JPH051101A - Ｎ，ｏ−硫酸化ヘパロザン、製法および医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 新規Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類、その組成
物および有効成分としてこれ含む医薬組成物を提供す
る。 【構成】 式(Ｉ)で示される反復ジサッカリド構造を特
徴とする、分子質量１５００ないし１５０００Ｄａの鎖
または鎖の混合物から成るＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類
およびその医薬的に許容し得る塩類、製法および医薬組
成物。 [式中、Ｅは、Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンのジサッカリド
単位の０〜８０％においてアセチル基、および残りのジ
サッカリド単位において硫酸基および可能ならば水素原
子を表し、Ｇは水素原子および硫酸基を表す] 【効果】 (Ｉ)式で示される新規なＮ,Ｏ−硫酸化ヘパ
ロザン類は強い 抗凝固活性を有し、特にアテローム性
動脈硬化症の治療的処置に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘ
パロザン類、これらの新規Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンを
含有するＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン組成物および有効成
分として新規Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンを含む医薬組成
物に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】グリコサミノグリカン類は、動物組織の
抽出により得られる生成物であることが知られている。
これらのグリコサミノグリカン類の中には、非常に有利
な抗凝固および抗血栓特性を有するものもある。この種
類に属する典型的な生成物は、ヘパリン、そのフラグメ
ントおよびそれらの誘導体並びにヘパリン硫酸塩および
デルマタン硫酸塩であるが、その供給源故にそれらは非
常に高価であるという不利な点を有する。特に、デルマ
タン硫酸塩は、ウロン酸基(イデュロニルまたはグルク
ロニル)およびアセチル−４−スルホガラクトサミニル
基から成る反復単位により構成された、ポリマー化の度
合が変化し得る種類のポリマーであることが知られてい
る(ステュールザッツ、「ザ・メトドロジー・オブ・コネ
クティブ・ティシュー・リサーチ」(The Methodology of
Connective Tissue Research)、(１９７６)、１３７−
１４６)。天然デルマタン硫酸塩は、２００００ないし
４００００Ｄａの分子質量を有する。この生成物は、抗
凝固剤および抗血栓剤として特に有利である(フェルナ
ンデス等、「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマ
トロジー」(British Journal of Haematology)、(１９８
６)、６４、３０９−３１７)。

【０００３】さらに、血液凝固は、下記の通り図式的に
機構が要約され得る複雑な生理学的現象であることが知
られている(ビョルクおよびリンダール、「モレキュラー
・アンド・セルラー・バイオケミストリー」(Ｍolecular
and Ｃellular Ｂiochemistry)、(１９８２)、ドクタ
ー・ダブリュー・ユンク・パブリッシャーズ、オランダ
国)。

【化８】

【０００４】ある種の刺激因子、例えば接触活性化因子
および組織因子は、血しょう中に存在する一連の凝固因
子の連続的活性化を誘発し、これらは上記図式のローマ
数字により同定され、添え字aの存在は所定の凝固因子
の活性化形態(添え字aが存在する)または非活性化形態
(添え字aが存在しない)を示している。刺激因子の性質
とは関係無く、最終段階は同一であり、因子Ｘaは因子I
I(プロトロンビンとしても知られている)を活性化し、
その活性化形態(因子IIa、トロンビンとしても知られて
いる)は、血餅の主要構成要素である不溶性フィブリン
を放出しながら可溶性フィブリノゲンの部分的蛋白質加
水分解を誘発する。

【０００５】正常な生理学的条件下では、調節蛋白質、
例えば抗トロンビンIII(ＡＴIII)およびヘパリンコファ
クターII(ＨＣII)もまた血しょう中に存在する。抗トロ
ンビンIIIは、上記図式においてアステリスク(星印)が
付された全凝固因子に関して阻害活性を及ぼす。この阻
害は、ヘパリンまたはヘパリン型の合成オリゴサッカリ
ドの存在下で非常に強く増幅される(アザ等、「バイオケ
ミストリー」(Ｂiochemistry)、(１９８５)、２４、６７
２３−６７２９)。ヘパリンコファクターIIは、凝固の
最終段階を触媒する因子IIa(トロンビン)に関してのみ
阻害活性を行使する。この活性は、ヘパリンまたはデル
マタン硫酸塩の存在下で大きく増幅される(トレフセ
ン、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー」(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.)、(１９８３)、２５８、６７１
３−６７１６)。２因子ＸaおよびIIaは誘発性刺激因子
とは独立して凝固における最後の２段階に関与するた
め、これら因子Ｘaまたは因子IIaの阻害は抗凝固および
抗血栓活性を得るのに好適な手段を構成する。因子IIa
単独の阻害を達成するため、特に有利な可能性をもたら
す方法は、ヘパリンコファクターIIの特異性を利用し、
その阻害活性の増幅に向かって努力することから成る。
デルマタン硫酸塩は、このタイプの最も強力な増幅活性
を有する公知生成物である。

【０００６】また、主要ヘパリン鎖の形成は２段階で行
なわれることが知られている。最初に、ヘパリンはプロ
テオグリカン前駆体から生合成され、その多糖類部分
は、分子質量３７９Ｄａの反復β−Ｄ−グルクロニル−
(１→４)−α−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニル
−(１→４)−単位(ジサッカリド単位)により構成され
た、ポリマー化の度合が変化し得る種類のポリマーによ
り構成される。この多糖類部分は通常Ｎ−アセチルヘパ
ロザンと称される(ナビア、「アナリティカル・バイオケ
ミストリー」(Ａnal．Ｂiochem.)、(１９８３)、１３
５、１３４−１４０)。生合成の第二段階はこの単純な
骨格に根深い修飾を加えるため、生合成のこの第一段階
は純粋に「ジサッカリド単位」について言える唯一のポイ
ントを表す(「ヘパリン、マニュファクチュア、ストラク
チャー、プロパティーズ、アナリシス」(L'heparine,fab
rication,structure,proprietes,analyses)、デュクロ
ス、(１９８４)、８１−８３頁、マゾン編−フランス
国)。

【０００７】事実上、生合成から生じる天然ヘパリン
は、恐らくは２位が硫酸化され、グルコサミンの分子と
組み合わされ、恐らくは６位が硫酸化され、２位のアミ
ンが硫酸化またはアセチル化された、グルクロン酸およ
びイデュロン酸(ウロン酸)の分子から成る多糖類であ
る。ヘパリンの構造は、１２０００〜１８０００Ｄａの
分子量に対応する下式(i)

【化９】 (式中、ＡはＨおよびＳＯ₃-を表し、ＢはＳＯ₃-および
ＣＯＣＨ₃を表し、nは２０ないし３０の整数である)に
より統計的に示され得る(ＥＰ−Ａ−０１１６８０１)。
置換基ＡおよびＢについて各々使用されている「Ｈおよ
びＳＯ₃-」および「ＳＯ₃-およびＣＯＣＨ₃」という表現
は、上記２０〜３０ジサッカリド単位において、Ａが水
素を表す場合もあればＳＯ₃-を表す場合もあり、同じく
Ｂが大多数の場合はＳＯ₃-であるがアセチル基の場合も
あることを示している。

【０００８】同様に、結合

【化１０】 は、上記２０〜３０ジサッカリド単位におけるＣＯＯ-
基が場合によっては立体配置(ii)

【化１１】 (Ｄ−グルクロン酸に対応)を有し、n単位の大多数にお
いては、立体配置（ｉｉｉ）

【化１２】 （Ｌ−イズロン酸に対応)を有することを意味する。こ
のため、様々な脱ポリマー化方法により得られたヘパリ
ンおよびヘパリンフラグメントは、グルクロン酸単位お
よびイズロン酸単位をともに含む巨大分子である。

【０００９】脱ポリマー化方法の中には、２０００ない
し９０００Ｄａの分子量およびヘパリン出発物質の場合
よりも少なくとも２０％大きい硫酸化度を有するヘパリ
ン・フラグメントの生成を可能にする方法もある。それ
らの「超硫酸化」ヘパリン類は、特許出願ＥＰ−Ａ−０１
１６８０１に記載されており、ウロン酸単位に関して上
述の２つの構造(ii)および(iii)を有する。また、エシ
ェリヒア・コリの種類に属する細菌の中には、反復β−
Ｄ−グルクロニル−(１→４)−α−Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコサミニル−(１→４)−単位から成る種類のポリマ
ーである、通常Ｋ５抗原と称されるきょう膜多糖類を産
生するものもあることが知られている(バン等、「ヨーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー」(Ｅu
r．Ｊ．Ｂiochem.)、(１９８１)、１１６、３５９−３
６４)。ヘパリンのプロテオグリカン前駆体の多糖類部
分と同じ化学的性質を有するこの多糖類を、ここではＮ
−アセチルヘパロザンと称す。この生成物は、１０⁵な
いし２×１０⁶Ｄａの分子質量を有し、「ウロン酸」単位
については、全くＤ−グルクロン酸によってのみ構成さ
れる非常に規則的な構造を有する(バン等、「ヨーロピア
ン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー」(Eur．J．
Biochem.)、(１９８１)、１１６、３５９−３６４およ
び特許出願ＥＰ−Ａ−０３３３２４３)。

【００１０】特許出願ＥＰ−Ａ−０３３３２４３は、Ｏ
−硫酸化Ｋ５多糖類、および同じくＯ−硫酸化された各
々４、６または８個の「糖」単位により構成されるそのフ
ラグメントの幾つかについて記載している。これらの生
成物は抗アンギオジェニックおよび抗腫よう活性を有
し、抗凝固特性に対するこれらの活性の割合は好適なも
のである。この文献はまた、各々４、６、８または１０
個の「糖」単位により構成されるＮ−アセチルヘパロザン
・フラグメントについて記載している。特許出願ＥＰ−
Ａ−０３３３２４３はまた、Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘ
パロザン構造を有するペンタサッカリドの全化学合成に
よる製法を記載している。

【００１１】現在、１５００ないし１５０００Ｄａ間で
変化し得る分子量を有するＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類
は、ヘパリンコファクターIIに関する抗凝固活性および
非常に高い抗Ｘa活性を有することが見出された。

【００１２】このため、本発明の対象であるＮ,Ｏ−硫
酸化ヘパロザン類は、それらの新規構造、特にそれらの
硫酸化度(グルコサミンのアミン基における硫酸化も同
様)およびそれらの薬理特性によって、文献に既に記載
された他の生成物とは区別される。それらは、他の薬理
特性よりも、デルマタン硫酸塩の場合よりもヘパリンコ
ファクターII(ＨＣII)に関して強い抗凝固活性を有し、
また非常に有利な薬物動力学的特徴を有する。事実上、
部分的化学合成により得られる生成物である本発明生成
物は、治療に常用されるグリコサミノグリカン類の薬理
活性、特にヘパリンの薬理活性を有し、それらは凝固の
調節に有用であり得、特に抗血栓剤として適用され得
る。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明の対象は、式(Ｉ)

【化１３】 [式中、Ｅは、Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンのジサッカリド
単位の０〜８０％においてはアセチル基、および残りの
ジサッカリド単位においては硫酸基および可能ならば水
素原子を表し、Ｇは水素原子および硫酸基を表す]で示
される反復ジサッカリド構造を特徴とする、分子質量１
５００ないし１５０００Ｄａの鎖または鎖の混合物から
成るＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類および前記Ｎ,Ｏ−硫酸
化ヘパロザンの医薬的に許容し得る塩類である。

【００１４】硫酸基／カルボキシル基比として表される
Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類の硫酸化度は、好ましくは
１.５〜３.０である。

【００１５】本発明はまた、本発明の対象である上記
Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンを少なくとも７０質量％の割
合で含み、好ましくは本発明の対象であるＮ,Ｏ−硫酸
化ヘパロザンを少なくとも９０質量％の割合で含むＮ,
Ｏ−硫酸化ヘパロザンの組成物に関するものである。

【００１６】本発明の対象であるＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロ
ザン類は、明確に定義された分子質量を有する同一の多
糖類鎖により構成され得、この分子質量は１５００−１
５０００Ｄａの範囲内に存する。また、それらは分子質
量が変化し得る鎖の混合物により構成され得、これらの
分子質量は１５００ないし１５０００Ｄａである。これ
らの鎖の分子質量の分散度はより大きい場合も小さい場
合もあり得る。事実上、本発明の対象であるＮ,Ｏ−硫
酸化ヘパロザン類は、それらの間での分子質量差異が多
くとも約１３５００Ｄａである鎖、または対照的に、そ
れらの間での分子量差異が１単位のウロニック構造(Ｄ
−グルクロン酸またはその誘導体)もしくはグルコサミ
ン構造に対応する約３００Ｄａである鎖のみにより構成
され得る。また、各Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンの構成に
従って、最低の分子質量または最高の分子質量を有する
鎖の分子質量は、１５００ないし１５０００Ｄａ間の値
に対応し得ることは明白である。

【００１７】上記で使用されている「Ｇは水素原子およ
び硫酸基を表す」という表現は、ジサッカリド単位にお
けるＧが、ある位置では水素原子を表し、他の残りの位
置では硫酸基を表すことを示す。同様に、Ｅは、幾つか
のジサッカリド単位においてはアセチル基を表し、これ
らの単位の残りにおいては硫酸基または可能ならば水素
原子を表す。このため、Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンのジ
サッカリド単位は必ずしも同一ではない。

【００１８】式(Ｉ)は、グルコサミン単位およびＤ−グ
ルクロン酸単位から成る反復的ジサッカリド構造を表
す。さらに特定すれば、式(Ｉ)のジサッカリド構造がn
回反復され、鎖の非還元的単位が、同等に、４位にヒド
ロキシル基を伴う式(Ｉ)で示された硫酸化または非硫酸
化グルコサミン単位、または可能ならばＣ４−Ｃ５位に
二重結合を含む硫酸化または非硫酸化Ｄ−グルクロン酸
であり得ると考えられる場合、前記単位は逆になり得
る。還元的単位は、アノマー酸素が水素により置換され
た式(Ｉ)で示されているＤ−グルクロン酸、またはグル
コサミン、または含窒素的脱ポリマー化(２,５−アンヒ
ドロ−Ｄ−マンノース)、次いで所望による酸化(２,５
−アンヒドロ−Ｄ−マンノン酸)または還元(２,５−ア
ンヒドロ−Ｄ−マンニトール)の結果として得られた２,
５−アンヒドロマンノ構造であり得る。

【００１９】好ましい生成物は、本発明の対象である
Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンの鎖の還元および非還元状２
末端が、硫酸化または非硫酸化ウロニック単位、硫酸化
または非硫酸化グルコサミン単位、硫酸化または非硫酸
化Ｎ−アセチルグルコサミン単位または２,５−アンヒ
ドロマンノ構造を有する単位である生成物である。

【００２０】還元および非還元状２末端が、硫酸化また
は非硫酸化ウロニック単位、硫酸化または非硫酸化グル
コサミン単位および硫酸化または非硫酸化Ｎ−アセチル
グルコサミン単位である鎖により構成されるＮ,Ｏ−硫
酸化ヘパロザン類が好ましい。

【００２１】また、本発明の対象は、本発明の対象であ
るＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンを７０％〜１００％の割合
で含む組成物の製造方法であって、下記順序の段階: −段階a: エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)(Ｋ
５)株の培養によるＮ−アセチルヘパロザンの形成、 −段階b: 形成されたＮ−アセチルヘパロザンの単離お
よび精製後、式(II)

【化１４】 で示される反復ジサッカリド構造を特徴とする、分子質
量１５００ないし１５０００Ｄａの鎖または鎖の混合物
から成るＮ−アセチルヘパロザンを７０％〜１００％の
割合で含む組成物の生成、 −段階c: Ｎ−アセチルヘパロザンのこの組成物の部分
的脱アセチル化による、式(III)

【化１５】 (式中、Ｒ'は、ジサッカリド単位の０〜８０％において
はアセチル基、および残りのジサッカリド単位において
は水素原子を表す)で示される反復ジサッカリド構造を
特徴とする、分子質量１５００ないし１５０００Ｄａの
鎖または鎖の混合物から成るヘパロザンを７０％〜１０
０％の割合で含む組成物を生成、 −段階d:−ヘパロザンのこの組成物の部分的Ｎ,Ｏ−硫
酸化、−またはヘパロザンのこの組成物の部分的Ｎ,Ｏ
−硫酸化、次いで全体的Ｎ−硫酸化の段階、−または全
体的もしくは部分的Ｎ−硫酸化、次いで全体的もしくは
部分的Ｏ−硫酸化の段階を含み、および所望により段階
a、b、cまたはdの最後に形成された分子質量の１つまた
はそれ以上の分画化段階を含み得ることを特徴とする方
法である。

【００２２】本発明方法に従い、本発明の対象である
Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンを７０％〜１００％の割合で
含む組成物を製造するためには、エシェリヒア・コリ
(Ｋ５)株として、好ましくはエシェリヒア・コリ株ＳＥ
ＢＲ３２８２が使用される。この株は、株Ｂi８３３７
−４１(Ｏ１０:Ｋ５:Ｈ４)ＡＴＣＣ２３５０６に由来す
る株(特に、グプタ等、ＦＥＭＳマイクロバイオロジー
・レターズ(ＭicrobiologyＬetters)、(１９８２)、１
４、７５−７８およびバン、「ヨーロピアン・ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー」(Ｅur．Ｊ．Ｂioche
m.)、(１９８１)、１１６、３５９−３６４に記載)であ
る。

【００２３】エシェリヒア・コリ株ＳＥＢＲ３２８２
は、カイザー等の方法(「ジャーナル・オブ・クリニカル
・マイクロバイオロジー」(Ｊ．Ｃlin．Ｍicrobiol.)、
(１９８４)、１９、２、２６４−２６６)によるＫ５−
特異的ファージ類別試験において陽性応答する。このた
め、それは明らかにエシェリヒア・コリ(Ｋ５)株であ
る。この株は、フランス国パリ、パスツール研究所のＣ
ＮＣＭにナンバーＩ−１０１３として寄託された。ま
た、自然発生的または誘導された突然変異体および他の
適当なエシェリヒア・コリ(Ｋ５)株、例えばＢi６２６
−４２株(０１２:ＫＳiＮＭ ＡＴＣＣ２３５０８)を使
用することも可能である。使用される培養培地は、好ま
しくは含窒素物質に富む培地、例えば酵母抽出物および
カゼイン加水分解物に富む培地であり、これは大量のア
ミノ酸の安価な供給手段である。エシェリヒア・コリ
(Ｋ５)株の培養は、好ましくはバイオマスの生長停止後
少なくとも２時間続行される。

【００２４】式(II)の反復ジサッカリド構造を特徴とす
る、分子質量１５００ないし１５０００Ｄａの鎖の混合
物から成るＮ−アセチルヘパロザンを７０％〜１００％
の割合で含む組成物を得るためのＮ−アセチルヘパロザ
ンの単離および精製は、少なくとも一つの沈澱段階およ
び一つのイオン交換クロマトグラフィー段階を含む方法
により行なわれる。この段階は、好ましくはＱセファロ
ース・カラムまたは均等内容のカラムを用いて行なわれ
る。沈澱は、適当な有機溶媒および特にアルコール、好
ましくはエタノールにより行なわれる。このプロセスの
間、Ｎ−アセチルヘパロザンは、塩形態、好ましくはナ
トリウム塩形態であり得る。

【００２５】一例として、好ましい単離および精製方法
は、下記要領で概説され得る。 −段階a₁: エタノール沈澱、 −段階b₁: 透析、 −段階c₁: エタノール沈澱、次いで脱水および乾燥、 −段階d₁: アニオン交換クロマトグラフィーによる精
製、 −段階e₁: 段階d₁で得られた溶離物のエタノール沈澱、
脱水、乾燥および粉砕。段階a₁、b₁およびc₁について述
べると、それらが行なわれる順序はあまり重要ではな
い。段階a₁またはc₁のうちの一つは省かれ得る。段階e₁
において、エタノール沈澱は必須ではない。他の方法、
例えば段階d₁で得られた溶離液の真空下濃縮によりＮ−
アセチルヘパロザンを単離することも可能である。

【００２６】また、分子質量１５００ないし１５０００
Ｄａの鎖の混合物から成るＮ−アセチルヘパロザンを７
０％〜１００％の割合で含む組成物を得るためのＮ−ア
セチルヘパロザンの単離および精製は、下記方法で行な
われ得る。 −段階a'₁: 透析、 −段階b'₁: 酸性培地における精製、pＨ３.５およびp
Ｈ１.８の水溶液に不溶性の不純物の除去、 −段階c'₁: エタノール沈澱、次いで脱水および乾燥、 −段階d'₁: アルカリ性加水分解および透析、 −段階e'₁: アニオン交換クロマトグラフィーによる精
製、 −段階f'₁: 排除クロマトグラフィーによる精製。 この単離および精製方法もまた本発明の好ましい方法で
ある。アルカリ性加水分解は、３０ないし８０℃の温度
でＮaＯＨ溶液により行なわれる。

【００２７】単離および精製方法を適用する場合に、培
養の最後に得られた懸濁液(この場合予めろ過が必要で
ある)、または既に下記段階: −段階a"₁: 培養の最後に得られた懸濁液の遠心分離、 −段階b"₁: 上清をアルカリ性溶液と接触させる工程、 −段階c"₁: 予備ろ過、 −段階d"₁: 特定されたカット-オフいき値の膜を用い
た濃縮、 −段階e"₁: 透析を含む方法に従い行なわれる予備精製
に付された生成物を出発物質として使用することが可能
である。段階e"₁は必須ではない。アルカリ性溶液とし
て、０.１Ｎ ＮaＯＨ溶液が使用され得る。好ましく
は、培養の最後に得られた生成物の予備精製は、上記方
法に従い行なわれる。

【００２８】上述のエシェリヒア・コリ(Ｋ５)株の培養
および単離および精製方法並びに予備精製段階により、
式(II)

【化１６】 で示される反復ジサッカリド構造を特徴とする、分子質
量１５００ないし１５０００Ｄａの鎖の混合物から成る
Ｎ−アセチルヘパロザンを７０％〜１００％の割合で含
むＮ−アセチルヘパロザンの組成物を得ることが可能で
ある。

【００２９】事実、上記単離および精製方法並びに予備
精製段階の結果として、１５００ないし１５０００Ｄａ
の分子質量を有する鎖の混合物から成るＮ−アセチルヘ
パロザンを少なくとも８０％〜１００％の割合で含むＮ
−アセチルヘパロザンの組成物を得ることが可能であ
る。１５００ないし１５０００Ｄａの分子質量を有する
鎖の混合物から成るＮ−アセチルヘパロザンは、新規生
成物であり、同じく本発明の対象を形成する。

【００３０】上記方法に従い、エシェリヒア・コリ株Ｓ
ＥＢＲ３２８２または上述の幾つかの他の適当な株を用
いて得られた新規Ｎ−アセチルヘパロザンの２つの還元
および非還元末端は、ウロニックまたはＮ−アセチルグ
ルコサミン単位である。鎖の大部分において、非還元状
末端は、式(a)

【化１７】 で示されるウロニック単位である。

【００３１】１５００ないし１５０００Ｄａの分子質量
を有する鎖の混合物から成り、式(II)の反復ジサッカリ
ド構造を有するＮ−アセチルヘパロザンに関して得られ
る組成物の濃縮は、様々な程度、特に前記Ｎ−アセチル
ヘパロザンの単離点まで遂行され得る。この濃縮は、慣
用的分子質量分画化技術、例えばゲル透過クロマトグラ
フィーおよび限外ろ過を用いて行なわれる(ホーナー、
「バイオケミカル・ジャーナル」(Ｂiochem．Ｊ.)、(１９
８９)、２６２、９５３−９５８、パイラー等、「ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」(Ｊ．Ｂio
l．Ｃhem.)、(１９８８)、２６３、１１、５１９７−５
２０１、およびリンダール等、「ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー」(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.)、
(１９８４)、２５９、２０、１２３６８−１２３７
６)。また、エタノール分画化方法の使用も可能である
(特許出願ＥＰ−Ａ−０２８７４７７)。後者の分画化方
法は、考えられ得る他の方法よりも特に高い価値を有す
る。

【００３２】上記Ｎ−アセチルヘパロザン類は、本発明
の対象であるＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類の製造だけで
なく他の誘導体の製造においても中間体として使用され
る。

【００３３】本発明の対象であるＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロ
ザンを製造するため、他の公知Ｎ−アセチルヘパロザン
類、例えば主に特許出願ＥＰ−Ａ−０３３３２４３に記
載されたものと全て同数のジサッカリド単位を有する多
糖類鎖から成る、特に６、８または１０個の「糖」単位か
ら成るＮ−アセチルヘパロザン類、平均１０個のモノサ
ッカリド単位を含む鎖から成るＮ−アセチルヘパロザン
・フラクション(グプタ等、ＦＥＭＳマイクロバイオロ
ジー・レターズ(Ｍicrobiology Ｌetters)(１９８３)、
１６、１３−１７)または次いで低分子量ヘパリンの製
造に使用される方法に従い脱ポリマー化され得る高分子
質量Ｎ−アセチルヘパロザン類を使用することも可能で
ある。事実、本発明の対象であるＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロ
ザン類は、高分子質量を有する公知多糖類(Ｋ５)から他
の方法により製造され得る。この場合、脱ポリマー化段
階が必要である。

【００３４】この脱ポリマー化は、高分子質量Ｎ−アセ
チルヘパロザンの脱アセチル化前、脱アセチル化後、Ｎ
−硫酸化後または別法としてＮ,Ｏ−硫酸化後に行なわ
れ得る。上述した通り、脱ポリマー化は、低分子量ヘパ
ロザンの製造に関する文献に記載された方法に従い、例
えばペリオデート、遊離基による脱ポリマー化、ベータ
-脱離または亜硝酸の作用により遂行され得る(特許出願
または特許ＥＰ−００４０１４４、ＥＰ−００３７３１
９、ＥＰ−０１２１０６７)。これらの方法は例として
与えられたものであり、限定的なものではない。グリコ
サミノグリカン類の他の脱ポリマー化方法があれば、そ
れも使用され得る。

【００３５】Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンが、それを亜硝
酸の作用に付すことによって高分子質量Ｎ−アセチルヘ
パロザン(先に脱アセチル化および可能ならばＮ−硫酸
化されている)から脱ポリマー化により製造される場
合、本発明の対象であるＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンの還
元単位は、２,５−アンヒドロマンノおよび特に２,５−
アンヒドロ−Ｄ−マンノース構造を有し得る。亜硝酸の
作用による脱ポリマー化は、Ｎ−脱アセチル化またはＮ
−硫酸化段階後に行なわれ得る。この段階の後に酸化ま
たは還元が行なわれる場合、還元単位に２,５−アンヒ
ドロ−Ｄ−マンノン酸または２,５−アンヒドロ−Ｄ−
マンニトール構造を各々有するＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザ
ンが得られる。

【００３６】上記式(III)の反復ジサッカリド構造を特
徴とする１５００ないし１５０００Ｄａの分子質量を有
する鎖の混合物から成るヘパロザンを７０％〜１００
％、さらには８０％〜１００％の割合で含む組成物を生
成させる、Ｎ−アセチルヘパロザンを７０％〜１００％
の割合で含む組成物の部分的脱アセチル化は、脱アセチ
ル化剤を用いた処理により行なわれる。脱アセチル化剤
としては、五硫化燐、トリエチルオキソニウム・フルオ
ロボレート、水酸化ナトリウムまたはヒドラジンを挙げ
ることができ、後の２剤は特に高い価値を有する。ま
た、強い無機酸、例えば塩酸、硫酸などの使用も可能で
ある。反応時間は、選択された作用条件、特に温度およ
び反応媒質中における脱アセチル化剤の濃度により異な
る。

【００３７】式(III)の反復ジサッカリド構造を特徴と
する分子質量が１５００ないし１５０００Ｄａの鎖また
は鎖の混合物から成るヘパロザンに関するヘパロザンの
組成物の濃縮は、上述の慣用的分子質量分画化技術(ゲ
ル透過クロマトグラフィー、限外ろ過およびエタノール
分画化)を用いることにより行なわれる。この場合、式
(III)の反復ジサッカリド構造を有する、分子質量が１
５００ないし１５０００Ｄａの(鎖の)混合物から成るヘ
パロザンを質量にして９０％〜１００％の割合で含む組
成物が得られる。

【００３８】１５００ないし１５０００Ｄａの分子質量
を有する鎖の混合物から成るヘパロザンを製造するため
には、高分子量Ｎ−アセチルヘパロザンを使用すること
も可能である。脱アセチル化後に得られた高分子量ヘパ
ロザンは、低分子量ヘパリンの製造に関して既に記載さ
れ、この出願で既に述べられた方法により脱ポリマー化
され得る。次いで、脱ポリマー化生成物を分画化に付す
ことにより、本発明の好ましいヘパロザンを得ることが
できる。

【００３９】式(III)

【化１８】 (式中、Ｒ'は、ジサッカリド単位の０〜８０％において
はアセチル基を表し、残りのジサッカリド単位において
は水素原子を表す)で示される反復ジサッカリド構造を
特徴とする、１５００ないし１５０００Ｄａの分子質量
を有する鎖の混合物から成るヘパロザン類は、新規生成
物であるため、同じく本発明の一部を形成する。

【００４０】本発明の好ましいヘパロザンは、式(III)
(ただし、アセチル基(Ｒ')は６０％を越えない含有率で
存在する)で示される反復ジサッカリド構造を特徴とす
る、１５００ないし１５０００Ｄａの分子質量を有する
鎖の混合物から成るヘパロザンである。また、上記ヘパ
ロザンを少なくとも７０質量％の割合で含むヘパロザン
の組成物も本発明の一部を形成する。これらのヘパロザ
ン類およびヘパロザンの組成物は、本発明の対象である
Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンの製造における有用な中間体
であるが、それらはまた、他の生成物、例えば続いてＤ
−グルクロン酸単位においてエピマー化が行なわれる生
成物の製造においても使用され得る。

【００４１】部分的Ｎ,Ｏ−硫酸化の段階の前に、ヘパ
ロザンは、有機塩基の塩または第４級アンモニウム塩に
変換され得る。ヘパロザンの第４級アンモニウム塩を形
成させるためには、好ましくはテトラブチルアンモニウ
ムが使用される。１０．１１．８７のフランス国特許第
２５８４７２８号(出願ＦＲ−８５／１０７８７に対応)
に記載された方法に従い行なわれる部分的Ｎ,Ｏ−硫酸
化段階は、極性非プロトン性溶媒、例えばジメチルホル
ムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルホスフ
ァーアミドまたはアセトニトリルまたはこれらの溶媒の
混合物中、例えば有機塩基、例えばトリメチルアミン、
トリエチルアミンまたはピリジンと、無水硫酸(三酸化
硫黄:ＳＯ₂)の複合体を用いて行なわれる。また、ピリ
ジンに溶かしたクロロスルホン酸を用いても行なわれ得
る。好ましくは、三酸化硫黄／ピリジン複合体が使用さ
れる。

【００４２】また、他の硫酸化剤、特にギルバートによ
り「ケミカル・レビュー」(ＣhemicalＲeview)(１９６
２)、６２、５４９−５８９頁に報告された硫酸化剤の
使用も可能である。Ｎ,Ｏ−硫酸化反応は、一般に６時
間ないし１４時間の間、０〜１００℃、好ましくは１０
〜５０℃の温度で行なわれる。製造プロセス中、部分的
Ｎ,Ｏ−硫酸化反応の最後に、本発明の対象であるＮ,Ｏ
−硫酸化ヘパロザンを７０％〜１００％の割合で含む
Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン組成物は、塩化ナトリウムに
関して０.３３モルの溶液が得られるまで塩化ナトリウ
ムを加え、次いで適量のエタノールを加えることにより
沈澱する。形成された沈澱物を０.５モル塩化ナトリウ
ム溶液中にとる。次いで、この溶液を中和する。適量の
エタノールを加えた後、形成された沈澱物を単離し、超
精製水中にとり、後者に対して透析し、凍結乾燥および
乾燥する。

【００４３】Ｎ,Ｏ−硫酸化段階および上項に記載され
たＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンの組成物の精製段階は１回
または複数回反復され得る。精製方法は一例として与え
られたものであり、均等内容の方法を排除するわけでは
ない。このＮ,Ｏ−硫酸化段階の後、好ましくは全体的
Ｎ−硫酸化段階が行なわれる。これは、一般に、硫酸化
剤、例えば有機塩基、例えばトリメチルアミンと無水硫
酸の複合体により、有利には塩基性pＨの水性溶媒中で
行なわれる。

【００４４】全体的Ｎ−硫酸化段階の最後に、塩化ナト
リウムに関して０.５モルの溶液が得られるまで塩化ナ
トリウム、さらにエタノールを加えた後、Ｎ,Ｏ−硫酸
化ヘパロザン組成物が沈澱する。次いで、形成された沈
澱物を０.５モルの塩化ナトリウム溶液に再溶解し、エ
タノールにより再沈澱させ、次に超精製水中にとり、後
者に対して透析し、凍結乾燥および乾燥する。Ｎ,Ｏ−
硫酸化ヘパロザンに関するＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン組
成物の濃縮は、既に述べた慣用的分子質量分画化技術を
用いて行なわれる。この濃縮を行うのは有利である。

【００４５】本発明の対象であるＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロ
ザン、および本発明の対象である新規Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘ
パロザンを少なくとも７０％の割合で含むＮ,Ｏ−硫酸
化ヘパロザン組成物は、最終的Ｎ−硫酸化反応を含む方
法により有利に得られる。式(Ｉ)における反復構造で
は、Ｅはアセチル基および硫酸基を表す。また、最初に
Ｎ−硫酸化、次いでＯ−硫酸化を行うことにより、本発
明の対象であるＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンを得ることも
可能である。好ましくはこの方法の変形を使用する。

【００４６】Ｎ−硫酸化は、有機塩基、例えばトリメチ
ルアミン、トリエチルアミンまたはピリジンと三酸化硫
黄の複合体を用いて行なわれる。また、それはピリジン
に溶かしたクロロスルホン酸によっても行なわれ得る。
トリメチルアミンと三酸化硫黄の複合体を使用するのが
有利であり、Ｎ−硫酸化反応は、アルカリ性水性媒質中
２０ないし８０℃の温度で行なわれる。Ｎ−硫酸化反応
の最後に、適量のエタノールを加えると、それによって
得られた生成物が沈澱する。形成された沈澱物を超精製
水中にとり、後者に対して透析し、凍結乾燥および乾燥
する。精製プロセスは一例として与えられたものであ
り、均等内容のプロセスを排除するわけではない。精製
段階は数回反復され得る。本発明方法によると、Ｏ−硫
酸化段階前に、Ｎ−硫酸化ヘパロザンは、好ましくは有
機塩基の塩または第４級アンモニウム塩に変換される。
第４級アンモニウム塩の形成には、好ましくはテトラブ
チルアンモニウムが使用される。

【００４７】Ｏ−硫酸化反応は、ホルムアミドまたは別
の化学的に均等な溶媒中、例えば有機塩基、例えばトリ
メチルアミン、トリエチルアミンまたはピリジンと三酸
化硫黄の複合体を用いて行なわれる。好ましくは三酸化
硫黄／ピリジン複合体が使用される。Ｏ−硫酸化反応
は、一般に１０℃ないし５０℃の温度で行なわれる。次
いで、Ｎ,Ｏ−硫酸化の場合と同様、ＮaＣlに関して０.
３３モルの溶液が得られるまで反応媒質に塩化ナトリウ
ムを加え、次に適量のエタノールを加えることにより、
Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンが沈澱する。次に、Ｎ,Ｏ−硫
酸化ヘパロザン組成物の精製が行なわれる。様々な段階
は既に上記で詳細に記載されている(エタノール沈澱、
透析など)。本発明によると、好ましいＮ,Ｏ−硫酸化ヘ
パロザンは、１１０００Ｄａ未満の分子質量を有する鎖
を少なくとも９０質量％の割合で含む。このＮ,Ｏ−硫
酸化ヘパロザンは０.２マイクロモル／mg未満の割合で
アミノ基(ＮＨ₂)を含むのが望ましい。アセチル基は好
ましくは６０％を越えない含有率で存在し、硫酸基／カ
ルボキシル基比として表される硫酸化度は１.５ないし
３.０であるのが望ましい。

【００４８】本発明の好ましい生成物は、平均分子質量
が約４０００〜７０００Ｄａであり、硫酸基／カルボキ
シル基比として表される硫酸化度が１.７ないし３であ
る鎖から成るＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類、および分子
質量が５０００ないし７０００Ｄａの鎖を少なくとも７
０質量％の割合で含み、１.８ないし２.５の硫酸化度を
有する約８０％Ｎ−脱アセチル化Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロ
ザン類(存在するアセチル基含有率は約２０％)、または
その他に、分子質量が１００００ないし１２０００Ｄａ
の鎖を少なくとも７０質量％の割合で含み、１.８〜２.
５の硫酸化度を有する約８０％Ｎ−脱アセチル化Ｎ,Ｏ
−硫酸化ヘパロザン類(存在するアセチル基含有率は２
０％)、またはその他に、分子質量が６０００ないし８
０００Ｄａの鎖を少なくとも７０質量％の割合で含み、
２.０〜２.８の硫酸化度を有する約４０％Ｎ−脱アセチ
ル化Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類(存在するアセチル基含
有率は６０％)である。

【００４９】本発明の好ましいＮ−硫酸化ヘパロザン類
は、さらに特定すれば、分子質量が２３００Ｄａないし
７２００Ｄａの鎖を少なくとも８０質量％の割合で含
み、 −１.８〜２.５の硫酸化度を有する約８０％Ｎ−脱アセ
チル化Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類(存在するアセチル基
含有率は２０％)、分子質量が３３００Ｄａないし７７
００Ｄａの鎖を少なくとも８０質量％の割合で含み、 −１.８〜２.５の硫酸化度を有する約８０％Ｎ−脱アセ
チル化Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類(存在するアセチル基
含有率は２０％)、分子質量が６９００Ｄａないし１３
５００Ｄａの鎖を少なくとも７０質量％の割合で含み、 −１.８〜２.５の硫酸化度を有する約８０％Ｎ−脱アセ
チル化Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類(存在するアセチル基
含有率は２０％)、分子質量が４０００Ｄａないし１０
３００Ｄａの鎖を少なくとも８０質量％の割合で含み、 −２.０〜２.８の硫酸化度を有する約４０％Ｎ−脱アセ
チル化Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類(存在するアセチル基
含有率は６０％)である。

【００５０】Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンの塩類として
は、全ての医薬的に許容し得る塩類が包含される。これ
らの塩類は、特にヘパリン塩類の製造について記載され
た(アメリカ合衆国特許４１６８３７７)慣用的方法によ
り得られる。精製方法と一緒に上記のＮ,Ｏ−硫酸化ヘ
パロザン製造方法を行うと、Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン
をナトリウム塩形態で得ることができる。これらの塩類
から、様々なヘパリン塩類または非塩形態のヘパリンの
製造に使用される方法(「ヘパリン、マニファクチャー、
ストラクチャー、プロパティーズ、アナリシス」(Ｌ'hep
arine,fabrication,structure,proprietes,analyses)、
デュクロス、(１９８４)、８１−８３頁、マゾン編、フ
ランス国)を適用することにより、Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロ
ザンの他の塩類または塩形態にされていないＮ,Ｏ−硫
酸化ヘパロザンを得ることが可能である。

【００５１】本発明の対象であるＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロ
ザン類は、先行技術の示唆するものに対して全く驚くべ
き有利な薬理学的および生化学的特性を有する。特に、
抗アンギオジェニックおよび抗腫よう活性を有し、抗凝
固活性に対するこれらの活性の比率が好適である、特許
ＥＰ−Ａ−０３３３２４３に記載されたＫ５抗原の硫酸
化生成物とは対照的に、本発明のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロ
ザン類は優れた凝固調節活性を有する。この活性は、様
々な凝固パラメーターに関してデルマタン硫酸塩の場合
よりも非常に高く、ヘパリンの場合と比べて優るとも劣
らないものであり得る。一層具体的には、この発明の代
表的な生産物のＡＴIII依存性またはＨＣII依存性抗II
ａ活性を、デュプイ(D. Dupouy)らがヘパリン補因子II
（ＨＣII）について報告した方法［トロンボーシス・ア
ンド・ヘモステーシス(Thrombosis andHaemostasis)、
（１９８８年）、６０巻（２）、２３６〜２３９頁］、
およびラーセン(M.L. Larsen)らが抗トロンビン（ＡＴI
II）について報告した方法［トロンボーシス・リサーチ
(Thrombosis Research)、（１９７８年）、１３巻
（２）、２８５〜２８８頁］により測定した。

【００５２】何れの場合も、試験は色素産生基質におけ
るトロンビンのアミド分解活性検定で、精製したＨＣII
または精製したＡＴIIIの存在で、精製トロンビン（因
子IIａ）に対する試験生産物の抑制効果を試験管内で測
定することからなる。スツールザッツ(H.W. Stuhlsatz)
らが報告した方法［「ザ・メソドロジー・オブ・コネク
ティブ・ティシュー・リサーチ(The Methodology of Co
nnective Tissue Re-search)」、（１９７６年）、１３
７〜１４６頁］によって作成したデルマタン硫酸は、最
も強力なＨＣII依存性抗IIａ活性を有するから、これを
この活性を測定する試験の対照生産物として使用し、そ
の試験結果を試験生産物１mgの活性に相当するデルマタ
ン硫酸（ＤＳ）のmg 数で表す（mg ＤＳ当量／mg）。こ
の発明の代表的な生産物の抗Ｘａ活性（イン・ウエスラ
ー(Yin-Wessler)力価）を、イン(E.T. Yin)らが報告し
た方法［ジャーナル・オブ・ラボラトリー・アンド・ク
リニカル・メディシン(J. Lab. Clin.Med.)、（１９７
３年）、８１巻（２）、２９８〜３１０頁］によって測
定し、一方、それら全体の抗凝固活性をプロクター(R.
R. Proctor)らが報告したＡＰＴＴ試験［アメリカン・
ジャーナル・オブ・クリニカル・パソロジー(Am. J. Cl
in. Path.)、（１９６１年）、３６巻、２１２〜２１９
頁］によって測定した。

【００５３】試験した生産物は、すべてデルマタン硫酸
より著しく高いＨＣII依存性抗IIａ活性を示した。ＡＴ
III依存性抗IIａ活性およびイン・ウエスラー力価は、
ヘパリンの活性より低いが、デルマタン硫酸の活性より
高いことが判明した。それら生産物のＡＰＴＴ力価はデ
ルマタン硫酸の力価より約２倍〜約２０倍高く、ヘパリ
ンの力価の６０％に達することができた。したがってこ
の発明のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロザン類は、特に有利な活
性の特異性および抗凝固活性を示した。しかもこれらの
生産物の分子質量が低いことは、極めて好都合な薬物動
態性をもたらす。この発明のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロザン
類は極めて毒性が低く、その毒性は医薬用生産物として
使用するのに全く支障がない。したがってこの発明はま
た、この発明の対象であるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロザン、
またはその塩の１つを有効成分として含有する医薬組成
物、または該Ｎ，Ｏ−硫酸エステル化ヘパロザン、また
はその塩の１つの少なくとも７０％を１またはそれ以上
の製薬上許容し得る好適な媒質と組み合わせて含有する
医薬組成物を包含する。

【００５４】これらの医薬組成物は、特にアテローム性
動脈硬化症、およびその他の動脈硬化症のような血管壁
の障害、および例えば外科的手術後、または腫瘍の発生
に伴って観察される血液凝固亢進状態、または細菌、ウ
イルス、または酵素の活性化によって誘発された凝固障
害の予防または治療的処置に有用である。投与量は患者
の年齢、体重、健康状態、疾患の性質および重篤度、お
よび投与経路によって幅広く変わり得る。投与量は、１
日当たり１回またはそれ以上の投与で約１mg〜１ｇ、好
ましくは１日約５mg〜５００mg、例えば１日２００mgの
用量単位で、断続的もしくは一定間隔で静脈内または皮
下に投与し、または経口で１日当たり２００mg〜１００
０mgの投与量で投与することを含む。言うまでもなくこ
れらの投与量は、各患者の観察結果、および予め実施し
た血液分析によって調節し得る。以下に実施例をあげて
この発明をさらに詳細に説明する。

【００５５】

【実施例】

Ｎ−アセチルヘパロザン類 実施例１ 主として低分子質量からなるＮ−アセチルヘパロザンの
生産（方法Ｉ） （１）エシェリキア・コリ(Escherichia coli)（Ｋ５）
細菌株の培養およびＮ−アセチルヘパロザンを含有する
濾液の分離 下記の表Ｉに示した組成の培地Ｂ ４００mlにエシェリ
キア・コリＳＥＢＲ３２８２株［パスツール・インステ
ィチュート(Pasteur Institute)のＣＮＣＭ、パリ(Pari
s)、フランス(France)でＮｏ.Ｉ−１０１３の番号のも
とに保管］を接種し、浮遊液を撹き混ぜながら３７℃で
２時間インキュベートする。ついで得られた前培養を、
表Ｉに示した組成の培地Ａ １１リットルを含有する１
８.５リットルの発酵槽へ移し、浮遊液への空気注入を
調節し（２０リットル／分まで）、撹き混ぜることによ
って酸素分圧を４０mm Hgに保ち、ｐＨ７.４、３７℃で
４時間インキュベートする。ついでグルコース６００ｇ
／リットルを含有する滅菌溶液を２５０ml／時の速度で
８時間連続的に導入することによってグルコースを添加
する。グルコースの添加完了後、温度、ｐＨ、酸素分圧
をこれと同一の条件下で、さらに１０時間培養を続け
る。培地のＯＤ（λ＝６００nm）をモニターすることに
よって、培養の最後の１２時間はバイオマスの増殖がな
いことが確認できる。ついで培養ブロスを２５℃に冷却
したのち、ポアサイズ０.２２μmのメンブランで濾過す
る。これによってＮ−アセチルヘパロザンを含有する濾
液約１２リットルが得られる。

【００５６】

【表１】 第１表 培地Ａおよび培地Ｂの組成および調製 ［培地Ａ］培地Ａは下記の３種の滅菌溶液を調合するこ
とによって調製する。 （溶液Ｎｏ.１）下記の組成を順に超精製水７００mlに
溶解する。 錯化剤：Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン （トリシン、フルカ(Fluka、商標)によって市場化） ３６０ mg ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２８０ mg ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ６.７mg ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ １２７０ mg Ｋ₂ＳＯ₄ ５００ mg ＫＣｌ ５０００ mg カゼイン加水分解物（アミノ酸の主供給源）ＨＹ ＣＡＳＥ ＳＦ （シェフィールド(Sheffield、商標)によって市場化） ２５０００ mg 酵母抽出物（ディフコ(Difco、商標)によって市場化） １８０００ mg 微量元素溶液（第II表参照） １ ml 消泡剤ストラクトール(Struktol)Ｊ６７３（シル(Sch
ill)およびザイラヒェル(Seilacher、商標)によって市
場化） パスツールピペットを使用して数滴ＫＯＨ溶
液（ｄ＝１.３８）でｐＨを調節し、超精製水で容量を
８５０mlに調節する。培地を１２０℃で４５分間加圧滅
菌する。 （溶液Ｎｏ.２）Ｋ₂ＨＰＯ₄ ５ｇを超精製水４０mlに溶
解し、ついでこれと同一の溶媒で容量を５０mlに調節す
る。得られた溶液をポアサイズ０.２μm のフィルター
で濾過する。 （溶液Ｎｏ.３）グルコース２０.７ｇを好適量の超精製
水に溶解し、これと同一の溶媒で容量を１００mlに調節
する。溶液を１１０℃で３０分間加圧滅菌する。

【００５７】［培地Ｂ］培地Ｂの調製は培地Ａの調製と
同じであるが、ただし消泡剤添加後、さらにｐＨ７.２
の緩衝液（３−モルホリノプロパンスルホン酸）２０ｇ
を追加すべきである。

【表２】第II表 培地Ａおよび培地Ｂの調製に使用する微量元素溶液の調
製 下記の微量元素を（順に）超精製水８００mlに溶解す
る。 Ｈ₃ＢＯ₃ ５００mg Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ １９３０mg ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ １１８５０mg ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ２５mg ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２０００mg ＡｌＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ ２４１０mg 塩酸（密度１.１９）１００mlを加え、超精製水を加
えて全量１０００mlに調節する。

【００５８】（２）主として低分子質量のＮ−アセチル
ヘパロザンの単離および精製 段階ａ−エタノール沈殿：９５％（ｖ／ｖ）エタノール
約４８リットルを濾液へ加え、混合物を放置して沈殿さ
せ、４℃で８時間沈降させる。ポンプ吸引によって上清
を除き、ついで遠心し、遠心ペレットを超精製水約１リ
ットルで取り出す。 段階ｂ−透析：前段階で得られた溶液を、ポアサイズ２
４Åのセルロース膜を備えたＮＯＪＡＸ４０袋に加え、
超精製水に２４時間透析する（溶液１容量：水６容量、
２時間後、８時間後、１６時間後に新しい超精製水と取
り替える）。この操作によって培地内に存在する塩類、
糖類、アミノ酸、オリゴヌクレオチド、およびオリゴペ
プチドのような小分子物質を除去することができる。 段階ｃ−沈澱、脱水、および乾燥：０.５Ｍ ＮａＣｌお
よびエタノール４容量を透析液１容量へ加える。室温で
５分間放置し、沈澱を生成させる。混合物を５０００ｇ
で２０分間遠心する。遠心ペレットをエタノールで取り
出し、得られた懸濁液を撹拌し、室温で１時間放置す
る。遠心および懸濁操作を反復する。混合物を５０００
ｇで２０分間再度遠心する。得られた遠心ペレットを乾
燥器で真空下に４０℃で２４時間乾燥する。 段階ｄ−粉砕・粉末化：乾燥した遠心ペレットを、無水
条件下に乳鉢を使用して粉砕する。 段階ｅ−陰イオン交換クロマトグラフィー：粉砕した遠
心ペレットを緩衝液Ｄと呼ばれる緩衝液［組成：２０mM
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）］で取り出す（１ｇ当た
り１００mlの割合）。第４級アンモニウム基で架橋した
アガロース・マトリックス［ファーマシア(Pharmacia、
商標)、「Ｑセファロース・ファースト・フロー(Q Seph
arose Fast Flow)」］を含有し、予め緩衝液Ｄで平衡化
した強陰イオン交換カラムで、得られた溶液をクロマト
グラフィー精製する（粉末１ｇ当たりゲル５０mlの割
合）。２１４nmのＵＶ検出基線へ戻るまで十分量の緩衝
液Ｄでゲルを洗浄し、ついで２５mMピペラジン溶液（ｐ
Ｈを３.５に調節）で洗浄する。カラムを０.５Ｍ Ｎａ
Ｃｌおよび２５mMピペラジンの組成を有する溶液（ｐＨ
３.５）で溶出する。５Ｎ ＮａＯＨ溶液を使用して溶出
液を中和する。 段階ｆ−沈澱、脱水、乾燥、および粉砕：塩化ナトリウ
ムを添加することなく前記の段階ｃおよびｄの操作を繰
り返す。段階ｆの終わりで得られたＮ−アセチルヘパロ
ザンをバッチＡと呼ぶ。精製処理の別法として、段階
ａ、ｃ、ｂ、ｄ、ｅ、およびｆの順に精製を実施する。
この別法によって得られたＮ−アセチルヘパロザンをバ
ッチＢと呼ぶ。

【００５９】（３）各精製段階後に得られたＮ−アセチ
ルヘパロザンの特性決定 核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル プロトンおよび¹³Ｃ炭素−ＮＭＲスペクトルを、バン
(W.E.Van) によって報告されたＮ−アセチルヘパロザン
［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー(Eur. J. Biochem.)、（１９８１年）、１１６巻、５
９〜３６４頁］と比較する。バッチＡおよびバッチＢの
Ｎ−アセチルヘパロザンで得られたスペクトルを検討し
た結果、これらの生産物はバンによって報告されたＮ−
アセチルヘパロザンと化学的に同一であることを確認し
た。このものはβ−Ｄ−グルクロニル−（１→４）−α
−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−（１→４）の繰
り返し構造からなるポリマー鎖を含んでいる。

【００６０】排除クロマトグラフィーによる分子質量分
布の測定 分子質量の分布を、下記の条件下で排除ＨＰＬＣにより
測定する。 −粒径１０μm、ポアサイズ２５０Åのシリカ・ビーズ
からなるカラム、 −溶離液：０.５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液、 −流速：１ml／分、 −λ＝２０５nmにおけるＵＶ検出。 −ヘパリンから誘導された下記の分子質量を有するオリ
ゴ糖系列：１３２４、１８８３、２４３６、３４１１、
３９９６、４５３５、４９９５、５３６５、６１５０、
６６７１、７５４２、８６５５、１００８８、１１５６
１、１２９５０、１４８０９、１７３８７、および２２
６７４Daを使用して検定を実施する。この標準系列で
は、９３４Da〜５６７０３Daの分子質量だけを考慮す
る。検出した光学密度がＮ−アセチルヘパロザンの量に
比例していることは、容認され得る事実である。ただし
この方法の精度は、高分子質量では、特に２００００Da
以上では指数的に低下する。バッチＡの排除クロマトグ
ラフィーの溶出パターンを図１に示す。図１を検討する
と分布は多重分散であり、約４７００Daに優勢なピーク
を含んでいることが認められる。バッチＡの少なくとも
７０％に等しい重量画分は１７００〜８０００Daの質量
を有している。バッチＢの分析についても極めて類似し
たクロマトグラムが得られる。分布の優勢なピークは約
５０００Daである。バッチＢの少なくとも７０％に等し
い重量画分は１５００〜８０００Daの分子質量を有して
いる。

【００６１】ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分
子質量分布の観察 これらの分析用試料は、ブロモフェノールブルーを含む
泳動終了標識物質(migration end-marker)と共に、トリ
スホウ酸塩緩衝液中アクリルアミドとＮ,Ｎ'−メチレン
ビスアクリルアミドの２９:１の混合物の重合により得
られる１５％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に供し
た。泳動は、４０mＡで約４時間、長さ１８cmのゲル上
で、泳動終了標識物質が現れるまで実施する。次いで、
Ｓ．ペルコネンら(ジャーナル・オブ・バクテリオルジ
ー(Ｊournal of Ｂacteriolgy)１７０巻、６号、２６４
６頁(１９８３年))の方法に準じて、ゲルをアルシアン
ブルーで染色した後、銀で染色する。この方法は酸性多
糖類に特異的である。この電気泳動による分析は、段階
aの最後に得られた部分精製物および最終段階、すなわ
ち、バッチＡまたはバッチＢから流出する精製物で実施
し、精製過程中のＮ−アセチルヘパロザンの分子質量分
布は実質的に変化しないことを証明することを目的とす
る。段階aの最後の得られた部分精製物および最終段階
(バッチＡまたはバッチＢ)で精製した生成物で得られた
記録を観察すると、実質的な差異は認められない(同じ
泳動距離で、同等の強度のバンドが存在する）。従っ
て、精製中のＮ−アセチルヘパロザンの分子質量分布の
実質的な変化はない。

【００６２】ウロン酸検定 最終段階の最後に得られる精製物(バッチＡまたはバッ
チＢ)の単位質量あたりのウロン酸量を、Ｔ．ビターに
より報告された方法(アナリティカル・バイオケミスト
リー(Ａnalytical Ｂiochemistry)４巻、３３０〜３３
４頁(１９６２年))に準じて比色定量法により定量し
た。この検定方法は、加熱条件下酸溶媒中グリコースア
ミノグリカンとカルバゾールの反応に基づいており、遊
離されたウロン酸量に比例してピンク色に着色する。バ
ッチＡでは、段階dの最後に得られた部分精製物および
最終段階fの最後に得られた精製物のウロン酸含量は、
各々１．３および２．１マイクロモル／mgである。バッ
チＢでは、最終段階の最後での精製物のウロン酸含量
は、これもまた２．１マイクロモル／mgである。

【００６３】紫外および可視部における分光光度法 精製物(バッチＡ)を超純水に溶解し、得られた溶液(c＝
１mg／ml)を光路１cmのセルに入れる。吸収スペクトル
は２００および６００nmの間で記録する。得られたスペ
クトルより、とりわけ２５６nmの吸収に基づくと、バッ
チＡはＤＮＡを１％未満しか含有しない。

【００６４】全タンパク検定 バイオラッドより市販されている「タンパク検定」キット
を用いて全タンパクを検定する。検定方法は、クーマシ
ー・ブリリアント・ブルーＧ２５０の酸溶液の最大吸収
波長が、タンパクがそれに対する結合型になったとき
に、４６５nmから５９５nmに上昇するという事実に基づ
いている(ライスナーら、アナリティカル・バイオケミ
ストリー(ＡnalyticalＢiochemistry)６４巻、５０９頁
(１９７５年))。バッチＡの全タンパク含量は、１．５
％未満である。

【００６５】遊離アミノ基(ＮＨ₂)検定 この検定は、ゼンサク・ヨシザワらにより、バイオケミ
カ・エト・バイオフィジカ・アクタ(Ｂiochemica et Ｂ
iophysica Ａcta)１４１巻、３５８〜３６５頁(１９６
７年)に報告された方法に準じて実施した。媒介変数Ｎ
Ｈ₂含量(マイクロモル／mgで表す)は、脱アセチル化β
−グルクロール−(１→４)−α−Ｎ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミニル−(１→４)−単位および遊離アミノ基を含
む夾雑物の量の指標である。バッチＡおよびバッチＢの
各々のＮＨ₂含量は０．０５マイクロモル／mgである。
ＮＨ₂／グルクロン酸比＝０．０５／２．１は２．５％
未満である。従って、β−Ｄ−グルクロニル−(１→４)
α−Ｎ−アセチル−グルコサミニル−(１→４)、１００
単位あたり、脱アセチル化したこの型の二糖は、(モル
で)２．５単位より少なくなる。

【００６６】実施例２ 低分子質量の優勢なＮ−アセチルヘパロザンの調製(方
法ＩＩ) １) エシエリキア・コリ(Ｅscherichia coli)(Ｋ５)細
菌株の培養およびＮ−アセチルヘパロザン含有濾過物の
分離 エシエリキア・コリ(Ｅscherichia coli)株ＳＥＢＲ３
２８２の培養およびＮ−アセチルヘパロザン含有濾過物
の分離は、実施例１に記載した方法に準じて実施した。

【００６７】２) 低分子質量の優勢なＮ−アセチルヘパ
ロザンの単離および精製 段階a−透析 実施例１[２)低分子質量の優勢なＮ−アセチルヘパロザ
ンの単離および精製、段階b]に記載の方法に従って、濾
過物３７５mlを透析に供する。透析後、精製溶液約１０
２０mlを得る。 段階b−酸溶媒中の精製 ５Ｎ ＨＣl溶液適当量を透析溶液に添加し、pＨ３．５
にする。形成された沈澱を遠心により除去し、溶液を同
じ酸(５Ｎ ＨＣl)で酸性にし、pＨ１．８にする。沈澱
形成するかもしれないが、遠心により除去する。次に、
溶液を５Ｎ ＮaＯＨ溶液を用いて中和する。 段階c−沈澱、脱水および乾燥 塩化ナトリウムを適当量、中和した溶液に加え、ＮaＣl
に関して０．５Ｍの溶液を得、エタノール４容量を次に
加える。室温で５分間、沈澱形成させる。混合物を５０
００gで２０分間遠心する。遠心塊をエタノール中にと
り、得られた懸濁液を撹拌し、室温で１時間立ててお
く。遠心し、懸濁する操作を繰り返す。混合物を再び５
０００gで２０分遠心する。得られたペレットを減圧下
４０℃で２４時間、オーブン中で乾燥する。 段階d−アルカリ性加水分解および透析 前段階で乾燥後得られた生成物を、０．２５Ｎ ＮaＯ
Ｈ溶液中２．５％(重量／容量)の濃度で溶解する。それ
により得られた溶液は５０℃を２時間維持する。次に５
Ｎ ＨＣl溶液を用いて中和し、多糖を含有する溶液
を、実施例１[２)低分子質量の優勢なＮ−アセチルヘパ
ロザンの単離および精製、段階b]記載の方法に準じて透
析に供する。透析後、約９９０mlの溶液が得られる。 段階e−陰イオン交換クロマトグラフィー ピペラジン、ＥＤＴＡおよびトライトンＸ−１００(商
標プロラボ)を適当量、透析溶液に添加し、各々ピペラ
ジンに関して２５mＭ、ＥＤＴＡに関して２mＭ、トライ
トンＸ−１００に関して０．２％(容量／容量)の濃度に
する。次に５ＮＨＣlを用いてpＨを３．５に調整する。
この溶液を、２５mＭピペラジン、２mＭＥＤＴＡおよび
０．２mＭトライトンＸ−１００を含有するピペラジン
緩衝液(pＨ３．５)で平衡にした４００ml Ｑセファロー
ス・ファスト・フロー・カラムに入れる。カラムをピペ
ラジン緩衝液で洗浄し、０．５Ｍ ＮaＣl溶液で溶離
し、生成物を次にエタノール４容量で沈澱させる。これ
を減圧下４０℃で乾燥する。Ｎ−アセチルヘパロザン約
９．８５gがそれにより得られる。 段階f−排除クロマトグラフィー 前段階で得られた生成物４gを、２０mＭトリス−ＨＣl
pＨ７．５および１ＮＮaＣlの組成の緩衝液６０mlに
溶解し、次いであらかじめ同じ緩衝液で平衡にした２０
０mlの商標オクチル−セファロースカラムに移す。エタ
ノール４容量を非保持分画に加える。形成した沈澱を洗
浄し、減圧下４０℃で乾燥する。それにより、Ｎ−アセ
チルヘパロザン３．９０gが得られる。

【００６８】３) 種々精製段階の最後に得られるＮ−ア
セチルヘパロザンの特性化 核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトル このＮ−アセチルヘパロザンで得られたプロトンおよび
¹³Ｃ炭素ＮＭＲスペクトルの研究により、この生成物は
Ｗ.Ｆ.バン(ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオ
ケミストリー(Ｅuropean Ｊourral of Ｂiochemistry)
１１６巻、５９〜３６４頁(１９８１年))により報告さ
れたＮ−アセチルヘパロザンと化学的に同一であること
が確認される。 排除クロマトグラフィーによる分子質量分布の決定 実施例１に記載されたＮ−アセチルヘパロザンの分子質
量分布の決定に用いた方法に準じて、分子質量分布を排
除ＨＰＬＣにより決定する。実施例２から流出するバッ
チを構成する鎖の、少なくとも８６％に等しい重量分画
は、１５００および１５０００Ｄａの間の分子質量を有
する。 ウロン酸検定 段階eから流出したＮ−アセチルヘパロザンのウロン酸
含量は、１．９４マイクロモル／mgである。 紫外および可視部の分光光度法 得られたスペクトルより、得られたＮ−アセチルヘパロ
ザンのＤＮＡ含量は１％未満であることが証明できる。 全タンパク検定 Ｎ−アセチルヘパロザンのこのバッチの全タンパク含量
は１％未満である。 遊離アミノ基(ＮＨ₂)検定 ＮＨ₂含量は０．１マイクロモル／mg未満である。

【００６９】実施例３ 低分子質量の優勢なＮ−アセチルヘパロザンの調製(方
法ＩＩＩ) １) エシエリキア・コリ(Ｅscherichia coli)(Ｋ５)株
の培養 エシエリキア・コリ(Ｅscherichia coli)株ＳＥＢＲ３
２８２の培養は、実施例１記載の方法に従って実施し
た。Ｎ−アセチルヘパロザン含有培養物約１２lを得
る。

【００７０】２) 予備精製 段階a−遠心分離 培養の最後に、得られた懸濁液(１２l)を８０００rpm
(すなわち１１０００および１４０００gの間)で２０分
間遠心にかける。段階b−溶媒をアルカリ性溶液と接触
させる。遠心後、塊を除去し、上清を０．１Ｎ ＮaＯ
Ｈと約１時間接触させる。 段階c−予備濾過 前段階で得られた溶液を、商標３Ｍシリーズ３００ポリ
プロピレン−フィルターを通す予備濾過に供する。 段階d−特異的遮断限界の膜を用いる濃縮 段階cで得られた濾過物をカットオフ閾値が１００００
Ｄａの商標アミコン中空ファイバー・カートリッジかま
たはそれと同等のものを用いて濃縮する。低分子質量Ｎ
−アセチルヘパロザンに富む溶液がそれにより得られ
る。 段階e−透析 低分子質量Ｎ−アセチルヘパロザンに富む溶液を超純水
で、再び商標アミコン・システムを用いて透析し、希釈
因子を非常に高くする(＞１００００)。

【００７１】３) 低分子質量の優勢なＮ−アセチルヘパ
ロザンの単離および精製:実施例１[２)低分子質量の優
勢なＮ−アセチルヘパロザンの単離および精製、段階c
−段階f]に記載した方法を用い、バッチＡのＮ−アセチ
ルヘパロザンと類似の特性を有するＮ−アセチルヘパロ
ザンを得るか、または実施例２[２)低分子質量の優勢な
Ｎ−アセチルヘパロザンの単離および精製、段階a−段
階f]に記載した方法を用いる。

【００７２】Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン 実施例４ 実施例１から流出した低分子質量の優勢なＮ−アセチル
ヘパロザンの化学的修飾 １) バッチＢの化学的修飾 段階a−部分的脱アセチル化:バッチB500mgを１Ｎ ＮaＯＨ
溶液１０mlに溶解する。溶液を５０℃にし、撹拌しなが
らこの温度で８時間反応させる。次に溶液を２Ｎ ＨＣ
l溶液で中和し、超純水で透析し、次いで凍結乾燥す
る。 段階b−テトラブチルアンモニウム塩の形成:上記の凍結
乾燥物を超純水２０ml中にとる。得られた溶液を、ジビ
ニルベンゼンで架橋したポリスチレンに基づくイオン交
換カラム(商標ドウ・ケミカル・ドウェックス５０Ｗ８)
に移し、あらかじめ酸溶媒で調製して、生成物が再び酸
の形態になるようにする。次に溶液を４０％テトラブチ
ルアンモニウム溶液０．４mlと混合する。これを凍結乾
燥する。 段階c−部分的Ｎ,Ｏ−硫酸塩化 前段階で得られた塩４２１mgをジメチルホルムアミド３
５mlに溶解し、三酸化硫黄／ピリジン複合体(参照番号
Ｓ７５５−６として商標アルドリッヒにより市販)を
３．７１g添加する。混合物を撹拌しながら室温で６時
間反応させる。反応溶媒１容量に、塩化ナトリウムを、
塩化ナトリウムに関する溶液濃度が０．３３Ｍになるま
で加え、続いてエタノール２容量を加える。沈澱を形成
させる。混合物を遠心にかけ、上清を除去する。遠心塊
を０．５ＭＮaＣl溶液にとり、それを中和する。次にエ
タノール２容量を加える。沈澱を形成させ、混合物を遠
心にかけ、遠心塊を超純水にとる。混合物を超純水で透
析し、凍結乾燥する。上述の一連の操作を繰り返す。 得られた凍結乾燥物は、以下の特性を有する: ＊ウロン酸含量: １．１１マイクロモル／mg ＊遊離ＮＨ₂含量: ０．０１マイクロモル／mg ＊硫酸化の程度: ２糖単位あたり２．６４ ウロン酸およびＮＨ₂含量は実施例１記載のとおりに測
定する。硫酸化の程度は、硫酸基／カルボキシル比とも
称し、カルボキシル基あたりの硫酸基の数の平均であ
る; これはＢ．カシューらによりカルボハイドレイト・
リサーチ(Ｃarbohydrate Ｒesearch)３９巻、１６８〜
１７６頁(１９７５年)に報告された硫酸基検定およびカ
ルボキシル基検定の電気伝導度法により測定する。

【００７３】２) バッチＡの化学的修飾 バッチＡを３分画に分け、バッチＡ１、バッチＡ２およ
びバッチＡ３と称する。 段階a−部分的脱アセチル化およびゲル濾過:バッチＡ
１、Ａ２およびＡ３を、バッチＡ１のみを透析し、凍結
乾燥するということは別として、上述の段階aでバッチ
Ｂのために記載されたように処理する。次にバッチＡ
１、Ａ２およびＡ３は以下の条件下、ゲル濾過(ゲル透
過クロマトグラフィーまたは排除クロマトグラフィーと
も称する)により分画化する:直径２５〜７５μｍのビー
ズの支持は、Ｎ,Ｎ'−メチレンビスアクリルアミドで架
橋したアリルデキストラン(商標ファルマシアにより市
販されているセファクリルＳ−３００ＨＲ)を基礎とし
た。用いた溶離液: ０．５Ｍ ＮaＣl溶液混合物は、Ｋ
avがバッチＡ１から流出したヘパロザンでは１に対して
０．４６、バッチＡ２から流出したヘパロザンでは１に
対して０．４３およびバッチＡ３から流出するヘパロザ
ンでは０．６４に対して０．４３に相当する分画から成
る。これらの分画は、以下では「ゲル濾過ヘパロザン」と
称する。Ｋavは排除クロマトグラフィーで通常的に用い
られる係数であり、排除クロマトグラフィーの分画化を
再現させることが可能となる。これは式:

【数１】 により定義され、式中、 Ｖe＝考慮中の分画の溶出容量 Ｖo＝排除容量 Ｖt＝全ゲル容量 バッチＡ１から流出したヘパロザンの部分的脱アセチル
化直後の分子質量分布、並びにバッチＡ１、Ａ２および
Ａ３から流出したゲル濾過ヘパロザンの分子質量分布
は、実施例１に記載した技法にしたがって排除クロマト
グラフィーにより決定する。

【００７４】バッチＡ１から流出したヘパロザンのゲル
濾過前およびゲル濾過後に得られた溶離図は、各々図２
および図３に示す。溶離図から導かれた結果は、以下の
第III表に符号し、表中ＭＷ₀は生成物の１％の重量分画
がＭＷ₀以上の分子質量を有するような分子質量を表
し、ＭＷ₁は、生成物の１０％の重量分画がＭＷ₁以上の
分子質量を有するような分子質量を表し、ＭＷ₃は、生
成物の１０％の重量分画がＭＷ₃以下の分子質量を有す
るような分子質量を表し、ＭＷ₂は最大吸収に対応する
分子質量を表す。

【表３】 第III表 バッチＡ１から流出したヘパロザン(ゲル濾過していない)およびバッチＡ１、 Ａ２およびＡ３から流出したゲル濾過ヘパロザンの分子質量分布 ＭＷ₀ ＭＷ₁ ＭＷ₂ ＭＷ₃ バッチＡ１から流出した、ゲル 濾過していないヘパロザン ４１４００ ９６００ ４４００ １４００ バッチＡ１から流出したゲル 濾過ヘパロザン １０７００ ６９００ ４４００ １６００ バッチＡ２から流出したゲル 濾過ヘパロザン １２７００ ７０００ ４５００ １５００ バッチＡ３から流出したゲル 濾過ヘパロザン １０３００ ６９００ ４５００ １５００

【００７５】図２および図３を比較して観察すると、ゲ
ル濾過により、あまり豊富でない、高分子質量ヘパロザ
ンの除去が可能となる。この結果は第III表で明白であ
り、表中ゲル濾過の操作の後にＭＷ₀が大きく低下する
のが観察される。各バッチのヘパロザンは、７０００Ｄ
ａ未満の分子質量の鎖の、少なくとも９０質量％を含有
する。バッチＡ１およびＡ２から流出したゲル濾過ヘパ
ロザンを、実施例１[２)低分子質量の優勢なＮ−アセチ
ルヘパロザンの単離および精製、段階c]に記載したとお
りに処理する。バッチＡ３から流出したゲル濾過ヘパロ
ザンは沈澱しないが、超純水で透析する。ウロン酸およ
び遊離アミノ基含量は、実施例１記載のとおり測定す
る。得られた結果は、以下の第IVに符号する。残存する
アセチル含量は、同等数のグルクロニルおよびグルコサ
ミル基が存在することを考慮することにより評価した。
脱アセチル化の程度は、遊離アミノ基含量のウロン酸含
量に対する比と同等であるとして計算した。

【００７６】核磁気共鳴スペクトル バッチＡ３から流出したゲル濾過ヘパロザンで得られた
プロトン核磁気共鳴スペクトルの研究より、生成物が予
期した構造を有すると結論づけることができた。積分に
より計算した脱アセチル化の程度は、４４％に等しいこ
とが見出された。この値は、遊離アミノ基含量のウロン
酸含量に対する比を用いて計算した値(４１％)に近似す
る。

【表４】 第ＶＩ表 バッチＡ１、Ａ２およびＡ３から流出するゲル濾過ヘパロザンの特性 ウロン酸 ＮＨ₂ 残存アセチル 脱アセチル 含量検定 含量検定 含量の計算値 化の程度 (マイクロモル/mg)(マイクロモル/mg)(マイクロモル/mg) バッチＡ１から流出した ゲル濾過ヘパロザン ２.３ １.１０ １.２０ ４８％ バッチＡ２から流出した ゲル濾過ヘパロザン ２.４ １.００ １.４０ ４２％ バッチＡ３から流出した ゲル濾過ヘパロザン ２.６ １.０５ １.５５ ４１％

【００７７】段階b−部分的Ｎ,Ｏ−硫酸化 脱アセチル化したバッチＡ１、Ａ２およびＡ３から流出
したゲル濾過ヘパロザンを最初の段落で記載した操作は
繰り返さないという事は別として、上述でバッチＢのた
めに記載された方法(段階c−部分的Ｎ,Ｏ−硫酸化)で処
理する。バッチＡ３から流出したヘパロザンのために、
最初の沈澱の後、塊を超純水にとり、超純水で透析し、
溶液のまま放置する。Ｎ,Ｏ−硫酸化生成物の特性は以
下の第Ｖ表に示す:

【表５】 第Ｖ表 部分的Ｎ,Ｏ−硫酸化反応後の、バッチＡ１、Ａ２およびＡ３から流出した Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンの特性 ＮＨ₂含量 硫酸化度 (マイクロモル／mg) (硫酸／カルボキシル比) バッチＡ１から流出した Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン ０.１０ １.９ バッチＡ２から流出した Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン ０.１０ １.９ バッチＡ３から流出した Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン ０.１０ １.８ Ｎ,Ｏ−硫酸化反応の後の残存ＮＨ₂含量(０．１０マイ
クロモル／mg)は、精製Ｎ−アセチルヘパロザン(０．０
５マイクロモル／mg)の残存ＮＨ₂含量よりも多いことが
認められるであろう。従って、硫酸化は窒素原子上では
起こっていない。

【００７８】段階c−全Ｎ−硫酸化 Ｎ,Ｏ−硫酸化生成物１重量、炭酸水素ナトリウム１重
量および三酸化硫黄／トリメチルアミン複合体１重量
を、用いたＮ,Ｏ−硫酸生成物グラムあたり超純水２０m
lの容量で混合し、混合物を撹拌しながら５５℃で２０
時間反応させる。次に、反応混合物を希釈し(希釈因子
１０)、その後、得られた溶液の伝導度を０．５Ｍ塩化
ナトリウム溶液の伝導度に調製する。次に、エタノール
２容量を加えて沈澱させ、遠心にかけ、続いて遠心塊を
０．５Ｍ ＮaＣl溶液にとり、次いで２容量のエタノー
ルを加えて２回目の沈澱をさせる。超純水にとり、超純
水で透析した後、生成物を凍結乾燥し、減圧下４０℃で
乾燥する。

【００７９】核磁気共鳴スペクトル バッチＡ３から流出したＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンの¹³
Ｃ ＮＭＲスペクトルの研究より、この化合物では、グ
ルコサミニル基の６位のアルコールは、完全に硫酸エス
テルの形態になっていることが示される。得られたＮ,
Ｏ−硫酸化ヘパロザンのいくつかの特性は、上記の方法
に従って決定し、以下の第ＶＩ表に示す:

【表６】 第ＶＩ表 バッチＡ１、Ａ２およびＡ３の全Ｎ−硫酸化後に得られた生成物の特性 ウロン酸 ＮＨ₂ 脱アセチル 硫酸化の 含量 含量 化の程度 程度(硫酸 (マイクロモル/mg)(マイクロモル/mg) /カルボキシル比) バッチＡ１から流出した Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン １.２０ ０.０２ ４８％ ２.２ バッチＡ２から流出した Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン １.３０ ０.０２ ４２％ ２.２ バッチＡ３から流出した Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン １.３５ ０.０２ ４１％ ２.１

【００８０】残存ＮＨ₂含量(０．０２マイクロモル／m
g)は低く、精製Ｎ−アセチルヘパロザンのＮＨ₂含量(バ
ッチＡおよびバッチＢで０．０５マイクロモル／mg)よ
り少なく、また部分的Ｎ,Ｏ−硫酸化に示す)に続いて得
られるＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンのＮＨ₂含量(第Ｖ表に
具体的に示す)よりも少ない。このことは、Ｎ−硫酸化
反応の全体的な性質を表している。Ｎ−硫酸化の後に得
られる生成物の分子質量分布は、実施例１記載の方法に
より分析する。バッチＡ１から流出した生成物で得られ
た溶離図は、図４に示す。極めて類似の溶離図が、バッ
チＡ２およびＡ３から流出した生成物で得られる。

【００８１】溶離図から導いた結果は表５に符号する。
ＭＷ₀、ＭＷ₁、ＭＷ₂およびＭＷ₃の定義は第III表で記
載したのと同一である。

【表７】 第ＶＩＩ表 バッチＡ１、Ａ２およびＡ３の全n−硫酸化の後に得られた生成物の分子質量 分布 ＭＷ₀ ＭＷ₁ ＭＷ₂ ＭＷ₃ バッチＡ１ １４７００ ９０００ ５７００ ２６００ バッチＡ２ １７５００ １００００ ５８００ ３４００ バッチＡ３ １１６００ ７６００ ５０００ １８００ 各バッチのＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンは、１００００Ｄ
ａ未満の分子質量の鎖の、少なくとも９０質量％を含有
する。実際は、バッチＡ１、Ａ２およびＡ３は、各々２
６００Ｄａおよび９０００Ｄａの間、３４００および２
００００Ｄａの間、並びに１８００および７６００Ｄａ
の間の分子質量の鎖の８０％を含有する。

【００８２】実施例５ 実施例１２から生じる低分子質量の多いＮ−アセチルヘ
パロザンの化学修飾、Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類の製
造:８０％Ｎ−脱アセチル化誘導体。使用したＮ−アセ
チルヘパロザンは実施例に記載した方法に従って製造し
た。この生成物のウロン酸含量は２.１２μmol／mgであ
る。分子質量の分布の測定は、実施例１に記載した方法
による排除クロマトグラフィにより実施した。少くとも
８７.５％に等しい重量フラクションは、１.５００と１
５.０００Ｄaの間の分子質量の鎖を有する。分布の優勢
ピークはほぼ４.９００Ｄaである。このＮ−アセチルヘ
パロザンのバッチをバッチＣという。 段階a−部分的脱アセチル化 ２.５gのバッチＣを２Ｎ ＮaＯＨ溶液５０ｍｌに溶解
する。溶液を５０℃とし、この温度で８時間、攪拌しな
がら反応させる。２Ｎ ＨＣl溶液を用いてpＨを８に調
整し、溶液を超精製水に対し透析し、次いで凍結乾燥す
る。これにより１.９６gの生成物が得られる。 Ｎ−脱アセチル化率 遊離アミノ基(ＮＨ₂)アッセーはＮ−アセチルヘパロシ
ンが８０％Ｎ−脱アセチル化したことを示す。

【００８３】段階b−Ｎ−硫酸化 上記凍結乾燥物を７０mlの水に取り、２.５gのＮa₂ＣＯ
₃と２.５gの三酸化硫酸／トリメチルアミン錯体を加え
る。混合物を２０時間５５℃で反応させる。反応溶液の
伝導度を脱塩水の添加により、０.５Ｍ ＮaＣlのそれ
まで持って来る。４容量のエタノールで沈澱させる。混
合物を遠心分離する。沈澱を再び０.５Ｍ ＮaＣl溶液
に溶解する。４容量のエタノールで沈澱させる。混合物
を遠心分離する。遠心分離したペレットを超精製水に取
り、この溶液を既に記載した(実施例１)方法によって透
析し、凍結乾燥する。約２gの生成物を得る。 段階c−テトラブチルアンモニウム塩の形成 前段階で得た凍結乾燥物を、実施例４[１)バッチＢの化
学修飾、段階b]に記載した方法によりテトラブチルアン
モニウム塩に変換する。２.７gの塩を得る。 段階d−Ｏ−硫酸化 前段階で得た２.６８０gの塩を１９６mlのホルムアミド
に溶解し、１１.２７gの三酸化硫黄／ピリジン錯体を加
える。混合物を攪拌しながら６時間３０℃で反応させ
る。５容量の反応溶液当り１容量の２Ｍ ＮaＣl溶液を
加えてＮaＯＨ溶液を用いてpＨを７に調整する。２容量
のエタノールで再沈澱させ、混合物を遠心分離し、ペレ
ットを０.５Ｍ ＮaＣl溶液に再び溶解する。次いで２
容量のエタノールを加える。沈澱を形成させ、混合物を
遠心分離し、遠心分離によるペレットを８０mlの超精製
水に取る。２０mlの２Ｍ ＮaＣl溶液を加え、４容量の
エタノールを加える。沈澱を形成させて混合物を遠心分
離する。

【００８４】段階e−ゲル濾過 段階dで得た生成物を超精製水に取り次いで実施例４
[２)バッチＡの化学修飾、段階a]に記載した条件に従い
ゲル濾過により分画する。Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンの
成分を構成する鎖の分子質量を実施例１に記載した方法
に従って、排除クロマトグラフィにより測定する。１.
５００と１２.０００Ｄaの間の分子質量を有する鎖を含
む分画[溶液Ｃ(Ａ)]を集める一方で、他方で２.０００
から３０.０００Ｄaの分子質量の鎖を構成するＮ,Ｏ−
硫酸化ヘパロザン類を含む分画[溶液Ｃ(Ｍ)]を集める。
溶液Ｃ(Ａ)に、４容量のエタノールを加える。沈澱を形
成させ、混合物を遠心分離し、遠心分離ペレットを超精
製水に取る。混合物を超精製水に対し透析し、凍結乾燥
する。１.８gの生成物を得る。こうして得たＮ,Ｏ−硫
酸化ヘパロザンをバッチＣ１と称する。

【００８５】上述の方法によって測定した、このＮ,Ｏ
−硫酸化ヘパロザンのいくつかの特性は以下の第VIII表
に示す。

【表８】 第VIII表 バッチＣ１に対応する生成物の特性 ウロン酸 ＮＨ₂ 脱アセチル化 硫酸化の程度 含量 含量 の程度 (硫酸／カルボキシル比) (μモル／mg) (μモル／mg)バッチ C1 1.６ ０.０１３ ８０％ １.９

【００８６】生成物の分子量の分布は実施例１に記載し
た技術により評価した。溶出プロフィルから導かれるい
くつかの結果を表IXに示す。

【表９】 第IX表 バッチＣ１に対応する生成物の分子質量の分布 ＭＷ₀ ＭＷ₁ ＭＷ₂ ＭＷ₃ バッチＣ１ ９.６００ ７.２００ ５.６２１ ２.３６７ ＭＷ₀、ＭＷ₁、ＭＷ₂及びＭＷ₃の定義は、第III表で与
えたものと同一である。バッチＣ１のＮ,Ｏ−硫酸化ヘ
パロザンは、１.５００及び１５.０００Ｄaの間の鎖９
５質量％を含む。

【００８７】核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトル 陽子及び¹³Ｃ炭素ＮＭＲスペクトルはバッチＣ１のＮ,
Ｏ−硫酸化ヘパロザンで得る(スペクトルはＡＭＸ５０
０、溶媒Ｄ₂Ｏに関する)。陽子及び¹³Ｃ ＮＭＲスペク
トルの研究は生成物の推定構造を確認する。後者は正し
くＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンである。陽子スペクトル中
糖陽子の強度対アセチル陽子のそれとの比の研究は、８
４％の脱アセチル化の推定度になる。この値は遊離アミ
ノ基含量対ウロン酸含量の比(８０％)を用いて計算した
ものに近い。ＢＣ炭素ＮＭＲスペクトルは、特に、グル
コサミンがほとんど全てＮ−硫酸化したことを確認す
る。Ｄ−グルクロン酸は２及び３位で硫酸化しない。 段階f−ゲル濾過 溶液Ｃ(Ｍ)に、４容量のエタノールを加える。沈澱を形
成させて、混合物を遠心分離し、ペレットを超精製水に
取り、混合物を透析し凍結乾燥する。次いで凍結乾燥物
を０.５Ｍ ＮaＣl溶液に溶かして段階eに定める条件に
従ってゲル濾過により分画する。

【００８８】１.３００と２１.０００Ｄaの間の分子質
量を有する鎖を含む分画[溶液Ｃ(Ｂ)]を一方で集め、他
方１.４００から３７.０００Ｄaのもの[溶液Ｃ(Ｃ)]を
集める。これら二つの溶液は、溶液Ｃ(Ａ)について上記
したように処理し、凍結乾燥後、バッチＣ２は溶液Ｃ
(Ｂ)から、バッチＣ３は溶液Ｃ(Ｃ)から得られる。第Ｘ
表はバッチＣ２及びバッチＣ３の生成物の溶出プロフィ
ルから導かれる結果のいくつかを示す。

【表１０】 第Ｘ表 バッチＣ２及びＣ３に対応する生成物の分子質量の分布 ＭＷ₀ ＭＷ₁ ＭＷ₂ ＭＷ₃ バッチＣ２ １４.６００ ９.６００ ７.５９７ ５.９５０ バッチＣ３ ２８.６５６ １７.３２０ １０.５１２ ７.９７５ ＭＷ₀、ＭＷ₁、ＭＷ₂及びＭＷ₃の定義は、第III表で述
べたものと同一である。バッチＣ２に対応するＮ,Ｏ−
硫酸化ヘパロザンは、分子質量１，５００から１５，０
００Ｄａの鎖約９９質量％を含む。バッチＣ３に対応す
るＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンは分子質量１，５００から
１５，０００Ｄａの鎖を約７３％含む。

【００８９】実施例６ 実施例２から得られた低分子質量体が優勢なＮ−アセチ
ルヘパロザンの化学的修飾。Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン:
硫酸価２．６のＮ−アセチル化誘導体４０％の製造 出発物質として用いたＮ−アセチルヘパロザンは実施例
２に記載により製造した。この生成物のウロン酸含有量
は１．９６μモル／mgである。このバッチをバッチＤと
称する。 段階a−部分的脱アセチル化 バッチＤ３．７gを１ＮＮaＯＨ７４mlに溶解し、混合物
を実施例５(段階a)に記載の方法により処理する。脱ア
セチル化は窒素雰囲気下で行う。凍結乾燥後、生成物
２．９１gを得る。 脱アセチル化率 凍結乾燥後得られた生成物の遊離アミノ基(ＮＨ₂)価は
Ｎ−アセチルヘパロザンが４０％Ｎ−脱アセチル化され
たことを示している。 段階b−硫酸化 先の段階で得られた生成物をＮaＣＯ₃３．７gの存在
下、三酸化イオウ／メチルアミン錯体で、実施例５記載
の方法(段階b)により処理した。これによって、Ｎ−硫
酸化ヘパロザン約３gを得た。 段階c−テトラブチルアンモニウム塩の形成 先の段階で得られたＮ−硫酸化ヘパロザンを実施例５
(段階c)の方法によりテトラブチルアンモニウム塩に変
換した。凍結乾燥物２．９９gを得る。 段階d−Ｏ−硫酸化 先の段階で得られた塩２．９８gを三酸化イオウ／トリ
メチルアミン錯体で、実施例５(段階d)に記載の方法に
より処理し、ついで実施例５に記載と同様にして沈澱お
よび精製を行う。生成物２．８gを得る。

【００９０】段階e−ゲル濾過 先の段階で得られた生成物を実施例４[２)バッチＡの化
学的修飾、段階ａ]に記載の方法および装置を用いてゲ
ル濾過により分画する。。Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン画
分の分子質量(molecular mass)分布を実施例１に記載
の技法により排除クロマトグラフィー(exclusion chro
natography)により測定した。Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン
からなる画分−その鎖の大部分は１５００から１５００
０Ｄa間の分子質量をもつ−を分離する。ついでこれら
の画分を濃縮し、超精製水に対して透析した。ついで沈
澱をエタノール５容を添加して生成させ、混合物を遠心
分離にかけ、沈澱物を０．５ＭＮaＣl溶液に溶解し、沈
澱操作を繰り返した。これによって得られた精製物をこ
の段階の初めに述べたプロトコルを用いて２度目の分画
にかけた。画分の分子質量分布を前記の方法による排除
クロマトグラフィーにより測定した。４０００から８０
００Ｄaの分子質量を有する生成物を集めた。それらの
画分を透析にかけ、ついで、生成物をエタノールを添加
して沈澱させた。沈澱物を回収し、０．５ＭＮaＣlに溶
解した。これにより得られた溶液を超精製水に対して透
析し、ついで凍結乾燥した。これにより、バッチＤ１と
称するところのＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン約１gを得る。

【００９１】このＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンの性質およ
び分子質量の分布を第XI表および第XII表にそれぞれ示
す。

【表１１】 第XI表 バッチＤ１による生成物の性質 ウロン酸含有量 ＮＨ₂含有量 脱アセチル化率 硫酸化度 (μmol／mg) (μmol／mg) (硫酸基／ カルボキシル比) バッチＤ１ １．５３ ０．０１ ４０％ ２．６０

【表１２】 第XII表 バッチＤ１の生成物の分子質量分布 ＭＷ₀ ＭＷ₁ ＭＷ₂ ＭＷ₃ バッチＤ１ １５,４３０ １０,３０５ ６,８５０ ４,０４７ ＭＷ₀,ＭＷ₁,ＭＷ₂およびＭＷ₃の定義は第III表にお
けると同様である。バッチＤ１のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロ
ザンは４０４７から１０３０５Ｄaの鎖８０質量％を含
み、これらの鎖の約９８．５質量％は１５００から１４
６００Ｄaの分子質量を有する。図５はＮ,Ｏ−硫酸化ヘ
パロザンにつき得られた溶出プロフィルを示す。

【００９２】核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトル プロトンおよび¹³Ｃ炭素ＮＭＲスペクトルはバッチＤ１
のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンにつき得る(スペクトル走査
ＡＭＸ５００、溶媒Ｄ₂Ｏ)。プロトンおよび¹³Ｃ炭素Ｎ
ＭＲスペクトルの検討の結果は生成物の推定構造に一致
する。後者は確かにＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンである。
¹³Ｃ炭素ＮＭＲスペクトルは特に、グルコサミン単位の
アミノ基は遊離アミノ(ＮＨ₂)型でないことを示してい
る。グルコサミンはＣ６位で完全に硫酸化(sulphated)
され、反対にすべてのグルクロン酸のヒドロキシル基は
硫酸化されていない。

【００９３】実施例７ 実施例２から得られた低分子質量体が優勢なＮ−アセチ
ルヘパロザンの化学的修飾。Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン:
硫酸価２．６のＮ−アセチル化誘導体４０％の製造 出発物質として用いたＮ−アセチルヘパロザンは実施例
２に記載により製造した。この生成物のウロン酸含有量
は２μモル／mgである。このバッチをバッチＥと称す
る。このＮ−アセチルヘパロザンの分子質量分布は実施
例１に記載の技法により評価した。このＮ−アセチルヘ
パロザンは１５００から１５０００Ｄaの鎖約７５質量
％を含み、鎖の平均質量は約１０９００Ｄaである。こ
の優勢部分の分子質量は５１３５Ｄaである。Ｎ−アセ
チルヘパロザンは実施例６(段階a)に述べたプロトコル
により４０％Ｎ−アセチル化された。このＮ−脱アセチ
ル化のために、出発物質２．５gを用い、これを１ＮＮa
ＯＨ５０ml中に溶解した。反応終了後、反応媒体のpＨ
をＨＣlを用いて６に調整し、ついで媒体を濃縮した。 Ｎ−脱アセチル化率 遊離アミノ基(ＮＨ₂)測定はＮ−アセチルヘパロザンが
４０％−Ｎ−脱アセチル化されていることを示した。

【００９４】段階b−ゲル濾過 ０．５ＭＮaＣlで平衡化したセファクリルＳ−３００Ｈ
Ｒカラム(５cm×１００cm)を用いた。各画分に含まれる
ヘパロザンを排出クロマトグラフィーにより測定した。
６０００から２００００Ｄaの分子量を有する鎖を含む
画分を集め、混合物をロータリーエバポレーターで濃縮
し、エタノール４容で沈澱を生成させ、生成した沈澱物
を乾燥した。

【００９５】段階c−テトラブチルアンモニウム塩の形
成および部分的Ｎ,Ｏ−硫酸化 テトラブチルアンモニウム塩を生成させるために、前段
階で得られた生成物３００mgを用い、実施例４[１)バッ
チＢの化学的修飾、段階b]の方法を適用した。塩４９０
mgを得、この塩をホルムアミド３０ml中に溶解した。つ
いで実施例４に記載の方法[１)バッチＢの化学的修飾、
段階c−第一節]の方法により行った。塩４９０mgが三酸
化シオウ／ピリジン錯体２．２５gと反応させ、Ｎ,Ｏ−
硫酸化ヘパロザン４０６mgを得る。 段階d−総Ｎ−硫酸化およびゲル濾過 上記段階で得られた生成物３７２mgを５％Ｎa₂ＣＯ₃溶
液１５ml中に溶解し、実施例４に記載の方法[２)バッチ
Ａの化学的修飾、段階c］により三酸化イオウ／トリメ
チルアミン錯体３７２mgで処理する。ついで、総Ｎ−硫
酸化後得られた生成物を、セファクリルＳ−３００ＨＲ
カラム(２．５cm×１００cm)を用いて既述のプロトコル
を適用してゲル濾過により分画した。６０００から２０
０００Ｄaの分子質量の画分を集め、ロータリーエバポ
レーターで濃縮し、冷超精製水に対して十分に透析し、
凍結乾燥した。これによって、Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザ
ン２６０mg、バッチＥと称するものを得る。

【００９６】この生成物の性質を第XIII表に示す。第XI
V表はバッチＥ１を構成する鎖の分子質量の分布を示
す。このＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンは分子量１５００か
ら１５０００Ｄaの分子質量の鎖約７５質量％含み、７
７００から１５０００Ｄaの分子質量を有する鎖６５質
量％含む。

【表１３】 第XIII表 バッチＥ１の生成物の性質 ウロン酸含有量 ＮＨ₂含有量 脱アセチル化率 硫酸化度 (μモル／mg) (μモル／mg) (硫酸基／ カルボキシル比) バッチＥ１ １．３５ ０．０１ ４０％ ３

【表１４】 第XIV表 バッチＥ１の生成物の分子質量分布 ＭＷ₀ ＭＷ₁ ＭＷ₂ ＭＷ₃ バッチＥ１ ３１,２３８ １９,６７１ １２,０２９ ７,７４８ ＭＷ₀,ＭＷ₁,ＭＷ₂およびＭＷ₃の定義は第III表に述べ
たのと同じである。

【００９７】実施例８ Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンの２種のバッチの製造:硫酸化
度２．２５および２．４の８０％Ｎ−脱アセチル化誘導
体 用いた出発物質、バッチＦは実施例２記載の方法により
製造した。この化合物を構成する鎖の分子質量分布の測
定は、実施例１記載の方法により排除クロマトグラフィ
ーにより行った。プロフィールの検討により、バッチＦ
はその分子質量が１５００から１５０００Ｄaである鎖
を９２質量％含むバッチＦであることが確認できる。優
勢なピークは約４８００Ｄaに位置する。少なくとも８
０％に等しいバッチＦの画分重量は２４００から１００
００Ｄaの分子質量を有する。この生成物のウロン酸含
有量は２．４μモル／mgである。 段階a−部分的脱アセチル化 この工程は実施例５(段階a)に記載と同様であり、バッ
チＦ２．５gおよび２ＮＮaＯＨ５０mlを用いる。８０％
Ｎ−脱アセチル化生成物１．６gを得る。Ｎ−脱アセチ
ル百分率は遊離アミノ基測定法により評価した。段階b
およびc−Ｎ−硫酸化およびテトラブチルアンモニウム
塩の生成これらの二段階は実施例５記載の段階bおよび
段階cと同じである。テトラブチルアンモニウム塩４．
７gを得る。 段階d−Ｏ−硫酸化 上で得た塩２．９gをホルムアミド２９０mlに溶解し、
三酸化イオウ／ピリジン１７．４gを添加する。この工
程は実施例５の段階dに記載と同じである。２回目の遠
心分離後得られたペレットを超精製水に溶解し、ついで
混合物を超精製水に対して透析し、凍結乾燥した。これ
によって、生成物３．６８gを得る。

【００９８】段階e−ゲル濾過 先の段階で得られた生成物を０．５ＭＮaＣl溶液に溶解
し、ついで０．５ＭＮaＣlで平衡化したセファクリルＳ
−３００ＨＲカラムにかけた。溶出液をフラクションコ
レクターを用いて集めた。分子質量１４００Ｄaから１
０００Ｄaの分子質量を有する画分を集め、ロータリー
エバポレーターで濃縮する。エタノール４容で沈澱さ
せ、混合物を遠心分離し、沈澱物を超精製水に溶解さ
せ、これにより得られた溶液を超精製水に対し大量に透
析し、凍結乾燥し、生成物を乾燥する。これにより、
Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン１．６g、バッチＦ１を得る。
分子質量５０００から３５０００Ｄaに対応する画分を
集め、ロータリーエバポレーター中で濃縮し、得られた
溶液にエタノール４容を添加し、混合物を遠心分離し、
沈澱物を水に溶解し、凍結乾燥する。凍結乾燥物をさら
に、この段階の初めに記載した方法に分画する。各画分
の分子質量分布を実施例１に記載の方法により排除クロ
マトグラフィーにより測定した。２０００Ｄａから２６
０００Ｄaを有するＮ,Ｏ−硫酸ヘパロザンを含む画分を
集める。エタノール４容で沈澱させ、混合物を遠心分離
し、ペレットを蒸溜水に溶解し、混合物を透析し、凍結
乾燥する。これにより、バッチＦ２と称する。Ｎ,Ｏ−
硫酸ヘパロザン０．６gを得る。

【００９９】第XV表にバッチＦ１およびＦ２の性質を示
す。この溶出プロフィールから得られた結果を第XVIに
まとめる。

【表１５】 第XV表 バッチＦ１およびＦ２に対応するＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンの性質 ウロン酸含有量 ＮＨ₂含有量 脱アセチル化率 硫酸化率 (μモル／mg) (μモル／mg) (硫酸基／ カルボキシル比) バッチＦ１ １．５８ ＜０．０１ ８０％ ２．４ バッチＦ２ １．５８ ＜０．０１ ８０％ ２．２５

【表１６】 第VI表 バッチＦ１およびＦ２に対応する生成物の分子質量分布 ＭＷ₀ ＭＷ₁ ＭＷ₂ ＭＷ₃ バッチＦ１ １１,７００ ７,７００ ５,８００ ３,３００ バッチＦ２ ２４,４００ １６,３２５ ８,６００ ６,９００ ＭＷ₀,ＭＷ₁,ＭＷ₂およびＭＷ₃の定義は第ＩＩＩ表に述
べたと同じである。バッチＦ１のＮ,Ｏ−硫酸ヘパロザ
ンは１５００から１５０００Ｄaの分子質量の鎖約９９
質量％を含み、分子質量１５００から１５０００Ｄaの
鎖約８４．６質量％、分子質量６９００から１３５００
Ｄa約７０質量％を含む。

【０１００】核磁気共鳴ＮＭＲスペクトル プロトンおよび¹³ＣＮＭＲスペクトルをバッチＦ１の
Ｎ,Ｏ−硫酸ヘパロザンにつき得る(スペクトル走査ＡＭ
Ｘ５００、溶媒Ｄ₂Ｏ)。プロトンスペクトルの検討の結
果は、特にアミノ脱アセチルプロトンの強度に対する糖
プロトンの強度の比から、Ｎ−アセチル化グルコサミン
単位２０％の推定値を得る。¹³Ｃスペクトルはグルコサ
ミン単位が確かにＮ−硫酸化されていることを示す。二
糖構造の大部分におけるグルクロン酸は２および３位で
Ｏ−硫酸化されていない。

【０１０１】製造 製造Ａ 高分子質量の優勢なＮ−アセチルヘパロザンの製造(方
法１) １) エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)(Ｋ５)株
の培養およびＮ−アセチルヘパロザン含有濾液の分離 下記第XVIIに詳述する組成の培地Ｄ４００mlにエシェリ
ヒア・コリ株ＳＥＢＲ３２８２を接種し、けん濁物を３
７℃にて２時間撹拌しつつ、インキュベートする。つい
で、得られた前培養物をこれも下記第XVII表中詳述する
組成の培地Ｃ１１ｌを含む１８．５l培養器に移し、け
ん濁物を６時間３０分、３７℃にてインキュベートし、
pＨを７．２、および酸素部分圧を空気の吹き込みおよ
び撹拌を調節して４０mmＨgに保つように調整した。つ
いでグリセリンをグリセリン５００g／l含有滅菌溶液を
連続方式で、１８g／時の速度で１６−１７時間にわた
って添加した。温度、pＨおよび酸素部分圧で同一条件
下で、実質的にすべてのグリセリンが消費されるまで培
養を継続した。グリセリン添加後培養けん濁物のＯＤ
(λ＝６００nm)を観測を行うと、培養容器中２８−３０
時間経過後の培養終了時までに静止状態、またはわずか
な融解状態にあることを示す。ついで培養ブロスを２５
℃に冷却し、その後、孔径０．２２μmの膜で濾過す
る。これにより高分子質量の優勢なＮ−アセチルヘパロ
ザンを含む濾液約１２ｌを得る。

【０１０２】第XVII表 培地Ｃおよび培地Ｄの組成および製造 培地Ｃ 下記のものを超精製水９００mlに順に溶解する。 ＮＴＡ(ニトリロトリ酢酸)・・・・・ １,０００mg Ｋ₂ＨＰＯ₄・・・・・・・・・・・・ ７９０mg グルタミン酸・・・・・・・・・・・１１,０００mg ＭgＣl₂．６Ｈ₂Ｏ・・・・・・・・・ ５００mg Ｋ₂ＳＯ₄・・・・・・・・・・・・・ ４５０mg ＦeＳＯ₄．７Ｈ₂Ｏ ・・・・・・・・ １８mg ＣaＣl₂．２Ｈ₂Ｏ・・・・・・・・・ ２mg ＮaＣl・・・・・・・・・・・・・・ ５００mg ＫＣl ・・・・・・・・・・・・・・ ５,０００mg 微量成分溶液(第２表参照、実施例１) １ml グリセリン・・・・・・・・・・・・１０,０００mg pＨは密度１．３８の濃水酸化カリウムで７．２に調節
し、容量を超精製水で１０００mlにした。滅菌濾過を
０．２μm膜を用いて行う。 グリセリン溶液 グリセリン５０gを適量の超精製水に溶解し、容量を同
じ溶媒で１０００mlに調整する。滅菌濾過を０．２μm
膜を用いて行う。発酵中に用いた消泡剤はストルクトル
Ｊ６７３(シル・アンド・ゼラシェル、商品名)である。 培地Ｄ 培地Ｄの調製は培地Ｃと同じであるが、さらに消泡剤添
加後、緩衝液(pＨ７．２)３−モルホリノプロパンスル
ホン酸を添加した点が異なる。 高分子質量Ｎ−アセチルヘパロザンの分離および精製 高分子質量の優勢なＮ−アセチルヘパロザンを実施例２
に記載の方法により分離および精製した[２)高分子質量
の優勢なＮ−アセチルヘパロザンの分離および精製、段
階a−段階f]

【０１０３】３) 得られたＮ−アセチルヘパロザンの性
質 排除クロマトグラフィーによる分子質量分布の測定 今回用いた基準から判断して、分子質量分布は概括的に
評価した。この製造で得られたＮ−アセチルヘパロザン
は分子質量２００００Ｄaから５０００００Ｄaの鎖から
なり、平均質量は約１０００００−２０００００Ｄaに
ある。 ウロン酸測定 最終段階における精製生成物のウロン酸含有量は２．２
μモル／mgである。 紫外可視分光光度測定 得られたスペクトルからこのバッチはＤＮＡ０.５％以
下を含むことが解る。 総蛋白測定 総蛋白含有量は０.５％以下である。 遊離アミノ基（ＮＨ₂）測定 ＮＨ₂含有量は０.１μモル／ｍｇである。

【０１０４】製造Ｂ 高分子質量の優勢なＮ−アセチルヘパロザンの製造（方
法II） １）エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）（Ｋ５）
株 エシェリヒア・コリ株 ＳＥＢＲ３２８２の培養を製造
Ａに記載の方法により行った。高分子質量の優勢なＮ−
アセチルヘパロザンを含む培養物約１２ｌを得る。 ２）予備精製 実施例３に記載と同様の方法［２）予備精製］を段階ｄ
で、カットオフ閾値３００００Ｄａまたは等質量を有す
る商品名アミコン中空糸カートリッジを用いて行った。 ３）高分子質量の優勢なＮ−アセチルヘパロザンの分離
および精製 実施例３に記載と同様の操作［低分子質量の優勢なＮ−
アセチルヘパロザンの分離および精製］である。

【０１０５】製造Ｃ 製造Ａに由来する高分子質量の優勢なＮ−アセチルヘパ
ロザンの化学的修飾種々の化学的修飾の出発物質とし
て、製造Ａに記載の方法によって得られたバッチＧ１と
称するＮ−アセチルヘパロザンを使用した。この精製物
のウロン酸含有量は２.４１μモル／ｍｇである。 段階ａ−部分的脱アセチル化 １.９ｇのバッチＧ１を２Ｎ ＮａＯＨ３８.５mlに溶解
した。溶液を５０℃にし、この温度で、８時間窒素気流
下反応させた。ついで、ｐＨを、２Ｎ ＨＣｌを用いて
８.２５に調節した。この混合物を超精製水に対して透
析し、ついで凍結乾燥した。これにより、精製物１.６
ｇ得る。 Ｎ−脱アセチル化率 遊離アミノ基（ＮＨ₂）の測定はＮ−アセチルヘパロザ
ンが８０％であることを示した。

【０１０６】段階ｂ−Ｎ−硫酸化 前段階で得られた生成物１.３ｇを超精製水５７mlに溶
解し、ＮａＣＯ₃１.９ｇおよび三酸化硫黄／トリメチル
アミンの錯体１.９ｇを添加し、混合物を５５℃にて２
０時間保った。ついで、この溶液の伝導率を脱塩水を添
加して０.５ＭＮａＣｌ溶液の伝導率に調節し、エタノ
ール４容を添加して沈澱させた。混合物を遠心分離し、
ペレットを０.５Ｍ ＮａＣｌ溶液に取り、エタノール
４容で沈澱を生じさせ、混合物を遠心分離した。このペ
レットを超精製水に溶解し、混合物を実施例１に記載の
方法により超精製水に対して透析し、ついで、凍結乾燥
した。これにより、Ｎ−硫酸ヘパロザン１.８０９ｇを
得る。 段階ｃ−テトラブチルアンモニウム塩の生成 前段階で製造した生成物を水１００mlに溶解し、この溶
液をダウエックス５０Ｗ８イオン交換カラムにかけた。
用いた操作は実施例４に記載と同様である。［１）バッ
チＢ、段階ｂの化学的修飾］。凍結乾燥後、塩約１.３
ｇを得る。 段階ｄ−Ｏ−硫酸化 上記で得られた塩をホルムアミド８０mlに溶解し、三酸
化硫黄／ピリジン錯体５.６ｇを添加した。混合物を３
０℃にて６時間反応させ、ついで、１６mlの２Ｍ Ｎａ
Ｃｌを添加した。混合物をｐＨ７にし、エタノール４容
にて沈澱を生じさせた。沈澱を０.５Ｍ ＮａＣｌ溶液
に取り、エタノール２容で再沈澱させ、混合物を超精製
水に対して透析し、ロータリーエバポレーターで濃縮し
た。

【０１０７】段階ｅ−ゲル濾過 前段階で得られた濃縮溶液を、セファクリルＳ−３００
ＨＲカラムおよび溶出液として０.５Ｍ ＮａＣｌ溶液
を用いて、ゲル濾過により分画した。分子質量１０００
０から５０００００に対応する画分を分離した。エタノ
ール２容を添加し、混合物を遠心分離した。ついで、こ
の伝導率を０.５Ｍ ＮａＣｌ溶液の伝導率に水を添加
して調整した。ゲル濾過による分画を繰り返し、平均分
子質量１０００００から２０００００Ｄａを有する鎖か
らなるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロザンを集め、同じく約５０
０００Ｄａから約１２０００の平均分子質量を有する鎖
からなるＮ，Ｏ−硫酸ヘパロザンを含む画分も集めた。
これらの３種の画分の各々につき、超精製水に対する透
析を行い、透析後得られた溶液を凍結乾燥した。これに
より、３種のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロザンを得る： −バッチＧ１は、平均分子質量１０００００から２００
０００Ｄａを有する鎖からなるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロザ
ンである。このバッチ０.１４０ｇを分離する。 −バッチＧ２は、約５００００Ｄａの平均分子質量を有
する鎖からなるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロザンである。この
Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロザン０.３５０ｇを分離する。 −バッチＧ３は、約１２０００の平均分子質量を有する
鎖からなるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロザンである。この後者
のバッチ約０.１００ｇを分離する。この実施例中の
Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロザンの３種のバッチを第XVIII表
に示す。

【表１７】 第XVIII表 バッチＧ１、Ｇ２およびＧ３に対応するＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロザンの性質 ウロン酸含有量 ＮＨ₂含有量 脱アセチル化率 硫酸化度 (μモル／mg) (μモル／mg) (硫酸基／ カルボニル比) バッチＧ１ １．４８ ＜０．０１ ８０％ ２．６ バッチＧ２ １．４５ ＜０．０１ ８０％ ２．６ バッチＧ３ １．４５ ＜０．０１ ８０％ ２．６

【図面の簡単な説明】

【図１】 バッチＡの排出曲線を示すグラフである。

【図２】 バッチＡ１からのヘパロザンのゲルろ過前の
排出曲線を示すグラフである。

【図３】 バッチＡ１からのヘパロザンのゲルろ過後の
排出曲線を示すグラフである。

【図４】 バッチＡ１からの生成物の排出曲線を示すグ
ラフである。

【図５】 Ｎ，Ｏ−硫酸化ヘパロザンの排出曲線をしめ
すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 19/26 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 マルク・ルイ・ヴイクトール・サロム フランス31320カスタネ−トローザン、レ ゾルム・スゴン・バ・エフ１番 (72)発明者 ギ・エチエンヌ・マリー・トウナイユ・デ ステ フランス31400トウールーズ、ブールヴア ル・グリフル・ドルヴアル２番

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式(Ｉ) 【化１】 [式中、Ｅは、Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンのジサッカリド
   単位の０〜８０％においてアセチル基、および残りのジ
   サッカリド単位において硫酸基および可能ならば水素原
   子を表し、Ｇは水素原子および硫酸基を表す]で示され
   る反復ジサッカリド構造を特徴とする、分子質量１５０
   ０ないし１５０００Ｄａの鎖または鎖の混合物から成る
   Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類および前記Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘ
   パロザンの医薬的に許容し得る塩類。
2. 【請求項２】 Ｅがアセチル基または硫酸基を表すこと
   を特徴とする、請求項１記載のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザ
   ン類。
3. 【請求項３】 硫酸基／カルボキシル基比として表され
   る硫酸化の程度が１.５ないし３であることを特徴とす
   る、請求項１および２のいずれかに記載のＮ,Ｏ−硫酸
   化ヘパロザン類。
4. 【請求項４】 式(Ｉ) 【化２】 [式中、Ｅは、前記Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンのジサッカ
   リド単位の０〜８０％においてアセチル基、および残り
   のジサッカリド単位において硫酸基および可能ならば水
   素原子を表し、Ｇは水素原子および硫酸基を表す]で示
   される反復ジサッカリド構造を特徴とし、硫酸基／カル
   ボキシル基比として表される硫酸化の程度が１.５〜３.
   ０であり、前記Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンの鎖の２つの
   還元および非還元末端が、硫酸化もしくは非硫酸化ウロ
   ン酸単位、硫酸化もしくは非硫酸化グルコサミン単位、
   硫酸化もしくは非硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン単位
   である、分子量１５００ないし１５０００Ｄａの鎖また
   は鎖の混合物から成る請求項１記載のＮ,Ｏ−硫酸化ヘ
   パロザン類および前記Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンの医薬
   的に許容し得る塩類。
5. 【請求項５】 アセチル基が６０％を越えない含有率で
   存在することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１
   項記載のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類。
6. 【請求項６】 分子質量１１０００Ｄａ未満の鎖を少な
   くとも９０質量％の割合で含むことを特徴とする、請求
   項１〜５のいずれか１項記載のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザ
   ン類。
7. 【請求項７】 ０.２マイクロモル／mg未満の割合でア
   ミノ基(ＮＨ₂)を含むことを特徴とする、請求項１記載
   のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類。
8. 【請求項８】 平均分子質量約４０００Ｄａないし７０
   ００Ｄａの鎖から成り、１.７ないし３の硫酸基／カル
   ボキシル基比として表される硫酸化度を有する、請求項
   １〜５のいずれか１項記載のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン
   類。
9. 【請求項９】 分子質量５０００ないし７０００Ｄａの
   鎖を少なくとも７０質量％の割合で含むこと、および硫
   酸基／カルボキシル基比として表される硫酸化度が１.
   ８ないし２.５であること、およびアセチル基が２０％
   を越えない含有率で存在することを特徴とする、請求項
   １記載のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類。
10. 【請求項１０】 分子質量１００００ないし１２０００
    Ｄａの鎖を少なくとも７０質量％の割合で含むこと、硫
    酸基／カルボキシル基比として表される硫酸化度が１.
    ８ないし２.５であること、およびアセチル基が２０％
    を越えない含有率で存在することを特徴とする、請求項
    １記載のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類。
11. 【請求項１１】 分子質量６０００ないし８０００Ｄａ
    の鎖を少なくとも７０質量％の割合で含むこと、硫酸基
    ／カルボキシル基比として表される硫酸化度が２.０な
    いし２.８であること、およびアセチル基が６０％を越
    えない含有率で存在することを特徴とする、請求項１記
    載のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類。
12. 【請求項１２】 分子質量２３００ないし７２００Ｄａ
    の鎖を少なくとも８０質量％の割合で含むこと、硫酸基
    ／カルボキシル基比として表される硫酸化度が１.８な
    いし２.５であること、およびアセチル基が２０％を越
    えない含有率で存在することを特徴とする、請求項１記
    載のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類。
13. 【請求項１３】 分子質量３３００ないし７７００Ｄａ
    の鎖を少なくとも８０質量％の割合で含むこと、硫酸基
    ／カルボキシル基比として表される硫酸化度が１.８な
    いし２.５であること、およびアセチル基が２０％を越
    えない含有率で存在することを特徴とする、請求項１記
    載のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類。
14. 【請求項１４】 分子質量６９００ないし１３５００Ｄ
    ａの鎖を少なくとも７０質量％の割合で含むこと、硫酸
    基／カルボキシル基比として表される硫酸化度が１.８
    ないし２.５であること、およびアセチル基が２０％を
    越えない含有率で存在することを特徴とする、請求項１
    記載のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類。
15. 【請求項１５】 分子質量４０００ないし１０３００Ｄ
    ａの鎖を少なくとも８０質量％の割合で含むこと、硫酸
    基／カルボキシル基比として表される硫酸化度が２.０
    ないし２.８であること、およびアセチル基が６０％を
    越えない含有率で存在することを特徴とする、請求項１
    記載のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類。
16. 【請求項１６】 請求項１〜１５のいずれか１項記載の
    Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザン類を少なくとも７０質量％の
    割合で含むことを特徴とする、Ｎ,Ｏ−硫酸化ヘパロザ
    ンの組成物。
17. 【請求項１７】 請求項１記載のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロ
    ザンを７０％〜１００％の割合で含む組成物の製造方法
    であって、下記順序の段階: −段階a: エシェリヒア・コリ(Ｋ５)株の培養、 −段階b: 形成されたＮ−アセチルヘパロザンの単離お
    よび精製により(先に予備精製を行う場合も行わない場
    合もある)、式(II) 【化３】 で示される反復ジサッカリド構造を特徴とする、分子質
    量１５００ないし１５０００Ｄａの鎖または鎖の混合物
    から成るＮ−アセチルヘパロザンを７０％〜１００％の
    割合で含む組成物を得、 −段階c: Ｎ−アセチルヘパロザンのこの組成物の部分
    的脱アセチル化により、式(III) 【化４】 (式中、Ｒ'は、ジサッカリド単位の０〜８０％において
    アセチル基、および残りのジサッカリド単位において水
    素原子を表す）で示される反復ジサッカリド構造を特徴
    とする、分子質量１５００ないし１５０００Ｄａの鎖ま
    たは鎖の混合物から成るヘパロザンを７０％〜１００％
    の割合で含む組成物を得、 −段階ｄ：−ヘパロザンのこの組成物の部分的Ｎ,Ｏ−
    硫酸化、−またはヘパロザンのこの組成物の部分的Ｎ,
    Ｏ−硫酸化、次いで全体的Ｎ−硫酸化の段階、−または
    全体的もしくは部分的Ｎ−硫酸化、次いで全体的もしく
    は部分的Ｏ−硫酸化の段階を含み、および所望により段
    階a、b、cまたはdの最後に形成された分子質量の１つま
    たはそれ以上の分画化段階を含み得ることを特徴とする
    方法。
18. 【請求項１８】 エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia co
    li)(Ｋ５)株がＳＥＢＲ３２８２株(寄託番号 Ｉ−１０
    １３としてフランス国パスツール研究所のＣＮＣＭに寄
    託)またはこの株の自然発生的もしくは誘導された突然
    変異体であることを特徴とする、請求項１７記載の方
    法。
19. 【請求項１９】 エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia co
    li)(Ｋ５)株の培養が、バイオマスの生長停止後少なく
    とも２時間続行されることを特徴とする、請求項１７記
    載の方法。
20. 【請求項２０】 Ｎ−アセチルヘパロザンの単離および
    精製が、少なくとも一つのアルコール沈澱段階および少
    なくとも一つのイオン交換クロマトグラフィー段階を含
    むことを特徴とする、請求項１７記載の方法。
21. 【請求項２１】 Ｎ−アセチルヘパロザンの単離および
    精製が、下記順序の段階: −段階a₁: エタノール沈澱、 −段階b₁: 透析、 −段階c₁: エタノール沈澱、次いで脱水および乾燥、 −段階d₁: アニオン交換クロマトグラフィーによる精
    製、 −段階e₁: 段階d₁で得られた溶離物のエタノール沈
    澱、脱水、乾燥および粉砕(ただし、段階a₁またはc₁の
    うちの一つは省かれ得る)を含む方法を用いて行なわれ
    ることを特徴とする、請求項１７記載の方法。
22. 【請求項２２】 Ｎ−アセチルヘパロザンの単離および
    精製が、下記順序の段階: −段階a'₁: 透析、 −段階b'₁: 酸性培地における精製、pＨ３.５およびp
    Ｈ１.８の水溶液に不溶性の不純物の除去、 −段階c'₁: エタノール沈澱、次いで脱水および乾燥、 −段階d'₁: アルカリ性加水分解および透析、 −段階e'₁: アニオン交換クロマトグラフィーによる精
    製、 −段階f'₁: 排除クロマトグラフィーによる精製を含む
    方法を用いて行なわれることを特徴とする、請求項１７
    記載の方法。
23. 【請求項２３】 エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia co
    li)(Ｋ５)株の培養から得られたＮ−アセチルヘパロザ
    ンを、単離および精製前に、下記順序の段階: −段階a"₁: 培養の最後に得られた懸濁液の遠心分離、 −段階b"₁: 上清をアルカリ性溶液と接触させる工程、 −段階c"₁: 予備ろ過、 −段階d"₁: 特定されたカット-オフいき値の膜を用い
    た濃縮、 −段階e"₁: 透析(ただし、段階e"₁は省かれ得る)を含
    む方法を用いて行なわれる予備精製に付すことを特徴と
    する、請求項１７記載の方法。
24. 【請求項２４】 部分的Ｎ,Ｏ−硫酸化の段階の後、塩
    基性pＨの水性溶媒中有機塩基との硫酸無水物の複合体
    により行なわれる全体的Ｎ−硫酸化が行なわれることを
    特徴とする、請求項１７記載の方法。
25. 【請求項２５】 全体的Ｎ−硫酸化の段階の後、分子質
    量分画化が行なわれることを特徴とする、請求項１７記
    載の方法。
26. 【請求項２６】 医薬的に許容し得る不活性賦形剤と組
    み合わせまたは混合して、請求項１〜１５のいずれか１
    項記載のＮ,Ｏ−硫酸化ヘパロザンを有効成分として含
    む医薬組成物。
27. 【請求項２７】 医薬的に許容し得る不活性賦形剤と組
    み合わせまたは混合して、請求項１６記載のＮ,Ｏ−硫
    酸化ヘパロザンの組成物を有効成分として含む医薬組成
    物。
28. 【請求項２８】 凝固の調節に使用され得る、請求項２
    ６および２７のいずれかに記載の医薬組成物。
29. 【請求項２９】 フランス国パリ、パスツール研究所の
    ＣＮＣＭに寄託番号Ｉ−１０１３として寄託された、エ
    シェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)(Ｋ５)株ＳＥＢ
    Ｒ３２８２。
30. 【請求項３０】 式(II) 【化５】 で示される反復ジサッカリド構造を特徴とする、分子質
    量１５００ないし１５０００Ｄａの鎖の混合物から成る
    Ｎ−アセチルヘパロザン類であって、前記Ｎ−アセチル
    ヘパロザンの２つの還元および非還元的末端がウロニッ
    クまたはＮ−アセチルグルコサミン単位である、Ｎ−ア
    セチルヘパロザン類。
31. 【請求項３１】 鎖の大部分において、非還元的末端が
    式(a) 【化６】 で示されるウロン酸単位であることを特徴とする、請求
    項３０記載のＮ−アセチルヘパロザン。
32. 【請求項３２】 請求項３０記載のＮ−アセチルヘパロ
    ザンを少なくとも７０％の割合で含むことを特徴とす
    る、Ｎ−アセチルヘパロザンの組成物。
33. 【請求項３３】 式(III) 【化７】 (式中、Ｒ'は、ジサッカリド単位の０〜８０％において
    アセチル基、および残りのジサッカリド単位において水
    素原子を表す)で示される反復ジサッカリド構造を特徴
    とする、分子質量１５００ないし１５０００Ｄａの鎖の
    混合物から成るヘパロザン類。
34. 【請求項３４】 アセチル基が６０％を越えない含有率
    で存在することを特徴とする、請求項３３記載のヘパロ
    ザン類。
35. 【請求項３５】 請求項３３および４４のいずれかに記
    載のヘパロザンを少なくとも７０質量％の割合で含むこ
    とを特徴とする、ヘパロザンの組成物。