JPH05271305A - 高分子量のｎ，ｏ−硫酸化ヘパロサン類、その製造方法および医薬組成物 - Google Patents
高分子量のｎ，ｏ−硫酸化ヘパロサン類、その製造方法および医薬組成物Info
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- JPH05271305A JPH05271305A JP4318638A JP31863892A JPH05271305A JP H05271305 A JPH05271305 A JP H05271305A JP 4318638 A JP4318638 A JP 4318638A JP 31863892 A JP31863892 A JP 31863892A JP H05271305 A JPH05271305 A JP H05271305A
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- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 式（Ｉ）で示される繰返し二糖構造を特徴と
する、１.５×１０4〜４.０×１０6Ｄの分子量を有する
連鎖、または連鎖の混合物からなるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパ
ロサン類、およびそれらのＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの
製薬上許容し得る塩類、エシエリキア・コリ（Ｋ５株）
の培養物からＮ−アセチルヘパロサンを単離、精製し部
分的に脱アセチル、硫酸化をほどこして式（Ｉ）のＮ，
Ｏ硫酸化ヘパロサンを得る製造方法ならびに該高分子量
Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンを主成分とする医薬組成物。 ［式中、Ｅは、このＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの二糖単
位の０〜８０％ではアセチル基、残りの二糖単位ではサ
ルフェート基、所望により水素原子、Ｇは水素原子およ
びサルフェート基を表わす］ 【効果】 上記医薬組成物は血液凝固抑制剤として有用
である。
する、１.５×１０4〜４.０×１０6Ｄの分子量を有する
連鎖、または連鎖の混合物からなるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパ
ロサン類、およびそれらのＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの
製薬上許容し得る塩類、エシエリキア・コリ（Ｋ５株）
の培養物からＮ−アセチルヘパロサンを単離、精製し部
分的に脱アセチル、硫酸化をほどこして式（Ｉ）のＮ，
Ｏ硫酸化ヘパロサンを得る製造方法ならびに該高分子量
Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンを主成分とする医薬組成物。 ［式中、Ｅは、このＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの二糖単
位の０〜８０％ではアセチル基、残りの二糖単位ではサ
ルフェート基、所望により水素原子、Ｇは水素原子およ
びサルフェート基を表わす］ 【効果】 上記医薬組成物は血液凝固抑制剤として有用
である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明の対象は、新規高分子量
のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類、これらの新規Ｎ，Ｏ−
硫酸化ヘパロサン類を含有するＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサ
ン組成物、および新規高分子量Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサ
ンを有効主成分とする医薬組成物である。
のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類、これらの新規Ｎ，Ｏ−
硫酸化ヘパロサン類を含有するＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサ
ン組成物、および新規高分子量Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサ
ンを有効主成分とする医薬組成物である。
【０００２】
【従来の技術】グリコサミノグリカン類は、動物組織か
ら抽出によって得ることができる生産物であることが知
られている。これらのグリコサミノグリカン類のあるも
のは、極めて有用な抗凝固作用および抗血栓作用を有す
る。この系統群の代表的な生産物は、ヘパリン、その分
解生産物、およびそれらの誘導体、およびヘパラン硫
酸、デルマタン硫酸であるが、これらの生産物は、その
起原が甚だ高価であるという難点を有する。特にデルマ
タン硫酸は、ウロン酸基（イズロン酸またはグルクロン
酸）およびアセチル４−硫酸化ガラクトサミニル基から
なる繰返し単位で構成されたさまざまな重合度有するポ
リマー系統群であることが分かっている［Ｈ.Ｗ.ストゥ
ールザッツ、「ザ・メソドロジー・オブ・コネクティブ
・ティシュー・リサーチ(TheMethodology of Connectiv
e Tissue Reseach)」、１９７６年、１３７〜１４６
頁］。天然デルマタン硫酸は２×１０4〜４×１０4Ｄの
分子量を有する。この生産物は抗凝固剤および抗トロン
ビン剤として特に有用である［Ｆ.フェルナンデツら、
ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー(Bri
tish Journal ofHaematology)、１９８６年、６４巻、
３０９〜３１７頁］。
ら抽出によって得ることができる生産物であることが知
られている。これらのグリコサミノグリカン類のあるも
のは、極めて有用な抗凝固作用および抗血栓作用を有す
る。この系統群の代表的な生産物は、ヘパリン、その分
解生産物、およびそれらの誘導体、およびヘパラン硫
酸、デルマタン硫酸であるが、これらの生産物は、その
起原が甚だ高価であるという難点を有する。特にデルマ
タン硫酸は、ウロン酸基（イズロン酸またはグルクロン
酸）およびアセチル４−硫酸化ガラクトサミニル基から
なる繰返し単位で構成されたさまざまな重合度有するポ
リマー系統群であることが分かっている［Ｈ.Ｗ.ストゥ
ールザッツ、「ザ・メソドロジー・オブ・コネクティブ
・ティシュー・リサーチ(TheMethodology of Connectiv
e Tissue Reseach)」、１９７６年、１３７〜１４６
頁］。天然デルマタン硫酸は２×１０4〜４×１０4Ｄの
分子量を有する。この生産物は抗凝固剤および抗トロン
ビン剤として特に有用である［Ｆ.フェルナンデツら、
ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー(Bri
tish Journal ofHaematology)、１９８６年、６４巻、
３０９〜３１７頁］。
【０００３】血液凝固は、その機序が下記の
【化６】 経路で図式的にまとめることができる複雑な生理現象で
あることが分かっている［Ｉ.ビエルクおよびＵ.リンダ
ール、「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオケミ
ストリー(Molecular and Cellular Biochemistry)」、
１９８２年、パブリッシャーズ・ドクター・Ｗ.ユンク
(Publishers Dr. W. Junk)、オランダ］。接触活性化因
子および組織因子のようなある種の刺激が、血漿中に存
在する一連の血液凝固因子の連続的な活性化の引き金と
なる。上記の反応式ではこれらの因子をローマ数字で表
わし、後尾のａの存在は、ある凝固因子の活性化形（ａ
を付した場合）または不活性化形（ａを付さない場合）
を表わす。刺激の性質がどのようなものであっても、最
終段階は同じであり、Ｘａ因子がII因子（プロトロンビ
ンともいう）を活性化し、この因子はその活性化形（II
ａ因子、トロンビンともいう）で可溶性フィブリノーゲ
ンの部分的タンパク分解を起こして、血餅の主な構成成
分である不溶性のフィブリンを遊離する。正常な生理条
件下では、抗トロンビンIII（ＡＴIII）およびヘパリン
補因子II（ＨＣII）のような調節タンパク質が同時に血
漿中に存在する。抗トロンビンIIIは、上記の反応式で
星印（＊）を付したすべての凝固因子に対して阻害活性
を示す。この阻害はヘパリン、またはヘパリン型合成オ
リゴ糖類の存在で著しく増強される［Ｄ.Ｈ.アサら、バ
イオケミストリー(Biochemistry)、１９８５年、２４
巻、６７２３〜６７２９頁］。ヘパリン補因子IIは、血
液凝固の最終段階を触媒するIIａ因子（トロンビン）に
対してだけ阻害活性を示す。この活性は、ヘパリンまた
はデルマタン硫酸の存在で著しく増強される［Ｄ.Ｍ.ト
レフセン、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー(J. Biol. Chem)、１９８３年、２５８巻、６７
１３〜６７１６頁］。Ｘａ因子またはIIａ因子の阻害
は、これらの２因子が、それぞれ別の刺激が引き金とな
る血液凝固の最後の２段階に関与するから、抗凝固活性
および抗血栓活性を得るのに好ましい手段を提供する。
IIａ因子だけの阻害を得るのに特に都合のよい可能性
は、ヘパリン補因子IIの特異性を利用し、その阻害活性
を増強する手段を探索することである。デルマタン硫酸
は、この種の最も強力な増強活性を有する既知の生産物
である。
あることが分かっている［Ｉ.ビエルクおよびＵ.リンダ
ール、「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオケミ
ストリー(Molecular and Cellular Biochemistry)」、
１９８２年、パブリッシャーズ・ドクター・Ｗ.ユンク
(Publishers Dr. W. Junk)、オランダ］。接触活性化因
子および組織因子のようなある種の刺激が、血漿中に存
在する一連の血液凝固因子の連続的な活性化の引き金と
なる。上記の反応式ではこれらの因子をローマ数字で表
わし、後尾のａの存在は、ある凝固因子の活性化形（ａ
を付した場合）または不活性化形（ａを付さない場合）
を表わす。刺激の性質がどのようなものであっても、最
終段階は同じであり、Ｘａ因子がII因子（プロトロンビ
ンともいう）を活性化し、この因子はその活性化形（II
ａ因子、トロンビンともいう）で可溶性フィブリノーゲ
ンの部分的タンパク分解を起こして、血餅の主な構成成
分である不溶性のフィブリンを遊離する。正常な生理条
件下では、抗トロンビンIII（ＡＴIII）およびヘパリン
補因子II（ＨＣII）のような調節タンパク質が同時に血
漿中に存在する。抗トロンビンIIIは、上記の反応式で
星印（＊）を付したすべての凝固因子に対して阻害活性
を示す。この阻害はヘパリン、またはヘパリン型合成オ
リゴ糖類の存在で著しく増強される［Ｄ.Ｈ.アサら、バ
イオケミストリー(Biochemistry)、１９８５年、２４
巻、６７２３〜６７２９頁］。ヘパリン補因子IIは、血
液凝固の最終段階を触媒するIIａ因子（トロンビン）に
対してだけ阻害活性を示す。この活性は、ヘパリンまた
はデルマタン硫酸の存在で著しく増強される［Ｄ.Ｍ.ト
レフセン、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー(J. Biol. Chem)、１９８３年、２５８巻、６７
１３〜６７１６頁］。Ｘａ因子またはIIａ因子の阻害
は、これらの２因子が、それぞれ別の刺激が引き金とな
る血液凝固の最後の２段階に関与するから、抗凝固活性
および抗血栓活性を得るのに好ましい手段を提供する。
IIａ因子だけの阻害を得るのに特に都合のよい可能性
は、ヘパリン補因子IIの特異性を利用し、その阻害活性
を増強する手段を探索することである。デルマタン硫酸
は、この種の最も強力な増強活性を有する既知の生産物
である。
【０００４】またヘパリンの主鎖は２段階で組立られる
ことが分かっている。第１段階では、ヘパリンはその多
糖部分がβ−Ｄ−グルクロニル−１，４−α−Ｎ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミニル−（１，４）の繰返し二糖単
位から構成されているさまざまな重合度のポリマー系統
群からなる前駆物質プロテオグリカンから生合成され
る。この多糖部分は一般にＮ−アセチルヘパロサンと呼
ばれる［Ｊ.ナビア、アナリティカル・バイオケミスト
リー(Anal. Biochem.)、１９８３年、１３５巻、１３４
〜１４０頁］。生合成の第２段階ではこの簡潔な骨格を
著しく変えてしまうので、この生合成の第１段階は、ま
さに「二糖単位」と呼ぶことができる唯一の時機である
［レパリン・ファブリカシォン・ストリュクチュール・
プロプリエテ・アナリーゼ(L'heparine, fabrication,
structure, proprietes, analyses)、Ｊ.Ｐ.デュクロ
ス、１９８４年、８１〜８３頁、マソン編、フラン
ス］。実際に、生合成から生じる天然ヘパリンは、グル
クロン酸分子および、所望により２位を硫酸化したイズ
ロン酸（ウロン酸）分子を、所望により６位を硫酸化
し、２位のアミンを硫酸化またはアセチル化したグルコ
サミン分子と結合させた分子からなる多糖である。
ことが分かっている。第１段階では、ヘパリンはその多
糖部分がβ−Ｄ−グルクロニル−１，４−α−Ｎ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミニル−（１，４）の繰返し二糖単
位から構成されているさまざまな重合度のポリマー系統
群からなる前駆物質プロテオグリカンから生合成され
る。この多糖部分は一般にＮ−アセチルヘパロサンと呼
ばれる［Ｊ.ナビア、アナリティカル・バイオケミスト
リー(Anal. Biochem.)、１９８３年、１３５巻、１３４
〜１４０頁］。生合成の第２段階ではこの簡潔な骨格を
著しく変えてしまうので、この生合成の第１段階は、ま
さに「二糖単位」と呼ぶことができる唯一の時機である
［レパリン・ファブリカシォン・ストリュクチュール・
プロプリエテ・アナリーゼ(L'heparine, fabrication,
structure, proprietes, analyses)、Ｊ.Ｐ.デュクロ
ス、１９８４年、８１〜８３頁、マソン編、フラン
ス］。実際に、生合成から生じる天然ヘパリンは、グル
クロン酸分子および、所望により２位を硫酸化したイズ
ロン酸（ウロン酸）分子を、所望により６位を硫酸化
し、２位のアミンを硫酸化またはアセチル化したグルコ
サミン分子と結合させた分子からなる多糖である。
【０００５】またエシェリキア・コリ（Escherichia co
li）種のある種の細菌が、β−Ｄ−グルクロニル−１，
４−α−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−(１,４)
の繰返し単位からなるポリマー系統群である一般に抗原
Ｋ５と呼ばれるきょう膜多糖を産生することが分かって
いる［Ｗ.Ｆ.バンら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー(Eur. J. Biochem.)、１９８１
年、１１６巻、３５９〜３６４頁］。この多糖はヘパリ
ンの前駆物質プロテオグリカンの多糖部分と同一の化学
的性質を有するものであり、本明細書では、以下これを
Ｎ−アセチルヘパロサンと呼ぶ。この生産物は１０5〜
２.０×１０6Ｄの分子量を有し、その「ウロン酸」単位
に、Ｄ−グルクロン酸だけで構成された極めて規則正し
い構造を有する［Ｗ.Ｆ.バンら、ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー、１９８１年、１１６
巻、３５９〜３６４頁、およびヨーロッパ特許出願公開
ＥＰ−Ａ−０３３３２４３号］。特許出願公開ＥＰ−Ａ
−０３３３２４３号には、Ｏ−硫酸化された多糖Ｋ５
（Ｏ−硫酸化−Ｎ−アセチルヘパロサン）、および同様
にＯ−硫酸化された、それぞれ四、六、または八「糖」
単位からなるある種のその切断生産物が報告されてい
る。これらの生産物は、抗血液凝固作用に対して都合よ
い比をもつ抗血管新生活性および抗腫瘍活性を示す。ま
たこの文献では、それぞれ四、六、八、または十「糖」
単位からなるＮ−アセチルヘパロサンの切断生産物、お
よび高分子量のＯ−硫酸化−Ｎ−アセチルヘパロサン類
が報告されている。この最後の生産物に、Ｗ.Ｆ.バンら
の報告［Ｗ.Ｆ.バンら、ヨーロピアン・ジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリー、１９８１年、１１６巻、３５
９〜３６４頁］による苛酷な解重合を行ない、特許出願
公開ＥＰ−Ａ−０３３３２４３号に報告されたような
八、六、または四「糖」単位からなるＯ−硫酸化−Ｎ−
アセチルヘパロサンの短い切断生産物が得られる。また
特許出願公開ＥＰ−Ａ−０３３３２４３号には、Ｏ−硫
酸化−Ｎ−アセチルヘパロサン構造を有する五糖の全化
学的合成による製造が報告されている。また多糖Ｋ５
は、Ｎ−脱アセチルおよびＮ−硫酸化すると、ポリマー
の最後の修飾反応、即ち、ヘパリン生合成のヘキスロノ
シルＣ５−エピマー化およびＯ−硫酸化を触媒する酵素
の基質として使用できることが知られている［Ｍ.クッ
シェら、バイオケミカル・ジャーナル(Biochem. J.)、
１９９１年、２７５巻、１５１〜１５８頁］。クッシェ
らは、ヒドラジン／硫酸ヒドラジンを使用してＮ−脱ア
セチル化し、Ｎ−脱アセチル化生産物をトリメチルアミ
ン／三酸化硫黄複合体で処理することによるＮ−硫酸化
によって、Ｎ−脱アセチル、Ｎ−硫酸化多糖Ｋ５の製造
を報告している。
li）種のある種の細菌が、β−Ｄ−グルクロニル−１，
４−α−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−(１,４)
の繰返し単位からなるポリマー系統群である一般に抗原
Ｋ５と呼ばれるきょう膜多糖を産生することが分かって
いる［Ｗ.Ｆ.バンら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー(Eur. J. Biochem.)、１９８１
年、１１６巻、３５９〜３６４頁］。この多糖はヘパリ
ンの前駆物質プロテオグリカンの多糖部分と同一の化学
的性質を有するものであり、本明細書では、以下これを
Ｎ−アセチルヘパロサンと呼ぶ。この生産物は１０5〜
２.０×１０6Ｄの分子量を有し、その「ウロン酸」単位
に、Ｄ−グルクロン酸だけで構成された極めて規則正し
い構造を有する［Ｗ.Ｆ.バンら、ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー、１９８１年、１１６
巻、３５９〜３６４頁、およびヨーロッパ特許出願公開
ＥＰ−Ａ−０３３３２４３号］。特許出願公開ＥＰ−Ａ
−０３３３２４３号には、Ｏ−硫酸化された多糖Ｋ５
（Ｏ−硫酸化−Ｎ−アセチルヘパロサン）、および同様
にＯ−硫酸化された、それぞれ四、六、または八「糖」
単位からなるある種のその切断生産物が報告されてい
る。これらの生産物は、抗血液凝固作用に対して都合よ
い比をもつ抗血管新生活性および抗腫瘍活性を示す。ま
たこの文献では、それぞれ四、六、八、または十「糖」
単位からなるＮ−アセチルヘパロサンの切断生産物、お
よび高分子量のＯ−硫酸化−Ｎ−アセチルヘパロサン類
が報告されている。この最後の生産物に、Ｗ.Ｆ.バンら
の報告［Ｗ.Ｆ.バンら、ヨーロピアン・ジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリー、１９８１年、１１６巻、３５
９〜３６４頁］による苛酷な解重合を行ない、特許出願
公開ＥＰ−Ａ−０３３３２４３号に報告されたような
八、六、または四「糖」単位からなるＯ−硫酸化−Ｎ−
アセチルヘパロサンの短い切断生産物が得られる。また
特許出願公開ＥＰ−Ａ−０３３３２４３号には、Ｏ−硫
酸化−Ｎ−アセチルヘパロサン構造を有する五糖の全化
学的合成による製造が報告されている。また多糖Ｋ５
は、Ｎ−脱アセチルおよびＮ−硫酸化すると、ポリマー
の最後の修飾反応、即ち、ヘパリン生合成のヘキスロノ
シルＣ５−エピマー化およびＯ−硫酸化を触媒する酵素
の基質として使用できることが知られている［Ｍ.クッ
シェら、バイオケミカル・ジャーナル(Biochem. J.)、
１９９１年、２７５巻、１５１〜１５８頁］。クッシェ
らは、ヒドラジン／硫酸ヒドラジンを使用してＮ−脱ア
セチル化し、Ｎ−脱アセチル化生産物をトリメチルアミ
ン／三酸化硫黄複合体で処理することによるＮ−硫酸化
によって、Ｎ−脱アセチル、Ｎ−硫酸化多糖Ｋ５の製造
を報告している。
【０００６】最後にＣ５−エピマー化、Ｎ−脱アセチル
化、Ｎ−硫酸化した多糖Ｋ５の部分的５−エピマー化お
よびＯ−硫酸化によって、標準的な粘液ヘパリンおよび
ヘパラン硫酸の中間に当たるＨＣIIを介する抗Ｘａ活性
および抗IIａ活性を有する生産物が得られることが判明
した［Ｂ.カスら、インターナショナル・シンポジアム
・オン・ヘパリン・アンド・リレーテッド・ポリサッカ
ライズ(InternationalSymposium on Heparin and Relat
ed Polysaccharides)、ウプサラ(Uppsala)、１９９１年
９月２〜６日、アブストラクトＮｏ.１２］。これらの
生産物のすべては、ヘパリンと同様、グルクロン酸構造
およびイズロン酸構造をともにその連鎖に有している。
またその連鎖にグルクロン酸構造およびイズロン酸構造
をともに含んでいる多糖Ｋ５のＣ５−エピマー化、Ｎ−
脱アセチル化、およびＮ−硫酸化誘導体がクッシェらに
よって報告された［Ｍ.クッシェら、バイオケミカル・
ジャーナル、１９９１年、２７５巻、１５１〜１５８
頁］。Ｊ.リーゼンフェルドら［グリココンジュゲート
(Glycoconjugate)、１９８７年、４巻、１７９〜１８９
頁］は、ヘパリンの生合成を解明しようと意図した研究
で、酵素によるＮ−アセチルヘパロサンの硫酸化につい
て報告したが、得られた生産物の正確な構造については
述べられていない。またフランス特許第２５８４７２８
号（１０.１１.８７）［特許出願Ｆｒ−８５.１０７８
７号に対応］には、出発グリコサミノグリカン類の糖単
位で、その重合度またはその均一性を変えることなく、
第１級水酸基（−ＯＨ）の代わりに硫酸エステル基（−
ＳＯ3 -基）を導入することができるグリコサミノグリカ
ン類、特にヘパリンの硫酸化の方法が報告されている。
化、Ｎ−硫酸化した多糖Ｋ５の部分的５−エピマー化お
よびＯ−硫酸化によって、標準的な粘液ヘパリンおよび
ヘパラン硫酸の中間に当たるＨＣIIを介する抗Ｘａ活性
および抗IIａ活性を有する生産物が得られることが判明
した［Ｂ.カスら、インターナショナル・シンポジアム
・オン・ヘパリン・アンド・リレーテッド・ポリサッカ
ライズ(InternationalSymposium on Heparin and Relat
ed Polysaccharides)、ウプサラ(Uppsala)、１９９１年
９月２〜６日、アブストラクトＮｏ.１２］。これらの
生産物のすべては、ヘパリンと同様、グルクロン酸構造
およびイズロン酸構造をともにその連鎖に有している。
またその連鎖にグルクロン酸構造およびイズロン酸構造
をともに含んでいる多糖Ｋ５のＣ５−エピマー化、Ｎ−
脱アセチル化、およびＮ−硫酸化誘導体がクッシェらに
よって報告された［Ｍ.クッシェら、バイオケミカル・
ジャーナル、１９９１年、２７５巻、１５１〜１５８
頁］。Ｊ.リーゼンフェルドら［グリココンジュゲート
(Glycoconjugate)、１９８７年、４巻、１７９〜１８９
頁］は、ヘパリンの生合成を解明しようと意図した研究
で、酵素によるＮ−アセチルヘパロサンの硫酸化につい
て報告したが、得られた生産物の正確な構造については
述べられていない。またフランス特許第２５８４７２８
号（１０.１１.８７）［特許出願Ｆｒ−８５.１０７８
７号に対応］には、出発グリコサミノグリカン類の糖単
位で、その重合度またはその均一性を変えることなく、
第１級水酸基（−ＯＨ）の代わりに硫酸エステル基（−
ＳＯ3 -基）を導入することができるグリコサミノグリカ
ン類、特にヘパリンの硫酸化の方法が報告されている。
【０００７】
【発明の構成】この発明では、Ｎ−脱アセチル化し、Ｎ
−硫酸化した多糖Ｋ５のＯ−硫酸化によって、血液凝固
に対して良好な活性を有する高分子量のＮ，Ｏ−硫酸化
ヘパロサンが得られることが判明した。その活性は、そ
れ自体、ヘパリン補因子IIを介し、また予想外なことに
抗トロンビンIIIを介することが分かった。より詳細に
は部分的５−エピマー化は必要でなく、その連鎖に含ま
れているＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンは、グルコサミン単
位から離れて、グルクロン酸単位だけで抗血液凝固薬お
よび抗血栓薬の有効主成分として使用できるという予想
外な態様であることが判明した。したがってこの発明の
対象である高分子量のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類は、
その新規構造、特に高度の硫酸化（グルコサミンのアミ
ン基の硫酸化も含み）、イズロン酸が存在しないこと、
およびその予想外な薬理学的性質によって特徴付けられ
る点で、文献上に既に報告された他の生産物と区別され
る。それらは、ヘパリン補因子II（ＨＣII）に関しては
デルマタン硫酸より一層強力な抗凝固活性を有する。実
際、それらの薬理学的活性は、治療上、一般に使用され
るグリコサミノグリカン類、特にヘパリンの活性に匹敵
し得、血液凝固の抑制に使用できる。より詳細にはこの
発明の生産物は、抗血栓薬としての適応がある。
−硫酸化した多糖Ｋ５のＯ−硫酸化によって、血液凝固
に対して良好な活性を有する高分子量のＮ，Ｏ−硫酸化
ヘパロサンが得られることが判明した。その活性は、そ
れ自体、ヘパリン補因子IIを介し、また予想外なことに
抗トロンビンIIIを介することが分かった。より詳細に
は部分的５−エピマー化は必要でなく、その連鎖に含ま
れているＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンは、グルコサミン単
位から離れて、グルクロン酸単位だけで抗血液凝固薬お
よび抗血栓薬の有効主成分として使用できるという予想
外な態様であることが判明した。したがってこの発明の
対象である高分子量のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類は、
その新規構造、特に高度の硫酸化（グルコサミンのアミ
ン基の硫酸化も含み）、イズロン酸が存在しないこと、
およびその予想外な薬理学的性質によって特徴付けられ
る点で、文献上に既に報告された他の生産物と区別され
る。それらは、ヘパリン補因子II（ＨＣII）に関しては
デルマタン硫酸より一層強力な抗凝固活性を有する。実
際、それらの薬理学的活性は、治療上、一般に使用され
るグリコサミノグリカン類、特にヘパリンの活性に匹敵
し得、血液凝固の抑制に使用できる。より詳細にはこの
発明の生産物は、抗血栓薬としての適応がある。
【０００８】多糖Ｋ５、およびそのＮ−脱アセチル、Ｎ
−硫酸化誘導体、およびこの発明の対象であるＮ，Ｏ−
硫酸化ヘパロサン類に関して本明細書の説明で使用する
「高分子量」の表現は、１.５×１０4Ｄより大きい分子
量、即ち、分子量が標準的な分析方法にしたがい、ある
精度をもって測定される範囲内で、その限度を超えた分
子量を表わす。天然多糖Ｋ５、およびその誘導体を例に
とれば、他に特定しない場合、前記の参考文献［Ｗ.Ｆ.
バンら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー、１９８１年、１１６巻、３５９〜３６４
頁］、およびヨーロッパ特許出願公開ＥＰ−Ａ−０３３
３２４３号に示された分子量の意味であると理解すべき
である。ただしこれと同一の表現は、分解し／または切
断することによって得られ、１.５×１０4〜１０5Ｄの
分子量を有する連鎖で構成された天然多糖Ｋ５の分子量
より低い分子量を有する生産物をも包含する。実際に
は、「高分子量」の表現は、所望によりＮ−脱アセチル
化、Ｎ−硫酸化した任意の多糖Ｋ５型の生産物、および
その切断生産物を含んで適用され、または約１.５×１
０4〜４.０×１０6Ｄの範囲の分子量を有する任意の
Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン、およびその切断生産物を含
んで適用される。
−硫酸化誘導体、およびこの発明の対象であるＮ，Ｏ−
硫酸化ヘパロサン類に関して本明細書の説明で使用する
「高分子量」の表現は、１.５×１０4Ｄより大きい分子
量、即ち、分子量が標準的な分析方法にしたがい、ある
精度をもって測定される範囲内で、その限度を超えた分
子量を表わす。天然多糖Ｋ５、およびその誘導体を例に
とれば、他に特定しない場合、前記の参考文献［Ｗ.Ｆ.
バンら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー、１９８１年、１１６巻、３５９〜３６４
頁］、およびヨーロッパ特許出願公開ＥＰ−Ａ−０３３
３２４３号に示された分子量の意味であると理解すべき
である。ただしこれと同一の表現は、分解し／または切
断することによって得られ、１.５×１０4〜１０5Ｄの
分子量を有する連鎖で構成された天然多糖Ｋ５の分子量
より低い分子量を有する生産物をも包含する。実際に
は、「高分子量」の表現は、所望によりＮ−脱アセチル
化、Ｎ−硫酸化した任意の多糖Ｋ５型の生産物、および
その切断生産物を含んで適用され、または約１.５×１
０4〜４.０×１０6Ｄの範囲の分子量を有する任意の
Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン、およびその切断生産物を含
んで適用される。
【０００９】この発明の対象は、式（Ｉ）
【化７】 ［式中、Ｅは、このＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの二糖単
位の０〜８０％ではアセチル基、残りの二糖単位ではサ
ルフェート基、所望により水素原子、Ｇは水素原子およ
びサルフェート基を表わす］で示される繰返し二糖構造
を特徴とし、１.５×１０4〜４.０×１０6Ｄの分子量を
有する連鎖、または連鎖の混合物からなるＮ，Ｏ−硫酸
化ヘパロサン類、およびそれらのＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロ
サンの製薬上許容し得る塩類である。サルフェート／カ
ルボキシル比として表わされる高分子量のＮ，Ｏ−硫酸
化ヘパロサンの硫酸化度は好ましくは１.５〜３.０であ
る。この発明はまた、上記のこの発明の対象であるＮ，
Ｏ−硫酸化ヘパロサンの質量の少なくとも７０％を含有
するＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン組成物に関する。
位の０〜８０％ではアセチル基、残りの二糖単位ではサ
ルフェート基、所望により水素原子、Ｇは水素原子およ
びサルフェート基を表わす］で示される繰返し二糖構造
を特徴とし、１.５×１０4〜４.０×１０6Ｄの分子量を
有する連鎖、または連鎖の混合物からなるＮ，Ｏ−硫酸
化ヘパロサン類、およびそれらのＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロ
サンの製薬上許容し得る塩類である。サルフェート／カ
ルボキシル比として表わされる高分子量のＮ，Ｏ−硫酸
化ヘパロサンの硫酸化度は好ましくは１.５〜３.０であ
る。この発明はまた、上記のこの発明の対象であるＮ，
Ｏ−硫酸化ヘパロサンの質量の少なくとも７０％を含有
するＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン組成物に関する。
【００１０】この発明の対象であるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパ
ロサン類は、明瞭な分子量の同一な多糖連鎖からなり
得、その場合、この分子量は１.５×１０4〜４.０×１
０6Ｄの範囲である。それらはまた、さまざまな分子量
の連鎖の混合物からなることもでき、その場合、これら
の分子量は１.５×１０4〜４.０×１０6Ｄである。これ
らの連鎖の分子量の開きは多少重要であり得る。実際に
は、この発明の対象であるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類
は、連鎖自身同士、最大約３.９×１０6Ｄまでの分子量
差を有する連鎖からなり得るか、あるいはそれとは反対
に、単にウロン酸構造（Ｄ−グルクロン酸、またはその
誘導体）またはグルコサミン構造の１単位に対応する約
３００Ｄの分子量差そのものを有する連鎖からなるの
か、さもなければＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンが化学的切
断から生じた場合なら、連鎖自身同士、３００Ｄ以下の
分子量差を有する連鎖からなり得る。またそれぞれの
Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの構成によって、最低の分子
量、または最高の分子量の何れかを有する連鎖の分子量
は、１.５×１０4〜４.９×１０6Ｄの間の任意の値に対
応できることは明らかである。「約」の語は示された値
に極めて近いことを意味し、これらの個々の値に限定さ
れないために使用する。この表現は分子量の評価中に遭
遇する困難性および使用した方法の精度のため、当業者
が得ることができる結果に開きがあるので妥当である
が、使用する方法の精度の方が有効であり得る。先に用
いた「Ｇは水素原子およびサルフェート基を表わす」の
表現は、式（Ｉ）の二糖単位におけるＧが、ある位置の
場合は水素原子を表わし、他の残りの位置の場合はサル
フェート基を表わすことをいう。これと同様に、Ｅはあ
る二糖単位ではアセチル基を表わし、これらの単位の残
りではサルフェート基、または所望により水素原子を表
わすことをいう。即ち、Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの二
糖単位は必ずしもすべて同一ではあり得ない。
ロサン類は、明瞭な分子量の同一な多糖連鎖からなり
得、その場合、この分子量は１.５×１０4〜４.０×１
０6Ｄの範囲である。それらはまた、さまざまな分子量
の連鎖の混合物からなることもでき、その場合、これら
の分子量は１.５×１０4〜４.０×１０6Ｄである。これ
らの連鎖の分子量の開きは多少重要であり得る。実際に
は、この発明の対象であるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類
は、連鎖自身同士、最大約３.９×１０6Ｄまでの分子量
差を有する連鎖からなり得るか、あるいはそれとは反対
に、単にウロン酸構造（Ｄ−グルクロン酸、またはその
誘導体）またはグルコサミン構造の１単位に対応する約
３００Ｄの分子量差そのものを有する連鎖からなるの
か、さもなければＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンが化学的切
断から生じた場合なら、連鎖自身同士、３００Ｄ以下の
分子量差を有する連鎖からなり得る。またそれぞれの
Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの構成によって、最低の分子
量、または最高の分子量の何れかを有する連鎖の分子量
は、１.５×１０4〜４.９×１０6Ｄの間の任意の値に対
応できることは明らかである。「約」の語は示された値
に極めて近いことを意味し、これらの個々の値に限定さ
れないために使用する。この表現は分子量の評価中に遭
遇する困難性および使用した方法の精度のため、当業者
が得ることができる結果に開きがあるので妥当である
が、使用する方法の精度の方が有効であり得る。先に用
いた「Ｇは水素原子およびサルフェート基を表わす」の
表現は、式（Ｉ）の二糖単位におけるＧが、ある位置の
場合は水素原子を表わし、他の残りの位置の場合はサル
フェート基を表わすことをいう。これと同様に、Ｅはあ
る二糖単位ではアセチル基を表わし、これらの単位の残
りではサルフェート基、または所望により水素原子を表
わすことをいう。即ち、Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの二
糖単位は必ずしもすべて同一ではあり得ない。
【００１１】式（Ｉ）はグルコサミン単位およびＤ−グ
ルクロン酸単位から構成された繰返し二糖構造を表わ
す。この単位は逆転させることができ、より詳細には式
（Ｉ）の二糖構造をｎ回繰返すと考えれば、連鎖の非還
元単位が、４位に水酸基を有する式（Ｉ）で表わされる
ようなグルコサミン単位であれば、このグルコサミン単
位は硫酸化され、または硫酸化されず、あるいは所望に
よりＣ４−Ｃ５位間に二重結合を含んでいるＤ−グルク
ロン酸であれば、これは硫酸化され、または硫酸化され
ない何れの場合も同等に許容し得る。還元単位は、式
（Ｉ）で表わされるように、アノマー酸素を水素で置換
したＤ−グルクロン酸、またはグルコサミンの何れの場
合でも同等に許容し得る。この発明の好ましい化合物
は、連鎖の還元末端および非還元末端が、硫酸化または
非硫酸化ウロン酸単位、硫酸化または非硫酸化グルコサ
ミン、または硫酸化または非硫酸化アセチルグルコサミ
ンである連鎖からなる。ヘパリンの場合と同様に、他に
明記しない場合、生産物を指示する「多糖Ｋ５」および
「Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン」の語は、ナトリウム塩の
形の生産物をいう。
ルクロン酸単位から構成された繰返し二糖構造を表わ
す。この単位は逆転させることができ、より詳細には式
（Ｉ）の二糖構造をｎ回繰返すと考えれば、連鎖の非還
元単位が、４位に水酸基を有する式（Ｉ）で表わされる
ようなグルコサミン単位であれば、このグルコサミン単
位は硫酸化され、または硫酸化されず、あるいは所望に
よりＣ４−Ｃ５位間に二重結合を含んでいるＤ−グルク
ロン酸であれば、これは硫酸化され、または硫酸化され
ない何れの場合も同等に許容し得る。還元単位は、式
（Ｉ）で表わされるように、アノマー酸素を水素で置換
したＤ−グルクロン酸、またはグルコサミンの何れの場
合でも同等に許容し得る。この発明の好ましい化合物
は、連鎖の還元末端および非還元末端が、硫酸化または
非硫酸化ウロン酸単位、硫酸化または非硫酸化グルコサ
ミン、または硫酸化または非硫酸化アセチルグルコサミ
ンである連鎖からなる。ヘパリンの場合と同様に、他に
明記しない場合、生産物を指示する「多糖Ｋ５」および
「Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン」の語は、ナトリウム塩の
形の生産物をいう。
【００１２】この発明のもう１つの態様は、（ｉ）Ｎ−
脱アセチルし、Ｎ−硫酸化した多糖Ｋ５、またはその切
断生産物の１つからなる出発物質をＯ−硫酸化し、ある
いは（ii）Ｎ−脱アセチル化した多糖Ｋ５、またはその
切断生産物の１つからなる出発物質を部分的Ｎ，Ｏ−硫
酸化し、所望により続いて完全Ｎ−硫酸化を行なう何れ
かにより、このようにして得た生産物を、ついで単離
し、所望により製薬上許容し得る塩へ転換することから
なる高分子量Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの製造方法に関
する。この発明の対象であるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン
を製造するため、出発物質として、約１.０×１０4〜約
２.０×１０6Ｄの範囲の分子量を有する物質を使用す
る。約４.０×１０6Ｄの分子量を有するＮ，Ｏ−硫酸化
ヘパロサンは、約２.０×１０6Ｄの分子量を有する物質
から得る。出発物質とＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの間に
生じる質量差は、Ｎ，Ｏ−硫酸化に由来する。
脱アセチルし、Ｎ−硫酸化した多糖Ｋ５、またはその切
断生産物の１つからなる出発物質をＯ−硫酸化し、ある
いは（ii）Ｎ−脱アセチル化した多糖Ｋ５、またはその
切断生産物の１つからなる出発物質を部分的Ｎ，Ｏ−硫
酸化し、所望により続いて完全Ｎ−硫酸化を行なう何れ
かにより、このようにして得た生産物を、ついで単離
し、所望により製薬上許容し得る塩へ転換することから
なる高分子量Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの製造方法に関
する。この発明の対象であるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン
を製造するため、出発物質として、約１.０×１０4〜約
２.０×１０6Ｄの範囲の分子量を有する物質を使用す
る。約４.０×１０6Ｄの分子量を有するＮ，Ｏ−硫酸化
ヘパロサンは、約２.０×１０6Ｄの分子量を有する物質
から得る。出発物質とＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの間に
生じる質量差は、Ｎ，Ｏ−硫酸化に由来する。
【００１３】より詳細には、この発明のもう１つの対象
は、 （段階ａ）エシェリキア・コリ(Escherichia coli)（Ｋ
５）株を培養して、高分子量Ｎ−アセチルヘパロサン
（多糖Ｋ５）を生成し、 （段階ｂ）式（II）
は、 （段階ａ）エシェリキア・コリ(Escherichia coli)（Ｋ
５）株を培養して、高分子量Ｎ−アセチルヘパロサン
（多糖Ｋ５）を生成し、 （段階ｂ）式（II）
【化８】 で示される繰返し二糖構造を特徴とし、１.０×１０4〜
２.０×１０6Ｄの分子量を有する連鎖の混合物からなる
Ｎ−アセチルヘパロサンの７０〜１００％を含有する組
成物を得るため、生成したＮ−アセチルヘパロサンを単
離および精製し、 （段階ｃ）式（III）
２.０×１０6Ｄの分子量を有する連鎖の混合物からなる
Ｎ−アセチルヘパロサンの７０〜１００％を含有する組
成物を得るため、生成したＮ−アセチルヘパロサンを単
離および精製し、 （段階ｃ）式（III）
【化９】 ［式中、Ｒ'は二糖単位の０〜８０％ではアセチル基、
残りの二糖単位では水素原子を表わす］で示される繰返
し二糖構造を特徴とし、１.０×１０4〜２.０×１０6Ｄ
の分子量を有する連鎖の混合物からなるヘパロサン７０
〜１００％を含有する組成物を得るため、このＮ−アセ
チルヘパロサンを部分的に脱アセチル化し、 （段階ｄ）式（IV）
残りの二糖単位では水素原子を表わす］で示される繰返
し二糖構造を特徴とし、１.０×１０4〜２.０×１０6Ｄ
の分子量を有する連鎖の混合物からなるヘパロサン７０
〜１００％を含有する組成物を得るため、このＮ−アセ
チルヘパロサンを部分的に脱アセチル化し、 （段階ｄ）式（IV）
【化１０】 ［式中、Ｅは、二糖単位の０〜８０％ではアセチル基、
残りの二糖単位ではサルフェート基、所望により水素原
子を表わす］で示される繰返し二糖構造を特徴とし、
１.０×１０4〜２.０×１０6Ｄの分子量を有する連鎖の
混合物からなるＮ−硫酸化ヘパロサン７０〜１００％を
含有する組成物を得るため、完全または部分的にＮ−硫
酸化し、ついでこの部分的または完全なＮ−硫酸化段階
に続いて、部分的または完全にＯ−硫酸化するか、また
はこのヘパロサン組成物の部分的にＮ，Ｏ−硫酸化、ま
たはこのヘパロサン組成物の部分的なＮ，Ｏ−硫酸化に
続いて、完全にＮ−硫酸化する何れかの段階を実施し、
所望によりａ、ｂ、ｃ、およびｄ段階の終わりに、分子
量を分別する１またはそれ以上の段階を含む 一連の段階を含むことからなる この発明の高分子量のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン７０〜
１００％を含有する組成物の製造方法である。
残りの二糖単位ではサルフェート基、所望により水素原
子を表わす］で示される繰返し二糖構造を特徴とし、
１.０×１０4〜２.０×１０6Ｄの分子量を有する連鎖の
混合物からなるＮ−硫酸化ヘパロサン７０〜１００％を
含有する組成物を得るため、完全または部分的にＮ−硫
酸化し、ついでこの部分的または完全なＮ−硫酸化段階
に続いて、部分的または完全にＯ−硫酸化するか、また
はこのヘパロサン組成物の部分的にＮ，Ｏ−硫酸化、ま
たはこのヘパロサン組成物の部分的なＮ，Ｏ−硫酸化に
続いて、完全にＮ−硫酸化する何れかの段階を実施し、
所望によりａ、ｂ、ｃ、およびｄ段階の終わりに、分子
量を分別する１またはそれ以上の段階を含む 一連の段階を含むことからなる この発明の高分子量のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン７０〜
１００％を含有する組成物の製造方法である。
【００１４】出発物質としては、クッシェら［バイオケ
ミカル・ジャーナル、１９９１年、２７５巻、１５１〜
１５８頁］が報告したようなＮ−脱アセチル化し、Ｎ−
硫酸化した多糖Ｋ５を使用できる。もう１つの都合よい
出発物質は、ＥＰ−Ａ−０３３３２４３号に報告された
ような多糖Ｋ５である。特に都合よい出発物質は、エシ
ェリキア・コリＳＥＢＲ３２８２の培養によって得られ
る多糖Ｋ５である。これはＢｉ８３３７−４１（０１
０：Ｋ５：Ｈ４）ＡＴＣＣ２３５０６株から誘導された
株である［具体的にはＤ.Ｓ.グプタら、ＦＥＭＳ・マイ
クロバイオロジー・レターズ(FEMS Microbiology Lette
rs)、１９８２年、１４巻、７５〜７８頁、およびＷ.バ
ン、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミスト
リー、１９８１年、１１６巻、３５９〜３６４頁に報告
されている］。エシェリキア・コリＳＥＢＲ３２８２株
は、Ｂ.カイザーらの方法［ジャーナル・オブ・クリニ
カル・マイクロバイオロジー(J. Clin. Microbiol.)、
１９８４年、１９巻（２）、２６４〜２６６頁］にした
がうＫ５特異的ファージによる型試験で陽性を示す。し
たがってこれは確実にエシェリキア・コリ（Ｋ５）株で
ある。この株はＣＮＣＭ（ザ・パスツール・インスチチ
ュート、パリ、フランス）にＮｏ.Ｉ−１０１３の番号
のもとに寄託されている。またこの株の自然変異株また
は誘導変異株の何れの変異株でも使用でき、また例えば
Ｂｉ６２６−４２株（０１２：Ｋ５(Ｌ)：ＮＭ）ＡＴＣ
Ｃ２３５０８のような他の好適なエシェリキア・コリ
（Ｋ５）株も使用できる。
ミカル・ジャーナル、１９９１年、２７５巻、１５１〜
１５８頁］が報告したようなＮ−脱アセチル化し、Ｎ−
硫酸化した多糖Ｋ５を使用できる。もう１つの都合よい
出発物質は、ＥＰ−Ａ−０３３３２４３号に報告された
ような多糖Ｋ５である。特に都合よい出発物質は、エシ
ェリキア・コリＳＥＢＲ３２８２の培養によって得られ
る多糖Ｋ５である。これはＢｉ８３３７−４１（０１
０：Ｋ５：Ｈ４）ＡＴＣＣ２３５０６株から誘導された
株である［具体的にはＤ.Ｓ.グプタら、ＦＥＭＳ・マイ
クロバイオロジー・レターズ(FEMS Microbiology Lette
rs)、１９８２年、１４巻、７５〜７８頁、およびＷ.バ
ン、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミスト
リー、１９８１年、１１６巻、３５９〜３６４頁に報告
されている］。エシェリキア・コリＳＥＢＲ３２８２株
は、Ｂ.カイザーらの方法［ジャーナル・オブ・クリニ
カル・マイクロバイオロジー(J. Clin. Microbiol.)、
１９８４年、１９巻（２）、２６４〜２６６頁］にした
がうＫ５特異的ファージによる型試験で陽性を示す。し
たがってこれは確実にエシェリキア・コリ（Ｋ５）株で
ある。この株はＣＮＣＭ（ザ・パスツール・インスチチ
ュート、パリ、フランス）にＮｏ.Ｉ−１０１３の番号
のもとに寄託されている。またこの株の自然変異株また
は誘導変異株の何れの変異株でも使用でき、また例えば
Ｂｉ６２６−４２株（０１２：Ｋ５(Ｌ)：ＮＭ）ＡＴＣ
Ｃ２３５０８のような他の好適なエシェリキア・コリ
（Ｋ５）株も使用できる。
【００１５】この発明の生産物の半合成のための出発物
質として使用する高分子量のＮ−アセチルヘパロサンを
製造するには、グリセリンに富んだ培地を使用する。グ
ルコースが特に好ましい。エシェリキア・コリ（Ｋ５）
株の培養は、バイオマスの増殖が停止した後、好ましく
は少なくとも２時間続ける（発酵装置中で約２５〜３５
時間熟成する）。段階ｂでは、式（II）で示される繰返
し二糖構造を特徴とし、１.０×１０4〜２.０×１０6Ｄ
の分子量を有する連鎖の混合物からなるＮ−アセチルヘ
パロサンの７０％〜１００％を含有する組成物を得るた
め、Ｎ−アセチルヘパロサンの単離および精製を、少な
くとも１沈殿段階および１イオン交換クロマトグラフィ
ー段階を含む方法によって実施する。この最後の段階
は、好ましくは「Ｑ−セファロース」カラムまたはこれ
に対応するカラムを使用することにより実施する。沈殿
は、好適な有機溶媒、特にアルコール、好ましくはエタ
ノールで実施する。この操作中、Ｎ−アセチルヘパロサ
ンは、塩の形、好ましくはナトリウム塩の形であり得
る。
質として使用する高分子量のＮ−アセチルヘパロサンを
製造するには、グリセリンに富んだ培地を使用する。グ
ルコースが特に好ましい。エシェリキア・コリ（Ｋ５）
株の培養は、バイオマスの増殖が停止した後、好ましく
は少なくとも２時間続ける（発酵装置中で約２５〜３５
時間熟成する）。段階ｂでは、式（II）で示される繰返
し二糖構造を特徴とし、１.０×１０4〜２.０×１０6Ｄ
の分子量を有する連鎖の混合物からなるＮ−アセチルヘ
パロサンの７０％〜１００％を含有する組成物を得るた
め、Ｎ−アセチルヘパロサンの単離および精製を、少な
くとも１沈殿段階および１イオン交換クロマトグラフィ
ー段階を含む方法によって実施する。この最後の段階
は、好ましくは「Ｑ−セファロース」カラムまたはこれ
に対応するカラムを使用することにより実施する。沈殿
は、好適な有機溶媒、特にアルコール、好ましくはエタ
ノールで実施する。この操作中、Ｎ−アセチルヘパロサ
ンは、塩の形、好ましくはナトリウム塩の形であり得
る。
【００１６】単離および精製の好ましい方法を例示すれ
ば、下記のように （段階ａ1）エタノール沈殿、 （段階ｂ1）透析、 （段階ｃ1）エタノール沈殿、ついで脱水、乾燥 （段階ｄ1）アニオン交換クロマトグラフィーによる精
製、 （段階ｅ1）段階ｄ1で得られた溶出液のエタノール沈
殿、脱水、乾燥、および粉砕する操作によって模式化に
示すことができる。段階ａ1、ｂ1、およびｃ1に関して
は、それを実施する順序はほとんど重要ではない。段階
ａ1またはｃ1の１つを省くことができる 段階ｅ1では、エタノール沈殿は必ずしも絶対に必要で
はない。Ｎ−アセチルヘパロサンは、例えば段階ｄ1で
得られた溶出液を真空下に蒸発するような別の方法によ
って単離することもできる。
ば、下記のように （段階ａ1）エタノール沈殿、 （段階ｂ1）透析、 （段階ｃ1）エタノール沈殿、ついで脱水、乾燥 （段階ｄ1）アニオン交換クロマトグラフィーによる精
製、 （段階ｅ1）段階ｄ1で得られた溶出液のエタノール沈
殿、脱水、乾燥、および粉砕する操作によって模式化に
示すことができる。段階ａ1、ｂ1、およびｃ1に関して
は、それを実施する順序はほとんど重要ではない。段階
ａ1またはｃ1の１つを省くことができる 段階ｅ1では、エタノール沈殿は必ずしも絶対に必要で
はない。Ｎ−アセチルヘパロサンは、例えば段階ｄ1で
得られた溶出液を真空下に蒸発するような別の方法によ
って単離することもできる。
【００１７】約１.５×１０4〜２.０×１０6Ｄの分子量
を有する連鎖の混合物からなるＮ−アセチルヘパロサン
の７０％〜１００％を含有する組成物を得るため、Ｎ−
アセチルヘパロサンの単離および精製は、また下記の （段階ａ'1）透析、 （段階ｂ'1）酸性媒質で精製、ｐＨ３.５およびｐＨ１.
８の水溶液で不溶性である不純物の除去、 （段階ｃ'1）エタノール沈殿、ついで脱水、乾燥、 （段階ｄ'1）アルカリ性加水分解および透析、 （段階ｅ'1）アニオン交換クロマトグラフィーによる精
製、 （段階ｆ'1）排除クロマトグラフィーによる精製によっ
て実施できる。この単離および精製操作もこの発明の好
ましい方法である。アルカリ性加水分解は、ＮａＯＨ溶
液で３０℃〜８０℃の温度で実施する。単離および精製
操作を適用することにより、培養の終わりに得られた懸
濁液を使用するか（この場合は、前濾過が必要であ
る）、または下記のような （段階ａ"1）培養の終わりに得られた懸濁液を遠心し、 （段階ｂ"1）上清をアルカリ性溶液と接触させ、 （段階ｃ"1）予備濾過し、 （段階ｄ"1）あらかめ測定した限界カットオフ値を有す
る膜で濃縮し、所望により （段階ｅ"1）透析の段階を含む操作にしたがって実施す
る予備精製を既に行なった物質の何れかを出発物質とし
て使用できる。この場合も、ＮａＯＨ溶液をアルカリ性
溶液として使用できる。好ましくは、培養の終わりに得
られた生成物を、上記の方法にしたがい前精製する。
を有する連鎖の混合物からなるＮ−アセチルヘパロサン
の７０％〜１００％を含有する組成物を得るため、Ｎ−
アセチルヘパロサンの単離および精製は、また下記の （段階ａ'1）透析、 （段階ｂ'1）酸性媒質で精製、ｐＨ３.５およびｐＨ１.
８の水溶液で不溶性である不純物の除去、 （段階ｃ'1）エタノール沈殿、ついで脱水、乾燥、 （段階ｄ'1）アルカリ性加水分解および透析、 （段階ｅ'1）アニオン交換クロマトグラフィーによる精
製、 （段階ｆ'1）排除クロマトグラフィーによる精製によっ
て実施できる。この単離および精製操作もこの発明の好
ましい方法である。アルカリ性加水分解は、ＮａＯＨ溶
液で３０℃〜８０℃の温度で実施する。単離および精製
操作を適用することにより、培養の終わりに得られた懸
濁液を使用するか（この場合は、前濾過が必要であ
る）、または下記のような （段階ａ"1）培養の終わりに得られた懸濁液を遠心し、 （段階ｂ"1）上清をアルカリ性溶液と接触させ、 （段階ｃ"1）予備濾過し、 （段階ｄ"1）あらかめ測定した限界カットオフ値を有す
る膜で濃縮し、所望により （段階ｅ"1）透析の段階を含む操作にしたがって実施す
る予備精製を既に行なった物質の何れかを出発物質とし
て使用できる。この場合も、ＮａＯＨ溶液をアルカリ性
溶液として使用できる。好ましくは、培養の終わりに得
られた生成物を、上記の方法にしたがい前精製する。
【００１８】上記の方法にしたがい、エシェリキア・コ
リＳＥＢＲ３２８２株、または前に挙げた別の好適な株
を使用して得られた式（II）のＮ−アセチルヘパロサン
類の２つの還元および非還元末端は、ウロン酸単位また
はＮ−アセチルグルコサミンである。連鎖の大半で、非
還元末端は、式（ａ）
リＳＥＢＲ３２８２株、または前に挙げた別の好適な株
を使用して得られた式（II）のＮ−アセチルヘパロサン
類の２つの還元および非還元末端は、ウロン酸単位また
はＮ−アセチルグルコサミンである。連鎖の大半で、非
還元末端は、式（ａ）
【化１１】 で示されるウロン酸単位である。Ｎ−アセチルヘパロサ
ンで得られた１.５×１０4〜２.０×１０6Ｄの分子量を
有し、式（II）で示される繰返し二糖構造を有する連鎖
の混合物からなる組成物の所望の濃化は、さまざまな程
度で、特にＮ−アセチルヘパロサンが単離されるまで実
施できる。この濃化は、分子量を分別するゲル浸透クロ
マトグラフィー、および限外濾過のような従来の技術を
用いて行なわれる［Ａ.Ａ.ホーナー、バイオケミカル・
ジャーナル、１９８９年、２６２巻、９５３〜９５８
頁、Ｇ.パイラーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、１９８８年、２６３巻（１１）、５
１９７〜５２０１頁、Ｕ.リンダールら、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー、１９８４年、２
５９巻（２０）、１２３６８〜１２３７６頁］。またエ
タノール分別法を用いることもできる（特許出願公開Ｅ
Ｐ−Ａ−０２８７４７７号）。この最後の分別法は想定
し得る他のどの方法より特に有用である。
ンで得られた１.５×１０4〜２.０×１０6Ｄの分子量を
有し、式（II）で示される繰返し二糖構造を有する連鎖
の混合物からなる組成物の所望の濃化は、さまざまな程
度で、特にＮ−アセチルヘパロサンが単離されるまで実
施できる。この濃化は、分子量を分別するゲル浸透クロ
マトグラフィー、および限外濾過のような従来の技術を
用いて行なわれる［Ａ.Ａ.ホーナー、バイオケミカル・
ジャーナル、１９８９年、２６２巻、９５３〜９５８
頁、Ｇ.パイラーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、１９８８年、２６３巻（１１）、５
１９７〜５２０１頁、Ｕ.リンダールら、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー、１９８４年、２
５９巻（２０）、１２３６８〜１２３７６頁］。またエ
タノール分別法を用いることもできる（特許出願公開Ｅ
Ｐ−Ａ−０２８７４７７号）。この最後の分別法は想定
し得る他のどの方法より特に有用である。
【００１９】段階ｃでは、脱アセチル化剤で処理するこ
とにより、高分子量のヘパロサンの７０％〜１００％を
含有する組成物を生産する、前述の式（III）の繰返し
二糖構造を特徴とし、１.０×１０4〜２.０×１０6Ｄの
分子量を有する連鎖の混合物からなるＮ−アセチルヘパ
ロサン７０％〜１００％を含有する組成物の部分的脱ア
セチル化を実施する。脱アセチル化剤としては、五硫化
リン、トリエチルオキソニウムフルオロボレート、水酸
化ナトリウムまたはヒドラジンであって、最後に挙げた
２つの脱アセチル化剤が特に有用である。また塩酸、硫
酸等のような無機強酸も使用できる。反応時間の長さ
は、選ばれた操作条件、特に温度および反応媒質中の脱
アセチル化剤の濃度によって変わる。式（III）の繰返
し二糖構造を特徴とし、１.０×１０4〜２.０×１０6Ｄ
の分子量を有する連鎖の混合物からなるヘパロサン中の
ヘパロサン組成物の濃化は、前述の分子量の分別（ゲル
浸透クロマトグラフィー、限外濾過、および水と混合し
得る有機溶媒、特にエタノールによる分別）の従来の技
術を用いて実施する。この場合、式（III）の繰返し二
糖構造を有し、１.０×１０4〜２.０×１０6Ｄの分子量
を有する混合物からなるヘパロサン質量の９０％〜１０
０％を含有する組成物を得ることができる。
とにより、高分子量のヘパロサンの７０％〜１００％を
含有する組成物を生産する、前述の式（III）の繰返し
二糖構造を特徴とし、１.０×１０4〜２.０×１０6Ｄの
分子量を有する連鎖の混合物からなるＮ−アセチルヘパ
ロサン７０％〜１００％を含有する組成物の部分的脱ア
セチル化を実施する。脱アセチル化剤としては、五硫化
リン、トリエチルオキソニウムフルオロボレート、水酸
化ナトリウムまたはヒドラジンであって、最後に挙げた
２つの脱アセチル化剤が特に有用である。また塩酸、硫
酸等のような無機強酸も使用できる。反応時間の長さ
は、選ばれた操作条件、特に温度および反応媒質中の脱
アセチル化剤の濃度によって変わる。式（III）の繰返
し二糖構造を特徴とし、１.０×１０4〜２.０×１０6Ｄ
の分子量を有する連鎖の混合物からなるヘパロサン中の
ヘパロサン組成物の濃化は、前述の分子量の分別（ゲル
浸透クロマトグラフィー、限外濾過、および水と混合し
得る有機溶媒、特にエタノールによる分別）の従来の技
術を用いて実施する。この場合、式（III）の繰返し二
糖構造を有し、１.０×１０4〜２.０×１０6Ｄの分子量
を有する混合物からなるヘパロサン質量の９０％〜１０
０％を含有する組成物を得ることができる。
【００２０】段階ｄ（部分的または完全なＮ−硫酸化に
続く、部分的または完全なＯ−硫酸化）の第１の変法と
しては、Ｎ−硫酸化を既知の方法［Ｍ.クッシェら、バ
イオケミカル・ジャーナル、１９９１年、２７５巻、１
５１〜１５８頁］を用いて実施する。より正確には、ト
リメチルアミン、トリエチルアミン、またはピリジンの
ような有機塩基と三酸化硫黄との複合体を使用してＮ−
硫酸化を実施する。またピリジン溶液中でクロルスルホ
ン酸により実施することができる。トリメチルアミンと
三酸化硫黄（ＳＯ3）の複合体を都合よく使用し、Ｎ−
硫酸化反応をアルカリ性水性媒質中で２０℃〜８０℃の
温度で実施する。Ｎ−硫酸化反応の終わりに、得られた
生産物を好適な量のエタノールの添加により沈殿させ
る。生成した沈殿を超精製水で取り出し、この媒質に対
して透析し、凍結乾燥する。この精製方法は、単に例示
のために示したのであって、対応方法を除外するもので
はない。精製段階は数回反復することができる。ついで
この発明の方法にしたがい、Ｏ−硫酸化段階の前に、Ｎ
−硫酸化ヘパロサンを好ましくは有機塩基の塩、または
第４級アンモニウム塩へ転換する。水酸化テトラブチル
アンモニウムを好ましく使用し、第４級アンモニウム塩
を作成する。
続く、部分的または完全なＯ−硫酸化）の第１の変法と
しては、Ｎ−硫酸化を既知の方法［Ｍ.クッシェら、バ
イオケミカル・ジャーナル、１９９１年、２７５巻、１
５１〜１５８頁］を用いて実施する。より正確には、ト
リメチルアミン、トリエチルアミン、またはピリジンの
ような有機塩基と三酸化硫黄との複合体を使用してＮ−
硫酸化を実施する。またピリジン溶液中でクロルスルホ
ン酸により実施することができる。トリメチルアミンと
三酸化硫黄（ＳＯ3）の複合体を都合よく使用し、Ｎ−
硫酸化反応をアルカリ性水性媒質中で２０℃〜８０℃の
温度で実施する。Ｎ−硫酸化反応の終わりに、得られた
生産物を好適な量のエタノールの添加により沈殿させ
る。生成した沈殿を超精製水で取り出し、この媒質に対
して透析し、凍結乾燥する。この精製方法は、単に例示
のために示したのであって、対応方法を除外するもので
はない。精製段階は数回反復することができる。ついで
この発明の方法にしたがい、Ｏ−硫酸化段階の前に、Ｎ
−硫酸化ヘパロサンを好ましくは有機塩基の塩、または
第４級アンモニウム塩へ転換する。水酸化テトラブチル
アンモニウムを好ましく使用し、第４級アンモニウム塩
を作成する。
【００２１】Ｏ−硫酸化反応は、ホルムアミド、または
化学的に対応するその他の溶媒中で、例えばトリメチル
アミン、トリエチルアミン、またはピリジンのような有
機塩基と三酸化硫黄との複合体を使用し、あるいはピリ
ジンの存在でクロルスルホン酸を使用して実施する。三
酸化硫黄／ピリジン複合体を好ましく使用する。一般に
Ｏ−硫酸化反応は１０℃〜５０℃の温度で実施する。つ
いで０.３Ｍ〜０.５Ｍ ＮａＣｌ溶液が得られるまで塩
化ナトリウムを反応媒質へ添加し、ついで好適な量のエ
タノールの添加により、Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンを沈
殿させる。ついでＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン組成物の精
製を下記の方法で実施する。沈殿を０.３Ｍ〜０.５Ｍ
ＮａＣｌ溶液に取り、エタノールで再沈殿し、生成した
沈殿を単離し、超精製水に溶解し、この媒質に対して透
析し、所望により凍結乾燥する。上記の精製方法は、例
示のために示したのであって、対応方法を除外するもの
ではない。精製は１回または１回以上実施することがで
きる。所望の分子量を有するＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン
中のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン組成物の濃化は、既述の
ように、分子量を分別する従来の技術を用いて実施す
る。この濃化を実施することが有利である。
化学的に対応するその他の溶媒中で、例えばトリメチル
アミン、トリエチルアミン、またはピリジンのような有
機塩基と三酸化硫黄との複合体を使用し、あるいはピリ
ジンの存在でクロルスルホン酸を使用して実施する。三
酸化硫黄／ピリジン複合体を好ましく使用する。一般に
Ｏ−硫酸化反応は１０℃〜５０℃の温度で実施する。つ
いで０.３Ｍ〜０.５Ｍ ＮａＣｌ溶液が得られるまで塩
化ナトリウムを反応媒質へ添加し、ついで好適な量のエ
タノールの添加により、Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンを沈
殿させる。ついでＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン組成物の精
製を下記の方法で実施する。沈殿を０.３Ｍ〜０.５Ｍ
ＮａＣｌ溶液に取り、エタノールで再沈殿し、生成した
沈殿を単離し、超精製水に溶解し、この媒質に対して透
析し、所望により凍結乾燥する。上記の精製方法は、例
示のために示したのであって、対応方法を除外するもの
ではない。精製は１回または１回以上実施することがで
きる。所望の分子量を有するＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン
中のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン組成物の濃化は、既述の
ように、分子量を分別する従来の技術を用いて実施す
る。この濃化を実施することが有利である。
【００２２】この操作の段階ｄ（ヘパロサン組成物の部
分的なＮ，Ｏ−硫酸化、または部分的Ｎ，Ｏ−硫酸化に
続く完全なＮ−硫酸化段階）の第２および第３の変法で
は、部分的なＮ，Ｏ−硫酸化段階の前に、ヘパロサン類
を有機塩基の塩、または第４級アンモニウム塩へ転換す
る。水酸化テトラブチルアンモニウムを好ましく使用し
て、ヘパロサンの第４級アンモニウム塩を作成する。フ
ランス特許第２５８４７２８号（１０.１１.８７）（特
許出願Ｆｒ−８５.１０７８７号に対応）に報告された
方法にしたがって実施する部分的なＮ，Ｏ−硫酸化段階
は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘ
キサメチルホスホルアミド、またはアセトニトリルのよ
うな極性疎水性溶媒、またはこれらの溶媒の混合物中
で、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、また
はピリジンのような有機塩基と三酸化硫黄との複合体を
使用して実施する。またピリジン溶液中でクロルスルホ
ン酸により実施する。三酸化硫黄／ピリジン複合体を好
ましく使用する。また他の硫酸化剤を使用することもで
き、特にＥ.Ｅ.ギルバートが報告した硫酸化剤［Ｅ.Ｅ.
ギルバート、ケミカル・レビュー(Chemical Review)、
１９６２年、６２巻、５４９〜５８９頁］を使用でき
る。Ｎ，Ｏ−硫酸化反応は、一般に０℃〜１００℃、好
ましくは１０℃〜５０℃で、６〜１４時間実施する。製
造操作中、部分的なＮ，Ｏ−硫酸化反応の終わりに、
０.３Ｍ〜０.５Ｍ塩化ナトリウム溶液が得られるまで塩
化ナトリウムを添加し、ついで好適な量のエタノールの
添加により、この発明の対象であるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパ
ロサンの７０％〜１００％を含有するＮ，Ｏ−硫酸化ヘ
パロサン組成物を沈殿させる。生成した沈殿を０.３Ｍ
〜０.５Ｍ塩化ナトリウム溶液に取る。ついでこの溶液
を中和する。好適な量のエタノールを添加したのち、生
成した沈殿を単離し、超精製水に溶解し、この媒質に対
して透析し、凍結乾燥する。前項で説明したＮ，Ｏ−硫
酸化段階、およびＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン組成物の精
製段階は、１回、または１回以上反復できる。ここでも
また、精製方法は例示のために示したのであって、対応
方法を除外するものではない。
分的なＮ，Ｏ−硫酸化、または部分的Ｎ，Ｏ−硫酸化に
続く完全なＮ−硫酸化段階）の第２および第３の変法で
は、部分的なＮ，Ｏ−硫酸化段階の前に、ヘパロサン類
を有機塩基の塩、または第４級アンモニウム塩へ転換す
る。水酸化テトラブチルアンモニウムを好ましく使用し
て、ヘパロサンの第４級アンモニウム塩を作成する。フ
ランス特許第２５８４７２８号（１０.１１.８７）（特
許出願Ｆｒ−８５.１０７８７号に対応）に報告された
方法にしたがって実施する部分的なＮ，Ｏ−硫酸化段階
は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘ
キサメチルホスホルアミド、またはアセトニトリルのよ
うな極性疎水性溶媒、またはこれらの溶媒の混合物中
で、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、また
はピリジンのような有機塩基と三酸化硫黄との複合体を
使用して実施する。またピリジン溶液中でクロルスルホ
ン酸により実施する。三酸化硫黄／ピリジン複合体を好
ましく使用する。また他の硫酸化剤を使用することもで
き、特にＥ.Ｅ.ギルバートが報告した硫酸化剤［Ｅ.Ｅ.
ギルバート、ケミカル・レビュー(Chemical Review)、
１９６２年、６２巻、５４９〜５８９頁］を使用でき
る。Ｎ，Ｏ−硫酸化反応は、一般に０℃〜１００℃、好
ましくは１０℃〜５０℃で、６〜１４時間実施する。製
造操作中、部分的なＮ，Ｏ−硫酸化反応の終わりに、
０.３Ｍ〜０.５Ｍ塩化ナトリウム溶液が得られるまで塩
化ナトリウムを添加し、ついで好適な量のエタノールの
添加により、この発明の対象であるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパ
ロサンの７０％〜１００％を含有するＮ，Ｏ−硫酸化ヘ
パロサン組成物を沈殿させる。生成した沈殿を０.３Ｍ
〜０.５Ｍ塩化ナトリウム溶液に取る。ついでこの溶液
を中和する。好適な量のエタノールを添加したのち、生
成した沈殿を単離し、超精製水に溶解し、この媒質に対
して透析し、凍結乾燥する。前項で説明したＮ，Ｏ−硫
酸化段階、およびＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン組成物の精
製段階は、１回、または１回以上反復できる。ここでも
また、精製方法は例示のために示したのであって、対応
方法を除外するものではない。
【００２３】このＮ，Ｏ−硫酸化段階に引き続き、前述
のようなＮ−硫酸化の技術により、一般に水性溶媒中
で、好ましくは塩基性ｐＨで、例えばトリメチルアミン
のような有機塩基と三酸化硫黄の複合体のような硫酸化
剤によって実施する完全なＮ−硫酸化段階を行なう。完
全なＮ−硫酸化段階の終わりに、０.３Ｍ〜０.５Ｍ塩化
ナトリウム溶液が得られるまで塩化ナトリウムを添加し
たのち、エタノールを添加して、Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロ
サン組成物を沈殿させる。ついで生成した沈殿を０.３
Ｍ〜０.５Ｍ塩化ナトリウム溶液に再溶解し、エタノー
ルで再沈殿し、超精製水に溶解し、この媒質に対して透
析し、凍結乾燥する。既述のように、Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘ
パロサン中のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン組成物の濃化を
実施することは有利である。これは分子量を分別する従
来の技術を用いて実施する。この発明の対象であるＮ，
Ｏ−硫酸化ヘパロサン類、およびこの発明の対象である
新規Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの少なくとも７０％を含
有するＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン組成物は、最終のＮ−
硫酸化反応を含む方法、または最初にＮ−硫酸化し、つ
いで部分的または完全なＯ−硫酸化を含む方法の何れか
の方法によって都合よく得られる。ここで式（Ｉ）で示
される繰返し構造のＥは、アセチル基またはサルフェー
ト基を表わす。
のようなＮ−硫酸化の技術により、一般に水性溶媒中
で、好ましくは塩基性ｐＨで、例えばトリメチルアミン
のような有機塩基と三酸化硫黄の複合体のような硫酸化
剤によって実施する完全なＮ−硫酸化段階を行なう。完
全なＮ−硫酸化段階の終わりに、０.３Ｍ〜０.５Ｍ塩化
ナトリウム溶液が得られるまで塩化ナトリウムを添加し
たのち、エタノールを添加して、Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロ
サン組成物を沈殿させる。ついで生成した沈殿を０.３
Ｍ〜０.５Ｍ塩化ナトリウム溶液に再溶解し、エタノー
ルで再沈殿し、超精製水に溶解し、この媒質に対して透
析し、凍結乾燥する。既述のように、Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘ
パロサン中のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン組成物の濃化を
実施することは有利である。これは分子量を分別する従
来の技術を用いて実施する。この発明の対象であるＮ，
Ｏ−硫酸化ヘパロサン類、およびこの発明の対象である
新規Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの少なくとも７０％を含
有するＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン組成物は、最終のＮ−
硫酸化反応を含む方法、または最初にＮ−硫酸化し、つ
いで部分的または完全なＯ−硫酸化を含む方法の何れか
の方法によって都合よく得られる。ここで式（Ｉ）で示
される繰返し構造のＥは、アセチル基またはサルフェー
ト基を表わす。
【００２４】この発明の対象であるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパ
ロサンは、０.２μM／mgを超えない遊離アミノ基（ＮＨ
2）を含有する。二糖単位のアセチル基は好ましくは６
０％に等しいか、またはそれ以下の水準で存在し、サル
フェート／カルボキシル比として表わされる硫酸化度は
１.５〜３.０である。この発明の好ましい生産物は、
１.０×１０5〜５.０×１０5Ｄの分子量を有する連鎖質
量の少なくとも７０％を含有するＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロ
サン類、および２.５×１０4〜２.５×１０5Ｄの分子量
を有する連鎖質量の少なくとも７０％を含有するＮ，Ｏ
−硫酸化ヘパロサン類である。さらに２.０×１０4〜１
０5Ｄの分子量を有する連鎖質量の少なくとも７０％を
含有するＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類を、この発明の好
ましいその他の生産物として挙げ得る。上記のＮ，Ｏ−
硫酸化ヘパロサンの製造方法および精製方法は、Ｎ，Ｏ
−硫酸化ヘパロサンをナトリウム塩の形で得ることによ
って可能となる。ヘパリンの各種の塩または塩化しない
ヘパリンを製造する方法［レパリン・ファブリカシォン
・ストリュクチュール・プロプリエテ・アナリーゼ、
Ｊ.Ｐ.デュクロス、１９８４年、８１〜８３頁、マソン
編、フランス］を、Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類の他の
塩類または塩化しないＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類の何
れかに適用することによって、これらの塩類から得るこ
とができる。Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの塩類とは、す
べて製薬上許容し得る塩類を意味する。これらの塩類
は、通常の方法、特にヘパリンの塩の製造について報告
された方法（米国特許第４１６８３７７号）によって得
られる。
ロサンは、０.２μM／mgを超えない遊離アミノ基（ＮＨ
2）を含有する。二糖単位のアセチル基は好ましくは６
０％に等しいか、またはそれ以下の水準で存在し、サル
フェート／カルボキシル比として表わされる硫酸化度は
１.５〜３.０である。この発明の好ましい生産物は、
１.０×１０5〜５.０×１０5Ｄの分子量を有する連鎖質
量の少なくとも７０％を含有するＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロ
サン類、および２.５×１０4〜２.５×１０5Ｄの分子量
を有する連鎖質量の少なくとも７０％を含有するＮ，Ｏ
−硫酸化ヘパロサン類である。さらに２.０×１０4〜１
０5Ｄの分子量を有する連鎖質量の少なくとも７０％を
含有するＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類を、この発明の好
ましいその他の生産物として挙げ得る。上記のＮ，Ｏ−
硫酸化ヘパロサンの製造方法および精製方法は、Ｎ，Ｏ
−硫酸化ヘパロサンをナトリウム塩の形で得ることによ
って可能となる。ヘパリンの各種の塩または塩化しない
ヘパリンを製造する方法［レパリン・ファブリカシォン
・ストリュクチュール・プロプリエテ・アナリーゼ、
Ｊ.Ｐ.デュクロス、１９８４年、８１〜８３頁、マソン
編、フランス］を、Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類の他の
塩類または塩化しないＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類の何
れかに適用することによって、これらの塩類から得るこ
とができる。Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの塩類とは、す
べて製薬上許容し得る塩類を意味する。これらの塩類
は、通常の方法、特にヘパリンの塩の製造について報告
された方法（米国特許第４１６８３７７号）によって得
られる。
【００２５】この発明の対象であるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパ
ロサン類は、先行技術の教示に関連して予想外である
が、有用な薬理学的および生化学的性質を有する。特に
特許出願公開ＥＰ−Ａ−０３３３２４３号に報告された
Ｋ５抗原の硫酸化生産物が、抗血管新生活性および抗腫
瘍活性を有し、さらにエンベロープウイルスに対する活
性を有し、これらの活性が、抗凝固作用と比べて好まし
い比を有するのに反し、この発明のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパ
ロサン類は血液凝固に対する良好な制御活性を有する。
この活性は、種々の血液凝固パラメーターに対するデル
マタン硫酸の活性よりはるかに強く、むしろヘパリンの
活性に匹敵する。より詳細には、この発明の代表的な生
産物のＡＴIIIまたはＨＣIIに依存する抗IIａ活性を、
ヘパリン補因子II（ＨＣII）についてはＤ.デュプイら
［トロンボーシス・アンド・ヘモステーシス(Thrombosi
s and Haemostasis)、１９８８年、６０巻（２）、２３
６〜２３９頁］、抗トロンビン（ＡＴIII）については
Ｍ.Ｌ.ラーセンら［トロンボーシス・リサーチ(Thrombo
sis Research)、１９７８年、１３巻（２）、２８５〜
２８８頁］が報告した方法にしたがって測定した。どち
らの場合とも、試験は、精製したＨＣIIおよびＡＴIII
の存在で、精製したトロンビン（IIａ因子）について、
トロンビンのアミド分解活性を色素産生物質で測定する
生産物の試験管内阻害効果を測定することにある。Ｈ.
Ｗ.スツールザッツらが報告した方法［「ザ・メソドロ
ジー・オブ・コネクティブ・ティシュー・リサーチ」、
１９７６年、１３７〜１４６頁］にしたがって製造した
デルマタン硫酸を標準物質として使用し、その結果を、
検討した生産物１mgに対するデルマタン硫酸（ＤＳ）当
量（mg）で表わしたこの活性の測定試験（mgＤＳ当量／
mg）で、この物質は最も強力なＨＣII依存性の抗IIａ活
性を示した。この発明の代表的な生産物の抗Ｘａ活性
［イン・ウエスラー(Yin-Wessler)力価］は、Ｅ.Ｔ.イ
ンらが報告した方法［ジャーナル・オブ・ラボラトリー
・アンド・クリニカル・メジシン(J. Lab. Cli. Me
d.)、１９７３年、８１巻（２）、２９８〜３１０頁］
によって測定し、全般的な抗凝固活性は、Ｒ.Ｒ.プロク
ターらが報告したＡＰＴＴ試験法［アメリカン・ジャー
ナル・オブ・クリニカル・パソロジー(Am. J. Clin. Pa
th.)、１９６１年、３６巻、２１２〜２１９頁］によっ
て測定した。試験したすべての生産物は、デルマタン硫
酸より著しく強力なＨＣII依存性の抗IIａ活性を示し
た。ＡＴIII依存性の抗IIａ活性およびイン・ウエスラ
ー力価は、ヘパリンの活性よりは低かったが、デルマタ
ン硫酸より強力であることが判明した。ＡＰＴＴ力価
は、デルマタン硫酸の活性の約２倍〜約１５倍高く、ヘ
パリンの活性の４０％に達した。即ち、この発明のＮ，
Ｏ−硫酸化ヘパロサン類は、特に優れた作用特異性およ
び抗凝固活性を有する。この発明のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパ
ロサン類は極めて低い毒性を示し、その毒性は医薬品と
しての用途に完全に適合し得る。したがってこの発明は
また、この発明の対象であるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン
類、またはその塩の１つ、またはこのＮ，Ｏ−硫酸化ヘ
パロサン、またはその塩の１つの少なくとも７０％を有
効主成分とし、１またはそれ以上の好適な製薬用担体と
組合せて含有する医薬組成物を提供する。
ロサン類は、先行技術の教示に関連して予想外である
が、有用な薬理学的および生化学的性質を有する。特に
特許出願公開ＥＰ−Ａ−０３３３２４３号に報告された
Ｋ５抗原の硫酸化生産物が、抗血管新生活性および抗腫
瘍活性を有し、さらにエンベロープウイルスに対する活
性を有し、これらの活性が、抗凝固作用と比べて好まし
い比を有するのに反し、この発明のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパ
ロサン類は血液凝固に対する良好な制御活性を有する。
この活性は、種々の血液凝固パラメーターに対するデル
マタン硫酸の活性よりはるかに強く、むしろヘパリンの
活性に匹敵する。より詳細には、この発明の代表的な生
産物のＡＴIIIまたはＨＣIIに依存する抗IIａ活性を、
ヘパリン補因子II（ＨＣII）についてはＤ.デュプイら
［トロンボーシス・アンド・ヘモステーシス(Thrombosi
s and Haemostasis)、１９８８年、６０巻（２）、２３
６〜２３９頁］、抗トロンビン（ＡＴIII）については
Ｍ.Ｌ.ラーセンら［トロンボーシス・リサーチ(Thrombo
sis Research)、１９７８年、１３巻（２）、２８５〜
２８８頁］が報告した方法にしたがって測定した。どち
らの場合とも、試験は、精製したＨＣIIおよびＡＴIII
の存在で、精製したトロンビン（IIａ因子）について、
トロンビンのアミド分解活性を色素産生物質で測定する
生産物の試験管内阻害効果を測定することにある。Ｈ.
Ｗ.スツールザッツらが報告した方法［「ザ・メソドロ
ジー・オブ・コネクティブ・ティシュー・リサーチ」、
１９７６年、１３７〜１４６頁］にしたがって製造した
デルマタン硫酸を標準物質として使用し、その結果を、
検討した生産物１mgに対するデルマタン硫酸（ＤＳ）当
量（mg）で表わしたこの活性の測定試験（mgＤＳ当量／
mg）で、この物質は最も強力なＨＣII依存性の抗IIａ活
性を示した。この発明の代表的な生産物の抗Ｘａ活性
［イン・ウエスラー(Yin-Wessler)力価］は、Ｅ.Ｔ.イ
ンらが報告した方法［ジャーナル・オブ・ラボラトリー
・アンド・クリニカル・メジシン(J. Lab. Cli. Me
d.)、１９７３年、８１巻（２）、２９８〜３１０頁］
によって測定し、全般的な抗凝固活性は、Ｒ.Ｒ.プロク
ターらが報告したＡＰＴＴ試験法［アメリカン・ジャー
ナル・オブ・クリニカル・パソロジー(Am. J. Clin. Pa
th.)、１９６１年、３６巻、２１２〜２１９頁］によっ
て測定した。試験したすべての生産物は、デルマタン硫
酸より著しく強力なＨＣII依存性の抗IIａ活性を示し
た。ＡＴIII依存性の抗IIａ活性およびイン・ウエスラ
ー力価は、ヘパリンの活性よりは低かったが、デルマタ
ン硫酸より強力であることが判明した。ＡＰＴＴ力価
は、デルマタン硫酸の活性の約２倍〜約１５倍高く、ヘ
パリンの活性の４０％に達した。即ち、この発明のＮ，
Ｏ−硫酸化ヘパロサン類は、特に優れた作用特異性およ
び抗凝固活性を有する。この発明のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパ
ロサン類は極めて低い毒性を示し、その毒性は医薬品と
しての用途に完全に適合し得る。したがってこの発明は
また、この発明の対象であるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン
類、またはその塩の１つ、またはこのＮ，Ｏ−硫酸化ヘ
パロサン、またはその塩の１つの少なくとも７０％を有
効主成分とし、１またはそれ以上の好適な製薬用担体と
組合せて含有する医薬組成物を提供する。
【００２６】これらの医薬組成物は、アテローム性動脈
硬化症および動脈硬化症のような血管壁の障害、および
例えば外科手術後、腫瘍増殖、または酵素、細菌または
ウイルス性の活性化因子によって生じる凝固障害に見ら
れる凝固能亢進状態の予防または治療的処置に特に有用
である。投与量は患者の年齢、体重、健康状態、および
疾患の性質および重篤度、投与経路の関数として幅広く
変わり得る。投与量は１日約１mg〜１ｇ、好ましくは１
日約５mg〜５００mg、例えば１日２００mgを、静脈内ま
たは皮下投与により、非連続的に、または一定の間隔を
置いて１日１回またはそれ以上の回数で行ない、または
１日当たり２００mg〜１０００mgを経口的に投与する。
いうまでもなくこれらの投与量は、患者毎に、観察した
結果、およびあらかじめ実施した血液検査によって調節
できる。
硬化症および動脈硬化症のような血管壁の障害、および
例えば外科手術後、腫瘍増殖、または酵素、細菌または
ウイルス性の活性化因子によって生じる凝固障害に見ら
れる凝固能亢進状態の予防または治療的処置に特に有用
である。投与量は患者の年齢、体重、健康状態、および
疾患の性質および重篤度、投与経路の関数として幅広く
変わり得る。投与量は１日約１mg〜１ｇ、好ましくは１
日約５mg〜５００mg、例えば１日２００mgを、静脈内ま
たは皮下投与により、非連続的に、または一定の間隔を
置いて１日１回またはそれ以上の回数で行ない、または
１日当たり２００mg〜１０００mgを経口的に投与する。
いうまでもなくこれらの投与量は、患者毎に、観察した
結果、およびあらかじめ実施した血液検査によって調節
できる。
【００２７】この発明の方法の出発物質の製造の段階
ｂ、ｃ、およびｄからそれぞれ得られたＮ−アセチルヘ
パロサン類［式（II）の化合物］、ヘパロサン類［式
（III）の化合物］、およびＮ−硫酸化ヘパロサン類
［式（IV）の化合物］、およびこの発明の対象である
Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類、およびこれらのすべての
物質の切断生産物は、低分子量、即ち、１.５×１０4以
下、特に１.５×１０3〜１.５×１０4Ｄの分子量のＮ−
アセチルヘパロサン類、Ｎ−硫酸化ヘパロサン類、およ
びＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類の解重合による製造に有
用な高分子量中間体である。解重合は、低分子量のヘパ
リンを製造するため文献に報告された方法、例えば過ヨ
ウ素酸塩による解重合、特に特許出願ＥＰ−０２８７４
７７号に報告された方法、あるいはフリーラジカルによ
る解重合、特に特許ＥＰ−０１２１０６７号に報告され
た方法によって実施できる。解重合はまた、β−脱離反
応によっても実施でき、より詳細には特許出願ＥＰ−０
０４０１４４号に報告された方法により実施できる。こ
の場合、所望により式（ａ）の非還元末端で、Ｏ−硫酸
化したα，β−不飽和ウロン酸末端が得られる。また亜
硝酸の反応による解重合、特に特許ＥＰ−００３７３１
９号に報告された方法は、優れた解重合の方法として用
い得る。この方法は、第１段階で、還元末端に、式
（ｂ）
ｂ、ｃ、およびｄからそれぞれ得られたＮ−アセチルヘ
パロサン類［式（II）の化合物］、ヘパロサン類［式
（III）の化合物］、およびＮ−硫酸化ヘパロサン類
［式（IV）の化合物］、およびこの発明の対象である
Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類、およびこれらのすべての
物質の切断生産物は、低分子量、即ち、１.５×１０4以
下、特に１.５×１０3〜１.５×１０4Ｄの分子量のＮ−
アセチルヘパロサン類、Ｎ−硫酸化ヘパロサン類、およ
びＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類の解重合による製造に有
用な高分子量中間体である。解重合は、低分子量のヘパ
リンを製造するため文献に報告された方法、例えば過ヨ
ウ素酸塩による解重合、特に特許出願ＥＰ−０２８７４
７７号に報告された方法、あるいはフリーラジカルによ
る解重合、特に特許ＥＰ−０１２１０６７号に報告され
た方法によって実施できる。解重合はまた、β−脱離反
応によっても実施でき、より詳細には特許出願ＥＰ−０
０４０１４４号に報告された方法により実施できる。こ
の場合、所望により式（ａ）の非還元末端で、Ｏ−硫酸
化したα，β−不飽和ウロン酸末端が得られる。また亜
硝酸の反応による解重合、特に特許ＥＰ−００３７３１
９号に報告された方法は、優れた解重合の方法として用
い得る。この方法は、第１段階で、還元末端に、式
（ｂ）
【化１２】 ［式中、Ｇは、解重合中に使用される物質では、水素原
子、または水素原子およびサルフェート基を表わす（式
(III) および(IV) の化合物ではＧは水素原子、式(Ｉ)
の物質ではＧは水素原子およびサルフェート基であ
る）］で示される２，５−無水マンノース単位を有する
生産物を得、ついで解重合に続いて、これを還元する
と、還元末端に、式（ｃ）
子、または水素原子およびサルフェート基を表わす（式
(III) および(IV) の化合物ではＧは水素原子、式(Ｉ)
の物質ではＧは水素原子およびサルフェート基であ
る）］で示される２，５−無水マンノース単位を有する
生産物を得、ついで解重合に続いて、これを還元する
と、還元末端に、式（ｃ）
【化１３】 ［式中、Ｇ'は、解重合に続いて硫酸化を行なわない場
合は水素原子、解重合に続いて硫酸化を行なう場合はサ
ルフェート基を表わす］で示される２，５−無水マンニ
ット単位を有する切断生産物を得る。亜硝酸との反応に
よる解重合に続いて、これを酸化すると、還元末端に、
式（ｄ）
合は水素原子、解重合に続いて硫酸化を行なう場合はサ
ルフェート基を表わす］で示される２，５−無水マンニ
ット単位を有する切断生産物を得る。亜硝酸との反応に
よる解重合に続いて、これを酸化すると、還元末端に、
式（ｄ）
【化１４】 で示される２，５−無水マンノン酸単位を有する切断生
産物が得られる。解重合は、所望により例えば特許出願
ＥＰ−０２４４２３５号およびＥＰ−０２４４２３６号
に報告されているような酵素法によっても実施できる。
上に挙げた解重合方法は、例示として示したものであっ
て、これに限定されるものではない。グリコサミノグリ
カン類の解重合のための任意の他の方法を用いることが
できる。ついで低分子量連鎖からなるＮ−アセチルヘパ
ロサン類、ヘパロサン類、Ｎ−硫酸化ヘパロサン類、お
よびＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類を得るため、解重合生
産物に１またはそれ以上の分別操作を行なうことができ
る。
産物が得られる。解重合は、所望により例えば特許出願
ＥＰ−０２４４２３５号およびＥＰ−０２４４２３６号
に報告されているような酵素法によっても実施できる。
上に挙げた解重合方法は、例示として示したものであっ
て、これに限定されるものではない。グリコサミノグリ
カン類の解重合のための任意の他の方法を用いることが
できる。ついで低分子量連鎖からなるＮ−アセチルヘパ
ロサン類、ヘパロサン類、Ｎ−硫酸化ヘパロサン類、お
よびＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類を得るため、解重合生
産物に１またはそれ以上の分別操作を行なうことができ
る。
【００２８】この発明のもう１つの対象は、解重合のの
ち、１.５×１０4Ｄ以下の低分子量のＮ−アセチルヘパ
ロサン類、ヘパロサン類、Ｎ−硫酸化ヘパロサン類、お
よびＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類を得るために、高分子
量のＮ−アセチルヘパロサン類［式（II）の化合物］、
ヘパロサン類［式（III）の化合物］、Ｎ−硫酸化ヘパ
ロサン類［式（IV）の化合物］、およびこの発明の対象
である高分子量のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類［式
（Ｉ）の化合物］を使用することである。この発明のも
う１つの一層特別な対象は、解重合ののち、１.５×１
０4Ｄ以下、特に１.５×１０3〜１.５×１０4Ｄの低分
子量のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類を製造するために、
Ｎ−硫酸化ヘパロサン類［式（IV）の化合物］、および
Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類［式（Ｉ）の化合物］を使
用することである。切断中に、式（IV）の化合物を出発
物質として使用する場合、式（IV）の生産物の切断によ
って得られた低分子量のＮ−硫酸化ヘパロサンに部分的
なＮ，Ｏ−硫酸化を行ない、または部分的なＮ，Ｏ−硫
酸化に続いて、完全なＮ−硫酸化段階を行なう何れかの
方法によって低分子量のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類が
得られる。以下に製造例および実施例を挙げてこの発明
をさらに説明する。
ち、１.５×１０4Ｄ以下の低分子量のＮ−アセチルヘパ
ロサン類、ヘパロサン類、Ｎ−硫酸化ヘパロサン類、お
よびＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類を得るために、高分子
量のＮ−アセチルヘパロサン類［式（II）の化合物］、
ヘパロサン類［式（III）の化合物］、Ｎ−硫酸化ヘパ
ロサン類［式（IV）の化合物］、およびこの発明の対象
である高分子量のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類［式
（Ｉ）の化合物］を使用することである。この発明のも
う１つの一層特別な対象は、解重合ののち、１.５×１
０4Ｄ以下、特に１.５×１０3〜１.５×１０4Ｄの低分
子量のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類を製造するために、
Ｎ−硫酸化ヘパロサン類［式（IV）の化合物］、および
Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類［式（Ｉ）の化合物］を使
用することである。切断中に、式（IV）の化合物を出発
物質として使用する場合、式（IV）の生産物の切断によ
って得られた低分子量のＮ−硫酸化ヘパロサンに部分的
なＮ，Ｏ−硫酸化を行ない、または部分的なＮ，Ｏ−硫
酸化に続いて、完全なＮ−硫酸化段階を行なう何れかの
方法によって低分子量のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類が
得られる。以下に製造例および実施例を挙げてこの発明
をさらに説明する。
【００２９】製造例Ｉ 高分子量Ｎ−アセチルヘパロサンの製造（方法Ｉ） （１）エシェリキア・コリ（Ｋ５）細菌株の培養および
Ｎ−アセチルヘパロサンを含有する濾液の分離 表Ｉに示した組成の培地Ｂ ４００mlをエシェリキア・
コリＳＥＢＲ３２８２株［ＣＮＣＭ（パスツール・イン
スチチュート）、パリ、フランスにＩ−１０１３の番号
のもとに寄託］とともに培養し、混合物を３７℃で２時
間撹拌しながら、インキュベートする。ついで得られた
前培養を表Ｉに示した組成の培地Ａ １１リットルを含
有する１８.５リットルの発酵装置へ移し、空気注入量
を調節し（２０リットル／分まで）、撹拌することによ
って酸素分圧を４０mm Hgに保ちながら、混合物を３７
℃、ｐＨ７.２で６時間３０分インキュベートする。つ
いでグリセリン（５００ｇ／リットル）を含有する滅菌
水を１８ｇ／時間の速度で１６〜１７時間連続的に導入
することにより、グリセリンを添加する。これと同一の
温度、ｐＨ、および酸素分圧条件下に、実質上グリセリ
ンが全部消費されるまで培養を続ける。グリセリンの添
加を完了したのち、発酵装置内で２０〜３０時間後に培
養を停止するまで、培養懸濁培地のＤＯ（λ＝６００n
m）をモニターする。培養は定常状態ないし僅かに溶菌
を示す。ついで培養ブロスを２５℃に冷却し、孔径０.
２２μmのメンブランで濾過する。Ｎ−アセチルヘパロ
サンを含有する濾液約１２リットルを得る。
Ｎ−アセチルヘパロサンを含有する濾液の分離 表Ｉに示した組成の培地Ｂ ４００mlをエシェリキア・
コリＳＥＢＲ３２８２株［ＣＮＣＭ（パスツール・イン
スチチュート）、パリ、フランスにＩ−１０１３の番号
のもとに寄託］とともに培養し、混合物を３７℃で２時
間撹拌しながら、インキュベートする。ついで得られた
前培養を表Ｉに示した組成の培地Ａ １１リットルを含
有する１８.５リットルの発酵装置へ移し、空気注入量
を調節し（２０リットル／分まで）、撹拌することによ
って酸素分圧を４０mm Hgに保ちながら、混合物を３７
℃、ｐＨ７.２で６時間３０分インキュベートする。つ
いでグリセリン（５００ｇ／リットル）を含有する滅菌
水を１８ｇ／時間の速度で１６〜１７時間連続的に導入
することにより、グリセリンを添加する。これと同一の
温度、ｐＨ、および酸素分圧条件下に、実質上グリセリ
ンが全部消費されるまで培養を続ける。グリセリンの添
加を完了したのち、発酵装置内で２０〜３０時間後に培
養を停止するまで、培養懸濁培地のＤＯ（λ＝６００n
m）をモニターする。培養は定常状態ないし僅かに溶菌
を示す。ついで培養ブロスを２５℃に冷却し、孔径０.
２２μmのメンブランで濾過する。Ｎ−アセチルヘパロ
サンを含有する濾液約１２リットルを得る。
【００３０】
【表１】 表Ｉ 培地Ａおよび培地Ｂの組成および調製 ［培地Ａ］ 下記の組成をこの表に示した順序に超精製水９００mlに溶解する。 ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸） １０００mg Ｋ2ＨＰＯ4 ７９０mg グルタミン酸 １１０００mg ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ５００mg Ｋ2ＳＯ4 ４５０mg ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １８mg ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２mg ＮａＣｌ ５００mg ＫＣｌ ５０００mg 微量元素溶液（表II参照） １ml グリセリン １００００mg 密度１.３８の濃厚水酸化カリウム溶液でｐＨ７.２に調
節し、超精製水を加えて全量１０００mlとする。０.２
μmのメンブランを通して滅菌濾過を実施する。 ［グリセリン溶液］グリセリン５０ｇを十分量の超精製
水に溶解し、これと同一の溶媒で全量１０００mlに調節
する。０.２μmのメンブランを通して滅菌濾過を実施す
る。発酵中に使用した消泡剤はストラクトール(Strukto
l)（商標）Ｊ６７３［シル・アンド・ザイラッヒャー(Sch
ill and Seilacher)］である。 ［培地Ｂ］培地Ｂの調製は、培地Ａの調製と同じである
が、消泡剤の添加後、緩衝液３−モルホリノプロパンス
ルホン酸(Ｍ.Ｏ.Ｐ.Ｓ.)（ｐＨ７.２）を追加的に添加
する。
節し、超精製水を加えて全量１０００mlとする。０.２
μmのメンブランを通して滅菌濾過を実施する。 ［グリセリン溶液］グリセリン５０ｇを十分量の超精製
水に溶解し、これと同一の溶媒で全量１０００mlに調節
する。０.２μmのメンブランを通して滅菌濾過を実施す
る。発酵中に使用した消泡剤はストラクトール(Strukto
l)（商標）Ｊ６７３［シル・アンド・ザイラッヒャー(Sch
ill and Seilacher)］である。 ［培地Ｂ］培地Ｂの調製は、培地Ａの調製と同じである
が、消泡剤の添加後、緩衝液３−モルホリノプロパンス
ルホン酸(Ｍ.Ｏ.Ｐ.Ｓ.)（ｐＨ７.２）を追加的に添加
する。
【００３１】
【表２】 表ＩＩ 培地Ａおよび培地Ｂの調製に使用する微量元素の溶液の調製 下記の組成を超精製水８００mlに溶解する（この表に示した順序で） Ｈ3ＢＯ3 ５００mg Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ １９３０mg ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ １１８５０mg ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ２５mg ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０００mg ＡｌＣｌ3・６Ｈ2Ｏ ２４１０mg 密度１.１９の塩酸１００mlを添加して、超精製水で全
量を１０００mlに調製する。
量を１０００mlに調製する。
【００３２】（２）主として高分子量のＮ−アセチルヘ
パロサンの単離および精製 （段階ａ）エタノール沈殿 ９５％（ｖ／ｖ）エタノール約４８リットルを濾液へ加
え、混合物を４℃で８時間放置して、沈殿、沈降させ
る。上清を吸引、ついで遠心によって除去し、遠心ペレ
ットを超精製水約１リットルに取る。 （段階ｂ）透析 上記の段階で得られた溶液をセルロース素材のメンブラ
ンで作られた孔径２４Åの「ノジャックス(Nojax)（商
標）４０」バッグに加え、超精製水に対して２４時間透
析する（溶液１容量／水６容量、２時間後、８時間後、
１６時間後に水を新しく入れ替える）。この操作によっ
て、培地中に存在する塩類、糖、アミノ酸、オリゴヌク
レオチド、およびオリゴペプチドのような小分子を除去
することができる。 （段階ｃ）沈殿、脱水、乾燥 ＮａＣｌ ０.５Ｍおよびエタノール４容量を透析溶液１
容量へ加える。室温で５分間放置すると、沈殿が生成す
る。混合物を５０００ｇで２０分間遠心する。遠心ペレ
ットをエタノールに取り、得られた懸濁液を撹拌し、室
温で１時間放置する。遠心および懸濁操作を繰返す。混
合物をもう一度５０００ｇで２０分間遠心する。得られ
た遠心ペレットをオーブン中で真空下に４０℃で２４時
間乾燥する。 （段階ｄ）粉砕、粉末化 乾燥した遠心ペレットを乳鉢を使用して無水条件下に粉
砕する。 （段階ｅ）アニオン交換クロマトグラフィー 粉砕した遠心ペレットを、１ｇ当たり、緩衝液（緩衝液
Ｄ、２０mMトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)）１００mlの量
に取る。得られた溶液を、緩衝液Ｄであらかじめ平衡化
した第４級アンモニウム基で架橋したアガロース・マト
リックス（「Ｑ−セファロース・ファースト・フロー(Q
-Sepharose Fast flow)」（商標）、ファーマシア社(Ph
armacia)］を含有する強アニオン交換カラム（粉末１ｇ
当たり、ゲル容量５０ml）でクロマトグラムに掛ける。
ゲルを、ＵＶ検出で２１４nmの基線となるまで十分量の
緩衝液Ｄで洗浄し、ついで２５mMピペラジン溶液（ｐＨ
３.５に調節）で洗浄する。０.５Ｍ ＮａＣｌおよび２
５mMピペラジンの組成を有する溶液（ｐＨ３.５）で溶
出を実施する。溶離液を５Ｎ ＮａＯＨ溶液で中和す
る。 （段階ｆ）沈殿、脱水、乾燥、粉砕 塩化ナトリウムを加えずに、前記の段階ｃおよびｄで説
明した操作を繰返す。段階ｆから得られたＮ−アセチル
ヘパロサンをバッチＡとよぶ。
パロサンの単離および精製 （段階ａ）エタノール沈殿 ９５％（ｖ／ｖ）エタノール約４８リットルを濾液へ加
え、混合物を４℃で８時間放置して、沈殿、沈降させ
る。上清を吸引、ついで遠心によって除去し、遠心ペレ
ットを超精製水約１リットルに取る。 （段階ｂ）透析 上記の段階で得られた溶液をセルロース素材のメンブラ
ンで作られた孔径２４Åの「ノジャックス(Nojax)（商
標）４０」バッグに加え、超精製水に対して２４時間透
析する（溶液１容量／水６容量、２時間後、８時間後、
１６時間後に水を新しく入れ替える）。この操作によっ
て、培地中に存在する塩類、糖、アミノ酸、オリゴヌク
レオチド、およびオリゴペプチドのような小分子を除去
することができる。 （段階ｃ）沈殿、脱水、乾燥 ＮａＣｌ ０.５Ｍおよびエタノール４容量を透析溶液１
容量へ加える。室温で５分間放置すると、沈殿が生成す
る。混合物を５０００ｇで２０分間遠心する。遠心ペレ
ットをエタノールに取り、得られた懸濁液を撹拌し、室
温で１時間放置する。遠心および懸濁操作を繰返す。混
合物をもう一度５０００ｇで２０分間遠心する。得られ
た遠心ペレットをオーブン中で真空下に４０℃で２４時
間乾燥する。 （段階ｄ）粉砕、粉末化 乾燥した遠心ペレットを乳鉢を使用して無水条件下に粉
砕する。 （段階ｅ）アニオン交換クロマトグラフィー 粉砕した遠心ペレットを、１ｇ当たり、緩衝液（緩衝液
Ｄ、２０mMトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)）１００mlの量
に取る。得られた溶液を、緩衝液Ｄであらかじめ平衡化
した第４級アンモニウム基で架橋したアガロース・マト
リックス（「Ｑ−セファロース・ファースト・フロー(Q
-Sepharose Fast flow)」（商標）、ファーマシア社(Ph
armacia)］を含有する強アニオン交換カラム（粉末１ｇ
当たり、ゲル容量５０ml）でクロマトグラムに掛ける。
ゲルを、ＵＶ検出で２１４nmの基線となるまで十分量の
緩衝液Ｄで洗浄し、ついで２５mMピペラジン溶液（ｐＨ
３.５に調節）で洗浄する。０.５Ｍ ＮａＣｌおよび２
５mMピペラジンの組成を有する溶液（ｐＨ３.５）で溶
出を実施する。溶離液を５Ｎ ＮａＯＨ溶液で中和す
る。 （段階ｆ）沈殿、脱水、乾燥、粉砕 塩化ナトリウムを加えずに、前記の段階ｃおよびｄで説
明した操作を繰返す。段階ｆから得られたＮ−アセチル
ヘパロサンをバッチＡとよぶ。
【００３３】（３）各種の精製段階で得られたＮ−アセ
チルヘパロサンの特性決定 核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル Ｗ.Ｆ.バンが報告したプロトンおよび13Ｃ−ＮＭＲ［ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、
１９８１年、１１６巻、３５９〜３６４頁］により、こ
れらのＮ−アセチルヘパロサンを比較した。バッチＡの
Ｎ−アセチルヘパロサンで得られたスペクトルの検討か
ら、これがＷ.Ｆ.バンの報告した生産物と同一物である
ことを確かめた。この生産物はβ−Ｄ−グルクロニル−
１，４−α−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−
（１，４）の繰返し構造からなるポリマー鎖である。 立体排除クロマトグラフィーによる分子量分布の測定 （第１法）下記の条件下に行なった排除ＨＰＬＣによ
り、分子量分布を測定する。直径１０μm、孔径２５０
Åを有するシリカビーズからなるカラム。 溶離液：０.５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液。 移動率：１ml／分。 ＵＶ検出（λ）＝２０５nm。 検量はヘパリンから誘導したオリゴ糖で実施する。これ
らは下記の分子量を有する：１３２４、１８８３、２４
３６、３４１１、３９９６、４５３５、４９９５、５３
６５、６１５０、６６７１、７５４２、８６５５、１０
０８８、１１５６１、１２９５０、１４８０９、１７３
８７、２２６７４Ｄ。 この検量範囲から考え、９３０Ｄ〜５７０００Ｄの分子
量だけが正確に測定される。検出した光学密度は、Ｎ−
アセチルヘパロサンの量に比例すると推定される。方法
の精度は、高分子量に関する有意性を、特に５×１０4
Ｄ以上のもので低下させる。バッチＡの排除クロマトグ
ラフィーの溶出パターンから、分布は多分散性であり、
約２×１０5Ｄで主ピークを含んでいると結論付けるこ
とができる。バッチＡの少なくとも７０重量％に等しい
画分は、１.０×１０5〜３.０×１０5Ｄの質量を有す
る。
チルヘパロサンの特性決定 核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル Ｗ.Ｆ.バンが報告したプロトンおよび13Ｃ−ＮＭＲ［ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、
１９８１年、１１６巻、３５９〜３６４頁］により、こ
れらのＮ−アセチルヘパロサンを比較した。バッチＡの
Ｎ−アセチルヘパロサンで得られたスペクトルの検討か
ら、これがＷ.Ｆ.バンの報告した生産物と同一物である
ことを確かめた。この生産物はβ−Ｄ−グルクロニル−
１，４−α−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−
（１，４）の繰返し構造からなるポリマー鎖である。 立体排除クロマトグラフィーによる分子量分布の測定 （第１法）下記の条件下に行なった排除ＨＰＬＣによ
り、分子量分布を測定する。直径１０μm、孔径２５０
Åを有するシリカビーズからなるカラム。 溶離液：０.５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液。 移動率：１ml／分。 ＵＶ検出（λ）＝２０５nm。 検量はヘパリンから誘導したオリゴ糖で実施する。これ
らは下記の分子量を有する：１３２４、１８８３、２４
３６、３４１１、３９９６、４５３５、４９９５、５３
６５、６１５０、６６７１、７５４２、８６５５、１０
０８８、１１５６１、１２９５０、１４８０９、１７３
８７、２２６７４Ｄ。 この検量範囲から考え、９３０Ｄ〜５７０００Ｄの分子
量だけが正確に測定される。検出した光学密度は、Ｎ−
アセチルヘパロサンの量に比例すると推定される。方法
の精度は、高分子量に関する有意性を、特に５×１０4
Ｄ以上のもので低下させる。バッチＡの排除クロマトグ
ラフィーの溶出パターンから、分布は多分散性であり、
約２×１０5Ｄで主ピークを含んでいると結論付けるこ
とができる。バッチＡの少なくとも７０重量％に等しい
画分は、１.０×１０5〜３.０×１０5Ｄの質量を有す
る。
【００３４】（第２法）結果を光散乱測定器を使用する
排除ＨＰＬＣによって確かめた。 カラム：１基のプレカラムと３基の連続カラムからなる
系。 −ＰＬ−アクアジェル(PL-Aquagel)−ＯＨ（商標）（プ
レカラム） −ＰＬ−アクアジェル−ＯＨ４０（商標） −ＰＬ−アクアジェル−ＯＨ５０（商標） −ＰＬ−アクアジェル−ＯＨ６０（商標） 溶離液：４００ppm ＮａＮ3水溶液 移動率：１ml／分 室温 検出：示差屈折計／光散乱組合せ方式。質量検出計（光
散乱）の反応は、式Ｃ×（ｄｎ/ｄｃ）2×Ｍｗ Ｃ ＝濃度 ｄｎ/ｄｃ＝屈折率増加 Ｍｗ ＝分子量 に比例する。ｄｎ／ｄｃ比の計算は２つの標準試料（デ
キストラン：Ｍｗ＝７００００Ｄおよび１５００００
Ｄ）を考慮することにより、示差屈折計の反応から算出
する。この方法によってバッチＡの少なくとも７０重量
％に等しい画分は、１.０×１０5〜３.０×１０5Ｄの質
量を有し、バッチＡの排除クロマトグラフィー後、得ら
れた溶出パターンから、約２１００００Ｄで主ピークを
含んでいることが確かめられた。
排除ＨＰＬＣによって確かめた。 カラム：１基のプレカラムと３基の連続カラムからなる
系。 −ＰＬ−アクアジェル(PL-Aquagel)−ＯＨ（商標）（プ
レカラム） −ＰＬ−アクアジェル−ＯＨ４０（商標） −ＰＬ−アクアジェル−ＯＨ５０（商標） −ＰＬ−アクアジェル−ＯＨ６０（商標） 溶離液：４００ppm ＮａＮ3水溶液 移動率：１ml／分 室温 検出：示差屈折計／光散乱組合せ方式。質量検出計（光
散乱）の反応は、式Ｃ×（ｄｎ/ｄｃ）2×Ｍｗ Ｃ ＝濃度 ｄｎ/ｄｃ＝屈折率増加 Ｍｗ ＝分子量 に比例する。ｄｎ／ｄｃ比の計算は２つの標準試料（デ
キストラン：Ｍｗ＝７００００Ｄおよび１５００００
Ｄ）を考慮することにより、示差屈折計の反応から算出
する。この方法によってバッチＡの少なくとも７０重量
％に等しい画分は、１.０×１０5〜３.０×１０5Ｄの質
量を有し、バッチＡの排除クロマトグラフィー後、得ら
れた溶出パターンから、約２１００００Ｄで主ピークを
含んでいることが確かめられた。
【００３５】ポリアクリルアミドゲルの電気泳動による
分子量分布の監視 分析すべきこれらの試料およびブロモフェノールブルー
を含む泳動終了マーカーを、アクリルアミドおよびＮ,
Ｎ'−メチレン−ビス−アクリルアミドの２９／１混合
物を重合化して得た１５％ポリアクリルアミドゲルのト
リス−ホウ酸塩緩衝液溶液の電気泳動に供した。泳動は
４０mＡで約４時間、１８cmのゲル上で、泳動終了マー
カーが現れるまで行う。次いでゲルを、Ｓ．ペルコネン
ら、(ジャーナル・オブ・バクテリオロジー１７０巻６
号２６４６頁(１９８３年))の技術に準じて、アルシア
ン・ブルーで、次に銀で呈色するが、これは酸性多糖類
に特異的である。この電気泳動による分析は、段階aか
ら得られた部分的に精製した産生物で、および最終段階
から結果的に生じた精製産生物で、精製過程中のＮ−ア
セチルヘパロサンの分子量分布に有意な差がないことを
確認する目的で行った。段階aで得られた部分精製産生
物の、および最終段階で精製した産生物のプロフィール
を観察すると、有意な差(同じ泳動距離で比較的強いバ
ンドの存在)は示されない。従って、精製中のＮ−アセ
チルヘパロサンの分子量分布に有意な変化はない。
分子量分布の監視 分析すべきこれらの試料およびブロモフェノールブルー
を含む泳動終了マーカーを、アクリルアミドおよびＮ,
Ｎ'−メチレン−ビス−アクリルアミドの２９／１混合
物を重合化して得た１５％ポリアクリルアミドゲルのト
リス−ホウ酸塩緩衝液溶液の電気泳動に供した。泳動は
４０mＡで約４時間、１８cmのゲル上で、泳動終了マー
カーが現れるまで行う。次いでゲルを、Ｓ．ペルコネン
ら、(ジャーナル・オブ・バクテリオロジー１７０巻６
号２６４６頁(１９８３年))の技術に準じて、アルシア
ン・ブルーで、次に銀で呈色するが、これは酸性多糖類
に特異的である。この電気泳動による分析は、段階aか
ら得られた部分的に精製した産生物で、および最終段階
から結果的に生じた精製産生物で、精製過程中のＮ−ア
セチルヘパロサンの分子量分布に有意な差がないことを
確認する目的で行った。段階aで得られた部分精製産生
物の、および最終段階で精製した産生物のプロフィール
を観察すると、有意な差(同じ泳動距離で比較的強いバ
ンドの存在)は示されない。従って、精製中のＮ−アセ
チルヘパロサンの分子量分布に有意な変化はない。
【００３６】ウロン酸の定量 最終段階から得た精製産生物の単位容量あたりのウロン
酸量を、Ｔ．ビター(アナリティカル・バイオケミスト
リー、４巻３３０−３３４頁(１９６２年))により報告
された方法に準じて、比色分析により決定した。この定
量方法は、グリコサミノグリカン類の熱酸性溶媒中カル
バゾールとの反応に基づいており、これにより放出した
ウロン酸量に比例してピンク色に呈色される。本明細書
の場合、酸はグルクロン酸である。バッチＡは、最終段
階から得られた部分精製産生物のウロン酸水準は２.２
マイクロモル／mgである。
酸量を、Ｔ．ビター(アナリティカル・バイオケミスト
リー、４巻３３０−３３４頁(１９６２年))により報告
された方法に準じて、比色分析により決定した。この定
量方法は、グリコサミノグリカン類の熱酸性溶媒中カル
バゾールとの反応に基づいており、これにより放出した
ウロン酸量に比例してピンク色に呈色される。本明細書
の場合、酸はグルクロン酸である。バッチＡは、最終段
階から得られた部分精製産生物のウロン酸水準は２.２
マイクロモル／mgである。
【００３７】紫外および可視部の分光光度測定法 精製した産生物(バッチＡ)を超純水に溶解し、得られた
溶液(Ｃ＝１mg／ml)を光学距離１cmの容器に入れる。吸
収スペクトルを２００−６００nmの間で記録する。得ら
れたスペクトルにより、とりわけ２５６nmでの吸収に基
づいて、バッチＡは１％未満のＡＤＮを含有することが
確認できる。
溶液(Ｃ＝１mg／ml)を光学距離１cmの容器に入れる。吸
収スペクトルを２００−６００nmの間で記録する。得ら
れたスペクトルにより、とりわけ２５６nmでの吸収に基
づいて、バッチＡは１％未満のＡＤＮを含有することが
確認できる。
【００３８】全タンパクの定量 商標バイオラッドにより市販されているタンパク検定キ
ットを用いて、全タンパクを定量する。定量方法は、コ
ーマシー・ブリリアント・ブルーg−２５０の酸性溶液
の最大吸収の波長は、タンパクがこれに結合しにくる
と、４６５nmから５９５nmに移動するという事実に基づ
いている(レイスナーら、アナリティカル・バイオケミ
ストリー６４巻５０９頁(１９７５年))。バッチＡの全
タンパクの水準は、１.５％未満である。
ットを用いて、全タンパクを定量する。定量方法は、コ
ーマシー・ブリリアント・ブルーg−２５０の酸性溶液
の最大吸収の波長は、タンパクがこれに結合しにくる
と、４６５nmから５９５nmに移動するという事実に基づ
いている(レイスナーら、アナリティカル・バイオケミ
ストリー６４巻５０９頁(１９７５年))。バッチＡの全
タンパクの水準は、１.５％未満である。
【００３９】遊離アミノ基(ＮＨ2)の定量 この定量は、ゼンサク・ヨシザワらにより、バイオケミ
カ・エト・バイオフィジカ・アクタ１４１巻３５８−３
６５頁(１９６７年)に報告された方法に準じて行った。
ＮＨ2水準のパラメーター(マイクロモル／mgで表現)
は、脱アセチル化β−グルクロニル−１,４−α−Ｎ−
アセチル−Ｄ−グルコサミニル(１,４)単位、および遊
離アミノ基を含有する。存在し得る不純物の量の指示体
である。バッチＡのＮＨ2水準は、０.１マイクロモル／
mgである。
カ・エト・バイオフィジカ・アクタ１４１巻３５８−３
６５頁(１９６７年)に報告された方法に準じて行った。
ＮＨ2水準のパラメーター(マイクロモル／mgで表現)
は、脱アセチル化β−グルクロニル−１,４−α−Ｎ−
アセチル−Ｄ−グルコサミニル(１,４)単位、および遊
離アミノ基を含有する。存在し得る不純物の量の指示体
である。バッチＡのＮＨ2水準は、０.１マイクロモル／
mgである。
【００４０】製造ＩＩ 十分に高分子量のＮ−アセチルヘパロサンの製造 (方法ＩＩ) １) 細菌株エシェリキア・コリ(Ｋ５)の培養およびＮ
−アセチルヘパロサン含有濾過物の分離 株エシェリキア・コリＳＥＢＲ３２８２の培養およびＮ
−アセチルヘパロサン含有濾過物の分離を、製造Ｉに記
載した方法に準じて行った。 ２) 十分に高分子量のＮ−アセチルヘパロサンの単離
および精製 段階a−透析 ろ過物３７５mlを製造Ｉ[２)十分に高分子量のＮ−アセ
チルヘパロサンの単離および精製、段階b]で記載した方
法に従って透析に供する。透析後、精製溶液約１０２０
mlを得る。 段階b−酸性溶媒での精製 pＨ３.５にするために、十分量の５Ｎ ＨＣlの溶液を
透析溶液に加える。形成した沈殿を遠心により除去し、
次に溶液を同じ酸(５Ｎ ＨＣl)で酸性にし、pＨ１,８
にする。沈殿を形成でき、これを遠心により除去する。
次に溶液を５Ｎ ＮaＯＨを用いて中性にする。 段階c−沈殿、脱水および乾燥 十分量の塩化ナトリウムを中性溶液に加えて０.５Ｍ
ＮaＣl溶液を得、次にエタノール４容量を加える。室温
で５分間沈殿を形成させる。混合物を５０００gで２０
分間遠心する。遠心小塊をエタノール中にとり、得られ
た懸濁液を攪拌し、室温で１時間放置する。遠心および
懸濁の操作を繰り返す。混合物を再び５０００gで２０
分間遠心する。得られた遠心小塊をオーブン中で減圧
下、４０℃で２４時間乾燥する。
−アセチルヘパロサン含有濾過物の分離 株エシェリキア・コリＳＥＢＲ３２８２の培養およびＮ
−アセチルヘパロサン含有濾過物の分離を、製造Ｉに記
載した方法に準じて行った。 ２) 十分に高分子量のＮ−アセチルヘパロサンの単離
および精製 段階a−透析 ろ過物３７５mlを製造Ｉ[２)十分に高分子量のＮ−アセ
チルヘパロサンの単離および精製、段階b]で記載した方
法に従って透析に供する。透析後、精製溶液約１０２０
mlを得る。 段階b−酸性溶媒での精製 pＨ３.５にするために、十分量の５Ｎ ＨＣlの溶液を
透析溶液に加える。形成した沈殿を遠心により除去し、
次に溶液を同じ酸(５Ｎ ＨＣl)で酸性にし、pＨ１,８
にする。沈殿を形成でき、これを遠心により除去する。
次に溶液を５Ｎ ＮaＯＨを用いて中性にする。 段階c−沈殿、脱水および乾燥 十分量の塩化ナトリウムを中性溶液に加えて０.５Ｍ
ＮaＣl溶液を得、次にエタノール４容量を加える。室温
で５分間沈殿を形成させる。混合物を５０００gで２０
分間遠心する。遠心小塊をエタノール中にとり、得られ
た懸濁液を攪拌し、室温で１時間放置する。遠心および
懸濁の操作を繰り返す。混合物を再び５０００gで２０
分間遠心する。得られた遠心小塊をオーブン中で減圧
下、４０℃で２４時間乾燥する。
【００４１】段階d−アルカリ性加水分解および透析 乾燥後、上記段階で得た産生物を、０.２５Ｎ ＮaＯＨ
溶液中２.５％(重量／容量)で溶解する。このようにし
て得られた溶液を２時間５０℃で維持する。次に溶液を
５Ｎ ＨＣl溶液で中性にし、次いで多糖類を含有する
溶液を、製造Ｉ[２)十分に高分子のＮ−アセチルヘパロ
サンの単離および精製、段階b]に記載した方法に準じて
透析に供する。透析後、約９９０mlの溶液を得る。 段階e−陰イオン交換クロマトグラフィー 十分量のピペラジン、ＥＤＴＡおよびトライトンＸ−１
００(商標プロラボ)を透析した溶液に加え、各々ピペラ
ジンに関して２５mＭ、ＥＤＴＡに関して２mＭおよびト
ライトンＸ−１００に関して０.２％(容量／容量)の濃
度を得る。次に５Ｎ ＨＣl溶液でpＨを３.５に調整す
る。この溶液を、２５mＭのピペラジン、２mＭのＥＤＴ
Ａおよび０.２mＭのトライトンＸ−１００を含有するピ
ペラジン緩衝液(pＨ＝３.５)で平衡にした。４００mlＱ
−セファロース・ファスト・フロー・カラムに載せる。
カラムをピペラジン緩衝液で洗浄し、０.５Ｍ ＮaＣl
溶液で溶出し、次に産生物をエタノール４容量で沈殿さ
せる。産生物を減圧下４０℃で乾燥する。このようにし
てＮ−アセチルヘパロサン約９.８５gを得る。 段階f−立体排除クロマトグラフィー 上記段階で得た産生物４gを組成:２０mＭトリス−塩
酸、pＨ７.５および１ＭＮaＣlである緩衝溶液６０mlに
溶解し、次に予め同じ緩衝液で平衡にした商標オクチル
・セファロースカラムを通す。保持されなかった分画に
エタノール４容量を加える。形成された沈殿を洗浄し、
減圧下４０℃で乾燥する。このようにしてＮ−アセチル
ヘパロサン(バッチＢ)３.９０gを得る。
溶液中２.５％(重量／容量)で溶解する。このようにし
て得られた溶液を２時間５０℃で維持する。次に溶液を
５Ｎ ＨＣl溶液で中性にし、次いで多糖類を含有する
溶液を、製造Ｉ[２)十分に高分子のＮ−アセチルヘパロ
サンの単離および精製、段階b]に記載した方法に準じて
透析に供する。透析後、約９９０mlの溶液を得る。 段階e−陰イオン交換クロマトグラフィー 十分量のピペラジン、ＥＤＴＡおよびトライトンＸ−１
００(商標プロラボ)を透析した溶液に加え、各々ピペラ
ジンに関して２５mＭ、ＥＤＴＡに関して２mＭおよびト
ライトンＸ−１００に関して０.２％(容量／容量)の濃
度を得る。次に５Ｎ ＨＣl溶液でpＨを３.５に調整す
る。この溶液を、２５mＭのピペラジン、２mＭのＥＤＴ
Ａおよび０.２mＭのトライトンＸ−１００を含有するピ
ペラジン緩衝液(pＨ＝３.５)で平衡にした。４００mlＱ
−セファロース・ファスト・フロー・カラムに載せる。
カラムをピペラジン緩衝液で洗浄し、０.５Ｍ ＮaＣl
溶液で溶出し、次に産生物をエタノール４容量で沈殿さ
せる。産生物を減圧下４０℃で乾燥する。このようにし
てＮ−アセチルヘパロサン約９.８５gを得る。 段階f−立体排除クロマトグラフィー 上記段階で得た産生物４gを組成:２０mＭトリス−塩
酸、pＨ７.５および１ＭＮaＣlである緩衝溶液６０mlに
溶解し、次に予め同じ緩衝液で平衡にした商標オクチル
・セファロースカラムを通す。保持されなかった分画に
エタノール４容量を加える。形成された沈殿を洗浄し、
減圧下４０℃で乾燥する。このようにしてＮ−アセチル
ヘパロサン(バッチＢ)３.９０gを得る。
【００４２】３) 種々精製段階から得られたＮ−アセ
チルヘパロサンの特性化 核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトル Ｗ．Ｆ．バーン(ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バ
イオケミストリー１１６巻３５９−３６４頁(１９８１
年))により報告されるように、このＮ−アセチルヘパロ
サンで得たプロトンおよび13Ｃ炭素ＮＭＲスペクトルの
研究により、産生物をＮ−アセチルヘパロサンであると
化学的に同定するのを確認する。 立体排除クロマトグラフィーによる分子量分布の決定 製造Ｉで記載したＮ−アセチルヘパロサンの分子量分布
の決定に用いた方法に準じて、立体排除クロマトグラフ
ィーにより分子量分布を決定する。製造ＩＩより結果的
に得られたバッチＢを構成する鎖の少なくとも６０重量
パーセントに等しい分画の分子量は５.０×１０4〜２.
５×１０5ダルトンの間である。 ウロン酸の定量 段階eから得られたＮ−アセチルヘパロサンのウロン酸
水準は２.２マイクロモル／mgである。 紫外および可視部の分光光度測定法 得られたスペクトルより、得られたＮ−アセチルヘパロ
サンは１％未満のＤＮＡを含有することが確認できるよ
うになる。 全タンパクの定量 バッチＢの全タンパクは１％未満である。 遊離アミノ基(ＮＨ2)の定量 ＮＨ2水準は０.１マイクロモル／mg未満である。
チルヘパロサンの特性化 核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトル Ｗ．Ｆ．バーン(ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バ
イオケミストリー１１６巻３５９−３６４頁(１９８１
年))により報告されるように、このＮ−アセチルヘパロ
サンで得たプロトンおよび13Ｃ炭素ＮＭＲスペクトルの
研究により、産生物をＮ−アセチルヘパロサンであると
化学的に同定するのを確認する。 立体排除クロマトグラフィーによる分子量分布の決定 製造Ｉで記載したＮ−アセチルヘパロサンの分子量分布
の決定に用いた方法に準じて、立体排除クロマトグラフ
ィーにより分子量分布を決定する。製造ＩＩより結果的
に得られたバッチＢを構成する鎖の少なくとも６０重量
パーセントに等しい分画の分子量は５.０×１０4〜２.
５×１０5ダルトンの間である。 ウロン酸の定量 段階eから得られたＮ−アセチルヘパロサンのウロン酸
水準は２.２マイクロモル／mgである。 紫外および可視部の分光光度測定法 得られたスペクトルより、得られたＮ−アセチルヘパロ
サンは１％未満のＤＮＡを含有することが確認できるよ
うになる。 全タンパクの定量 バッチＢの全タンパクは１％未満である。 遊離アミノ基(ＮＨ2)の定量 ＮＨ2水準は０.１マイクロモル／mg未満である。
【００４３】製造ＩＩ 十分に高分子量のＮ−アセチルヘパロサンの製造(方法
ＩＩＩ) １) 細菌株エシェリキア・コリの培養(Ｋ５) 製造Ｉに記載された方法に準じて、株エシェリキア・コ
リＳＥＢＲ３２８２を培養する。Ｎ−アセチルヘパロサ
ン含有培養物約１２lを得る。 ２) 予備的な精製 段階a−遠心 培養の終わりに、得られた懸濁液を８０００回転／分
(または１１０００〜１４０００g)で２０分間遠心す
る。 段階b−アルカリ性溶液に接触させる 遠心後、小塊を除去し、上清を０.１Ｎ ＮaＯＨ溶液に
約１時間接触させる。 段階c−予備的な濾過 上記段階で得た溶液を、商標ポリプロピレン３Ｍシリー
ズ３００フィルターを通す予備濾過に供する。 段階d−閾しゃ断値を予め決定した膜を通す濃縮 段階cで得た濾過物を、閾しゃ断値３００００ダルトン
の商標アミコン中空ファイバーまたはそれと同等の物を
含有するカートリッジを通して濃縮する。高分子量Ｎ−
アセチルヘパロサンの濃縮した溶液はこのようにして得
る。 段階e−透析 高分子量Ｎ−アセチルヘパロサンの濃縮した溶液を、ま
た商標アミコン系で、非常に高い希釈係数(＞１０００
０)で超純水に対して透析する。 ３) 十分に高分子量Ｎ−アセチルヘパロサンの単離お
よび精製 製造Ｉ[２)十分に高分子量のＮ−アセチルヘパロサンの
単離および精製、段階c−段階f]で示されるのと同様に
単離および精製を行い、バッチＡのものと類似の、また
は製造ＩＩ[２)十分に高分子量のＮ−アセチルヘパロサ
ンの単離および精製、段階a−段階f]に示されるような
特性を有するＮ−アセチルヘパロサン(バッチＣ)を得
る。
ＩＩＩ) １) 細菌株エシェリキア・コリの培養(Ｋ５) 製造Ｉに記載された方法に準じて、株エシェリキア・コ
リＳＥＢＲ３２８２を培養する。Ｎ−アセチルヘパロサ
ン含有培養物約１２lを得る。 ２) 予備的な精製 段階a−遠心 培養の終わりに、得られた懸濁液を８０００回転／分
(または１１０００〜１４０００g)で２０分間遠心す
る。 段階b−アルカリ性溶液に接触させる 遠心後、小塊を除去し、上清を０.１Ｎ ＮaＯＨ溶液に
約１時間接触させる。 段階c−予備的な濾過 上記段階で得た溶液を、商標ポリプロピレン３Ｍシリー
ズ３００フィルターを通す予備濾過に供する。 段階d−閾しゃ断値を予め決定した膜を通す濃縮 段階cで得た濾過物を、閾しゃ断値３００００ダルトン
の商標アミコン中空ファイバーまたはそれと同等の物を
含有するカートリッジを通して濃縮する。高分子量Ｎ−
アセチルヘパロサンの濃縮した溶液はこのようにして得
る。 段階e−透析 高分子量Ｎ−アセチルヘパロサンの濃縮した溶液を、ま
た商標アミコン系で、非常に高い希釈係数(＞１０００
０)で超純水に対して透析する。 ３) 十分に高分子量Ｎ−アセチルヘパロサンの単離お
よび精製 製造Ｉ[２)十分に高分子量のＮ−アセチルヘパロサンの
単離および精製、段階c−段階f]で示されるのと同様に
単離および精製を行い、バッチＡのものと類似の、また
は製造ＩＩ[２)十分に高分子量のＮ−アセチルヘパロサ
ンの単離および精製、段階a−段階f]に示されるような
特性を有するＮ−アセチルヘパロサン(バッチＣ)を得
る。
【００４４】製造ＩＶ 十分に高分子量のＮ−アセチルヘパロサンの製造(方法
ＩＶ) １) 細菌株エシェリキア・コリ(Ｋ５)の培養 株エシェリキア・コリＳＥＢＲ３２８２を、培養培地と
して培地Ａの代わりに培地Ｃ、および培地Ｂの変わりに
培地Ｄを用い、製造Ｉに記載した方法に準じて培養し
た。培地Ｃおよび培地Ｄの組成は表ＩＩＩ(次頁参照)に
具体的に示す。このようにして、Ｎ−アセチルヘパロサ
ン含有濾過物約１２lを得る。 ２) 十分に高分子量のＮ−アセチルヘパロサンの単離
および精製 単離および精製は、製造Ｉ[２)十分に高分子量のＮ−ア
セチルヘパロサンの単離および精製、段階a、段階f]に
記載した方法と同様に行う。このようにしてバッチＤを
得る。 ３) 得られたＮ−アセチルヘパロサンの特性化 排除クロマトグラフィーによる分子量分布の決定 製造Ｉ[３)種々精製段階から得たＮ−アセチルヘパロサ
ンの特性化:立体排除クロマトグラフィーによる分子量
分布の決定−第１および第２の方法]に記載した方法と
同等の方法を用いる。バッチＤの立体排除クロマトグラ
フィーの溶出プロフィールの研究により、分子量分布は
多分散であり、約１１００００ダルトンに主要なピーク
があると結論づけることができる。バッチＤの少なくと
も７５重量パーセントと同等の分画の分子量は１.０×
１０4〜２.５×１０5ダルトンである。 ウロン酸の定量 ウロン酸水準は２.０マイクロモル／mgである。 遊離アミノ基(ＮＨ2)の定量 バッチのＮＨ2水準は、０.１マイクロモル／mg未満であ
る。
ＩＶ) １) 細菌株エシェリキア・コリ(Ｋ５)の培養 株エシェリキア・コリＳＥＢＲ３２８２を、培養培地と
して培地Ａの代わりに培地Ｃ、および培地Ｂの変わりに
培地Ｄを用い、製造Ｉに記載した方法に準じて培養し
た。培地Ｃおよび培地Ｄの組成は表ＩＩＩ(次頁参照)に
具体的に示す。このようにして、Ｎ−アセチルヘパロサ
ン含有濾過物約１２lを得る。 ２) 十分に高分子量のＮ−アセチルヘパロサンの単離
および精製 単離および精製は、製造Ｉ[２)十分に高分子量のＮ−ア
セチルヘパロサンの単離および精製、段階a、段階f]に
記載した方法と同様に行う。このようにしてバッチＤを
得る。 ３) 得られたＮ−アセチルヘパロサンの特性化 排除クロマトグラフィーによる分子量分布の決定 製造Ｉ[３)種々精製段階から得たＮ−アセチルヘパロサ
ンの特性化:立体排除クロマトグラフィーによる分子量
分布の決定−第１および第２の方法]に記載した方法と
同等の方法を用いる。バッチＤの立体排除クロマトグラ
フィーの溶出プロフィールの研究により、分子量分布は
多分散であり、約１１００００ダルトンに主要なピーク
があると結論づけることができる。バッチＤの少なくと
も７５重量パーセントと同等の分画の分子量は１.０×
１０4〜２.５×１０5ダルトンである。 ウロン酸の定量 ウロン酸水準は２.０マイクロモル／mgである。 遊離アミノ基(ＮＨ2)の定量 バッチのＮＨ2水準は、０.１マイクロモル／mg未満であ
る。
【００４５】
【表３】 表ＩＩＩ 培地Ｃおよび培地Ｄの組成および調整 培地Ｃ 培地Ｃは以下の３つの無菌溶液を配合して調整する: 溶液番号１ この順序で超純水７００mlに溶解する: 錯化剤:Ｎ−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]−グリシン(商標フルカにより 市販されているトリシン) ３６０mg ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２８０mg ＣaＣl2・２Ｈ2Ｏ ６.７mg ＭｇＣl2・６Ｈ2Ｏ １２７０mg Ｋ2ＳＯ4 ５００mg ＫＣl ５０００mg カゼイン加水分解物(アミノ酸の主要な源泉) ＨＹカーゼＳＦ(商標シェフィールドにより市販) ２５０００mg 酵母菌抽出物(商標ディフコにより市販) １８０００mg 微少要素の溶液(表ＩＩ、製造Ｉ参照) １ml 泡止め剤ストラクトールＪ６７３(商標シル・アンド・
セイラハーにより市販):パスツールピペットから数滴。 ＫＯＨ溶液(d＝１.３８)でpＨを７.４に調整し、超純水
で８５０mlにする。培地は１２０℃で４５分間オートク
レーブに入れる。 溶液番号２ Ｋ2ＨＰＯ4５gを超純水約４０mlに溶解し、次に同じ溶
媒で５０mlに調整する。得られた溶液を０.２μmの有孔
性のフィルターを通して濾過する。 溶液番号３ グリセロール２０.７gを十分量の超純水に溶解し、容量
を同じ溶媒で１００mlに調整する。１１０℃で３０分
間、オートクレーブに入れる。 培地Ｄ 緩衝液２０g(pＨ＝７.２):泡止め剤添加後３−モルホォ
リノプロパンスルホン酸を加えるのが望ましいという違
いは別にして、培地Ｄは培地Ｃと同等に調整する。
セイラハーにより市販):パスツールピペットから数滴。 ＫＯＨ溶液(d＝１.３８)でpＨを７.４に調整し、超純水
で８５０mlにする。培地は１２０℃で４５分間オートク
レーブに入れる。 溶液番号２ Ｋ2ＨＰＯ4５gを超純水約４０mlに溶解し、次に同じ溶
媒で５０mlに調整する。得られた溶液を０.２μmの有孔
性のフィルターを通して濾過する。 溶液番号３ グリセロール２０.７gを十分量の超純水に溶解し、容量
を同じ溶媒で１００mlに調整する。１１０℃で３０分
間、オートクレーブに入れる。 培地Ｄ 緩衝液２０g(pＨ＝７.２):泡止め剤添加後３−モルホォ
リノプロパンスルホン酸を加えるのが望ましいという違
いは別にして、培地Ｄは培地Ｃと同等に調整する。
【００４６】製造Ｖ ヘパロサン(４０％Ｎ−脱アセチル化誘導体)の製造 製造ＩＶで記載したＮ−アセチルヘパロサン(バッチＤ)
３.７gを１Ｎ ＮaＯＨ７４mlに溶解する。溶液を５０
℃にし、この温度で８時間、窒素下で攪拌しながら反応
させる。次に２Ｎ ＨＣl溶液でpＨ約８に調整し、得ら
れた溶液を超純水で透析し、凍結乾燥する。凍結乾燥
後、２.９１gの産生物(バッチＥ)を得る。 Ｎ−脱アセチル化の程度 凍結乾燥後に得た産生物の遊離アミノ基(ＮＨ2)を定量
すると、Ｎ−アセチルヘパロサンの４０％がＮ−脱アセ
チル化されたことが示される。
３.７gを１Ｎ ＮaＯＨ７４mlに溶解する。溶液を５０
℃にし、この温度で８時間、窒素下で攪拌しながら反応
させる。次に２Ｎ ＨＣl溶液でpＨ約８に調整し、得ら
れた溶液を超純水で透析し、凍結乾燥する。凍結乾燥
後、２.９１gの産生物(バッチＥ)を得る。 Ｎ−脱アセチル化の程度 凍結乾燥後に得た産生物の遊離アミノ基(ＮＨ2)を定量
すると、Ｎ−アセチルヘパロサンの４０％がＮ−脱アセ
チル化されたことが示される。
【００４７】製造ＶＩ Ｎ−硫酸化ヘパロサン(８０％Ｎ−脱アセチル化誘導体)
の製造 製造ＩＩに記載した方法に準じて製造したＮ−アセチル
ヘパロサンをバッチＦと称し、これを出発物質として種
々の化学的修飾のために使用する。この産生物のウロン
酸水準は２.４１マイクロモル／mgである。 段階a−部分的Ｎ−脱アセチル化 バッチＦ１.９gを２Ｎ ＮaＯＨ３８.５mlに溶解する。
溶液を５０℃にし、この温度で８時間、窒素下で反応さ
せる。次に２Ｎ ＨＣlを添加してpＨ８.２５に調整す
る。溶液を超純水で透析し、次いで凍結乾燥する。この
ようにして産生物１.６gを得る。 Ｎ−脱アセチル化の程度 遊離アミノ基(ＮＨ2)の定量により、Ｎ−アセチルヘパ
ロサンの８０％がＮ−脱アセチル化されたことが示され
る。 段階b−Ｎ−硫酸化 上記段階で得た産生物１.３３gを超純水５７mlに溶解
し、Ｎa2ＣＯ3１.９gおよび三酸化イオウ／トリメチル
アミン複合体１.９gを混合物に加え、２時間５５℃にす
る。次に、脱ミネラル水を添加して、溶液の伝導度を
０.５Ｍ ＮaＣlの伝導度に調整し、４容量のエタノー
ルで固体を沈澱させる。この固体を遠心し、小塊を０.
５Ｍ ＮaＣl溶液にとり、４容量のエタノールで固体を
沈澱させ、遠心する。小塊を超純水に溶解し、溶液を製
造Ｉに記載された方法に準じて透析し、次いで凍結乾燥
する。このようにしてＮ−硫酸化ヘパロサン(バッチ
Ｆ1)１.８０９gを得る。
の製造 製造ＩＩに記載した方法に準じて製造したＮ−アセチル
ヘパロサンをバッチＦと称し、これを出発物質として種
々の化学的修飾のために使用する。この産生物のウロン
酸水準は２.４１マイクロモル／mgである。 段階a−部分的Ｎ−脱アセチル化 バッチＦ１.９gを２Ｎ ＮaＯＨ３８.５mlに溶解する。
溶液を５０℃にし、この温度で８時間、窒素下で反応さ
せる。次に２Ｎ ＨＣlを添加してpＨ８.２５に調整す
る。溶液を超純水で透析し、次いで凍結乾燥する。この
ようにして産生物１.６gを得る。 Ｎ−脱アセチル化の程度 遊離アミノ基(ＮＨ2)の定量により、Ｎ−アセチルヘパ
ロサンの８０％がＮ−脱アセチル化されたことが示され
る。 段階b−Ｎ−硫酸化 上記段階で得た産生物１.３３gを超純水５７mlに溶解
し、Ｎa2ＣＯ3１.９gおよび三酸化イオウ／トリメチル
アミン複合体１.９gを混合物に加え、２時間５５℃にす
る。次に、脱ミネラル水を添加して、溶液の伝導度を
０.５Ｍ ＮaＣlの伝導度に調整し、４容量のエタノー
ルで固体を沈澱させる。この固体を遠心し、小塊を０.
５Ｍ ＮaＣl溶液にとり、４容量のエタノールで固体を
沈澱させ、遠心する。小塊を超純水に溶解し、溶液を製
造Ｉに記載された方法に準じて透析し、次いで凍結乾燥
する。このようにしてＮ−硫酸化ヘパロサン(バッチ
Ｆ1)１.８０９gを得る。
【００４８】製造ＶＩＩ 亜硝酸での脱重合化による低分子量Ｎ−硫酸化ヘパロサ
ン(８０％Ｎ−脱アセチル化誘導体)の製造:(最終亜硝酸
濃度:０.０４Ｍ) 段階a−亜硝酸ナトリウムでの開裂 製造ＶＩで得られた産生物１gを超純水８mlに溶解す
る。溶液のpＨを２Ｎ ＨＣlで２.５に調整する。１０
０mg／ml亜硝酸ナトリウム水溶液０.２７６mlを、室温
で窒素流下、激しく攪拌した溶液に加える(最終亜硝酸
塩モル濃度:０.０４Ｍ)。pＨを２Ｎ ＨＣlで即座に再
調整し、溶液の全容量１０mlにする。窒素流下で２時
間、攪拌を続ける。 段階b−形成した２,５−アンヒドロマンノース基の還元 溶液のpＨを２Ｎ 水酸化ナトリウム溶液で７.０に調整
し、次に水素化ホウ素ナトリウム０.２gを加え、混合物
を空気にさらしながら室温で１５時間攪拌する。過剰の
水素化ホウ素を１０％酢酸でpＨ３.５に酸性化すること
により加水分解する。反応溶液を１５分間攪拌し、次に
pＨを２Ｎ 水酸化ナトリウム溶液で７.０に調整する。
反応産生物を４容量のエタノールで沈澱し、遠心し、純
粋なエタノールで洗浄し、減圧下６０℃で乾燥する。こ
のようにして低分子量脱重合比Ｎ−硫酸化ヘパロサン
(８０％Ｎ−脱アセチル化誘導体)９８０mgを得、これは
還元末端が２,５−アンヒドロマンニトール基である(バ
ッチＧ)。
ン(８０％Ｎ−脱アセチル化誘導体)の製造:(最終亜硝酸
濃度:０.０４Ｍ) 段階a−亜硝酸ナトリウムでの開裂 製造ＶＩで得られた産生物１gを超純水８mlに溶解す
る。溶液のpＨを２Ｎ ＨＣlで２.５に調整する。１０
０mg／ml亜硝酸ナトリウム水溶液０.２７６mlを、室温
で窒素流下、激しく攪拌した溶液に加える(最終亜硝酸
塩モル濃度:０.０４Ｍ)。pＨを２Ｎ ＨＣlで即座に再
調整し、溶液の全容量１０mlにする。窒素流下で２時
間、攪拌を続ける。 段階b−形成した２,５−アンヒドロマンノース基の還元 溶液のpＨを２Ｎ 水酸化ナトリウム溶液で７.０に調整
し、次に水素化ホウ素ナトリウム０.２gを加え、混合物
を空気にさらしながら室温で１５時間攪拌する。過剰の
水素化ホウ素を１０％酢酸でpＨ３.５に酸性化すること
により加水分解する。反応溶液を１５分間攪拌し、次に
pＨを２Ｎ 水酸化ナトリウム溶液で７.０に調整する。
反応産生物を４容量のエタノールで沈澱し、遠心し、純
粋なエタノールで洗浄し、減圧下６０℃で乾燥する。こ
のようにして低分子量脱重合比Ｎ−硫酸化ヘパロサン
(８０％Ｎ−脱アセチル化誘導体)９８０mgを得、これは
還元末端が２,５−アンヒドロマンニトール基である(バ
ッチＧ)。
【００４９】立体排除高速液体クロマトグラフィー(Ｈ
ＰＬＣ)による分子量分布の決定 以下の条件下で、立体排除ＨＰＬＣにより、分子量分布
を決定する: ＴＳＫ２０００(トーヨー・ソーダ)カラム 移動相:０.５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液 流速:１ml／分 λ＝２０５nmの紫外線検出器 計測は、製造Ｉ[３)種々精製段階から得たＮ−アセチル
ヘパロサンの特性化:立体排除クロマトグラフィーによ
る分子量分布の決定−第１の方法]に記載したのと同様
に、ヘパリンから誘導した一連のオリゴ糖類を用いて行
う。溶出プロフィールから導かれた結果のいくつかは、
以下の表ＩＶに照合する。ＭＷ1は、ＭＷ1よりも高分子
量であるのが、産生物の１重量パーセント分画であるよ
うな分子量を表す。ＭＷ2派、ＭＷ2よりも高分子量であ
るのが、産生物の１０重量パーセント分画であるような
分子量を表す。ＭＷ4は、ＮＷ4よりも低分子量であるの
が、産生物の１０重量パーセント分画であるような分子
量を表す。ＭＷ5は、ＭＷ5よりも低分子量であるのが、
産生物の１重量パーセント分画であるような分子量を表
す。ＭＷ3は、最大吸収に相当する分子量を表す。
ＰＬＣ)による分子量分布の決定 以下の条件下で、立体排除ＨＰＬＣにより、分子量分布
を決定する: ＴＳＫ２０００(トーヨー・ソーダ)カラム 移動相:０.５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液 流速:１ml／分 λ＝２０５nmの紫外線検出器 計測は、製造Ｉ[３)種々精製段階から得たＮ−アセチル
ヘパロサンの特性化:立体排除クロマトグラフィーによ
る分子量分布の決定−第１の方法]に記載したのと同様
に、ヘパリンから誘導した一連のオリゴ糖類を用いて行
う。溶出プロフィールから導かれた結果のいくつかは、
以下の表ＩＶに照合する。ＭＷ1は、ＭＷ1よりも高分子
量であるのが、産生物の１重量パーセント分画であるよ
うな分子量を表す。ＭＷ2派、ＭＷ2よりも高分子量であ
るのが、産生物の１０重量パーセント分画であるような
分子量を表す。ＭＷ4は、ＮＷ4よりも低分子量であるの
が、産生物の１０重量パーセント分画であるような分子
量を表す。ＭＷ5は、ＭＷ5よりも低分子量であるのが、
産生物の１重量パーセント分画であるような分子量を表
す。ＭＷ3は、最大吸収に相当する分子量を表す。
【表４】 表ＩＶ 製造ＶＩＩで得た産生物の分子量分布(バッチＧ) ＭＷ1 ＭＷ2 ＭＷ3 ＭＷ4 ＭＷ5 １６,９３９ ８８４３ ３７１６ １７５７ ９２５
【００５０】製造ＶＩＩＩ 亜硝酸での脱重合による低分子量Ｎ−硫酸化ヘパロサン
(８０％Ｎ−脱アセチル化誘導体)の製造:(最終亜硝酸塩
濃度:０.０３Ｍ) 製造ＶＩＩに記載のとおり、１００mg／ml亜硝酸ナトリ
ウム０.２７６mlの代わりに０.２０８mlを添加すること
により、製造する。このようにして産生物９９０mg(バ
ッチＨ)を得る。分子量分布を、製造ＶＩＩに記載する
とおり、立体排除ＨＰＬＣにより決定する。溶出プロフ
ィールから導かれる結果のいくつかを、表Ｖに照合させ
る。ＭＷ1、ＭＷ2、ＭＷ3、ＭＷ4およびＭＷ5は表ＩＶ
に示す意味である。
(８０％Ｎ−脱アセチル化誘導体)の製造:(最終亜硝酸塩
濃度:０.０３Ｍ) 製造ＶＩＩに記載のとおり、１００mg／ml亜硝酸ナトリ
ウム０.２７６mlの代わりに０.２０８mlを添加すること
により、製造する。このようにして産生物９９０mg(バ
ッチＨ)を得る。分子量分布を、製造ＶＩＩに記載する
とおり、立体排除ＨＰＬＣにより決定する。溶出プロフ
ィールから導かれる結果のいくつかを、表Ｖに照合させ
る。ＭＷ1、ＭＷ2、ＭＷ3、ＭＷ4およびＭＷ5は表ＩＶ
に示す意味である。
【表５】 表Ｖ 製造ＶＩＩＩで得た産生物の分子量分布(バッチＨ) ＭＷ1 ＭＷ2 ＭＷ3 ＭＷ4 ＭＷ5 １９,８５６ １２,１４６ ５３７７ ２４６０ １５３６ Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサン
【００５１】実施例１ Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサン:硫酸化の過程が２.６である
８０％Ｎ−脱アセチル化誘導体 段階a−テトラブチルアンモニウム塩の形成 製造ＶＩに準じて得られたＮ−硫酸化ヘパロサン８００
mg(出発物質として用いるＮ−アセチルヘパロサンは製
造ＩＶに準じて製造される)を水１００mlに溶解する。
この溶液を、ジビニルベンゼンで交叉架橋したポリスチ
レン(商標ダウケミカル、ドウェックス５０Ｗ８ ２０
−５０メッシュ)を基礎とし、予め酸性溶媒で条件付け
したイオン交換カラムに載せ、産生物を再び酸性の形態
にする。溶出液のpＨを水酸化テトラブチルアンモニウ
ム溶液(４０％重量／容量)で７にする。溶出液が完全に
中性になったとき(pＨ＝７)溶液の添加をやめる。溶液
を凍結乾燥する。凍結乾燥後、約１.３gの塩を得る。 段階b−Ｏ−硫酸化 上記段階で得た塩をホルムアミド８０mlに溶解し、三酸
化イオウ／ピリジン複合体(参照番号Ｓ７５５−６で商
標アルドリッヒより市販)５.６gを加える。混合物を３
０℃で６時間反応させ、次に２Ｍ ＮaＣl １６mlを加
える。５Ｎ ＮaＯＨ溶液でpＨを７にし、エタノール２
容量で沈澱させる。沈澱を０.５Ｍ ＮaＣl溶液にと
り、エタノール２容量で再沈澱させ、超純水で透析し、
ロータバポールで濃縮する。
８０％Ｎ−脱アセチル化誘導体 段階a−テトラブチルアンモニウム塩の形成 製造ＶＩに準じて得られたＮ−硫酸化ヘパロサン８００
mg(出発物質として用いるＮ−アセチルヘパロサンは製
造ＩＶに準じて製造される)を水１００mlに溶解する。
この溶液を、ジビニルベンゼンで交叉架橋したポリスチ
レン(商標ダウケミカル、ドウェックス５０Ｗ８ ２０
−５０メッシュ)を基礎とし、予め酸性溶媒で条件付け
したイオン交換カラムに載せ、産生物を再び酸性の形態
にする。溶出液のpＨを水酸化テトラブチルアンモニウ
ム溶液(４０％重量／容量)で７にする。溶出液が完全に
中性になったとき(pＨ＝７)溶液の添加をやめる。溶液
を凍結乾燥する。凍結乾燥後、約１.３gの塩を得る。 段階b−Ｏ−硫酸化 上記段階で得た塩をホルムアミド８０mlに溶解し、三酸
化イオウ／ピリジン複合体(参照番号Ｓ７５５−６で商
標アルドリッヒより市販)５.６gを加える。混合物を３
０℃で６時間反応させ、次に２Ｍ ＮaＣl １６mlを加
える。５Ｎ ＮaＯＨ溶液でpＨを７にし、エタノール２
容量で沈澱させる。沈澱を０.５Ｍ ＮaＣl溶液にと
り、エタノール２容量で再沈澱させ、超純水で透析し、
ロータバポールで濃縮する。
【００５２】段階c−ゲル濾過 段階bで得た濃縮溶液を、セファクリルＳ３００ＨＲカ
ラムを用い、溶出液に０.５Ｍ ＮaＣl溶液を用いてゲ
ル濾過して分画化する。平均分子量が１０００００−２
０００００ダルトンの鎖から成るＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロ
サンを含有する分画、および平均分子量約５００００ダ
ルトンおよび約１２０００ダルトンの鎖から成るＮ,Ｏ
−硫酸化ヘパロサンを含有する分画を集める。エタノー
ル５容量とこれら３つの分画の各々に加え、超純水での
透析に供し、透析後に得られた溶液を凍結乾燥に供す
る。Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンの３バッチは以下のよう
にして得られる: −バッチ１Ａは、平均分子量１５００００〜２００００
０ダルトンの鎖から成るＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンであ
る。このＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンは、少なくとも７０
％量が１.０×１０5〜５.０×１０5ダルトンの分子量の
鎖から成る。このＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサン０.１４０g
を単離する。 −バッチ１Ｂは、平均分子量が約５００００ダルトンの
鎖から成るＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンである。このＮ,Ｏ
−硫酸化ヘパロサンは、少なくとも７０％量が分子量
２.０×１０4〜１.０×１０5ダルトンの鎖から成る。こ
のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンの０.３５０gを単離する。 −バッチ１Ｃは、平均分子量が１２０００ダルトンの鎖
から成るＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンである。この最後の
産生物を約０.１００gを単離する。この実施例に記載し
たＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンの３つのバッチの特性は表
ＶＩに照合する。
ラムを用い、溶出液に０.５Ｍ ＮaＣl溶液を用いてゲ
ル濾過して分画化する。平均分子量が１０００００−２
０００００ダルトンの鎖から成るＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロ
サンを含有する分画、および平均分子量約５００００ダ
ルトンおよび約１２０００ダルトンの鎖から成るＮ,Ｏ
−硫酸化ヘパロサンを含有する分画を集める。エタノー
ル５容量とこれら３つの分画の各々に加え、超純水での
透析に供し、透析後に得られた溶液を凍結乾燥に供す
る。Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンの３バッチは以下のよう
にして得られる: −バッチ１Ａは、平均分子量１５００００〜２００００
０ダルトンの鎖から成るＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンであ
る。このＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンは、少なくとも７０
％量が１.０×１０5〜５.０×１０5ダルトンの分子量の
鎖から成る。このＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサン０.１４０g
を単離する。 −バッチ１Ｂは、平均分子量が約５００００ダルトンの
鎖から成るＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンである。このＮ,Ｏ
−硫酸化ヘパロサンは、少なくとも７０％量が分子量
２.０×１０4〜１.０×１０5ダルトンの鎖から成る。こ
のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンの０.３５０gを単離する。 −バッチ１Ｃは、平均分子量が１２０００ダルトンの鎖
から成るＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンである。この最後の
産生物を約０.１００gを単離する。この実施例に記載し
たＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンの３つのバッチの特性は表
ＶＩに照合する。
【表６】 表ＶＩ バッチ１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに対応するＮ,Ｏ−硫酸化 ヘパロサンの特性 ウロン酸水準 ＮＨ2水準 脱アセチル化 硫酸化の程度 (マイクロ (マイクロ の程度 (サルフェート／ モル／mg) モル／mg) カルボキシル比) バッチ１Ａ １.４８ ＜０.０１ ８０％ ２.６ バッチ１Ｂ １.４５ ＜０.０１ ８０％ ２.６ バッチ１Ｃ １.４５ ＜０.０１ ８０％ ２.６ 硫酸化の程度は、サルフェート／カルボキシル化とも称
し、二糖類構造中に含まれるカルボキシル基あたりの、
この同一構造中に含まれるサルフェート基の数の平均で
ある;これはＢ．カシューらによりカルボハイドレート
・リサーチ３９巻１６８−１７６頁(１９７５年)に報告
された、サルフェート基およびカルボキシル基の定量用
の伝導度測定法により測定する
し、二糖類構造中に含まれるカルボキシル基あたりの、
この同一構造中に含まれるサルフェート基の数の平均で
ある;これはＢ．カシューらによりカルボハイドレート
・リサーチ３９巻１６８−１７６頁(１９７５年)に報告
された、サルフェート基およびカルボキシル基の定量用
の伝導度測定法により測定する
【００５３】実施例２ Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサン:硫酸化の程度が２.１である
４０％Ｎ−脱アセチル化誘導体 段階a−テトラブチルアンモニア塩の形成 製造Ｖに準じて製造したヘパロサン(バッチＥ)を出発物
質として用い、実施例１、段階aに記載した方法に準じ
て塩を製造する。ヘパロサンの製造のために出発物質と
して用いたＮ−アセチルヘパロサンは、製造Ｉの方法に
準じて製造した。 段階b−部分的Ｎ,Ｏ−硫酸化:上記段階で得た塩４２１m
gをジメチルホルムアミド３５mlに溶解し、三酸化イオ
ウ／ピリジン複合体３.７１gを加える。混合物を室温で
６時間攪拌しながら反応させる。塩化ナトリウムを１容
量の反応混合物に、溶液の塩化ナトリウム濃度が０.３
３Ｍになるまで加え、次にエタノール２容量を加える。
沈澱を形成させる。混合物を遠心し、上清を捨てる。遠
心小塊を中性にした０.５Ｍ ＮaＣl溶液中にとる。次
にエタノール２容量を加える。沈澱を形成させ、混合物
を遠心し、遠心小塊を超純水中にとる。溶液を超純水で
透析し、凍結乾燥する。得られた凍結乾燥は、以下の特
性を有する: ＊遊離ＮＨ2水準:０.１０マイクロモル／mg ＊硫酸化の過程:二糖単位あたり１.９
４０％Ｎ−脱アセチル化誘導体 段階a−テトラブチルアンモニア塩の形成 製造Ｖに準じて製造したヘパロサン(バッチＥ)を出発物
質として用い、実施例１、段階aに記載した方法に準じ
て塩を製造する。ヘパロサンの製造のために出発物質と
して用いたＮ−アセチルヘパロサンは、製造Ｉの方法に
準じて製造した。 段階b−部分的Ｎ,Ｏ−硫酸化:上記段階で得た塩４２１m
gをジメチルホルムアミド３５mlに溶解し、三酸化イオ
ウ／ピリジン複合体３.７１gを加える。混合物を室温で
６時間攪拌しながら反応させる。塩化ナトリウムを１容
量の反応混合物に、溶液の塩化ナトリウム濃度が０.３
３Ｍになるまで加え、次にエタノール２容量を加える。
沈澱を形成させる。混合物を遠心し、上清を捨てる。遠
心小塊を中性にした０.５Ｍ ＮaＣl溶液中にとる。次
にエタノール２容量を加える。沈澱を形成させ、混合物
を遠心し、遠心小塊を超純水中にとる。溶液を超純水で
透析し、凍結乾燥する。得られた凍結乾燥は、以下の特
性を有する: ＊遊離ＮＨ2水準:０.１０マイクロモル／mg ＊硫酸化の過程:二糖単位あたり１.９
【００５４】段階c−完全なＮ−硫酸化 Ｎ,Ｏ−硫酸化産生物を重量で１パート、炭酸水素ナト
リウムを重量で１パートおよび三酸化イオウ／トリメチ
ルアミン複合体を重量で１パートを、用いるＮ,Ｏ−硫
酸化産生物グラムあたり２０mlの容量の超純水中で混合
し、混合物を５５℃で２０時間攪拌しながら反応させ
る。次に反応混合物を希釈し(希釈係数１０)、次いで得
られた溶液の伝導度を、０.５Ｍの塩化ナトリウム溶液
の伝導度に調整する。次に２容量のエタノールを加えて
沈澱させ、次いで遠心し、その後遠心小塊を０.５Ｍ
ＮaＣl溶液中にとり、次いで２容量のエタノールの添加
して２回めの沈澱を行う。超純水にとった後、超純水で
透析し、産生物凍結乾燥し、減圧下４０℃で乾燥する。
得られた凍結乾燥物(バッチ２)には以下の特性がある: ＊遊離ＮＨ2水準:０.０２マイクロモル／mg ＊硫酸化の程度:二糖単位あたり２.１ 残留ＮＨ2水準(０.０２マイクロモル／mg)は低く、部分
的Ｎ,Ｏ−硫酸化段階で得られたＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサ
ンのＮＨ2水準よりも低いことが観察される。このこと
は、Ｎ−硫酸化反応特性が完結したことを示す。バッチ
２は少なくとも７０％量が分子量が２.０×１０4ダルト
ン〜２.５×１０5ダルトンである鎖を含有する。
リウムを重量で１パートおよび三酸化イオウ／トリメチ
ルアミン複合体を重量で１パートを、用いるＮ,Ｏ−硫
酸化産生物グラムあたり２０mlの容量の超純水中で混合
し、混合物を５５℃で２０時間攪拌しながら反応させ
る。次に反応混合物を希釈し(希釈係数１０)、次いで得
られた溶液の伝導度を、０.５Ｍの塩化ナトリウム溶液
の伝導度に調整する。次に２容量のエタノールを加えて
沈澱させ、次いで遠心し、その後遠心小塊を０.５Ｍ
ＮaＣl溶液中にとり、次いで２容量のエタノールの添加
して２回めの沈澱を行う。超純水にとった後、超純水で
透析し、産生物凍結乾燥し、減圧下４０℃で乾燥する。
得られた凍結乾燥物(バッチ２)には以下の特性がある: ＊遊離ＮＨ2水準:０.０２マイクロモル／mg ＊硫酸化の程度:二糖単位あたり２.１ 残留ＮＨ2水準(０.０２マイクロモル／mg)は低く、部分
的Ｎ,Ｏ−硫酸化段階で得られたＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサ
ンのＮＨ2水準よりも低いことが観察される。このこと
は、Ｎ−硫酸化反応特性が完結したことを示す。バッチ
２は少なくとも７０％量が分子量が２.０×１０4ダルト
ン〜２.５×１０5ダルトンである鎖を含有する。
【００５５】実施例３ Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサン:硫酸化の程度が２.６である
８０％脱アセチル化誘導体 製造ＶＩ(段階aおよびbに記載した方法に準じて製造し
たＮ−硫酸化ヘパロサン３.３５gを出発物質として使用
する。この化合物は、製造ＩＩＩで記載した方法に準じ
て製造したＮ−アセチルヘパロサン４gから得られた。
出発物質として用いた７０％のＮ−硫酸化ヘパロサン
は、分子量２００００〜１５００００ダルトンの鎖から
成り、以下の特性がある: ＊ウロン酸水準:１.５マイクロモル／mg ＊遊離ＮＨ2水準:０.１０マイクロモル／mg ＊脱アセチル化の程度:８０％ 段階a−テトラブチルアンモニウム塩の形成 Ｎ−硫酸化ヘパロサンを超純水４００mlに溶解し、塩を
実施例１(段階a)に記載のとおり製造する。凍結乾燥
後、６.６６gの塩を得る。 段階b−Ｏ−硫酸化 上記段階で得た塩２９７mgをホルムアミド２０mlに溶解
し、三酸化イオウ／ピリジン複合体１gを加え、次に実
施例１(段階b)記載のとおり製造する。このようにして
Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサン２６０mgを得る。このＮ,Ｏ−
硫酸化ヘパロサン(バッチ３)の特性を表ＶＩＩに示す。
８０％脱アセチル化誘導体 製造ＶＩ(段階aおよびbに記載した方法に準じて製造し
たＮ−硫酸化ヘパロサン３.３５gを出発物質として使用
する。この化合物は、製造ＩＩＩで記載した方法に準じ
て製造したＮ−アセチルヘパロサン４gから得られた。
出発物質として用いた７０％のＮ−硫酸化ヘパロサン
は、分子量２００００〜１５００００ダルトンの鎖から
成り、以下の特性がある: ＊ウロン酸水準:１.５マイクロモル／mg ＊遊離ＮＨ2水準:０.１０マイクロモル／mg ＊脱アセチル化の程度:８０％ 段階a−テトラブチルアンモニウム塩の形成 Ｎ−硫酸化ヘパロサンを超純水４００mlに溶解し、塩を
実施例１(段階a)に記載のとおり製造する。凍結乾燥
後、６.６６gの塩を得る。 段階b−Ｏ−硫酸化 上記段階で得た塩２９７mgをホルムアミド２０mlに溶解
し、三酸化イオウ／ピリジン複合体１gを加え、次に実
施例１(段階b)記載のとおり製造する。このようにして
Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサン２６０mgを得る。このＮ,Ｏ−
硫酸化ヘパロサン(バッチ３)の特性を表ＶＩＩに示す。
【表７】 表ＶＩＩ バッチ３に相当する産生物の特性 ウロン酸水準 ＮＨ2水準 脱アセチル化 硫酸化の程度 (マイクロ (マイクロ の程度 (サルフェート／ モル／mg) モル／mg) カルボキシル比) バッチ３ １.５０ ＜０.０２ ８０％ ２.６０ バッチ３のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンを構成する鎖の分
子量分布を、製造Ｉ(第１の方法)に記載した技術に準じ
て、立体排除クロマトグラフィーにより決定する。最大
吸収に相当する分子量は、８００００−１５００００ダ
ルトンと概算される。バッチ３は少なくとも７０％量が
分子量２.５×１０4ダルトン〜２.５×１０5ダルトンの
鎖を含有し、少なくとも６０％量が分子量４.５×１０4
〜２.５×１０5ダルトンの鎖を含有する。
子量分布を、製造Ｉ(第１の方法)に記載した技術に準じ
て、立体排除クロマトグラフィーにより決定する。最大
吸収に相当する分子量は、８００００−１５００００ダ
ルトンと概算される。バッチ３は少なくとも７０％量が
分子量２.５×１０4ダルトン〜２.５×１０5ダルトンの
鎖を含有し、少なくとも６０％量が分子量４.５×１０4
〜２.５×１０5ダルトンの鎖を含有する。
【００５６】低分子量Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンの製造
のための高分子量Ｎ−硫酸化ヘパロサンおよびＮ,Ｏ−
硫酸化ヘパロサンの使用 実施例４ 高分子量Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンからの低分子量Ｎ,Ｏ
−硫酸化ヘパロサンの製造:硫酸化の程度が２.５である
８０％脱アセチル化誘導体 段階a−テトラブチルアンモニウム塩の形成 実施例１、段階aに記載するとおりに、製造ＶＩに準じ
て得たＮ−硫酸化ヘパロサン５gおよび十分量の溶媒お
よび反応物を用いて製造する。凍結乾燥後、約９.３gの
塩を得る。 段階b−Ｏ−硫酸化 前に得られたテトラブチルアンモニウム塩８.１０gを無
水ホルムアミド４５０mlに溶解する。溶液を４Å分子ふ
るいを有する２９０mlカラムを通す。次に三酸化イオウ
／ピリジン複合体２７gをそこに加え、混合物を３０℃
で６時間恒温培養する。次に２Ｍ ＮaＣl溶液の十分量
を加え、反応混合物の最終塩化ナトリウム濃度が０.５
Ｍになるようにする。次に混合物を１Ｎ ＮaＯＨで中
性にし、２容量のエタノールで沈澱させる。沈澱物を
０.５Ｍ ＮaＣl溶液でとり、２容量のエタノールで沈
澱させる。遠心後、小塊を最低容量の水でとり、１５時
間透析する。透析後に得られた溶液を次に凍結乾燥に供
する。このようにして、産生物５.８gを得る。 段階c−亜硝酸による脱重合(最終亜硝酸濃度:０.０３５
Ｍ) 段階bで得た産生物２gを２２℃で超純水１７mlに溶解す
る。溶液を１時間減圧に置き、脱ガスする。次に窒素流
下激しく攪拌し、５Ｎ ＨＣlでpＨを２.５まで下げ、
１００mg／mg亜硝酸ナトリウム０.４８４mlを加える。p
Ｈを即座に２.５に再調整し、容量を超純水で９０mlに
する(反応溶液中の最終亜硝酸濃度を０.０３５Ｍと同等
にする)。窒素流下室温で３時間攪拌する。次にpＨを５
Ｎ 水酸化ナトリウム溶液を用いて７.０にし、水素化
ホウ素ナトリウム０.４gを加える。溶液を空気にさらし
ながら１５時間攪拌する。過剰の水素化ホウ素ナトリウ
ムを３０％酢酸でpＨ３.５まで酸性にすることにより分
解する。次に反応溶液を空気にさらしながら１５分間激
しく攪拌し、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを
７に調整する。断片化したヘパロサンを４容量のエタノ
ールで沈澱し、遠心し、焼結しブュッハナーロート上で
エタノール洗浄し、減圧下６０℃で乾燥して回収する。
このようにして８.７gの産生物を得る。
のための高分子量Ｎ−硫酸化ヘパロサンおよびＮ,Ｏ−
硫酸化ヘパロサンの使用 実施例４ 高分子量Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンからの低分子量Ｎ,Ｏ
−硫酸化ヘパロサンの製造:硫酸化の程度が２.５である
８０％脱アセチル化誘導体 段階a−テトラブチルアンモニウム塩の形成 実施例１、段階aに記載するとおりに、製造ＶＩに準じ
て得たＮ−硫酸化ヘパロサン５gおよび十分量の溶媒お
よび反応物を用いて製造する。凍結乾燥後、約９.３gの
塩を得る。 段階b−Ｏ−硫酸化 前に得られたテトラブチルアンモニウム塩８.１０gを無
水ホルムアミド４５０mlに溶解する。溶液を４Å分子ふ
るいを有する２９０mlカラムを通す。次に三酸化イオウ
／ピリジン複合体２７gをそこに加え、混合物を３０℃
で６時間恒温培養する。次に２Ｍ ＮaＣl溶液の十分量
を加え、反応混合物の最終塩化ナトリウム濃度が０.５
Ｍになるようにする。次に混合物を１Ｎ ＮaＯＨで中
性にし、２容量のエタノールで沈澱させる。沈澱物を
０.５Ｍ ＮaＣl溶液でとり、２容量のエタノールで沈
澱させる。遠心後、小塊を最低容量の水でとり、１５時
間透析する。透析後に得られた溶液を次に凍結乾燥に供
する。このようにして、産生物５.８gを得る。 段階c−亜硝酸による脱重合(最終亜硝酸濃度:０.０３５
Ｍ) 段階bで得た産生物２gを２２℃で超純水１７mlに溶解す
る。溶液を１時間減圧に置き、脱ガスする。次に窒素流
下激しく攪拌し、５Ｎ ＨＣlでpＨを２.５まで下げ、
１００mg／mg亜硝酸ナトリウム０.４８４mlを加える。p
Ｈを即座に２.５に再調整し、容量を超純水で９０mlに
する(反応溶液中の最終亜硝酸濃度を０.０３５Ｍと同等
にする)。窒素流下室温で３時間攪拌する。次にpＨを５
Ｎ 水酸化ナトリウム溶液を用いて７.０にし、水素化
ホウ素ナトリウム０.４gを加える。溶液を空気にさらし
ながら１５時間攪拌する。過剰の水素化ホウ素ナトリウ
ムを３０％酢酸でpＨ３.５まで酸性にすることにより分
解する。次に反応溶液を空気にさらしながら１５分間激
しく攪拌し、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを
７に調整する。断片化したヘパロサンを４容量のエタノ
ールで沈澱し、遠心し、焼結しブュッハナーロート上で
エタノール洗浄し、減圧下６０℃で乾燥して回収する。
このようにして８.７gの産生物を得る。
【００５７】段階d−ゲル濾過 段階cで得た産生物１.６gを０.５Ｍ ＮaＣl １５mlに
溶解し、予め０.５ＭＮaＣlで平衡にした５cm×１００c
mセファクリルＳ２００ＨＲ(ファルマシア)カラムでゲ
ル濾過する(流速８ml／分)。溶出液を３０個の４０ml分
画に収集する。各分画のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサン開裂
産生物の分子量を、製造ＶＩＩに記載した方法に準じて
ＴＳＫ２０００カラムの立体排除ＨＰＬＣにより評価す
る。平均分子量が約５５００〜８０００ダルトンである
分画を組み合わせる。これらの分画に含有される産生物
は、エタノール４容量で沈澱させ、遠心し、透析し、凍
結乾燥して回収する。低分子量Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサ
ン(バッチ４)の特性を表ＶＩＩＩに示す。
溶解し、予め０.５ＭＮaＣlで平衡にした５cm×１００c
mセファクリルＳ２００ＨＲ(ファルマシア)カラムでゲ
ル濾過する(流速８ml／分)。溶出液を３０個の４０ml分
画に収集する。各分画のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサン開裂
産生物の分子量を、製造ＶＩＩに記載した方法に準じて
ＴＳＫ２０００カラムの立体排除ＨＰＬＣにより評価す
る。平均分子量が約５５００〜８０００ダルトンである
分画を組み合わせる。これらの分画に含有される産生物
は、エタノール４容量で沈澱させ、遠心し、透析し、凍
結乾燥して回収する。低分子量Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサ
ン(バッチ４)の特性を表ＶＩＩＩに示す。
【表８】 表ＶＩＩＩ バッチ４に相当する産生物の特性 ウロン酸水準 ＮＨ2水準 脱アセチル化 硫酸化の程度 (マイクロ (マイクロ の程度 (サルフェート／ モル／mg) モル／mg) カルボキシル比) バッチ４ １.４０ ＜０.０２ ８０％ ２.５０ 低分子量Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサン(バッチ４)を構成す
る鎖の分子量分布を表ＩＸに示す。これは、製造ＶＩＩ
に記載したように立体排除ＨＰＬＣにより評価した。Ｍ
Ｗ1、ＭＷ2、ＭＷ3、ＭＷ4およびＭＷ5は、表ＩＶで示
した意味である。
る鎖の分子量分布を表ＩＸに示す。これは、製造ＶＩＩ
に記載したように立体排除ＨＰＬＣにより評価した。Ｍ
Ｗ1、ＭＷ2、ＭＷ3、ＭＷ4およびＭＷ5は、表ＩＶで示
した意味である。
【表９】 表ＩＸ バッチ４に相当する産生物の分子量分布 ＭＷ1 ＭＷ2 ＭＷ3 ＭＷ4 ＭＷ5 １４,８８７ ９４４５ ６９１２ ５０６７ ２７５４
【００５８】実施例５ 高分子量Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンからの低分子量Ｎ,Ｏ
−硫酸化ヘパロサンの製造:硫酸化の程度が２.９である
８０％脱アセチル化誘導体 段階a−８０％Ｎ−脱アセチル化誘導体であるＮ−硫酸
化ヘパロサンの亜硝酸での脱重合化(最終亜硝酸塩濃度
０.０３５Ｍ) 製造ＶＩと同一のＮ−硫酸化ヘパロサン９gを２２℃で
超純水８５mlに溶解する。溶液を減圧下に１時間置いて
脱ガス化する。次にこれを窒素流下激しく攪拌し、pＨ
を５Ｎ ＨＣlを用いて２.５まで下げ、１００mg／ml亜
硝酸ナトリウム２.１７mlを加える。pＨを即座に２.５
に再調整し、容量を超純水で９０mlにする(反応混合物
中の亜硝酸ナトリウムの最終濃度は０.０３５Ｍに等し
い。)窒素流下室温で３時間、攪拌し続ける。次にpＨ
を、５Ｎ ＮaＯＨを用いて７.０にし、水素化ホウ素ナ
トリウム１.８gを加える。溶液を空気にさらしながら１
５時間攪拌する。次に過剰の水素化ホウ素を、３０％酢
酸でpＨ３.５まで酸性にすることにより、分解する。次
に反応溶液を空気にさらしながら１５分間激しく攪拌す
る。５Ｎ ＮaＯＨを添加してpＨを７.０に調整する。
断片化したＮ−硫酸ヘパロサンを４容量エタノールで沈
澱し、遠心し、焼結ビュフナーロート上でエタノール洗
浄し、減圧下６０℃で乾燥して回収する。最終的に８.
７gの産生物が得られる。得られた低分子量(バッチ５
Ａ)Ｎ−硫酸化ヘパロサン(８０％Ｎ−脱アセチル化誘導
体)を構成する鎖の分子量分布を、製造ＶＩＩに記載す
るように、立体排除ＨＰＬＣにより評価した。クロマト
グラフィーのプロフィールより導かれる結果を表Ｘに示
す。ＭＷ1、ＭＷ2、ＭＷ3、ＭＷ4およびＭＷ5は表ＩＶ
で示した意味である。
−硫酸化ヘパロサンの製造:硫酸化の程度が２.９である
８０％脱アセチル化誘導体 段階a−８０％Ｎ−脱アセチル化誘導体であるＮ−硫酸
化ヘパロサンの亜硝酸での脱重合化(最終亜硝酸塩濃度
０.０３５Ｍ) 製造ＶＩと同一のＮ−硫酸化ヘパロサン９gを２２℃で
超純水８５mlに溶解する。溶液を減圧下に１時間置いて
脱ガス化する。次にこれを窒素流下激しく攪拌し、pＨ
を５Ｎ ＨＣlを用いて２.５まで下げ、１００mg／ml亜
硝酸ナトリウム２.１７mlを加える。pＨを即座に２.５
に再調整し、容量を超純水で９０mlにする(反応混合物
中の亜硝酸ナトリウムの最終濃度は０.０３５Ｍに等し
い。)窒素流下室温で３時間、攪拌し続ける。次にpＨ
を、５Ｎ ＮaＯＨを用いて７.０にし、水素化ホウ素ナ
トリウム１.８gを加える。溶液を空気にさらしながら１
５時間攪拌する。次に過剰の水素化ホウ素を、３０％酢
酸でpＨ３.５まで酸性にすることにより、分解する。次
に反応溶液を空気にさらしながら１５分間激しく攪拌す
る。５Ｎ ＮaＯＨを添加してpＨを７.０に調整する。
断片化したＮ−硫酸ヘパロサンを４容量エタノールで沈
澱し、遠心し、焼結ビュフナーロート上でエタノール洗
浄し、減圧下６０℃で乾燥して回収する。最終的に８.
７gの産生物が得られる。得られた低分子量(バッチ５
Ａ)Ｎ−硫酸化ヘパロサン(８０％Ｎ−脱アセチル化誘導
体)を構成する鎖の分子量分布を、製造ＶＩＩに記載す
るように、立体排除ＨＰＬＣにより評価した。クロマト
グラフィーのプロフィールより導かれる結果を表Ｘに示
す。ＭＷ1、ＭＷ2、ＭＷ3、ＭＷ4およびＭＷ5は表ＩＶ
で示した意味である。
【表１０】 表Ｘ バッチ５Ａに相当する産生物の分子量分布 ＭＷ1 ＭＷ2 ＭＷ3 ＭＷ4 ＭＷ5 １４,２８２ ８９９９ ３８０５ ２１７７ １５３６ バッチ５ＡのＮ−硫酸化ヘパロサンを構成する全ての鎖
は、還元末端で式(Ｃ)(式中、Ｇは水素原子を表す)の構
造を含む。
は、還元末端で式(Ｃ)(式中、Ｇは水素原子を表す)の構
造を含む。
【００５９】段階b−ゲル濾過 上記段階で得た産生物１.６gを０.５Ｍ ＮaＣl １５ml
に溶解し、０.５ＭＮaＣlで予め平衡にした５cm×１０c
mセファクリルＳ２００ＨＲ(ファルマシア)カラムで、
流速８ml／分でゲル濾過する。溶出した液を３０×４０
ml分画に収集する。各分画のヘパロサン開裂産生物の分
子量を、製造ＶＩＩに記載した方法に準じてＴＳＫ２０
００カラムの立体排除ＨＰＬＣにより評価する。一方は
約５０００〜７０００ダルトン(バッチ５Ｂ１)および他
方は３５００〜５０００ダルトン(バッチ５Ｂ２)の平均
分子量を有する分画を組み合わせる。バッチ５Ｂ１およ
び５Ｂ２に含有される分画化Ｎ−硫酸化ヘパロサンを、
４容量のエタノールで沈澱し、遠心し、透析し、凍結乾
燥して回収する。バッチ５Ｂ１に相当するものが０.５
g、バッチ５Ｂ２に相当するものが０.４５g、最終的に
得られる。これらの２つのヘパロサンの分子量分布を立
体排除ＨＰＬＣにより、製造ＶＩＩに記載するように分
析し、結果を表ＸＩに示す。ＭＷ1、ＭＷ2、ＭＷ3、Ｍ
Ｗ4およびＭＷ5は表ＩＶの意味である。
に溶解し、０.５ＭＮaＣlで予め平衡にした５cm×１０c
mセファクリルＳ２００ＨＲ(ファルマシア)カラムで、
流速８ml／分でゲル濾過する。溶出した液を３０×４０
ml分画に収集する。各分画のヘパロサン開裂産生物の分
子量を、製造ＶＩＩに記載した方法に準じてＴＳＫ２０
００カラムの立体排除ＨＰＬＣにより評価する。一方は
約５０００〜７０００ダルトン(バッチ５Ｂ１)および他
方は３５００〜５０００ダルトン(バッチ５Ｂ２)の平均
分子量を有する分画を組み合わせる。バッチ５Ｂ１およ
び５Ｂ２に含有される分画化Ｎ−硫酸化ヘパロサンを、
４容量のエタノールで沈澱し、遠心し、透析し、凍結乾
燥して回収する。バッチ５Ｂ１に相当するものが０.５
g、バッチ５Ｂ２に相当するものが０.４５g、最終的に
得られる。これらの２つのヘパロサンの分子量分布を立
体排除ＨＰＬＣにより、製造ＶＩＩに記載するように分
析し、結果を表ＸＩに示す。ＭＷ1、ＭＷ2、ＭＷ3、Ｍ
Ｗ4およびＭＷ5は表ＩＶの意味である。
【表１１】 表ＸＩ バッチ５Ｂ１および５Ｂ２に相当する産生物の分子量分布 ＭＷ1 ＭＷ2 ＭＷ3 ＭＷ4 ＭＷ5 バッチ 5B1 ９９４３ ８０５１ ６３５７ ４６１１ ２４６０ バッチ 5B2 ７８００ ６２３６ ４０８８ ２４００ １５３６ 段階Ｃ−低分子量Ｎ−硫酸化、Ｎ−脱アセチル化ヘパロ
サン開裂産生物のＯ−硫酸化 バッチ５Ｂ１の８４０mgを、予め酸性にし、水酸化テト
ラブチルアンモニウムで中性にしたドウェックス樹脂を
通して、テトラブチルアンモニウム塩に転換する。テト
ラブチルアンモニウム塩を回収し、凍結乾燥する。
サン開裂産生物のＯ−硫酸化 バッチ５Ｂ１の８４０mgを、予め酸性にし、水酸化テト
ラブチルアンモニウムで中性にしたドウェックス樹脂を
通して、テトラブチルアンモニウム塩に転換する。テト
ラブチルアンモニウム塩を回収し、凍結乾燥する。
【００６０】方法Ｉ:三酸化イオウ／ピリジン複合体に
よる硫酸化 上記で得たテトラブチルアンモニウム塩の形態のＮ−硫
酸化、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサン４２０mgを無水ホル
ムアミド４２mlに溶解する(示した分子量は塩の形態に
していないＮ−硫酸化、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンに
相当する)。溶液は４Å分子ふるいを有する１５mlカラ
ムを通す。次に三酸化イオウ／ピリジン複合体をそこへ
加え、混合物を３０℃で６時間恒温培養する。２Ｍ Ｎ
aＣl溶液９mlを加え、次いで１Ｎ ＮaＯＨで中性にす
る。Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンをエタノール２容量で沈
澱させ、遠心し、０.５ＭＮaＣl １０mlに再溶解し、
再び、２容量のエタノールで沈澱させる。遠心後、小塊
を最低容量の水にとり、１５時間透析する。最後に、産
生物を凍結乾燥する。Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサン４７１m
gを得る(バッチ５Ｃ１a)。この産生物の特性は、実施例
４で記載したＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサン(バッチ４)の特
性と同等である。
よる硫酸化 上記で得たテトラブチルアンモニウム塩の形態のＮ−硫
酸化、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサン４２０mgを無水ホル
ムアミド４２mlに溶解する(示した分子量は塩の形態に
していないＮ−硫酸化、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンに
相当する)。溶液は４Å分子ふるいを有する１５mlカラ
ムを通す。次に三酸化イオウ／ピリジン複合体をそこへ
加え、混合物を３０℃で６時間恒温培養する。２Ｍ Ｎ
aＣl溶液９mlを加え、次いで１Ｎ ＮaＯＨで中性にす
る。Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンをエタノール２容量で沈
澱させ、遠心し、０.５ＭＮaＣl １０mlに再溶解し、
再び、２容量のエタノールで沈澱させる。遠心後、小塊
を最低容量の水にとり、１５時間透析する。最後に、産
生物を凍結乾燥する。Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサン４７１m
gを得る(バッチ５Ｃ１a)。この産生物の特性は、実施例
４で記載したＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサン(バッチ４)の特
性と同等である。
【００６１】方法ＩＩ:クロロスルホン酸による硫酸化 テトラブチルアンモニウム塩の形態のＮ−硫酸化、Ｎ−
脱アセチル化ヘパロサンの残りの４２０mgを無水ホルム
アミド８mlに溶解する(示した分子量は、塩の形態にし
ていないＮ−硫酸化、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンに相
当する)。溶液を４Å分子ふるいを有する１５mlカラム
に通し、塩化カルシウム乾燥管の付いた三首丸底フラス
コ中で回収する。次に無水ピリジン３４６μlを加え
る。次にクロロスルホン酸２５６mlのジクロロメタン１
ml溶液を、混合物を激しく攪拌しながら、および反応混
合物の温度が３５℃を越えないように注意しながら、非
常にゆっくりと通す(添加時間:１５分)。次に溶液を室
温で２時間攪拌する。０.５ＭＮaＣlを加え、溶液を１
Ｎ 水酸化ナトリウム溶液で中性にする。Ｎ,Ｏ−硫酸
化ヘパロサンを２容量エタノールで沈澱させ、遠心し、
０.５ＭＮaＣl １０mlに再溶解する。続いて、再びエタ
ノールを２容量で沈澱させ、遠心する。小塊を最低容量
の水にとり、１５時間十分に透析する。凍結乾燥後、４
３０mgの産生物を得、これをバッチ５Ｃ１bと称する。
この低分子量Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンの特性を表ＸＩ
Ｉに示す。
脱アセチル化ヘパロサンの残りの４２０mgを無水ホルム
アミド８mlに溶解する(示した分子量は、塩の形態にし
ていないＮ−硫酸化、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンに相
当する)。溶液を４Å分子ふるいを有する１５mlカラム
に通し、塩化カルシウム乾燥管の付いた三首丸底フラス
コ中で回収する。次に無水ピリジン３４６μlを加え
る。次にクロロスルホン酸２５６mlのジクロロメタン１
ml溶液を、混合物を激しく攪拌しながら、および反応混
合物の温度が３５℃を越えないように注意しながら、非
常にゆっくりと通す(添加時間:１５分)。次に溶液を室
温で２時間攪拌する。０.５ＭＮaＣlを加え、溶液を１
Ｎ 水酸化ナトリウム溶液で中性にする。Ｎ,Ｏ−硫酸
化ヘパロサンを２容量エタノールで沈澱させ、遠心し、
０.５ＭＮaＣl １０mlに再溶解する。続いて、再びエタ
ノールを２容量で沈澱させ、遠心する。小塊を最低容量
の水にとり、１５時間十分に透析する。凍結乾燥後、４
３０mgの産生物を得、これをバッチ５Ｃ１bと称する。
この低分子量Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンの特性を表ＸＩ
Ｉに示す。
【表１２】 表ＸＩＩ バッチ５Ｃ１bに相当する産生物の特性 ウロン酸水準 ＮＨ2水準 脱アセチル化 硫酸化の程度 (マイクロ (マイクロ の程度 (サルフェート／ モル／mg) モル／mg) カルボキシル比) バッチ 5C1b １.５０ ＜０.０２ ８０％ ２.９０ バッチＡ５Ｃ１６のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロサンを構成す
る鎖の分子量分布を、製造ＶＩＩに記載した方法に準じ
て立体排除ＨＰＬＣにより評価した。これを表ＸＩＩＩ
に示す。ＭＷ1、ＭＷ2、ＭＷ3、ＭＷ4およびＭＷ5は表
ＩＶに示した意味である。
る鎖の分子量分布を、製造ＶＩＩに記載した方法に準じ
て立体排除ＨＰＬＣにより評価した。これを表ＸＩＩＩ
に示す。ＭＷ1、ＭＷ2、ＭＷ3、ＭＷ4およびＭＷ5は表
ＩＶに示した意味である。
【表１３】 表ＸＩＩＩ バッチ５Ｃ１bに相当する産生物の分子量分布 ＭＷ1 ＭＷ2 ＭＷ3 ＭＷ4 ＭＷ5 １１,８８１ ９１１６ ７２５３ ５５１３ ３０５６ この産生物は、７０％が８７９２〜５９００ダルトンの
分子量の鎖から成る。
分子量の鎖から成る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 マルク・ルイ・ヴィクトール・サロム フランス31320カスタネ−トローザン、レ ジダーンス・“レゾルム−スゴン”・エフ １番
Claims (22)
- 【請求項１】 式（Ｉ）： 【化１】 ［式中、Ｅは、このＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの二糖単
位の０〜８０％ではアセチル基、残りの二糖単位ではサ
ルフェート基、所望により水素原子、Ｇは水素原子およ
びサルフェート基を表わす］で示される繰返し二糖構造
を特徴とする、１.５×１０4〜４.０×１０6Ｄの分子量
を有する連鎖、または連鎖の混合物からなるＮ，Ｏ−硫
酸化ヘパロサン類、およびそれらのＮ，Ｏ−硫酸化ヘパ
ロサンの製薬上許容し得る塩類。 - 【請求項２】 Ｅがアセチル基およびサルフェート基を
表わす請求項１記載のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類。 - 【請求項３】 サルフェート／カルボキシル比として表
わされる硫酸化度が１.５〜３.０である請求項１および
２の何れか１項記載のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類。 - 【請求項４】 式（Ｉ）： 【化２】 ［式中、Ｅは、このＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの二糖単
位の０〜８０％ではアセチル基、残りの二糖単位ではサ
ルフェート基、所望により水素原子、Ｇは水素原子およ
びサルフェート基を表わす］で示される繰返し二糖構造
であって、サルフェート／カルボキシル比で表わされる
硫酸化度が１.５〜３.０、Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの
連鎖の２つの還元および非還元末端が、硫酸化または非
硫酸化ウロン酸単位、硫酸化または非硫酸化グルコサミ
ン、または硫酸化または非硫酸化Ｎ−アセチルグルコサ
ミンであることを特徴とする、１.５×１０4〜４.０×
１０6Ｄの分子量を有する連鎖、または連鎖の混合物か
らなる請求項１に記載のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類、
およびそれらのＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの製薬上許容
し得る塩類。 - 【請求項５】 二糖単位のアセチル基が６０％に等しい
か、またはそれ以下の水準で存在する、請求項１〜４の
何れか１項記載のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン類。 - 【請求項６】 含有する遊離アミノ基（ＮＨ2）が０.２
μM／mgを超えない、請求項１記載のＮ，Ｏ−硫酸化ヘ
パロサン類。 - 【請求項７】 １.０×１０5〜５.０×１０5Ｄの分子量
を有する連鎖を少なくとも７０質量％を含有する、請求
項１〜３の何れか１項記載のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン
類。 - 【請求項８】 ２.５×１０4〜２.５×１０5Ｄの分子量
を有する連鎖を少なくとも７０質量％を含有する、請求
項１〜３の何れか１項記載のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン
類。 - 【請求項９】 ２.０×１０4〜１.０×１０5Ｄの分子量
を有する連鎖を少なくとも７０質量％を含有する、請求
項１〜３の何れか１項記載のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン
類。 - 【請求項１０】 請求項１〜９の何れか１項記載のＮ，
Ｏ−硫酸化ヘパロサンを少なくとも７０質量％を含有す
る、Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン組成物。 - 【請求項１１】 （段階ａ）エシェリキア・コリ(Esche
richia coli)（Ｋ５）株を培養し、 （段階ｂ）式（II）： 【化３】 で示される繰返し二糖構造を特徴とし、１.０×１０4〜
２.０×１０6Ｄの分子量を有する連鎖の混合物からなる
高分子量Ｎ−アセチルヘパロサン７０〜１００％を含有
する組成物を得るため、生成したＮ−アセチルヘパロサ
ンを、所望によ予備精製し、単離し、精製し、 （段階ｃ）式（III）： 【化４】 ［式中、Ｒ'は二糖単位の０〜８０％ではアセチル基、
残りの二糖単位では水素原子を表わす］で示される繰返
し二糖構造を特徴とする、１.０×１０4Ｄ〜２.０×１
０6Ｄの分子量を有する連鎖の混合物からなる高分子量
Ｎ−アセチルヘパロサン７０〜１００％を含有する組成
物を得るため、このＮ−アセチルヘパロサンを部分的に
脱アセチル化し、 （段階ｄ）式（IV）： 【化５】 ［式中、Ｅは、二糖単位の０〜８０％ではアセチル基、
残りの二糖単位ではサルフェート基、所望により水素原
子を表わす］で示される繰返し二糖構造を特徴とする、
１.０×１０4〜２.０×１０6Ｄの分子量を有する連鎖の
混合物からなるＮ−硫酸化ヘパロサン７０〜１００％を
含有する組成物を得るため、完全または部分的にＮ−硫
酸化し、ついでこの部分的または完全なＮ−硫酸化段階
に続いて、部分的または完全にＯ−硫酸化するか、また
はこのヘパロサン組成物の部分的にＮ，Ｏ−硫酸化、ま
たはこのヘパロサン組成物の部分的なＮ，Ｏ−硫酸化に
続いて、完全にＮ−硫酸化する何れかの段階を実施し、
所望によりａ、ｂ、ｃ、およびｄ段階の終わりに分子量
を分別する１またはそれ以上の段階を含むことを一連の
段階を含む請求項１に記載のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン
７０〜１００％を含有する組成物の製造方法。 - 【請求項１２】 エシェリキア・コリ（Ｋ５）株がＳＥ
ＢＲ３２８２株（ＣＮＣＭ（ザ・パスツール・インスチ
チュート(The Pasteur Institute)、パリ、フランス）
でＮｏ.Ｉ−１０１３の番号のもとに寄託されてい
る）、またはこの株の自然変異株または誘導変異株であ
る、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 エシェリキア・コリ（Ｋ５）株の培養
をグリセリンに富んだ培地で実施する、請求項１１記載
の方法。 - 【請求項１４】 Ｎ−アセチルヘパロサンの分離および
精製が少なくともアルコール沈殿の１段階および少なく
ともイオン交換クロマトグラフィーの１段階を含む、請
求項１１記載の方法。 - 【請求項１５】 Ｎ−アセチルヘパロサンの単離および
精製を （段階ａ1）エタノール沈殿、 （段階ｂ1）透析、 （段階ｃ1）エタノール沈殿、ついで脱水、乾燥 （段階ｄ1）アニオン交換クロマトグラフィーによる精
製、 （段階ｅ1）段階ｄ1で得られた溶出液のエタノール沈
殿、脱水、乾燥、および粉砕する一連の段階を含み、こ
こで段階ａ1またはｃ1の１つを省くことができる操作を
用いて実施する、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１６】 Ｎ−アセチルヘパロサンの単離および
精製を （段階ａ'1）透析、 （段階ｂ'1）酸性媒質で精製、ｐＨ３.５およびｐＨ１.
８の水溶液で不溶性である不純物の除去、 （段階ｃ'1）エタノール沈殿、ついで脱水、乾燥、 （段階ｄ'1）アルカリ性加水分解および透析、 （段階ｅ'1）アニオン交換クロマトグラフィーによる精
製、 （段階ｆ'1）排除クロマトグラフィーによる精製する一
連の段階を含む操作を用いて実施する、請求項１１記載
の方法。 - 【請求項１７】 単離および精製の前に、エシェリキア
・コリ（Ｋ５）株の培養から得られたＮ−アセチルヘパ
ロサンを （段階ａ"1）培養の終わりに得られた懸濁液を遠心し、 （段階ｂ"1）上清をアルカリ性溶液と接触させ、 （段階ｃ"1）予備濾過し、 （段階ｄ"1）あらかじめ測定した限界カットオフ値を有
する膜で濃縮し、所望により （段階ｅ"1）透析する一連の段階を含む操作を用いて実
施する予備精製に掛ける、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１８】 不活性な製薬上許容し得る賦形剤と組
合せ、またはこれとの混合物として、請求項１〜９の何
れか１項記載のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンを有効主成分
として含有する医薬組成物。 - 【請求項１９】 不活性な製薬上許容し得る賦形剤と組
合せ、またはこれとの混合物として、請求項１０に記載
のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンを有効主成分として含有す
る医薬組成物。 - 【請求項２０】 血液凝固の抑制に使用できる請求項１
８および１９の何れか１項記載の医薬組成物。 - 【請求項２１】 切断後、１.５×１０4Ｄ以下、および
１.５×１０3〜１.５×１０4Ｄである低分子量を有する
Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンを製造する請求項１に記載の
式（Ｉ）の高分子量Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンの用途。 - 【請求項２２】 切断後、１.５×１０4Ｄ以下、および
１.５×１０3〜１.５×１０4Ｄである低分子量を有する
Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロサンを製造する請求項１１に記載
の式（IV）の化合物、Ｎ−硫酸化ヘパロサンの用途。
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|---|---|---|---|
| FR9114725A FR2684385B1 (fr) | 1991-11-28 | 1991-11-28 | Heparosanes-n,o-sulfates de haute masse moleculaire, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent. |
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