CN1244702C - 一种鞘氨醇杆菌及用其生产的肝素酶生产肝素寡糖的方法 - Google Patents

Abstract

一种用于生产肝素酶的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.HC-6155)CGMCC No 0660菌种及其培养方法，培养后的无细胞粗酶液的制备和通过吸附、离子交换层析法纯化提取肝素酶。以肝素为底物，采用肝素酶在20-30℃恒温条件下降解肝素，生成肝素寡糖混合物，通过超滤和凝胶过滤进行分级分离，再经超滤和蒸发浓缩提取一系列具有抗平滑肌细胞增生活性而抗凝活性很低的肝素寡糖。

Description

一种鞘氨醇杆菌及用其生产的肝素酶生产肝素寡糖的方法

技术领域

本发明属于酶工程技术领域。主要涉及一种鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.HC-6155)CGMCC 0660及其产酶条件和应用该酶生产具有抗平滑肌细胞增生等活性肝素寡糖的酶工程技术。

技术背景

肝素酶是一种能够降解肝素类物质的裂合酶，降解肝素的主要特点是产生不饱和双键的糖醛酸和带有还原末端的葡萄糖胺。关于肝素酶来源的报道不多，目前，微生物来源的肝素酶有Calliher P.M.(1981)报道的肝素黄杆菌(Flavobacteriumheparinum ATCC 13125)、Watanabe M.(1998)报道的解肝素普雷沃氏菌(Prevotella heparinolytica)、LinhardtR.J.(1986)报道的从瘤胃中分离得到的拟杆菌(Bacteroides sp.)和KimB.T.(2000)报道的从人肠道中分离出来的粪拟杆菌(Bacteroidesstercoris HJ-15)及Jigyodan S.(1991)发表专利(JP3247297)报道的芽孢杆菌(Bacillus sp.BH100)。但是，直到目前为止，肝素黄杆菌是商品肝素酶的唯一来源。

肝素黄杆菌肝素酶也是目前唯一经系统研究的肝素酶。Yang V.C.(1985)、Nader H.B.(1990)和Lohse D.L.(1992)都分别报道了肝素黄杆菌肝素酶的纯化和性质研究结果。已从肝素黄杆菌中分离纯化出三个肝素酶，分别为肝素酶I、II和III。这三种肝素酶的酶学特性各不相同，酶I、II、III的分子量分别为42.8KD、84.1KD、70.8KD；等电点分别为pH8.5、pH9.0、pH10.0；最适作用温度分别为35℃、40℃、45℃；最适作用pH分别为7.15、7.30、7.60。更重要的是它们的底物特异性和作用方式不同。肝素酶I是外切型的，具有连续外切肝素的活性，也含少量的内切酶活性(＜10％)。肝素酶II是内切型的，但底物专一性不高，

既能作用肝素又能作用硫酸乙酰肝素，因而，这两个酶作用底物的终产物都是二糖，没有生物活性。肝素酶III是内切型的，但只能作用硫酸乙酰肝素，不能降解肝素。拟杆菌肝素酶虽然也进行了纯化，但性质研究不系统。

肝素酶的用途有多种。可用于在体外循环中肝素的消除、制备低分子肝素或活性肝素寡糖片段，也是肝素精确结构的确定及其结构与功能关系研究不可缺少的工具酶。

肝素是由糖醛酸(L-艾杜糖醛酸和D-葡萄糖醛酸)和D-葡萄糖胺以1→4糖苷键连接起来的大分子的糖胺聚糖(GAG)，其分子结构极为复杂且不均一，至今其精确结构仍不清楚。但是，已经发现与其复杂结构相对应的多种生物学功能。肝素作为抗凝剂和抗血栓药物在临床上已经应用60多年，近些年来，发现肝素具有抗平滑肌细胞增生、抗炎、抗肿瘤和调节脂代谢等生物活性。因此，肝素可用于预防和治疗由外伤、器官移植、哮喘、高血压、充血性心力衰竭、肾小球肾炎等疾病引起的平滑肌细胞增生，防止血管狭窄；预防和治疗冠心病、动脉粥样硬化、心肌梗塞、脑栓塞患者经血管“搭桥术”、球囊扩充术、“安装支架术”和“心内或颅内分流术”后由于受到刺激的平滑肌细胞迅速增殖引起的血管再狭窄症；此外，小儿先天性心脏病患者由于血管平滑肌细胞延伸到肺的外周小动脉血管引起的不可逆性的肺动脉高压，不做手术有生命危险，手术后引起平滑肌细胞增生，使血管再狭窄，也是致命的。因此，广大患者迫切需求能抑制平滑肌细胞增生的药物。但是，由于肝素具有抗凝活性，使用量大会引起出血和血小板减少等副作用，限制了肝素在这方面的临床应用。

Lippman M.M.(1977)报道的肝素的结构与功能研究结果表明，肝素的抗增生活性与抗凝活性无关，只与肝素片段大小和所带电荷有关。目前，国内外均用化学方法制备保留抗凝活性的低分子肝素，C onrad H.E.(1995)发表了用化学方法制备具有抗平滑肌细胞增生活性肝素寡糖的专利，但至今没实际应用。由于化学法解聚肝素反应剧烈，使肝素分子中的某些功能基团在反应过程中或多或少地被破坏，因而，某些生物活性功能也不同程度地降低或丧失。因此，采用酶法制备低分子肝素或活性肝素寡糖片段，成为当今有关的糖生物学研究工作者的研究热点。

由于肝素的分子结构复杂又不均一，起抗凝作用的是肝素分子中不规则序列区域中的五糖序列，抗增生活性是由规则序列区域中高度硫酸化的部分决定的。因此，需要特异性很强的肝素酶。但是，目前有实用价值的肝素酶很少，肝素黄杆菌肝素酶是唯一的商品肝素酶，但价格昂贵(696美元/11单位，Sigma)，而且降解肝素产生的低分子肝素仍然保留很高的抗凝活性，不适用于制备低抗凝、高抗增生活性的肝素寡糖。本发明中由鞘氨醇杆菌产生的肝素酶II和肝素酶III能够特异地作用肝素分子中起抗凝作用的不规则序列区域，保留了具有抗增生等生物活性的规则序列区域中高度硫酸化的部分。因此，本发明具有很好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的产生肝素酶的菌种，进而利用该酶降解肝素，制备一系列具有生物活性的肝素寡糖及其应用。

本发明中的产酶菌种是从土壤中分离筛选出的一株产生新型肝素酶的菌种。通过外部形态、生理生化反应特征鉴定和根据以16s rRNA基因序列为基础的系统发育学分析结果，确认该菌是未见报道的鞘氨醇杆菌属的一个新种(Sphingobacterium sp.HC-6155)。现已从这个菌中分离纯化出三种肝素酶，即为肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III，并研究了它们的酶学性质。本发明利用了酶II和酶III降解肝素产生一系列肝素寡糖的特性，以商品肝素为底物，用酶II或/和酶III作催化剂，研制出具有低抗凝、高抗平滑肌细胞增生等生物活性的肝素寡糖。

1.产酶菌种和产酶条件：通过富集培养、平板分离、天青A测定的方法，从土壤中选育出一株产生新型肝素酶的菌种，菌株代号为HC-6155，经鉴定为鞘氨醇杆菌属的一个新种(Sphingobactcrium sp.HC-6155)，并于2001年12月6日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC 0660。确定了培养基组成和培养条件。鞘氨醇杆菌CGMCC 0660在装有50ml含蛋白胨1.5-2.0％、酵母粉或牛肉膏0.1-0.5％、蔗糖或葡萄糖1.5-2.5％、NaCl 0.1％、K₂HPO₄ 0.25％，Na₂HPO₄ 0.25％、MgCl₂或MgSo₄ 0.05％、肝素0.1-0.2％，pH7.0-8.5培养基的500ml三角瓶中，于30-33℃，200转/分的摇床上培养36小时。

2.鞘氨醇杆菌肝素酶的纯化和酶学性质：利用超声破碎细胞，得到的无细胞粗酶液先用DEAE-纤维素吸附。将DEAE-纤维素用0.02mol/L，pH6.8的磷酸缓冲液充分平衡，加入到粗酶液中吸附杂蛋白，通过离心收集上清液。然后再用羟基磷灰石吸附，将羟基磷灰石用0.02mol/L，pH6.8的磷酸缓冲液充分平衡，加入到经DEAE-纤维素处理后的酶液中，离心收集沉淀，被吸附的酶用含1mol/L NaCl的相同缓冲液一次洗脱，洗脱液超滤浓缩并脱盐。脱盐后的肝素酶液通过用0.02mol/L，pH6.8的磷酸缓冲液充分平衡的SP-Sepharose FF柱层析进一步纯化，以含0-0.5mol/L NaCl线性梯度的相同缓冲液进行梯度洗脱，分离纯化出三种肝素酶，分别为肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III。它们的酶学性质：分子量分别为96.8KD、68.0KD、70.1KD；最适作用温度分别为37℃、45℃、49℃；最适作用pH分别为7.0、6.5、7.0；底物专一性、作用方式和终产物：三种肝素酶均能作用肝素，酶I是外切型的，降解肝素终产物为二糖，酶II和酶III是内切型的，降解肝素的终产物为一系列肝素寡糖，并且保持了肝素分子中具有抗增生等生物活性区域的完整性，非常适用于具有抗增生等活性肝素寡糖的制备。

3.抗平滑肌细胞增生活性肝素寡糖的制备和分离纯化：本发明所述的用肝素酶生产肝素寡糖的方法是指：以商品肝素为原料，用部分纯化的肝素酶II或肝素酶III，在一定条件下降解肝素，制备肝素寡糖。用0.05mol/L，pH7.0的磷酸缓冲配制2％的肝素溶液，每克肝素用酶量为0.1单位，于20-30℃反应，当A232为0.55-0.65时终止反应。得到的反应混合物经截留分子量10000的滤膜超滤除去大分子的肝素和酶蛋白，再用截留分子量1000的膜超滤浓缩并脱盐，得到平均分子量4500的肝素寡糖混合物。混合肝素寡糖通过Sephadex G-50柱进行分级分离，然后通过浓缩、冻干提取一系列部分纯化的肝素寡糖。

附图说明

图1是经DEAE-纤维素和羟基磷灰石吸附处理的肝素酶进行SP-Sepharose FF离子交换柱层析洗脱图谱。峰I、峰II和峰III分别为肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III的活性峰。

图2是肝素寡糖混合物经Sephadex G-50柱层析的部分洗脱图谱，图中A、B、C、D、E、F峰分别为12-14糖、10-12糖、8-10糖、6-8糖、4-6糖和2-4糖。

图3是肝素及肝素寡糖的抗凝活性示意图，A、B、C、D、E、F、G、H分别表示肝素、肝素寡糖混合物及部分分级的4-6糖、6-8糖、8-10糖、10-12糖、12-14糖和14糖以上部分的抗凝活性。

图4是肝素及肝素寡糖对培养的人体主动脉平滑肌细胞增殖的抑制率。A、B、C、D、E、F、G分别表示肝素、肝素寡糖混合物及部分分级的4-6糖、6-8糖、8-10糖、10-12糖和12-14糖的抑制率。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，通过如下的实施例予以详细说明，但并非限定本发明。

实施例：

1.菌种培养和鉴定：将产生肝素酶的菌株HC-6155接种在普通的牛肉汁斜面培养基上，于30℃培养48小时，再接入装有50ml发酵培养基的500ml三角瓶中，在30℃，200转/分的摇床上培养16小时，然后按2％的接种量转接到装50ml相同培养基的500ml三角瓶中，在相同条件下培养36小时。通过外部形态、生理生化反应特征和分子生物学方法进行鉴定。该菌的外部形态为杆状，不运动的革兰氏阴性细菌，产生浅紫色色素，不利用柠檬酸、KNO₃、吐温、丙二酸等，不产生H₂S气体，能利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖。并根据以16_S rRNA基因序列为基础的系统发育学分析结果，确认该菌种为鞘氨醇杆菌属的一个新种(Sphingobacteriumsp.HC-6155)。该菌株16s rRNA基因图谱如序列表Seq.No.1所示。

2.酶活力测定：按照Langer R.(1981)叙述的方法测定酶活力。粗酶采用天青A法。取适当稀释的酶液100μl(控制肝素降解量不超过30％)，加入100μl 2％的肝素溶液(用含0.2mol/L NaCl的0.05mol/L，pH7.0的磷酸缓冲液配制)，36℃水浴中反应1小时，加入3.8ml 0.05mol/L的HCI终止反应。取100μl反应液，加入4ml天青A溶液(50mg/L)，测定A₅₀₅。根据标准曲线计算出肝素的降解量。酶活力单位定义：在上述条件下，每小时降解1mg肝素所需要的酶量为1个酶活力单位。较纯的酶用紫外吸收法测定。取100μl适当稀释的酶液，加100μl 2％的肝素溶液，于36℃反应30分钟，加入3.8ml 0.05mol/L的HCI终止反应，测A₂₃₂。酶活力单位定义：在上述条件下，每分钟生成1μmol不饱和糖醛酸所需要的酶量(以不饱和糖醛酸的摩尔消光系数为5.1×10³cm^-1计算)。

3.蛋白含量的测定：采用Bradford(1976)法，以牛血清白蛋白为标准。

4.肝素抗凝活性的测定：采用冷炜主编的《肝素的生物测定》(1994)中叙述的猪血浆法。将肝素标准品和待测样品分别用生理盐水稀释到3-8IU/ml，再按1∶0.8的比例分级稀释为高中低三种不同的浓度。取12支洁净的小试管，使标准品和待测样品的高中低各浓度均为双管。每支管各加入猪血浆0.8ml，在37℃水浴中保温5分钟，分别加入标准品和待测样品0.1ml和1％CaCl₂ 0.1ml，迅速混匀并记时。混匀后的试管立即置于恒温水浴中，开始观察并记录各管的凝结时间。根据标准品和样品的凝结时间计算出样品的抗凝活性。

5.粘均分子量的测定：采用杨春雷在《中国药学杂志》(1995)中叙述的方法。通过测定不同浓度下肝素样品的粘度η，推算出肝素样品的特征粘度[η](样品浓度为零时的粘度)。根据经验公式[η]＝3.2×10^-5×Mr^0.906计算出肝素样品的平均分子量。

6.肝素酶的生产：将鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.HC-6155)CGMCC 0660接种在普通牛肉汁斜面上，在30℃培养48小时。按已确定的发酵培养基组成(％)：蔗糖2、蛋白胨1.5、酵母粉0.4、NaCl 0.1、K₂HPO₄0.25、Na₂HPO₄ 0.25、MgSO₄ 0.05、肝素0.2，pH8.0，配制5.5升培养基，其中500ml用于种子培养。按每瓶50ml分装在500ml三角瓶中，1.05kg/cm²灭菌30分钟。将在斜面上培养的种子接入装有上述培养基的500ml三角瓶中，于30℃，200转/分的摇床上培养16小时，然后按2％的接种量将种子液转接到装有相同培养基的500ml三角瓶中，在相同条件下培养36小时。培养液在4℃，10000转/分离心10分钟，收集菌体，并用0.02mol/L，pH6.8的磷酸缓冲液洗涤菌体2次。按0.2克湿菌体加1ml缓冲液的比例，将菌体悬浮在相同的缓冲液中，在冰浴中以脉冲方式超声破碎细胞10分钟。细胞破碎液在4℃，15000转/分离心40分钟，得无细胞粗提酶液，用天青A法测定酶活力。

7.酶的部分纯化

(1)DEAE-纤维素吸附：取400ml用0.02mol，pH6.8的磷酸缓冲液平衡过并予冷到4℃的DEAE-纤维素(湿态)加入到393ml粗酶液中，置于4℃1小时，并轻轻搅动，避免起泡沫。在4℃5000转/分离心5分钟，收集上清液528ml，测定酶活力和蛋白含量，比活力为10.37U/mg。

(2)羟基磷灰石吸附：将50克经酸碱处理过的羟基磷灰石用0.02mol/L，pH6.8的磷酸缓冲液充分平衡并予冷到4℃，加到经DEAE-纤维素去杂后的酶液中，在4℃放置1小时，并不时地轻轻搅拌。然后，在4℃5000转/分离心5分钟，弃去上清，用4℃的相同缓冲液洗涤羟基磷灰石，至无蛋白检出为止。用含有1mol/L NaCl的相同缓冲液一次洗脱，洗脱液在冰浴中超滤浓缩并脱盐，得135ml酶液，比活力为20.8U/mg(天青A法测定)，紫外吸收法(A₂₃₂)测定的比活力为0.94IU/mg，是粗酶液的4.7倍。而且酶的稳定性大有提高，在4℃放置三个月，酶活性无明显地变化。

(3)SP-Sepharose FF离子交换柱层析：用0.02mol/L，pH6.8的磷酸缓冲液充分平衡SP-Sepharose柱(1.6×30cm)，将经羟基磷灰石纯化得到的132ml酶液(蛋白为2.4mg/ml，活力为1.92IU/ml)上柱，并用相同的缓冲液充分淋洗柱，至无蛋白检出。用1200ml含0-0.5mol/L NaCl线性梯度的相同缓冲液进行梯度洗脱。流速为2ml/分，每管收集6ml(40管以后开始收集)，洗脱图谱如图1所示。经SP-Sepharose柱层析后出现三个肝素酶活峰，按洗脱顺序分别称为酶I、酶II和酶III。根据酶II和酶III降解肝素产生系列肝素寡糖的特性，将酶II和酶III的活性峰分别合并，然后超滤浓缩，得到部分纯化的肝毒酶II和肝素酶III的浓缩酶液。

8.抗增生活性肝素寡糖的制备：以商品肝素(160IU/mg)为原料，用0.05mol/L，pH7.0的磷酸缓冲液配制2％的肝素，按每克肝素加0.1单位酶的比例加入部分纯化的肝素酶III，于25℃摇床上反应，每隔8小时取出100μl反应液，加3.9ml 0.05mol/L HCl终止反应，测定A₂₃₂。当A₂₃₂为0.6时终止反应。反应液经截留分子量10000的膜超滤除去大分子的肝素和酶蛋白等，滤液再用截留分子量1000的膜超滤浓缩并除盐。然后，用75％的乙醇沉淀，离心收集沉淀并在真空下蒸发干，得到平均分子量4500左右的肝素寡糖混合物。

9.肝素寡糖的部分纯化：配制10％的混合肝素寡糖溶液，上予先用10％乙醇平衡过的Sephadex G-50柱(2.6×100cm)，用10％乙醇溶液洗柱，分部收集。流速为12ml/h，6ml/管，测定A₂₃₂。通过Sephadex G-50凝胶排阻层析，将肝素寡糖混合物分级成聚合度分别为2-4、4-6、6-8、8-10、10-12、12-14和14糖以上的几部分(图2)。各部分通过旋转蒸发浓缩后冻干，得到白色粉末状的肝素寡糖。

10.肝素寡糖抗凝活性和抗增生活性的检测：采用猪血浆法测定抗凝活性。以制备肝素寡糖的商品肝素(标准效价160IU/mg)为标准品，分别测定肝素、肝素寡糖混合物和部分分级的系列寡糖的抗凝活性。结果表明(图3)，肝素寡糖混合物的抗凝活性只有商品肝素的25％，而部分纯化的肝素寡糖的抗凝活性更低，4-6、6-8、8-10、10-12、12-14和14糖以上的肝素寡糖的抗凝活性分别是商品肝素的0.8％、2.4％、5.8％、10.6、19.4％和81％。由此可见，混合肝素寡糖的抗凝活性主要集中在14糖以上的部分。

采用3H标记胸腺嘧啶参入法测定肝素、肝素寡糖混合物和部分纯化的系列寡糖对体外培养的胎儿主动脉平滑肌细胞增殖的影响，糖醛酸的浓度为70μg/ml，以培养液中不加肝素和寡糖的细胞为对照。结果表明(图4)，未经分离的平均分子量4500的混合肝素寡糖对人体主动脉平滑肌细胞增殖的抑制程度与商品肝素很接近，但是抗凝活性只是商品肝素的25％。部分纯化的4-6、6-8、8-10、10-12、12-14五部分肝素寡糖对平滑肌细胞增殖均有抑制作用，其中的8-10糖(八糖或十糖)的抑制效果最好，对平滑肌细胞增殖的抑制率是商品肝素的121.9％，而抗凝活性只有商品肝素的5.8％，12-14糖也有抗增生活性，但抗凝活性也比较高。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种用肝素酶生产肝素寡糖的方法

<160>1

<170>Patent In Version 3.1

<210>1

<211>1482

<212>DNA

<213>Sphingobacterium sp.HC-6155

<400>1

gatgaacgct agcggcaggc ctaatacatg caagtcgaac gggattacca ccagagcttg     60

ctctggaggt atgagagtgg cgaacgggtg cgtaacgcgt atgcaacctg cccatgacag    120

ggggatagcc cggagaaatc cggattaaga ccgcatgaca ctacagtatg gcatcatatt    180

gtagtcaaat ctgaggaggt catggatggg catgcgtgcc attagctaat tggcggggta    240

acggcccacc aaggcgacga tggctagggg atctgagagg attgcccccc acactggtac    300

tgagacacgg accagactcc tacgggaggc agcagtaagg aatattggtc aatggaggga    360

actctgaacc agccatgccg cgtgcaggat gactgcccta tgggttgtaa actgcttttg    420

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taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gaggatccga gcgttatccg gatttattgg    540

gtttaaaggg agcgtaggcg gcctattaag tcagtggtga aagacggcag ctcaactgtc    600

gcagtgccat tgatactgat gggctagaat gtagctgagg taggcggaat gtgacaagta    660

gcggtgaaat gcatagatat gtcacagaac accgattgcg aaggcagctt gctaaactat    720

aattgacgct gaggctcgaa agcgtgggta tcgaacagga ttagataccc tggtagtcca    780

cgccctaaac gatgatgact cgatgttagc gatataccgt tagcgtccaa gcgaaagcgt    840

taagttatcc acctggggag tacgtccgca agggtgaaac tcaaaggaat tgacgggggc    900

ccgcacaagc ggaggagcat gtggtttaat tcgatgatac gcgaggaacc ttacccgggc    960

ttgaaagtta ctgaagaacg cagagacgcg ttcgtccttc gggacaggaa actaggtgct   1020

gcatggctgt cgtcagctcg tgccgtgagg tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac   1080

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tgctacaatg gtcggtacag agggccgcta cccagcaatg ggatgccaat ctcaaaaagc   1260

cgatcacagt tcggatcggg gcctgcaact cggccccgtg aagttggatt cgctagtaat   1320

cgcgtatcag caatgacgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaag   1380

ccatggaaat tgggggtgcc taaagtccgt aaccgcaagg agcggcctag ggcaagaccg   1440

ataactgggg ctaagtcgta acaaggtagc cgtaccggaa gg                      1482

Claims (7)

1.一种用微生物肝素酶生产肝素寡糖的方法，该方法涉及如下步骤：一种用于生产肝素酶的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.HC-6155)CGMCCNo 0660菌种及其培养；培养后的无细胞粗酶液的制备和通过吸附、离子交换层析法纯化提取肝素酶；以肝素为底物，采用肝素酶在20-30℃恒温条件下降解肝素，生成肝素寡糖混合物；通过凝胶过滤分离、膜超滤浓缩、脱盐和蒸发浓缩提取肝素寡糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的培养鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.HC-6155)CGMCC No 0660的培养基组成为：蔗糖或葡萄糖1.5-2.5％、蛋白胨1.5-2.0％、酵母粉或牛肉膏0.1-0.5％、NaCl0.1％、K₂HPO₄ 0.25％、Na₂HPO₄ 0.25％、MgCl₂或MgSO₄ 0.05％、肝素0.1-0.2％，pH7.0-8.5；培养温度为30-33℃，200转/分摇床培养36小时。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的无细胞粗酶液的制备方法是采用在冰浴中以脉冲方式超声破碎细胞，所述的离子交换吸附的方法，首先是采用DEAE-纤维素吸附的方法，将DEAE-纤维素用0.02mol/L，pH6.8的磷酸缓冲液充分平衡，加入到粗酶液中吸附杂蛋白，通过离心收集上清液，然后再用羟基磷灰石吸附，将羟基磷灰石用0.02mol/L，pH6.8的磷酸缓冲液充分平衡，加入到经DEAE-纤维素处理后的酶液中，离心收集沉淀，被吸附的酶用含1mol/L NaCl的相同缓冲液一次洗脱，洗脱液超滤浓缩并脱盐，脱盐后的肝素酶液通过用0.02mol/L，pH6.8的磷酸缓冲液充分平衡的SP-Sepharose柱层析进一步纯化，以含0-0.5mol/L NaGl线性梯度的相同缓冲液进行梯度洗脱，收集具有酶活性部分，通过超滤浓缩得到浓缩的肝素酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的肝素酶为肝素酶II或/和肝素酶III。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于肝素酶降解肝素的反应温度为20-30℃反应，当A₂₃₂为0.55-0.65时终止反应，反应液用截留分子量10000的膜超滤除去大分子的肝素和酶蛋白，再用截留分子量1000的膜超滤浓缩和脱盐，最终得到平均分子量4500左右的肝素寡糖混合物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的肝素寡糖混合物是通过Sephadex G-50进行分级分离。

7.一种鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.HC-6155)，其保藏号为CGMCC NO.0660。

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