HU210925B

HU210925B - Process to prepare polisaccharide mixtures wita low moleculare weight and pharmaceutical compns. contg. them

Info

Publication number: HU210925B
Application number: HU912122A
Authority: HU
Inventors: Roger Debrie
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer Sa
Priority date: 1990-06-26
Filing date: 1991-06-25
Publication date: 1995-09-28
Also published as: ES2036922B9; GB9113589D0; JPH04226101A; NO304991B1; MX25829A; ES2036922A1; IT1248557B; SE9101957L; LU87957A1; CA2045433A1; US5389618A; FR2663639B1; AT398976B; AU7928891A; BE1006827A3; DK176524B1; GR1000763B; ITMI911757A0; IL98604A; FR2663639A1

Description

A találmány kis molekulatömegű poliszacharidok heparinok - és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására vonatkozik.

A találmány szerint a heparint alkotó poliszacharidok általános szerkezetének megfelelő, olyan szulfatált poliszacharidok elegyeit állítjuk elő, amelyek átlagos molekulatömege - ez alatt a tömegátlagos molekulatömeget értjük - kisebb, mint a hepariné, a 2000 daltonnái kisebb molekulatömegű láncok száma 9 és 20% közötti, a 8000 daltonnái nagyobb molekulatömegű láncok száma 5 és 20% közötti, és tömegátlagos molekulatömegük és számátlagos molekulatömegük aránya 1,3 és 1,6 között van.

A heparinok extrakcióval nyerhető biológiai anyagok, és a glikóz-amino-glikán családhoz tartoznak, továbbá antikoaguláns és antitrombotikus hatásúak. Elsősorban posztoperatív vénás trombózis kezelésére alkalmazhatók. A természetes heparinok számtalan kellemetlen tünetet okoznak és ezért alkalmazásuk lehetőségei korlátozottak. Elsősorban antikoaguláns hatásuk miatt vérzéseket válthatnak ki, és a szérum néhány faktorának, így a pf4 érzékenysége miatt viszonylag nagy adagok alkalmazása szükséges. Ezért az antitrombotikus hatást - amelyet az antiprotrombináz hatásának tulajdonítanak - előnyben kell részesíteni az antikoaguláns hatás rovására, ami az antitrombin effektussal jár együtt.

Ezért azt javasolták, hogy a heparint kisebb molekulatömegű molekulákra kell bontani. A 40 144 számú európai szabadalmi leírás szulfatált poliszacharidok elegyét ismerteti, amelynek általános szerkezete heparint képző poliszacharidokból áll, a lánc egyik végén etilénes kettőskötést tartalmaz, és átlagos molekulatömegük 2000 és 10 000 dalton közötti. Ezeket az elegyeket heparin észter depolimerizálásával és elszappanosításával állítják elő. A leírás szerint igen jelentős antitrombotikus hatású, viszont globális antikoaguláns hatása kisebb a heparinénál.

A heparinnál a legnagyobb probléma a tennék rendkívüli heterogén volta. Igen nehéz felbecsülni, hogy az egyes részecskék hogyan járulnak hozzá a heparin hatásához, depolimerizáláskor milyen az egyes részecskék viselkedése, és végül, milyen lesz a végtermékben a részecskék szerkezete és részaránya. A fentiekben említett kellemetlen tüneteket még nem sikerült kielégítően megoldani. A technika állása, elsősorban a 40 144 számú európai szabadalmi leírás szerint nem lehet olyan elegyet előállítani, amely kielégítő farmakológiai tulajdonságokkal rendelkezik, nevezetesen kielégítő felezési idővel a plazmában, eléggé gyors felszívódási sebességgel, kielégítő biodiszponibilitással vagy gyenge clearance-szel.

Más ismert eljárások szerint lehetséges a heparin részecskékre bontása oly módon, hogy a nem kívánt hatásokat csökkentsék [Johnson és munkatársai: Thrombos. Haemostas. Stuttgart, (1976) 35, 586; Lane és munkatársai: Thrombosis Research 16, 651; Lasker és munkatársai 3 766 167 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. Úgy tűnik, hogy mindegyik eljárás szerint az előnyben részesített vizsgált hatás a heparin részecskék bontásának mértékével nő (lásd 301 618 számú közzétett európai szabadalmi bejelentés, amely antitrombotikus hatású pentaszacharidokra vonatkozik],

A heparin hatásmechanizmusára vonatkozó legújabb tanulmányok is igazolják, hogy a heparin átlagos molekulatömege (kb. 20 000 dalton) befolyásolja a trombinképződést in vitro [Béguin és munkatársai: Thromb. Heamost., 61, 30 (1989)]. A szerzők megállapították, hogy a kis molekulatömegű heparin antiprotrombináz hatású és a nagyobb molekulatömegű heparinok antitrombin hatásúak.

Ezzel párhuzamosan javasolják a heparinok részecskékre bontását azért, hogy homogénebb átlagos molekulatömegű heparinok elegyét lehessen extrahálni. A 337 327 számú európai szabadalmi bejelentés egy olyan eljárást ismertet, amellyel oligoszacharid fragmenseket lehet előállítani heparinból. Az eljárás segítségével csökkentett molekulatömegű diszperziót kapnak. Az eljárás szerint előzetesen eltávolítják a 3000 daltonnái kisebb molekulatömegű frakciót, amelynek segítségével a végtermékben a fragmensek 10-16 szacharidnál kevesebbet tartalmaznak és a részecskék molekulatömege 7000 dalton fölötti. A feltalálók szerint ezzel a kezeléssel homogenizálni lehet a végterméket, amely lehetővé teszi az antikoaguláns hatás csökkentését, viszont a vizsgált antitrombotikus hatást megőrzi. A kapott elegy még mindig rendelkezik maradék hemorrágiás hatással, vagy gyenge az antitrombotikus hatása.

A 2 548 672 számon nyilvánosságra hozott francia szabadalmi bejelentés szerint a heparin kvaterner ammóniumsóval végzett kisózásával, észterképzéssel és depolimerizálással, majd frakcionálással meghatározott szerkezetű, homogén szulfatált oligoszacharidokat állítanak elő.

A technika állása nem teszi lehetővé, hogy meghatározzuk, hogy melyek azok a tulajdonságok, amelyek egyesítésével az optimális biológiai hatást el lehet érni. A fent idézett cikkekben a szerző konklúziója is rávilágít: nem tudjuk, hogy a heparin mely tulajdonságainak optimális a kombinációja. A jellemzés meghatározza a különböző készítményeket, és a tulajdonságok korrelációja a klinikai megfigyeléssel megadhatja talán a megfelelő választ.

Azt találtuk, hogy elő lehet állítani olyan heparint, amely előnyös tulajdonságú mind a profilaxis során, mind pedig a trombózisos megbetegedések kezelésében. Nem várt módon azt találtuk, hogy a végtermékben jelenlévő részecskék nagy és kis molekulatömege jobb hatást biztosít a terméknek. Szemben a technika állásának javaslataival, úgy látszik, előnyös megőrizni a végső elegyben a nagyobb molekulatömegű részecskéket is, ami bizonyos heterogenitást biztosít.

A találmány szerinti eljárással előállított elegy felezési ideje az ismert termékekhez képest hosszabb még a javított heparinnál is. Ez utóbbihoz képest fontos megemlíteni azt, hogy a találmány szerinti eljárással előállított elegy felezési ideje független a befecskendezett anyag mennyiségétől. Ez annál jelentősebb, mivel

HU 210 925 Β a termék hatása előre megmondható sokkal inkább, mint a heparin esetében.

Emberben a találmány szerinti eljárással előállított elegy biodiszponibilitása kiváló, amelyet az anti-Xa szubsztancia hatásával mértünk, heparin esetében 30% körüli, és a találmány szerinti elegyé 90% körüli. Ez az előny lehetővé teszi, hogy a befecskendezett mennyiséget csökkentsük és a terápiás hatékonyságát javítsuk.

Másik jelentős tulajdonsága a találmány szerinti eljárással előállított elegynek az, hogy nagy sebességgel szívódik fel a szervezetben. Ez a jellemzője lehetővé teszi az azonnali biológiai aktivitását, nagyobb biztonságot nyújt a kezelés során azzal, hogy gyorsan telíti a beteg szervezetét.

A találmány szerinti eljárással előállított elegy másik jellemzője a gyenge „clearance”-e, összehasonlítva más termékekkel és a javított heparin készítményekkel. A kémiai szerkezetének és molekulatömegének vagy szulfáttartalmának tudható be, hogy az elegy valóban ellenáll a lebomlásnak (deszulfatálás, hidrolízis) és a szervezetből való eliminálásnak, ami szintén növeli a terápiás kapacitását.

A találmány szerinti eljárással előállított készítmény hosszabb ideig tartózkodik a szervezetben, mint a kiindulási heparin. Ez a tulajdonsága más szóval annyit jelent, hogy hosszabb ideig marad in vivő hatékony, ezáltal jobb a terápiás hatékonysága.

Ezen túlmenően ezeknek a készítményeknek az érzékenysége kisebb a szérumban lévő faktorokkal szemben, ami szintén növeli hatását in vivő, és lehetővé teszi a kisebb dózisok alkalmazását.

A készítmény különösen előnyös tulajdonságait az előállítási eljárás során ellenőriztük, valamint a jelenlévő részecskék szerkezeti jellemzőit, és a molekuláris megoszlását. Az így kapott elegyben a kis és nagy molekulatömegű molekulák megoszlása rendkívül kedvező, ami biztosítja a kívánt antitrombotikus hatást, kis mértékű hemorrágiás hatás mellett.

A találmány szerinti eljárással előállított készítmények jellemzőit a könnyű és a nehéz láncok százalékával lehet kifejezni, valamint az elegy tömegátlagos molekulatömeg és a számátlagos molekulatömege arányával, ami a molekuláris megoszlást tükrözi.

A találmány tárgya tehát szulfátéit poliszacharidok elegyének előállítására vonatkozik, amelyek a heparin általános szerkezetét képező poliszacharidokból áll, az jellemzi, hogy az átlagos molekulatömeg alacsonyabb a heparin molekulatömegénél, és 2000 daltonnál kisebb molekulatömegű poliszacharid láncot 9-20%, és 8000 daltonnái nagyobb molekulatömegű poliszacharid láncot 5 és 20% közötti mennyiségben tartalmaz. A tömegátlagos molekulatömeg és a számátlagos molekulatömeg aránya 1,3 és 1,6 közötti.

Azt találtuk, hogy ezeket a tulajdonságokat még javítani lehetett az elegy szennyezőanyag tartalmának csökkentésével. A legtöbb heparin különböző szennyezőanyagokat tartalmaz, mint nukleinsavat, polipeptideket és különböző poliszacharidokat. Ezek közül megemlíthetjük különösen a kondroitin-kénsavat, a heparánt vagy a dermatán-szulfátot. Minden szennyező anyag molekulatömege rendkívül nagy a szubsztituensek miatt, vagy pedig a szulfatálás mértéke miatt és képesek megzavarni az előállítás során a terméket (például a depolimerázáció során) vagy módosítják a végső molekuláris megoszlást vagy közvetlenül a hatását úgy, hogy az aktív láncok arányát módosítják. Sikerült az eljárást úgy tökéletesíteni, hogy lehetővé váljék a szennyező anyagok eltávolítása, amelynek segítségével az elegy minősége javul, miután ennek az előkezelésnek alávetettük. Az előkezelés hatását meg lehet mérni úgy, hogy a szennyezőanyagok összehasonlító mintájaként dermatán-szulfátot (heparánt) használunk.

A találmány szerinti eljárás különleges előnyét az jelenti, hogy a szulfátéit poliszacharidok elegye a fent említett jellemzőkkel rendelkezik, vagyis 2%-nál kevesebb dermatán-szulfátot tartalmaz, ha előkezeljük.

A találmány szerinti egyik előnyös eljárással előállított szulfátéit poliszacharidok elegyében lévő molekulák átlagos molekulatömege körülbelül 3500 dalton és körülbelül 5500 dalton közötti.

A találmány szerinti eljárással előállított szulfátéit poliszacharidok láncának egyik végén túlnyomórészt 2-O-szulfo-4-enopiranóz-uronsav van.

A találmány tárgyát képezi a szulfátéit poliszacharidok elegyének előállítási eljárása, amelyek molekulatömege kisebb, mint a hepariné, és a 2000 daltonnái kisebb molekulatömegű láncok száma 9 és 20% közötti, a 8000 daltonnái nagyobb molekulatömegű láncoké 5 és 20% közötti. Ezekben az elegyekben a tömegátlagos molekulatömeg és a számátlagos molekulatömeg aránya 1,3 és 1,6 közötti. A találmány szerinti eljárás a következő műveletekkel jellemezhető:

- az első műveletnél a heparin vizes oldatát sózzuk hosszúláncú kvatemer ammóniumsó segítségével,

- a második művelet során egy így kapott sót észterezünk úgy, hogy az észterezés mértéke 9,5% és 14% közötti legyen és

- a harmadik műveletnél egy kapott 9,5 és 14% közötti észterezettségű észtert depolimerizálunk.

Megállapítottuk, hogy a depolimerizáció szintjét és így a végtermék molekuláris jellemzőit is lehet ellenőrizni, a kiindulási heparinsó észterezésének mértéke alapján.

A találmány szerinti eljárással lehetséges közvetlenül és reprodukálható módon a szulfátéit poliszacharidok elegyének előállítása, amelyek jellemzőit a fentiekben ismertettük.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott kiindulási heparin előnyösen sertésből származó heparin, elsősorban sertés nyálkahártyájából származó heparin. Azt találtuk, hogy a kiindulási heparin származásától függően a kapott elegy aktivitása lényegesen változhat. Nevezetesen ha a kiindulási anyag szarvasmarha eredetű, akkor a kapott elegy antikoaguláns aktivitása nagyobb, mint ha sertés intesztinuumának nyálkahártyájából kapott heparinból indulunk ki.

A találmány szerinti eljárás egyik különösen előnyös változata szerint a kiindulási heparint előzetesen alkohol segítségével kicsapjuk. Ez az előkezelés lehe3

HU 210 925 Β tővé teszi a következő szennyezőanyagok, mint kondroitin kénsav vagy heparán-szulfát mennyiségének csökkentését.

Jó eredményeket kaphatunk alkohollal, például metanollal.

A heparin nátriumsója tisztaságának mértékét ezt követően kiszorításos folyadékkromatográfiás eljárással határozzuk meg.

Ez az előzetes művelet lehetővé teszi, hogy a heparin 2%-nál kevesebb dermatán-szulfát szennyezést tartalmazzon.

A heparin sóvá alakítását még pontosabban a következőképpen végezhetjük el.

A heparin sóját úgy állíthatjuk elő, hogy egy megfelelő kvaterner ammónium sót reagáltatunk a heparin nátriumsójával, vizes közegben, 20 °C körüli hőmérsékleten. Kvaterner ammóniumsóként előnyösen benzetoniumsót, mint benzetonium-kloridot használunk, amelyet a heparin nátriumsójával reagáltathatunk.

A második műveletet, az észterezési műveletet, az alábbi feltételek között végezzük.

A heparinsó részleges észterének előállítását, ahol az észterezés mértéke 9,5 és 14% közötti, úgy végezhetjük el, hogy a heparin hosszúláncú kvaterner ammóniumsóját észterezzük, klórozott szerves oldószerben, klór-származék jelenlétében. A reakció hatékonyságát növelhetjük, hogy ha különböző reagensek arányát, a hőmérsékletet és a reakció időtartamát ellenőrizzük.

A heparin részleges észtere előnyösen aromás észter.

Az alkalmazott klór-származék előnyösen benzilklorid, és a klórozott oldószer kloroform vagy diklórmetán.

Ahhoz, hogy az észterezés mértéke 9,5 és 14% közötti legyen, különösen előnyös egy tömegrész heparinsóra körülbelül 1 térfogatrész klór-származékot alkalmazni, 3-5 térfogatrész klórozott szerves oldószert. A reakciót 15-48 óra alatt végezzük el 25 és 45 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 30 és 40 °C között.

Előnyös eljárás során a heparin részleges észtere nátriumsója alakjában van.

Az így keletkezett észter visszanyerhető úgy, hogy alkohol, mint metanol hozzáadásával kicsapjuk, nátriumacetát jelenlétében. Előnyösen 1-1,2 térfogat mennyiségű alkoholt alkalmazunk egy térfogat reakcióelegyre. Az észterezés mértékét a keletkezett észter nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással ellenőrizhetjük. Benzilészter esetében a kapott benzilalkohol mennyiségét mérhetjük az észter elszappanosításával, 0 °C-on.

A találmány szerinti eljárás utolsó műveletét a következőképpen végezzük.

A depolimerizációt előnyösen úgy végezzük, hogy a kapott észtert erős bázissal kezeljük vizes oldatban. Még pontosabban nátrium-hidroxidot használhatunk.

A bázis és az észter tömegének az aránya előnyösen 0,05 és 0,02 közötti és még előnyösebben 0,08 és 0,15 közötti.

A reakcióelegy hőmérsékletét 50 és 70 °C közöttire, előnyösen 55 és 65 °C közöttire állítjuk be, és a reakció időtartama 30 perc és 3 óra közötti, előnyösen L-2 óra közötti.

Előnyösen olyan közegben dolgozunk, ahol a víz és az észter tömegének az aránya 15 és 30 közötti.

A depolimerizáció műveletét különösen előnyösen úgy végezhetjük el, ha az alábbiakat elegyítjük:

- a heparin aromás észterének 1 tömegrésze, amelyet a második művelet során kaptunk, só alakjában, amelynek észterezési mértéke 9,5 és 14% közötti,

- nátrium-hidroxid 0,08 és 0,15 tömegrész, és

- 20-30 tömegrész víz,

- a reakcióelegyet 1-2 órán keresztül 55-65 ’C közötti hőmérsékleten tartjuk.

A kapott terméket ezt követően úgy nyerjük vissza, hogy a reakcióelegyet hígított ásványi sav segítségével előnyösen hidrogén-klorid segítségével semlegesítjük, majd kicsapjuk alkohol, mint metanol jelenlétében.

Ezzel az eljárással közvetlenül és reprodukálható módon állíthatjuk elő a szulfátéit poliszacharidok elegyét, amelyek:

- 9-20% mennyiségben tartalmaznak 2000 daltonnal kisebb molekulatömegű láncot,

- 5-20% mennyiségben tartalmaznak 8000 daltonnál nagyobb molekulatömegű láncot, átlagos molekulatömegük 3500 és 5500 dalton közötti, és a tőmegátlagos molekulatömeg és a számátlagos molekulatömeg aránya 1,3 és 1,6 közötti.

A találmány szerinti eljárással előállított elegy előnyösen alkalmazható antitrombózisos szerként.

Elsősorban vénás trombózisok megelőzésére lehet alkalmazni, súlyos esetekben. Ez vonatkozik elhúzódó kezelések esetére is. Ez az elegy teszi lehetővé először, hogy állandó adagokkal csökkentsék az ortopéd sebészetben a trombózisos balesetek veszélyét. A kockázat minden kezelés hiányában 70%-os, heparin jelenlétében 25% körüli és a találmány szerinti eljárással előállított elegy esetében 10% körüli, vagy ennél is kevesebb.

Művese tubulusaiba is befecskendezhető a találmány szerinti eljárással előállított elegy, csökkenti a trombózisra való hajlamot, mielőtt az még kifejlődne. Ez utóbbi alkalmazást kiterjeszthetjük sebészeti beteganyag trombózisának megelőzésére.

A találmány szerinti eljárással előállított elegy másik előnyös terápiás alkalmazása az artériás trombózisok megelőzésére is alkalmazható, nevezetesen a szívinfarktus esetében.

A találmány szerinti eljárással előállított elegy különösen értékes alkalmazási területe a sebészeti beteganyag vénás trombózisának megelőzése, valamint a posztoperatív szakban. A sebészeti alkalmazásával megelőzhetjük az operáció alatti vérzéseket, valamint az anesztetikumok típusának problémáit és adagolását, amelyek az operáció előtti időszakban jelentkeznek.

A találmány szerinti eljárással előállított készítmények terápiás hatékonyságát a bemutatott tulajdonságok együttese igazolja.

A következő példák a találmány szerinti eljárást mutatják be korlátozó jelleg nélkül.

Meghatározási eljárás

A termék molekulatömegét és a molekulatömeg

HU 210 925 Β megoszlását nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással határoztuk meg két sorozat oszlopban, például amelyek TSK G 3000SW (30x0,75 cm) és Lichrosorb 100 Diói 10 μ (25x0,75 cm), vagy TSK G 2000SW, amely refractométer detektorával van összekapcsolva. Az alkalmazott oldószer 0,3 mólos, pH = 7 értékű foszfát pufferoldat, és az áthaladási sebessége 0,7 ml percenként. A rendszert standard anyagmintával, enoxaparinnal (PHARMUKA) kalibráltuk, amelyet frakcionálással állítottunk elő kiszorításos kromatográfiás eljárással, agaróz-poli(akril-amid)-on (IBF), amely eljárást Barrow Cliffe és munkatársai írtak le Thromb. Res.-ben [12, 27-36 (1977-78)] vagy Lane, D. A. és munkatársai a Thromb. Res.-ben [12, 257-271 (1977— 78)]. Az eredményeket Perkin Elmer GPC6 féle készülék segítségével számítottuk ki.

A következő példákban az elegy globális antikoaguláns aktivitását turbidimetriás eljárással mértük és standard anyagmintaként kis molekulatömegű nemzetközi heparinmintát használtunk. AXa-faktor (antitrombotikus faktor) hatását amidolitikus módszerrel határoztuk meg kromogén szubsztrátumon, amelyet Teien és munkatársai ismertettek a Thromb. Res.-ben [10,399^110 (1977)], ők alkalmazták először standard anyagmintaként a kis molekulatömegű nemzetközi heparin mintát.

1. példa

Ez a példa mutatja be a heparin nátriumsójának előkezelését, amely lehetővé teszi a szennyezőanyagok, mint a kondroitin kénsav és a heparán-szulfát mennyiségének a csökkentését.

g kereskedelmi forgalomban kapható heparin (nátriumsó) 100 ml vízzel készített oldatához, amely 3 g nátrium-kloridot tartalmaz, 80 ml metanolt adunk. A termék kicsapódik, szűrjük, mossuk, majd szárítjuk. Az így kapott heparin nátriumsója tisztaságának mértékét kiszorításos folyadékkromatográfiás eljárással határozzuk meg két sorosan kapcsolt oszloppal, amelyek TSK 2000SW és TSK 3000SW néven kaphatók a kereskedelmi forgalomban, amelyhez UV detektor van kapcsolva és 206 nm-re van beállítva. A használt mozgófázis vizes, 0,5 mólos nátrium-szulfát-oldat, amely 1 ml percenkénti sebességgel cirkulál. Az eredményt összehasonlítjuk egy olyan heparinmintával, amely 2% dermatán-szulfátot tartalmaz.

A fenti körülmények szerint kapott heparin minta 2%-nál kevesebb dermatán-szulfátot tartalmaz.

2. példa

Ez a példa a heparin kvaterner ammóniumsójának az előállítását mutatja be.

Az 1. példa szerint előállított, 2%-nál kevesebb dermatán-szulfátot tartalmazó heparin nátriumsó 10 gjának 100 ml vízzel készített oldatához 25 g benzetonium-klorid 125 ml vízzel készített oldatát adjuk. A terméket szobahőmérsékleten tartjuk, ezt követően szűrjük, majd vízzel mossuk és szárítjuk.

Ezzel azonos módon állítjuk elő a heparin benzetoniumsóját, amelyet nem vetettünk alá az 1. példa szerinti kezelésnek.

3. példa

Ez a példa mutatja be a találmány szerinti elegy előállítását és tulajdonságait.

1. Észterezés.

g, az 1. példa szerint előkezelt benzetonium-heparinát 75 ml diklór-metánnal készített oldatához 15 ml benzil-kloridot adunk. Az oldatot 35 °C-on hevítjük és ezen a hőmérsékleten tartjuk 25 órán keresztül, majd 90 ml 10%-os, metanolos nátrium-acetát-oldatot adunk hozzá, szűrjük, metanollal mossuk és szárítjuk. így 6,5 g heparin benzilészterét kapjuk nátriumsó alakjában, az észterezésének mértékét meghatároztuk, ez 13,3%.

2. Depolimerízáció.

A fentiekben kapott heparin benzilészterének 10 gját nátriumsója alakjában 250 ml vízben oldunk. Az oldatot 62 °C-on hevítjük, majd 0,9 g nátrium-hidroxidot adunk hozzá. Ezen a hőmérsékleten tartjuk 1 óra és 30 percen keresztül. A reakcióelegyet ezt követően 20 °C körüli hőmérsékletre lehűtjük, hígított hidrogénklorid-oldat hozzáadásával semlegesítjük. A reakcióelegy koncentrációját kiegészítjük úgy, hogy 10% nátrium-kloridot tartalmazzon. A terméket 750 ml metanollal kicsapjuk, szűrjük és szárítjuk. Az így kapott heparin szerkezeti jellemzői a következők:

- átlagos molekulatömeg: 3900 dalton

- molekuláris megoszlás:

2000 daltonnál kisebb molekulatömegű lánc 20%

8000 dalton fölötti molekulatömegű lánc 5,5% .

- a megoszlás: 1,39

- antitrombotikus aktivitás (Xa): 106 NE

- antikoaguláns hatás: 22,6 NE.

4. példa

Hasonló eljárással olyan észterből kiindulva, amelynek észterezési mértéke 9,5 és 14% közötti, depolimerizált heparin-oldatot állítunk elő, amelynek szerkezeti jellemzői a következők:

a) - átlagos molekulatömeg: 4425 dalton

- molekuláris megoszlás:

2000 daltonnái kisebb molekulatömegű lánc 12,4%

8000 daltonnál nagyobb molekulatömegű lánc 9,3%.

- megoszlás: 1,37

- antitrombotikus hatás: 102 NE

- antikoaguláns hatás: 33 NE.

b) - átlagos molekulatömeg: 4579 dalton

- molekuláris megoszlás:

2000 daltonnál kisebb molekulatömegű lánc 11,2%

8000 daltonnál nagyobb molekulatömegű lánc 10,4%

- megoszlás: 1,37

- antitrombotikus hatás: 104 NE

- antikoaguláns hatás: 37 NE.

c) - átlagos molekulatömeg: 4446 dalton

HU 210 925 Β

- molekuláris megoszlás:

2000 daltonnál kisebb molekulatömegű lánc 12,6% 8000 daltonnái nagyobb molekulatömegű lánc 9,5%.

- megoszlás: 1,38

- antitrombotikus hatás: 100 NE

- antikoaguláns hatás: 32 NE.

5. példa

Ez a példa olyan elegy előállítását mutatja be, amely nem tartozik a találmány szerinti eljárás köréhez.

1. Észterezés.

g, az 1. példa szerint előkezelt benzetonium-heparinát 60 ml diklór-metánnal készített oldatához 12 ml benzil-kloridot adunk. Az oldatot 28 °C hőmérsékleten hevítjük és ezen a hőmérsékleten tartjuk 30 órán keresztül. Ekkor 90 ml 10%-os, metanolos nátrium-acetát-oldatot adunk hozzá, szüljük, metanollal mossuk és szárítjuk, így 6,3 g heparin benzilésztert kapunk nátriumsója alakjában. A termék észterezésének mértékét meghatároztuk nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással, az észter 0 °C hőmérsékleten való elszappanosításakor szabaddá váló benzilalkohol mennyiségéből, ez 9,2%.

2. Depolimerizáció.

A fentiek szerint kapott 10 g heparin-benzilésztert nátriumsója alakjában 200 ml vízben oldunk. Az oldatot 58 °C hőmérsékleten hevítjük, majd 1,1 g nátriumhidroxidot adunk hozzá. A hőmérsékletet 1 órán keresztül 58 °C hőmérsékleten tartjuk. A reakcióelegyet ezt követően 20 °C hőmérsékletre lehűtjük, hígított hidrogén-klorid-oldat hozzáadásával semlegesítjük. A reakcióelegy nátrium-klorid koncentrációját 10%-osra állítjuk be. A kapott terméket ezt követően 600 ml metanollal kicsapjuk, szűrjük és szárítjuk. így heparint kapunk, amelynek szerkezeti jellemzői a következők:

- átlagos molekulatömeg: 5425 dalton

- molekuláris megoszlás:

2000 daltonnál kisebb molekulatömegű lánc 9,6%

8000 daltonnál nagyobb molekulatömegű lánc 19,5%

- megoszlás: 1,44

- antitrombotikus hatás: 122 NE

- antikoaguláns hatás: 68,6 NE.

Az eredmények alapján az antikoaguláns hatás jelentős, amely igazolja, hogy a találmány szerinti eljárással előállított elegy értékesebb és jellemzői kifejezettebbek.

6. példa

Ez a példa a találmány szerinti eljárással előállított elegy stabilitásának előnyét in vivő bemutatja, amelyet a plazmában való felezési idejével fejezünk ki.

Az első farmakokinetikai vizsgálatokat 21-30 éves önkéntes jelentkezőkön végeztük. 20 és 80 mg/ml közötti adagokat fecskendeztünk be szubkután. Az idők folyamán mintákat vettünk ki (4,5 ml) és 4 °C körüli hőmérsékleten raktároztuk. Majd a mintákat centrifugáltuk 15 percen keresztül, 2300 g sebességgel. A vértestecskékben szegény plazmát elkülönítettük és az analízis előtt lefagyasztottuk. Az elegy felezési idejét meghatároztuk az antitrombotikus hatás mérésével. A kapott eredmények a következők:

- a 3. és 4. példa szerint előállított elegy eredményei a következők:

mg-os adag: az esetek 75%-ában a felezési idő 4 óránál több volt és az esetek 45%-ánál 4,5 óránál is több volt.

mg-os adag: az esetek 75%-ában a felezési idő 3,7 óránál több volt.

- azonos körülmények között adagolva az érintetlen heparin intravénásán befecskendezve: a felezés idő 0,6 óra körüli.

_ a 40 144 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett eljárással előállított termék felezési ideje 4,5 óra az esetek 17%-ában.

A második vizsgálatot is elvégeztük hasonló körülmények között 20 betegen, és a következő eredményeket kaptuk a találmány szerinti eleggyel:

mg-os adag: az esetek 80%-ában a felezési idő 4 óránál több volt és az esetek 40%-ánál 4,5 óránál is több volt.

mg-os adag: az esetek 60%-ában a felezési idő 3,9 óra.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás a heparint alkotó poliszacharidok általános szerkezetének megfelelő szulfatált poliszacharidok elegyeinek előállítására, amelyek átlagos molekulatömege kisebb, mint a hepariné, a 2000 daltonnál kisebb molekulatömegű láncok száma 9 és 20% közötti a 8000 daltonnál nagyobb molekulatömegű láncok száma 5 és 20% közötti, és a tömegátlagos molekulatömegük és a számátlagos molekulatömegük aránya 1,3 és 1,6 között van, a heparinnak hosszúláncú ammóniumsóval végzett kisózásával, a kapott só észterezésével és az észter depolimerizálásával, azzal jellemezve, hogy

- a heparint a hosszúláncú kvaterner ammóniumsóval vizes közegben kisózzuk;

- a kapott sót olyan mértékben észterezzük, hogy észterezettsége 9,5 és 14% között legyen, és

- a kapott, 9,5 és 14% közötti észterezettségű észtert depolimerizáljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás 2%-nál kevesebb dermatán-szulfátot tartalmazó elegy előállítására, azzal jellemezve, hogy előkezelt heparint alkalmazunk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan elegyet állítunk elő, amelynek átlagos molekulatömege 3500 és 5500 dalton között van.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a depolimerizálással a szulfatált poliszacharidok láncának egyik végén 2-0-szulfo-4-enopiranózuronsav-csoportot tartalmazó elegyet állítunk elő.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az észterképzést klórozott oldószerben, aromás klórszármazékkal végezzük.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez6

HU 210 925 B ve, hogy klórszármazékként benzil-kloridot és oldószerként kloroformot vagy diklór-metánt alkalmazunk.
7. Az 1., 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az észterezést 1 tömegrész heparinsó és 1 térfogatrész klórozott származék reagáltatásával 3-5 térfogatrész klórozott szerves oldószerben, 25 és 45 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 30 és 40 °C között végezzük.
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a depolimerizálási műveletben az észtert erős bázis vizes oldatával kezeljük.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bázist és az észtert 0,05 és 0,2 közötti, előnyösen 0,08 és 0,15 közötti tömegarányban alkalmazzuk.
10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizet és az észtert 15 és 30 közötti tömegarányban alkalmazzuk.
11. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez5 ve, hogy 50 és 70 °C között, előnyösen 55 és 65 °C közötti hőmérsékleten 30 perc és 3 óra között, előnyösen 1 és 2 óra között reagáltatunk.
12. Az 1-11. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyaként alkohol se10 gítségével kicsapott heparint alkalmazunk.
13. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az 1-12. igénypontok bármelyike szerint előállított szulfátéit poliszacharidok elegyét a gyógyszertechnológiában szokáso15 san alkalmazott segédanyagokkal összekeverjük és gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.