CN114787195B - 一种肝素酶iii的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种肝素酶III的制备方法，包括以下步骤：将肝素黄杆菌破碎离心后所得上清液进行硫酸铵沉淀，沉淀物溶解后透析；上样SP柱，以20‑30mM Tris‑HCl缓冲液平衡，相同缓冲液中0‑0.5M NaCl线性洗脱，收集肝素酶活性组分，透析；上样SP柱，以含0.05‑0.2M NaCl的50mMTris‑HCl缓冲液洗脱，收集肝素酶活性组分，透析；上样SP柱，含0.3％肝素的50mM Tris‑HCl缓冲液等度洗脱，收集肝素酶活性组分，透析；上样SP柱，以含0.055M NaCl的50mM Tris‑HCl溶液等度洗脱，收集肝素酶活性组分，浓缩得到肝素酶III。
Description
技术领域
本申请属于生物材料技术领域，涉及一种肝素酶III的制备方法。
背景技术
肝素酶最初是从肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)中被发现和分离的，肝素黄杆菌是一类来自土壤的革兰阴性菌，目前已经从中分离纯化得到3种肝素酶：肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III。三种肝素酶的主要区别在于相对分子质量、电荷性质及底物特异性。
肝素酶I相对分子量为43800，等电点9.3，能够特异性切割肝素类分子6SGlcNS(1→4)2SIdoA之间的连接键。肝素酶II相对分子量为84500，等电点约为8.9，底物特异性在三个肝素酶中最宽，对肝素类和硫酸乙酰肝素类连接位点均有切割作用。肝素酶III相对分子量为73000，等电点约为10，能够特异性切割硫酸乙酰肝素类分子中GlcNS/GlcNAc(1→4)GlcA之间连接键。
肝素酶在制备低分子肝素、消除体外循环中的肝素抗凝剂、确定肝素精确结构等方面有着重要的用途。但是肝素酶稳定性差、不易提纯，因而价格昂贵，限制了其在医药工业领域的广泛应用。
肝素酶的纯化工作有许多研究报道，Yang等(Purification andcharacterization of heparinase from Flavobacterium heparinum，J Biol Chem，1985，260(3)：1849-1857)用羟基磷灰石吸附/洗脱处理、QAE-Sepharose柱层析、HA-HPLC、Mono-S FPLC、GPC-HPLC等五步纯化，最终获得纯的肝素酶III，比活性达到63.5IU/mg，活性收率为2.74％。
目前，肝素黄杆菌发酵法仍然是肝素酶I、II、III生产研究的主要方法，肝素酶的制备已有许多研究报道。马小来等人(CN102286448B)利用组合柱层析，从肝素黄杆菌细胞破碎液中同时提取肝素酶I、II和III，最终所得肝素酶I收率为35％，比活为416.67IU/mg，肝素酶II收率为22％，比活为15.33IU/mg，肝素酶III收率为4％，比活为235IU/mg，但是其肝素酶III的活性收率过低。
因此，在本领域中，期望能够开发一种能够显著提高肝素酶III活性收率的制备方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本申请的目的在于提供一种肝素酶III的制备方法，本申请所述方法使得肝素酶III的活性收率相对于现有技术有明显的提高。
为达到此申请目的，本申请采用以下技术方案：
本申请提供一种肝素酶III的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将肝素黄杆菌破碎、离心，上清液中加入硫酸铵进行沉淀，用缓冲液将沉淀物溶解后进行透析；
(2)将透析后的酶液上样SP柱，以20-30mM Tris-HCl缓冲液平衡，相同缓冲液中0-0.5M NaCl溶液线性洗脱，收集第二个具有肝素酶活性的组分，然后进行透析；
(3)将第(2)步透析后的酶液上样SP柱，以含0.05-0.2M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集第一个具有肝素酶活性的组分，然后进行透析；
(4)将第(3)步透析后的酶液上样SP柱，以50mM Tris-HCl缓冲液进行等度洗脱，该缓冲液中含有质量浓度为0.3％的肝素、10mM CaCl2以及25mM NaCl，其pH值为7.0，收集具有肝素酶活性的组分，然后进行透析；和
(5)将第(4)步透析后的酶液上样SP柱，以含0.055M NaCl的50mM Tris-HCl溶液等度洗脱，收集具有肝素酶活性的组分，然后浓缩得到肝素酶III。
在本申请中，使用所述制备方法能够提高肝素酶III的活性收率；目前现有技术中肝素酶III最高活性收率为4％，本申请肝素酶III活性收率达到15.1％，是现有技术的近四倍。
优选地，步骤(1)所述破碎在4-8℃(例如4℃、5℃、6℃、7℃或8℃)下进行。
优选地，步骤(1)所述离心的转速为10000-20000rpm，例如10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm、15000rpm、16000rpm、17000rpm、18000rpm、19000rpm或20000rpm。
优选地，步骤(1)所述加入硫酸铵进行沉淀的具体方法为：向上清液中加入硫酸铵，使得硫酸铵终浓度为50％饱和度，搅拌30-45min(例如30min、33min、35min、38min、40min、43min或45min)，而后4-8℃(例如4℃、5℃、6℃、7℃或8℃)下于10000-20000rpm(例如10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm、15000rpm、16000rpm、17000rpm、18000rpm、19000rpm或20000rpm)转速离心20-40min(例如20min、25min、28min、30min、35min、38min或40min)，取上清液，向上清液中加入硫酸铵，使得硫酸铵终浓度为80％饱和度，继续搅拌30-45min(例如30min、33min、35min、38min、40min、43min或45min)，4-8℃(例如4℃、5℃、6℃、7℃或8℃)下于10000-20000rpm(例如10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm、15000rpm、16000rpm、17000rpm、18000rpm、19000rpm或20000rpm)转速离心20-40min(例如20min、25min、28min、30min、35min、38min或40min)，收集沉淀物。
优选地，步骤(1)所述缓冲液为20-30mM(20mM、22mM、25mM、28mM或30mM)Tris-HCl缓冲液，其含有5-10mM(例如5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM)CaCl2，pH值为7.0。
优选地，步骤(1)所述透析在截留分子量为10kDa的透析袋中进行。
优选地，步骤(1)所述透析的温度为4-8℃，例如4℃、5℃、6℃、7℃或8℃。
优选地，步骤(1)所述透析利用的透析溶剂与步骤(1)中溶解沉淀物所用的缓冲液相同。
优选地，步骤(2)所述Tris-HCl缓冲液中还含有5-10mM(例如5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM)CaCl2，pH值为7.0。
优选地，步骤(2)所述透析在截留分子量为10kDa的透析袋中进行。
优选地，步骤(2)所述透析利用的透析溶剂为50mM Tris-HCl缓冲液，其中还含有10mM CaCl2，其pH值为7.0。
优选地，步骤(2)所述透析的温度为4-8℃，例如4℃、5℃、6℃、7℃或8℃。
优选地，步骤(3)所述含0.05-0.2M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液中还含有10mMCaCl2，其pH值为7.0。
优选地，步骤(3)所述透析在截留分子量为10kDa的透析袋中进行。
优选地，步骤(3)所述透析利用的透析溶剂为50mM Tris-HCl缓冲液，其中还含有10mM CaCl2，其pH值为7.0。
优选地，步骤(3)所述透析的温度为4-8℃，例如4℃、5℃、6℃、7℃或8℃。
优选地，步骤(4)所述透析在截留分子量为10kDa的透析袋中进行。
优选地，步骤(4)所述透析利用的透析溶剂为50mM Tris-HCl缓冲液，其中还含有10mM CaCl2，其pH值为7.0。
优选地，步骤(4)所述透析的温度为4-8℃，例如4℃、5℃、6℃、7℃或8℃。
优选地，步骤(5)所述含0.055M NaCl的50mM Tris-HCl溶液中还含有10mM CaCl2，其pH值为7.0。
优选地，所述浓缩利用30kDa的超滤离心管进行。
相对于现有技术，本申请具有如下有益效果：
在本申请中，使用所述制备方法能够提高肝素酶III的活性收率；以纯化酶酶活计算，目前现有技术中肝素酶III最高活性收率为4％，本申请肝素酶III活性收率达到15.1％，是现有技术的近四倍。
附图说明
图1为实施例1中肝素黄杆菌破碎离心后得到的粗酶以及制备得到的肝素酶III的SDS-PAGE电泳图，其中1为肝素黄杆菌破碎离心后得到的粗酶；2为经过纯化后的肝素酶III；3为Marker。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本申请的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本申请，不应视为对本申请的具体限制。
实施例1
在本实施例中所使用的肝素黄杆菌可以通过现有技术的培养方法进行培养，例如可以利用如下方法培养得到：
种子培养基：称取牛肉膏5g，蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，溶解在1L纯化水中，用6M NaOH调pH值至7.0，分装于500mL三角瓶中，121℃下灭菌20分钟，冷却备用。
发酵培养基：取肝素80g，KH2PO4 25g，Na2HPO4·12H2O 25g，MgSO4·7H2O 5g，蛋白胨100g溶解于10L纯水中，用6M NaOH调pH至7.0，分装于5L三角瓶中，121℃下灭菌20分钟，冷却备用。
种子培养：在洁净环境中，将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到种子培养基(50mL)中，23℃，150rpm，培养1天。然后取菌液(25mL)转接入种子培养基(375mL)中，23℃，150rpm，培养1天。
发酵培养：将种子培养液(375mL)按照7.5％的体积比接种于发酵培养基(5L)中，23℃，150rpm，震荡培养24-36小时。
收集细菌：将发酵培养得到的发酵液在3800rpm，4℃下离心60分钟，收集沉淀，称重，包装储存在洁净离心管中，至于-20℃下冷冻保存。
经过如上所述培养过程得到肝素黄杆菌，而后进行肝素酶III的制备，具体地包括以下步骤：
(1)粗酶制备
向肝素黄杆菌中加入25mM的Tris-HCl(10mM CaCl2，pH 7.0)缓冲液500mL，搅拌，然后用高压均质机在压力800bar，4℃条件下进行粉碎。将细胞破碎液在4℃下，18000rpm，离心30分钟，得到上清液即为粗酶液。
(2)硫酸铵沉淀
将步骤(1)得到的粗酶液置于冰浴中，加入干燥硫酸铵固体粉末，硫酸铵终浓度为50％饱和度，继续搅拌30-45分钟，然后18000rpm，4℃离心30分钟；取上清液并向其中缓慢加入干燥的硫酸铵粉末，硫酸铵终浓度为80％饱和度，继续搅拌30-45分钟，然后18000rpm，4℃离心30分钟，弃去上清液，将沉淀以25mM Tris-HCl(含10mM CaCl2，pH 7.0)缓冲液150mL溶解，装入透析袋(MWCO：10kDa)中，然后将透析袋置于50倍体积的25mM Tris-HCl(含10mM CaCl2，pH 7.0)缓冲液中，于4-8℃温度下透析过夜。
(3)肝素酶III的第一次粗分离
将步骤(2)透析所得酶液上样SP柱，以25mM Tris-HCl(含10mM CaCl2，pH 7.0)缓冲液平衡，然后相同缓冲液中0-0.5M NaCl进行线性洗脱。用部分收集器收集，检测每管洗脱液的肝素降解能力和HS降解能力并检测每管样品在280nm处的吸收值。收集第二个活性峰对应的洗脱液，将收集的洗脱液装入透析袋(MWCO：10kDa)，置于2L 50mM Tris-HCl(含10mM CaCl2，pH 7.0)缓冲液中，于4-8℃温度下透析过夜。
(4)肝素酶III的第二次粗分离
将步骤(3)中透析所得酶液上样SP柱，以50mM Tris-HCl(含10mM CaCl2，0.05MNaCl，pH 7.0)缓冲液平衡后，以含0.05-0.2M NaCl的50mM Tris-HCl(含10mM CaCl2，pH7.0)溶液进行线性洗脱。用部分收集器收集，检测每管洗脱液的肝素降解能力和HS降解能力以及每管样品在280nm处的吸收值，收集第一个活性峰对应的洗脱液，将所得洗脱液装入透析袋(MWCO：10kDa)中，置于2L 50mM Tris-HCl(含10mM CaCl2，pH 7.0)缓冲液中，于4-8℃温度下充分透析过夜。
(5)肝素酶III的第一次精纯化
将步骤(4)中透析所得酶液上样SP柱，以50mM Tris-HCl(含10mM CaCl2，pH 7.0，25mMNaCl，0.3％肝素)缓冲液等度洗脱，用部分收集器收集，检测每管洗脱液的HS降解能力和280nm处的吸收值，收集活性峰对应的洗脱液。将洗脱液装入透析袋(MWCO：10kDa)，在2L50mM Tris-HCl(含10mM CaCl2，pH 7.0)缓冲液中，于4-8℃温度下充分透析过夜。
(6)肝素酶III的第二次精纯化
将步骤(5)透析所得酶液上样SP柱，以含0.055M NaCl的50mM Tris-HCl(含10mMCaCl2，pH 7.0)溶液等度洗脱，部分收集器收集，检测每管HS降解能力，收集活性峰对应的洗脱液，用30kDa超滤离心管浓缩后即为纯化的肝素酶III。
对肝素黄杆菌破碎离心后得到的粗酶以及制备得到的肝素酶III进行SDS-PAGE电泳分析，得到如图1所示结果，其中1为肝素黄杆菌破碎离心后得到的粗酶；2为经过纯化后的肝素酶III；3为Marker，从图1中可以看出，经本申请制备方法得到的肝素酶III纯度高。
实施例2
参照实施例1，将实施例1步骤(5)中肝素等度洗脱改为线性洗脱，具体条件为：使用含NaCl和肝素的50mM Tris-HCl(含10mM CaCl2，pH 7.0)缓冲液按5～75mM NaCl，0.1％～0.5％肝素进行线性洗脱，用部分收集器收集，检测每管洗脱液的HS降解能力和280nm处的吸收值，收集活性峰对应的洗脱液。
最终得到纯化的肝素酶III。
实施例3
在本实施例中对以上实施例中制备得到的肝素酶III进行酶活性测试，测试中利用到的材料肝素底物和HS底物通过如下方法配制：
肝素底物：称取100mg肝素，用25mM Tris-HCl(含10mM CaCl2，pH 7.0)缓冲液溶解后定容至100mL，配制成1mg/mL的肝素底物溶液。
HS底物：称取25mg HS，用25mM Tris-HCl(含10mM CaCl2，pH 7.0)缓冲液溶解后定容至25mL，配制成1mg/mL的HS底物溶液。
酶活性测试方法如下：
在5mL石英比色皿中加入在37℃预热过的2.5mL HS底物溶液，移取20μL粗酶液或肝素酶III酶液，摇匀后在232nm处测定吸光值，测两分钟内吸光变化值，并计算每分钟内的平均变化值，以HS双键的摩尔消光系数ε＝3800计算其形成量，换算为酶液中酶的国际单位，换算系数为32.9，即ΔOD232nm/分钟×32.9的值即为单位酶活性(IU/mL)。
通过测试得到的肝素酶III的活性收率如下表1所示。
表1：
由表1的结果可以看出，本申请所述制备方法得到的肝素酶III活性收率达到15.1％，而如果将步骤(5)中等度洗脱改为线性洗脱，则肝素酶III活性收率会显著下降。
本申请通过上述实施例来说明本申请的工艺方法，但本申请并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本申请必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本申请的任何改进，对本申请所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本申请的保护范围和公开范围之内。
Claims (7)
1.一种肝素酶III的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将肝素黄杆菌破碎、离心，上清液中加入硫酸铵进行沉淀，用缓冲液将沉淀物溶解后进行透析；
(2)将透析后的酶液上样SP柱，以20-30mM Tris-HCl缓冲液平衡，相同缓冲液中0-0.5MNaCl溶液线性洗脱，收集第二个具有肝素酶活性的组分，然后进行透析；
(3)将第(2)步透析后的酶液上样SP柱，以含0.05-0.2M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集第一个具有肝素酶活性的组分，然后进行透析；
(4)将第(3)步透析后的酶液上样SP柱，以50mM Tris-HCl缓冲液进行等度洗脱，该缓冲液中含有质量浓度为0.3％的肝素、10mM CaCl2以及25mM NaCl，其pH值为7.0，收集具有肝素酶活性的组分，然后进行透析；和
(5)将第(4)步透析后的酶液上样SP柱，以含0.055M NaCl的50mM Tris-HCl溶液等度洗脱，收集具有肝素酶活性的组分，然后浓缩得到肝素酶III；
步骤(1)所述加入硫酸铵进行沉淀的具体方法为：向上清液中加入硫酸铵，使得硫酸铵终浓度为50％饱和度，搅拌30-45min，而后4-8℃下于10000-20000rpm转速离心20-40min，取上清液，向上清液中加入硫酸铵，使得硫酸铵终浓度为80％饱和度，继续搅拌30-45min，4-8℃下于10000-20000rpm转速离心20-40min，收集沉淀物；
步骤(1)所述缓冲液为20-30mM Tris-HCl缓冲液，其含有5-10mM CaCl2，pH值为7.0；
步骤(1)所述透析在截留分子量为10kDa的透析袋中进行；
步骤(1)所述透析利用的透析溶剂与步骤(1)中溶解沉淀物所用的缓冲液相同；
步骤(2)所述Tris-HCl缓冲液中含有5-10mM CaCl2，pH值为7.0；
步骤(2)所述透析在截留分子量为10kDa的透析袋中进行；
步骤(2)所述透析利用的透析溶剂为50mM Tris-HCl缓冲液，其中还含有10mM CaCl2，其pH值为7.0；
步骤(3)所述含0.05-0.2M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液中还含有10mM CaCl2，其pH值为7.0；
步骤(3)所述透析在截留分子量为10kDa的透析袋中进行；
步骤(3)所述透析利用的透析溶剂为50mM Tris-HCl缓冲液，其中还含有10mM CaCl2，其pH值为7.0；
步骤(4)所述透析在截留分子量为10kDa的透析袋中进行；
步骤(4)所述透析利用的透析溶剂为50mM Tris-HCl缓冲液，其中还含有10mM CaCl2，其pH值为7.0；
步骤(5)所述含0.055M NaCl的50mM Tris-HCl溶液中还含有10mM CaCl2，其pH值为7.0。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(1)所述破碎在4-8℃，离心的转速为10000-20000rpm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(1)所述透析的温度为4-8℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(2)所述透析的温度为4-8℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(3)所述透析的温度为4-8℃。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(4)所述透析的温度为4-8℃。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(5)所述浓缩利用30kDa的超滤离心管进行。
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