CN100436483C - 一种依诺肝素钠的纯化生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种依诺肝素钠的纯化生产方法,在水媒介中用长链季铵盐盐化肝素,经氯苄酯化后,在碱性条件下解聚得到分子量在3500-5500道尔顿之间的依诺肝素粗品,将上述解聚所得依诺肝素钠粗品经活性炭和大孔吸附树脂进行脱色后,得到能达到或优于欧洲药典4规定的颜色标准的依诺肝素成品,该方法经济实用,易于实现工业化生产,而且不会对依诺肝素钠的结构产生破坏。
Description
技术领域
本发明涉及一种低分子肝素钠的纯化生产方法,特别地,涉及一种依诺肝素钠的纯化生产方法。
发明背景
依诺肝素钠英文名为enoxaparin sodium,根据欧洲药典4的定义,其化学结构式如下:
其中,n为1-21的整数,R为H或SO3Na,R’为H或SO3Na或CO-CH3,当R2为H时R3为CO2Na或者当R2为CO2Na时R3为H。
根据欧洲药典4的规定,依诺肝素钠属于低分子肝素家族中的一员,系用猪肠黏膜中提取的肝素钠盐经苄基酯化后碱性解聚而得,平均分子量为4500道尔顿左右,主要特征为在分子的非还原端有一个4-烯醇吡喃糖醛酸结构。
依诺肝素的主要作用机制在于本品通过与抗凝血酶III及其复合物结合,加强对Xa因子和凝血酶(IIa因子)的抑制作用。但由于本品分子链较短,对抗Xa活性较强而久,对凝血酶抑制作用较弱,抗血栓形成活性强于抗凝血活性。与普通肝素相比,本品具有抗血栓作用强,出血危险性小,生物利用度高,半衰期长,使用方便等优点,因而深受医生和患者青睐。依诺肝素现在全球肝素类药物市场中拥有最多的适应证,包括:
(1)预防因病而致活动有限患者发生的深度静脉血栓(此适应证虽迟至2001年才在美国获得批准,但这类患者人数估计却高达每年1300万人左右);
(2)预防腹部手术后存在血栓栓塞并发症风险的患者发生的深度静脉血栓;
(3)预防髋部置换术后患者发生的深度静脉血栓;
(4)预防膝置换术后患者发生的深度静脉血栓;
(5)与阿司匹林(aspirin)合用预防不稳定型心绞痛和无Q波心肌梗塞患者发生的动脉血栓(此类患者人数全球估计有200万人);
(6)与华法林(warfarin)合用用于有或无肺栓塞之急性深度静脉血栓的住院患者;
(7)与华法林合用用于无肺栓塞之急性深度静脉血栓的门诊患者。
另外,安万特(Aventis)公司来我国申请了两个依诺肝素在治疗大脑缺血(CN01803471.3)和预防及治疗中枢神经系统创伤(CN98805489.2)的方法专利。
目前世界上生产低分子肝素钠的方法有物理分级法(FR2440376、US4692435、FR2453875等)、化学裂解法(EP14184、EP37319、EP347588、US4629699、EP380943等)和酶法(EP64452、US4826827、EP244236等)。依诺肝素由于其特殊的结构,采用的是碱裂解法。有关依诺肝素的生产工艺,已有多篇文献报道。例如,US4692435公开了肝素的前期制备工艺,主要用于去除肝素原料中的硫酸软骨素。US4440926报道了利用季铵盐酯化肝素的生产工艺。US5389618报道了一种依诺肝素的生产工艺,主要过程包括肝素钠的预处理、肝素钠季铵盐的制备、肝素苄基酯的制备(酯化程度在9.5%-14%之间)以及在碱性条件下解聚肝素苄基酯衍生物得到依诺肝素成品。
但是,上述文献均未提及一个重要的生产工艺问题,即在依诺肝素生产过程中会产生一些有色杂质,目前还不清楚这些杂质的物质结构,而且很难用常规手段分离出这些有色杂质。而依诺肝素钠的色素问题是影响依诺肝素钠成品质量的重要指标,药物溶液的颜色及其与规定颜色的差异能在一定程度上反映药物的纯度。欧洲药典4规定依诺肝素10%水溶液(重量体积比)的溶液颜色为黄色标准5号色((有关标准色的规定,可参考European Pharmacopoeia 4中2.2.2节“degree of coloration of liquids”中的有关规定),这对依诺肝素钠的生产工艺提出较高的要求。由于依诺肝素是亲水性多糖,一般的纯化工艺如活性炭吸附尽管可以脱掉部分色素,但残留色素无法再进一步分离,无法达到欧洲药典4的标准;而化学脱色法则容易破坏依诺肝素的结构,从而影响依诺肝素成品的质量。因此,需要采用新的纯化工艺来解决这一技术难题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种依诺肝素钠的纯化生产方法,应用该方法生产出的依诺肝素钠符合欧洲药典4的规定。
本发明的目的通过以下技术方案来实现:
在水媒介中用长链季铵盐盐化肝素,苄基酯化上述被盐化的肝素,控制其酯化程度在9.5%-14%之间,然后在碱性条件下解聚上述酯化程度在9.5%-14%之间的肝素,得到依诺肝素钠粗品。
根据上述工艺制备的依诺肝素钠粗品,其颜色为黄褐色,需要进行脱色。发明人经过对比研究发现,将依诺肝素钠粗品上树脂柱脱色可以有效解决依诺肝素钠的色素问题,尤其大孔吸附树脂脱色效果明显。大孔吸附树脂中脱色效果较好的种类如罗门哈斯公司(Rohm Haas)生产的AMBERLITE系列,如极性大孔聚烷酯吸附树脂XAD-7HP,非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂XAD-1600等;南开大学化工厂生产的非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂H1020、H103和D4006等,其中优选非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂H103。
进一步的,可将树脂脱色和活性炭脱色结合起来,能够对依诺肝素钠中的色素进行有效分离。例如,先将粗品用活性炭进行吸附,再上柱用大孔吸附树脂脱色;或者粗品先上柱用大孔吸附树脂脱色,再用活性炭吸附脱色。
本发明的有益效果是,利用活性炭和大孔吸附树脂组合法对依诺肝素钠进行脱色,可有效分离有色杂质,使依诺肝素钠成品达到或优于欧洲药典4规定的黄色标准5号色,而常规方法如仅用活性炭脱色无法使依诺肝素钠成品达到欧洲药典4规定的黄色标准5号色;另外,该方法经济实用,易于实现工业化生产,而且不会对依诺肝素钠的结构产生破坏,这要比化学脱色法优越的多。
具体实施方式
肝素钠首先需要经过解聚成为平均分子量在3500-5500道尔顿之间的依诺肝素钠粗品,其技术方案为:肝素钠先通过乙醇沉淀,利用杂质和肝素钠在乙醇中沉淀溶解度不同,减少肝素钠原料中硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素的含量。然后,在水介质中用长链四价铵盐(例如苄乙铵)盐化肝素钠,生成肝素钠季铵盐沉淀。肝素钠季铵盐在二氯甲烷中和氯苄发生酯化反应,控制酯化程度在9.5%-14%之间,酯化率的测定可参考US5389618说明书第五栏44-48行的方法,即取m克肝素苄基酯水解,测定生成的苯甲醇含量为n克,n/m所得的比值即为酯化率,经沉淀、过滤、洗涤、干燥后得到肝素苄基酯。将肝素苄基酯溶于水,加入适量氢氧化钠,于60-65℃反应1-3个小时,用盐酸中和,加入氯化钠,乙醇沉淀后,过滤干燥即得依诺肝素钠粗品,其颜色为褐黄色。
依据该生产工艺,最后得到的依诺肝素钠为硫酸肝素多糖的不同种类的混合物,混合物的基本组成为9%-20%的多糖链分子量小于2000道尔顿,5%-20%的多糖链分子量大于8000道尔顿,60%-86%的多糖链的分子量在2000-8000道尔顿之间,其平均分子量在3500-5500道尔顿之间。
进一步的,根据欧洲药典4标准,优选依诺肝素钠中混合物的基本组成为12%-20%的多糖链分子量小于2000道尔顿,,68%-88%的多糖链的分子量在2000-8000道尔顿之间,其平均分子量在3500-5500道尔顿之间。
根据上述工艺生产出的依诺肝素钠,不可避免的会产生色素问题。脱色可采用活性炭脱色法和树脂脱色法组合进行。将依诺肝素钠加水溶解后,经活性炭脱色,再上树脂柱,冻干后,即可得到符合欧洲药典4标准的依诺肝素钠成品;或者将依诺肝素钠样品先上树脂柱,经收集目标组分、沉淀、过滤后,再经活性炭脱色,经沉淀冻干后,即可得到符合欧洲药典4标准的依诺肝素钠成品,各项指标的检测可参考欧洲药典4依诺肝素标准的相关规定。
上述的树脂可选用大孔吸附树脂中脱色效果较好的种类,如罗门哈斯公司(Rohm Haas)生产的AMBERLITE系列,如极性大孔聚烷酯吸附树脂XAD-7HP,非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂XAD-1600等;南开大学化工厂生产的非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂H1020、H103和D4006等。其中,优选南开大学化工厂生产的非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂H103,其各项技术参数如下所示:
为进一步阐明本发明,提供以下利用大孔吸附树脂和活性炭对依诺肝素钠进行脱色的实例。
实施例1、依诺肝素钠的制备
1.1在水媒介中用长链季铵盐盐化肝素
称取肝素原料100g和20g氯化钠溶于1L水,室温下慢慢加入800ml 95%的乙醇,沉淀过夜后,去上清,沉淀加1L水溶解。称取250g的苄乙铵溶于1L水中,将其慢慢加入肝素溶液中,搅拌。沉淀过滤,用水清洗后,过滤烘干,约得到327g的肝素钠季铵盐。
1.2苄基酯化肝素
将上述肝素钠季铵盐溶于1.2L二氯甲烷中,缓慢加入350ml氯苄,在35℃下搅拌25小时。另外称取200g醋酸钠溶于2L甲醇中,慢慢加入到上述二氯甲烷溶液中,待沉淀析出后,过滤,用甲醇清洗2遍,过滤烘干,约得到116g肝素苄基酯,根据上述方法,测得其酯化率为13.4%。
1.3碱性条件下解聚
将116g肝素苄基酯溶于2.5L水中,加热到62℃,加入10.8g氢氧化钠,搅拌裂解1.5个小时,降温到20℃,加入盐酸调节溶液pH至7.0。然后加入氯化钠使终浓度为10%,加入8L甲醇,搅拌30分钟,待沉淀析出后,过滤,用甲醇滤洗两次,真空干燥,所得样品为褐黄色,称重约为43.6g。经检测,重均分子量为4718,其中分子量小于2000道尔顿的多糖分子含量为12.6%,分子量在2000-8000道尔顿之间的多糖分子含量为74.5%,分子量大于8000道尔顿的多糖分子含量为12.8%
实施例2、脱色法一
称取23克依诺肝素粗品,加水溶解,比色相当于欧洲药典4规定的黄色3号色。加入活性炭,100rpm搅拌40分钟,先用滤纸过滤除去活性炭,然后再用微孔滤膜过滤除去残余的活性炭,比色介于欧洲药典4定义的黄色4号色和5号色之间。将依诺肝素钠溶液上H103非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂柱(南开大学化工厂生产),柱床体积150ml,用水洗脱,收集目标峰。收集液再上柱洗脱2次,收集目标峰,比色优于欧洲药典4规定的黄色5号色,接近于黄色6号色。将收集液用乙醇沉淀,经过滤、冻干后,称重得18.8克。经检测,所得依诺肝素钠成品各项指标如下:
重均分子量:4604;
分子量分布:分子量小于2000道尔顿的多糖分子含量为13.8%,分子量在2000-8000道尔顿之间的多糖分子含量为75.1%。
抗Xa/抗II:4.1;
抗Xa:108IU/mg;
231nm吸收值:14.06。
实施例3:脱色法二
称取30克依诺肝素粗品,加水溶解,比色接近于欧洲药典4规定的黄色3号色。将依诺肝素溶液上XAD-7HP极性大孔聚烷酯吸附树脂柱(Rohm Haas公司生产),柱床体积为120ml,用水洗脱,收集目标峰。再上柱洗脱2次,收集目标峰,比色为欧洲药典4定义的黄色4号色。加入活性炭,100rpm搅拌40分钟,先用滤纸过滤除去活性炭,然后再用微孔滤膜过滤除去残余的活性炭,比色优于欧洲药典4规定的黄色5号色。收集液经乙醇沉淀,过滤、冻干后,称重得26.4克。经检测,所得依诺肝素钠成品各项指标如下:
重均分子量:4653;
分子量分布:分子量小于2000道尔顿的多糖分子含量为13.4%,分子量在2000-8000道尔顿之间的多糖分子含量为75.8%。
抗Xa/抗II:4.3;
抗Xa:112.4IU/mg;
231nm吸收值:14.56。
上述实施例用来解释说明本发明,而不是对本发明进行限制,在本发明的精神和权利要求的保护范围内,对本发明作出的任何修改和改变,都落入本发明的保护范围。
Claims (7)
1、一种依诺肝素钠的纯化方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将依诺肝素钠粗品加水溶解,然后用活性炭和大孔吸附树脂组合脱色,其中大孔吸附树脂脱色时用水洗脱,所述的大孔吸附树脂为极性大孔聚烷酯吸附树脂XAD-7HP、非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂XAD-1600、非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂H1020、非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂H103或非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂D4006;
(2)可任选地由脱色后的水溶液获得依诺肝素钠成品。
2、根据权利要求1所述的依诺肝素钠的纯化方法,其特征在于,所述步骤(1)中,所述的依诺肝素钠粗品为硫酸肝素多糖的不同种类的混合物,混合物的基本组成为9%-20%的多糖链分子量小于2000道尔顿,5%-20%的多糖链分子量大于8000道尔顿,60%-86%的多糖链的分子量在2000-8000道尔顿之间,其平均分子量在3500-5500道尔顿之间。
3、根据权利要求1所述的依诺肝素钠的纯化方法,其特征在于,所述步骤(1)中,先经活性炭吸附脱色,再经大孔吸附树脂脱色;或者先经大孔吸附树脂脱色,再经活性炭吸附脱色。
4、根据权利要求3所述的依诺肝素钠的纯化方法,其特征在于,所述步骤(1)中,活性炭吸附脱色包括:向溶液中加入活性炭,100rpm搅拌40分钟,用滤纸过滤除去活性炭,再用微孔滤膜过滤除去残余的活性炭。
5、根据权利要求1所述的依诺肝素钠的纯化方法,其特征在于,所述的大孔吸附树脂为非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂H103。
6、根据权利要求1所述的依诺肝素钠的纯化方法,其特征在于,所述步骤(2)中,纯化的依诺肝素钠水溶液经乙醇沉淀、过滤、冻干后,获得依诺肝素钠成品。
7、根据权利要求1-6任一项所述的依诺肝素钠的纯化方法,其特征在于,所述依诺肝素钠粗品通过以下步骤获得:在水媒介中用苄乙铵盐化肝素,苄基酯化上述被盐化的肝素,控制其酯化程度在9.5%-14%之间,然后在碱性条件下解聚上述酯化程度在9.5%-14%之间的肝素,得到依诺肝素粗品。
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