NO316894B1

NO316894B1 - Nye pentasakkarider, farmasoytiske preparater inneholdende de samme samt anvendelse derav

Info

Publication number: NO316894B1
Application number: NO20003661A
Authority: NO
Inventors: Maurice Petitou
Original assignee: Sanofi Aventis
Priority date: 1998-01-19
Filing date: 2000-07-17
Publication date: 2004-06-14
Also published as: AU1974699A; CO4970823A1; SI1049706T1; NZ505614A; GT199900006A; EP1049706B1; CA2318326A1; SK10792000A3; EE200000421A1; CA2318326C; IL137240A0; SK284176B6; ES2200494T3; AU744137B2; PT1049706E; US6670338B1; PL341874A1; DK1049706T3; JP4695756B2; TW550267B

Abstract

Oppfinnelsen vedrører et pentasakkarid i en syreform og de farmasøytisk aksepterbare salter derav, hvor den anioniske form derav er beskrevet i formel (I) hvor Ri er (C-C)alkyl, R er hydrogen, en -SO" gruppe, (C-C)alkyl eller (C- C)acyl, T er hydrogen eller en etylgruppe og n er 1 eller 2.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye pentasakkarider, farmasøytiske preparater inneholdende disse samt anvendelse derav.

Heparin er et polysakkarid av glykosaminoglykanfamilien som er kjent for dets antikoagulerende egenskaper. Det er kjent (I. Bjørk og U. Lindahl, Molecular and Cell Biochemistry, 1982, Dr. W: Junk Publishers - Netherlands) at blodkoagula-sjon er et komplekst fysiologisk fenomen. Visse stimuli som kontaktaktivering og vevsfaktor, utløser den etterfølgende aktivering av en rekke koagulasjonsfaktorer som er tilstede i blodplasma. Uansett stimulienes natur er sluttrinnene iden-tiske, idet den aktiverte faktor X (Xa) aktiverer faktor II {også kjent som protrombin) som, i sin aktiverte form {faktor Ila, også kjent som trombin) fører til delvis proteolyse av oppløselig fibrinogen med frigjøring av uoppløselig fibrin som er en av hovedbestanddelene i et blodkoagel.

Under normale fysiologiske betingelser er aktiviteten til koagulasjonsfaktorene regulert ved hjelp av proteiner som antitrombin III (AT III) og heparin-kofaktor II (HC II) som også er tilstede i plasma. AT III utviser inhiberende aktivitet på et visst antall koagulasjonsfaktorer, og særlig på faktorer Xa og Ila.

Inhibering av faktor Xa eller faktor Ila er således det foretrukne middel for å oppnå antikoagulerende og antitrombotisk aktivitet, da disse to faktorer er involvert i de siste to koagulasjonstrinn som er uavhengig av den utløsende stimulus.

Et pentasakkarid som det som er beskrevet av P. Sinay et al., Carbohydrate Research 1984, 132 C5 representerer, den minste heparinsekvensen som kreves for binding til AT III. Denne forbindelse ble oppnådd for omtrent femten år siden ved total kjemisk syntese.

Siden da har et visst antall syntetiske oligosakkarider, oppnådd.ved total kjemisk syntese og med antitrombotisk antikoagulerende aktivitet, blitt beskrevet i litteraturen.

EP patent 0 084 999 beskriver derivater som består av uronsyre (glukuronsyre eller iduronsyre) monosakkaridenheter og glukosamin som har fordelaktige antitrombotiske egenskaper. Foruten substituenter som består av hydroksyl-grupper, inneholder disse forbindelser N-sulfatgrupper, N-acetylgrupper og i enkelte tilfeller er de anomere hydroksyl-grupper erstattet med metoksygrupper.

EP patentsøknad 0 165 134 beskriver også syntetiske oligosakkarider med antitrombotisk aktivitet. Disse forbindelser som består av uronsyremonosakkaridenheter og glukosamin og inneholder en O-sulfatgruppe i 3 stillingen i glukosamin-enheten er også beskrevet i EP patentsøknad 0 301 618. Disse forbindelser har kraftige antitrombotiske og antikoagulerende egenskaper. EP patent 0 454 220 beskriver uronsyrederivater og glukosederivater som inneholder 0-alkyl- eller O-sulfatgrupper som substituenter. Disse sistnevnte forbindelser har også antitrombotiske og antikoagulerende egenskaper.

Sulfaterte glykosaminoglykanoidderivater hvor N-sulfat-, N-acetat- eller hydroksylfunksjonelle grupper er blitt erstattet med alkoksy-, aryloksy-, aralkyloksy- eller O-sulfatgrupper er også beskrevet i EP patent 0 529 175. Disse forbindelser har fordelaktige antitrombotiske egenskaper. De sistnevnte forbindelser er også inhibitorer av proliferasjon av glatte muskelceller.

Oligosakkarider og særlig pentasakkarider som er analog med den minste heparinsekvensen som kreves for binding til AT III er beskrevet i Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1993, 32, 3, 434-43 6. Disse forbindelser inneholder glukuronsyre eller glukoseenheter hvis hydroksylfunksjoner er blitt erstattet med O-sulfat- eller O-metylgrupper.

En rekke studier har siden blitt utført på pentasakkarider og

.det er blitt indikert i litteraturen at konformasjonen av L-iduronsyreenheten G spiller en viktig rolle i forbindelse med aktiviteten av produktene. En rekke konformasjonstilstander for enheten G er blitt beskrevet (<4>C1,<1>C4, <2S>0) og det er

blitt foreslått at denne konformasjonsfleksibilitet er essen-siell for den biologiske aktivitet til produkter inneholdende L-iduronsyre (B. Casu, M. Petitou, A. Provasoli og P. Sinay, Conformational flexibility: a new consept for explaining binding and biological properties of iduronic aci-containing glycosaminoglycans. Trends Biochem. Sei. 1988, 13, 221-225).

Man har nå overraskende funnet at ved å erstatte en av 0-alkylgruppene med en alkylenbro og ved således å låse konformasjonen av L-iduronsyren, oppnås oligosakkarider med fordelaktige biologiske egenskaper skjønt de mangler konfor-mas jonsf leksibilitet . Grunnen til dette er at forbindelsene ifølge oppfinnelsen avviker fra andre syntetiske heparinoider beskrevet i litteraturen i kraft av deres nye strukturer og deres kraftige og uventede biologiske egenskaper. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er pentasakkarider hvor L-iduron-syrenheten G er i den såkalte "locked" <2>S0 konf ormas jon og hvor D-glukuronsyreenheten E eventuelt har en etylgruppe i 5 stilling. Disse forbindelser har svært høy anti-faktor Xa aktivitet og stor affinitet for AT III.

Formålet med den foreliggende oppfinnelse er mere spesielt et pentasakkarid i syreform og de farmasøytisk aksepterbare salter derav med en eller flere farmasøytisk aksepterbare kationer, hvis anioniske form har formelen (I):

hvor: R representerer hydrogen eller en -S03" gruppe, (C1-C3)

alkylgruppe eller {C2-C3)acylgruppe,

T representerer hydrogen eller en etylgruppe,

n representerer l eller 2.

Oppfinnelsen omfatter pentasakkarider i syreform, eller i form av et farmasøytisk aksepterbart salt. I syreformen er - C00" og -S03" funksjonene i henholdsvis formen -COOH og

-SO3H.

Uttrykket "farmasøytisk aksepterbart salt av pentasakkaridene ifølge oppfinnelsen" skal vise til pentasakkarider hvor en eller flere av -COO" og/eller -S03" funksjonene er ionisk bundet til et farmasøytisk aksepterbart metallkation.

De foretrukne salter ifølge oppfinnelsen er dem hvor kationet er valgt fra kationene av alkalimetaller og enda mere foretrukket dem hvor kationet er Na<+> eller K<+>.

Pentasakkaridene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved at en forløper av enheten G fremstilles, som kobles med en forløper av enheten H til å gi en forløper av GH, idet pentasakkaridet til slutt oppnås: ved enten kobling av en forløper av GH med en forløper av

DEP,

eller ved kobling av en forløper av GH med en forløper av EF, etterfulgt av tilsetning av D.

En hvilken som helst forløper av G, av H, av EF eller av DEF kan anvendes. Dette betyr at det er mulig, i henhold til disse fremgangsmåter, å fremstille en hel familie av pentasakkarider som felles har enhet G i låst konfigurasjon.

Fremgangsmåten beskrevet i det foregående er den foretrukne fremgangsmåten. Pentasakkaridene ifølge oppfinnelsen kan imidlertid fremstilles ved hjelp av andre kjente metoder innen sukkerkjemien, og særlig ved å reagere et monosakkarid som inneholder beskyttelsesgrupper som beskrevet av T.W. Green, i Protective Groups in Organic Synthesis (Wiley, N.Y.

1981), på hydroksylradikalene og eventuelt på karboksylradikalene, om tilstede, med et annet beskyttet monosakkarid for å danne et disakkarid som deretter reageres med et annet beskyttet monosakkarid for å danne et beskyttet trisakkarid hvorfra et beskyttet tetrasakkarid og deretter et beskyttet pentasakkarid kan oppnås.

De beskyttede pentasakkarider avbeskyttes deretter og sulfateres eventuelt, eller avbeskyttes delvis, sulfateres deretter og avbeskyttes deretter, i denne rekkefølge for å oppnå forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Slike fremgangsmåter er kjente innen karbohydratkjemien og er spesielt beskrevet av G. Jaurand et al. i Bioorganic and

Medicinal Chemistry Letters 1992, 2, 9, 897-900, av J. Basten et al., i Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 1992, 2, 9, 905-910 og av M. Petitou og CA.A. van Boeckel i "Chemical synthesis of heparin fragment and analogues" 2 03-210 - Process in the chemistry of organic natural products, Ed. Springer Verlag Vienna - N.Y. 1992.

Fremgangsmåten som beskrevet i det foregående gjør det mulig å oppnå forbindelsene ifølge oppfinnelsen i form av salter. For å oppnå de tilsvarende syrer blir forbindelsene ifølge oppfinnelsen i form av salter bragt - i kontakt med en kation-bytter-harpiks i syreform.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen i form av syrer kan deretter nøytraliseres med en base for å oppnå et ønsket salt.

For å gjennomføre dette kan en hvilken som helst uorganisk eller organisk base som gir farmasøytisk aksepterbare salter anvendes.

Natriumhydroksyd, kaliumhydroksyd, kalsiumhydroksyd eller magnesiumhydroksyd anvendes foretrukket. Natrium- og kal-siumsaltene av pentasakkaridene i følge oppfinnelsen er de foretrukne salter.

Forbindelsene som er formålet med den foreliggende oppfinnelse har fordelaktige farmakologiske og biokjemiske egenskaper. Mere spesielt har de stor anti-faktor Xa aktivitet og stor affinitet for AT III.

Som nevnt i det foregående aktiverer faktor Xa i sin koagulå-sjonskaskade protrombin til trombin, som proteolyserer opp-løselig fibrinogen med frigjørelse av uoppløselig fibrin, som er hovedbestanddelen i et blodkoagel. Inhibering av faktor Xa er således et foretrukket middel for å oppnå antikoagulerende og antitrombotisk aktivitet. Anti-faktor Xa aktiviteten til produktene ifølge oppfinnelsen ble evaluert ved pH 7, i henhold til metoden beskrevet av Teien A.N. og Lie M., i Thrombosis Research 1977, 10, 399-410, og det er blitt vist at produktene ifølge oppfinnelsen har anti-Xa aktivitet som er lik eller større enn aktiviteten til de allerede kjente syntetiske heparinoider. Affiniteten av pentasakkaridene ifølge oppfinnelsen, hvis anion har formelen (I), for AT III ble bestemt ved spektrofluorimetri under betingelsene beskrevet av D. Atha et Al. i Biochemistry 1987, 26, 6454-6461. Resultatene av testene viste at forbindelsene ifølge oppfinnelsen har svært høy affinitet for AT III.

Dessuten ble den totale antitrombotiske aktivitet til disse forbindelser evaluert i rotter ved hjelp av en modell med venestase og induksjon med tromboplastin i henhold til metoden beskrevet av J. Reyers et al. i Thrombosis Research 1980, 18, 669-674. ED50 for forbindelsene i følge oppfinnelsen er minst i den samme størrelsesorden som eller mindre enn den for de andre syntetiske heparinoider som allerede er kjente. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen har således fordelaktig aksjonsspesifisitet og fordelaktig antikoagulerende og antitrombotisk aktivitet.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er anvendbare for fremstilling av farmasøytiske preparater for parenteral administrering.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen har svært lav toksisitet, idet deres toksisitet er fullstendig kompatibel med deres bruk som medisiner.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er svært stabile og er således egnet som det aktive prinsippet i medisiner.

Oppfinnelsen vedrører også farmasøytiske preparater som inneholder, som aktivt prinsipp, et pentasakkarid ifølge oppfinnelsen i form av et salt med en farmasøytisk aksepterbar base eller i syreform, kombinert med eller blandet med en farmasøytisk aksepterbar, ikke giftig inert eksipiens.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av et polysakkarid ifølge oppfinnelsen for fremstilling av en medisin som er anvendbar i patologier forbundet med en koagulasjons-dysfunksjon.

I hver enhetsdose er det aktive prinsipp tilstede i de mengder som er avpasset de daglige anbefalte doser. Hver enhetsdose inneholder fra 0,1 til 100 mg aktivt prinsipp, foretrukket fra 0,5 til 50 mg.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes i kombi-nasjon med ett eller flere andre aktive prinsipper som er anvendbare for den ønskelig terapi som for eksempel antitrombotiske midler, antikoagulasjonsmidler, anti-plate-aggregeringsmidler som for eksempel dipyridamol, aspirin, tiklopidin, klopidogrel eller antagonister av Ilb/lIIa glyko-proteinkomplekset.

De farmasøytiske preparater er utformet for administrering til pattedyr, inkluderende mennesker, for behandling av de ovennevnte sykdommer.

Farmasøytiske preparater som således oppnås er fordelaktig i forskjellige former som for eksempel injiserbare eller drikk-bare oppløsninger, sukkerbelagte tabletter, vanlig tabletter eller gelantinkapsler. De injiserbare oppløsninger er de foretrukne farmasøytiske former. De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen er spesielt anvendbare for forebyggende eller helbredende behandling av lidelser i den vaskulære vegg, hyperkoagulasjonstUstander som observeres etter for eksempel tumorkirurgi eller nedbrytning av koagel, indusert ved bakterielle, virale eller enzymatiske aktivatorer.

Doseringen kan variere innen et omfattende område avhengig av pasientens alder, vekt og helsetilstand, av naturen og alvor-ligheten- av lidelsen og av administreringsruten. Denne dose-ring omfatter administrering av en eller flere doser fra omtrent 0,5 mg til omtrent 1000 mg pr. døgn, foretrukket fra omtrent 1 til omtrent 100 mg pr. døgn og enda mere foretrukket fra omtrent 0,5 til omtrent 50 mg pr. døgn, for eksempel omtrent 2 0 mg pr. døgn, intramuskulaert eller subku-tant i porsjonsvise administreringer eller som administreringer ved regulære intervaller, eller som en daglig dose på omtrent 200 mg til omtrent 1000 mg pr. dag administrert oralt.

Disse doser kan naturligvis innstilles for hver pasient avhengig av de observerte resultater og av blodanalysene som er gjennomført på forhånd. Subkutan administrering er den foretrukne rute.

Formålet med den foreliggende oppfinnelse er således også farmasøytiske preparater som inneholder, som aktivt prinsipp, en av de ovennevnte forbindelser eventuelt kombinert med et annet aktivt prinsipp. Disse preparater er fremstilt slik at de kan administreres digestivt eller parenteralt.

I de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen for oral, sublingval, subkutan, intramuskulær, intravenøs, transdermal, transmukøs, lokal eller rektal administrering, kan den aktive bestanddel administreres■i enhetsformer for administrering, blandet med standard farmasøytiske bærere, til dyr eller til mennesker. De passende enhetsformer for administrering omfatter orale former som orale suspensjoner, oppløsninger, granuler og pulvere, gelatinkapsler og tabletter, sublingvale og buccale former for administrering, subkutane, intra-muskulære, intravenøse, intranasale eller intraokulære former for administrering og rektale former for administrering.

Når et fast preparat fremstilles i form av tabletter, blandes den viktigste aktive bestanddelen med en farmasøytisk vehik-kel som gelatin, stivelse, laktose, magnesiumstearat, talkum, gummi-arabikum eller lignende. Tabletter kan belegges med sukrose eller andre passende materialer eller de kan alternativt behandles slik at de har forlenget eller for-sinket aktivitet og slik at de kontinuerlig frigjør en for-håndsbestemt mengde aktivt prinsipp.

Et preparat som gelantinkapsler oppnås ved å blande den aktive bestanddel med et fortynningsmiddel og -ved å helle blandingen som oppnådd inn i myke eller harde gelantinkapsler .

De vanndispergerbare pulver eller granuler kan inneholde den aktive bestanddel blandet med dispersjonsmidler eller fukt-midler, eller suspensjonsmidler, som polyvinylpyrrolidon, så vel som med søtningsmidler eller smaksforsterkere.

For rektal administrering anvendes stikkpiller som fremstilles med bindemidler som smelter ved rektal temperatur,

for eksempel kakaosmør eller"polyetylenglykoler.

For parenteral, intranasal eller intraokulær administrering, anvendes vandige suspensjoner, ^isotone saltoppløsninger eller sterile og injiserbare oppløsninger som inneholder farmako-logisk kompatible dispersjonsmidler og/eller fuktemidler, for eksempel propylenglykol eller butylenglykol.

For transmukøs administrering kan det aktive prinsipp utformes i nærvær av en promoter som et gallesalt, en hydrofil polymer som for eksempel hydroksypropylcellulose, hydroksy-propylmetylcellulose, hydroksyetylcellulose, etylcellulose, karboksymetylcellulose, dekstran, polyvinylpyrrolidon, pektiner, stivelse, gelatin, kasein, akrylsyrer, akrylsyre-estere og kopolymerer derav, vinylpolymerer eller kopoly-raerer, vinylalkoholer, alkoksypolymerer, polyetylenoksyd-polymerer, polyetere eller en blanding derav.

Det aktive prinsipp kan også utformes i form av mikrokapsler, eventuelt med en eller flere bærere eller tilsetningsstoffer.

Det aktive prinsipp kan også være i form av et kompleks med et cyklodekstrin, for eksempel a-, p- eller y-cyklodekstrin, 2-hydroksypropyl-p-cyklodekstrin eller metyl-P-cyklodekstrin .

Det aktive prinsipp kan også frigjøres ved hjelp av en bal-long som inneholder dette eller ved en endovaskulær ekstender innført i blodkarene, ben farmakologiske effektivitet av det aktive prinsipp berøres således ikke.

Subkutan administrering er den foretrukne rute.

Fremgangsmåtene og fremstillingene i det etterfølgende og reaksjonsskjemaene (se fig. 1-7) illustrerer syntesen av de forskjellige mellomprodukter som er anvendbare for å oppnå pentasakkaridene ifølge oppfinnelsen.

De følgende forkortelser, anvendes:

TBDMS: tert-butyldimetylsilyl, Lev: levulinyl, Bn: benzyl, Bz: benzoyl, TLC: tynsjiktkromatografi, Olm: trikloracet-imidyl, LSIMS:"liquid secondary ion mass spectrometry", ESIMS: "electron spray inoization mass spectrometry", TMS: trimetylsilyl, TSP: natriumtrimetylsilyltetradeutero-propionat, Tf: triflat, MS: molekylsiler, All: allyl, PMB: p-metoksybenzyl, Se: trimetylsilyletyl.

Dowex, Sephadex, Chelex og Toyopearl er handelsnavn.

I fremgangsmåtene, fremstillingene og eksemplene beskrevet i det etterfølgende kan de generelle prosedyrer som vedrører den katalytiske kobling av imidatene, spaltingen av levulin-syreesterne, den katalytiske kobling av tioglykosidene, forsåpningen, metyleringen og den selektive avbeskyttelse av p-metoksybenzylgruppen, avbeskyttelsen og sulfateringen av oligo- og polysakkaridene ved hydrogenolyse av benzylesterne eller eterne, forsåpningen av esterne eller sulfateringene, gjennomføres ved å anvende de generelle metoder i det etter-følgende på de passende mellomprodukter.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen syntetiseres i henhold til de forskjellige fremstillingene som beskrevet i det etter-følgende.

FREMSTILLING 1

6-0-tert-butyldimetylsxlyl-l,2-0-isopropyliden-3-0-metyl-a-D-glukofuranose (2)

Diolen 1 (10 g, 42,7 mmol) tas opp i vannfritt diklormetan (100 ml) og tert-butyl-dimetylsilylklorid (7,1 g, 47,3 mmol) og imidazol (5,8 g, 85,3 mmol) tilsettes. Reaksjonsblandingen omrøres ved romtemperatur. Etter 2 timer fortynnes blandingen i diklormetan og vaske med vann. Den organiske fase tørkes over magnesiumsulfåt og konsentreres, og resten renses ved kromatografi på en silikagelkolonne (1/9 volum/- volum etylacetat/cykloheksan) til å gi det ønskede produkt 2 (11,9 g, 80%) i form av en sirup.

[o]D -34° (c=l,9, CHC13) .

FREMSTILLING 2

6-O-tert-butyldimetylsilyl-l,2-0-isopropyliden-3-0-metyl-5-C-vinyl-a-D-glukofuranose (4)

Oksalylklorid (3,2 ml, 36,8 mmol) og dimetylsulfoksyd (5,2 ml, 73,4 mmol) tilsettes, ved -78°C, til vannfritt diklormetan (40 ml) og blandingen omrøres i 30 minutter. Deretter tilsettes forbindelse 2 (6,4 g, 18,4 mmol) og blandingen om-røres i ytterligere 1 time. Deretter tilsettes trietylamin (15,3 ml, 110,0 mmol) og etter 3 0 minutter fortynnes reaksjonsblandingen i diklormetan. En standard bearbeiding gir pentuloseforbindelsen (3), som anvendes direkte i den etter-følgende reaksjon. Det urene keton 3 tas opp i vannfritt tetrahydrofuran {10 0 ml) og en IM oppløsning av vinylmagne-siumbromid i tetrahydrofuran (28 ml, 27,6 mmol) tilsettes ved 0°C. Etter 1 time fortynnes reaksjonsblåndingen, men ikke med ammoniumklorid, og vaskes med vann. Den organiske fase tørkes over magnesiumsulfat og konsentreres, resten renses ved kromatografi på en silikagelkolonne (1/9 volum/volum etylacetat/cykloheksan) til å gi den ønskede forbindelse 4 (70%, 4,8 g) i form av en sirup.

[a]D -40° (c=l,3, CHC13).

Anal. beregnet: C 57,72, H 9,15. Funnet: C 57,77, H 9,23.

FREMSTILLING 3

1,2,4,6-tetra-0-acetyl-3-0-metyl-5-C-vinyl-p-D-glukopyranose

(6)

Forbindelse 4 (3,5 g, 9,4 mmol) tas opp i vann (50 ml), IR-12 0 harpiks (l g) tilsettes dertil og blandingen oppvarmes ved 8 0°C i 6 timer. Harpiksen avfiltreres og filtratet konsentreres . Det urene produkt 5 acetyleres ved anvendelse av eddiksyreanhydrid (12 ml) og pyridin (13 ml) . Overskuddet av eddiksyreanhydrid ødelegges med metanol og løsningsmidlene konsentreres. Resten ekstraheres med vann og diklormetan. Den organiske fase tørkes over magnesiumsulfat, konsentreres og, etter rensing ved kromatografi på en kolonne av silikagel (3/2 volum/volum etylacetat/cykloheksan), oppnås tetraacetatet 6 i form av et faststoff (75%, 2,7 g) , s.m.p. = 50°C.

[a]D -84° (c=l,6, CHC13) .

Anal. beregnet: C 52,47, H 6,19. Funnet: C 52,51, H 6,19. CI-MS: 406 (M + NH4) , 389 (M + l) .

FREMSTILLING 4

Metyl-2,3,6-tri-0-benzyl-4-0-(2,4,6-tri-0-acetyl-3-0-metyl-5-C-vinyl-p-D-glukopyranosyl)-a-D-glukanosid (8).

Forbindelse 6 (1,6 g, 4,1 mmol) og forbindelse 7 (2,1 g, 4,5 mmol) (P.J. Garegg og H. Hultberg, Carbohydr. Res. 1981, 93, CIO) oppløses i vannfritt diklormetan (50 ml) og molekylsiler (4,0 g) tilsettes. Reaksjonsblandingen omrøres ved romtemperatur i 1 time og TMSOTf (0,95 ml, 5,2 mmol) tilsettes deretter ved -78°C. Reaksjonsblandingen får deretter stå for forsiktig oppvarming til romtemperatur. Etter 2 timer nøy-traliseres reaksjonsblandingen med trietylamin og filtreres gjennom Celite, filtratet vaskes med vann. Den organiske fase tørkes over magnesiumsulfat og konsentreres, og resten renses ved kromatografi på silikagel (4/1 volum/volum etylacetat/- cykloheksan) til å gi den ønskede forbindelse 8 (2,77 g, 8 5%) i form av et faststoff. S.m.p. = 47°C.

[o]D -36° (c=0,6, CHC13) .

Anal. beregnet: C 65,14, H 6,61. Funnet: C 65,09, H 6,70.

FREMSTILLING 5

Metyl-2,3,6-0-tri-0-benzyl-4-0-(4,6-0-isopropyliden-3-0-metyl-5-C-vinyl-p-D-glukopyranosyl)-o-D-glukopyranosid (10).

Forbindelse 8 (2,7 g, 3,4 mmol) oppløses i metanol (40 ml). Natrium (katalytisk) tilsettes ved 0°C og blandingen omrøres ved romtemperatur i 3 timer. Løsningsmiddelet konsentreres og resten 9 tas opp i vannfritt aceton (40 ml) og 2,2-dime-toksypropan (2 ml) og p-toluensulfonsyre (katalytisk) tilsettes. Reaksjonsblandingen omrøres ved romtemperatur over natten. Løsningsmiddelet avdampes og resten tas opp i kloroform og vaskes med vann. Den organiske fase tørkes over magnesiumsulfat og konsentreres og resten renses ved kromatografi på en silikakolonne (1/1 volum/volum etylacetat/- cykloheksan) til å gi 4<1>,6'-isopropyliden-O-derivatet 10 (1,7 g, 70%) i form av et faststoff. S.m.p. = 55°C.

[a]D -13° (c = 0,8, CHCI3) .

Anal. beregnet: C 67,97, H 7,13. Funnet: C 67,87, H 7,16. CI-MS: 707 (M + 1), 724 (M + NH4) .

FREMSTILLING 6

Metyl-2,3,6-tri-0-benzyl-4-0-{4,6-0-isopropyliden-3-0-metyl-5-C-vinyl-p-D-mannopyranosyl)-a-D-glukopyranosid (12).

Oksalylklorid (0,35 ml, 4,0 mmol) og vannfritt DMSO (0,57 ml, 8,0 mmol) omrøres i vannfritt diklormetan (10 ml) ved -78°C i 30 minutter. Forbindelse 10- (1,4 g, 2,0 mmol) i vannfritt diklormetan (10 ml) tilsettes til oppløsningen og omrøring fortsettes i ytterligere 45 minutter. Reaksjonsblandingen nøytraliseres ved tilsetning av vannfritt trietylamin (1,7 ml, 12,0 mmol) og fortynnes deretter med diklormetan. Etter vasking med vann tørkes den organiske fase over magnesiumsulfat og konsentreres og resten 11 anvendes direkte i den etterfølgende reaksjon uten rensing. Ketonet 11 tas opp i vannfritt tetrahydrofuran (15 ml) og en IN oppløsning av superhydrid i tetrahydrofuran (4 ml, 4,0 mmol) tilsettes ved -78°C. Reaksjonsblandingen omrøres ved romtemperatur i 1 time og 5% natriumhydroksyd (2 ml) og hydrogenperoksyd (1 ml) tilsettes deretter. Løsningsmiddelet avdampes og resten tas opp i etylacetat og vaskes med vann. Den organiske fase tørkes over magnesiumsulfat og konsentreres og resten renses ved kromatografi (2/1 volum/volum etylacetat/cykloheksan) til å gi forbindelse 12 (1,0 g, 70%).

[ec]D -11° (c=0,5, CHC13) .

CI-MS: 724 (M + 18), 707 (M + 1).

FREMSTILLING 7

Metyl-2,3,6-tri-0-benzyl-4-0-(2-0-acetyl-3-0-metyl-5-C-vinyl-p-D-manriopyranosyl)-o-D-glukopyranosid (14) .

Forbindelse 12 (940 mg, 1,3 mmol) oppløses i pyridin (3 ml)

og eddiksyreanhydrid (0,3 ml) tilsettes. Reaksjonsblandingen omrøres ved romtemperatur i 3 timer. Overskudd av pyridin og eddiksyreanhydrid konsentreres og resten 13 anvendes direkte for avbeskyttelsen av isopropyliden ved anvendelse av 8 0% eddiksyre (5 ml) ved 60°C i 2 timer. Overskuddet av eddiksyre avdampes og resten renses ved kromatografi på en silikagelkolonne (4/1 volum/volum etylacetat/cykloheksan) til å gi diolen 14 (660 mg, 70%) i form av et faststoff. S.m.p. = 53°C.

[<X]D -10° ■ (C=0, 8, CHCl3) .

CI-MS: 709 (M + 1), 726 (M +18).

FREMSTILLING 8

Metyl-2,3,6-tri-0-benzyl-4-0-(2-0-acetyl-3-0-metyl-6-0-tosyl-5-C-vinyl-p-D-mannopyranosyl)-a-D-glukopyranose (15).

Forbindelse 14 {600 mg, 0,9 mmol) oppløses i pyridin [3 ml) og tosylklorid (240 mg, 1,3 mmol) tilsettes. Reaksjonsblandingen omrøres ved romtemperatur i 3 timer. Løsnings-midlet avdampes og resten fortynnes med kloroform og vaskes med vann. Den organiske fase tørkes over magnesiumsulfat og konsentreres, resten renses ved kromatografi på en silikagelkolonne' (l/l volum/volum etylacetat/cykloheksan) til å gi tosylforbindelsen 15 (297 mg, 80%) i form av en sirup.

[a]D -26° (c=0,8, CHCl-j) .

FREMSTILLING 9

Metyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-O-(2,6-anhydro-3-0-metyl-5-C-vinyl-p-D-mannopyranosyl)-a-D-glukopyranosid (16).

Forbindelse 15 (550 mg, 0,6 mmol) tas opp i etanol (3 ml) og 0,IN av en etanolisk natriumhydroksydoppløsning (5 ml) tilsettes deretter. Reaksjonsblandingen oppvarmes ved 70°C i 3 timer og nøytraliseres deretter med en IR-120 harpiks (H+ form) og filtreres gjennom Celité. Etter konsentrering renses resten ved kromatografi på en silikagelkolonne (l/l volum/volum etylacetat/cykloheksan) til i gi forbindelse 16 {292 mg, 70%) i form en sirup.

[ a]D +13° (c=0,5, CHC13).

CI-MS: 666 (M + 18).

FREMSTILLING 10

Metyl-2,3,6-tri-0-benzyl-4-0-(benzyl-3-0-metyl-2-0-5-C-metyliden-o-L-idopyranuronat)-a-D-glukopyranosid (17)

Forbindelse 16 (260 mg, 0,4 mmol) oppløses i diklormetan (20 ml), oppløsningen omrøres ved -78°C og ozon bobles deretter gjennom blandingen i 30 sekunder. Oppløsningen går over til en blek gulfarge. Dimetylsulfid tilsettes til oppløsningen og reaksjonsblandingen vaskes deretter med vann. Den organiske fase tørkes over magnesiumsulfat og konsentreres og den etterfølgende reaksjon gjennomføres direkte uten ytterligere rensing. ■ Det urene aldehyd tas opp i tert-butanol (16 ml) og 2-metyl-2-buten (5 ml) og vannet (16 ml) tilsettes. NaH2P04 (700 mg) og NaC102 (700 mg) tilsettes deretter påfølgende til blandingen. Suspensjonen omrøres kraftig ved romtemperatur over natten, fortynnes med vann og ekstraheres med etylacetat. Den organiske fase tørkes over magnesiumsulfat og konsentreres og den påfølgende reaksjon gjennomføres direkte. Den urene syre tas opp i dimetylformamid (25 ml) og tetra-butylammoniumjodid (0,7 g, 2,0 mmol), kaliumbikarbonat (0,25 g, 2,5 mmol) og benzylbromid (0,250 ml, 2,1 mmol) tilsettes. Reaks jonsblandingen omrøres ved romtemperatur i 5 timer.. Reaksjonsblandingen ekstraheres med vann og dietyleter. Eterfasen tørkes over magnesiumsulfat og konsentreres og resten renses ved kromatografi på en silikagelkolonne (2/1 volum/volum etylacetat/cykloheksan) til å gi derivatet 17 (236 mg, 80%) i form av en sirup.

CI-MS: 774 (M + 18).

FREMSTILLING 11

Metyl-O- (6-0-acetyl-2 ,3,4-tri-O-metyl-a-D-glukopyranosyl) -

(1-4) -O-(benzyl-2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranosyluronat)-(1-4)-O-(3,6-di-0-acetyl-2-0-benzyl-o-D-glukopyranosyl)-(1-4)-O-(2,6-anhydro-5-C-benzyloksykarbonyl-3-0-metyl-p-D-mannopyranosyl)-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzyl-o-D-glukopyranbsid (19)

Imidatet 18 (Van der Heijden et al., abstr. 9th Eur. Carbohydr. Symp. Utrecht, 6-11 juli, 1997, A74, s 154) (81 mg, 78,2 /imol) akseptoren 17 (65 mg, 86,0 /imol) og fine molekylsiler (70 mg, 4 Å) omrøres i en 1/2 (volum/volum) diklormetan/dietyleterblanding (2,4 ml) under en inert atmosfære.

Reaksjonsblandingen omrøres i 3 0 minutter og NaHC03 tilsettes deretter til nøytraliseringspunktet. Etter filtrering og konsentrering renses resten på en kolonne av Sephadex LH 2 0 gel (l/l volum/volum diklormetan/etanol) og deretter på en silikagelkolonne (1/1 (volum/volum) etylacetat/cykloheksan) tii å gi forbindelse 19 (86 mg, 67%) .

Ia]D +66°(c=l,0, CH2<C>H2).

<1>1H NMR er gitt i tabell l i det etterfølgende.

FREMSTILLING 12

Metyl-O- (2 , 3 , 4-tri-O-metyl-a-D-glukopyranosyl) - (1-4) -O- (2 , 3-di-O-metyl-p-D-glukopyranosyluronsyre)-(1-4)-O-(a-D-glukopyranosyl) - (1-4) -O- (2 , 6-anhydro-5-C-karboksy-3-0-metyl-p-D-mannopyranosyl)- (1-4)-a-D-glukopyranosid (20).

I henhold til M. Petitou og CA.A. van Boeckel, Progress in the Chemistry of Organic Natural Products, publisert av W. Herz et al., Vienne, Springer-Verlag, New York, 1992, 143-210.

En oppløsning av forbindelse 19 (49 mg, 30,0 /imol) i eddiksyre (3 ml) omrøres under hydrogen (3,5 MPA) i 12 timer ved 40°C i nærvær av 5% palladium på trekull (73 mg, 35 b). Blandingen filtreres gjennom Celite, konsentreres og kodes-tilleres med vann (4x5 ml). Resten oppløses i en vandig IM NaOH oppløsning (3 ml) og oppvarmes ved 55°C i 3 timer. Oppløsningen avkjøles og føres gjennom en Sephadex 625 F kolonne (170 ml) eluert med vann. Fraksjoner som inneholder forbindelse 20 føres gjennom en kolonne av Dowex H+ harpiks. Eluatet konsentreres til å gi forbindelse 20 (25 mg, 86%) .

[cc]D +105° (c 1,0, H2<0>)

<X>H NMR er gitt i tabell 1 i det etterfølgende.

FREMSTILLING 13

Metyl-O-(4,6-0-isopropyliden-2,3-di-0-metyl-5-C-vinyl-p-D-glukopyranosyl)-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzyl-a-D-glukopyranosid (22) .

Natriumhydrid (0,31 g, 13,0 mmol) tilsettes ved 0°C til en oppløsning av metyl-O-(4,6-0-isopropyliden-3-O-metyl-5-C-vinyl-p-D-glukopyranosyl) - (1-4) -2,3, 6-tri-O-benzyl-ec-D-glukopyranosid (10) (6,11 g, 8,65 mmol) og metyljodid (0,80 ml, 13,0 mmol) i N,N-dimetylformamid (9,00 ml). Blandingen får stå med omrøring i 2 timer (TLC), metanol tilsettes og reaksjonsblandingen helles inn i vann. Denne blanding ekstraheres med etylacetat og ekstraktene vaskes med vann, tørkes og konsentreres. Resten renses på en silikakolonne (3/2 (volum/volum) cykloheksan/dietyleter) til å gi 22 (5,92 g, 88%).

TLC: Rf = 0,28, (3/2 (volum/volum) cykloheksan/dietyleter).

FREMSTILLING 14

Metyl-O-(4,6-0-isopropyliden-2,3-di-0-metyl-5-C-etyl-p-D-glukopyranosyl)-(1-4)- 2, 3,6-tri-O-benzyl-o-D-glukopyranosid (23) .

Platinaoksyd (160 mg) tilsettes til én oppløsning av 22 (5,80 g, 8,04 mmol) i etylacetat (400 ml). Hydrogen innføres. Blandingen får stå méd omrøring i 40 minutter (TLC), filtreres og avdampes til å gi 23.

TLC: Rf = 0,60, (4/1 (volum/volum) toluen/etylacetat).

FREMSTILLING 15

Metyl-O-(2,3-di-0-metyl-5-C-etyl-p-D-glukopyranosyl)-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzyl-a-D-glukopyranosid (24).

Den urene forbindelse 23 oppløses i 70% eddiksyre (60 ml) og omrøres ved 8 0°C i 2 timer. Blandingen konsentreres under vakuum og koavdampes med toluen til å gi 24.

TLC: Rf = 0,52, (4/1 (volum/volum) diklormetan/metanol).

FREMSTILLING 16

Metyl-O-(benzyl-2,3-di-0-metyl-5-C-etyl-p-D-glukopyranosyl-uronat)-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzyl-o-D-glukopyranosid (25). 2 , 2, 6, 6-tetrametyl-l-piperidyloksy (17,5 mg),, natriumhydro-genkarbonatoppløsning (17,5 ml), kaliumbromid (87 mg) og tetrabutylammoniumklorid (115,5 mg) tilsettes til en opp-løsning av forbindelse 24 (5,75 g) i tetrahydrofuran (28 ml). Blandingen avkjøles til 0°C og en blanding av en mettet natriumkloridoppløsning (17 ml), en mettet natriumhydrogen-karbonatoppløsning (8,70 ml) og natriumhypokloritt (1,3 M, 20 ml) tilsettes i løpet av 15 minutter. Etter omrøring i 1 time fortynnes blandingen med vann og ekstraheres (3 ganger) med diklormetan. Den organiske fase vaskes med en vandig natriumkloridoppløsning, tørkes over magnesiumsulfat, filtreres og avdampes til tørrhet til å gi det urene syrederivat.

Syrederivatet oppløses i N,N-dimetylformamid (107 ml) under en nitrogenatmosfære. Kaliumhydrogenkarbonat (4,10 g) og benzylbromid (9,70 ml) tilsettes og blandingen omrøres i 16 timer. Etylacetat og vann tilsettes, og etter ekstrahering, konsentreres den organiske fase. Rensing ved kromatografi på en silikagelkolonne gir 3,81 g av forbindelse 25 (60% utbytte fra forbindelse 23).

[ce]d +24° (c = 0,15, diklormetan).

FREMSTILLING 17

Metyl-O-(benzyl-5-C-etyl-4-0-levulinyl-2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranosyluronat)-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzyl-a-D-glukopyranosid (26) .

Forbindelse 25 (3,51 g, 4,46 mmol) oppløses i vannfritt dioksan (45 ml). Levulinsyre (1,00 g, 8,93 mmol), l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidhydroklorid (1,70 g, 8,93 mmol) og 4-dimetylaminopyridin (0,11 g, 8,93 mmol) tilsettes . Blandingen får stå med omrøring i 16 timer og ekstraheres med etylacetat. Ekstraktene vaskes påfølgende med en vandig 5% .kaliumhydrogensulfatoppløsning, med vann, med en mettet vandig natriumhydrogenkarbonatoppløsning og med vann, tørkes og konsentreres. Resten renses på en kolonne av silika (2/1 og deretter 3/2 (volum/volum) cykloheksan/- etylacetat) til å gi ren 26 (3,64 g, 85%).

[ec]D +26° (c = 0,9, diklormetan).

FREMSTILLING 18

O-(benzyl-5-C-etyl-4-0-levulinyl-2,3-di-O-metyl-p-D-gluko-pyranosyluronat)-(1-4)-1,3,6-tri-0-acetyl-2-0-benzyl-D-gluko-pyranose (27).

Forbindelse 26 (3,35 g, 3,78 mmol) oppløses i eddiksyreanhydrid (22 ml). Oppløsningen avkjøles til -2 0°C og 22 ml av en kald oppløsning av svovelsyre i eddiksyreanhydrid (1 ml svovelsyre i 10 ml eddiksyreanhydrid) tilsettes. Blandingen fortynnes med etylacetat, vaskes med en mettet vandig natri-umhydrogenkarbonatoppløsning, med vann, tørkes og konsen-' treres. Resten renses på en silikakolonne (l/l (volum/volum) cykloheksan/etylacetat) til å gi 27 (2,20 g, 65,5%).

TLC: Rf = 0,24 (l/l (volum/volum) cykloheksan/etylacetat).

FREMSTILLING.19

O-(benzyl-5-C-etyl-4-0-levulinyl-2,3-di-O-metyl-p-D-gluko-pyranosyluronat)-(1-4)-3,6-di-0-acetyl-2-0-benzyl-D-gluko-pyranose (28).

Benzylamin (11 ml, 101,4 mmol) tilsettes til en oppløsning av forbindelse 27 (2,18 g, 2,67 mmol) i tetrahydrofuran (50 ml). Blandingen får stå med omrøring i 4 timer. Den ekstraheres med etylacetat og ekstraktene vaskes med en vandig IM salt-syreoppløsning (102 ml) og med vann, tørkes og konsentreres. Resten renses på en silikakolonne (l/l (volum/volum) toluen/- etylacetat) til å gi en blanding (a/p = 50/50) av forbindelse 28 (1,33 g, 65%). TLC: Rf = 0,22 (l/l (volum/volum) toluen/etylacetat).

FREMSTILLING 20

O-(benzyl-5-C-etyl-4-0-levulinyl-2,3-di-O-metyl-p-D-gluko-pyranosyluronat) - (1-4) -3,6, di-O-acetyl-2-O-benzyl-D-gluko-pyranosyltrikloracetimidat (29).

Forbindelse 28 (1,32 g, 1,71 mmol) oppløses i diklormetan (34 ml) og trikloracetonitril (0,87 ml, 8,50 mmol) og cesiumkar-bonat (0,90 g, 2,73 mmol) tilsettes under argon. Blandingen får stå med omrøring i 2 timer (TLC) og filtreres. Resten renses på en silikakolonne (3/2 (volum/volum) cykloheksan/- etylacetat) til å gi en blanding (a/p =.85/15) av imidater 29 '(1,20 g, 77%) .

TLC: Rf = 0,36 (1/2 (volum/volum)cykloheksan/etylacetat).

FREMSTILLING 21

Metyl-O-(benzyl-5-C-etyl-4-0-levulinyl-2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranosyluronat)-(1-4)-O-(3,6-di-0-acetyl-2-O-benzyl-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-O-(2,6-anhydro-5-C-benzyloksy-karbonyl-3-O-metyl-p-D-mannopyranosyl)-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzyl-a-D-glukopyranosid (30).

En oppløsning av tert-butyldimetylsilyltriflat i diklormetan(lM, 0,19 ml) tilsettes, under argon ved -20°C, til en oppløsning av imidatet 29 (1,19 g, 1,29 mmol) og metyl-2,3,6-tri-0-benzyl-4-(benzyl-3-0-metyl-2-0-5-C-metyliden-a-L-ido-pyranuronat)-a-D-glukopyranosid 17 (1,02 g, 1,35 mmol) i toluen (40 ml) i nærvær av 4 Å molékylsiler (1,93 g). Etter 30 minutter (TLC), tilsettes igjen en tert-butyldimetylsilyl-trif latoppløsning i diklormetan (IM, 0,19.ml). Etter 30 minutter (TLC), tilsettes fast natriumhydrogenkarbonat. Oppløsningen filtreres, vaskes med vann, tørkes og avdampes til tørrhet. Resten renses ved kolonnekromatografi på Sephadex LH20 og deretter.på en silikakolonne (2/1 (volum/- volum) toluen/etylacetat) til å gi det rene tetrasakkarid 30-a (l,14 g, 58%).

[a]D +47° (c = 0,21, diklormetan).

FREMSTILLING 22

Metyl-O- (benzyl-5-C-etyl-2, 3-di-O-roetyl-p-D-glukopyranosyl-uronat) -(1-4)-O-(3,6-di-0-acetyl-2-0-benzyl-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-O-(2,6 anhydro-5-C-benzyloksykarbonyl-3-0-metyl-p-D-mannopyranosyl) - (1-4) -2,3, 6-tri-O-benzyl-a-D-glukopyranosid (31) .

Forbindelse 30 (1,13 g, 0,75 mmol) oppløses i en 2/1 (volum/- volum) étanol/toluenblanding (150 ml) og hydrazinacetat (0,35 '. g, 3,73 mmol) tilsettes. Blandingen får stå med omrøring i l time (TLC) og konsentreres. Resten renses på en silikakolonne (3/2 (volum/volum) toluen/etylacetat) til å gi 31 (0, 816 g, 83 %) .

[k]d +35° (c = 1,01, diklormetan).

FREMSTILLING 23

Metyl-O-(6-0-acetyl-2,3,4-tri-O-metyl-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-O-(benzyl-5-C-etyl-2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranosyl-uronat)-(1-4)-O-(3,6-di-0-acetyl-2-0-benzyl-a-D-glukopyranosyl) -(1-4)-O-(2,6-anhydro-5-C-benzyloksykarbonyl-3-0-metyl-p-D-mannopyranosyl)-(1-4)-2,3,6-tri-O-benzyl-a-D-glukopyranosid (33) .

'6-0-acetyl-2,3,4-tri-O-metyl-D-glukopyranosetrikloracetimidat 32 (34,7 mg, 0,0245 mmol) (P. Westerduin et al. BioOrg-. Med. Chem., 1994, 2, 1267) og glykosylakseptoren 31 (80 mg, 0,056 mmol) behandles i henhold til fremstilling 21. Forbindelsen renses på en Sephadex LH-20 kromatografikolonne (1/1 (volum/volum) diklormetan/etanol) og deretter på en silikakolonne (3/2 (volum/volum) diisopropyleter/etylacetat) til å gi derivatet 33 (54,6 mg, 58%).

[a]D +55° (c = 1, diklormetan).

FREMSTILLING 24

Metyl-O- (6-0-acetyl-2 , 3,4-tri-O-metyl-a-D-glukopyranosyl) -

(1-4)-O-(5-C-etyl-2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranosyluronsyre)-(1-4) -O-(3,6-dx-O-acetyl-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-O-(2,6-

anhydro-S-C-karboksy-3-O-metyl-p-D-mannopyranosyl)-(1-4) -a-D-glukopyranosid (34) .

En oppløsning av forbindelse 33 (40 mg, 0,024 mmol) i eddiksyre (2 ml) omrøres under en hydrogenatmosfære i nærvær av 10% palladium på trekull (80 mg) i 16 timer og filtreres. Filtratet konsentreres til å gi forbindelse 34.

FREMSTILLING 25

Metyl-O-(2,3,4-tri-O-metyl-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-O-(5-C-etyl-2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranosyluronsyre)-(1-4)-O-(a-D-glukopyranosyl)- (1-4)-O-(2,6-anhydro-5-C-karboksy-3-0-metyl-p-D-mannopyranosyl)-(1-4)-a-D-glukopyranosid (35).

En vandig 5M natriumhydroksydoppløsning (216 fil) tilsettes til en oppløsning av den urene forbindelse 34 i metanol (866 /il) . Etter 2 5 timer innføres vann og reaks jonsblandingen føres gjennom en kolonne av Sephadex G-25 gel (2 x 38 cm) eluert med vann. Eluatet konsentreres, føres gjennom en Dowex 50 H+ kolonne (2 ml) og frysetørkes. På dette trinn anvendes -"-H NMR for å undersøke om alle beskyttelsesgruppene er blitt fjernet.

EKSEMPEL 1

Metyl-O-(2,3,4-tri-O-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-0-(2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranosyluronsyre)-(1-4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-O-(2,6-anhydro-S-C-karboksy-3-O-metyl-p-D-mannopyranosyl)-(1—4)-2,3,6-tri-O-.sulfo-a-D-glukopyranosid-natriumsalt (21) .

I henhold til CA.A. van Boeckel og M. Petitou, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1993, 32, 1671-1690.

En oppløsning av forbindelse 20 (20 mg, 20,7 /imol) og av trietylamin/svoveltrioksydkompleks (164 mg, 0,90 /miol) i dimetylformamid (2 ml) oppvarmes ved 55°C, beskyttet mot lys, i 18 timer og 3 0 minutter. Reaksjonsblandingen avkjøles til romtemperatur og fortynnes deretter med en vandig 0,2M NaCl oppløsning. Oppløsningen anbringes deretter på toppen av en kolonne av Sephadex G-25 F (170 ml) eluert med en vandig 0,2M NaCl oppløsning.

Fraksjoner som inneholdt pentasakkåridet konsentreres og avsaltes ved anvendelse av den samme kolonne eluert med vann. Etter frysetørking oppnås forbindelse 21 (30,5 mg, 85%).

[o]D +49° (c = 0,63, H20) .

<1>H NMR er gitt i tabell 2 i det etterfølgende.

EKSEMPEL 2

Metyl-O-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4) -O- (5-C-etyl-2 , 3-di-O-metyl-p-D-glukopyranosyluron.syre) -

(1-4) -O- (2,3, 6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl) - (1-4) -O- (2 , 6-anhydro-5-C-karboksy-3-0-metyl-p-D-mannopyranosyl)-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranosidnatriumsalt (36).

Trietylamin/svoveltrioksydkompleks (91 mg) tilsettes til en oppløsning av den urene forbindelse 35 i dimetylformamid (1,3 ml) . Etter 20'timer ved 55°C anbringes oppløsningen på toppen av en kolonne av Sephadex G-25 (2 x 38 cm) eluert med 0,2M natriumklorid. Fraksjoner som inneholder produktet' konsentreres og avsaltes ved anvendelse av den samme kolonne eluert med vann. Forbindelse 36 oppnås etter frysetørking (21,9 mg, 52% fra forbindelse 33).

<1>H NMR er gitt i tabell 3 i det etterfølgende

Ved å gå frem som i eksempel 1 og 2 i det foregående, fremstilles forbindelser 37 til 40 i eksempler 3 til 6 i det etterfølgende. ^-H NMR spektrene som oppnås for disse forbindelser er i overensstemmelse med konfigurasjonene indikert under.

EKSEMPEL 3

Metyl-O-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-O-(2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranosyluronsyre)-(1-4)-0-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-O-(2,6-anhydro-5-C-karboksy-3-0-metyl-p-D-mannopyranosyl)-(1-4)-2-O-sulfo-3,6-di-O-metyl-a-D-glukopyranosidnatriumsalt (37).

[ a] D +51° (c = 0,48, vann).

EKSEMPEL 4

Metyl-O-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-O-(2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranosyluronsyre)-(1-4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-O-(2,6-anhydro-

5-C-karboksy-3-0-metyl-p-D-mannopyranosyl)-(1-4)-2,3-di-O-sulfo-6-O-metyl-a-D-glukopyranosidnatriumsalt (38).

[ct]D +57° (c = 0,28, vann).

EKSEMPEL 5

Metyl-O-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-O-(2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranosyluronsyre)-(1-4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-O-(2,6-anhydro-5-C-karboksy-3-0-metyl-p-D-mannopyranosyl)-(1-4)-2,6-di-O-sulfo-3-O-metyl-a-D-glukopyranosidnatriumsalt (39).

[a]D +53° (c = 0,3, vann).

EKSEMPEL 6

Metyl-O-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4) -O- (2 , 3-di-O-metyl-p-D-glukopyranosyluronsyre) - (1-4) -O-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-O-(2,7-anhydro-5-C-karboksy-6-deoksy-3-O-metyl-p-D-mannoheptopyranosyl)-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranosidnatriumsalt (40).

[a]D 49° (c = 0,25, vann).

Claims

l. Pentasakkarid i syreform og de farmasøytiske aksepterbare salter derav,

karakterisert ved at den anioniske form derav har formelen:

hvor.:

R representerer hydrogen eller en -S03" gruppe,

(C1-C3)alkylgruppe eller (C2-C3)acylgruppe,

T representerer hydrogen eller en etylgruppe,

n representerer 1 eller 2.
2. Pentasakkarid som angitt i krav 1,

karakterisert ved at det er i form av natrium-saltet eller kaliumsaltet.
3. Pentasakkarid som angitt i krav 1 eller 2,

karakterisert ved at det er valgt fra: • Metyl-O-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-0-(2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranosyluronsyre)- (1-4)-0-(2,3,4-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-0-(2,6-ånhydro-5-C-karboksy-3-0-metyl-p-D-mannopyranosyl)-(1-4)-(2,3,6-tri-0-sul t fo- ta-D-glukopyranosid-natriumsalt, • Metyl-O-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-0-(5-C-etyl-2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranosyluron-syre)-(1-4)-0- (2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-0-(2,6-anhydro-5-C-karboksy-3-0-metyl-p-D-manno-pyranosyl)-(1-4)-2,3,6-tri-0-sulfo-a-D-glukopyranosid-natriumsalt, • Metyl-O-(2,3,4-tri-0-metyl-6-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-0-(2,3-di-0-metyl-p-D-glukopyranosyluronsyre)- (1-4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-0-(2,6-anhydro-5-C-karboksy-3-0-metyl-p-D-mannopyranosyl)-(1-4)-2-0-sulf o-3 , 6-di-O-metyl-a-D-glukopyranosidnatriumsalt, • Metyl-O-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-0-(2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranosyluronsyre)-(1-4)-0-(2 , 3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-0-(2,6-anhydro-5-C-karboksy-3-0'-metyl-p-D-mannopyranosyl) - (1-4) - 2,3-di-0-sulfo-6-0-metyl-a-D-glukopyranosidnatriumsalt, • Metyl-O-(2,3,4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4) -0-(2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranosyluronsyre)-(1-4)-0-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-0-(2,6-anhydro-5-C-karboksy-3-0-metyl-p-D-mannopyranosyl)-(1-4)-2,6-di-O-sulfo-3-0-metyl-a-D-glukopyranosidnatriumsalt, • Metyl-O- (2, 3 , 4-tri-0-metyl-6-0-sulfo-a-D-gl-ukopyranosyl) - (1-4)-O-(2,3-di-O-metyl-p-D-glukopyranosyluronsyre)-(1-4)-0-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(1-4)-0-(2,7-anhydro-5-C-karboksy-6-deoksy-3-0-metyl-p-D-mannohep to-pyranosyl)-(1-4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranosid-natriumsalt.
4. Farmasøytisk preparat,

karakterisert ved at det som aktivt prinsipp inneholder et pentasakkarid som angitt i et eller flere av kravene 1 til 3, i form av et. salt med en farmasøytisk aksepterbar base eller i syreform, kombinert med eller blandet med en farmasøytisk aksepterbar, ikke giftig inert eksipiens.
5. Farmasøytisk preparat som angitt i krav 4, karakterisert ved at det er i form av dose-ringsenheter hvor det aktive prinsipp er blandet med minst en farmasøytisk eksipiens.
6. Preparat som angitt i krav 5,

karakterisert ved at hver doseringsenhet inneholder fra 0,1 til 100 mg aktivt prinsipp.
7. Preparat som angitt i krav 6,

karakterisert ved hver doseringsenhet inneholder fra 0,5 til 50 mg aktivt prinsipp.
8. Anvendelse av polysakkaridet som angitt i krav 1 til 3 for fremstilling av en medisin som er anvendbar i patologier forbundet med en koagulasjons-dysfunksjon.