NO304991B1

NO304991B1 - FremgangsmÕte for fremstilling av blandinger av sulfaterte polysakkarider

Info

Publication number: NO304991B1
Application number: NO912485A
Authority: NO
Inventors: Roger Debrie
Original assignee: Rh Ne Poulenc Rorer Sa
Priority date: 1990-06-26
Filing date: 1991-06-25
Publication date: 1999-03-15
Also published as: ITMI911757A1; NZ238691A; SE9101957L; AU643531B2; ATA128191A; HUT57796A; AU7928891A; FI913101A0; DK124391D0; FR2663639B1; FI913101A; MX25829A; FI104490B; IL98604A0; GB2245898B; DK176524B1; GR910100270A; CA2045433A1; ES2036922B9; DK124391A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av polysakkarider med lav molekylvekt, særlig hepariner med lav molekylvekt.

Hepariner er ved ekstrahering oppnådde biologiske stoffer som hører til familien glycose aminoglycaner og de er anvendelige på grunn av sin antikoagulerende og sin antitrombotiske virkning. De anvendes spesielt ved behandling av venetromboser efter operasjoner. I nativ form har imidlertid hepariner visse mangler som begrenser deres anvendelse. Den antikoagulerende virkning kan således fremkalle blødninger og følsomheten overfor visse serumfaktorer som pf4, nødvendig-gjør anvendelsen av relativt høye doser. Det er altså nødvendig å øke den antitrombotiske virkning som spesielt tilskrives antiprotrombinase, på bekostning av den antikoagulerende virkning som tilskrives antitrombin.

For dette formål har man foreslått fragmentering av hepariner til molekyler med lavere gjennomsnittlige molekylvekter. I EP-PS 40144 beskrives det således blandinger av sulfaterte polysakkarider med samme generelle struktur som de polysakkarider som inngår i heparin, hvorved disse polysakkarider inneholder en etenisk dobbeltbinding ved en av sidekjedene, og har en vektmidlere molekylvekt på mellom 2000 og 10 000 Dalton. Disse blandinger oppnås ved depolymerisering og forsepning av en heparinester. Det angis at blandingene har en høy antitrombotisk virkning og en total antikoagulerende virkning som er lavere enn virkningen av heparin.

Et av hovedproblemene med hepariner er at de er meget heterogene produkter. Det er altså vanskelig å bedømme det bidrag som hver heparintype gir til virkningen av et heparin produkt, det er vanskelig å bestemme heparintypenes oppførsel under depolymerisering og det er vanskelig å kontrollere heparintypenes struktur og egenskaper i sluttproduktene. Av disse grunner har de ovenfor nevnte problemer ikke kunnet løses på fullstendig tilfredsstillende måte. De tidligere beskrevne fremgangsmåter, særlig den fremgangsmåte som er beskrevet i EP-PS 40144, gjør det ikke mulig å oppnå blandinger med ønskede farmakologiske egenskaper, det vil si tilstrekkelig høy halveringstid i plasma, en tilstrekkelig høy absorbsjonshastighet, en god biologisk tilgjengelighet og en lav "clearance".

Man har også beskrevet andre fremgangsmåter for fragmentering av heparin i den hensikt å redusere de uønskede virkninger (Johnson et al. "Thrombos. Haemostas." Stuttg., 1976, 35, 586; Lane et. al., "Thrombos Research" 16, 651; Lasker et al., US 3 766 167). Alle disse publikasjoner synes å vise at den ønskede virkning fremmes når heparinets fragmenterings-grad øker (se også EP-publ. 301618 som beskriver penta-sakkarider med antitrombotisk virkning).

Nylig gjennomførte undersøkelser med henblikk på hepardiners virkningsmekanisme ved dannelse av trombin har vist at hepariners virkning in vitro påvirkes av den midlere molekylvekt (Béguin et al., "Thromb. Haemost." 61, 30, 1989). Forfatterne angir at hepariner med lav molekylvekt fremfor alt har en antiprotrombinasevirkning og at hepariner med høyere molekylvekt har en antitrombinvirkning.

Det er også foreslått at man skal fraksjonere hepariner for å utvinne blandinger med mere homogene midlere molekylvekt. I EP-publ. 337327 beskrives det således en fremgangsmåte for fremstilling av oligosakkaridfragmenter stammene fra hepariner, og denne fremgangsmåte muliggjør fremstilling av blandinger med redusert molekylvektsfordeling. I henhold til denne fremgangsmåte fjernes først fraksjoner med en midlere molekylvekt under 3000 Dalton, noe som medfører at fragmentet inneholdende mindre enn 10 til 16 sakkarider fjernes fra sluttproduktene, og fraksjoner med en molekylvekt over 7000 Dalton. Denne behandling som har til hensikt å homogenisere sluttproduktene, gjør det ifølge oppfinnerne mulig å redusere den antikoagulerende virkning under opprettholdelse av den ønskede antitrombotiske virkning.

På tross av disse arbeider har de oppnådde blandinger fremdeles en gjenværende blødningsfremkallende virkning eller en alt for lav antitrombotisk virkning. Ingen ting i den tidligere publiserte litteratur gjør det mulig å bestemme hvilke egenskaper som bør kombineres for å oppnå en optimal biologisk virkning. Den slutning forfatterne til den ovenfor angitte artikkel, trekker, er beskrivende: "Vi vet ikke hvilken som er den optimale kombinasjon av heparinets egenskaper. Nøyaktig karakterisering av forskjellige preparater og sammenligning av egenskapene med kliniske observasjoner, kan eventuelt gi et svar."

Man har funnet at det er mulig å oppnå heparinet med fordelaktige egenskaper, spesielt for profilakse og behandling av trombotiske tilstander. Man har således uventet funnet at når sluttproduktet inneholder både forbindelser med høy molekylvekt og forbindelser med lav molekylvekt, oppviser produktene en bedre virkning. I motsetning til det som fremgår av den kjente teknikk synes det altså å være fordelaktig i den ferdige blanding å beholde forbindelser med høy molekylvekt samt en viss heterogenitet.

Farmakokinetiske studier av blandingene som fremstilles ifølge oppfinnelsen viser at de forener meget fordelaktige egenskaper. Disse blandingene har spesielt en lavere halveringstid enn modent heparin og andre kjente produkter. Det er dessuten viktig å understreke at blandingene i motsetning til heparin, har en halveringstid som er uavhengig av den injiserte dose. Dette er interessant fordi den fremkalte virkning er meget mer forutsigbar enn ved anvendelsen av heparin.

Hos mennesker har blandingene som fremstilles ifølge oppfinnelsen en utmerket biologisk tilgjengelighet, bestemt ved hjelp av antl-Xa-aktiviteten. Således oppnås for blandingene en verdi på ca. 30 % for heparin og ca. 90 %. Dette er meget fordelaktig efter som det muliggjør en reduksjon av de injiserte doser og en forbedring av den terapeutiske virkning.

En annen viktig egenskap for disse blandingene er den store absorbsjonshastigheten. Denne egenskap gjør det mulig å oppnå en nesten øyeblikkelig biologisk virkning. Dette medfører en hurtigere og sikrere behandling av pasienten. En annen egenskap hos blandingene er at de har en lav "clearance", sammenlignet med modent heparin og andre kjente produkter. Takket være den kjemiske struktur, molekylvekten og sulfat-innholdet, oppviser blandingene en god motstandskraft mot nedbrytning (desulfatering, hydrolyse) og eliminering, noe som øker blandingenes terapeutiske virkning.

Blandingen oppviser dessuten en lengre oppholdstid enn utgangsheparinet. Denne egenskap viser seg ved en forlengelse av den tid i løpet av hvilken produktet forblir aktivt in vivo og altså ved en bedre terapeutisk virkning.

Blandingene har også en mindre følsomhet overfor serumfaktorer, noe som øker varigheten av virkningen in vivo og muliggjør anvendelsen av lave doser.

Disse meget fordelaktige egenskaper oppnås ved at man, under fremstillingen, regulerer visse strukturegenskaper hos de herværende forbindelser og regulerer molekylvektsfordelingen. De oppnådde blandinger har et gunstig forhold mellom fraksjoner med høy molekylvekt og fraksjoner med lav molekylvekt, noe som gir blandingene nødvendige antitrombotiske egenskaper med en ubetydelig blødningsfremkallende virkning.

De karakteristiske egenskaper uttrykkes ved hjelp av den prosentuelle andel tunge kjeder henholdsvis lette kjeder og forholdet mellom blandingenes vektmldlere molekylvekt og deres tallmidlere molekylvekt, som gjenspeiler molekylvekts-sprednlngen.

Foreliggende oppfinnelse angår således fremstilling av blandinger av sulfaterte polysakkarider med den samme generelle struktur som de polysakkarider som inngår i heparin, og som har en lavere vektmldlere molekylvekt enn heparin, at de inneholder mellom 9 og 20 s6 kjeder med en molekylvekt under 2000 Dalton og mellom 5 og 20 # kjeder med en molekylvekt over 8000 Dalton, og ved at forholdet mellom den vektmldlere molekylvekt og den tallmidlere molekylvekt er mellom 1,3 og 1,6.

Det er videre fastslått at det er mulig ytterligere å forbedre blandingenes egenskaper ved å redusere forurens-ningsinnholdet. De fleste hepariner inneholder slike forurensninger som nukleinsyrer, polypeptider og forskjellige polysakkarider. Blant disse skal spesielt nevnes kondroitin-sulfater, heparansulfat og dermatansulfat. På grunn av den meget høye molekylvekt, de inngående substituenter og sulfateringsgraden, kan hver og en av disse forbindelser forstyrre fremstillingen av produktet (for eksempel depolymeriseringen) slik at den endelige molekylvektsfordeling endres. Forurensningene kan også direkte påvirke aktiviteten ved å modifisere de aktive kjedenes egenskaper. Ifølge oppfinnelsen er det mulig å eliminere disse forurensninger, hvorved man kan konstatere en forbedring av egenskapene i de blandinger som er underkastet slik forbehandling. Virkningen av denne forbehandling kan måles under anvendelse av dermatansulfat som forurensningsstandard.

Blandingene av sulfaterte polysakkarider som fremstilles ifølge oppfinnelsen inneholder fortrinnsvis mindre enn 2 % dermatansulfat.

Videre har blandingen av sulfaterte polysakkarider som fremstilles ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis en vektmidlere molekylvekt på mellom 3500 og 5500 Dalton.

Kjedene av de sulfaterte polysakkarider som inngår i blandingene inneholder fortrinnsvis en 2-0-sulfo-4-enopyrano-seuronsyre ved en av kjedeendene.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse som antydet ovenfor en fremgangsmåte for fremstilling av blandinger av sulfaterte polysakkarider som har samme generelle struktur som de polysakkarider som inngår i heparin, som har lavere vektmidlere molekylvekt enn heparin, som inneholder mellom 9 og 20 % kjeder med en molekylvekt under 2000 Dalton og mellom 5 og 20 % kjeder med en molekylvekt over 8000 Dalton og hvori forholdet mellom vektmidlere og tallmidlere molekylvekt er mellom 1,3 og 1,6, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at følgende trinn gjennom-føres : a) i et første trinn omdannes et heparin i vannholdig medium til et salt derav ved hjelp av et kvaternært ammoniumsalt med lang kjede; b) i et andre trinn forestres det oppnådde salt til en ester med en forestringsgrad på mellom 9,5 og 14 %; og c) i et tredje trinn depolymeriseres den oppnådde ester med en forestringsgrad på mellom 9,5 og 14 %.

Det er nu fastslått at man kan regulere depolymeriserings-nivået og dermed også sluttproduktets molekylære egenskaper ved å forestre saltet av utgangsheparinet til egnet forestringsgrad .

Ifølge oppfinnelsen er det altså mulig direkte og på reproduserbar måte å fremstille blandinger av sulfaterte polysakkarider med de ovenfor angitte egenskaper.

Det ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendte utgangs-heparin er fortrinnsvis et svineheparin, fremfor alt svineslimhinner. Man har funnet at de oppnådde "blandingers aktivitet kan variere betydelig avhengig av utgangsheparinets opprinnelse. Når utgangsheparinet stammer fra fe oppnås således blandinger med høyere antikoagulerende virkning enn når heparinet stammer fra tarmslimhinnen hos griser.

I henhold til en spesielt foretrukken utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjennomføres dessuten et innledende trinn for utfelling av utgangsseparinet ved hjelp av en alkohol. Denne forbehandling gjør det mulig å redusere innholdet av forurensninger av typen kondroitinsulfat og heparansulfat. En alkohol som gir godt resultat ved denne behandling er metanol.

Natriumheparinets renhet kan derefter bestemmes ved vaeskekromatografi med sterisk utelukning.

Dette innledende trinn gjør det spesielt mulig å fremstille et heparin med et innhold av dermatansulfat på mindre enn 2 *.

Saltdannelsen av heparinet gjennomføres på følgende måte.

Heparinsaltet kan fremstilles ved at et overskudd av det tilsvarende salt omsettes med et natriumheparin i vannholdig medium ved en temperatur nær 20°C. Det anvendte kvaternære ammoniumsaltet er fortrinnsvis et benzetoniumsalt, spesielt benzetoniumklorid, som kan omsettes med natriumheparinet.

Forestringen i det andre trinn av fremgangsmåten gjennomføres på følgende måte.

Den partielle heparinester i form av salt og hvis forestringsgrad er mellom 9,5 og 14 %, kan fremstilles ved forestring av det kvaternære ammoniumsaltet (med lang kjede) av heparin i et klorert organisk oppløsningsmiddel i nærvær av en klorforbindelse. Reaksjonens effektivitet kan økes ved regulering av forholdene mellom de forskjellige reaksjons-komponenter, reaksjonstemperatur og reaksjonstid.

Den partielle heparin ester er hensiktsmessig en aromatisk ester.

Den anvendte klorforbindelse er fortrinnsvis benzylklorid og det klorerte oppløsningsmiddel er fortrinnsvis kloroform eller metylenklorid.

For at forestringsgraden skal bli mellom 9,5 og 14 % er det spesielt hensiktsmessig, pr. vektdel heparinsalt å anvende en volumdel klorforbindelse i 3 til 5 volumdeler klorert organisk oppløsningsmiddel samt gjennomføre reaksjonen i løpet av 15 til 48 timer ved en temperatur mellom 25 og 45°C, fortrinnsvis mellom 30 og 40°C.

I henhold til en foretrukket utførelsesform foreligger den partielle heparinester i form av natriumsalt.

De således dannede estere kan utvinnes ved utfelling ved hjelp av en alkohol, særlig metanol, i nærvær av natriumacetat. Man anvender fortrinnsvis mellom 1 og 1,2 volumer alkohol pr. volumreaksjonsmedium. Esterens forestringsgrad kan kontrolleres ved høyeffektiv væskekromatografi. Når det gjelder en benzylester kan man måle den mengde benzylalkohol som oppnås ved forsåpning av esteren ved 0°C.

Det siste trinnet av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjennomføres hensiktsmessig på følgende måte.

Depolymeriseringen skjer fortrinnsvis ved at esteren behandles ved en sterk base i vandig oppløsning. Fortrinnsvis anvendes natriumhydroksyd.

Vektforholdet mellom base og ester er hensiktsmessig mellom 0,05 og 0,2, fortrinnsvis mellom 0,08 og 0,5.

Reaksjonsmediets temperatur innstilles til en verdi mellom 50 og 70°C, fortrinnsvis mellom 55 og 65°C, og reaksjonen gjennomføres i et tidsrom fra 30 minutter til 3 timer, fortrinnsvis 1 til 2 timer.

Det er dessuten hensiktsmessig å gjennomføre reaksjonen i et medium hvori vektforholdet mellom vann og ester er mellom 15 og 30.

I henhold til en spesielt foretrukken utførelsesform gjennomføres depolymeriseringen ved at man blander 1 vektdel av den i trinn 2 oppnådde aromatiske ester av heparin i form av et salt, hvis forestringsgrad er mellom 9,5 og 14 %, med 0,08 til 0,15 vektdeler natriumhydroksyd og 20 til 30 vektdeler vann, hvorefter den oppnådde blanding holdes ved en temperatur mellom 55 og 65°C i et tidsrom på 1 til 2 timer.

Produktet kan gjenvinnes ved at reaksjonsmediet nøytraliseres ved hjelp av en fortynnet mineralsyre, fortrinnsvis saltsyre, hvorefter utfellingen gjennomføres ved hjelp av en alkohol som metanol.

På denne måte er det mulig direkte og på reproduserbar måte å fremstille en blanding av sulfaterte polysakkarider, hvilke inneholder mellom 9 og 20 # kjeder med en molekylvekt under 2000 Dalton og mellom 5 og 20 % kjeder med en molekylvekt over 8000 Dalton, hvilke har en midlere molekylvekt mellom 3500 og 5500 Dalton, og hvori forhodlet mellom vektmidlere molekylvekt og tallmidlere molekylvekt er mellom 1,3 og 1,6.

Blandingene som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse kan hensiktsmessig anvendes som antitrombotiske midler.

De kan spesielt anvendes for å forhindre venetromboser ved risikable tilstander. Dette gjelder også ved langvarige risikable tilstander. Blandingene gjør det for første gang mulig, ved bestemte doser å redusere de foreliggende risiki for trombotiske tilstander ved ortopedisk kirurgi. Denne risiko som er 70 % i fravær av behandlingen og ca. 25 # i nærvær av heparin, er ca. 10 % ved anvendelse av blandingene som fremstilles ifølge oppfinnelsen, sågar ennu lavere.

Ved innsprøyting av blandingene i en kunstig nyres rørsystem kan man redusere forekomsten av tromboser. Denne sistnevnte anvendelse kan utvides til å forhindre tromboser i kirurgisk materiale.

En annen fordelaktig terapeutisk anvendelse av blandingene som fremstilles ifølge oppfinnelsen er å forhindre trombotiske tilstander i arteriene, spesielt ved myokard-infarkter.

Det er dessuten meget fordelaktig å anvende blandingene for å forhindre venetromboser for kirurgiske pasienter ved behandling efter operasjoen. Denne anvendelse er meget fordelaktig fordi den gjør det mulig å unngå blødningsrisiki under operasjonen og de problemer med type og dose av bedøvningsmiddel som kan opptre ved behandling før operasjon.

Alle disse egenskaper viser de terapeutiske muligheter for preparatene som oppnås ved bruk av oppfinnelsens teknologi.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved de følgende, illu-strerende eksempler.

Bestemmelsesmetoder

Produktenes molekylvekter og molvektsfordelingen bestemmes ved høytrykksvæskekromatografi med anvendelse av to seriekoblede kolonner, for eksempel de kolonner som er kommersielt tilgjengelige under betegnelsene TSK G 3000SW (30 cm x 0,75 cm) og Lichrosorb 100 Diol 10 jj (25 cm x 0,75 cm), eller TSK G 2000SW, koblet til en refraktometrisk detektor. Det anvendte oppløsningsmiddel er en 0,3 M fosfatbuffer med pH-verdi = 7, og strømmen er 0,7 ml/min. Systemet kalibreres med standarder, fremstilt ved fraksjonering av enoksaparin (Pharmuka) ved utelukkelseskromatografi på agarose polyakryl-amid (IBF) i henhold til den metode som er beskrevet av BarrowCliffe et al., "Thromb. Res.", 12, 27-36 (1977-78) eller D.A. Lane et al., "Thromb. Res.", 12, 257-271 (1977-78). Resultatene beregnes ved hjelp av en datamaskin-programmert GPC6 (Perkin Eimer).

I de følgende eksempler måles blandingenes totale antikoagulerende virkning på turbidimetrisk måte under anvendelse av den første internasjonale heparinstandard med lav molekylvekt. Virkningen mot faktor Xa (den antitrombotiske virkning) måles i henhold til den amidolyttiske metode på kromogent substrat som beskrevet av Teien et al. i "Thromb. Res.", 10, 399-410 (1977), hvorved man anvender den første internasjonale heparinstandard med lav molekylvekt.

Eksempel 1

Dette eksempel viser den innlednende behandling av natrium heparin for å redusere innhold av forurensninger av typen kondroitinsulfat og heparansulfat.

Til en oppløsning av 10 g kommersielt natriumsalt av heparin i 100 ml vann inneholdende 3 g natriumklorid settes 8 ml metanol. Efter utfelling filtreres produktet fra hvorefter det vaskes og tørkes. Renhetsgraden for det derved oppnådde natriumheparin måles ved væskekromatografi med sterisk utelukning. Herved anvendes det to seriekoblede kolonner, nemlig de kolonner som er kommersielt tilgjengelige under betegnelsene TSK 2000SW (60 cm x 0,75 cm) og TSK 3000SW (60 cm x 0,75 cm), koblet til en UV-detektor innstilt på 206 nm. Den anvendte mobile fase er en 0,5 M vannoppløsning av natriumsulfat som sirkulerer i en mengde av 1 ml pr. minutt. Prøven sammenlignes med en heparinstandard inneholdende 2 % dermatansulfat.

Under de ovenfor angitte betingelser inneholder det oppnådde heparin mindre enn 2 % dermatansulfat.

Eksempel 2

Dette eksempel illustrerer fremstilling av kvaternært ammoniumsalt av heparin.

I denne oppløsning av 10 g natriumheparinat ifølge eksempel 1 og inneholdende mindre enn 2 # dermatansulfat i 100 ml vann, settes en oppløsning av 25 g benzetoniumklorid i 125 ml vann. Det ved romtemperatur oppnådde produkt filtreres av, vaskes med vann og tørkes.

På nøyaktig samme måte fremstilles benzetoniumsaltet av et heparid som ikke er underkastet den i eksempel 1 beskrevne behandling.

Eksempel 3

Dette eksempel viser fremstillingen av blandinger innenfor oppfinnelsens konsept og disse blandingers egenskaper.

1) Forestring

Til en oppløsning av 15 g benzetoniumheparinat (forbehandlet ved den fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel 1) i 75 ml metylenklorid settes 15 ml benzylklorid.

Oppløsningen oppvarmes til en temperatur av 35°C som holdes i 25 timer. Ef ter tilsettes 90 ml av en 10 #-ig oppløsning av natriumacetat i metanol. Utfellingen filtreres av, vaskes med metanol og tørkes. Herved oppnås 6,5 g benzylester av heparin i form av natriumsalt og hvis forestringsgrad, bestemt på ovenfor angitte måte, er 13,3 %.

2) Depolymer i ser ing

10 g benzylester av heparin i form av natriumsalt, oppnådd på ovenfor beskrevne måte, oppløses i 250 ml vann. Den oppnådde oppløsning oppvarmes til 62<0>C og 0,9 g natriumhydroksyd tilsettes. Temperaturen holdes ved 62° C i 1 time og 30 minutter. Reaksjonsblandingen avkjøles derefter til 20°C og nøytraliseres ved tilsetning av fortynnet saltsyre. Natriumkloridkonsentrasjonen i reaksjonsmediet innstilles derefter til 10 1o. Produktet felles til slutt ut i 750 ml metanol hvorefter det separeres og tørkes. Herved oppnås et heparin med følgende egenskaper:

Vektmidlere molekylvekt: 3900 Dalton

Molekylvektsfordel ing:

20 % kjeder med en molekylvekt under 2000 Dalton 5,5 % kjeder med en molekylvekt over 8000 Dalton Spredning: d = 1,39

Anti-Xa-aktivitet: 106 internasjonale enheter Antikoagulerende virkning: 22,6 internasjonale enheter.

Eksempel 4

Ved å gå ut fra estere med en forestringsgrad mellom 9,5 og 14 % fremstilles på lignende måte depolymeriserte hepariner med følgende egenskaper: a) Vektmidlere molekylvekt: 4425 Dalton

Molekylvektsfordeling:

12,4 % kjeder med en molekylvekt under 2000 Dalton 9,3 1o kjeder med en molekylvekt over 8000 Dalton Spredning: d = 1,37

Anti-Xa-aktivitet: 102 internasjonale enheter Antikoagulerende virkning: 33 internasjonale enheter.

b) Vektmidlere molekylvekt: 4579 Dalton

Molekylvektsfordeling:

11,2 1o kjeder med en molekylvekt under 2000 Dalton 10,4 % kjeder med en molekylvekt over 8000 Dalton Spredning: d = 1,37

Anti-Xa-aktivitet: 104 internasjonale enheter Antikoagulerende virkning: 37 internasjonale enheter.

c) Vektmidlere molekylvekt: 4446 Dalton

Molekylvektsfordeling:

12,6 % kjeder med en molekylvekt under 2000 Dalton 9,5 % kjeder med en molekylvekt over 8000 Dalton Spredning: d = 1,38

Anti-Xa-aktivitet: 100 internasjonale enheter Antikoagulerende virkning: 32 internasjonale enheter.

Eksempel 5

Dette eksempel illustrerer fremstilling av en blanding som ikke ligger innenfor oppfinnelsens konsept.

1) Forestring

Til en oppløsning av 15 g benzetoniumheparinat (fremstilt i henhold til den metode som er beskrevet i eksempel 1) i 60 ml metylenklorid settes 12 ml benzylklorid. Den resulterende oppløsnings oppvarmes til 28°C, en temperatur som holdes i 30 timer. Derefter tilsettes 90 ml av en 10 #-ig oppløsning av natriumacetat i metanol. Fellingen filtreres av, vaskes med metanol og tørkes. Herved oppnås 6,3 g benzylester av heparin i form av natriumsalt. Dette produktets forestringsgrad bestemmes ved at man ved hjelp av høyeffektiv væskekromatografi bestemmer den mengde benzylalkohol som frigjøres ved forsepning av esteren ved 0°C. Forestringsgraden er 9,2 %.

2 ) Depolymerisering

10 g av den ovenfor angitte benzylester av heparin i form av natriumsalt oppløses i 200 ml vann. Oppløsningen oppvarmes til 58°C og det tilsettes 1,1 g natriumhydroksyd. Temperaturen holdes ved 58°C i 1 time. Reaksjonsblandingen avkjøles derefter til 20°C og nøytraliseres ved tilsetning av fortynnet saltsyre. Natriumkloridkonsentrasjonen i reaksjonsmediet innstilles derefter til 10 96. Produktet felles til slutt ut i 600 ml metanol hvorefter det filtreres av og tørkes. Herved oppnås et heparin med følgende egenskaper: Vektmidlere molekylvekt: 5425 Dalton

Molekylvektsfordel ing:

9,6 % kjeder med en molekylvekt under 2000 Dalton 19,5 % kjeder med en molekylvekt over 8000 Dalton Spredning: d = 1,44

Anti-Xa-aktivitet: 122 internasjonale enheter Antikoagulerende virkning: 68,6 internasjonale enheter.

Av disse resultater fremgår det at dette produkt har en høy antikoagulerende virkning. De ifølge oppfinnelsen fremstilte blandinger har således bedre egenskaper.

Eksempel 6

Dette eksempel illustrerer den forbedrede stabilitet in vivo for blandingene som fremstilles ifølge oppfinnelsen, uttrykt ved hjelp av halveringstiden i plasma.

Et første farmakokinetisk studie ble gjennomført med frivillige forsøkspersoner med en alder mellom 21 og 30 år. Forsøkspersonene ble gitt subkutane injeksjoner i doser fra 20 til 80 mg/ml. Blodprøver med volumet 4,5 ml ble tatt ved de forskjellige tidspunkter og oppbevart ved ca. 4°C. Prøvene ble derefter sentrifugert ved 2300 g i 15 minutter og et blodplatefattig plasma ble separert og frosset før analyse. Blandingenes halveringstid ble bestemt ved måling av anti-Xa-virkningen. De oppnådde resultater er gitt nedenfor.

Når de i eksemplene 3 og 4 fremstilte blandinger administreres i en dose på 40 mg var halveringstiden lengre enn 4 timer i 75 % av tilfellene og halveringstiden var lengre enn 4,5 timer i 45 % av tilfellene. Ved en dose på 60 mg var halveringstiden lengre enn 3,7 timer i 75 % av tilfellene. Når intaktheparin injiseres intravenøst under identiske doseringsbetingelser måles det en halveringstid på ca. 0,6 timer. Et produkt fremstilt ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet i EP-PS 40144 oppviser en halveringstid på over 4,5 time i 17 # av tilfellene.

En andre studie gjennomføres under lignende betingelser under anvendelse av 20 pasienter. Når blandinger som fremstilles ifølge oppfinnelsen administreres i en dose av 40 mg var halveringstiden over 4 timer i 80 % av tilfellene og halveringstiden var over 4,5 time i ca. 40 % av tilfellene. Ved en dose på 20 mg var halveringstiden over 3,9 timer i 60 io av tilfellene.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av blandinger av sulfaterte polysakkarider som har samme generelle struktur som de polysakkarider som inngår i heparin, som har lavere vektmidlere molekylvekt enn heparin, som inneholder mellom 9 og 20 % kjeder med en molekylvekt under 2000 Dalton og mellom 5 og 20 % kjeder med en molekylvekt over 8000 Dalton og hvori forholdet mellom vektmidlere og tallmidlere molekylvekt er mellom 1,3 og 1,6,karakterisert vedat følgende trinn gjennomføres: a) i et første trinn omdannes et heparin i vannholdig medium til et salt derav ved hjelp av et kvaternært ammoniumsalt med lang kjede; b) i et andre trinn forestres det oppnådde salt til en ester med en forestringsgrad på mellom 9,5 og 14 % ; og c) i et tredje trinn depolymeriseres den oppnådde ester med en forestringsgrad på mellom 9,5 og 14 %.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at det fremstilles en blanding inneholdende mindre enn 2 % dermatansulfat.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at det fremstilles en blanding med midlere molekylvekt på mellom 3500 og 5500 Dalton.

4 . Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at det fremstilles en blanding hvori kjedene av sulfaterte polysakkarider inneholder en 2-0-sulfo-4-eno-pyranoseuronsyre ved en av kjedeendene.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at det andre trinnet gjennomføres i et klorert organisk oppløsningsmiddel i nærvær av en klorforbindelse.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisertved at klorforbindelsen er benzylklorid og at oppløs-ningsmidlet er kloroform eller metylenklorid.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 5 eller 6,karakterisert vedat forestringen gjennomføres ved blanding av 1 vektdel heparinsalt med ca. 1 volumdel klorforbindelse i 3 til 5 volumdeler av et klorert organisk oppløsningsmiddel ved en temperatur mellom 25 og 45°C, fortrinnsvis mellom 30 og 40°C.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at det tredje trinnet gjennomføres ved at esteren behandles med en sterk base i vannoppløsning.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisertved at vektforholdet mellom base og ester holdes mellom 0,05 og 0,2, fortrinnsvis mellom 0,08 og 0,15.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisertved at vektforholdet mellom vann og ester holdes mellom 15 og 30.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisertved at temperaturen instilles til en verdi mellom 50 og 70°C, fortrinnsvis mellom 55 og 65°C, og at reaksjonen gjennomføres i et tidsrom fra 30 minutter til 3 timer og fortrinnsvis 1 til 2 timer.

12. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11,karakterisert vedat man i et innledende trinn feller ut utgangsheparinet ved hjelp av en alkohol.