CN1749284A

CN1749284A - 低分子肝素纯化方法

Info

Publication number: CN1749284A
Application number: CN 200510094424
Authority: CN
Inventors: 唐明龙
Original assignee: JIANYOU BIOLOGICAL CHEMICAL PHARMACEUTICLA CO Ltd NANJING
Current assignee: JIANYOU BIOLOGICAL CHEMICAL PHARMACEUTICLA CO Ltd NANJING
Priority date: 2005-09-19
Filing date: 2005-09-19
Publication date: 2006-03-22

Abstract

本发明涉及用于抗凝血和抗血栓药物的低分子肝素的提取纯化方法，以粗品低分子肝素为原料，将其溶于NaCl溶液，通过分子筛凝胶层析分离截取符合分子量要求的层析液，层析液加入1.0～1.5倍95％浓度的乙醇，沉淀经脱水、干燥，得低分子肝素片断。本发明采用在层析前用紫外灯照射或加入氧化剂次氯酸钠或氢溴酸反应的方法除去粗品中有害的－N－NO－；采用强阴离子交换树脂方法除去粗品中苯甲醇等多种化学不纯物。本发明采用理化手段分离出特定分子量分布的低分子肝素片断，除去不纯物，产品能达到低分子肝素产品国际药典标准。方法简单，收率高。

Description

低分子肝素纯化方法

技术领域

本发明涉及用于抗凝血和抗血栓药物的低分子肝素的提取纯化方法，属生物医药领域。

背景技术

肝素应用于临床抗凝血治疗已逾70余年。自上世纪80年代研究发现，随着肝素分子量的降低，其抗凝血活性较快地下降，但和抗血栓功能密切相关的抗Xa活性下降相对较慢。基于这一发现，人们研究出具有较高抗血栓活性-抗Xa活性和较低出血倾向-低抗凝血活性的肝素片断，即后来应运而生的“低分子肝素”。研究表明，分子量2000以下的肝素片断没有抗Xa活性，分子量大于8000的片断虽有较高的抗Xa活性，但抗IIa活性也较高，使抗Xa/IIa比值太低而不符合低分子肝素钠的标准。因此药典规定，低分子肝素钠中要求将低于2000和高于8000的部分控制在一定范围之内。

低分子肝素的出现开辟了老药新用的新篇章。2004年低分子肝素钠销售已逾40亿美元。特别是安万特的依诺肝素钠2004年销售已逾25亿美元。低分子肝素是以不同分子量分布为其特点的生化药物。不同的分子量分布决定具有不同的抗Xa和抗IIa生物活性。位居全球前四位的制药巨人均有其特定的低分子肝素钠，如辉瑞的达肝素钠分子量在6000左右；葛兰素的低分子肝素钙分子量为4300左右；赛诺菲-安万特的依诺肝素钠是含有不饱和双链的分子量在4500左右的片断；诺华的山道低分子肝素钠是分子量为4500～8000的肝素片断。

低分子肝素的提取工艺有化学降解法、物理降解法、酶降解法等。酶降解法由于生产成本太高而缺乏竞争力。物理降解，如Y-射线因反应难以控制，至今未能大量生产。

目前国际市场低分子肝素主流产品均以化学降解方法制得，化学降解法生产的低分子肝素见于四大制药巨头。辉瑞从Pharmacia接收了亚硝酸钠降解的达肝素钠，葛兰素从赛诺菲购买的亚硝酸钠降解的纳曲肝素钙，赛诺菲-安万特以肝素季铵盐化→酯化→碱降解的依诺肝素钠。Opocrin以H₂O₂-CuCl降解，生产新复先低分子肝素钠。诺华以亚硝酸异戊酯降解生产的山道低分子肝素钠。以化学法降解的低分子肝素钠是分子量从几百到近一万的不同分子量片断的混合物，因此工业生产上必须采用有效的分离纯化手段得到在一定分子量范围的片段。目前多以分级沉淀进行纯化分离，但是分级沉淀技术难以分离出分子量分布狭窄的片断，如达肝素钠分子量分布为5600～6400时，分级沉淀难以达到分离效果。为了达到合理的片断分布，常常使收得率降低。

从常规肝素到低分子肝素的降解过程中需加入氧化剂及各种有机溶剂，如亚硝酸降解中，有硼氢化钠参与；碱降解法中有季铵盐、氯化苄、二氯甲烷、甲醇等参与；H₂O₂法中有铜离子参与。多种化学物参与反应，可能使降解过程中产生一些有害的中间产物和反应副产物，如亚硝酸降解过程中必然会产生对人体有致癌作用的-N-NO-基团，含量一般达1～20ppm，超过欧洲药典标准0.25ppm的4～80倍；碱降解过程中会产生苯甲醇等，反应结束后还必须去除这些不纯物。

发明内容

本发明的目的是提供一种以理化手段从粗品肝素钠中分离出特定分子量分布的低分子肝素片断并除去不纯物的方法，使低分子肝素质量符合药典的标准。

本发明低分子肝素纯化方法以化学降解所得的粗品低分子肝素为原料，按如下步骤纯化：

①粗品肝素经HPLC测定平均分子量及分子量分布，确定样品中需要除去部分的百分数；

②粗品低分子肝素溶解于1％NaCl(重量)溶液中，制成10～15％(g/ml)粗品肝素钠溶液，溶液过平衡好的分子筛凝胶层析柱，流速：一柱床体积/2小时，以每管等体积(如每管10m1)收集流出的层析液，并按先后序号排列；

③逐管测定200nm光吸收值，绘制出光吸收图谱，根据面积积分及对应步骤①确定的百分数确定需弃去的层析液序号，保留其余序号管内层析液；

④合并步骤②保留的各管层析液，加入1.0～1.5倍95％(重量)乙醇，沉淀过夜，弃去上清，沉淀脱水、干燥，得低分子肝素粗品片断。

所说的分子筛层析柱选自Sepharose，Superdex或Sephadex分子筛。一般小分子化合物不纯物都可在Superdex×30和SephadexG-50分子筛层析中有效地除去。

对于检得-N-NO-含量超标的粗品肝素，还应选择以下步骤：

将步骤②制得的肝素溶液在过分子筛层析柱之前，先用16W波长190～360nm紫外灯照射15～30分钟。

或将步骤②制得的肝素溶液在过分子筛层析柱之前，按低分子肝素重量的0.01～0.1％的量加入氧化剂次氯酸钠或氢溴酸反应。

对于不纯物物超标的粗品肝素，本发明将步骤②制得的肝素溶液在过分子筛层析柱之前，过阴离子交换树脂柱，使低分子肝素被树脂吸附，含不纯物的流出液作为废被弃去，用重量浓度2-5％的NaCl溶液清洗树脂，去杂质，再用重量浓度12-15％的NaCl溶液从树脂上洗脱肝素。

综上所述，本发明采用分子筛层析技术能得到合理的分子量分布的低分子肝素片断，并且收得率高于其他传统的方法。经比较，分子筛层析技术的收率一般要高于分级沉淀5个百分点。对于价格昂贵的生化产品而言，收率的提高对经济效益的提高是至关重要的。本发明选用Sepharose，Superdex，Sephadex等分子筛层析分离取得了较好的结果。Sepharose因具有流速快便于使用。Superdex.因其分离效果好值得推荐。Sephadex因其价格便宜值得选择。在Sephadex G-50层析时，低分子肝素浓度为10％左右，流速为一个柱床体积/1.5-2小时。对于不纯物超标的肝素，本发明采用对肝素有特异吸附作用的强阴离子交换树脂，使低分子肝素被树脂吸附，不纯物留在废液中被弃去，这一方法可以除去苯甲醇等多种不纯物。对于-N-NO-超标的情况，本发明采用紫外线照射的物理方法或加入使之产生原子氧的次氯酸或氢溴酸的化学方法打断-N-NO-键。-N-NO-键打开后，生成亚硝酸盐而易于被层析方法除去。经本发明方法纯化的低分子肝素，其分子分布及不纯物含量均能达到低分子肝素产品国际药典标准。

具体实施方式

下面以低分子肝素钠为例说明低分子肝素的的提取和纯化过程。

实施例1

100g肝素钠，溶于1000ml 1％NaCl溶液中，调PH2.0～3.0，室温，加入1.5～3.5％w/w的亚硝酸钠，最好2.95g亚硝酸钠，反应2小时，以碘化钾-淀粉试纸测定不变蓝，说明反应完成。调PH9.5，加入1g硼氢化钠，放置过夜。调PH3.5，一小时后调PH至6.0，加入0.40倍体积乙醇，大分子沉淀析出，将上清吸出，补加95％乙醇至0.70～0.8倍体积，过夜，沉淀脱水、干燥，得粗品55g。

HPLC测定样品分子量分布结果：＜2000部分大于20％，＞8000部分符合规定，荧光化学分析测得-N-NO 8ppm，高于药典规定0.25ppm，硼6ppm，高于药典1ppm，需进行如下纯化处理：

上述粗品溶于550ml 1％(重量)NaCl溶液中，16W波长254nm，紫外灯照射30分钟。

上述照射液过平衡好的Superdex层析柱，层析柱的径/高为1：3.5，样品层为10％柱床体积；流速：1.5小时/柱床体积。流出液按每管10ml，依次分管收集。

用波长200nm紫外光检测各管收集液，根据HPLC分子范围测定结果，弃去序号在先的＜2000的小分子部分，其余部分用1.5倍乙醇沉淀、脱水、干燥得纯化低分子肝素钠产品。

产品检测结果为：硼＜1ppm，-N-NO-0.05ppm，分子量分布符合纳屈肝素钠质量标准。

实施例2

100g肝素钠加入250～350g季铵盐，反应完全后，干燥得到大约350g肝素钠季铵盐。

肝素季铵盐加入400ml氯化苄，2000ml二氯甲烷，室温反应24小时。

加入10％乙酸钠甲醇溶液3500ml，脱水干燥得180克酯化肝素。

180克酯化肝素溶于2000ml水，加温至60℃，加入0.1M NaOH反应一小时。反应结束后加入等体积的乙醇溶液。过夜，收集沉淀，脱水，干燥，得粗品58g。

HPLC测分子量分布，测得分子量＜2000和＞8000两部分均不符合要求，且苯甲醇含量高达3％(药典小于0.1％)，需要进一步纯化。

粗品溶于1％NaCl(重量浓度)溶液，通过平衡好的Amberlite958离子交换柱。肝素被树脂吸附，弃去废液，用2-5％(重量浓度)NaCl溶液清洗树脂，去杂质。用12-15％(重量浓度)NaCl溶液从树脂上洗脱肝素钠。溶液过Sepharose层析柱，收集分子量合格部分。同例1方法加1.0～1.5倍95％(重量浓度)乙醇，然后沉淀，脱水，干燥得产品。

测定各项指标均符合依诺肝素钠要求。

实施例3

肝素钠100g溶于适合的溶液中，调PH2.4左右，加入3ML亚硝酸异戊酯1～2小时。碘化钾-淀粉试纸测定不变蓝色说明反应完成。调PH9.5左右，加入0.8g硼氢化钠，过夜。次日调PH至3.5，一小时后调PH6.0左右。一倍体积乙醇沉淀，脱水、干燥，得62g粗品。

HPLC测得分子量分布不符合药典要求，进一步层析纯化如下。粗品溶于350ml 1％氯化钠溶液中，密闭条件下加50微升氢溴酸，反应一小时。按例1方法将溶液通过Sephadex G-50层析柱，层析条件同例1；测200nm光吸收，分部收集，收集分子量合格部分，加一倍乙醇，取沉淀，脱水、干燥得成品49克。各项指标符合药典标准。

Claims

1.低分子肝素纯化方法，以化学降解所得的粗品低分子肝素为原料，其特征是按如下步骤纯化：

①粗品肝素经HPLC测定平均分子量及分子量分布，确定样品中需要应除去的大分子和小分子部分的百分数；

②粗品低分子肝素解于重量浓度为1％NaCl溶液中，制成10～15％g/ml粗品肝素溶液，溶液过平衡好的分子筛凝胶层析柱，以每管等体积收集流出的层析液，并按先后序号排列；

③逐管测定200nm光吸收值，绘制出光吸收图谱，根据面积积分及对应步骤①确定的百分数确定需弃去的层析液序号，保留其余序号层析液；

④合并步骤②保留的层析液，加入1.0～1.5倍95％重量浓度的乙醇，沉淀过夜，弃去上清，沉淀脱水、干燥，得低分子肝素片断。

2.根据权利要求1所述的低分子肝素纯化方法，其特征是所说的分子筛层析柱选自Sepharose，、Superdex或Sephadex分子筛。

3.根据权利要求2所述的低分子肝素纯化方法，其特征是所说的分子筛层析柱是Superdex×30或Sephadex G-50。

4.根据权利要求3所述的低分子肝素纯化方法，其特征是所说的分子筛层析柱是用Superdex×30，低分子肝素浓度为10％，流速为一个柱床体积/1.5小时。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的低分子肝素纯化方法，其特征是将步骤②制得的肝素溶液在过分子筛层析柱之前，采用16W波长190～360nm紫外灯照射15～30分钟。

6.根据权利要求1或2或3或4所述的低分子肝素纯化方法，其特征是将步骤②制得的肝素溶液在过分子筛层析柱之前，按低分子肝素钠重量的0.01～0.1％的量加入氧化剂次氯酸钠或氢溴酸反应。

7.根据权利要求1或2或3或4所述的低分子肝素纯化方法，其特征是将步骤②制得的肝素溶液在过分子筛层析柱之前，采用波长190～360nm紫外灯照射15～30分钟。

8.根据权利要求所述1或2或3或4的低分子肝素纯化方法，其特征是将步骤②制得的肝素溶液在过分子筛层析柱之前，过阴离子交换树脂柱，使低分子肝素被树脂吸附，流出液废弃，用重量浓度2-5％的NaCl溶液清洗树脂，去杂质，用重量浓度12-15％的NaCl溶液从树脂上洗脱肝素。

9.根据权利要求所述7的低分子肝素纯化方法，其特征是紫外光功率16W，波长254nm。

10.根据权利要求所述8的低分子肝素纯化方法，其特征是阴离子交换树脂是Amberlite 958离子交换树脂。