues, Process in the chemistry of organic natural Products, Ed. Springer Verlag Vienna-New York, 1992, str. 203-210.

Uvedené postupy umožňujú získať zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu vo forme solí. S cielom získať zodpovedajúce kyseliny sa podrobia zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu vo forme solí reakcii s katiónovo výmennou živicou v kyslej forme.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu vo forme kyseliny sa potom dajú s cieľom získať požadované soli neutralizovať bázou.

Na tento účel sa dá použiť akákoľvek anorganická alebo organická báza, ktorá poskytuje farmaceutický prijateľné soli.

Výhodne sa používajú hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid vápenatý alebo hydroxid horečnatý. Výhodné sú sodné a vápenaté soli pentasacharidov podlá predkladaného vynálezu.

Zlúčeniny, ktoré sú predmetom podľa predkladaného vynálezu, majú výhodné farmakologické a biochemické vlastnosti. Konkrétnejšie majú silnú aktivitu proti faktoru Xa a veľkú afinitu k AT III.

Ako sa už uviedlo, faktor Xa aktivuje v zrážacej kaskáde protrcmbín na trombín, ktorý proteolyzuje rozpustný fibrinogén, pričcm sa uvoľňuje nerozpustný fibrín, čo je hlavná zložka krvnej zrazeniny. Inhibícia faktora Xa je teda výhodným prostriedkom r.a dosiahnutie antikoagulačnej a antitrombotickej aktivity. Aktivita proti faktoru Xa produktov podľa predkladaného vynálezu sa stanovila pri pH 7 postupom opísaným v práci A. N. Teien a M. Lie, Thrombosis Research, 10, 399-410 (1977) a dokázalo sa, že produkty podľa predkladaného vynálezu majú aktivitu proti Xa rovnakú alebo väčšiu než už známe syntetické heparinoidy. Afinita pentasacharidov podlá predkladaného vynálezu, ktorých anión má vzorec I, k AT III sa stanovila spektrofluorimetricky použitím podmienok opísaných v práci D. Atha a ďalší, Biochemistry 2c, 6454-6461 (1987). Výsledky testov ukázali, že zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu majú veľmi vysokú afinitu k AT III.

Všeobecná antitrombotická aktivita týchto zlúčenín sa ďalej hodnotila po intravenóznom alebo podkožnom podaní u potkanov v mcdeli hromadenia krvi v žilách a indukcie s tromboplastínom spôsobom opísaným J. Reyersom a ďalšími v práci Thrombosis Research, 18, 669-674 (1980). Hodnota ED₅₀ zlúčenín podía predkladaného vynálezu je aspoň rovnakého rádu alebo menšia než u iných už známych syntetických heparinoidov. Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu tak majú výhodnú špecifickosť pôsobenia a výhodnú antikoagulačnú a antitrombotická aktivitu.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sú vhodné na prípraΊ vu farmaceutických prostriedkov na parenterálne podávanie.

Zlúčeniny podía predkladaného vynálezu majú velmi nízku toxicitu; ich toxicita je úplne kompatibilná s ich použitím ako liečiv.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sú veľmi stabilné a preto vhodné najmä ako aktívne zložky liečiv.

Vynález sa týka aj farmaceutických prostriedkov obsahujúcich ako aktívnu zložku zlúčeninu podľa predkladaného vynálezu alebo jednu z jej farmaceutický prijateľných solí, prípadne v kombinácii s jedným alebo niekoľkými inertnými a zodpovedajúcimi prísadami.

V každej jednotke dávky je aktívna zložka prítomná v množstve vhodnom pre konkrétnu dennú dávku. Každá jednotka dávky obsahuje od 0,1 do 100 mg aktívnej zložky, výhodne 0,5 až 50 mg aktívnej zložky.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sa dajú použiť aj v kombinácii s jednou alebo niekoľkými ďalšími aktívnymi zložkami, ktoré sú vhodné na požadovanú terapiu, ako sú napríklad antitrombctické činidlá, antikoagulanty, činidlá proti agregácii krvných doštičiek ako je napríklad dipyridamol, aspirín, tiklopidín, klopidogrel alebo antagonisti glykoproteínovéhc komplexu Ilb/IIIa.

Farmaceutické prostriedky sú formulované na podávanie cicavcov vrátane človeka na liečenie uvedených chorôb.

Takto získané farmaceutické prostriedky sú výhodné v rôznych formách ako napríklad roztoky pre injekcie alebo nápoje, cukrom potiahnuté tablety, bežné tablety alebo želatínové kapsule. Výhodnou formou sú roztoky pre injekcie. Farmaceutické prostriedky podľa predkladaného vynálezu sú vhodné najmä na preventívne alebo akútne liečenie chorôb cievnych stien ako je ateroskleróza, hyperkoagulabilita napríklad po chirurgickom zákroku na nádore alebo po narušení koagulácie spôsobenej bakteriálnymi, vírusovými alebo enzymatickými aktivátormi.

Všeobecnejšie sa dajú pentasacharidy podía predkladaného vynálezu použiť pri liečení patologických stavov s poruchami zrážania krvi.

Dávkovanie sa môže líšiť v rámci širokého rozsahu v závislosti od veku pacienta, hmotnosti, zdravotného stavu, charakteru a závažnosti ťažkostí a aj od spôsobu podávania. Dávkovanie zahŕňa pccanie jednej alebo niekoľkých dávok 0,5 až 1000 mg za deň, výhodne 1 až 100 mg za deň, výhodnejšie 0,5 až 50 mg za deň, napríklad 20 mg za deň, a to intramuskulárne alebo podkožné, po dávkach alebo v pravidelných intervaloch, alebo perorálne podanie dennej dávky 200 až 1000 mg za deň.

Tieto dávky sa dajú prirodzene upraviť pre každého pacienta v závislosti od dosiahnutých výsledkov a podľa vopred uskutočneného rozboru krvi. Výhodným spôsobom je podkožné podávanie.

Predmetom predkladaného vynálezu sú tak aj farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú ako aktívnu zložku jednu z uvedených zlúčenín, prípadne v kombinácii s ďalšou aktívnou zložkou. Tieto prostriedky sú upravené tak, aby sa dali podávať do tráviacej sústavy alebo mimo tráviacu sústavu.

Farmaceutické prostriedky podľa predkladaného vynálezu na perorálne, podjazykové, podkožné, intramuskulárne, intravenózne, transdermálne, sliznicové, lokálne alebo rektálne podávanie sa podávajú ľuďom alebo zvieratám ako jednotková dávka s aktívnou zložkou zmiešanou so štandardnými farmaceutickými prísadami. Vhodné jednotkové formy na podávanie zahŕňajú perorálne formy ako tablety, želatínové kapsule, prášky, granule a perorálne suspenzie alebo roztoky, podjazykové a orálne formy, podkožné, intramuskulárne, intravenózne, intranazálne a očné formy a rektálne formy.

Keď sa pripravuje tuhý prostriedok vo forme tabliet, zmieša sa hlavná aktívna zložka s farmaceutickým nosičom ako je želatína, škrob, laktóza, stearan horečnatý, mastenec, arabská guma, a pod. Tablety sa dajú poťahovať sacharózou alebo inými vhodnými materiálmi alebo alternatívne sa dajú upraviť tak, že majú dlho9 dobú alebo oneskorenú aktivitu a tak že plynulé uvolňujú vopred stanovené množstvo aktívnej zložky.

Želatínové kapsule sa získajú zmiešaním aktívnej zložky s riedidlom a naliatím získanej zmesi do kapsulí z mäkkej alebo tvrdej želatíny.

Prášky, ktoré sa dispergujú vo vode, alebo granule môžu obsahovať aktívnu zložku v zmesi s disperzným, suspenzným alebo zvlnčujúcim činidlom ako je polyvinylpyrolidón, a so sladidlami alebo príchuťami.

Na rektálne podávanie sa pripravujú čapíky, ktoré sa vyrábajú zo spájadiel, ktoré sa topia pri teplote rekta, napríklad z kakaového masla alebo polyetylénglykolov.

Na parenterálne, intranazálne alebo očné podávanie sa používajú vhodné suspenzie, izotonické fyziologické roztoky alebo roztoky na sterilné injekcie, ktoré obsahujú farmakologicky kompatibilné disperzné činidlá a/alebo zvlhčujúce činidlá, napríklad propylénglykol alebo butylénglykol.

Na podávanie cez sliznicu môže byť aktívna zložka vo forme zmesi s promótora, ako je žlčová soľ, hydrofilný polymér ako napríklad hydrcxypropylcelulóza, hydroxypropylmetylcelulóza, hydroxyetylcelulóza, etylcelulóza, karboxymetylcelulóza, dextrán, pclyvinylpyrolydón, pektíny, škroby, želatína, kazeín, akrylové kyseliny a estery a ich kopolyméry, vinylové polyméry alebo kopolyméry, vinylalkoholy, alkoxypolyméry, polyetylénoxidové polyméry, polyétery alebo ich zmesi.

Aktívna zložka môže byť aj vo forme mikrokapsulí, prípadne s jednou alebo niekoľkými prísadami alebo nosičmi.

Aktívna zložka môže byť aj vo forme komplexu s cyklcdextrínom, napríklad α-, β- alebo γ-cyklodextrínom, 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrínom alebo metyl-p-cyklodextrínom.

Aktívna zložka sa môže uvoľňovať aj z balónikov, ktoré ju obsahujú, alebo z endovaskulárnych rozťahovačov zavedených do ciev. Farmakologická účinnosť aktívnej zložky sa tým neovplyvňuje.

Výhodnou cestou podávania je podkožný spôsob.

Nasledovné spôsoby, prípravy a schémy ilustrujú syntézy rôznych intermediátov, ktoré sú vhodné na získanie pentasacharidov podľa predkladaného vynálezu.

Ďalej sa používajú nasledovné skratky:

TBDMS: terc-butyldimetylsilylová skupina; Lev: levulinylová skupina; Bn: benzylová skupina; Bz: benzoylová skupina; TLC: tenkovrstvová chromatografia; Olm: trichlóracetimidoylová skupina; LSIMS: kvapalinová hmotnostná spektrometria sekundárneho iónu; ESIMS: elektrónsprejová ionizačná hmotnostná spektrometria; TMS: trimetylsilylová skupina; TSP: trimetylsilyltetradeuteriopropionát sodný; Tf: triflát; MS: molekulové sitá; Al: alylová skupina; PMB: p-metoxybenzylová skupina; SE: trimetylsilyetylová skupina;

Dowex®, Sephadex®, Chelex® a Toyopearl® sú registrované ochranné známky.

V spôsoboch, prípravách a príkladoch opísaných v ďalšej časti predkladaného vynálezu sa všeobecné postupy katalytického spojenia imidátov, štiepenie levulínových esterov, katalytické spojenie tioglykozidov, zmydelnenie, metylácia a selektívne odstránenie ochranných skupín p-metoxybenzylovej skupiny, odstránenie ochranných skupín a sulfatácia oligo- a polysacharidov hydrogenolýzou benzylesterov alebo éterov, zmydelnenie esterov alebo sulfatácia, uskutočňujú aplikáciou všeobecných postupov na príslušné intermediáty.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sa syntetizujú rôznymi prípravami opísanými v ďalšej časti predkladaného vynálezu.

c

H

E o

u t*> o in o co

L· x

Eh

s

Q

OQ

Eh sr ω

OQ

EPríprava donora monosacharidu <0 (0 > -H o u C 'to H Ό (D -H 3 X ω o

H ffl σι s

x u

II cm

X u

O

CM

X

O U CN o

I O 02 co

M

O O X x x

o

c »rH o -o

CM -H

O U < >

υ m

p*

OJ >

c >u

TJ

J-l o

<c

E ><u £

u cn x | o x

O m 2 « U

TJ α Z O C CM D S

n) tj > -H o u C 'TJ J-t Ό φ -H 3 X W o

OJ

Príprava u prvá konverzia disacharidu

ΛΙ

í	k	o
'(D		0
>		O
0 <	CN	CM dP
r— ΜΓ	r—1	Λ
«J	U	i in
Jŕ 'TJ	CN	U oo
(U 4-1	****	0
i—¹ -H	u	CO
O 0}		r~
E		1

(D

U «C

O

<

Φ s

E eu <

cm <U

S o

c

Ό

4J (U u

TJ x

u o

> JZ

Ό O

O

O n, o

S-i

HP Si

U o

CM [Φ s

ω

Cu m*

H o O » Λ

X = m

Ύ' * (U x 2 O •H TJ J Z rH CM

U

O > X Ό U

O

-X Ch O

M <#> -X

O r-

>

r* >c t:

K2*

O

c.

TJ e

•aj .c u

cn «#>

H o

CS	x cn
x		X
o	X	o
u	u	(0
<	o o	z
	CS	s
T3		rH
c		*
>		O

x o*> O >

+j u o CJ o r~ o

r.c cn

Vznik bicyklického systému

Φ

W

Εm

c	CN
*ι—1	rtP
o t:	X
CM	U iT)
υ u	o 00	C
< >	O	•H
	CN	-1 TJ

υ x

cn <*>

m

H > Q.

U o o 00 O CN

x o

U o

CS

P“

I

CM r—H u

M

X u

X c	L
«Φ
jJ	[u
3	2
XI	Q
-) X
> O	X
+J □	n
o ω	o
ε '	U OP
υ	X
. Μ	iC ID
CM Φ	r-
O -u	x
r—í	M
U	ra
(O	c
z	ra

CN	m

Príprava 1

6-0-terc-Butyldimetylsilyl-1,2-0-izopropylidén-3-0-metyl-a-D-giukofuranóza (2)

1C g (42,7 mmol) diolu 1 sa rozpustí v 100 ml bezvodého dichlórmetánu a pridá sa 7,1 g (47,3 mmol) terc-butyldimetylsiiylchicridu a 5,8 g (85,3 mmol) imidazolu. Reakčná zmes sa mieša počas 2 hodín pri teplote miestnosti, potom sa zriedi dichlórmetánom a premyje sa vodou. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým a zahustí sa, zvyšok sa prečistí chromatografiou na silikagéli (1/9; objemový pomer; etylacetát/cyklohexán), čím sa získa 11,9 g (80 %) požadovaného produktu 2 vo forme sirupu .

[a]_z= -34° (c = 1,9; chloroform).

Príprava 2

6-0-terc-Butyldimetylsilyl-1,2-0-izopropylidén-3-0-metyl-5-C-vir.yl-a-D-glukofurancza (4)

K 40 ml bezvodého dichlórmetánu sa pri teplote -78 °C pridá 3,2 ml (36,8 mmol) oxalylchloridu a 5,2 ml (73,4 mmol) dimetylsulfoxidu. Zmes sa mieša počas 30 minút, potom sa pridá 6,4 g :18,4 mmol·) zlúčeniny 2 a zmes sa mieša počas ďalšej hodiny. Potom sa pridá 15,3 ml (110,0 mmol) trietylamínu a po 30 minútach sa reakčná zmes zriedi dichlórmetánom. Štandardné spracovanie poskytne pentulózovú zlúčeninu 3, ktorá sa priamo použije v nasledovnej reakcii.

Surový ketón sa rozpustí v 100 ml bezvodého tetrahydrofurár.u a pri teplote 0 °C sa pridá 28 ml (27,6 mmol) IM roztoku vinyimagnéziumbromidu v tetrahydrofuráne. Po 1 hodine sa reakčná zmes zriedi, nie chloridom amónnym, a premyje sa vodou. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým, zahustí sa a zvyšok sa prečistí chromatografiou na silikagéli (1/9; objemový pomer; etylacetát/cyklohexán), čím sa získa 4,8 g (70 %) požadovanej zlúčeniny 4 vo forme sirupu.

[«;□ = -40° (c = 1,3; chloroform).

Elementárna analýza: vypočítané C 57,72, H 9,15; nájdené C 57,77, H 9,23.

Príprava 3

1,2,3,4-Tetra-0-acetyl-3-0-metyl-5-C-vinyl-a-D-glukopyranóza (6)

3.5 g (9,4 mmol) zlúčeniny 4 sa rozpustí v 50 ml vody, do zmesi sa pridá 1 g živice IR-120 a zmes sa počas 6 hodín zohrieva na teplotu 80 °C. Živica sa odstráni filtráciou a filtrát sa zahustí. Surový produkt 5 sa acetyluje použitím 12 ml acetanhydridu a 13 ml pyridínu. Nadbytok acetanhydridu sa rozloží metanolom a rozpúšťadlá sa odparia. Zvyšok sa extrahuje z vody dichlórmetánom. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým, zahustí sa a zvyšok sa prečistí chromatografiou na silikagéli (3/2; objemový pomer; etylacetát/cyklohexán), čím sa získa 2,7 g (75 %) tetraacetátu 6 vo forme tuhej látky, teplota topenia 50 C.

[a]_c= -34° (c = 1,6; chloroform).

Elementárna analýza: vypočítané C 52,47, H 6,19; nájdené C 52,51, H 6,19.

Hmotnostné spektrum Cl: 406 (M + NHJ, 389 (M + 1).

Príprava 4

Metyl-2, 3, 6-tri-O-benzyl-4-O-(2,4,6-tri-O-acetyl-3-O-metyl-5-C-vinvi-p-D-glukopyranozyl)-a-D-glukanozid (8)

1.6 g (4,1 mmol) zlúčeniny 6 a 2,1 g (4,5 mmol) zlúčeniny 7 (P. J. Garegg a H. Hultberg, Carbohydr. Res. CIO, 93 (1981)) sa rozpustí v 50 ml bezvodého dichlórmetánu a pridajú sa 4,0 g molekulových sít. Reakčná zmes sa mieša počas 1 hodiny pri teplote miestnosti a potom sa pri teplote -78 ’C pridá 0,95 ml (5 mmol)

TMSOTf. Reakčná zmes sa pomaly vytemperuje na teplotu miestnosti a po 2 hodinách sa neutralizuje trietylamínom a prefiltruje sa cez kremelinu. Filtrát sa premyje vodou a organická fáza sa vysuší síranom horečnatým. Zvyšok sa prečistí chromatografiou na silikagéli (4/1; objemový pomer; etylacetát/cyklohexán), čím sa získa 2,77 g (85 %) požadovanej zlúčeniny 8 vo forme tuhej látky, teplota topenia 47 °C.

[a]_D= -36° (c = 0,6; chloroform).

Elementárna analýza: vypočítané C 65,14, H 6,61; nájdené C 65,09, H 6,70.

Príprava 5

Metyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-O-(4,6-izopropylidén-3-0-metyl-5-C-vinyl-p-D-glukopyranozyl)-a-D-glukopyranozid (10)

2,7 g (3,4 mmol) zlúčeniny 8 sa rozpustí v 40 ml metanolu a pri teplote 0 °C sa pridá katalytické množstvo sodíka. Zmes sa mieša počas 3 hodín pri teplote miestnosti, potom sa zahustí, zvyšok sa prevedie do 40 ml bezvodého acetónu a pridajú sa 2 ml 2,2-dimetoxypropánu a katalytické množstvo kyseliny p-toluénsulfónovej. Reakčná zmes sa mieša cez noc pri teplote miestnosti. Rozpúšťadlo sa odparí, zvyšok sa prevedie do chloroformu a premyje sa vodou. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým, zahustí sa a zvyšok sa prečistí chromatografiou na silikagéli (1/1; objemový pomer; etylacetát/cyklohexán), čím sa získa 1,7 g (70 %) 4',6'-O-izopropylidénderivátu 10 vo forme tuhej látky, teplota topenia 55 °C.

[a]_D = -13° (c = 0,8; chloroform).

Elementárna analýza: vypočítané C 67,97, H 7,13; nájdené C 67,87, H 7,16.

Hmotnostné spektrum CI: 707 (M + 1), 724 {M + NH₄).

Príprava 6

Metyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-O-(4,6-izopropylidén-3-0-metyl-5-C-vinyl-p-D-manopyranozyl)-a-D-glukopyranozid (12)

0,35 ml (4,0 mmol) oxalylchloridu a 0,57 ml (8,0 mmol) bezvodého dimetylsulfoxidu sa počas 30 minút mieša pri teplote -78 °C v 10 ml bezvodého dichlórmetánu. Potom sa k roztoku pridá 1,4 g (2,0 mmol) zlúčeniny 10 v 10 ml bezvodého dichlórmetánu a zmes sa mieša počas ďalších 45 minút. Reakčná zmes sa neutralizuje pridaním 1,7 ml (12,0 mmol) bezvodého trietylamínu a potom sa zriedi dichlórmetánom, premyje sa vodou, vysuší sa síranom horečnatým a zahustí sa a zvyšok 11 sa priamo použije v nasledovnej reakcii bez ďalšieho čistenia.

Ketón 11 sa prevedie do 15 ml bezvodého tetrahydrofuránu a pri teplote -78 °C sa pridajú 4 ml (4,0 mmol) IN roztoku superhyaridu v tetrahydrofuráne. Reakčná zmes sa mieša počas 1 hodiny pri teplote miestnosti a potom sa pridajú 2 ml 5 % roztoku hydroxidu sodného a 1 ml peroxidu vodíka. Rozpúšťadlo sa odparí a zvyšok sa prevedie do etylacetátu a premyje sa vodou. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým a zahustí sa a zvyšok sa prečistí chromatografiou na silikagéli (2/1; objemový pomer; etylacetát/cyklohexán), čím sa získa 1,0 g (70 %) zlúčeniny 12.

[ajz. = -11° (c = 0,5; chloroform).

Hmotnostné spektrum Cl: 724 (M + NHJ , 707 (M + 1).

Fríprava 7

Metyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-O-(2-O-acetyl-3-O-metyl-5-C-vinyl-β-D-manopyranozyl)-a-D-glukopyranozid (14)

940 mg (1,3 mmol) zlúčeniny 12 sa rozpustí v 3 ml pyridínu a pridá sa 0,3 ml acetanhydridu. Reakčná zmes sa mieša počas 3 hodín pri teplote miestnosti, nadbytok pyridínu a acetanhydridu sa odparí a zvyšok 13 sa priamo použije na odchránenie izopropylidénovej ochrannej skupiny, pričom sa použije 5 ml 80 % kyseliny octovej pri teplote 60 °C počas 2 hodín. Nadbytok kyseliny octovej sa odparí a zvyšok sa prečistí chromatografiou na silikagéli (4/1; objemový pomer; etylacetát/cyklohexán), čím sa získa 660 mg (70 %) diolu 14 vo forme tuhej látky, teplota topenia 53 'C.

[cx]₌ = -10° (c = 0,8; chloroform).

Hmotnostné spektrum CI: 709 (M + l), 726 (M + NH₄) .

Príprava 8

Metyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-O-(2-0-acetyl-3-0-metyl-6-0-tozyl-5-C-vinyl-3-D-manopyranozyl)-a-D-glukopyranóza (15)

600 mg (0,9 mmol) zlúčeniny 14 sa rozpustí v 3 ml pyridínu a pridá sa 240 mg (1,3 mmol) tozylchloridu. Reakčná zmes sa mieša počas 3 hodín pri teplote miestnosti, rozpúšťadlo sa odparí a zvyšok sa zriedi chloroformom a premyje vodou. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým a zahustí sa a zvyšok sa prečistí chromatografiou na silikagéli (1/1; objemový pomer; etylacetát/cyklohexán), čím sa získa 297 mg (80 %) tozylovej zlúčeniny 15 vo forme sirupu.

[a]₃= -26° (c = 0,8; chloroform).

Príprava 9

Metyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-O-(2,6-anhydro-3-0-metyl-5-C-vinyl-β-D-manopyranozyl)-a-D-glukcpyranozid (16)

550 mg (0,6 mmol) zlúčeniny 15 sa prevedie do etanolu (3 ml) a potom sa pridá 5 ml 0,lN etanolického roztoku hydroxidu sodného. Reakčná zmes sa zohrieva počas 3 hodín na teplotu 70 °C a potom sa neutralizuje živicou IR-120 (v H⁺ forme) a prefiltruje sa cez Celíte. Po zahustení sa zvyšok prečistí chromatografiou na silikagéli (1/1; objemový pomer; etylacetát/cyklohexán), čím sa získa 292 mg (70 %) zlúčeniny 16 vo forme sirupu.

[a]_D= +13° (c = 0,5; chloroform).

Hmotnostné spektrum CI: 666 (M + NH₄) .

Príprava 10

Metyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-O-(benzyl-3-O-metyl-2-O-5-C-metylidén-a-L-idopyranuronát)-α-D-glukopyranozid (17)

260 mg (0,4 mmol) zlúčeniny 16 sa rozpustí v 20 ml dichlórmetánu, roztok sa mieša pri teplote -78 “C a potom sa počas 30 sekúnd zavádza do zmesi ozón. Tým sa objaví svetložlté sfarbenie roztoku. Potom sa pridá dimetylsulfid a reakčná zmes sa premyje vodou. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým a zahustí sa a potom sa uskutoční bez ďalšieho čistenia nasledovná reakcia.

Surový aldehyd sa prevedie do 16 ml terc-butanolu a pridá sa 5 ml 2-metyl-2-buténu a 16 ml vody. Potom sa do zmesi postupne pridá 700 mg dihydrogénfosforečnanu sodného a 700 mg chloritanu sodného (NaClO2) . Suspenzia sa intenzívne mieša pri teplote miestnosti, zriedi sa vodou a extrahuje sa etylacetátom. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým a zahustí sa a potom sa priamo uskutoční nasledovní reakcia.

Surová kyselina sa prevedie do 25 ml dimetylformamidu a pridá sa 0,7 g (2,0 mmol) tetrabutylamóniumjodidu, 0,25 g (2,5 mmol·) hydrogenuhličitanu draselného a 0,250 ml (2,1 mmol) benzylbromidu. Reakčná zmes sa mieša počas 5 hodín pri teplote miestnosti a potom sa rozdelí medzi vodu a dietyléter. Éterová fáza sa vysuší síranom horečnatým a zahustí sa a zvyšok sa prečistí chromatografiou na silikagéli (2/1; objemový pomer; etylacetát/cyklohexán) , čím sa získa 236 mg (80 %) derivátu 17 vo forme sirupu.

Hmotnostné spektrum CI: 774 (M + NH₄) .

Schéma 2 - Kondenzácia imidátu DEF ochrannej skupiny a sulfatácia (18) s GH (17), odstránenie

OAc

sodná soľ

Príprava 11

Metyl-O-(6-O-acetyl-2,3,4-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-O-(benzyl-2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranozyluronát)-(l->4)-O-(3,6-di-0-acetyl-2-0-benzyl-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-O-(2,6-anhydro-5-C-benzyloxykarbonyl-3-0-metyl-p-D-manopyranozyl)-(1—>4)-2,3,6-tri-O-benzyl-a-D-glukopyranozid (19) mg (78,2 μπιοί) imidátu 18 (Van der Heijden a ďalší, abstrakt 9^th Eur. Carbohydr. Symp. Utrecht, 6.-11. júla 1997; A74, strana 154), 65 mg (86,0 μπιοί) akceptora 17 a 70 mg práškových molekulových sít 4A sa mieša v inertnej atmosfére v 2,4 ml zmesi 1/2; objemový pomer; dichlórmetán/dietyléter. Reakčná zmes sa mieša počas 30 minút a potom sa pridáva hydrogénuhličitan sodný až do neutrálnej reakcie. Po filtrácii a zahustení sa zvyšok prečistí na kolóne gélu Sephadex® LH-20 (1/1; objemový pomer; dichlórmetán/etanol) a potom na kolóne silikagélu (1/1; objemový pomer; etylacetát/cyklohexán), čím sa získa 86 mg (67 %) zlúčeniny 19.

[a]_D= +66° (c 1,0; dichlórmetán).

*H-NMR spektrum je opísané v tabuľke 1

Príprava 12

Metyl-O-(2,3,4-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-O-(2, 3-di-O-metyl-p-D-glukopyranozylurónová kyselina)-(1—>4)-O-(a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-0-(2,6-anhydro-5-C-karboxy-3-0-metyl-p~D-manopyranozyl)-{1—>4)-a-D-glukopyranozid (20)

Zlúčenina sa pripraví podľa M. Petitou a C. A. A. van Boeckel, Progress in the Chemistry of Organic Natural Products, vydal W. Herz a ďalší, Springer Verlag, Wien-New York, 1992, strany 143-210.

Roztok 49 mg (30,0 μπιοί) zlúčeniny 19 sa mieša v 3 ml kyseliny octovej v atmosfére vodíka pri tlaku 3,5 MPa počas 12 hodín pri teplote 40 °C v prítomnosti 73 mg 5 % paládia na uhlí (35b). Zmes .sa prefiltruje cez Celíte, zahustí sa a destiluje sa štyrikrát s 5 ml vody. Zvyšok sa rozpustí v 3 ml IM vodného roztoku hydroxidu sodného a počas 3 hodín sa zohrieva na teplotu 55 °C. Roztok sa potom ochladí a preleje sa cez 170 ml kolónu Sephadex'⁵625 F, pričom sa eluuje vodou. Frakcie obsahujúce produkt 20 sa prelejú cez kolónu živice Dowex® H⁺. Vymytý roztok sa zahustí, čím sa získa 25 mg (86 %) zlúčeniny 20.

[a]o = +105° (c = 1,0; voda).

‘H-NMR spektrum je opísané v tabuľke 1

Tabuľka 1

Zlúč.	Jed- notka	H-l	H-2	H-3	H-4	H-5	H-6	H-6’	J._. ’Hz;
19lCDC1₃)	D	5, 50	3,11	3, 37	3,03	3,43	4,28	4,22	3,7
	E	4,14	2, 93	3,31	3,92	3,83	-	-	~ 9
	F	4,98	3,45	5,41	3,63	3,94	4,38	4,19	3,6
	G	5,18	3,83	3,12	4,12	-	4,10	3,98	- 1
	H	4,58	3,51	4,01	3,78	3,80	3,83	3, 61	3,6

20(D;O)	D	5,50	3,33	3,49	3,30	3,50	3,74	3,74	3,9
	E	4,62	3,26	3, 58	3, 90	4,04	-	-	7,9
	F	5,13	3,58	3,-6	3, 61	3,70 až 3,90	4,1
	G	5,23	4,35	3,71	4,20	-	4,25	4,10	- 1
	H	4,82	3, 64	3,84	3,73	3,70 až 3,90	3,7

Schéma 3 - príprava donora EF, disacharidu 29

29

Príprava 13

Metyl-O-(4,6-0-izopropylidén-2,3-di-0-metyl-5-C-vinyl-P-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-2,3,6-tri-O-benzyl-a-D-glukopyranozid (22)

0,31 g (13,0 mmol) hydridu sodného sa pri teplote 0 °C pridá k roztoku 6,11 g (8,65 mmol) metyl-O-(4,6-O-izopropylidén-3-0-metyl-5-C-vinyl-3-D-glukopyranozyl)-{1—>4)-2,3,6-tri-O-benzyl-a-D-glukopyranozidu (10) a 0,80 ml (13,0 mmol) metyljodidu v 9 ml N,N-dimetylformamidu. Zmes sa mieša počas 2 hodín (podľa tenkovrstvovej chromatografie), pridá sa metanol a reakčná zmes sa naleje do vody. Zmes sa extrahuje etylacetátom, extrakty sa premyjú vodou, vysušia sa a zahustia sa. Zvyšok sa prečistí chromatografiou na silikagéli (3/2; objemový pomer; cyklohexán/dietyléter), čím sa získa 5,92 g (88 %) zlúčeniny 22.

Tenkovrstvová chromatografia: Rf = 0,28 (3/2; objemový pomer;

cyklohexán/dietyléter).

Príprava 14

Metyl-O-(4,6-0-izopropylidén-2,3-di-0-metyl-5-C-etyl-p-D-glukopyranozyl)-(l->4)-2,3,6-tri-O-benzyl-a-D-glukopyranozid (23)

160 mg oxidu platiny sa pridá do roztoku 5,80 g (8,04 mmol) látky 22 v 400 ml etylacetátu. Potom sa zavádza vodík. Zmes sa mieša počas 40 minút (podía tenkovrstvovej chromatografie) , prefiltruje sa a odparí sa, čím sa získa zlúčenina 23.

Tenkovrstvová chromatografia: R_f = 0,60 (4/1; objemový pomer; toluén/etylacetát) .

Príprava 15

Metyl-O-(2,3-di-0-metyl-5-C-etyl-p-D-glukopyranozyl)-(l->4)-2,3,6-tri-O-benzyl-a-D-glukopyranozid (24)

Surová zlúčenina 23 sa rozpusti v 60 ml 70 % kyseliny octo25 vej a mieša sa počas 2 hodín pri teplote 80 °C. Zmes sa zahustí vo vákuu a odparí sa s toluénom, čím sa získa zlúčenina 24.

Tenkovrstvová chromatografia: Rf = 0,52 (4/1; objemový pomer;

dichľórmetán/metanol).

Príprava 16

Metyl-O-(benzyl-2,3-di-0-metyl-5-C-etyl-3-D-glukopyranozyluror.át) - (1—>4) -2,3, 6-tri-O-benzyl-a-D-glukopyranozid (25)

K roztoku 5,75 g zlúčeniny 24 v 28 ml tetrahydrofuránu sa pridá 17,5 mg 2,2,6,6-tetrametyl-l-piperidyloxidu, 17,5 ml roztoku hydrogénuhličitanu sodného, 87 mg bromidu draselného a 115,5 mg tetrabutylamóniumchloridu. Zmes sa ochladí na teplotu 0 °C a počas 15 minút sa pridá zmes 17 ml nasýteného roztoku chloridu sodného, 8,70 ml nasýteného roztoku hydrogénuhličitanu sodného a 20 ml 1,3M roztoku chlórnanu sodného. Zmes sa mieša počas 1 hodiny, potom sa zriedi vodou a extrahuje sa trikrát dichlórmetánom. Organická fáza sa premyje nasýteným roztokom chloridu sodného, vysuší sa síranom horečnatým, prefiltruje sa a odparí sa dosucha, čím sa získa surový derivát kyseliny.

Derivát kyseliny sa rozpustí v 107 ml Ν,Ν-dimetylformamidu v atmosfére dusíka. Potom sa pridá 4,10 g hydrogénuhličitanu draselného a 9,70 ml benzylbromidu a zmes sa mieša počas 16 hodín, potom sa pridá etylacetát a voda a po extrakcii sa organická fáza zahustí. Zvyšok sa prečistí chromatografiou na silikagéli, čím sa získa 3,81 g zlúčeniny 25 (60 % výťažok zo zlúčeniny 23) .

[gCd= +24° (c = 0,15; dichlórmetán).

Príprava 17

Metyl-O-(benzyl-5-C-etyl-4-0-levuloyl-2,3-di-0-metyl-p-D-glukopyranozyluronát)-(1—>4)-2,3,6-tri-O-benzyl-a-D-glukopyranozid (26)

3,51 g (4,46 mmol) zlúčeniny 25 sa rozpustí v 45 ml bezvodého dioxánu. Potom sa pridá 1,00 g (8,93 mmol) kyseliny levulovej, 1,70 g (8,93 mmol) hydrochloridu 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu a 0,11 g (8,93 mmol) 4-dimetylaminopyridínu. Zmes sa mieša počas 16 hodín, potom sa extrahuje etylacetátom, extrakty sa dôkladne premyjú vodným 5 % roztokom hydrogensíranu draselného, vodou, nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodcu, vysušia sa a zahustia sa. Zvyšok sa prečistí chromatcgrafiou na silikagéli (2/1 a potom 3/2; objemový pomer; cyklohexán/etylacetát), čím sa získa 3,64 g (85 %) čistej látky 26.

[ct] □ = +26° (c = 0,9; dichlórmetán).

Príprava 18

O-(Benzyl-5-C-etyl-4-0-levuloyl-2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranozyluronát)-(1—>4)-1,3,6-tri-0-acetyl-2-0-benzyl-D-glukopyranóza (27)

3,35 g (3,78 mmol) zlúčeniny 26 sa rozpustí v 22 ml acetanhydridu. Roztok sa ochladí na teplotu -20 °C a pridá sa 22 ml studeného roztoku kyseliny sírovej v acetanhydride (1 ml kyseliny sírovej v 10 ml acetanhydridu). Zmes sa zriedi etylacetátom, premyje sa nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, vodou, vysuší sa a zahustí sa. Zvyšok sa prečistí chromatografiou na silikagéli (1/1; objemový pomer; cyklohexán/etylacetát), čím sa získa 2,20 g (65,5 %) zlúčeniny 27.

Tenkovrstvová chromatografia: Rf = 0,24, (1/1; objemový pomer; cyklohexán/etylacetát).

Príprava 19

O-(Benzyl-5-C-etyl-4-0-levuloyl-2,3-di-0-metyl-p-D-glukopyranozyluronát)-(1—>4)-3,6-di-0-acetyl-2-0-benzyl-D-glukopyranóza (28)

K roztoku 2,18 g (2,67 mmol) zlúčeniny 27 v 50 ml tetrahyd27 rofuránu sa pridá 11 ml (101,4 mmol) benzylamínu. Zmes sa mieša počas 4 hodín, potom sa extrahuje etylacetátom a extrakty sa premyjú 102 ml IM kyseliny chlorovodíkovej a vodou, vysušia sa a zahustia sa. Zvyšok sa prečistí chromatografiou na silikagéli í 1/1; objemový pomer; toluén/etylacetát), čím sa získa 1,33 g (65 *) zmesi α/β 50/50 zlúčeniny 28.

Tenkovrstvová chromatografia: Rf = 0,22 (1/1; objemový pomer; toluén/etylacetát) .

Príprava 20

O-(Benzyl-5-C-etyl-4-0-levuloyl-2,3-di-0-metyl-p-D-glukopyranozylurcnát)-(1—>4)-3,6-di-0-acetyl-2-0-benzyl-D-glukopyranozyltrichlóracetimidát (29)

1,32 g (1,71 mmol) zlúčeniny 28 sa rozpustí v 34 ml dichlórmetánu a v atmosfére argónu sa pridá 0,87 ml (8,50 mmol) trichlóracetonitrilu a 0,90 g (2,73 mmol) uhličitanu cézneho. Zmes sa mieša počas 2 hodín (podľa tenkovrstvovej chromatografie) a prefiltruje sa. Zvyšok sa prečistí chromatografiou na silikagéli (3/2; objemový pomer; cyklohexán/etylacetát), čím sa získa 1,20 g (77 %) zmesi α/β 85/15 imidátu 29.

Tenkovrstvová chromatografia: Rf = 0,36 (1/2 (v/v) cyklohexán/etylacetát).

Schéma 4 - Príprava akceptora tetrasacharidu 31

Príprava 21

Metyl-O-(benzyl-5-C-ety1-4-O-levuloyl-2,3-di-O-metyl-3-D-glukopyranozyluronát)-(1—>4)-0-(3,6-di-0-acetyl-2-0-benzyl-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(2,6-anhydro-5-C-benzyloxykarbonyl-3-0-metyl-p-D-manopyranozyl)-(1—>4)-2,3,6-tri-O-benzyl-a-D-glukopyranozid (30)

0,19 ml IM roztoku terc-butyldimetylsilyltriflátu v dichlórmetáne sa v atmosfére argónu pridá pri teplote -20 °C a v prítomnosti 1,93 g molekulových sít 4A k roztoku 1,19 g (1,29 mmol) imidátu 29 a 1,02 g (1,35 mmol) mtyl-2,3,6-tri-Obenzyl-4-(benzyl-3-0-metyl-2-0-5-C-metylidén-a-L-idopyranuronát)-α-D-glukopyranozidu v 40 ml toluénu. Zmes sa mieša

-D-glukopyranozidu v 40 ml toluénu. Zmes sa mieša počas 30 minút (podľa tenkovrstvovej chromatografie) a potom sa opäť pridá 0,19 ml IM roztoku terc-butyldimetylsilyltriflátu v dichlórmetáne. Po 30 minútach (podľa tenkovrstvovej chromatografie) sa pridá tuhý hydrogénuhličitan sodný. Roztok sa prefiltruje, premyje sa vodou, vysuší sa a odparí sa dosucha. Zvyšok sa prečistí chromatografiou na kolóne Sephadex® LH-20 a potom na kolóne silikagélu (2/1; objemový pomer; toluén/etylacetát), čím sa získa 1,14 g (58 %) čistého tetrasacharidu 30-a.

[a]_D= +47° (c = 0,21; dichlórmetán).

Príprava 22

Metyl-O-(benzyl-5-C-etyl-2,3-di-0-metyl-p-D-glukopyranozyluronát)-(l->4)-0-(3,6-di-0-acetyl-2-0-benzyl-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(2,6-anhydro-5-C-benzyloxykarbonyl-3-0-metyl-a-D-manopyranozyl)-(1—>4)-2,3,6-tri-O-benzyl-a-D-glukopyranozid (31)

1,13 g (0,75 mmol) zlúčeniny 30 sa rozpustí v 150 ml zmesi 2/1; objemový pomer; etanol/toluén a pridá sa 0,35 g (3,73 mmol) hydrazínacetátu. Zmes sa mieša počas 1 hodiny (tenkovrstvová chromatografia) a potom sa zahustí. Zvyšok sa prečistí chromatografiou na silikagéli (3/2; objemový pomer; toluén/etylacetát), číir. sa získa 0,816 g (83 %) zlúčeniny 31.

[aj_D= +35° (c = 1,01; dichlórmetán).

Schéma 5 - Kondenzácia tetrasacharidu EFGH (31) s glykozylovým donorom D (32), odstránenie ochrannej skupiny a sulfatácia

CMe I

Príprava 23

Metyl-O-(6-O-acetyl-2,3,4-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-:l->4)-0-(benzyl-5-C-etyl-2,3-di-O-metyl-a-D-glukopyranozyluronát)-(l->4)-0-(3,6-di-0-acetyl-2-0-benzyl-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-O-(2,6-anhydro-5-C-benzyloxykarbonyl-3-0-metyl^-D-manopyranozyl)-(1—>4)-2,3,6-tri-O-benzyl-a-D-glukopyranozid

23)

34,7 mg (0,0245 mmol) trichlóracetimidátu 6-0-acetyl-2,3,4-tri-O-metyl-D-glukopyranózy 32 (P. Westerduin a ďalší, Bioorg.

Med. Chem. 2, 1267 (1994)) a 80 mg (0,056 mmol) glykozylového akceptora 31 reaguje postupom opísaným v príprave 21. Zlúčenina sa prečistí na kolóne Sephadex® LH-20 (1/1; objemový pomer; dichlórmerán/etanol) a potom na kolóne silikagélu (3/2; objemový pomer; diizopropyléter/etylacetát), čím sa získa 54,6 mg (58 %) derivátu 33.

í«]₀= +55° (c = 1; dichlórmetán).

Príprava 24

Metyl-O-(6-0-acetyl-2,3,4-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(5-C-etyl-2,3-di-O-metyl-a-D-glukopyranozylurónová • kyselina)-(1—>4)-O-(3,6-di-O-acetyl-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(2,6-anhydro-5-C-karboxy-3-0-metyl^-D-manopyranozyl)-(l->4)*

-a-D-glukopyranozid (34)

Roztok 40 mg (0,024 mmol) zlúčeniny 33 v 2 ml kyseliny octovej sa počas 16 hodín mieša v atmosfére vodíka v prítomnosti 80 mg 10 % paládia na uhlí a potom sa prefiltruje. Filtrát sa zahustí, čím sa získa zlúčenina 34.

Príprava 25

Metyl-O-(2,3, 4-tri-O-metyl-a-D-glukopyranozyl) -(1—>4)-0-(5—C—

-etyl-2,3-di-O-metyl-a-D-glukopyranozylurónová kyselina)-(1->4)-O-(α-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-O-(2,6-anhydro-5-C-karboxy-3-0-metyl^-D-manopyranozyl)-(1—>4)-a-D-glukopyranozid (35)

216 μΐ vodného 5M roztoku hydroxidu sodného sa pridá k 866 μΐ roztoku surovej zlúčeniny 34 v metanole. Po 25 hodinách sa pridá voda a zmes sa preleje cez kolónu gélu Sephadex^3, G-25 (2 x 38 cm), pričom sa eluuje vodou. Eluát sa zahustí a preleje sa cez 2 ml kolónu Dowex® 50 H⁺ a lyofilizuje sa. V tomto štádiu sa pomocou ¹H-NMR skontroluje, že sa odstránili všetky ochranné skupiny.

Príklad 1

Metyl-O-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(2,3-di-0-metyl^-D-glukopyranozylurónová kyselina)-(1—>4)-0-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(2,6-anhydro-3-0-metyl-a-L-idopyranozylurónová kyselina)-(1—>4)-2,3,6-tri-0-sulfo-a-D-glukopyranozid (21)

Postupuje sa podľa C. A. A. van Boeckel a M. Petitou, Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 32, 1671-1690 (1993)).

Roztok 20 mg (20,7 μιηοΙ) zlúčeniny 20 a 164 mg (0,90 μπιοί) komplexu trietylamín/oxid sírový sa zohrieva v 2 ml dimetylformamidu na teplotu 55 °C bez prístupu svetla počas 18 hodín a 30 minút. Reakčná zmes sa ochladí na teplotu miestnosti a potom sa zriedi vedným 0,2M roztokom chloridu sodného. Roztok sa potom nanesie na 170 ml kolónu Sephadex® G25F a vymýva sa vodným 0,2M roztokom chloridu sodného.

Frakcie obsahujúce pentasacharid sa zahustia a zbavia sa soli na rovnakej kolóne, pričom sa eluuje vodou. Po lyofilizácii sa získa 30,5 mg (85 %) zlúčeniny 21.

[a]_D= +49° (c = 0,63; voda).

¹H-NMR spektrum je uvedené v nasledovnej tabuľke 2.

Tabuľka 2

Zlúč.	Jed- notka	H-l	H-2	H-3	H-4	H-5	H-6	H-6'	Ji-: (Hz)
2 7	P M	5,46	3,32	3,55	3,34	3,87	4,28	4,12	3,9
	-	4,66	3,26	3,53	3,89	3,73	-	-	7,9
	F	5,50	4,36	4,81	4,00	4,17	4,49	4,41	3,7
	G	5,49	4,41	3,73	4,17	-	4,24	4,09	- 1
	H	5,16	4,36	4,52	4,01	4,08	4,41	4,30	3,7

Príklad 2

Sodná soľ metyl-O-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(5-C-etyl-2,3-di-0-metyl-p-D-glukopyranozylurónová kyselina)-(l->4)-0-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-0-(2,6-anhydro-5-C-karboxy-3-0-metyl-p-D-manopyranozyl)- (1—>4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranozidu (36) mg komplexu trietylamín/oxid sírový sa pridá k roztoku surovej zlúčeniny 35 v 1,3 ml dimetylformamidu. Po 20 hodinách pri teplote 55 °C sa roztok nanesie na kolónu Sephadex® G-25 (2 x 38 cm) a vymýva sa 0,2M roztokom chloridu sodného. Frakcie obsahujúce produkt sa zahustia a zbavia sa soli na rovnakej kolóne, pričom sa premýva vodou. Po lyofilizácii sa získa 21,9 mg zlúčeniny 36 (52 % zo zlúčeniny 33).

Ή-NMR spektrum je uvedené v nasledovnej tabuľke 3

Tabulka 3

	H-l (Ji-z Hz)	H-2	H-3	H-4	H-5	H-6	H-6'	ďaláie
D	5,43 (3,9)	3,28	3,53	3,30	4,02	4,27	4,14
E	4,68 (8,1)	3,27	3,60	3,98				2,041/1,80: CH₂CH₃ 09,4: CH₂CH₃
F	5,50 (3,7)	4,35	4,50	3,84	4,07	4,61	4,30
G	5,47 (1,1)	4,39	3,72	4,16	-	4,23	4,08
H	5,16 (3,7)	4,36	4,81	4,00	4,17	4,50	4,39

Postupom opísaným v príkladoch 1 a 2 sa pripravia zlúčeniny 37 až 40 z nasledovných príkladov 3 až 6. Získané ¹H-NMR spektrá týchto zlúčenín sú v súlade s uvedenými konfiguráciami.

Príklad 3

Sodná soľ metyl-0-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-O-(2,3-di-0-metyl-p-D-glukopyranozylurónová kyselina) -{1—>4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(2,6-anhydro-5-C-karboxy-3-0-metyl-p-D-manopyranozyl)-(1—>4)-2-0-sulfo-3,6-di-O-metyl-a-D-glukopyranozidu (37) [<x]_D= +51° (c = 0,48; voda).

Príklad 4

Sodná soľ metyl-O-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyrano35 zyl)- (1—>4)-O-(2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranozylurónová kyselina) -(1->4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-0-(2,6-anhydro-5-C-karboxy-3-0-metyl-p-D-manopyranozyl)-(l->4)-2,3-'di-0-sulfo-6-0-metyl-a-D-glukopyranozidu (38) [a]_D= +57° (c = 0,28; voda).

Príklad 5

Sodná sol metyl-0-(2,3,4-tri-O-metyl-6-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(2,3-di-0-metyl-P-D-glukopyranozylurónová kyselina) -(1—>4)-0-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(2,6-anhydro-5-C-karboxy-3-0-metyl-p-D-manopyranozyl)-(l->4)-2,6-di-0-sulfo-3-0-metyl-a-D-glukopyranozidu (39) [a]-= +53° (c = 0,3; voda).

Príklad 6

Sodná sol metyl-0-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(2,3-di-0-metyl-p-D-glukopyranozylurónová kyselina) -(l->4)-0-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(2,7-anhydro-5-C-karboxy-6-deoxy-3-0-metyl-p-D-manoheptopyranozyl)-(1->4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranozidu (40)

Claims

.Pentasacharid v kyslej forme a jeho farmaceutický prijatelscli, ktorých aniónová forma má vzorec I n é v ktorom

P.¹ je alkylová skupina obsahujúca 1 až 3 atómy uhlíka;

R je atóm vodíka alebo skupina -SO3, alkylová skupina obsahujúca 1 až 3 atómy uhlíka alebo acylová skupina obsahujúca 2 až 3 atómy uhlíka;

T je atóm vodíka alebo etylová skupina;

n je číslo 1 alebo 2.
2. Pentasacharid podía nároku 1 vo forme sodnej alebo draselnej scli.
3. Pentasacharid pcdla ktoréhokoľvek nároku 1 a 2 vybraný zo skupiny, ktorú tvorí • sodná soľ metyl-0-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(2,6-anhydro-5-C-karboxy-3-0-metyl-p-D-manopyranozyl)-(l->4)-0-(2,3, 6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-0-(2,6'-anhydro-3-0-metyl-a-L-idopyranozylurónová kyselina)-(1—>4)-2,3, 6-tri-0-sulfo-a-D-glukopyranozidu;

• sodná soľ metyl-O-(2, 3, 4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-<x-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(5-C-etyl-2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranozylurónová kyselina)-(l->4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyŕanozyl)-(l->4)-0-(2, 6-anhydro-5-C-karboxy-3-0-metyl-p-D-manopyranozyl)-(1—>4)-2,3, 6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranozidu • sodná sol metyl-O-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranozylurónová kyselina) - (l->4)-0-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(2,6-anhydro-5-C-karboxy-3-0-metyl-p-D-manopyranozyl)-(1->4)-2-O-sulfo-3,6-di-0-metyl-a-D-glukopyranozidu • sodná soľ metyl-O-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranozylurónová kyselina) - (1—>4)-0-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-0-(2,6-anhydro-5-C-karboxy-3-0-metyl-p-D-manopyranozyl)-(1—>4)-2,3-di-0-sulfo-6-0-metyl-a-D-glukopyranozidu • sodná sol metyl-O-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranozylurónová kyselina) -(1—>4)-0-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(l->4)-0-(2,6-anhydro-5-C-karboxy-3-0-metyl-p-D-manopyranozyl)-(1—>4)-2,6-di-0-sulfo-3-0-metyl-a-D-glukopyranozidu • sodná sol metyl-O-(2,3, 4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranozylurónová kyselina) -(1—>4)-0-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranozyl)-(1—>4)-0-(2,7-anhydro-5-C-karboxy-6-deoxy-3-0-metyl-p-D-manoheptopyranozyl)-(1—>4)-2, 3, 6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranozidu.
4. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že ako aktívnu zložku obsahuje pentasacharid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 vo forme soli s farmaceutický prijateľnou zásadou alebo v kyslej forme, v kombinácii alebo zmesi s inertnou, netoxickou, farmaceutický prijateľnou prísadou.

i
5. Farmaceutická kompozícia podía nároku 4, vyznačujúca sa tým, že je vo forme dávkovej jednotky v ktorej je aktívna zložka zmiešaná s aspoň jednou farmaceutickou prísadou.
6. Farmaceutická kompozícia podía nároku 5, vyznačujúca sa tým, že každá dávková jednotka obsahuje 0,1 až 100 mg aktívnej zložky.
7. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 6, vyznačujúca sa t ý m, že každá dávková jednotka obsahuje 0,5 až 50 mg aktívnej zložky.
8. Použitie polysacharidu podľa nárokov 1 až 3 na prípravu liečiva na použitie na liečenie patologických stavov spojených s poruchami zrážania krvi.