PT98102B - Processo de preparacao de misturas de polissacaridos de baixo peso molecular e de composicoes farmaceuticas que as contem - Google Patents
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Description
MEMÓRIA DESCRITIVA
O presente invento refere-se à preparação de polissacáridos de baixo peso molecular. Mais particularmente, refere-se à preparação de heparinas de baixo peso molecular.
As heparinas são substâncias biológicas de extracção, da família dos glicosaminoglicanos, utilizadas pelas suas propriedades anticoagulantes e antitrombóticas. Nomeadamente são utilizadas no tratamento de tromboses venosas pós-operatórias, No entanto, na sua forma nativa, as heparinas apresentam um certo número de inconvenientes que limitam as condições da sua utiliza-ção. Em particular, a actividade anticoagulante pode ocasionar hemorragias e a sua sensibilidade a certos factores séricos, como o of4, impõem a utilização de doses relativamente importantes. É portanto necessário priviligiar a actividade antitrombótica, atribuída especialmente à actividade antiprotrombinase, à custa da actividade anticoagulante, atribuída ao efeito antitrombina.
Com este fim, foi já proposto fragmentarem-se as heparinas em moléculas de pesos moleculares médios mais pequenos. Em particular, é já conhecida na arte anterior a patente europeia EP 40144. Esta patente descreve misturas de polissacáridos sulfatados com a estrutura geral dos polissacáridos constitutivos da heparina, possuindo uma dupla ligação etilénica numa das extremidades da sua cadeia, e cujo peso molecular em peso está compreendido entre 2000 e 10000 Dalton. Estas misturas são obtidas por despolimerização e saponificação dum éster da heparina. Indica-se que apresentam uma actividade anti-trombótica elevada e uma actividade anticoagulante global inferior à da heparina.
Todavia, um dos maiores problemas encontrados com as heparinas reside no facto de se tratar de produtos muito heterogéneos. É portanto difícil apreciar a contribuição de cada uma das espécies na actividade da heparina, de conhecer o comportamento dessas espécies no caso da despolimerização e, enfim, de contro72 353
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-3lar a estrutura destas espécies e as suas proporções respectivas nos produtos finais. Por estas razões, os inconvenientes atrás mencionados não podem ser resolvidos de maneira totalmente satisfatória. Especialmente os processos descritos na arte anterior e em particular na patente EP 40144 não permitem obter misturas que possuam as propriedades farmacológicas necessárias para uma melhor aplicação, a saber, uma semi-vida plasmática suficientemente elevada, uma velocidade de absorção bastante grande, tuna forte biodisponibilidade ou ainda uma fraca clearance.
Não obstante foram descritos outros processos que permitem fragmentar a heparina para diminuir os seus efeitos indesejáveis (Johnson et coll. Thrombos. Haemostas. Stuttg., 1976, 35, 586; Lane et coll, Thrombosis Research 16, 651, Lasker et coll. US 3 766 167). Cada um destes processos parece indicar que a actividade procurada é priviligiada quando o grau de fragmentação da heparina aumenta (ver também o pedido de patente europeia EP 301 618 relativo a pentassacáridos que possuem actividade antitrombótica).
Com a mesma finalidade, estudos recentes sobre o mecanismo de acção das heparinas na formação de trombina evidenciaram a influência do peso molecular médio das heparinas sobre a sua actividade in vitro (Béguin et coll., Thromb. Haemost., 61, 30, 1989). Os autores indicam que as heparinas de baixo peso molecular possuem uma actividade antiprotrombinase e as heparinas de peso molecular mais elevado, uma actividade antitrombina.
Paralelamente, foi também proposto fraccionar as heparinas, a fim de extrair as misturas de peso molecular médio mais homogéneo. Conhece-se, em particular, o pedido de patente europeia EP 337 327 que descreve um processo de preparação de fragmentos de oligossacáridos derivados da heparina, que permitem obter misturas com uma dispersão molecular reduzida. Segundo este processo, eliminam-se previamente as fracções de peso molecular inferior a 3000 Dalton, o que leva a retirar do produto final os fragmentos que contêm menos de 10 a 16 sacáridos, e as espécies de peso molecular superior a 7000 Dalton. Segundo os inventores,
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-4este tratamento que tem por objectivo homogeneizar a mistura final, permitiria diminuir a actividade anticoagulante, conservando no entanto a actividade antitrombótica procurada.
No entanto, apesar destes trabalhos, as misturas obtidas apresentam sempre um efeito hemorrágico residual ou uma actividade antitrombótica demasiado fraca. Além disso, nada na arte anterior permite determinar guais são as propriedades que devem ser reunidas para se obter uma actividade biológica óptima. Aliás, a conclusão dos autores do artigo acima citado é eloquente: Não sabemos qual é a combinação óptima das propriedades da heparina. A caracterização precisa das diferentes preparações e a correlação destas propriedades com as observações clínicas poderia eventualmente conduzir a uma resposta.
Verificou-se agora que é possível obter heparinas que apresentam propriedades vantajosas, especialmente para a sua utilização na profilaxia e tratamento de acidentes trombóticos.De modo inesperado, a requerente com efeito verificou que a presença no produto final, simultaneamente de espécies de elevado e baixo peso molecular, conferia uma melhor actividade ao produto. Contrariamente às indicações da arte anterior, parece portanto preferível conservar na mistura final as espécies de peso molecular elevado bem como uma certa heterogeneidade.
O estudo farmacocinético das misturas do invento mostra que elas apresentam propriedades particularmente vantajosas.
Em particular, as misturas do invento apresentam um tempo de semi-vida superior aos outros produtos conhecidos e ao da heparina madura. Por outro lado, em relação a esta última, é importante sublinhar que a semi-vida das misturas do invento é independente da dose injectada. Isto é interessante pois que o efeito produzido é bastante mais previzível do que no caso da heparina.
Além disso, no homem, as misturas do invento apresentam uma excelente biodisponibilidade, medida pela actividade anti-Xa. As72 353
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sim, sendo de cerca de 30% para a heparina, ela é de cerca de 90% para as misturas do invento. Isto é vantajoso pois permite reduzir as doses injectadas e melhorar a potencialidade terapêutica.
Por outro lado, uma outra propriedade importante das misturas do invento reside na sua grande velocidade de absorção. Esta característica permite obter uma actividade biológica quase instantânea e oferece portanto uma maior segurança no tratamento, cobrindo rapidamente o paciente.
Uma outra característica das misturas do invento é a sua fraca clearance em comparação com a de outros produtos e com a da heparina madura. Graças à sua estrutura química, ao seu peso molecular ou à sua taxa de sulfato, estas misturas apresentam com efeito uma resistência particular à degradação (dessulfatação, hidrólise) e à eliminação, o que aumenta ainda as suas capacidades terapêuticas.
Igualmente, as preparações do invento possuem um tempo de residência acrescido em relação à heparina de partida. Esta propriedade traduz-se num prolongamento do tempo durante o qual o produto permanece activo in vivo e, portanto, numa melhor eficácia terapêutica.
Além disso, estas preparações apresentam igualmente uma sensibilidade reduzida aos factores séricos, o que aumenta a sua duração de acção in vivo e permite utilizá-las em doses fracas.
Estas propriedades particularmente vantajosas obtêm-se controlando, no decurso do processo de preparação, certas características estruturais das espécies em presença, bem como a sua repartição molecular. As misturas assim obtidas têm uma relação favorável entre fracções de elevado e baixo pesos moleculares, o que lhes confere as propriedades antitrombóticas pretendidas, com um efeito hemorrágico pequeno.
Esta característica do invento exprime-se simultaneamente
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pela percentagem de cadeias pesadas e de cadeias leves, e pela relação entre o peso molecular médio em peso, das misturas, e o seu peso molecular médio em número, que reflecte a dispersão molecular.
Um objectivo do presente invento reside portanto na preparação de misturas de polissacáridos sulfatados que apresentam a estrutura geral dos polissacáridos constitutivos da heparina, caracterizadas por terem um peso molecular médio em peso inferior ao da heparina, por conterem entre 9 e 20% de cadeias de peso molecular inferior a 2000 Dalton e entre 5 e 20% de cadeias de peso molecular superior a 8000 Dalton, onde a relação peso molecular médio em peso/peso molecular médio em número, está compreendida entre 1,3 e 1,6.
Por outro lado, a requerente constatou que é possível melhorar ainda as propriedades das misturas diminuindo o seu teor de impurezas. Particularmente, a maior parte das heparinas contêm contaminantes como os ácidos nucleieos, polipéptidos ou diversos polissacáridos. Entre estes podem citar-se em particular os condroitina-sulfatos e o heparano ou o dermatana-sulfato. Cada um destes contaminantes devido ao seu peso molecular muito elevado, devido aos substituintes que transporta ou ao seu grau de sulfatação, é capaz de interferir durante a preparação do produto (na despolimerização por exemplo) para modificar a repartição molecular final ou directamente na actividade, modificando nomeadamente as proporções das cadeias activas. A requerente realizou agora um processo que permite eliminar estas impurezas e constatou uma melhoria na qualidade das misturas que sofreram este pré-tratamento. 0 efeito deste pré-tratamento pode ser medido utilizando como impureza testemunha o dermatana-sulfato.
Um objectivo mais particular do presente invento reside em misturas de polissacáridos sulfatados que apresentam as características acima enunciadas, caracterizadas por conterem menos de 2% de dermatana-sulfato.
De um modo preferido, as misturas de polissacáridos
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-7sulfatados do invento possuem um peso molecular médio em peso compreendido entre cerca de 3500 Dalton e cerca de 5500 Dalton.
Sempre dum modo preferencial, as cadeias de polissacáridos sulfatados que constituem as misturas do invento têm um ácido 2-0-sulfo-4-enopirano-surónico numa das suas extremidades.
Um outro aspecto do invento refere-se a um processo de preparação de misturas de polissacáridos sulfatados tendo um peso molecular médio em peso inferior ao da heparina, contendo entre 9 e 20% de cadeias de peso molecular inferior a 2000 Dalton e entre 5 e 20% de cadeias de peso molecular superior a 8000 Dalton, nos quais a relação peso molecular médio em peso/peso molecular médio em número está compreendida entre 1,3 e 1,6. 0 processo do invento caracteriza-se por se realizarem as seguintes etapas:
- numa primeira etapa, salifica-se, em meio aquoso, uma heparina por meio dum sal de amónio quaternário de cadeia longa,
- numa segunda etapa, esterifica-se o sal assim obtido, para preparar um éster com um grau de esterificação compreendido entre 9,5% e 14%, e
- numa terceira etapa, despolimeriza-se o éster obtido com um grau de esterificação compreendido entre 9,5 e 14%.
A requerente constatou com efeito que se pode controlar o nível de despolimerização e portanto as características moleculares do produto final, manejando o grau de esterificação do sal de heparina de partida.
De acordo com o invento, é portanto possível obter directamente e de maneira reprodutível misturas de polissacáridos sulfatados com as características acima indicadas.
A heparina de partida utilizada no processo do invento é de preferência uma heparina de porco e especialmente de mucosa de porco. Com efeito verificou-se que a actividade das misturas obtidas podia variar de maneira substancial segundo a origem da heparina de partida. Nomeadamente, quando a heparina de partida é de origem bovina, obtêm-se misturas com uma actividade anticoagu72 353
-8lante superior à obtida a partir da heparina da mucosa intestinal do porco.
Além disso, numa variante particularmente vantajosa, o processo do invento compreende uma outra etapa preliminar de precipitação da heparina de partida por meio de um álcool. Este pré-tratamento permite diminuir o teor de impurezas do tipo condroitina-sulfato ou heparana-sulfato .
Um álcool que dá bons resultados é por exemplo o metanol.
o grau de pureza da heparina sódica pode em seguida ser determinado por cromatografia líquida de exclusão estereoquímica.
Esta etapa preliminar permite nomeadamente preparar uma heparina com um teor em dermatana-sulfato inferior a 2%.
Mais precisamente, a salificação da heparina realiza-se do seguinte modo.
sal de heparina pode ser obtido por acção de um excesso do sal correspondente sobre uma heparina sódica, em meio aquoso, a uma temperatura de cerca de 20“C. De modo vantajoso, o sal de amónio quaternário utilizado é de preferência um sal de benzetónio, como por exemplo o cloreto de benzetónio, que se pode fazer reagir com a heparina sódica.
No que se refere à segunda etapa, prefere-se realizar a esterificação nas seguintes condições.
o éster parcial de heparina sob a forma de sal, onde a taxa de esterif icação está compreendida entre 9,5 e 14%, pode ser obtido por esterificação do sal de amónio quaternário de cadeia longa de heparina num solvente orgânico clorado, em presença dum derivado de cloro. Além disso, aumenta-se a eficácia da reacção controlando as proporções dos diferentes reagentes, a temperatura e o tempo de reacção.
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-9De modo vantajoso, aromático.
o éster parcial de heparina é um éster
Ainda se prefere que o derivado de cloro seja o cloreto de benzilo e o solvente clorado seja escolhido entre o clorofórmio e o cloreto de metileno.
Para obter uma taxa de esterificação compreendida entre 9,5 e 14%, é particularmente vantajoso utilizar, para 1 parte em peso do sal de heparina, cerca de 1 parte em volume do derivado de cloro, no seio de 3 a 5 partes em volume de solvente orgânico clorado, e efectuar a reacção durante um período de 15 a 48 horas, a uma temperatura compreendida entre 25 e 45 °C e, de preferência, entre 30 e 40°C.
Num modo preferido de realização, o éster parcial de heparina encontra-se sob a forma de sal de sódio.
Os ésteres assim preparados podem ser recuperados por precipitação por meio de um álcool, como por exemplo o metanol, em presença de acetato de sódio. De preferência, utiliza-se entre 1 e 1,2 volumes de álcool por volume de meio reagente. A taxa de esterificação do éster pode em seguida ser controlada por cromatografia em etapa líquida de alta eficiência. Em particular, no caso do éster benzílico, pode-se medir a quantidade de álcool benzílico obtida por saponificação do éster a 0°c.
A última etapa do processo do invento realiza-se vantajosamente do modo seguinte.
De preferência, a despolimerização realiza-se tratando o éster com uma base forte em solução aquosa. Mais precisamente pode utilizar-se a soda.
É vantajoso que a relação em peso base/éster esteja compreendida entre 0,05 e 0,2 e de preferência entre 0,08 e 0,15.
Ajusta-se a temperatura do meio até um valor compreendido
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-10entre 50 e 70°C e, de preferência, entre 55 e 65eC, e a reacção realiza-se durante um período que vai de 30 minutos até 3 horas, de preferência de 1 a 2 horas.
Além disso, é preferível operar num meio em que a relação em peso água/éster esteja compreendida entre 15 e 30.
Uma maneira particularmente vantajosa de realizar a despolimerização consiste em misturar:
- uma parte em peso dum éster aromático da heparina como o obtido na segunda etapa, sob a forma de sal, cuja taxa de esterificação esteja compreendida entre 9,5 e 14%,
- entre 0,08 e 0,15 partes em peso de soda, e
- entre 20 e 30 partes em peso de água, e depois manter, durante 1 a 2 horas, a temperatura entre 55 e 65°C.
produto pode em seguida ser recuperado por neutralização do meio reaccional recorrendo a um ácido mineral diluído, de preferência o ácido clorídrico, e precipitação em presença dum álcool como o metanol.
Desta maneira é possível obter, directamente e de maneira reprodutível, uma mistura de polissacáridos sulfatados contendo
- entre 9 e 20% de cadeias de peso molecular inferior a 2000 Dalton,
- entre 5 e 20% de cadeias de peso molecular superior a 8000 Dalton, e tendo um peso molecular médio compreendido entre 3500 e 5500 Dalton e uma relação peso molecular médio em peso/peso molecular médio em número, compreendida entre 1,3 e 1,6.
As misturas do presente invento podem ser utilizadas de modo vantajoso como agentes antitrombóticos.
Em particular, são aplicáveis na prevenção de tromboses venosas em situações de risco. Isto é igualmente válido para situações de risco prolongado. Em particular, estas misturas per72 353
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-li-
mitem pela primeira vez diminuir, em doses fixas, os riscos de acidentes trombóticos na cirurgia ortopédica. Este risco que é de 70% na ausência de qualquer tratamento e de cerca de 25% na presença de heparina, situa-se à volta dos 10% ou menos com as misturas do invento.
De igual modo, injectadas nos túbulos dum rim artificial, estas misturas podem reduzir as tromboses susceptíveis de aí se desenvolverem. Esta última aplicação pode ser estendida à prevenção de tromboses no material cirúrgico.
Uma outra utilização terapêutica vantajosa das misturas do invento reside na prevenção de acidentes trombóticos arteriais, nomeadamente no caso do enfarte do miocárdio.
Por outro lado, uma aplicação particularmente interessante das misturas de acordo com o presente invento reside na possibilidade de utilizar um regime pós-operatório para a prevenção de tromboses venosas nos doentes operados. Esta aplicação é bastante vantajosa, pois permite evitar os riscos de hemorragia durante a operação e os problemas derivados do tipo e das doses de anestesiante, ocasionados pela prevenção em regime pós-operatório.
O conjunto destas propriedades mostra as potencialidades terapêuticas das preparações do invento.
Os exemplos que se seguem ilustram o presente invento e não têm um carácter limitativo.
TÉCNICAS DE DOSAGEM
Os pesos moleculares e as repartições do peso molecular dos produtos são determinados por cromatografia líquida de alta pressão com duas colunas em série, p. ex. os comercializados sob a designação TSK G 3000SW (30x0,75 cm) e Lichrosorb 100 Diol 10μ (25x0,75 cm), ou TSK G 2000SW ligadas a um detector refractométrico. 0 solvente utilizado é um tampão fosfato 0,3M, pH 7, e o caudal é de 0,7 ml/min. Calibra-se o sistema com padrões preparados por fraccionamento da enoxaparina (PHARMUKA) por cromatogra72 353
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fia de exclusão sobre agarose-poliacrilamida (IBF) segundo a técnica descrita por BarrowCliffe e Col., Thromb. res., 12, 27-36 (1977-78) ou D.A. Lane e Col., Thromb. res., 12, 257-271 (1977-78). Os resultados são calculados por meio do programa de computador GPC6 (Perkin Elmer).
Nos exemplos que se seguem, a actividade anticoagulante global das misturas é medida por turbidimetria utilizando um primeiro padrão internacional de heparina de baixo peso molecular. A actividade anti-factor Xa (antitrombótico) é medida pelo método amidolítico sobre um substrato cromogéneo descrito por Teien e Col., Thromb. res., 10, 399-410 (1977), utilizando o primeiro padrão internacional de heparina de baixo peso molecular.
EXEMPLO 1
Este exemplo ilustra a etapa preliminar de tratamento da heparina sódica que permite reduzir o teor de impurezas do tipo condroitina-sulfato e heparana-sulfato .
A 10 g de heparina comercial (sal de sódio) em solução em 100 ml de água contendo 3 g de cloreto de sódio, juntam-se 80 ml de metanol. Após precipitação, filtra-se o produto obtido, lavase e seca-se. O grau de pureza da heparina sódica assim obtida é medido por cromatografia liquida de exclusão estereoquímica, com duas colunas em série, como as comercializadas sob a designação TSK 2000SW (60 x 0,75 cm) e TSK 3000SW (60 x 0,75 cm), ligadas a um detector UV regulado aos 206 nm. A etapa móvel utilizada é uma solução aquosa de sulfato de sódio 0,5 M circulando a um caudal de 1 ml.min.1. Compara-se o ensaio com uma heparina testemunha, contendo 2% de dermatana-sulfato .
Nas condições acima indicadas, a heparina obtida continha menos de 2% de dermatana-sulfato .
EXEMPLO 2
Este exemplo ilustra a preparação do sal de amónio quaternário de heparina.
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A uma solução de 10 g de heparinato de sódio, segundo o exemplo l, contendo menos de 2% de dermatana-sulfato, em 100 ml de água, junta-se uma solução de 25g de cloreto de benzetónio em 125 ml de água. O produto obtido à temperatura ambiente, é em seguida filtrado, lavado com água e seco.
De maneira idêntica prepara-se o sal de benzetónio duma heparina que não tenha sido submetida ao tratamento do exemplo 1.
EXEMPLO 3
Este exemplo ilustra a preparação e as propriedades das misturas do invento.
1. Esterificação
A uma solução de 15 g de heparinato de benzetónio previamente tratado segundo o processo do exemplo 1 em 75 ml de cloreto de metileno, juntam-se 15 ml de cloreto de benzilo. Aquece-se a solução a uma temperatura de 35°C, que se mantém durante 25 horas. Juntam-se então 90 ml duma solução a 10% de acetato de sódio em metanol, filtra-se, lava-se com metanol e seca-se. Obtêm-se assim 6,5 g de éster benzilico de heparina, sob a forma de sal de sódio cuja taxa de esterificação, determinada como acima se indicou. é de 13,3%.
2. Despolimerização
Dissolvem-se 10 g do éster benzilico de heparina, obtido acima sob a forma de sal de sódio em 250 ml de água. A esta solução aquecida a 62°C juntam-se 0,9 g de soda. Mantém-se a temperatura durante 1 hora e 30 minutos a 62°C. A mistura reaccional é em seguida arrefecida a cerca de 20°C e neutralizada pela adição de ácido clorídrico diluído. Ajusta-se então a concentração do meio reaccional a 10% em cloreto de sódio. 0 produto é por fim precipitado em 750 ml de metanol, filtrado e seco. Obtém-se assim uma heparina que apresenta as seguintes características estruturais:
- peso molecular médio em peso: 3900 Dalton
- repartição molecular:
- 20% de cadeias de peso molecular inferior a 2000 Dalton
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-14- 5,5% de cadeias de peso molecular superior a 8000
Dalton
- dispersão: d = 1,39
- actividade anti-Xa: 106 UI actividade anti-coagulante
22,6 UI
EXEMPLO 4
De modo semelhante, partindo de ésteres com uma taxa de esterificação entre 9,5 e 14%, preparam-se soluções de heparina despolimerizada com as seguintes caracteristicas estruturais:
a) - peso molecular médio em peso: 4425 Dalton - repartição molecular:
| - 12,4% | de | cadeias | de | peso | molecular | inferior a | 2000 | |
| Dalton | - 9,3% | de | cadeias | de | peso | molecular | superior a | 8000 |
| Dalton | ||||||||
| - | dispersão: | d = | = 1,37 |
- actividade anti-Xa: 102 UI
- actividade anti-coagulante: 33 UI
b) - peso molecular médio em peso: 4579 Dalton
- repartição molecular:
- 11,2% de cadeias de peso molecular inferior a 2000
Dalton
- 10,4% de cadeias de peso molecular superior a 8000
Dalton
- dispersão: d = 1,37
- actividade anti-Xa: 104 UI
- actividade anti-coagulante: 37 UI
c) - peso molecular médio em peso: 4446 Dalton - repartição molecular:
| - 12,6% | de | cadeias | de | peso | molecular | inferior a | 2000 | |
| Dalton | ||||||||
| - 9,5% | de | cadeias | de | peso | molecular | superior a | 8000 |
Dalton dispersão: d = 1,38 actividade anti-Xa: 100 UI actividade anti-coagulante: 32 UI
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-15EXEMPLO 5
Este exemplo ilustra a preparação duma mistura que não apresenta as características do invento.
1. Esterificação
A uma solução de 15 g de heparinato de benzetónio previamente tratado segundo o processo do exemplo 1 em 60 ml de cloreto de metileno, juntam-se 12 ml de cloreto de benzilo. Aquece-se a solução a uma temperatura de 28°C, que se mantém durante 30 horas. Juntam-se então 90 ml duma solução a 10% de acetato de sódio em metanol, filtra-se, lava-se com metanol e seca-se. Obtêm-se assim 6,3 g de éster benzílico de heparina, sob a forma de sal de sódio. A taxa de esterificação deste produto, determinada por medida em cromatografia líquida de alta eficiência, da quantidade de álcool benzílico libertada por saponificação do éster a 0°C, é de 9,2%.
2. Despolimerização
Dissolvem-se 10 g do éster benzílico de heparina acima obtido sob a forma de sal de sódio, em 200 ml de água. A esta solução aquecida a 58°C juntam-se 1,1 g de soda. Mantém-se a temperatura durante 1 hora a 58°C. A mistura reaccional é em seguida arrefecida até cerca de 20°C e neutralizada por adição de ácido clorídrico diluído. Ajusta-se então a concentração do meio reaccional a 10% em cloreto de sódio. O produto é por fim precipitado em 600 ml de metanol, filtrado e seco. Obtém-se assim uma heparina gue apresenta as seguintes características estruturais:
- peso molecular médio em peso: 5425 Dalton
- repartição molecular:
- 9,6% de cadeias de peso molecular inferior a 2000
Dalton
- 19,5% de cadeias de peso molecular superior a 8000
Dalton
- dispersão: d = 1,44
- actividade anti-Xa: 122 UI
- actividade anti-coagulante: 68,6 UI
353
ST 90044
-16Estes resultados, que revelam uma actividade anti-coagulante elevada, demonstram a superioridade das misturas preparadas segundo o invento, e que possuem as características enunciadas.
EXEMPLO 6
Este exemplo ilustra o ganho de estabilidade in vivo das misturas do invento, expresso pela sua semi-vida plasmática.
Realizou-se um primeiro estudo farmaco-cinético em voluntários entre os 21 e os 30 anos. Aplicaram-se injecções subcutâneas em doses que variavam entre 20 e 80 mg/ml. No decorrer do tempo, retiram-se amostras (4,5 ml) e guardam-se a cerca de 4°C. Centrifugam-se então as amostras durante 15 minutos a 2300 g, separa-se o plasmo pobre em plaquetas que se congela antes da análise. Determina-se em seguida a semi-vida das misturas medindo a actividade anti-Xa. Os resultados obtidos são os seguintes:
- com as misturas obtidas nos exemplos 3 e 4:
- dose 40 mg: em 75% dos casos a semi-vida é superior a 4 horas, e é mesmo superior a 4 horas e meia em cerca de 45% dos casos
- dose 60 mg: em 75% dos casos, a semi-vida é superior a 3,7 horas
- em condições de dosagem idênticas, a heparina intacta, injectada por via endo-venosa, possui uma semi-vida de 0,6 horas aproximadamente.
- Quando o produto é preparado segundo o processo descrito na patente europeia EP 40144, a semi-vida é superior a 4 horas e meia em 17% dos casos.
Um segundo estudo realizado em condições semelhantes em 20 pacientes deu os resultados seguintes para as misturas conformes com o presente invento.
- dose 40 mg: em 80% dos casos, a semi-vida é superior a 4 horas, e é superior a 4 horas e meia em 40%, aproximadamente, dos casos
- dose 20 mg: em 60% dos casos, a semi-vida é superior a 3,9 horas.
Claims (12)
- REIVINDICAÇÕES1 - Processo de preparação de misturas de polissacáridos sulfatados que apresentam a estrutura geral dos polissacáridos constituintes da heparina e que têm um peso molecular médio, em peso, inferior ao da heparina, entre 9 e 20% de cadeias com peso molecular inferior a 2000 Dalton e entre 5 a 20% de cadeias com peso molecular superior a 8000 Dalton, e nos quais a relação peso molecular médio em peso/peso molecular médio em número está compreendida entre 1,3 e 1,6, caracterizado por:- numa primeira etapa, se salificar, em meio aquoso, uma heparina por meio de um sal de amónio quaternário de cadeia lonqa,- numa segunda etapa, se esterificar o sal assim obtido, para formar um éster possuindo um grau de esterificação compreendido entre 9,5% e 14%, e- numa terceira etapa, se despolimerizar o éster obtido que possui um grau de esterificação compreendido entre 9,5% e 14%.
- 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma mistura contendo menos do que 2% de dermatana-sulfato.
- 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma mistura possuindo um peso molecular médio compreendido entre cerca de 3500 Dalton e cerca de 5500 Dalton.
- 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma mistura cujas cadeias de polissacáridos sulfatados têm um ácido 2-0.-sulfo-4-enopirano-surónico numa das suas extremidades.
- 5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a segunda etapa se realizar num solvente orgânico clorado, na presença de um derivado de cloro.
- 6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o derivado de cloro ser o cloreto de benzilo e o solvente ser escolhido entre o clorofórmio e o cloreto de metileno.72 353ST 90044-187 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1, 5 ou 6, caracterizado por a esterificação se realizar por mistura de 1 parte, em peso, do sal de heparina com cerca de 1 parte, em volume, de um derivado de cloro, no seio de 3 a 5 partes, em volume, de um solvente orgânico clorado, a uma temperatura compreendida entre 25 e 45 °C, de preferência entre 30 e 40°C.
- 8 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a terceira etapa se realizar por tratamento do éster com uma base forte em solução aquosa.
- 9 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a relação, em peso, base/éster, estar compreendida entre 0,05 e 0,2, de preferência entre 0,08 e 0,15.
- 10 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a relação, em peso, água/éster, estar compreendida entre 15 e 30.
- 11 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a temperatura do meio ser ajustada a um valor compreendido entre 50 e 70°C, de preferência entre 55 e 65°C, e a reacção ser efectuada durante um período de 30 minutos a 3 horas, de preferência de 1 a 2 horas.
- 12 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a ll, caracterizado por, numa etapa preliminar, se precipitar a heparina de partida por meio de um álcool.
- 13 - Processo de preparação de composições terapêuticas, caracterizado por se associar uma mistura de polissacáridos sulfatados obtida segundo o processo de qualquer das reivindicações 1 a 12 com veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB1A | Laying open of patent application |
Effective date: 19911126 |
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| FG3A | Patent granted, date of granting |
Effective date: 19980825 |
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| PD3A | Change of proprietorship |
Owner name: AVENTIS PHARMA, S.A. Effective date: 20011116 |
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| MM4A | Annulment/lapse due to non-payment of fees, searched and examined patent |
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