ITMI970678A1 - Glicosaminoglicani aventi elevata attivita' antitrombotica - Google Patents

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Benito Casu
Annamaria Naggi
Giangiacomo Torri
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Description

TECNICA ANTERIORE
L ' eparina è un polisaccaride estratto da organi animali , impiegato da oltre cinquanta anni come agente anticoagulante ed antitrombotico. Insieme all'eparansolfato, essa appartiene alla famiglia dei glicosaminoglicani, costituiti da sequenze alternate di un acido uronico (iduronico o glucuronico) e di glucosamina, variamente solfatate a seconda del tessuto e della specie animale da cui sono stati ottenuti e, in una certa misura, anche dei processi di isolamento.
La struttura dell'eparina può essere rappresentata in termini statistici dalla formula (I)
dove le unità U rappresentano l'acido iduronico (IdoA) o glucuronico (GlcA) e le unità A rappresentano la glucosamina N-solfata (GlcNAc); R2, R3 ed Rg rappresentano gruppi solfato o idrogeno ed R' rappresenta SO^ oppure Ac.
Le sequenze maggiormente rappresentate nelle eparine impiegate in clinica sono quelle del disaccaride trisolfato (IdoA2S0^-GlcNSO^óSO^)- Per contro, una sequenza pentasaccaridica minore contenuta soltanto in circa un terzo delle catene che costituiscono le comuni eparine e caratterizzata da una unità glucosamminica solfata in posizione 3 (GlcNSO^SO^) e che costituisce il sito attivo dell'eparina e dell'eparansolfato per l 'antitrombina III è essenziale per l'espressione di attività anticoagulante ed antitrombotica significative. L'unità glucosamina 3~0-solfata è considerata il marker di detto sito attivo e l'attività antitrombotica, generalmente espressa dalla capacità di inibizione dei fattori di coagulazione X attivato (Xa) e trombina (Ila), è correiabile con il contenuto percentuale di detta unità nelle eparine.
Le proprietà anticoagulanti ed antitrombotiche dell'eparina e dell'eparansolfato sono modulate anche dalla lunghezza delle catene polisaccaridiche che li compongono. Ad esempio le eparine a basso peso molecolare (LMWH) hanno attività anticoagulante inferiore ma attività antitrombotica analoga a quella delle eparine tradizionali, e tendono a sostituire queste ultime in diverse applicazioni terapeutiche, specialmente per ridurre i rischi emorragici ed altri effetti collaterali dell’eparina, come la trombocitopenia. Inoltre, le LMWH sono caratterizzate da una migliore biodisponibilità rispetto alle eparine tradizionali quando vengono somministrate per via sottocutanea, come è comune nella prevenzione della trombosi venosa. (B. Casu Heparin structure. Hemostasis 20/1,66-73 (1990)); (D.A. Lane, J. Bjòrk, U. Lindall (Ed. s). Heparin and Related Polysaccharides, Plenum Press. New York, 1992).
Poiché, come sopra ricordato, le sequenze pentasaccaridiche dell'eparina maggiormente responsabili dell'attività antitrombotica sono contenute soltanto in circa un terzo delle catene epariniche naturali, è di interesse pratico potenziare detta attività concentrando le catene che contengono dette sequenze, oppure generando nuovi siti attivi sia nelle catene che già ne contengono uno, che in quelle prive di siti attivi. Il primo obbiettivo, conseguibile mediante cromatografia di affinità su antitrombina III oppure (meno efficacemente) mediante trattamento dell'eparina con resine cationiche, è tuttora considerato dispendioso, anche perchè non utilizza una parte consistente (circa due terzi) delle comuni eparine.
L'obiettivo di generare ulteriori siti attivi per l'antitrombina non è d'altra parte conseguibile mediante solfatazione dell'eparina con metodi classici, che portano a strutture nelle quali il sito attivo per l'antitrombina è mascherato da un eccesso di gruppi solfati. Anche se occasionalmente mostrano un' attività anticoagulante maggiore dell' eparina di partenza (per lo più attraverso meccanismi di azione diversi da quelli mediati dall' anti trombina ) , detti prodotti sono generalmente meno attivi dell 'eparina come antitrombotici , e possono comportare effetti collaterali indesiderabili a causa delle interazioni aspecifiche con altre proteine piasmatiche . [B . Casu , Structure and biological activity of heparin , Advances Carbohydr . Chem . Biochem. 43,51-134(1985)].
D'altra parte, tentativi di "ricostruire" le sequenze attive dell'eparina mediante risolfatazione di eparine parzialmente o completamente desolfatate porta a prodotti con attività antitrombotica ridotta, anziché potenziata. Ciò è dovuto, in particolare, alla tendenza delle unità iduroniche a solfatarsi in posizione 3 anziché in posizione 2, e/o ad insufficiente solfatazione in posizione 3 delle unità glucosamminiche. [R. N. Rej, K.G. Ludwig-Baxter, A.S. Perlin, Carbohydr. Res. 210,299_310 (1991)]·
SOMMARIO
E' stato ora trovato un processo che consente di ottenere glicosaminoglicani aventi elevata attività antitrombotica in vitro, contenenti almeno il 20% di unità iduroniche solfatate in posizione 2 e non solfatate in posizione 3 ed almeno il 30# di unità sulfaminoglucosaraminiche solfatate in posizione 3 e in posizione 6, ed aventi un rapporto molare solfati/carbossili compreso fra 2,0 e 3.5
Detto processo impiega come materiali di partenza vari tipi di glicosaminoglicani supersolfatati ed è caratterizzato dai seguenti stadi:
a) preparazione del sale di una base organica del glicosaminoglicano supersolfatato di partenza;
b) desolfatazione solvolitica parziale del sale della base organica dello stadio a);
c) N-risolfatazione del prodotto parzialmente desolfatato dello stadio b).
d) eventuale 6-0-risolfatazione del prodotto dello stadio c). Il prodotto ottenuto può essere impiegato come sostanza attiva nella preparazione di composizioni farmaceutiche atte al trattamento antitrombosi.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
Le caratteristiche ed i vantaggi dei glicosaminoglicani aventi elevata attività antitrombotica secondo la presente invenzione e del relativo processo di preparazione saranno maggiormente illustrati nel corso della seguente descrizione dettagliata.
Nel processo secondo la presente invenzione possono essere impiegati come materiali di partenza parecchi tipi di glicosaminoglicani supersolfatati ed in particolare possono essere impiegati: eparine supersolfatate a basso peso molecolare (ssLMWH), da 1.500 a 8.000 daltons, eparine supersolfatate ad alto peso molecolare, da 8.000 a 20.000 daltons, eparansolfati supersolfatati a basso peso molecolare, da 1.500 a 8.000 daltons, eparansolfati supersolfatati ad alto peso molecolare, da 8.000 a 25.000 daltons, eparansolfati ed eparine "biotecnologici" supersolfatati, epimerizzati e non epimerizzati, ottenuti dal polisaccaride K5 N-solfatato.
Come noto, i glicosaminoglicani supersolfatati sono glicosaminoglicani nei quali tutti gli idrogeni ossidrilici (o la maggioranza di questi) sono stati sostituiti con gruppi SO^-, e sono preparati secondo procedimenti descritti da vari autori (M.L. Wolfrom et al, J. Am. Chem. Soc. 75.1519 (1953): Nagasawa et al, Carbohydr. Res. I58, 183-190 (1986); EP 214,879 (1986); US Patent 4,727,063; Naggi et al, Biochem. Pharmacol. 36, 1895<_>1900 (1987); Ogamo et al, Carbohydr. Res. 193, 165-172 (1989)).
Il processo è realizzato secondo i seguenti stadi:
a) Preparazione del sale di una base organica del glicosaminoglicano supersolfatato di partenza, detta base organica essendo scelta tra piridina, tetrametilammonio e tetrabutilammonio.
Il glicosaminoglicano supersolfatato di partenza sotto forma di sale di sodio viene disciolto in acqua distillata e passato attraverso una colonna a scambio cationico.
Alla soluzione ottenuta viene aggiunta la base organica a temperatura ambiente ed in quantità tale da raggiungere pH 9 ottenendo il sale che viene poi liofilizzato.
b) Desolfatazione solvolitica parziale del sale dello stadio a). Il sale di base organica ottenuto nello stadio a) viene trattato con una soluzione di un solvente aprotico polare contenente metanolo o in percentuale variabile fra il 5 e il 10$, preferibilmente DMSO contenente il 10# di metanolo, con un rapporto in peso fra questa soluzione e detto sale di base organica da 50:1 a 100:1.
La soluzione ottenuta viene riscaldata sotto agitazione a temperatura compresa fra 50 e 90°C per un tempo compreso fra 5 e 480 minuti ottenendo la desolfatazione parziale di detto sale.
Alla miscela di reazione viene poi aggiunta acqua ed NaOH 0,25N fino a pH neutro ed il prodotto viene precipitato mediante aggiunta di EtOH saturato con acetato di sodio. Il prodotto viene poi dializzato attraverso membrane cut-off 2000 e desalato mediante gel filtrazione.
c) N-risolfatazione del prodotto ottenuto dallo stadio b).
Il prodotto ottenuto dallo stadio b) viene disciolto in una quantità di acqua da 10/0,1 a 10/1 ml/g ed alla soluzione viene aggiunto NaHCO^ fino a pH 9 e poi trimetilammina solfotriossido in quantità in peso uguale a quello di detto prodotto. Si riscalda a 50-60°C per due ore e poi si aggiunge ancora una quantità uguale di trimetilammina solfotriossido e si continua il riscaldamento alla stessa temperatura per 24 ore.
Il prodotto viene precipitato mediante aggiunta di EtOH saturato con acetato di-sodio, dializzato attraverso membrane cut-off 2000 dapprima in soluzioni di NaCl e poi in acqua distillata ed infine viene desalato mediante gel filtrazione.
d ) Eventuale 6-0-risol f atazione del prodotto ottenuto dallo stadio c) . I prodotti che, in base all ' analisi NMR risultano desolfatati per più del 30$ in posizione 6 dell ' unità glucosamminica , possono essere 6-0-risolfatati secondo procedimenti noti (ad es . secondo K. Nagasawa, H. Vchiyama e N. Wajiama, Carbohydr. Res . 158 (1986) 183-190) .
Il prodotto ottenuto presenta le seguenti caratteristiche :
almeno il 20 % di unità iduroniche solfatate in posizione 2 e non solfatate in posizione 3;
almeno il 30$ di unità solfaminoglucosaminiche solfatate in posizione 3 e in posizione 6, come nel sito attivo per l'antitrombina delle eparine naturali;
rapporto molare solfati/carbossili compreso fra 2,0 e 3.5; attività anti-Xa in vitro compresa fra 100 e 150 U/mg.
Il contenuto di unità iduroniche solfatate in posizione 2 e non solfatate in posizione 3. e di unità solfaminoglucosaminiche solfatate in posizione 3 è stato determinato mediante analisi NMR basata sull'integrazione di segnali specificamente ascrivibili a determinate unità e determinati tipi di solfatazione [E.A. Yates, F. Santini, M. Guerrini, A. Naggi, G. Torri, B. Casu: 1⁄2 and NMR spectral assignmens of thè major sequences of twelve systematically modified heparin derivatives, Carbohydr. Res. 294, 15-27 (1996)].
Il rapporto molare solfati/carbossili è stato determinato mediante metodo conduttimetrico [B. Casu e U. Gennaro: A simple conductimetric method for determining thè sulfate and carboxylate groups of heparin and chondroitin sulfates, Carbohydr. Res. 39.
168-176 (1975)]·
L'attività anti-Xa in vitro è stata determinata con metodo cromogenico (A. N. Teien et al, Thrombosis Res. 8,4ΐ3<_>4ΐ6, 1976). La presente invenzione si riferisce particolarmente a glicosaminoglicani appartenenti al gruppo costituito da eparine a basso peso molecolare ( da 1.500 a 8.000 daltons), eparine ad alto peso molecolare (da 8.000 a 18.000 daltons), eparansolfati a basso peso molecolare (da 1.500 a 8.000 daltons), eparansolfati ad alto peso molecolare (da 8.000 a 25.000 daltons) ed eparansolfati ed eparine da polisaccaride K5.
Grazie alle loro caratteristiche, i glicosaminoglicani secondo la presente invenzione possono essere impiegati in miscela con eccipienti o diluenti farmacologicamente accettabili, per la preparazione di composizioni farmaceutiche atte al trattamento antitrombosi.
La presente invenzione si riferisce quindi anche al metodo terapeutico per il trattamento e la prevenzione della trombosi, consistente nella somministrazione di una dose da 1 a 1-500 mg/giorno di detti glicosaminoglicani.
A scopo illustrativo dell'invenzione vengono riportati i seguenti esempi:
Esempio 1 - Preparazione di eparina a basso peso molecolare avente attività antitrombotica elevata.
a) Preparazione del sale di piridina di una eparina a basso peso molecolare supersolfatata (ssLMWH) (G 1074/4)
360 mg del sale di sodio di ssLMWH avente peso molecolare di 5-000 daltons, ottenuta da un'eparina commerciale da mucosa intestinale suina secondo il procedimento descritto nel brevetto US 4,727.063 e nella pubblicazione: Naggi et al, Biochem, Pharmacol. 36, l895-1900 (1987). avente attività = 87 U anti-Xa/mg, spettro ^C-NMR di fig. IA, sono stati disciolti in acqua distillata (30 mi) e passati attraverso una colonna a scambio cationico (AMBERLITE IR 120 nella forma H<+ >). La soluzione ottenuta è stata portata a pH 9 con piridina. Il sale di piridina dell'eparina a basso peso molecolare supersolfatata cosi ottenuto è stato liofilizzato.
b) Desolfatazione del sale di piridina della ssLMWH.
Il sale di piridina dell'eparina a basso peso molecolare supersolfatata ottenuto come sopra è stato disciolto in una soluzione di DMSO/MeOH 10% (25 mi). La soluzione è stata riscaldata sotto agitazione in un bagno ad olio a 80°C per 15 minuti. Al termine della reazione sono stati aggiunti 15 mi di acqua e la soluzione è stata neutralizzata con NaOH 0,25 N. Il prodotto della reazione è stato precipitato mediante aggiunta di 60 mi di EtOH saturato con acetato di sodio, dializzato attraverso membrane cut-off 2000 per 48 ore in acqua distillata e desalato mediante gel filtrazione su Sephadex G25. Il prodotto ottenuto presenta le seguenti caratteristiche: lo spettro NMR (figura 1B) mostra tipici segnali da eparina completamente N-desolfatata (C2NH2:56 ppm) e parzialmente 6-0-desolfatata
(C60H:62 ppm), e il segnale a 65 ppm tipico di unità iduroniche non solfatate in posizione 3 e solfatate in posizione 2.
c) N-risolfatazione del prodotto parzialmente desolfatato dello stadio b) (G 2291)■
100 mg del prodotto ottenuto nello stadio b) sono stati sciolti in 10 mi di acqua e portati a pH 9 con NaHCO^. E' stata quindi aggiunta la stessa quantità in peso di trimetilammina solfotriossido (TMA.SO^) e la soluzione è stata riscaldata sotto agitazione in un bagno ad olio a 55 “C. Dopo 2 ore è stata fatta una ulteriore aggiunta uguale in peso di TMA.SO^ e si è lasciato reagire per 24 ore. Al termine della reazione la miscela è stata portata a pH 9·
Il campione è stato precipitato mediante aggiunta di 4 volumi di EtOH saturato con acetato di sodio, dializzato attraverso membrane cut-off 2000 per 24 ore in NaCl IN, per 24 ore in NaCl 0,5 N e per 24 ore in acqua distillata, e desalato mediante gel filtrazione su Sephadex G25.
Il prodotto ottenuto presenta le seguenti caratteristiche:
Rapporto molare solfati/carbossili: 3-22
Attività anti-Xa: 152 U/mg
Lo spettro 1⁄2 NMR conferma la completa N-solfatazione.
Esempio 2 (G 2309)
E’ stato ripetuto l'esempio 1, con un tempo di reazione della desolfatazione di 30 min. Il prodotto ottenuto dalla desolfatazione presenta lo spettro NMR riportato in fig. 1C, con le caratteristiche descritte nel punto b) dell'esempio 1. Dopo N-risolfatazione, il prodotto ottenuto presenta le seguenti caratteristiche:
Attività anti-Xa:110 U/mg.
Lo spettro 1⁄2 NMR conferma la completa N-solfatazione.
Esempio 3 (G 2301)
a) E' stato ripetuto l'esempio 1 , con un tempo di reazione della desolfatazione di 45 min . Il prodotto ottenuto dalla desolfatazione presenta lo spettro NMR riportato in figura 1D, con le caratteristiche descritte nel punto b esempio 1.
Dopo N-risolfatazione, lo spettro H NMR conferma la completa N-solfatazione.
b) Il prodotto N-risolfatato è stato 6-0-risolfatato secondo il procedimento citato nella descrizione dettagliata.
Esempio 4
E' stato ripetuto l'esempio 1 variando tempi e temperatura del punto b), e precisamente operando per 1,5 ore a 65°C. I prodotti ottenuti dalle desolfatazioni presentano spettri NMR anologhi a quelli delle figure 1B, 1C e 1D.
Il segnale a 65 ppm (tipico delle unità iduroniche desolfatate in posizione 3 e solfatate in posizione 2) è presente in quantità significative, anche se inferiori a quelle ottenute nelle condizioni dell'esempio 1 punto b.
Esempio 5
a) E' stato ripetuto l'esempio 1 con temperatura della desolfatazione di 90°C e tempo di 45 min. Il prodotto ottenuto dalla desolfatazione presenta uno spettro NMR con caratteristiche analoghe a quelle descritte nel punto b esempio 1. Tuttavia il segnale caratteristico della glucosamina solfatata in posizione 6 è sensibilmente inferiore, ed il segnale caratteristico della glucosamina non solfatata in detta posizione sensibilmente superiore, rispetto a quello degli spettri dei prodotti ottenuti a temperature superiori e tempi inferiori. b) Il prodotto è stato 6-0-risolfatato secondo il procedimento citato nella descrizione dettagliata.
ESEMPIO 6
E' stato ripetuto l'esempio 1, partendo da eparina ad alto peso molecolare (12.000 daltons) supersolfatata trattando il suo sale di piridina in DMF a 55°C con addotto SO^/piridina (rapporto molare 3:1 rispetto agli ossidrili liberi) per 5 ore. Il prodotto ottenuto (rapporto molare solfati/carbossili > 3; segnale 13C-NMR a 75 ppm caratteristico delle unità iduroniche solfatate in posizione 2 non solfatate in posizione 3) è stato N-risolfatato come descritto nell'esempio le.
Come illustrato in Tabella 1 per le eparine a basso peso molecolare, l'attività antitrombotica dei prodotti ottenuti (espressa dall'inibizione in vitro del fattore Xa) è notevolmente superiore sia a quella del prodotto supersolfatato di partenza che a quello di eparine a basso peso molecolare attualmente in commercio, impiegate in terapia.
TABELLA 1 - ATTIVITÀ’ anti-Xa* ;1” set 2° set LMW-H 100 ssLMWH (G 1074/4) 100 ;15' desolfatazione da G1074/4 (G 228l) 175 162 ;30’ desolfatazione da G1074/4 (G 2309) 125 125 ;*) U/mg. Valori normalizzati nel primo set rispetto all'eparina a basso peso molecolare supersolfatata (ssLMWH), e nel secondo set rispetto ad una miscela 1:1 in peso dei prodotti commerciali "Fraxieparin" e "Lovenox" (LMWH) _

Claims (1)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Glicosaminoglicani aventi elevata attività antitrombotica in vitro, contenenti almeno il 20% di unità iduroniche solfatate in posizione 2 e non solfatate in posizione 3 ed almeno il 30^ di unità sulfaminoglucosamminiche solfatate in posizione 3 e in posizione 6, ed aventi un rapporto molare solfati/carbossili compreso fra 2 e 3.5· 2. Glicosaminoglicani secondo la rivendicazione 1, costituiti da eparine a basso peso molecolare (da 1.500 a 8.000 daltons). 3- Glicosaminoglicani secondo la rivendicazione 1, costituiti da eparine ad alto peso molecolare (da 8.000 a 18.000 daltons). 4. Glicosaminoglicani secondo la rivendicazione 1, costituiti da eparansolfato a basso peso molecolare (da 1.500 a 8.000 daltons). 5. Glicosaminoglicani secondo la rivendicazione 1, costituiti da eparansolfato ad alto peso molecolare (da 8.000 a 25-000 daltons). 6. Glicosaminoglicani secondo la rivendicazione 1, costituiti da eparansolfati ed eparine ottenuti dal polisaccaride K5· 7. Processo per la preparazione di glicosaminoglicani secondo la rivendicazione 1 a partire da vari tipi di glicosaminoglicani supersolfatati, caratterizzato dai seguenti stadi: a) preparazione del sale di una base organica del glicosaminoglicano supersolfatato di partenza; b) desolfstazione solvolitica parziale del sale della base organica dello stadio a); c) N-risolfatazione del prodotto parzialmente desolfatato dello stadio b). d) eventuale 6-0-risolfatazione del prodotto dello stadio c). 8. Processo secondo la rivendicazione 7. caratterizzato dal fatto che detti glicosaminoglicani supersolfatati di partenza sono scelti dal gruppo costituito da eparine supersolfatate a basso peso molecolare, da 1.500 a 8.000 daltons, eparine supersolfatate ad alto peso molecolare, da 8.000 a 20.000 daltons, eparansolfati supersolfatati a basso peso molecolare, da 1.500 a 8.000 daltons, eparansolfati supersolfatati ad alto peso molecolare, da 8.000 a 25-000 daltons, eparansolfati ed eparine biotecnologici ottenuti dal polisaccaride K5 N-solfatato, epimerizzati e non epimerizzati. 9. Processo secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che detta preparazione dello stadio a) è ottenuta trattando con una base organica fino a pH 9 una soluzione di sale di sodio del glicosaminoglicano di partenza. 10. Processo secondo la rivendicazione 7< caratterizzato dal fatto che detta desolfstazione dello stadio b) è condotta trattando il sale di una base organica ottenuto nello stadio a) con un solvente aprotico polare contenente metanolo o H2O con un rapporto in peso fra questa soluzione e detto sale di base organica compreso fra 50 : l e 100 : 1, a temperatura compresa fra 50 e 80°C per un tempo compreso fra 5 e 480 minuti. 11. Processo secondo la rivendicazione 7. caratterizzato dal fatto che detta N-risolfatazione dello stadio c) è condotta trattando una soluzione acquosa del prodotto ottenuto nello stadio b} con trimetilamina solfotriossido in quantità in peso eguale a quella di detto prodotto, a pH 9, riscaldando a 50-60°C ed aggiungendo successivamente ancora una quantità eguale di trimetilamina solfotriossido. 12. Metodo terapeutico per il trattamento antitrombosi comprendente la somministrazione di una quantità da 1 a 1.500 mg/giorno di un glicosaminoglicano come definito nella rivendicazione 1.
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